WO2010069987A1 - Verfahren und vorrichtung zur dynamischen verlagerung eines lichtstrahls gegenüber einer den lichtstrahl fokussierenden optik - Google Patents
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- WO2010069987A1 WO2010069987A1 PCT/EP2009/067269 EP2009067269W WO2010069987A1 WO 2010069987 A1 WO2010069987 A1 WO 2010069987A1 EP 2009067269 W EP2009067269 W EP 2009067269W WO 2010069987 A1 WO2010069987 A1 WO 2010069987A1
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- G02B26/101—Scanning systems with both horizontal and vertical deflecting means, e.g. raster or XY scanners
Definitions
- the invention relates to a device for dynamic displacement of a light beam with respect to a light beam focusing optics having the features of the preamble of independent claim 1 and to a corresponding method for dynamic displacement of a light beam relative to a light beam focusing optics having the features of the preamble of the independent Patent claim 8.
- the invention relates to the field of light scanning microscopy, in which an object is scanned with the focused light beam, as a rule a focused laser beam.
- This scanning is also referred to as scanning or scanning, and a corresponding device is also known as a beam scanner, laser scanner or raster scanner.
- object scanners In early confocal light scanning microscopy, which has the advantage that lying outside the focal plane of the microscope objective object parts are not blurred and thus interfering with the image of the object of interest in the focal plane, so-called object scanners were used, which move the respective object relative to the static light beam , Such an arrangement is described in US 3,013,467.
- object scanner allows a simple, static look. Due to inertial conditions, however, an object scanner only allows comparatively low scanning speeds and accordingly low frame rates. Practically, the scanning speeds in biology or medicine are sufficient only for dead fixed samples.
- beam scanning methods are used in confocal light scanning microscopes in which the light beam, usually a laser beam, is deflected with beam deflection means relative to the optics subsequently focusing it around a point in the pupil plane of the focusing optics which is briefly referred to here as a pupil, in order to shift it in the focal plane of the microscope objective.
- the pupil is in the lens itself and is therefore not mechanically accessible. Therefore, the scanning mechanism used must be placed in an optical image of the pupil of the lens. If the beam fulcrum is not exactly in the pupil of the focusing optics, the image brightness decreases sharply towards the edge of the scanning area, which is not tolerable.
- DE 40 26 130 A1 discloses a device having the features of the preamble of independent patent claim 1 and a method having the features of the preamble of independent claim 8, in which a laser beam is generated by two rotating mirrors whose pivotal movement about parallel pivot axes according to a fixed mathematical relationship is deflected in one direction so that it is rotated by a fixed point of impact on another rotating mirror. By pivoting this further rotating mirror, the laser beam is deflected in the second direction. If the impact point is in the entrance pupil of the downstream focusing optics, the common pivot point of the laser beam falls in both directions in the pupil of the focusing optics.
- Deflecting the light beam in the first direction two rotatably arranged in a predetermined angular position mutually arranged mirror provided so together around the optical
- Axis of an incident laser beam are pivotable, that this falls at a fixed point on a arranged on the extended optical axis of the incident laser beam further rotating mirror which is pivotable about an orthogonal to the incident light beam and the deflected light beam extending pivot axis.
- the light beam is rotated in both directions by a single point in this pupil image.
- further mirrors may be provided to the focused laser beam about the optical axis of the incident
- Scanning range is in the pupil of a focusing optics much higher requirements than the conventional light scanning microscopy.
- a first fluorescence excitation laser beam is used for fluorescence excitation as in the confocal light scanning microscopy.
- a second stimulation laser beam is used, which deletes the fluorescence in the edge region of the diffraction-limited light spot of the excitation light.
- the electric field of the stimulation laser beam is spatially modulated with so-called phase plates or modulators in an image of the pupil of the objective so that the integral of the electric field disappears over the pupil.
- the residual light intensity in the zero point of the stimulation beam must be less than one percent of the maximum ambient brightness in order not to also delete the measurement signal of interest from the focus point.
- the spatial phase structure of the stimulation beam in the pupil may correspondingly move by scanning the scanning range by deflecting the light beam only by the smallest fractions, in practice a maximum of about one-thousandth of the pupil diameter. This criterion is by means of the known laser scanner if at all only with extreme effort, d. H. high-quality optical components for the rotating mirror and the focusing optics, to achieve.
- US 2006/0151449 A1 discloses a system and a method for scanning a surface with a parallel beam.
- a collimated beam of light for example from a laser, is translated parallel to its optical axis with two pairs of light deflecting means, such as mirrors.
- the beam deflecting means are successively pivotable about two pivot axes parallel to one another and transverse to the light beam and pivotable about two further pivot axes parallel to one another and extending transversely to the light beam but also transversely to the first pivot axes.
- the two beam deflecting means which are pivotable about mutually parallel pivot axes are pivoted in the same direction by the same angle to cause the parallel displacement of the laser beam, so that, for example, rotating mirror are aligned as beam deflection in each operating position of the known system with respect to their surface normal in pairs antiparallel to each other. A focusing of the light beam does not take place.
- the invention has for its object to provide a device with the features of the preamble of independent claim 1 and a method having the features of the preamble of independent claim 8, with which it is possible without much practical or equipment expense, the light beam to a Rotate fixed pivot in the pupil of the focusing optics in two directions to scan the two-dimensional scanning without varying the optical ratios over the scanning.
- the object of the invention is achieved by a device having the features of independent patent claim 1 and by a method having the features of independent claim 8.
- Preferred embodiments of the new device are described in the dependent claims 2 to 7, while the dependent claims 9 to 15 relate to preferred embodiments of the new method.
- each direction in which the light beam is to be deflected with respect to the optical axis of the focusing optics in order to displace it in this direction within the scanning range at least and also preferably two beam deflection means are connected in series.
- the two beam deflecting means divert the light beam in the same plane but at two successive points by one deflection angle each. These two deflection angles are independently dynamically changeable. From the combination of the independent dynamic variability of the two deflection angles out can both the beam position of the light beam in the respective direction in the pupil of the focusing optics and the angle of the light beam to the optical axis of the focusing optics and thus the position of the focused light beam in the scanning be set.
- the beam position in the pupil can be recorded during scanning of the scanning region.
- the deflection means can use it In particular, be arranged on a anyway vacant location of the beam path. There is no extra space for them and, in particular, no extra pupil images have to be done for them.
- the degrees of freedom provided by the two independently acting beam deflection means not only compensate for distances of the deflection means to the pupil or pupil image of the focusing image, but also lens errors of the focusing optics and / or errors of the beam deflection means itself. That is, in the new device the criteria of the pivoting of the light beam around a fixed point in the pupil of the optics are to be observed even more accurately than with an ideal mirror in the pupil, since such a mirror can not compensate aberrations of the optics unlike the two beam deflecting means connected in series in each direction. With the device according to the invention, the fulcrum of the deflected light beam can also be specified in the axial direction, or laid so as to be such. B. different axial positions of different lenses to consider.
- a control is provided for the beam deflecting means which determines the four deflection angles of the total of at least four beam deflecting means for each point of the scanning range.
- a fixed value belongs to each of the four deflection angles.
- the four deflection angles are correlated. However, they do not change in fixed relationships when scanning the sample area, but rather, so that the ideal four deflection angles are set for each dot.
- the ideal deflection angles for each point of the scan area are set by the controller so that the light beam always passes at the same location through the pupil of the focusing optics. Preferably, it runs with its center of gravity through the center of the pupil.
- the values of the four deflection angles which follow one another when the scanning region is scanned are preferably set by the controller in such a way that the scanning region is scanned with the focused light beam in a predetermined pattern.
- This predetermined pattern exists z. B. from exactly parallel lines the same distance along which the focused laser beam is moved at a constant speed.
- Such a distortion-free pattern makes it possible to assign a measurement signal coming from the area of the focused light beam exactly to a specific location of the scanning area on the basis of its time.
- a beam position detection device for detecting a beam position in the pupil or an image of the pupil of the optics and a further beam position detection device for simultaneously detecting a beam position in the scanning region or an image be provided of the scanning.
- the beam deflecting means of the device according to the invention can basically act on the light beam at any desired location in order to deflect it.
- different locations of the light beam prove to be particularly favorable to deflect the light beam exactly in the manner desired here. These include all places where the light beam is collimated.
- a collimated light beam is tilted with respect to the optical axis of the optics focusing thereafter in order to comply with the criterion that the light beam is always at the same position through the pupil of the optics runs.
- the beam deflection means of the device according to the invention act on a previously focused light beam, they laterally displace the focused light beam with respect to the optical axis of the optics to comply with the same criterion.
- the occurring change in the beam length of the light beam does not affect, however, in an axial displacement of the focus of the light beam of the same size.
- the effective lateral displacement of the focus is paramount to the image-forming effect of focusing the focus between the beam deflecting means and the focus of the light beam.
- the axial displacement of the focus is proportional to the square of the image reduction. That is, in the present device, the axial focus error in the object space is reduced by the magnification factor of the optics between the object space and the beam deflection means.
- the beam deflecting means may be arranged around an image of the pupil of the optics, with no objection to providing one of the beam deflecting means exactly in the pupil image.
- the beam deflecting means can also be arranged around an intermediate image of the scanning region, it also being possible here for one of the beam deflecting means to be arranged exactly in the intermediate image.
- Such an intermediate image is often freely accessible in scanning microscopes, which is the typical size of beam deflection z.
- B. in terms of galvanometergizener rotating mirror.
- Such rotating mirrors are preferably formed in the device according to the invention so that they are pivotable about a pivot axis extending in its mirror plane. The two beam deflecting means of each direction in the form of rotary mirrors are then pivotable about parallel pivot axes.
- the light beam is deflected in each direction in which the scanning region is to be scanned at two points lying one behind the other about two independently dynamically changing deflection angles.
- the light beam is preferably deflected by the four deflection angles in such a way that it always passes through the pupil of the optics focusing on it at the same point.
- the light beam is deflected by the total of four deflection angles so that the scanning area is scanned with the focused light beam in a predetermined distortion-free pattern.
- the four deflection angles must be determined and stored for each point of the scan area because their ideals also take into account aberrations of the optics and errors of the deflection means used to deflect the light beam.
- a beam position of the light beam in the pupil or an image of the pupil can be detected to keep it constant while simultaneously detecting a beam position in the scan area or an image of the scan area for each set deflection angle to detect the location of the scanning area reached with the light beam. From this, a sequence of the four deflection angles can then be set in the opposite direction in order to scan the scanning region in a desired pattern.
- the location of the deflection of the light beam is not particularly critical, although certain locations are preferred for this purpose. These include the areas in which the light beam is collimated. Another convenient location is the pupil of the optics (if accessible) or any picture of the pupil of the optics. In particular, however, it is also possible with the present invention to make the deflection of the light beam in the region of an intermediate image of the scanning region and still to move the effective pivot point of the light beam relative to the optical axis of the focusing optics in the pupil.
- the present invention is not limited to any particular application, it proves to be particularly advantageous in high resolution scanning light microscopy to modulate the electric field in at least one component of the coherent light beam such that the integral of the electric field is above the pupil of the focusing beam
- Intensity distribution of a stimulation laser beam is set in the STED microscopy, which has a zero point at the geometric focus point of the light beam is extremely sensitive to an easily avoided with the present invention offset of the
- Fig. 1 shows an arrangement of four galvanometer driven rotary mirrors, as they can be used in the present invention as a beam deflecting means.
- Fig. 3 shows the structure of a STED scanning microscope, in which the invention in the
- Fig. 5 outlines the possibility of an adaptive given by the invention
- FIG. 1 shows a scanning arrangement 16 of four rotary mirrors 22 to 25, each driven by a galvanometer 40, which in the present invention can be used as a beam deflecting means 26 for a light beam 7.
- deflect two deflection means 26 here the rotating mirror 22 and 23 on the one hand and the rotating mirrors 24 and 25 on the other hand
- the light beam 7 in two successive points by deflection angle 31 and 32 or 33 and 34, in one direction to, d. H .
- the deflection angle 31 and 32 on the one hand and the Deflection angles 33 and 34 lie substantially in one plane.
- the rotating mirrors 22 and 23 about two parallel pivot axes 27 and 28 are pivotable, while the rotating mirrors 24 and 25 are pivotable about two to the pivot axes 27 and 28 substantially orthogonal and mutually parallel further pivot axes 29 and 30. All pivotal movements of the rotating mirror 22 to 25 about the pivot axes 27 to 30 are independently possible.
- the light beam 7 focusing optics adjustable in both lateral directions, but also the position of the pivot point of the light beam 7 in the longitudinal direction of the optical axis.
- this pivot point can be held stationary by the control of the deflection means 26 in all changes of the angular position of the light beam 7. In particular, it may be retained at the location of a pupil image 17 of the subsequent focusing optic. This is particularly easy when the deflection means 26 are arranged around this location of Figure 17, as shown in Fig. 1.
- the galvanometer-driven rotary mirrors 22 to 25 reproduced as beam deflecting means 26 in FIG. 1 are only a concrete example of the implementation of the present invention.
- acousto-optic or electro-optical beam deflecting means, piezoelectrically driven mirrors, so-called MEMS (microelectromechanical systems) and the like can be used as the beam deflecting means 26.
- FIG. 2 outlines the integration of the scanning arrangement 16 in a confocal scanning light microscope.
- a fluorescence excitation laser 1 emits a fluorescence excitation laser beam 2 which is directed via a color beam splitter 3 as a light beam 7 through the scanner arrangement 16 into a focusing optic 4 which focuses it into an object 6.
- the focusing optics 4 is constructed here from a scanning lens 21, a tube lens 19 and a lens 5 and images the object 6 in an intermediate image 18.
- the detection light 11 returning from the object 6 is scanned by the scanning arrangement 16 and detected by a detector 8 in a confocal arrangement, which is realized by a focusing lens 10 and a pinhole 9 arranged behind it.
- the STED fluorescence light microscope sketched in FIG. 3 also detects the detection light 11 from the object 6 with the detector 8 in a confocal arrangement behind the focusing lens
- the stimulation laser beam 14 forms here a further component of the light beam 7 and is to be connected via a further Color h l ller l 1 5 a coupled.
- each of the trigonometric pulses of the stimulation laser beam 14 in the image 17 of the pupil of the optic 4 is modulated with a phase plate 13 in such a way that the integral of the electric field across this image 17 of the pupil is zero. If this condition is met exactly, the intensity distribution of the stimulation laser beam 14 at the geometric focal point of the light beam 7 in the object 6 has a zero at which he the excitation of fluorescent dye in the object 6 by the excitation laser beam 2 unlike in the environment of the geometric focus does not extinguish.
- the detection light 1 1 can be obtained until it is confined below the diffraction limit.
- the scanning arrangement 16 is not arranged around the image 17 of the pupil of the optics 4, but around the intermediate image 18. In a scanning light microscope, this region is usually particularly easily accessible.
- this fulcrum may still lie in the not shown here pupil of the optics 4, so that the condition that the integral of the electric field of the stimulation laser beam 14th is zero over the pupil of the focusing optics, even when scanning the object 6 is maintained.
- the first lens of the focusing optics 4 is not a scanning lens in the narrower sense and is therefore referred to here as a collimating lens 20.
- the scanning light microscope sketched in FIG. 4 has the detector 8 in transmitted light arrangement behind the object 6 and a further objective 39. That is, the detection light 1 1 from the object 6 is not scanned here with the scanner assembly 16. Accordingly, the detector 8 is not in a confocal arrangement, but may have a two-dimensional sensor array for recording an image of the object 6, wherein the spatial assignment takes place via the pixels of the sensor array. Otherwise, the structure of the scanning light microscope according to FIG. 4 corresponds to that of FIG. 2.
- the four deflection angles 31 to 34 according to FIG. 1 are to be determined, with which the conditions are satisfied that the desired point is hit in the object space and that the light beam 7 passes through the center of the pupil of the focusing optics 4 runs.
- These deflection angle quadruples are determinable by conventional means and in an associated control for the beam deflection means 26 which are not here are shown separately, storage and usable. So z. B. in a calibration phase or during the respective imaging process detectors, such as four-quadrant diodes, position sensitive diodes, CCD cameras or the like in the pupil or the spatial space or images of the same are introduced to determine the necessary An Tavernraten or functions thereof and save.
- these are then used in the actual object image in order to determine the deflection angle quadruples necessary for the beam deflecting means point by point or interpolating.
- a point-by-point determination of the interpolative definition is to be preferred, since an interpolation proceeds from at least continuous ratios which, for example, do not have to be present in the case of local aberrations.
- the calibration thus largely eliminates both optical distortion as well as inaccuracies of the beam positions caused by mechanical inaccuracies in the structure.
- the requirements on the inherent accuracies of the parts used, as well as in the opto-mechanical system design and in the adjustment are substantially reduced.
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Abstract
Zur dynamischen Verlagerung eines Lichtstrahls (7) gegenüber einer den Lichtstrahl fokussierenden Optik, um ein Objekt mit dem fokussierten Lichtstrahl (7) in einem zweidimensionalen Abtastbereich abzutasten, wird der Lichtstrahl (7) gegenüber der optischen Achse der Optik in zwei verschiedenen Richtungen in zwei hintereinander liegenden Punkten je Richtung um zwei sich unabhängig voneinander dynamisch verändernde Ablenkwinkel (31 und 32 bzw. 33 und 34) abgelenkt.
Description
VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR DYNAMISCHEN VERLAGERUNG EINES LICHTSTRAHLS GEGENÜBER EINER DEN LICHTSTRAHL FOKUSSIERENDEN OPTIK
TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur dynamischen Verlagerung eines Lichtstrahls gegenüber einer den Lichtstrahl fokussierenden Optik mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 sowie auf ein entsprechendes Verfahren zur dynamischen Verlagerung eines Lichtstrahls gegenüber einer den Lichtstrahl fokussierenden Optik mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 8.
Die Erfindung fällt dabei insbesondere auf das Gebiet der Lichtrastermikroskopie, bei der ein Objekt mit dem fokussierten Lichtstrahl, in der Regel einem fokussierten Laserstrahl, abgetastet wird. Dieses Abtasten wird auch als Scannen oder Rastern bezeichnet, und eine entsprechende Vorrichtung ist auch als Strahlscanner, Laserscanner oder Rasterscanner bekannt.
STAND DER TECHNIK
In der frühen konfokalen Lichtrastermikroskopie, die den Vorteil hat, dass außerhalb der Fokalebene des Mikroskopobjektivs liegende Objektteile nicht unscharf und damit störend dem Bild des interessierenden Objekts in der Fokalebene überlagert werden, wurden sogenannte Objektscanner verwendet, die das jeweilige Objekt relativ zu dem ruhenden Lichtstrahl bewegen. Eine solche Anordnung ist in der US 3,013,467 beschrieben. Die Verwendung eines Objektscanners erlaubt zwar eine einfache, statische Optik. Trägheitsbedingt ermöglicht ein Objektscanner jedoch nur vergleichsweise geringe Abtastgeschwindigkeiten und entsprechend
geringe Bildraten. Praktisch sind die Abtastgeschwindigkeiten in der Biologie oder Medizin nur für tote fixierte Proben ausreichend.
Für die Abbildung lebender Zellstrukturen in biologischen Proben werden in konfokalen Lichtrastermikroskopen daher Strahlrasterverfahren angewandt, bei denen der Lichtstrahl, in aller Regel ein Laserstrahl, gegenüber der ihn anschließend fokussierenden Optik mit Strahlablenkungsmitteln so abgelenkt wird, dass er um einen Punkt in der Pupillenebene der fokussierenden Optik verdreht wird, die hier kurz als Pupille bezeichnet wird, um ihn in der Fokalebene des Mikroskopobjektivs zu verlagern. Bei Mikroskopobjektiven höherer Vergrößerung liegt jedoch die Pupille im Objektiv selbst und ist somit mechanisch nicht zugänglich. Daher muss der verwendete Rastermechanismus in eine optische Abbildung der Pupille des Objektivs verlegt werden. Wenn der Strahldrehpunkt nicht genau in der Pupille der fokussierenden Optik liegt, nimmt die Bildhelligkeit zum Rand des Abtastbereichs hin stark ab, was nicht tolerabel ist.
In der Pupille der fokussierenden Optik bzw. einer Abbildung der Pupille der Optik kann jeweils nur ein Strahlablenkungsmittel angeordnet werden. Um mit einem solchen einzigen Strahlablenkungsmittel in Form eines Spiegels den Abtastbereich in zwei Richtungen abzutasten, ist es aus der DE 84 28 200 LM bekannt, den Spiegel kardanisch so zu lagern, dass er um den Auftreffpunkt des einfallenden Lichtstrahls in zwei zueinander senkrechten Richtungen verschwenkbar ist. Die mechanische Ausführung dieses bekannten Rasterscanners erlaubt aber keine hohen Abtastgeschwindigkeiten, und auch die mögliche Präzision ist begrenzt.
Grundsätzlich ist es möglich, zwei Abbildungen der Pupille der fokussierenden Optik vorzusehen und in jeder Pupillenabbildung ein Strahlablenkungsmittel anzuordnen, das den Lichtstrahl in einer von zwei Richtungen gegenüber der fokussierenden Optik ablenkt. Hierdurch wird jedoch der optische Aufbau komplex, mit negativen Auswirkungen auf die optische Trans- mission.
Wird einer von zwei getren nte Drehspiegel , die um orthogonale Schwen kachsen verschwenkbar sind, oder werden diese sogar beide nur nahe einer einzigen Abbildung der Pupille einer nachgeschalteten fokussierenden Optik angeordnet, resultieren hieraus neben einer variierenden Bildhelligkeit geometrische Verzeichnung und chromatische Fehler.
Einen Überblick über bekannte Laserscanner gibt James B. Pawley: "Handbook of Biological Confocal Microscopy", 3. Auflage, Springer Verlag, ISBN 10. 0-387-25921 -X, ISBN 13: 987- 0387-25921-5.
Aus der DE 40 26 130 A1 sind eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unab- hängigen Patentanspruchs 1 und ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 8 bekannt, bei denen ein Laserstrahl durch zwei Drehspiegel, deren Schwenkbewegung um parallele Schwenkachsen gemäß einer festen mathematischen Beziehung gekoppelt ist, in einer Richtung so abgelenkt wird, dass er um einen festen Auftreffpunkt auf einen weiteren Drehspiegel verdreht wird. Durch Verschwenken dieses weiteren Drehspiegels wird der Laserstrahl in der zweiten Richtung abgelenkt. Wenn der Auftreffpunkt dabei in der Eintrittspupille der nachgeschalteten fokussierenden Optik liegt, fällt der gemeinsame Drehpunkt des Laserstrahls in beide Richtungen in die Pupille der fokussierenden Optik.
Eine weitere Vorrichtung mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patent- anspruchs 1 u nd ein weiteres Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 8 sind aus der DE 196 54 210 A1 bekannt. Hier sind zum
Ablenken des Lichtstrahls in der ersten Richtung zwei in einer vorgegebenen Winkelposition drehfest zueinander angeordnete Spiegel vorgesehen, die so gemeinsam um die optische
Achse eines einfallenden Laserstrahls verschwenkbar sind, dass dieser in einem festen Punkt auf einen auf der verlängerten optischen Achse des einfallenden Laserstrahls angeordneten weiteren Drehspiegel fällt, der um eine orthogonal zu dem einfallenden Lichtstrahl und dem abgelenkten Lichtstrahl verlaufenden Schwenkachse verschwenkbar ist. Durch Anordnung des weiteren Drehspiegels in einer Abbildung der Pupille der nachgeschalteten fokussierenden
Optik wird der Lichtstrah l in beiden Richtungen um einen einzigen Punkt in dieser Pupillenabbildung verdreht. Bei dieser bekannten Vorrichtung können weitere Spiegel vorgesehen sein, um den fokussierten Laserstrahl um die optische Achse des einfallenden
Laserstrahls zu verdrehen.
In jüngerer Zeit sind Verfahren der hochauflösenden Lichtrastermikrokopie aufgekommen, mit denen Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze erreicht werden. Ein Beispiel hierfür ist die STED (Stimulated Emission Depletion)-Mikroskopie, wie sie in der WO 95/21393 A beschrieben ist. Diese neueren Verfahren stellen an die Abbildung des Laserstrahls, mit dem der
- A -
Abtastbereich abgetastet wird, in die Pupille einer fokussierenden Optik wesentlich höhere Anforderungen als die herkömmliche Lichtrastermikroskopie. So wird in der STED-Mikroskopie ein erster Fluoreszenzanregungslaserstrahl zur Fluoreszenzanregung wie bei der konfokalen Lichtrastermikrokopie verwendet. Zusätzlich wird jedoch ein zweiter Stimulationslaserstrahl eingesetzt, der die Fluoreszenz im Randbereich des beugungsbegrenzten Lichtflecks des Anregungslichts löscht. Dazu wird die Intensitätsverteilung des Stimulationslichts in der Fokalebene z. B. ringförmig gestaltet. Um in der Mitte der Intensitätsverteilung des Stimulationslichts eine Nullstelle zu erreichen, wird das elektrische Feld des Stimulationslaserstrahls mit sogenannten Phasenplatten oder -modulatoren räumlich so in einer Abbildung der Pupille des Objektivs moduliert, dass das Integral des elektrischen Felds über der Pupille verschwindet. Für die praktische Durchführung der STED-Mikroskopie muss die Restlichtintensität in der Nullstelle des Stimulationsstrahls unter einem Prozent der maximalen Umgebungshelligkeit liegen, um nicht auch das interessierende Messsignal aus dem Fokuspunkt zu löschen. Die räumliche Phasenstruktur des Stimulationsstrahls in der Pupille darf sich entsprechend beim Abtasten des Abtastbereichs durch Ablenken des Lichtstrahls nur um geringste Bruchteile, in der Praxis maximal etwa ein Tausendstel des Pupillendurchmessers, verschieben. Dieses Kriterium ist mittels der bekannten Laserscanner falls überhaupt nur mit extremem Aufwand, d. h. hochwertigsten optischen Komponenten für die Drehspiegel und die fokussierende Optik, zu erreichen.
Aus der US 2006/0151449 A1 sind ein System und ein Verfahren zum Abtasten einer Oberfläche mit einem parallelen Strahl bekannt. Ein kollimierter Lichtstrahl, beispielsweise von einem Laser, wird mit zwei Paaren von Lichtablenkungsmitteln, wie beispielsweise Spiegeln, lateral zu seiner optischen Achse parallelverschoben. Die Strahlablenkungsmittel sind nacheinander um zwei zueinander parallele und quer zu dem Lichtstrahl verlaufende Schwenk- achsen und um zwei weitere zueinander parallele und quer zu dem Lichtstrahl, aber auch quer zu den ersten Schwenkachsen verlaufende Schwenkachsen verschwenkbar. Dabei werden die beiden Strahlablenkungsmittel, die um zueinander parallele Schwenkachsen verschwenkbar sind, jeweils um gleiche Winkel gleichsinnig verschwenkt, um die Parallelverschiebung des Laserstrahls zu bewirken, so dass beispielsweise Drehspiegel als Strahlablenkungsmittel in jeder Betriebsstellung des bekannten Systems bezüglich ihrer Oberflächennormalen paarweise antiparallel zueinander ausgerichtet sind. Eine Fokussierung des Lichtstrahls erfolgt nicht.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 und ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 8 aufzuzeigen, mit denen es ohne großen prak- tischen oder apparativen Aufwand möglich ist, den Lichtstrahl um einen festen Drehpunkt in der Pupille der fokussierenden Optik in zwei Richtungen zu verdrehen, um den zweidimensionalen Abtastbereich ohne Variation der optischen Verhältnisse über dem Abtastbereich abzutasten.
LÖSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 8 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen der neuen Vorrichtung sind in den abhängigen Patentansprüchen 2 bis 7 beschrieben, während die abhängigen Patentansprüche 9 bis 15 bevorzugte Ausführungsformen des neuen Verfahrens betreffen.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei der neuen Vorrichtung sind je Richtung, in der der Lichtstrahl gegenüber der optischen Achse der fokussierenden Optik abgelenkt werden soll, um ihn in dieser Richtung innerhalb des Abtastbereichs zu verschieben, mindestens und auch vorzugsweise zwei Strahlablenkungsmittel hintereinander geschaltet. Die beiden Strahlablenkungsmittel lenken den Lichtstrahl zwar in derselben Ebene, aber an zwei hintereinander liegenden Punkten um jeweils einen Ablenk- winkel ab. Dabei sind diese beiden Ablenkwinkel unabhängig voneinander dynamisch veränderbar. Aus der Kombination der unabhängigen dynamischen Veränderbarkeit der beiden Ablenkwinkel heraus kann sowohl die Strahllage des Lichtstrahls in der jeweiligen Richtung in der Pupille der fokussierenden Optik als auch der Winkel des Lichtstrahls zu der optischen Achse der fokussierenden Optik und damit die Lage des fokussierten Lichtstrahls in dem Abtastbereich eingestellt werden. Dies bedeutet insbesondere, dass die Strahllage in der Pupille beim Abtasten des Abtastbereichs festgehalten werden kann. Diese Möglichkeit besteht für beide Richtungen, in denen der Lichtstrahl abgelenkt werden muss, um den Abtastbereich abzutasten, grundsätzlich unabhängig davon, wie nahe die Ablenkmittel von der Pupille oder einer Pupillenabbildung der fokussierenden Optik entfernt sind. Die Ablenkmittel können damit
insbesondere an einer sowieso freien Stelle des Strahlengangs angeordnet werden. Es muss für sie kein extra Platz geschaffen und insbesondere müssen für sie keine extra Pupillenabbildungen durchgeführt werden.
Durch die mit Hilfe der zwei unabhängig voneinander wirkenden Strahlablenkungsmittel bereitgestellten Freiheitsgrade sind nicht nur Abstände der Ablenkungsmittel zu der Pupille oder einer Pupillenabbildung der fokussierenden Abbildung kompensierbar, sondern auch Linsenfehler der fokussierenden Optik und/oder Fehler der Strahlablenkungsmittel selbst. Das heißt, bei der neuen Vorrichtung sind die Kriterien des Verschwenkens des Lichtstrahls um einen festen Punkt in der Pupille der Optik sogar genauer einzuhalten als mit einem idealen Spiegel in deren Pupille, da ein solcher Spiegel Abbildungsfehler der Optik anders als die hintereinander geschalteten zwei Strahlablenkungsmittel je Richtung nicht kompensieren kann. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann der Drehpunkt des abgelenkten Lichtstrahls auch gezielt in axialer Richtung vorgegeben , beziehungsweise verlegt werden, um so z. B. unterschiedliche axiale Lagen verschiedener Objektive zu berücksichtigen.
Um diese Kompensationsmöglichkeiten auszunutzen, ist eine Steuerung für die Strahlablenkungsmittel vorgesehen, die die vier Ablenkwinkel der insgesamt mindestens vier Strahlablenkungsmittel für jeden Punkt des Abtastbereichs festlegt. Dabei gehört zu jedem Punkt des Abtastbereichs ein fester Wert für jeden der vier Ablenkwinkel. Insoweit sind die vier Ablenkwin kel unterei nander korreliert. Sie ändern sich jedoch beim Abtasten des Abtastbereichs nicht in festen Beziehungen zueinander, sondern so, dass jeweils für jeden Punkt die idealen vier Ablenkwinkel eingestellt werden.
Die idealen Ablenkwinkel für jeden Punkt des Abtastbereichs werden von der Steuerung so festgelegt, dass der Lichtstrahl immer an derselben Stelle durch die Pupille der fokussierenden Optik verläuft. Vorzugsweise verläuft er mit seinem Schwerpunkt durch das Zentrum der Pupille.
Die beim Abtasten des Abtastbereichs aufeinander folgenden Werte der vier Ablenkwinkel werden von der Steuerung vorzugsweise so festgelegt, dass der Abtastbereich mit dem fokussierten Lichtstrahl in einem vorgegebenen Muster abgetastet wird. Dieses vorgegebene Muster besteht z. B. aus exakt parallelen Linien gleichen Abstands, längs derer der fokussierte Laserstrahl mit konstanter Geschwindigkeit bewegt wird. Ein solches verzerrungsfreies Muster
erlaubt es, ein aus dem Bereich des fokussierten Lichtstrahls kommendes Messsignal allein aufgrund seines Zeitpunkts exakt einem bestimmten Ort des Abtastbereichs zuzuordnen.
Um bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Werte der vier Ablenkwinkel für jeden Punkt des Abtastbereichs zu gewinnen, können eine Strahllageerfassungseinrichtung zur Erfassung einer Strahllage in der Pupille oder einer Abbildung der Pupille der Optik und eine weitere Strahllageerfassungseinrichtung zur gleichzeitigen Erfassung einer Strahllage in dem Abtastbereich oder einer Abbildung des Abtastbereichs vorgesehen sein. So kann überwacht werden, dass die Strahllage in der Pupille konstant bleibt und den dabei eingestellten Ablenkwinkeln eine bestimmte Strahllage in dem Abtastbereich zugeordnet wird. Hieraus können in um- gekehrter Richtung die Abfolgen der Werte der vier Ablenkwinkel festgelegt werden, die erforderlich sind, um den Abtastbereich in einem gewünschten Muster abzutasten.
Die Strahlablenkungsmittel der erfindungsgemäßen Vorrichtung können grundsätzlich an beliebiger Stelle auf den Lichtstrahl einwirken, um diesen abzulenken. Verschiedene Stellen des Lichtstrahls erweisen sich jedoch als besonders günstig, um den Lichtstrahl genau in der hier gewünschten Weise abzulenken. Hierzu zählen alle Stellen, an denen der Lichtstrahl kollimiert ist. Anders als bei dem aus der US 2006/0151449 A1 bekannten Verfahren wird ein kollimierter Lichtstrahl bei der vorliegenden Erfindung jedoch gegenüber der optischen Achse der ihn anschließend fokussierenden Optik verkippt, um das Kriterium einzuhalten, dass der Lichtstrahl immer an derselben Stelle durch die Pupille der Optik verläuft.
Wenn die Strahlablenkungsmittel der erfindungsgemäßen Vorrichtung auf einen zuvor fokussierten Lichtstrahl einwirken, verschieben sie den fokussierten Lichtstrahl gegenüber der optischen Achse der Optik lateral, um dasselbe Kriterium einzuhalten. Die hierbei auftretende Änderung der Strahllänge des Lichtstrahls wirkt sich jedoch nicht in eine axiale Verlagerung des Fokus des Lichtstrahls von gleicher Größe aus. Die effektive laterale Verlagerung des Fokus ist p ro po rti on a l z u r B i l d ve rkl e i n e ru n g d e r fok u s s i e ren d e n O pti k zwi sc h e n d e n Strahlablenkungsmitteln und dem Fokus des Lichtstrahls. Die axiale Verlagerung des Fokus ist hingegen proportional zum Quadrat der Bildverkleinerung. Das bedeutet, dass bei der vorliegenden Vorrichtung der axiale Fokusfehler im Objektraum um den Vergrößerungsfaktor der Optik zwischen dem Objektraum und den Strahlablenkungsmitteln reduziert ist. In einem Mikroskop mit einem beispielsweise 100-fach vergrößernden Objektiv, durch das hindurch der Lichtstrahl in Verkleinerungsrichtung fokussiert wird, wird der im Objektraum wirksame axiale
Fokusfehler, der durch die laterale Auslenkung des Lichtstrahls verursacht wird, auf ein Hundertstel und damit auf vernachlässigbar kleine Werte reduziert.
Bei zuvor fokussiertem Lichtstrahl können die Strahlablenkungsmittel um eine Abbildung der Pupille der Optik herum angeordnet sein , wobei nichts dagegen spricht, eines der Strahlablenkungsmittel genau in der Pupillenabbildung vorzusehen. Besonders günstig ist es bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung jedoch, dass die Strahlablenkungsmittel auch um ein Zwischenbild des Abtastbereichs herum angeordnet sein können, wobei auch hier eines der Strahlablenkungsmittel genau in dem Zwischenbild angeordnet sein kann. Ein solches Zwischenbild ist in Rastermikroskopen häufig frei zugänglich, was die typische Größe von Strahlablenkungsmitteln z. B. in Form galvanometergetriebener Drehspiegel anbelangt. Derartige Drehspiegel sind bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorzugsweise so ausgebildet, dass sie um eine in ihrer Spiegelebene verlaufende Schwenkachse verschwenkbar sind. Die beiden Strahlablenkungsmittel jeder Richtung in Form von Drehspiegeln sind dann entsprechend um parallele Schwenkachsen verschwenkbar.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Lichtstrahl je Richtung, in der der Abtastbereich abzutasten ist, an zwei hintereinander liegenden Punkten um zwei sich unabhängig voneinander dynamisch verändernde Ablenkwinkel abgelenkt. Dabei wird der Lichtstrahl um die insgesamt vier Ablenkwinkel vorzugsweise so abgelenkt, dass er immer an derselben Stelle durch die Pupille der ihn fokussierenden Optik hindurch tritt. Weiter ist es bevorzugt, dass der Lichtstrahl um die insgesamt vier Ablenkwinkel so abgelenkt wird, dass der Abtastbereich mit dem fokussierten Lichtstrahl in einem vorgegebenen verzerrungsfreien Muster abgetastet wird. Um dies zu ermöglichen, müssen die vier Ablenkwinkel für jeden Punkt des Abtastbereichs bestimmt und gespeichert werden, weil ihre Idealwerte auch Abbildungsfehler der Optik und Fehler der zum Ablenken des Lichtstrahls verwendeten Ablenkmittel berücksichtigen. Um die vier Ablenkwinkel für jeden Punkt des Abtastbereichs zu bestimmen, kann eine Strahllage des Lichtstrahls in der Pupille oder eine Abbildung der Pupille erfasst werden, um sie konstant zu halten, während gleichzeitig eine Strahllage in dem Abtastbereich oder einer Abbildung des Abtastbereichs erfasst wird, um für die jeweils eingestellten Ablenkwinkel den mit dem Lichtstrahl erreichten Ort des Abtastbereichs zu erfassen. Hieraus kann dann in umgekehrter Richtung eine Abfolge der vier Ablenkwinkel festgelegt werden, um den Abtastbereich in einem gewünschten Muster abzutasten.
Bereits im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wurde darauf hingewiesen, dass bei der vorliegenden Erfindung der Ort des Ablenkens des Lichtstrahls nicht besonders kritisch ist, wenn auch bestimmte Orte hierfür bevorzugt sind. Dazu zählen die Bereiche, in denen der Lichtstrahl kollimiert ist. Ein weiterer günstiger Ort liegt bei der Pupille der Optik (falls zugänglich) oder jeder Abbildung der Pupille der Optik. Insbesondere ist es aber mit der vorliegenden Erfindung auch möglich, die Ablenkung des Lichtstrahls im Bereich eines Zwischenbilds des Abtastbereichs vorzunehmen und dennoch den effektiven Drehpunkt des Lichtstrahls gegenüber der optischen Achse der fokussierenden Optik in die Pupille zu verschieben.
Während die vorliegende Erfindung nicht auf bestimmte Anwendungen beschränkt ist, erweist sie sich doch bei der hochauflösenden Rasterlichtmikroskopie als besonders vorteilhaft, wenn das elektrische Feld bei mindestens einer Komponente des kohärenten Lichtstrahls derart moduliert wird, dass das Integral des elektrischen Felds über der Pupille der fokussierenden
Optik null ist. Dieses Kriterium für das Integral des elektrischen Felds, mit dem z. B. eine
Intensitätsverteilung eines Stimulationslaserstrahls bei der STED-Mikroskopie eingestellt wird, die eine Nullstelle am geometrischen Fokuspunkt des Lichtstrahls aufweist, ist extrem empfindlich gegenüber einem mit der vorliegenden Erfindung leicht vermeidbaren Versatz des
Lichtstrahls gegenüber der Pupille der fokussierenden Optik. Dabei ist die vorliegende
Erfindung nicht auf sehr hochwertige optische Bauteile für die fokussierende Optik oder die
Strahlablenkungsmittel angewiesen, weil durch den Freiheitsgrad aufgrund der jeweils zwei Strahlablenkungen je Richtung, in der der Abtastbereich abgetastet wird, alle auftretenden
Fehler kompensiert werden können.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen - insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren
Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert und beschrieben.
Fig. 1 zeigt eine Anordnung von vier galvanometergetriebenen Drehspiegeln, wie sie bei der vorliegenden Erfindung als Strahlablenkungsmittel zur Anwendung kommen können.
Fig. 2 skizziert ein konfokales Lichtrastermikroskop, bei dem die Erfindung im Bereich einer Abbildung der Pupille der fokussierenden Optik realisiert ist.
Fig. 3 zeigt den Aufbau eines STED-Rasterlichtmikroskops, bei dem die Erfindung im
Bereich eines Zwischenbilds der fokussierenden Optik realisiert ist.
Fig. 4 skizziert ein Lichtrastermikroskop mit Detektion im Durchlichtverfahren, bei dem die Erfindung im Bereich einer Abbildung der Pupille der fokussierenden Optik realisiert ist; und
Fig. 5 skizziert die aufgrund der Erfindung gegebene Möglichkeit eines adaptiven
Abtastverfahrens.
FIGURENBESCHREIBUNG
Fig. 1 zeigt eine Scananordnung 16 von vier jeweils durch ein Galvanometer 40 getriebenen Drehspiegeln 22 bis 25, die bei der vorliegenden Erfindung als Strahlablenkungsmittel 26 für einen Lichtstrahl 7 zum Einsatz kommen können. Dabei lenken jeweils zwei Ablenkungsmittel 26, hier die Drehspiegel 22 und 23 einerseits und die Drehspiegel 24 und 25 andererseits, den Lichtstrahl 7 in zwei aufeinander folgenden Punkten um Ablenkwinkel 31 und 32 bzw. 33 und 34, in jeweils einer Richtung um, d. h . die Ablenkwinkel 31 und 32 einerseits und die
Ablenkwinkel 33 und 34 andererseits liegen im Wesentlichen in einer Ebene. Dazu sind die Drehspiegel 22 und 23 um zwei parallele Schwenkachsen 27 und 28 verschwenkbar, während die Drehspiegel 24 und 25 um zwei zu den Schwenkachsen 27 und 28 im Wesentlichen orthogonal und zueinander parallel verlaufende weitere Schwenkachsen 29 und 30 verschwenkbar sind. Alle Schwenkbewegungen der Drehspiegel 22 bis 25 um die Schwenkachsen 27 bis 30 sind dabei unabhängig voneinander möglich. Dadurch ist nicht nur die Winkellage des austretenden Lichtstrahls 7 zu der optischen Achse einer sich an die Scananordnung 16 anschließenden, den Lichtstrahl 7 fokussierenden Optik in beiden lateralen Richtungen einstellbar, sondern auch die Lage des Drehpunkts des Lichtstrahls 7 in Längsrichtung der optischen Achse. So kann dieser Drehpunkt durch die Ansteuerung der Ablenkmittel 26 bei allen Veränderungen der Winkellage des Lichtstrahls 7 ortsfest gehalten werden. Insbesondere kann er an dem Ort einer Abbildung 17 der Pupille der sich anschließenden fokussierenden Optik festgehalten werden. Dies ist besonders einfach möglich, wenn die Ablenkmittel 26 um diesen Ort der Abbildung 17 herum angeordnet sind, wie dies in Fig. 1 dargestellt ist. Die in Fig. 1 als Strahlablenkungsmittel 26 wiedergegebenen galvanometergetriebenen Drehspiegel 22 bis 25 sind nur ein konkretes Beispiel für die Umsetzung der vorliegenden Erfindung. Alternativ können als Strahlablenkungsmittel 26 auch akustooptische oder elektrooptische Strahlablenkungsmittel, piezoelektrisch angetriebene Spiegel, sogenannte MEMS (Micro- Electro-Mechanical-Systems) und dergleichen eingesetzt werden.
Fig. 2 skizziert die Integration der Scananordnung 16 in ein konfokales Rasterlichtmikroskop. Ein Fluoreszenzanregungslaser 1 gibt einen Fluoreszenzanregungslaserstrahl 2 ab, der über einen Farbstrahlteiler 3 als Lichtstrahl 7 durch die Scanneranordnung 16 in eine fokussierende Optik 4 gelenkt wird, die ihn in ein Objekt 6 fokussiert. Die fokussierende Optik 4 ist hier aus einer Abtastlinse 21 , einer Tubuslinse 19 und einem Objektiv 5 aufgebaut und bildet das Objekt 6 in einem Zwischenbild 18 ab. Das von dem Objekt 6 zurücklaufende Detektionslicht 11 wird von der Scananordnung 16 entscannt und von einem Detektor 8 in konfokaler Anordnung erfasst, die durch eine Fokussierlinse 10 und eine dahinter angeordnete Lochblende 9 realisiert ist.
Das in Fig. 3 skizzierte STED-Fluoreszenzlichtmikroskop erfasst das Detektionslicht 1 1 von dem Objekt 6 ebenfalls mit dem Detektor 8 in konfokaler Anordnung hinter der Fokussierlinse
10 und der Lochblende 9. Hier ist zusätzlich zu dem Aufbau gemäß Fig. 2 ein Stimulationslaser
12 vorgesehen, der einen Stimulationslaserstrahl 14 abgibt. Der Stimulationslaserstrahl 14
bildet hier eine weitere Komponente des Lichtstrahls 7 aus und wird dazu über einen weiteren Farbstra h ltei l er 1 5 e i n gekoppelt. Zuvor wi rd j ed och d as el e ktri sch e Fe l d d es Stimulationslaserstrahls 14 in der Abbildung 17 der Pupille der Optik 4 mit einer Phasenplatte 13 derart moduliert, dass das Integral des elektrischen Felds über dieser Abbildung 17 der Pupille null ist. Wenn diese Bedingung exakt eingehalten wird, weist die Intensitätsverteilung des Stimulationslaserstrahls 14 an dem geometrischen Fokuspunkt des Lichtstrahls 7 in dem Objekt 6 eine Nullstelle auf, an der er die Anregung von Fluoreszenzfarbstoff in dem Objekt 6 durch den Anregungslaserstrahl 2 anders als in der U mgebung des geometrischen Fokuspunkts nicht auslöscht. Hierdurch wi rd d er rä u m l ich e Berei ch , au s d em das Detektionslicht 1 1 stammen kann, bis unter die Beugungsgrenze eingegrenzt. Weiterhin ist in Fig. 3 abweichend von Fig. 2 die Scananordnung 16 nicht um die Abbildung 17 der Pupille der Optik 4 herum angeordnet, sondern um das Zwischenbild 18. Dieser Bereich ist bei einem Rasterlichtmikroskop üblicherweise besonders gut zugänglich. Durch die Freiheitsgrade der Scanneranordnung 16 bezüglich der Lage des Drehpunkts, um den herum der Lichtstrahl 7 effektiv verdreht wird, kann dieser Drehpunkt trotzdem in der hier nicht eingezeichneten Pupille der Optik 4 liegen, damit die Bedingung, dass das Integral des elektrischen Felds des Stimulationslaserstrahls 14 über die Pupille der fokussierenden Optik Null ist, auch beim Abtasten des Objekts 6 erhalten bleibt. Durch die Verlagerung der Scanneranordnung 16 ist die erste Linse der fokussierenden Optik 4 hier keine Abtastlinse im engeren Sinne und wird hier daher als Kollimationslinse 20 bezeichnet.
Das in Fig. 4 skizzierte Rasterlichtmikroskop weist den Detektor 8 in Durchlichtanordnung hinter dem Objekt 6 und einem weiteren Objektiv 39 auf. Das heißt, das Detektionslicht 1 1 von dem Objekt 6 wird hier nicht mit der Scanneranordnung 16 entscannt. Entsprechend befindet sich der Detektor 8 nicht in einer konfokalen Anordnung, sondern kann ein zweidimensionales Sensorarray zur Aufzeichnung einer Abbildung des Objekts 6 aufweisen, wobei die räumliche Zuordnung über die Bildpunkte des Sensorarrays erfolgt. Ansonsten entspricht der Aufbau des Rasterlichtmikroskops gemäß Fig. 4 demjenigen gemäß Fig. 2.
Für jeden abzutastenden Punkt des Objekts 6 sind die vier Ablenkwinkel 31 bis 34 gemäß Fig. 1 zu ermitteln, mit denen die Bedingungen erfüllt werden, dass der gewünschte Punkt im Objektraum getroffen wird und dass der Lichtstrahl 7 durch das Zentrum der Pupille der fokussierenden Optik 4 verläuft. Diese Ablenkwinkelquadrupel sind mit herkömmlichen Mitteln bestimmbar und in einer zugehörigen Steuerung für die Strahlablenkungsmittel 26, die hier nicht
separat dargestellt sind, Speicher- und nutzbar. So können z. B. in einer Kalibierphase oder auch während des jeweiligen Abbildungsprozesses Detektoren, wie beispielsweise Vier- Quadrantendioden, positionssensitive Dioden, CCD-Kameras oder dergleichen in die Pupille bzw. den Ortsraum oder Abbilder derselben eingebracht werden, um die notwendigen Ansteuerraten oder Funktionen derselben zu ermitteln und zu speichern. Im Allgemeinen werden diese dann bei der eigentlichen Objektabbildung genutzt, um die für die Strahlablenkungsmittel notwendigen Ablenkwinkelquadrupel Punkt für Punkt oder auch interpolierend festzulegen. Dabei ist eine punktweise Bestimmung der interpolierenden Festlegung vorzuziehen, da eine Interpolation von zumindest stetigen Verhältnissen ausgeht, die beispielsweise bei lokalen Abbildungsfehlern nicht vorliegen müssen. Die Kalibrierung eliminiert so weitgehend sowohl optische Abbildungsverzeichnungen, wie auch durch mechanische Ungenauigkeiten im Aufbau verursache Ungenauigkeiten der Strahllagen. Durch die Anwendung der Erfindung werden die Anforderungen an die inhärenten Genauigkeiten der verwendeten Teile, wie auch beim opto-mechanischen Systemaufbau und bei der Justage wesentlich reduziert.
Gleichzeitig wird im Betrieb eine wesentlich präzisere Strahlkontrolle möglich. So sind bei Verwendung von kleinen Drehspiegeln 22 bis 25 mit geringer Trägheit als Strahlablenkungsmittel 26 schnelle adaptive Rastermuster 36, in denen der jeweilige Abtastbereich 35 des Objekts 6 mit dem fokussierten Lichtstrahl 7 abgetastet wird, möglich. Auf diese Weise können beispielsweise dunkle Hintergrundbereiche oder aus anderen Gründen uninteressante Objektbereiche ausgelassen werden, um durch die reduzierte Bildpunkteanzahl eine höhere Bildwiederholungsrate zu erreichen. Dies ist in Fig. 5 skizziert, wo das Rastermuster 36 in dem Abtastbereich 35 so adaptiert ist, dass es eine Zelle 37 mit einem Kern 38 als Objekt 6 zwar abdeckt, aber nicht signifikant darüber hinausgeht.
BEZUGSZEICHENLISTE
Fluoreszenzanregungslaser 31 Ablenkwinkel
Fluoreszenzanregungslaserstrahl 32 Ablenkwinkel
Farbstrahlteiler 33 Ablenkwinkel fokussierende Optik 34 Ablenkwinkel
Objektiv 35 Abtastbereich
Objekt 36 Muster
Lichtstrahl 37 Zelle
Detektor 38 Kern
Lochblende 39 Objektiv
Fokussierlinse 40 Galvanometer
Detektionslicht
Stimulationslaser
Phasenplatte
Stimulationslaserstrahl
Farbstrahlteiler
Scanneranordnung
Abbild der Pupille
Zwischenbild
Tubuslinse
Koordinationslinse
Abtastlinse
Drehspiegel
Drehspiegel
Drehspiegel
Drehspiegel
Strahlablenkungsmittel
Schwenkachse
Schwenkachse
Schwenkachse
Schwenkachse
Claims
1. Vorrichtung zur dynamischen Verlagerung eines Lichtstrahls gegenüber einer den Lichtstrahl fokussierenden, eine Pupille aufweisenden Optik, um mit dem fokussierten Lichtstrahl ein Objekt in einem zweidimensionalen Abtastbereichs abzutasten, wobei die Vorrichtung Strahlablenkungsmittel aufweist, die den Lichtstrahl gegenüber der optischen Achse der Optik in zwei verschiedenen Richtungen um dynamisch veränderbare Ablenkwinkel ablenken, dadurch gekennzeichnet, dass je Richtung mindestens zwei Strahlablenkungsmittel (26) hintereinander geschaltet sind, die den Lichtstrahl (7) um zwei unabhängig voneinander dynamisch veränderbare Ablenkwinkel (31 , 32 bzw. 33, 34) ablenken, und dass eine Steuerung für die Strahlablenkungsmittel (26) vorgesehen ist, die die vier Ablenkwinkel (31 bis 34) für jeden Punkt des Abtastbereichs (35) so festlegt, dass der Lichtstrahl (7) immer an derselben Stelle durch die Pupille der Optik (4) verläuft.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung die vier Ablenkwinkel (31 bis 34) auf solche aufeinanderfolgende Werte festlegt, dass der Abtastbereich (35) mit dem fokussierten Lichtstrahl (7) in einem vorgegebenen Muster (36) abgetastet wird.
3. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, dass eine Strahllageerfassungseinrichtung zur Erfassung einer Strahllage in der Pupille oder einer Abbildung (17) der Pupille der Optik (4) und eine weitere Strahllageerfassungseinrichtung z u r gleichzeitigen Erfassung einer Strahllage in dem Abtastbereich (35) oder einer Abbildung des Abtastbereichs vorgesehen sind.
4. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, d a s s die Optik (4) den Lichtstrahl (7) vor seinem Auftreffen auf die Strahlablenkungsmittel (26) kollimiert und dass die Strahlablenkungsmittel den kollimierten Lichtstrahl (7) gegenüber der optischen Achse der Optik (4) verkippen.
5. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Optik (4) den Lichtstrahl (7) vor seinem Auftreffen auf die Strahlablenkungsmittel (26) fokussiert und dass die Strahlablenkungsmittel den fokussierten Lichtstrahl (7) gegenüber der optischen Achse der Optik (4) lateral verschieben.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlablenkungsmittel (26) um eine Abbildung (17) der Pupille der Optik (4) herum oder um ein Zwischenbild (18) des Abtastbereichs (35) herum angeordnet sind.
7. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Strahlablenkungsmittel (26) Drehspiegel (22 bis 25) umfassen, die um eine in ihrer Spiegelebene oder parallel dazu verlaufende Schwenkachse (27 bis 30) verschwenkbar sind.
8. Verfahren zur dynamischen Verlagerung eines Lichtstrahls gegenüber einer den Lichtstrahl fokussierenden Optik, um das Objekt mit dem fokussierten Lichtstrahl in einem zweidimensionalen Abtastbereichs abzutasten, insbesondere unter Verwendung einer Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Lichtstrahl gegenüber der optischen Achse der Optik in zwei verschiedenen Richtungen um sich dynamisch ändernde Ablenkwinkel abgelenkt wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtstrahl (7) je Richtung an zwei hintereinander liegenden Punkten um zwei sich unabhängig voneinander dynamisch verändernde Ablenkwinkel (31 bis 34) so abgelenkt wird, dass der Lichtstrahl (7) immer an derselben Stelle durch die Pupille der Optik (4) verläuft.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtstrahl (7) derart abgelenkt wird, dass er mit seinem Schwerpunkt durch das Zentrum der Pupille der Optik (4) verläuft.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtstrahl (7) um die vier Ablenkwinkel (31 bis 34) so abgelenkt wird, dass der Abtastbereich (35) mit dem fokussierten Lichtstrahl (7) in einem vorgegebenen Muster (36) abgetastet wird.
1 1. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, d a ss zuvor die vier Ablenkwinkel (31 bis 34) für jeden Punkt des Abtastbereichs (35) bestimmt und gespeichert werden, wobei eine Strahllage in der Pupille oder einer Abbildung (17) der Pupille der Optik (4) und eine Strahllage in dem Abtastbereich (35) oder einer Abbildung des Abtastbereichs gleichzeitig erfasst werden.
12. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 8 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtstrahl (7) vor dem Ablenken kollimiert und durch das Ablenken gegenüber der optischen Achse der Optik (4) verkippt wird.
13. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 8 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtstrahl (7) vor dem Ablenken fokussiert und durch das Ablenken gegenüber der optischen Achse der Optik (4) lateral verschoben wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtstrahl (7) in Punkten abgelenkt wird, die um eine Abbildung (17) der Pupille der Optik (4) herum oder um ein Zwischenbild (18) des Abtastbereichs (35) herum angeordnet sind
15. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrische Feld bei mindestens einer Komponente des kohärenten Lichtstrahls (7) derart moduliert wird, dass das Integral des elektrischen Felds über der Pupille der fokussierenden Optik (4) null ist.
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