WO2010055666A1 - ニトリルヒドラターゼ変異体 - Google Patents
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- C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)
Definitions
- the present invention relates to a nitrile hydratase mutant, a gene encoding the same, a DNA containing the gene, a plasmid containing the gene, a transformant using the plasmid, and a nitrile hydratase mutant using the transformant. Relates to the method of production.
- nitrile hydratase an enzyme having nitrile hydration activity that converts nitrile groups of various compounds into amide groups by hydration, has been discovered, and many microbial strains that produce the enzyme have been disclosed.
- a plasmid capable of expressing a large amount of nitrile hydratase derived from Pseudocardia thermophila in a transformant and a cell line transformed with the plasmid have been produced.
- production of the nitrile hydratase by the cell line and production of the corresponding amide compound by contacting the cell line or the nitrile hydratase obtained therefrom with a nitrile compound are possible (Patent Document 1). reference).
- the activity value of the enzyme preparation can be increased.
- An object of the present invention is to provide a nitrile hydratase having a high initial reaction rate and enzyme stability.
- the present invention is as follows.
- [1] A nitrile hydratase variant comprising substitution of at least one amino acid with another amino acid, which improves two or more properties of nitrile hydratase by substituting three or less amino acids with one or more amino acids.
- [2] The nitrile hydratase variant according to [1], wherein the improved properties are initial reaction rate and thermal stability.
- a nitrilase mutant characterized in that when the amino acid at position 231 of the ⁇ subunit is substituted, Ala is substituted with Val.
- (Aa) The 36th Thr of the ⁇ subunit is Met, and the 126th Phe of the ⁇ subunit is Tyr.
- (Ag) 19th Ala of ⁇ subunit is Val, 71st Arg of ⁇ subunit is His, and 126th Phe of ⁇ subunit is Tyr.
- (Ah) The 36th Thr of the ⁇ subunit is Met, the 148th Gly of the ⁇ subunit is Asp, and the 204th Val of the ⁇ subunit is Arg.
- the 46th Met of the ⁇ subunit is Lys, the 108th Glu of the ⁇ subunit is Arg, and the 212th Ser of the ⁇ subunit is Tyr.
- the 48th Leu of the ⁇ subunit is Val, the 108th Glu of the ⁇ subunit is Arg, and the 212th Ser of the ⁇ subunit is Tyr.
- the 127th Leu of the ⁇ subunit is Ser, the 160th Arg of the ⁇ subunit is Trp, and the 186th Leu of the ⁇ subunit is Arg.
- the 148th Gly of the ⁇ subunit is Asp
- the 204th Val of the ⁇ subunit is Arg
- the 108th Glu of the ⁇ subunit is Asp
- the 200th Ala of the ⁇ subunit is Glu.
- the 36th Thr of the ⁇ subunit is Gly
- the 188th Thr of the ⁇ subunit is Gly.
- the 36th Thr of the ⁇ subunit is Ala
- the 48th Asn of the ⁇ subunit is Gln.
- the 150th Ala of the ⁇ subunit is Ser, and the 217th Asp of the ⁇ subunit is Cys.
- 61th Ala of ⁇ subunit is Gly, and 150th Ala of ⁇ subunit is Asn.
- the 61st Ala of the ⁇ subunit is Ser, and the 160th Arg of the ⁇ subunit is Met.
- the 160th Arg of the ⁇ subunit is Cys, and the 168th Thr of the ⁇ subunit is Glu.
- a gene encoding a nitrile hydratase comprising a gene encoding the ⁇ subunit shown in SEQ ID NO: 3 of the sequence listing and a gene encoding the ⁇ subunit shown in SEQ ID NO: 4 of the sequence listing
- a gene encoding a nitrile hydratase mutant comprising at least one base substitution selected from the base substitution positions consisting of the following (a) to (l): (A) 274th to 276th of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (B) 280th to 282nd of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (C) positions 589 to 591 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (D) 10th to 12th base sequence of SEQ ID NO: 4 (E) 69th to 71st nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 (F) 235th to 237th of the base sequence of SEQ ID NO: 4 (G) 286th to
- the gene according to any one of [9] to [12] contains at least one base substitution selected from the base substitution positions consisting of the following (aa) to (br), and has a nitrile hydratase activity.
- a gene encoding a nitrile hydratase mutant characterized by comprising: (Aa) The 106th to 108th ACG of the base sequence of SEQ ID NO: 3 is ATG, and the 376th to 378th TTC of the base sequence of SEQ ID NO: 3 is TAC. (Ab) GGC is the 442nd to 444th GGC of the base sequence of SEQ ID NO: 3, and CGC is the 610th to 612th GTC of the base sequence of SEQ ID NO: 3.
- (Ac) 151 to 153rd TTC of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is GTC, and 322nd to 324th GAG of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is GAT.
- GTC is the TC from the 352nd to 354th of the base sequence of SEQ ID NO: 4
- GAG is the 598th to 600th GCC of the base sequence of SEQ ID NO: 4.
- CGG of 478th to 480th of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is TGG
- CGG of 556th to 558th of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is CGG.
- Th to 558th CTG (Ap) 16th to 18th CTG of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is ACG, 55th to 57th GCG of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is GTG, and 376th to 376 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
- the 378 th TTC is TAC
- the 136 th to 138 th ATG of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is AAG
- the 322 th to 324 th GAG of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is CGG
- the 16th to 18th CTGs of the base sequence of SEQ ID NO: 3 are ACG
- the 55th to 57th GCGs of the base sequence of SEQ ID NO: 3 are GTG
- the 378th TTC is TAC, the 142nd to 144th CTGs of the base sequence of SEQ ID NO: 4 are GTG, the 322nd to 324th GAGs of the base sequence of SEQ ID NO: 4 are CGG, and the SEQ ID NO: 4 TAC from 634th to 636th TCC in base sequence (Ar) 16th to 18th CTG of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is GCG, 55th to 57th GCG of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is GTG, and 376th to 376 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
- the 378th TTC is TAC, the 379th to 381th CTG of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is TCG, the 478th to 480th CGG of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is TGG, and the SEQ ID NO: 4 CGG from the 556th to 558th CTG in the base sequence (As
- the 378th TTC is TAC, the 28th to 30th ACC of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is GAC, the 352nd to 354th TTC of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is GTC, and the SEQ ID NO: 4 GAG from 598th to 600th GCC in base sequence (At) 55th to 57th GCG of the base sequence of SEQ ID NO: 3 is GTG, 211st to 213th CGT of the base sequence of SEQ ID NO: 3 is CAT, 376th to 376 of the base sequence of SEQ ID NO: 3
- the 378th TTC is TAC, the 109th to 111st TTCs of the base sequence of SEQ ID NO: 4 are CTC, the 322nd to 324th GAGs of the base sequence of SEQ ID NO: 4 are GAT, and the SEQ ID NO: 4 GAG from 598th to 600th GCC in base sequence (Au) 55th to 57th GCG of the base sequence of S
- the 612st GTC is CGC
- the 121st to 123rd TTC of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is ATC
- the 151st to 153rd TTC of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is GTC
- GGC from 442th to 444th in the base sequence of SEQ ID NO: 3 is GAC
- GTC from 610th to 612th in the base sequence of SEQ ID NO: 3 is CGC, and from 322 to the base sequence of SEQ ID NO: 4.
- GAG is GAT, and 598th to 600th GCC of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 is GAG (Ax) GGG is the 106th to 108th ACG of the base sequence of SEQ ID NO: 3, and GGC is the 562nd to 564th ACC of the base sequence of SEQ ID NO: 3.
- Ay GCG is the 106th to 108th ACG of the base sequence of SEQ ID NO: 324th GAG is GAT, and 598th to 600th GCC of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 is GAG (Ax) GGG is the 106th to 108th ACG of the base sequence of SEQ ID NO: 3, and GGC is the 562nd to 564th ACC of the base sequence of SEQ ID NO: 3.
- Ay GCG is the 106th to 108th ACG of the base sequence of SEQ ID NO: 3
- CAA is the 142nd to 144th AAC of the base sequence of SEQ ID NO
- GAA is the 142nd to 144th AAC of the base sequence of SEQ ID NO: 3
- GGG is the 436th to 438th CGG of the base sequence of SEQ ID NO: 4.
- Ba The 106th to 108th ACG of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is TGG, and the 526th to 528th TAC of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 is TGC.
- Bb ATG from 526th to 528th TAC in the base sequence of SEQ ID NO: 4, and GGC from 649th to 651th GAC in the base sequence of SEQ ID NO: 4.
- the 106th to 108th ACG of the base sequence of SEQ ID NO: 3 is TCG, and the 97th to 99th GCG of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is GTG.
- (Bd) 526 th to 528 th TAC of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is GCC, and 649 th to 651 th GAC of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is GTC.
- (Be) GTG is the 118th to 120th ACG of the base sequence of SEQ ID NO: 4, and ATG is the 652nd to 654th TGC of the base sequence of SEQ ID NO: 4.
- (Bf) 97th to 99th GCG of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is ATG, and 526th to 528th TAC of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is ACC.
- CTG is the 118th to 120th ACG of the base sequence of SEQ ID NO: 4
- CTC is the 649th to 651th GAC of the base sequence of SEQ ID NO: 4.
- the 118th to 120th ACG of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is ATT, and the 181st to 183rd GCC of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is GTC.
- Bj GTG is the 334th to 336th AAG of the base sequence of SEQ ID NO: 4
- ATG is the 649th to 651th GAC of the base sequence of SEQ ID NO: 4
- Bk 181st to 183rd GCC of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 is TGG
- 649th to 651th GAC of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 is CAC
- Bl 181st to 183rd GCC of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is CTC
- 334th to 336th AAG of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is ATT.
- TCG is the GCG from the 448th to 450th positions of the base sequence of SEQ ID NO: 4
- TGT is the 649th to 651th GAC of the base sequence of SEQ ID NO: 4.
- DNA further comprising a promoter sequence required for gene expression upstream of the 5 ′ end of the gene encoding the nitrile hydratase variant according to any one of [9] to [13], A ligated DNA comprising a ribosome binding sequence contained in SEQ ID NO: 7 downstream of the 3 ′ end.
- a plasmid comprising the DNA according to [14].
- a transformant obtained by transforming a host cell with the plasmid according to [15].
- the transformant according to [16] is cultured in a medium to produce a nitrile hydratase variant based on a nitrile hydratase gene contained in a plasmid in the transformant.
- a process for producing a nitrile hydratase mutant comprising the step of:
- the above (a) to (l) Substitution of at least one amino acid with another amino acid selected from amino acid substitution positions consisting of This simultaneously improves the initial reaction rate and enzyme stability of nitrile hydratase, increases the activity value per unit weight of the enzyme preparation, and reduces the risk of enzyme deactivation due to temperature fluctuations in industrial use. can do. Therefore, the amide compound can be stably produced with a smaller amount of enzyme, and the production cost of the amide compound can be reduced.
- the present invention it is possible to provide a novel nitrile hydratase mutant having improved initial reaction rate and enzyme stability as compared with wild-type nitrile hydratase, and the production cost of the enzyme in the production cost of the amide compound can be reduced. Can be lowered.
- the nitrile hydratase variant of the present invention includes substitution of at least one amino acid with another amino acid to improve two or more properties of nitrile hydratase by substituting three or less amino acids with one or more amino acids.
- the properties improved by the nitrile hydratase mutant of the present invention include physical properties related to the reaction itself for hydrating a nitrile group and converting it to an amide group, and enzyme stability.
- Physical properties related to the reaction itself include enzyme activity, substrate specificity, Vmax, Km, and initial reaction rate.
- Enzyme stability includes thermal stability, substrate stability, and product stability.
- the nitrile hydratase variant of the present invention preferably contains a substitution of at least one amino acid with another amino acid to improve the properties of a nitrile hydratase derived from a thermophilic bacterium.
- a thermophilic bacterium one belonging to the genus Pseudocardia can be preferably used, and specifically, Pseudocardia thermophila can be mentioned.
- the nitrile hydratase variant of the present invention is a nitrile hydratase comprising an ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
- SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
- SEQ ID NO: 2 a ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
- Table I at least one amino acid substitution position selected from (a) to (l) is substituted with another amino acid.
- the nitrile hydratase mutant of the present invention can have a higher initial reaction rate and enzyme stability than the wild-type nitrile hydratase described in Patent Document 1.
- a plurality of amino acid substitutions (a) to (l) shown in Table I may be combined, or may be combined with amino acid substitutions at different positions other than (a) to (l).
- amino acid substitutions at least selected from the group consisting of (a), (c), (f), (i), (h), the 230th of the ⁇ subunit, and the 231st of the ⁇ subunit
- One amino acid may be substituted with another amino acid.
- Examples of amino acid substitutions that can be combined in (a)-(l) include, for example, those in Table II.
- the nitrile hydratase variant of the present invention further comprises the amino acid position of the nitrile hydratase of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 as shown in Table III in addition to the nitrile hydratase variant of any one of (a) to (x) above. Mutations may be included in aa) to (br).
- nitrile hydratase activity refers to nitrile hydration activity in which nitrile groups of various compounds are converted to amide groups by hydration, and more preferably activity in which acrylonitrile is converted to acrylamide.
- “improving nitrile hydratase activity” means improving the initial reaction rate.
- the “initial reaction rate” in the present invention can be confirmed as follows. First, a nitrile hydratase preparation is added to a 50 mM Tris-HCl aqueous solution (pH 8.0) containing 2.5% (v / v) acrylonitrile as a substrate. In place of the nitrile hydratase preparation, microbial cells and culture solution, or nitrile hydratase crude purified product can also be used. After the addition of nitrile hydratase, the reaction is carried out at 20 ° C. for 15 minutes. 1M phosphoric acid is added to the reaction solution to stop the reaction, and the produced acrylamide is quantified. The amount of acrylamide can be analyzed by HPLC.
- “Improvement of the initial reaction rate” in the present invention means that the initial reaction rate is significantly improved compared to wild-type nitrile hydratase and conventionally known nitrile hydratase mutants. It means that it has improved more than twice.
- enhancing enzyme stability means improving the thermal stability of nitrile hydratase.
- Nitrile hydratase with improved thermal stability is considered to have enhanced structural stability of the protein, so it also increases stability against stresses other than heating, that is, organic solvents, high concentrations of substrates, and products. It is expected that
- the “enzymatic thermostability” in the present invention can be confirmed as follows. First, the nitrile hydratase sample is heat-treated at 60 ° C. for 2 hours and then returned to 20 ° C., and a 50 mM Tris-HCl aqueous solution (pH 8.0) containing 2.5% (v / v) acrylonitrile as a substrate is added. In place of the nitrile hydratase preparation, microbial cells and culture solution, or nitrile hydratase crude purified product can also be used. The heat-treated nitrile hydratase and the substrate are mixed and reacted at 20 ° C. for 15 minutes, and the initial reaction rate is measured.
- “enhancement of thermal stability of the enzyme” means that the initial reaction rate after heat treatment is similar to that of wild-type nitrile hydratase subjected to heat treatment and conventionally known nitrile hydratase mutants. It means that it has improved significantly, specifically 1.2 times or more.
- nitrile hydratase in the present invention nitrile hydratase derived from Pseudocardia thermophila described in Patent Document 1 is preferable, and the wild-type nitrile hydratase can be expressed in a large amount in the transformant.
- MT-10822 accession number FERM BP-5785, 1-1-1 Higashi 1-1, Tsukuba City, Ibaraki Pref., National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, February 1996 Can be raised
- the conventionally known nitrile hydratase mutants in the present invention can be nitrile hydratase mutants described in Patent Documents 1 to 4.
- the nitrile hydratase mutant of the present invention has the following characteristics.
- a dimer in which an ⁇ subunit and a ⁇ subunit are associated is a basic structural unit, and the dimer further associates to form a tetramer.
- the 111th cysteine residue of ⁇ subunit is post-translationally modified to cysteine sulfinic acid (Cys-SOOH) and the 113th cysteine residue is cysteine sulfenic acid (Cys-SOH), respectively.
- the polypeptide chain of the ⁇ subunit and the cobalt atom are bonded via a to form an active center.
- the reaction can be carried out preferably in the range of 0 to 60 ° C., and the pH during the reaction is usually selected in the range of 4 to 10, preferably 6 to 9.
- the nitrile hydratase mutant of the present invention can be produced as follows.
- a plasmid containing DNA encoding a nitrile hydratase mutant is prepared, and an arbitrary host cell is transformed with this plasmid to obtain a transformant or a cell line. Subsequently, the above transformant or cell line is cultured to produce a nitrile hydratase mutant.
- the gene encoding wild-type nitrile hydratase consists of a base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and a base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
- the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing corresponds to the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
- the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
- Corresponds to the amino acid sequence consisting of A DNA encoding a nitrile hydratase variant can be obtained by base substitution of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and / or SEQ ID NO: 4.
- the amino acid substitutions (a) to (l) shown in Table I can be realized by base substitution as shown in Table IV-1.
- amino acid substitution shown in Table II can be realized by base substitution as shown in Table IV-2.
- the amino acid substitution shown in Table III can be realized by base substitution.
- the gene encoding the ⁇ subunit of the nitrile hydratase mutant as described above in addition to the gene encoding the ⁇ subunit of the nitrile hydratase mutant as described above, the gene encoding the ⁇ subunit or the nitrile hydratase mutant gene, the regulatory regions necessary for the expression of each gene and autonomous replication It is possible to have a configuration that enables production of nitrile hydratase by a transformant or a cell line obtained by transforming an arbitrary host cell, such as a region necessary for the preparation.
- An example of any host cell referred to herein is E. coli.
- control regions necessary for expression include promoter sequences (including operator sequences that control transcription), ribosome binding sequences (SD sequences), transcription termination sequences, and the like.
- promoter sequences include trp promoter of tryptophan operon derived from E. coli, lac promoter of lactose operon, PL promoter and PR promoter derived from lambda phage, and the like.
- artificially designed and modified sequences such as tac promoter and trc promoter can also be used.
- the ribosome binding sequence is preferably a sequence having TAAGGAGGT contained in SEQ ID NO: 7, and the sequence order of these control regions on the plasmid is such that the promoter sequence and the ribosome binding sequence are based on the gene encoding the nitrile hydratase variant. It is desirable to be located upstream from the 5 ′ end, and the transcription termination sequence is desirably located downstream from the gene encoding the nitrile hydratase variant. Further, the ⁇ subunit gene and the ⁇ subunit gene of the nitrile hydratase mutant may be expressed as independent cistrons by such a control region, or may be expressed as a polycistron by a common control region.
- plasmid vectors that satisfy the above requirements include pBR322, pUC18, pBluescript, pKK223-3, and pSC101, which have autonomously replicable regions in E. coli.
- a method for constructing the plasmid of the present invention by inserting a gene encoding the nitrile hydratase mutant of the present invention into such a plasmid vector together with a region necessary for the active expression of the nitrile hydratase mutant Methods for transforming host cells and methods for producing nitrile hydratase in the transformant are described in, for example, “Molecular Cloning 3rd Edition” (J. Sambrook et al; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) Common methods and host cells known in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering can be used.
- a transformant obtained by transforming the above plasmid into a desired host cell can be cultured in a medium to produce a nitrile hydratase mutant based on the nitrile hydratase gene of the plasmid.
- the host cell is Escherichia coli
- LB medium or M9 medium is generally used as a medium for culturing the transformant. More preferably, Fe medium and Co ion are added to such medium components at 0.1 ⁇ g / mL. It may be present as described above. After inoculating the transformant, it may be grown at an appropriate culture temperature (generally 20 ° C. to 50 ° C.).
- a gene encoding the nitrile hydratase variant of the present invention is expressed to produce a nitrile hydratase variant having a desired enzyme activity, a gene encoding a protein involved in the activation of nitrile hydratase is required. .
- the protein involved in the activation of nitrile hydratase is a protein having the property that the presence or absence of expression of the protein directly affects the activation of nitrile hydratase, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-253168.
- a typical example is a protein (nitrile hydratase activating protein) involved in nitrile hydratase activation derived from Pseudonocardia thermophila described in the publication.
- the sequences of the nitrile hydratase activating protein are shown in Sequence Listing: 5 and 6.
- An amide compound can be produced as follows using the nitrile hydratase mutant of the present invention. First, a transformant or a cell line that produces the nitrile hydratase mutant of the present invention is cultured, and the resulting culture solution, cells, or cell treatment product is contacted with a nitrile compound in a medium. In this way, the corresponding amide compound is produced.
- the cell-treated product as used herein refers to an extract or ground product from the transformant, a crude enzyme preparation obtained by separating the nitrile hydratase active fraction of these extract or ground product, and further purification.
- a post-separated product such as an enzyme-purified product obtained, an immobilized product obtained by immobilizing the transformant, an extract of the transformant, a ground product, or a post-separated product using an appropriate means.
- the contacting temperature is not particularly limited, but is preferably within a temperature range in which the nitrile hydratase mutant is not inactivated, and more preferably 0 ° C. to 60 ° C.
- the nitrile compound is not particularly limited as long as the nitrile hydratase variant of the present invention can act as a substrate, but preferably acetonitrile, propionitrile, acrylonitrile, methacrylonitrile, n-butyronitrile, isobutyronitrile, Representative examples thereof include nitrile compounds having 2 to 4 carbon atoms such as crotononitrile and ⁇ -hydroxyisobutyronitrile.
- the concentration of the nitrile compound in the aqueous medium is not particularly limited, and the reaction temperature is not particularly limited, but is preferably within a temperature range in which the nitrile hydratase is not deactivated, more preferably 0. ° C to 60 ° C. In order to produce an amide compound with a smaller amount of enzyme, it is preferable to use a nitrile hydratase mutant having a certain stability under the conditions for producing the amide compound.
- the inventors of the present invention have included substitution of at least one amino acid with at least one amino acid for improving two or more properties by substitution of one or more amino acids with three or less amino acids.
- a nitrile hydratase mutant was found in which both the physical properties related to the reaction itself and the enzyme stability were improved.
- the nitrile hydratase comprising the ⁇ subunit shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the ⁇ subunit shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing consists of the above (a) to (l).
- Example 1 Obtaining a nitrile hydratase expression plasmid (1) with a modified ribosome binding sequence Plasmid pPT-DB1 described in Example 3 of Patent Document 1 as a template, described in SEQ ID NOs: 7 and 8 in the sequence listing A gene fragment of about 0.7 kbp was obtained by PCR reaction using the primers. After the PCR fragment was cleaved with restriction enzymes EcoRI and NotI, the restriction fragment-treated solution was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to purify the DNA fragment.
- pPT-DB1 was cleaved with EcoRI and NotI and subjected to agarose gel electrophoresis, and only a DNA fragment of about 3.9 kbp was excised from the agarose gel.
- the about 0.7 kbp and about 3.9 kbp DNA fragments thus obtained were ligated using a DNA ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the ribosome binding sequence modified nitrile hydratase expression plasmid (1 ) was produced.
- E. coli HB101 competent cells (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (1).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and pPT-DB1 has the modified ribosome binding sequence shown in Table 1. Confirmed that.
- Transformant (1) thus obtained, and transformant containing pPT-DB1 as the base, MT-10822 (Accession No. FERM BP-5785, 1-1-1 East Tsukuba City, Ibaraki Prefecture)
- FERM BP-5785 1-1-1 East Tsukuba City, Ibaraki Prefecture
- PCR reaction no. 1 is a system of 50 ⁇ L in total containing 50 pmol each of the primer described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence listed in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing) (the composition depends on the conditions described in the mutation introduction kit)
- the conditions of heat denaturation (98 ° C.) for 15 seconds, annealing (55 ° C.) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C.) for 120 seconds were repeated 25 cycles.
- PCR reaction no. 2 is a 50 ⁇ L total system containing 50 pmol each of MUT4 primer (sequence is described in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing) and M13 primer RV (sequence is described in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing) (the composition is in the mutagenesis kit). PCR reaction no. The same operation as in No. 1 was performed.
- PCR reaction no. 1 and no When the amplified DNA product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 ⁇ L each of the reaction completed solution of No. 2, the presence of the amplified DNA product could be confirmed. Excess primer and dNTP were removed from each PCR reaction completed solution using Microcon 100 (Takara Shuzo), and then TE was added to prepare 50 ⁇ L of each solution. A total amount of 47.5 ⁇ L of an annealing solution containing 0.5 ⁇ L each of the TE solution (the composition depends on the conditions described in the mutagenesis kit) was prepared, heat denaturation treatment (98 ° C.) was performed for 10 minutes, and then to 37 ° C.
- agarose electrophoresis agarose concentration 1.0% by weight
- Cooling was performed at a constant rate over 60 minutes, followed by annealing by holding at 37 ° C. for 15 minutes.
- 0.5 ⁇ L of TaKaRa LA Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) was added to the annealing treatment solution, and heat treatment was performed at 72 ° C. for 3 minutes to complete the heteroduplex.
- the agarose piece (about 0.1 g) was finely pulverized and suspended in 1 mL of TE solution, and kept at 55 ° C. for 1 hour to completely melt the agarose. I let you. The melt was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to purify the DNA fragment, and finally dissolved in 10 ⁇ L of TE.
- the purified amplified DNA fragment of about 2 kb was cleaved with restriction enzymes EcoRI and HindIII, and the restriction enzyme treatment solution was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to purify the DNA fragment, and finally 10 ⁇ L of TE Dissolved in.
- the nitrile hydratase expression plasmid (1) in which the ribosome binding sequence described in Example 1 was modified with EcoRI and HindIII was cleaved, and agarose gel electrophoresis (using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration 0.7) %), And only a DNA fragment of about 2.7 kb was cut out from the agarose gel.
- the cut agarose piece (about 0.1 g) was finely pulverized and suspended in 1 mL of TE solution, and then kept at 55 ° C. for 1 hour to completely melt the agarose. The melt was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to purify the DNA fragment, and finally dissolved in 10 ⁇ L of TE.
- the about 2 kbp and about 2.7 kbp DNA fragments thus obtained were ligated using a DNA ligation kit (Takara Shuzo), and then transformed into an E. coli HB101 competent cell (Toyobo). .
- a DNA ligation kit (Takara Shuzo)
- Toyobo E. coli HB101 competent cell
- the above operation is performed using the primer shown in SEQ ID NO: 13 instead of the primer shown in SEQ ID NO: 9, and encodes the nitrile hydratase mutant.
- Plasmid (3) was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- a plasmid (4) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cell manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- Example 2 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (5)
- a transformant (5) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (a) and (av) as shown in Table 3, the above Reference Example 1 was obtained.
- the plasmid (2) recovered from the transformant (2) described above as a template using the primer described in SEQ ID NO: 16 in the Sequence Listing, and using the mutation introduction kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (5) encoding a hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- a transformant (5) obtained by Toyobo Co., Ltd.
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 92nd Asp of the ⁇ subunit was added to the plasmid (2) described in Reference Example 1. It was confirmed that the mutation with Glu has a newly added sequence as intended.
- Example 3 Acquisition of amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (6)
- a transformant (6) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (a) and (bc) as shown in Table 3 the above Reference Example 2 was used.
- the plasmid (3) recovered from the transformant (3) described above as a template using the primer described in SEQ ID NO: 16 in the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (6) encoding a hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (6).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 92nd Asp of the ⁇ subunit was added to the plasmid (3) described in Reference Example 2. It was confirmed that the mutation with Glu has a newly added sequence as intended.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (6) thus obtained and the transformant (3) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 4 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (7)
- a transformant (7) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (a) and (bh) as shown in Table 3, the above Reference Example 3 was used.
- the plasmid (4) recovered from the transformant (4) described above as a template using the primer described in SEQ ID NO: 16 in the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (7) encoding a hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (7).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 92nd Asp of the ⁇ subunit was added to the plasmid (4) described in Reference Example 3. It was confirmed that the mutation with Glu has a newly added sequence as intended.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (7) thus obtained and the base transformant (4) were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- a plasmid (10) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- a transformant (10) was transformed with the plasmid to obtain a transformant (10).
- Example 5 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (11) As shown in Table 5, in order to obtain a transformant (11) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (b) and (ak), the above Reference Example 4 was obtained. Using the plasmid (8) recovered from the transformant (8) described above as a template, using the primer described in SEQ ID NO: 19 in the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (11) encoding a hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (11). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 94th Met of the ⁇ subunit was added to the plasmid (8) described in Reference Example 4. It was confirmed that the mutation with a Ile has a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (11) thus obtained and the transformant (8) serving as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 6 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (12) As shown in Table 5, in order to obtain a transformant (12) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (b) and (ap), the above Reference Example 5 was used. Using the plasmid (9) recovered from the transformant (9) described above as a template, using the primer described in SEQ ID NO: 19 in the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (12) encoding a hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (12). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 94th Met of the ⁇ subunit was added to the plasmid (9) described in Reference Example 5. It was confirmed that the mutation with a Ile has a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (12) thus obtained and the transformant (9) serving as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 7 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (13)
- a transformant (13) expressing a nitrile hydratase mutant obtained by mutating nitrile hydratase at the amino acid substitution positions (b) and (bp) as shown in Table 5 the above Reference Example 6 was used.
- the plasmid (10) recovered from the transformant (10) described above as a template using the primer described in SEQ ID NO: 19 in the Sequence Listing, and using the mutation introduction kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (13) encoding a hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (13). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 94th Met of the ⁇ subunit was added to the plasmid (10) described in Reference Example 6. It was confirmed that the mutation with a Ile has a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (13) thus obtained and the transformant (10) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- a plasmid (15) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- Example 8 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (17) As shown in Table 7, in order to obtain a transformant (17) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (c) and (an), the above Reference Example 7 was used. Using the plasmid (14) recovered from the transformant (14) described above as a template, using the primer described in SEQ ID NO: 24 of the Sequence Listing, and using the mutagenesis kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (17) encoding a hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cell manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- a transformant (17) was transformed with the plasmid to obtain a transformant (17).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 197th Gly of the ⁇ subunit was added to the plasmid (14) described in Reference Example 7. It was confirmed that the mutation with a Cys has a newly added sequence as intended.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (17) thus obtained and the transformant (14) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 9 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (18) As shown in Table 7, in order to obtain a transformant (18) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions of (c) and (be), the above Reference Example 8 was used. Using the plasmid (15) recovered from the transformant (15) described above as a template, using the primer described in SEQ ID NO: 24 of the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (18) encoding a hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (18). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the base sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 197th Gly of the ⁇ subunit was added to the plasmid (15) described in Reference Example 8. It was confirmed that the mutation with a Cys has a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (18) thus obtained and the transformant (15) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 10 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (19)
- the plasmid (16) recovered from the transformant (16) described above as a template using the primer described in SEQ ID NO: 24 of the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (19) encoding a hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (19). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 197th Gly of the ⁇ subunit was added to the plasmid (16) described in Reference Example 9. It was confirmed that the mutation with a Cys has a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (19) thus obtained and the transformant (16) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- a plasmid (22) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- Example 11 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (23) As shown in Table 9, in order to obtain a transformant (23) expressing a nitrile hydratase mutant obtained by mutating nitrile hydratase at the amino acid substitution positions (d) and (ar), the above Reference Example 10 was used. Using the plasmid (20) recovered from the transformant (20) described above as a template, using the primer described in SEQ ID NO: 29 of the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (23) encoding a hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (23). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the fourth Val of ⁇ subunit was added to the plasmid (20) described in Reference Example 10. It was confirmed that the mutation with Met has the desired sequence newly added. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (23) thus obtained and the transformant (20) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 12 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (24)
- a transformant (24) expressing a nitrile hydratase mutant obtained by mutating nitrile hydratase at the amino acid substitution positions (d) and (ax) as shown in Table 9 the above Reference Example 11 was used.
- the plasmid (21) recovered from the transformant (21) described above as a template using the primer described in SEQ ID NO: 29 in the Sequence Listing, and the method using the mutation introduction kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (24) encoding a hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (24).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the plasmid (21) described in Reference Example 11 was added to the fourth Val of the ⁇ subunit. It was confirmed that the mutation with Met has the desired sequence newly added.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (24) thus obtained and the transformant (21) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 13 Acquisition of amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (25)
- a transformant (25) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (d) and (bd) as shown in Table 9 the above Reference Example 12 was used.
- the plasmid (22) recovered from the transformant (22) described above as a template using the primer described in SEQ ID NO: 29 of the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (25) encoding a hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (19).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the fourth Val of the ⁇ subunit was added to the plasmid (22) described in Reference Example 12. It was confirmed that the mutation with a Met has a newly added sequence as intended.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (25) thus obtained and the transformant (22) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- the transformant (25) has a new mutation in which the fourth Val of the ⁇ subunit is Met.
- a 1.25-fold improvement in the initial reaction rate and a 1.25-fold improvement in thermal stability were observed with respect to the transformant (22).
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (28). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the plasmid (26) described in Reference Example 13 was transformed into the eighth Gly of the ⁇ subunit. It was confirmed that the mutation with Ala has the desired sequence newly added. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (28) thus obtained and the transformant (26) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (29). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the plasmid (27) described in Reference Example 14 was transformed into the eighth Gly of the ⁇ subunit. It was confirmed that the mutation with Ala was newly added and had the desired sequence. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (29) thus obtained and the transformant (27) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (30). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the plasmid (16) described in Reference Example 9 was replaced with the eighth Gly of the ⁇ subunit. It was confirmed that the mutation with Ala was newly added and had the desired sequence. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (30) thus obtained and the transformant (16) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- a plasmid (32) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- Example 14 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (33)
- a transformant (33) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (f) and (au) as shown in Table 13, the above Reference Example 15
- the above plasmid (31) recovered from the transformant (31) described above as a template using the primer described in SEQ ID NO: 33 of the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (33) encoding a hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (33).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 79th His of the ⁇ subunit was added to the plasmid (31) described in Reference Example 15. It was confirmed that a mutation with Asn has a newly added sequence as intended.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (33) thus obtained and the transformant (31) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 15 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (34) As shown in Table 13, in order to obtain a transformant (34) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (f) and (bf), the above Reference Example 16 was used. Using the plasmid (32) recovered from the transformant (32) described above as a template, using the primer described in SEQ ID NO: 33 of the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (34) encoding a hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (34). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 79th His of the ⁇ subunit was added to the plasmid (32) described in Reference Example 16. It was confirmed that the mutation with Asn has a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (34) thus obtained and the transformant (32) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 16 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (35)
- a transformant (35) expressing a nitrile hydratase mutant obtained by mutating nitrile hydratase at the amino acid substitution positions (f) and (bp) as shown in Table 13, the above Reference Example 6 was used.
- the plasmid (10) recovered from the transformant (10) described above as a template using the primer described in SEQ ID NO: 33 of the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (35) encoding a hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (35). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 79th His of the ⁇ subunit was added to the plasmid (10) described in Reference Example 6. It was confirmed that a mutation with Asn has a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (35) thus obtained and the transformant (10) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 17 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (39)
- a transformant (39) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (g) and (aa) as shown in Table 15 the above Reference Example 17
- the above Reference Example 17 Using the plasmid (36) recovered from the transformant (36) described above as a template, using the primer described in SEQ ID NO: 34 of the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (39) encoding a hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (39). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 96th Gln of the ⁇ subunit was added to the plasmid (36) described in Reference Example 17. It was confirmed that the mutation with arg as Arg has the newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (39) thus obtained and the transformant (36) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 18 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (40)
- a transformant (40) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (g) and (ah) as shown in Table 15 the above Reference Example 18 was obtained.
- the plasmid (37) recovered from the transformant (37) described above as a template using the primer described in SEQ ID NO: 34 in the Sequence Listing, and using the mutation introduction kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (40) encoding a hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells (Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (40). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 96th Gln of the ⁇ subunit was added to the plasmid (37) described in Reference Example 18. It was confirmed that the mutation with arg as Arg has the newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (40) thus obtained and the transformant (37) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 19 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (41)
- a transformant (41) expressing a nitrile hydratase mutant obtained by mutating a nitrile hydratase at the amino acid substitution positions (g) and (aq) as shown in Table 15 the above Reference Example 19 Using the plasmid (38) recovered from the transformant (38) described above as a template, using the primer described in SEQ ID NO: 34 of the Sequence Listing, and the method using the mutation introduction kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (41) encoding a hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (41). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 96th Gln of the ⁇ subunit was added to the plasmid (38) described in Reference Example 19. It was confirmed that the mutation with arg as Arg has a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (41) thus obtained and the transformant (38) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- a plasmid (43) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- Example 20 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (44) As shown in Table 17, in order to obtain a transformant (44) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions of (h) and (ae), the above Reference Example 20 was obtained. Using the plasmid (42) recovered from the transformant (42) described above as a template, using the primer described in SEQ ID NO: 37 of the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (44) encoding a hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (44). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 107th Pro of the ⁇ subunit was added to the plasmid (42) described in Reference Example 20. It was confirmed that the mutation with Met has the desired sequence newly added. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (44) thus obtained and the transformant (42) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 21 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (45) As shown in Table 17, in order to obtain a transformant (45) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (h) and (au), the above Reference Example 15 was used. Using the plasmid (31) recovered from the described transformant (31) as a template, using the primer described in SEQ ID NO: 68 of the Sequence Listing, and the method using the mutation introduction kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (45) encoding a hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (45).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 107th Pro of the ⁇ subunit was added to the plasmid (31) described in Reference Example 15. It was confirmed that the mutation with a Met has a newly added sequence as intended.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (45) thus obtained and the transformant (31) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 22 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (46)
- the plasmid (43) recovered from the transformant (43) described above as a template using the primer described in SEQ ID NO: 37 of the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (46) encoding a hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (46). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 107th Pro of the ⁇ subunit was added to the plasmid (43) described in Reference Example 21. It was confirmed that the mutation with a Met has a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (46) thus obtained and the transformant (43) serving as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 23 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (47) As shown in Table 18, in order to obtain a transformant (47) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (i) and (aa), the above Reference Example 17 was used. Using the plasmid (36) recovered from the transformant (36) described above as a template, the primer described in SEQ ID NO: 38 in the Sequence Listing, and the method using the mutagenesis kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (47) encoding a hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (47). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the plasmid (36) described in Reference Example 17 was converted into the 226th Val of ⁇ subunit. It was confirmed that a mutation with a Ile was newly added and had the desired sequence. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (47) thus obtained and the transformant (36) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 24 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (48) As shown in Table 18, in order to obtain a transformant (48) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (i) and (ak), the above Reference Example 4 was obtained. Using the plasmid (8) recovered from the transformant (8) described above as a template, using the primer described in SEQ ID NO: 38 of the Sequence Listing, and using the mutagenesis kit described in Reference Example 2, the above nitrile A plasmid (48) encoding a hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (48). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the plasmid (8) described in Reference Example 4 was added to the 226th Val of ⁇ subunit. It was confirmed that a mutation with a Ile was newly added and had the desired sequence. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (48) thus obtained and the transformant (8) serving as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 25 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (49)
- the above plasmid (15) recovered from the transformant (15) of No. 3 as a template using the primer described in SEQ ID NO: 38 of the Sequence Listing, and using the mutation introducing kit described in Reference Example 2, the above nitrile hydra A plasmid (49) encoding a tase variant was generated.
- coli HB101 competent cells (Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (49). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 226th Val of the ⁇ subunit was added to the plasmid (15) described in Reference Example 8. It was confirmed that the mutation with a Ile has a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (49) thus obtained and the transformant (15) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- a plasmid (51) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cell manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- a plasmid (52) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- Example 26 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (53) As shown in Table 20, in order to obtain a transformant (53) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (m-1) and (af), Using the plasmid (50) recovered from the transformant (50) described in Example 22 as a template, using the primers described in SEQ ID NOs: 43 and 19 in the sequence listing, the method described in Reference Example 2 was performed for each mutation point. By repeating the above, a plasmid (53) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (53). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 13th Ile of the ⁇ subunit was added to the plasmid (50) described in Reference Example 22. It was confirmed that a mutation with Leu and ⁇ -subunit 94th Met as Ile has a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (53) thus obtained and the transformant (50) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (54).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 13th Ile of the ⁇ subunit was added to the plasmid (51) described in Reference Example 23. It was confirmed that a mutation with Leu and ⁇ -subunit 94th Met as Ile has a newly added sequence as intended.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (54) thus obtained and the transformant (51) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 28 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (55)
- a transformant (55) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (m-1) and (bj) as shown in Table 20
- the above-mentioned reference Using the plasmid (52) recovered from the transformant (52) described in Example 24 as a template, using the primers described in SEQ ID NOs: 43 and 19 in the sequence listing, the method described in Reference Example 2 was performed for each mutation point. By repeating the above, a plasmid (55) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (55). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 13th Ile of the ⁇ subunit was added to the plasmid (52) described in Reference Example 24. It was confirmed that a mutation with Leu and ⁇ -subunit 94th Met as Ile has a newly added sequence as intended. The transformant (55) thus obtained and the initial reaction rate and thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (52) as the base were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- plasmid (57) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (57).
- coli HB101 competent cell manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- a transformant (58) was transformed with the plasmid to obtain a transformant (58).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 13th Ile of the ⁇ subunit was added to the plasmid (56) described in Reference Example 25. It was confirmed that a mutation with Leu and 96th Gln of the ⁇ subunit as Arg was newly added and had the desired sequence.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (58) thus obtained and the transformant (56) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 30 Acquisition of amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (59)
- a transformant (59) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (m-2) and (at) as shown in Table 22 the above-mentioned reference
- the method described in Reference Example 2 was performed at each mutation point.
- a plasmid (59) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (59).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 13th Ile of the ⁇ subunit was added to the plasmid (27) described in Reference Example 14. It was confirmed that a mutation with Leu and 96th Gln of the ⁇ subunit as Arg was newly added and had the desired sequence.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (59) thus obtained and the transformant (27) serving as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 31 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (60)
- a transformant (60) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (m-2) and (ay) as shown in Table 22 the above-mentioned reference
- the plasmid (57) recovered from the transformant (57) described in Example 26 as a template, using the primers described in SEQ ID NOs: 43 and 34 in the sequence listing, the method described in Reference Example 2 was performed at each mutation point.
- a plasmid (60) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 13th Ile of the ⁇ subunit was added to the plasmid (57) described in Reference Example 26. It was confirmed that a mutation with Leu and 96th Gln of the ⁇ subunit as Arg was newly added and had the desired sequence.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (60) thus obtained and the transformant (57) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 32 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (61)
- a transformant (61) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (n-1) and (af) as shown in Table 23 the above-mentioned reference
- the method described in Reference Example 2 was performed for each mutation point.
- a plasmid (61) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (61). Moreover, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 27th Met of the ⁇ subunit was added to the plasmid (50) described in Reference Example 22. It was confirmed that a mutation having Ile and the 94th Met of the ⁇ subunit as Ile has a newly added sequence. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (61) thus obtained and the transformant (50) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 33 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (62)
- a transformant (62) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (n-1) and (ao) as shown in Table 23 the above Reference Example was used.
- the method described in Reference Example 2 was performed for each mutation point.
- a plasmid (62) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (62). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 27th Met of the ⁇ subunit was added to the plasmid (26) described in Reference Example 13. It was confirmed that a mutation having Ile and the 94th Met of the ⁇ subunit as Ile has a newly added sequence. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (62) thus obtained and the transformant (26) as the base thereof were the same as those in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 34 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (63)
- a transformant (63) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (n-1) and (ax) as shown in Table 23 the above-mentioned reference
- the method described in Reference Example 2 was performed for each mutation point.
- a plasmid (63) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (63). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 27th Met of the ⁇ subunit was added to the plasmid (21) described in Reference Example 11. It was confirmed that a mutation having Ile and the 94th Met of the ⁇ subunit as Ile has a newly added sequence. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of an amide compound using the transformant (63) thus obtained and the transformant (21) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- a plasmid (66) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- E. coli HB101 competent cells (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (67). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 27th Met of the ⁇ subunit was added to the plasmid (64) described in Reference Example 27. It was confirmed that a mutation with Ile and 107 subunit Pro of the ⁇ subunit as Met was newly added and had the desired sequence. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (67) thus obtained and the transformant (64) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- coli HB101 competent cells (Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (68). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 27th Met of the ⁇ subunit was added to the plasmid (65) described in Reference Example 28. It was confirmed that the mutation has a target sequence with a newly added mutation in which Ile and 107th Pro of the ⁇ subunit are Met. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (68) thus obtained and the transformant (65) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 37 Acquisition of amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (69)
- a transformant (69) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (n-2) and (bb) as shown in Table 25 the above-mentioned reference
- the method described in Reference Example 2 was performed at each mutation point.
- a plasmid (69) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (69). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 27th Met of the ⁇ subunit was added to the plasmid (66) described in Reference Example 29. It was confirmed that the mutation has a target sequence with a newly added mutation in which Ile and 107th Pro of the ⁇ subunit are Met. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (69) thus obtained and the transformant (66) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- a plasmid (72) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- a transformant (72) was transformed with the plasmid to obtain a transformant (72).
- Example 38 Acquisition of amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (73)
- a transformant (73) expressing a nitrile hydratase mutant obtained by mutating nitrile hydratase at the amino acid substitution positions (q) and (al) as shown in Table 27 was used.
- the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point using the plasmid (70) recovered from the described transformant (70) as a template and using the primers described in SEQ ID NOs: 16 and 38 in the Sequence Listing.
- a plasmid (73) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cell manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- a transformant (73) was transformed with the plasmid to obtain a transformant (73).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 92nd Asp of the ⁇ subunit was added to the plasmid (70) described in Reference Example 30. It was confirmed that a mutation having Glu and ⁇ -subunit 226th Val as Ile has a newly added sequence as intended.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (73) thus obtained and the transformant (70) based on the transformant (73) were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 39 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (74)
- a transformant (74) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (q) and (aw) as shown in Table 27 was used.
- the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point using the plasmid (71) recovered from the described transformant (71) as a template and using the primers described in SEQ ID NOs: 16 and 38 in the Sequence Listing.
- a plasmid (74) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (74).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 92nd Asp of the ⁇ subunit was added to the plasmid (71) described in Reference Example 31. It was confirmed that a mutation having Glu and ⁇ -subunit 226th Val as Ile has a newly added sequence as intended.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (74) thus obtained and the transformant (71) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 40 Acquisition of amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (75) As shown in Table 27, in order to obtain a transformant (75) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (q) and (bl), the above Reference Example 32 was obtained. The method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point using the plasmid (72) recovered from the transformant (72) described above as a template and using the primers described in SEQ ID NOs: 16 and 38 in the Sequence Listing. Thus, a plasmid (75) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (75).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 92nd Asp of the ⁇ subunit was added to the plasmid (72) described in Reference Example 32. It was confirmed that a mutation having Glu and ⁇ -subunit 226th Val as Ile has a newly added sequence as intended.
- the transformant thus obtained (75) and the initial reaction rate and thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (72) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- a plasmid (76) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cell manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- a plasmid (77) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (78). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the fourth Val of ⁇ subunit was added to the plasmid (14) described in Reference Example 7. It was confirmed that a mutation with Ast as the Met and 79th His of the ⁇ subunit was newly added and had the desired sequence. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (78) thus obtained and the transformant (14) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. The method was compared.
- Example 42 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (79) As shown in Table 29, in order to obtain a transformant (79) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (o) and (bi), the above Reference Example 33 was obtained. Using the plasmid (76) recovered from the described transformant (76) as a template, using the primers described in SEQ ID NOs: 29 and 33 in the Sequence Listing, the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point. Thus, a plasmid (79) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cells (Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (79). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the fourth Val of the ⁇ subunit was added to the plasmid (76) described in Reference Example 33. It was confirmed that the mutation has Met and the ⁇ -subunit 79-His Asn as the newly added sequence. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (79) thus obtained and the transformant (76) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 43 Acquisition of amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (80)
- the plasmid (77) recovered from the described transformant (77) as a template using the primers described in SEQ ID NOs: 29 and 33 in the sequence listing, the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point.
- a plasmid (80) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (80).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the plasmid (77) described in Reference Example 34 was added to the fourth Val of the ⁇ subunit. It was confirmed that a mutation with Ast as the Met and 79th His of the ⁇ subunit was newly added and had the desired sequence.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (80) thus obtained and the transformant (77) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 44 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (83)
- a transformant (83) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (p) and (ag) as shown in Table 31 the above Reference Example 35 was obtained.
- the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point.
- a plasmid (83) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (83). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 79th His of the ⁇ subunit was added to the plasmid (81) described in Reference Example 35. Asn and the ⁇ -subunit 230th Ala, Glu was confirmed to have a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (83) thus obtained and the transformant (81) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 45 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (84)
- a transformant (84) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (p) and (ai) as shown in Table 31 the above Reference Example 36 was used.
- the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point using the plasmid (82) recovered from the transformant (82) described above as a template and using the primers described in SEQ ID NOs: 33 and 60 in the Sequence Listing.
- a plasmid (84) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (84). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 79th His of the ⁇ subunit was added to the plasmid (82) described in Reference Example 36. Asn and the ⁇ -subunit 230th Ala, Glu was confirmed to have a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (84) thus obtained and the transformant (82) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 46 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (85)
- a transformant (85) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (p) and (aq) as shown in Table 31, the above Reference Example 19
- the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point.
- a plasmid (85) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (85). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 79th His of the ⁇ subunit was added to the plasmid (38) described in Reference Example 31. Asn and the ⁇ -subunit 230th Ala, Glu was confirmed to have a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (85) thus obtained and the transformant (38) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- a plasmid (87) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cell manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- Example 47 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (88)
- a transformant (88) expressing a nitrile hydratase mutant obtained by mutating nitrile hydratase at the amino acid substitution positions (j) and (ad) as shown in Table 33 the above Reference Example 37 was used.
- the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point.
- a plasmid (88) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (88). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the plasmid (86) described in Reference Example 37 was added to the 110th Glu of the ⁇ subunit. Asn and the ⁇ -subunit 231st Ala as Val was confirmed to have a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (88) thus obtained and the base transformant (86) were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 48 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (89)
- a transformant (89) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (j) and (aj) as shown in Table 33 the above Reference Example 27 was used.
- the plasmid (64) recovered from the described transformant (64) as a template using the primers described in SEQ ID NOs: 57 and 58 in the sequence listing, the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point.
- a plasmid (89) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (89). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the plasmid (64) described in Reference Example 27 was added to the 110th Glu of the ⁇ subunit. Asn and the ⁇ -subunit 231st Ala as Val was confirmed to have a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (89) thus obtained and the transformant (64) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 49 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (90)
- a transformant (90) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (j) and (bg) as shown in Table 33 the above Reference Example 38 was used.
- the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point using the plasmid (87) recovered from the described transformant (87) as a template and using the primers described in SEQ ID NOs: 57 and 58 in the Sequence Listing.
- a plasmid (90) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (90). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the plasmid (87) described in Reference Example 38 was added to the 110th Glu of the ⁇ subunit. Asn and the ⁇ -subunit 231st Ala as Val was confirmed to have a newly added sequence as intended. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (90) thus obtained and the transformant (87) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 50 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (91)
- a transformant (91) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (k) and (ad) as shown in Table 34
- a plasmid encoding In order to obtain this, the plasmid (86) recovered from the transformant (86) described in Reference Example 37 was used as a template, and the primers described in SEQ ID NOs: 59 and 60 in the Sequence Listing were used.
- a plasmid (91) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cell manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the plasmid (86) described in Reference Example 37 was replaced with the 206th Pro of the ⁇ subunit. It was confirmed that a mutation having Leu and ⁇ subunit A230 at the 230th Ala as Glu has a newly added sequence.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (91) thus obtained and the transformant (86) as the base thereof were the same as those in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 51 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (92) As shown in Table 34, in order to obtain a transformant (92) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (k) and (as), the above Reference Example 28 was obtained. The method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point using the plasmid (65) recovered from the transformant (65) described above as a template and using the primers described in SEQ ID NOs: 59 and 60 in the Sequence Listing. Thus, a plasmid (92) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared. E.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (92). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the plasmid (65) described in Reference Example 28 was transformed into the 206th Pro of the ⁇ subunit. It was confirmed that a mutation having Leu and ⁇ subunit A230 at the 230th Ala as Glu has a newly added sequence. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (92) thus obtained and the transformant (65) serving as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 52 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (93)
- a transformant (93) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (k) and (av) as shown in Table 34
- the above Reference Example 1 was used.
- the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point.
- a plasmid (93) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (93). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the plasmid (2) described in Reference Example 1 was transferred to the 206th Pro of the ⁇ subunit. It was confirmed that a mutation having Leu and ⁇ subunit A230 at the 230th Ala as Glu has a newly added sequence. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (93) thus obtained and the transformant (2) serving as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 53 Acquisition of amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (95)
- a transformant (95) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (l) and (ag) as shown in Table 36 the above Reference Example 35 was used.
- the method described in Reference Example 2 was performed at each mutation point.
- a plasmid (95) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (95). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 13th Ile of the ⁇ subunit was added to the plasmid (81) described in Reference Example 35. It was confirmed that the mutation was changed to Leu, and the 27th Met of the ⁇ subunit was Ile and the 110th Glu of the ⁇ subunit was Asn. . The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (95) thus obtained and the transformant (81) serving as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 54 Acquisition of amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (96)
- a transformant (96) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (l) and (am) as shown in Table 36 the above Reference Example 25 was used.
- the method described in Reference Example 2 was performed at each mutation point.
- a plasmid (96) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (96).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 13th Ile of the ⁇ subunit was added to the plasmid (56) described in Reference Example 25. It was confirmed that the mutation was changed to Leu, and the 27th Met of the ⁇ subunit was Ile and the 110th Glu of the ⁇ subunit was Asn. .
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (96) thus obtained and the transformant (56) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- the 13th Ile of the ⁇ subunit is Leu
- the 27th Met of the ⁇ subunit is Ile
- the 110th Glu of the ⁇ subunit is Asn.
- E. coli HB101 competent cells (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (97). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 13th Ile of the ⁇ subunit was added to the plasmid (94) described in Reference Example 39. It was confirmed that the mutation was changed to Leu, and the 27th Met of the ⁇ subunit was Ile and the 110th Glu of the ⁇ subunit was Asn. . The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (97) thus obtained and the transformant (94) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- the 13th Ile of the ⁇ subunit is Leu
- the 27th Met of the ⁇ subunit is Ile
- the 110th Glu of the ⁇ subunit is Asn.
- Example 56 Acquisition of amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (99)
- a transformant (99) expressing a nitrile hydratase mutant obtained by mutating nitrile hydratase at the amino acid substitution positions (r) and (ab) as shown in Table 38 the above Reference Example 40 was used.
- the method described in Reference Example 2 was performed for each mutation point.
- a plasmid (99) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (99). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 13th Ile of the ⁇ subunit was added to the plasmid (98) described in Reference Example 40. It was confirmed that the mutation with Leu and ⁇ -subunit 206th Pro as Leu and ⁇ -subunit 226th Val as Ile has the newly added sequence. . The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (99) thus obtained and the transformant (98) serving as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 57 Acquisition of amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (100)
- a transformant (100) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (r) and (ai) as shown in Table 38 the above Reference Example 36 was used.
- the method described in Reference Example 2 was performed for each mutation point.
- a plasmid (100) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (100). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the base sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 13th Ile of the ⁇ subunit was added to the plasmid (82) described in Reference Example 36. It was confirmed that the mutation with Leu and ⁇ -subunit 206th Pro as Leu and ⁇ -subunit 226th Val as Ile has the newly added sequence. . The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (100) thus obtained and the transformant (82) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- the 13th Ile of the ⁇ subunit is Leu
- the 206th Pro of the ⁇ subunit is Leu
- the 226th Val of the ⁇ subunit is Ile.
- Example 58 Acquisition of amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (101)
- a transformant (101) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (r) and (bh) as shown in Table 38 the above Reference Example 3 was used.
- the method described in Reference Example 2 was performed at each mutation point.
- a plasmid (101) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (101). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 13th Ile of the ⁇ subunit was added to the plasmid (4) described in Reference Example 3. It was confirmed that the mutation with Leu and ⁇ -subunit 206th Pro as Leu and ⁇ -subunit 226th Val as Ile has the newly added sequence. . The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (101) thus obtained and the transformant (4) as the base thereof were the same as those described in Example 1. Comparison was made by the method.
- the 13th Ile of the ⁇ subunit is Leu
- the 206th Pro of the ⁇ subunit is Leu
- the 226th Val of the ⁇ subunit is Ile.
- Example 59 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (103)
- a transformant (103) expressing a nitrile hydratase mutant obtained by mutating nitrile hydratase at the amino acid substitution positions (s) and (ab) as shown in Table 40 the above Reference Example 40 was used.
- the method described in Reference Example 2 was performed for each mutation point.
- a plasmid (103) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (103).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 92nd Asp of the ⁇ subunit was added to the plasmid (98) described in Reference Example 40. It was confirmed that the mutation with Glu, ⁇ subunit 4th Val as Met and ⁇ subunit 206th Pro as Leu was newly added and had the desired sequence. .
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (103) thus obtained and the transformant (98) serving as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- the mutation was such that the 92nd Asp of the ⁇ subunit was Glu, the 4th Val of the ⁇ subunit was Met, and the 206th Pro of the ⁇ subunit was Leu.
- the 92nd Asp of the ⁇ subunit was Glu
- the 4th Val of the ⁇ subunit was Met
- the 206th Pro of the ⁇ subunit was Leu.
- Example 60 Acquisition of amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (104)
- a transformant (104) expressing a nitrile hydratase mutant in which the nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (s) and (ah) as shown in Table 40 the above Reference Example 18 was used.
- the plasmid (37) recovered from the described transformant (37) as a template using the primers set forth in SEQ ID NOs: 16, 29, and 59 in the sequence listing, the method described in Reference Example 2 was performed at each mutation point.
- a plasmid (104) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (104). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 92nd Asp of the ⁇ subunit was added to the plasmid (37) described in Reference Example 18. It was confirmed that the mutation with Glu, ⁇ subunit 4th Val as Met and ⁇ subunit 206th Pro as Leu was newly added and had the desired sequence. . The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (104) thus obtained and the transformant (37) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- the mutation was such that the 92nd Asp of the ⁇ subunit was Glu, the 4th Val of the ⁇ subunit was Met, and the 206th Pro of the ⁇ subunit was Leu.
- the reaction initial speed was improved by 1.82 times and the thermal stability was improved by 1.41 times with respect to the transformant (37).
- Example 61 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (105)
- a transformant (105) expressing a nitrile hydratase mutant obtained by mutating nitrile hydratase at the amino acid substitution positions (s) and (ac) as shown in Table 40
- the above Reference Example 41 was used.
- the method described in Reference Example 2 was performed at each mutation point. By repeating the above, a plasmid (105) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (105). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 92nd Asp of the ⁇ subunit was added to the plasmid (102) described in Reference Example 41. It was confirmed that the mutation with Glu, ⁇ subunit 4th Val as Met and ⁇ subunit 206th Pro as Leu was newly added and had the desired sequence. . The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (105) thus obtained and the transformant (102) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- the mutation is as follows: the As subunit 92 Asp is Glu, the ⁇ subunit 4th Val is Met, and the ⁇ subunit 206th Pro is Leu.
- the As subunit 92 Asp is Glu
- the ⁇ subunit 4th Val is Met
- the ⁇ subunit 206th Pro is Leu.
- a plasmid (106) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- a transformant 106
- Example 62 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (107)
- a transformant (107) expressing a nitrile hydratase mutant obtained by mutating nitrile hydratase at the amino acid substitution positions (t) and (ac) as shown in Table 42
- the above Reference Example 41 was used.
- the method described in Reference Example 2 was performed for each mutation point.
- a plasmid (107) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (107). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 197th Gly of the ⁇ subunit was added to the plasmid (102) described in Reference Example 41. It was confirmed that the mutation was changed to Cys, and the 107th Pro of the ⁇ subunit was Met, and the 230th Ala of the ⁇ subunit was Glu. . The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (107) thus obtained and the base transformant (102) were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 63 Acquisition of amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (108)
- a transformant (108) expressing a nitrile hydratase mutant obtained by mutating nitrile hydratase at the amino acid substitution positions (t) and (al) as shown in Table 42 the above Reference Example 30 was used.
- the method described in Reference Example 2 was performed for each mutation point.
- a plasmid (108) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells (Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (108). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 197th Gly of the ⁇ subunit was added to the plasmid (70) described in Reference Example 30. It was confirmed that the mutation was changed to Cys, and the 107th Pro of the ⁇ subunit was Met, and the 230th Ala of the ⁇ subunit was Glu. . The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (108) thus obtained and the transformant (70) based on the transformant (108) were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 64 Obtaining an amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (109)
- a transformant (109) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (t) and (az) as shown in Table 42
- the above Reference Example 42 was used.
- the method described in Reference Example 2 was performed for each mutation point.
- a plasmid (109) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (109).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 197th Gly of the ⁇ subunit was added to the plasmid (106) described in Reference Example 43. It was confirmed that the mutation was changed to Cys, and the 107th Pro of the ⁇ subunit was Met, and the 230th Ala of the ⁇ subunit was Glu. .
- the initial rate of reaction and thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (109) thus obtained and the transformant (106) based on the transformant were the same as those described in Example 1. Comparison was made by the method.
- a plasmid (110) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
- a transformant 110.
- Example 65 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (111)
- a transformant (111) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (u) and (aq) as shown in Table 44 the above Reference Example 19 was obtained.
- the plasmid (38) recovered from the described transformant (38) as a template using the primers described in SEQ ID NOs: 33 and 69 in the Sequence Listing, the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point.
- a plasmid (111) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (111). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 79th His of the ⁇ subunit was added to the plasmid (38) described in Reference Example 19. Asn and the ⁇ -subunit 230th Ala to Glu and the ⁇ -subunit 231st Ala to Val were confirmed to have the newly added sequence as intended. . The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (111) thus obtained and the transformant (38) serving as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- the mutation is such that 79th His of the ⁇ subunit is Asn, 230th Ala of the ⁇ subunit is Glu, and 231st Ala of the ⁇ subunit is Val.
- a 1.46-fold improvement in the initial reaction rate and a 1.43-fold improvement in thermal stability were observed with respect to the transformant (38).
- Example 66 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (112)
- a transformant (112) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (u) and (ap) as shown in Table 44 the above Reference Example 5 was used.
- the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point using the plasmid (9) recovered from the transformant (9) described above as a template and using the primers described in SEQ ID NOs: 33 and 69 in the Sequence Listing.
- a plasmid (112) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (112). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 79th His of the ⁇ subunit was added to the plasmid (9) described in Reference Example 5. Asn and the ⁇ -subunit 230th Ala to Glu and the ⁇ -subunit 231st Ala to Val were confirmed to have the newly added sequence as intended. . The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (112) thus obtained and the transformant (9) based on the transformant (112) were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- the mutation is such that the 79th His of the ⁇ subunit is Asn, the 230th Ala of the ⁇ subunit is Glu, and the 231st Ala of the ⁇ subunit is Val.
- a 1.42 times improvement in the initial reaction rate and a 1.66 times improvement in thermal stability were observed with respect to the transformant (9).
- Example 67 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (113)
- a transformant (113) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (u) and (ba) as shown in Table 44 the above Reference Example 43 was used.
- the method described in Reference Example 2 is repeated for each mutation point.
- a plasmid (113) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (113). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 79th His of the ⁇ subunit was added to the plasmid (110) described in Reference Example 43. Asn and the ⁇ -subunit 230th Ala to Glu and the ⁇ -subunit 231st Ala to Val were confirmed to have the newly added sequence as intended. . The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (113) thus obtained and the transformant (110) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- the mutation is such that the 79th His of the ⁇ subunit is Asn, the 230th Ala of the ⁇ subunit is Glu, and the 231st Ala of the ⁇ subunit is Val.
- a 1.39-fold improvement in the initial reaction rate and a 1.38-fold improvement in thermal stability were observed with respect to the transformant (110).
- Example 68 Acquisition of amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (114)
- a transformant (114) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (v) and (al) as shown in Table 45 the above Reference Example 30 was used.
- the method described in Reference Example 2 was performed for each mutation point.
- a plasmid (114) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- coli HB101 competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd. were transformed with the plasmid to obtain a transformant (114).
- a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 92nd Asp of the ⁇ subunit was added to the plasmid (70) described in Reference Example 30. It was confirmed that the mutation has Glu, the ⁇ subunit 24th Val as Ile, and the ⁇ subunit 226th Val as Ile, and a newly added mutation.
- the initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (114) thus obtained and the transformant (70) as the base thereof were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- Example 69 Acquisition of amino acid substitution product with improved nitrile hydratase activity and thermal stability (115)
- a transformant (115) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (w) and (al) as shown in Table 46 the above Reference Example 30 was used.
- the method described in Reference Example 2 was changed to the mutation point. By repeating each time, a plasmid (115) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (115). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 197th Gly of the ⁇ subunit was added to the plasmid (70) described in Reference Example 30. Cys, 24th Val of ⁇ subunit is Ile, 107th Pro of ⁇ subunit is Met, and 230th Ala of ⁇ subunit is Glu. It was confirmed that it has. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of an amide compound using the transformant (115) thus obtained and the transformant (70) based on the transformant (115) were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- the 197th Gly of the ⁇ subunit was Cys
- the 24th Val of the ⁇ subunit was Ile
- the 107th Pro of the ⁇ subunit was Met
- the ⁇ subunit was New addition of mutation with 230th Ala as Glu, 2.22 times improvement in initial reaction rate and 2.51 times improvement in thermal stability for transformant (70) It was observed.
- Example 70 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (116)
- a transformant (116) expressing a nitrile hydratase mutant obtained by mutating a nitrile hydratase at the amino acid substitution positions (w) and (az) as shown in Table 46 the above Reference Example 42 was used.
- the method described in Reference Example 2 was mutated.
- a plasmid (116) encoding the nitrile hydratase mutant was prepared.
- E. coli HB101 competent cells (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (116). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined with a DNA sequencer, and the 197th Gly of the ⁇ subunit was added to the plasmid (106) described in Reference Example 42. Cys, 24th Val of ⁇ subunit is Ile, 107th Pro of ⁇ subunit is Met, and 230th Ala of ⁇ subunit is Glu. It was confirmed that it has. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (116) thus obtained and the transformant (106) based on the transformant (116) were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
- the 197th Gly of the ⁇ subunit was Cys
- the 24th Val of the ⁇ subunit was Ile
- the 107th Pro of the ⁇ subunit was Met
- the ⁇ subunit was New addition of mutation with Glu as the 230th Ala improves the initial reaction rate by 2.35 times and 1.87 times the thermal stability of the transformant (106) It was observed.
- Example 71 Obtaining an amino acid substitution product having improved nitrile hydratase activity and thermal stability (117)
- a transformant (117) expressing a nitrile hydratase mutant in which nitrile hydratase was mutated at the amino acid substitution positions (x) and (aq) as shown in Table 47
- the above Reference Example 19 was obtained.
- the method described in Reference Example 2 was performed for each mutation point. By repeating, the plasmid (117) which codes the said nitrile hydratase variant was produced.
- E. coli HB101 competent cells (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were transformed with the plasmid to obtain a transformant (117). Further, a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene part was determined with a DNA sequencer, and the 24th Val of ⁇ subunit was added to the plasmid (38) described in Reference Example 19. Ile, 79th His of the ⁇ subunit is Asn, 230th Ala of the ⁇ subunit is Glu, and 231st Ala of the ⁇ subunit is Val. It was confirmed that it has. The initial rate of reaction and the thermal stability in the production of the amide compound using the transformant (117) thus obtained and the transformant (38) based on the transformant were the same as in the method described in Example 1. Comparison was made by the method.
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Abstract
Description
[1]3以下1以上のアミノ酸置換により、ニトリルヒドラターゼの2以上の性質を改善する少なくとも1つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むことを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体。
[2][1]に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、改善される前記性質が反応初速度及び熱安定性であることを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体。
[3][1]又は[2]に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、
配列表の配列番号:1に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号:2に示されるβサブユニットとからなり、下記(a)~(l)からなるアミノ酸置換位置より選ばれる、少なくとも1つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むことを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体。
(a)αサブユニットの92番目
(b)αサブユニットの94番目
(c)αサブユニットの197番目
(d)βサブユニットの4番目
(e)βサブユニットの24番目
(f)βサブユニットの79番目
(g)βサブユニットの96番目
(h)βサブユニットの107番目
(i)βサブユニットの226番目
(j)βサブユニットの110番目、及び、βサブユニットの231番目
(k)βサブユニットの206番目、及び、βサブユニットの230番目
(l)αサブユニットの13番目、αサブユニットの27番目、及び、βサブユニットの110番目
[4][3]に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、さらに下記(m)~(u)からなるアミノ酸置換位置より選ばれる、少なくとも1つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体。
(m)(b)又は(g)のとき、αサブユニットの13番目
(n)(b)又は(h)のとき、αサブユニットの27番目
(o)(d)及び(f)
(p)(f)のとき、βサブユニットの230番目
(q)(a)及び(i)
(r)(i)のとき、αサブユニットの13番目、及び、βサブユニットの206番目
(s)(a)及び(d)のとき、βサブユニットの206番目
(t)(c)及び(h)のとき、βサブユニットの230番目
(u)(f)のとき、βサブユニットの230番目、及び、βサブユニットの231番目
[5][3]に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、(e)のとき、(a)、(c)、(f)、(i)、(h)、βサブユニットの230番目、及びβサブユニットの231番目からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換をさらに含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体。
[6][1]~[5]いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、
αサブユニットの13番目のアミノ酸が置換されているとき、IleがLeuに置換されており、
αサブユニットの27番目のアミノ酸が置換されているとき、MetがIleに置換されており、
αサブユニットの92番目のアミノ酸が置換されているとき、AspがGluに置換されており、
αサブユニットの94番目のアミノ酸が置換されているとき、MetがIleに置換されており、
αサブユニットの197番目のアミノ酸が置換されているとき、GlyがCysに置換されており、
βサブユニットの4番目のアミノ酸が置換されているとき、ValがMetに置換されており、
βサブユニットの24番目のアミノ酸が置換されているとき、ValがIleに置換されており、
βサブユニットの79番目のアミノ酸が置換されているとき、HisがAsnに置換されており、
βサブユニットの96番目のアミノ酸が置換されているとき、GlnがArgに置換されており、
βサブユニットの107番目のアミノ酸が置換されているとき、ProがMetに置換されており、
βサブユニットの110番目のアミノ酸が置換されているとき、GluがAsnに置換されており、
βサブユニットの206番目のアミノ酸が置換されているとき、ProがLeuに置換されており、
βサブユニットの226番目のアミノ酸が置換されているとき、ValがIleに置換されており、
βサブユニットの230番目のアミノ酸が置換されているとき、AlaがGluに置換され
βサブユニットの231番目のアミノ酸が置換されているとき、AlaがValに置換されていることを特徴とするニトリルターゼ変異体。
[7][3]~[6]いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、更に下記(aa)~(br)からなるアミノ酸置換より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸の置換を含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体。
(aa)αサブユニットの36番目のThrをMet、及び、αサブユニットの126番目のPheをTyr
(ab)αサブユニットの148番目のGlyをAsp、及び、αサブユニットの204番目のValをArg
(ac)βサブユニットの51番目のPheをVal、及び、βサブユニットの108番目のGluをAsp
(ad)βサブユニットの118番目のPheをVal、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(ae)βサブユニットの160番目のArgをTrp、及び、βサブユニットの186番目のLeuをArg
(af)αサブユニットの6番目のLeuをThr、αサブユニットの36番目のThrをMet、及び、αサブユニットの126番目のPheをTyr
(ag)αサブユニットの19番目のAlaをVal、αサブユニットの71番目のArgをHis、及び、αサブユニットの126番目のPheをTyr
(ah)αサブユニットの36番目のThrをMet、αサブユニットの148番目のGlyをAsp、及び、αサブユニットの204番目のValをArg
(ai)βサブユニットの10番目のThrをAsp、βサブユニットの118番目のPheをVal、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(aj)βサブユニットの37番目のPheをLeu、βサブユニットの108番目のGluをAsp、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(ak)βサブユニットの37番目のPheをVal、βサブユニットの108番目のGluをAsp、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(al)βサブユニットの41番目のPheをIle、βサブユニットの51番目のPheをVal、及び、βサブユニットの108番目のGluをAsp
(am)βサブユニットの46番目のMetをLys、βサブユニットの108番目のGluをArg、及び、βサブユニットの212番目のSerをTyr
(an)βサブユニットの48番目のLeuをVal、βサブユニットの108番目のGluをArg、及び、βサブユニットの212番目のSerをTyr
(ao)βサブユニットの127番目のLeuをSer、βサブユニットの160番目のArgをTrp、及び、βサブユニットの186番目のLeuをArg
(ap)αサブユニットの6番目のLeuをThr、αサブユニットの19番目のAlaをVal、αサブユニットの126番目のPheをTyr、βサブユニットの46番目のMetをLys、βサブユニットの108番目のGluをArg、及び、βサブユニットの212番目のSerをTyr
(aq)αサブユニットの6番目のLeuをThr、αサブユニットの19番目のAlaをVal、αサブユニットの126番目のPheをTyr、βサブユニットの48番目のLeuをVal、βサブユニットの108番目のGluをArg、及び、βサブユニットの212番目のSerをTyr
(ar)αサブユニットの6番目のLeuをAla、αサブユニットの19番目のAlaをVal、αサブユニットの126番目のPheをTyr、βサブユニットの127番目のLeuをSer、βサブユニットの160番目のArgをTrp、及び、βサブユニットの186番目のLeuをArg
(as)αサブユニットの6番目のLeuをThr、αサブユニットの36番目のThrをMet、αサブユニットの126番目のPheをTyr、βサブユニットの10番目のThrをAsp、βサブユニットの118番目のPheをVal、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(at)αサブユニットの19番目のAlaをVal、αサブユニットの71番目のArgをHis、αサブユニットの126番目のPheをTyr、βサブユニットの37番目のPheをLeu、βサブユニットの108番目のGluをAsp、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(au)αサブユニットの19番目のAlaをVal、αサブユニットの71番目のArgをHis、αサブユニットの126番目のPheをTyr、βサブユニットの37番目のPheをVal、βサブユニットの108番目のGluをAsp、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(av)αサブユニットの36番目のThrをMet、αサブユニットの148番目のGlyをAsp、αサブユニットの204番目のValをArg、βサブユニットの41番目のPheをIle、βサブユニットの51番目のPheをVal、及び、βサブユニットの108番目のGluをAsp
(aw)αサブユニットの148番目のGlyをAsp、αサブユニットの204番目のValをArg、βサブユニットの108番目のGluをAsp、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(ax)αサブユニットの36番目のThrをGly、及び、αサブユニットの188番目のThrをGly
(ay)αサブユニットの36番目のThrをAla、及び、αサブユニットの48番目のAsnをGln
(az)αサブユニットの48番目のAsnをGlu、及び、βサブユニットの146番目のArgをGly
(ba)αサブユニットの36番目のThrをTrp、及び、βサブユニットの176番目のTyrをCys
(bb)βサブユニットの176番目のTyrをMet、及び、βサブユニットの217番目のAspをGly
(bc)αサブユニットの36番目のThrをSer、及び、βサブユニットの33番目のAlaをVal
(bd)βサブユニットの176番目のTyrをAla、及び、βサブユニットの217番目のAspをVal
(be)βサブユニットの40番目のThrをVal、及び、βサブユニットの218番目のCysをMet
(bf)βサブユニットの33番目のAlaをMet、及び、βサブユニットの176番目のTyrをThr
(bg)βサブユニットの40番目のThrをLeu、及び、βサブユニットの217番目のAspをLeu
(bh)βサブユニットの40番目のThrをIle、及び、βサブユニットの61番目のAlaをVal
(bi)βサブユニットの61番目のAlaをThr、及び、βサブユニットの218番目のCysをSer
(bj)βサブユニットの112番目のLysをVal、及び、βサブユニットの217番目のAspをMet
(bk)βサブユニットの61番目のAlaをTrp、及び、βサブユニットの217番目のAspをHis
(bl)βサブユニットの61番目のAlaをLeu、及び、βサブユニットの112番目のLysをIle
(bm)βサブユニットの146番目のArgをGly、及び、βサブユニットの217番目のAspをSer
(bn)βサブユニットの171番目のLysをAla、及び、βサブユニットの217番目のAspをThr
(bo)βサブユニットの150番目のAlaをSer、及び、βサブユニットの217番目のAspをCys
(bp)βサブユニットの61番目のAlaをGly、及び、βサブユニットの150番目のAlaをAsn
(bq)βサブユニットの61番目のAlaをSer、及び、βサブユニットの160番目のArgをMet
(br)βサブユニットの160番目のArgをCys、及び、βサブユニットの168番目のThrをGlu
[8][1]~[7]いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子。
[9]配列表の配列番号:3に示されるαサブユニットをコードする遺伝子と、配列表の配列番号:4に示されるβサブユニットをコードする遺伝子とからなる、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子において、下記(a)~(l)からなる塩基置換位置より選ばれる、少なくとも1つの塩基置換を含むことを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子。
(a)配列番号:3の塩基配列の274番目~276番目
(b)配列番号:3の塩基配列の280番目~282番目
(c)配列番号:3の塩基配列の589番目~591番目
(d)配列番号:4の塩基配列の10番目~12番目
(e)配列番号:4の塩基配列の69番目~71番目
(f)配列番号:4の塩基配列の235番目~237番目
(g)配列番号:4の塩基配列の286番目~288番目
(h)配列番号:4の塩基配列の319番目~321番目
(i)配列番号:4の塩基配列の676番目~678番目
(j)配列番号:4の塩基配列の328番目~330番目、及び、配列番号:4の691番目~693番目
(k)配列番号:4の塩基配列の616番目~618番目、及び、配列番号:4の塩基配列の688番目~690番目
(l)配列番号:3の塩基配列の37番目~39番目、及び、配列番号:3の塩基配列の79番目~81番目、及び、配列番号:4の塩基配列の328番目~330番目
[10][9]に記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子において、さらに下記(m)~(u)からなる塩基置換位置より選ばれる、少なくとも1つの塩基置換を含むことを特徴とする遺伝子。
(m)(b)又は(g)のとき、配列番号:3の塩基配列の37番目~39番目
(n)(b)又は(h)のとき、配列番号:3の塩基配列の79番目~81番目
(o)(d)及び(f)
(p)(f)のとき、配列番号:4の塩基配列の688番目~690番目
(q)(a)及び(i)
(r)(i)のとき、配列番号:3の塩基配列の37~39番目及び、配列番号:4の塩基配列の616番目~618番目
(s)(a)及び(d)のとき、配列番号:4の塩基配列の616番目~618番目
(t)(c)及び(h)のとき、配列番号:4の塩基配列の688番目~690番目
(u)(f)のとき、配列番号:4の塩基配列の688番目~690番目、及び、配列番号:4の塩基配列の691番目~693番目
[11][9]に記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子において、(e)のとき、(a)、(c)、(f)、(i)、(h)、配列番号:4の塩基配列の688番目~690番目、及び配列番号:4の塩基配列の691番目~693番目からなる塩基置換位置から選択される少なくとも1つの塩基の他の塩基への置換をさらに含むことを特徴とする遺伝子。
[12][9]~[11]いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子において、
配列番号:3の塩基配列の37番目~39番目が塩基置換されているとき、ATCがCTCに置換されており、
配列番号:3の塩基配列の79番目~81番目が塩基置換されているとき、ATGがATCに置換されており、
配列番号:3の塩基配列の274番目~276番目が塩基置換されているとき、GACがGAGに置換されており、
配列番号:3の塩基配列の280番目~282番目が塩基置換されているとき、ATGがATCに置換されており、
配列番号:3の塩基配列の589番目~591番目が塩基置換されているとき、GGCをTGCに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の10番目~12番目が塩基置換されているとき、GTGをATGに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の69番目~71番目が塩基置換されているとき、GTCがATCに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の235番目~237番目が塩基置換されているとき、CACがAACに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の286番目~288番目が塩基置換されているとき、CAGがCGTに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の319番目~321番目が塩基置換されているとき、CCCがATGに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の328番目~330番目が塩基置換されているとき、GAGがAACに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の616番目~618番目が塩基置換されているとき、CCGがCTGに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の676番目~678番目が塩基置換されているとき、GTCがATCに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の688番目~690番目が塩基置換されているとき、GCGがGAGに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の691番目~693番目が塩基置換されているとき、GCCがGTCに置換されていることを特徴とする遺伝子。
[13][9]~[12]いずれかに記載の遺伝子が、下記(aa)~(br)からなる塩基置換位置より選ばれる、少なくとも1つの塩基置換を含み、かつ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子。
(aa)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをATG、及び、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC
(ab)配列番号:3の塩基配列の442番目~444番目のGGCをGAC、及び、配列番号:3の塩基配列の610番目~612番目のGTCをCGC
(ac)配列番号:4の塩基配列の151番目~153番目のTTCをGTC、及び、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT
(ad)配列番号:4の塩基配列の352番目~354番目のTTCをGTC、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(ae)配列番号:4の塩基配列の478番目~480番目のCGGをTGG、及び、配列番号:4の塩基配列の556番目~558番目のCTGをCGG
(af)配列番号:3の塩基配列の16番目~18番目のCTGをACG、配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをATG、及び、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC
(ag)配列番号:3の塩基配列の55番目~57番目のGCGをGTG、配列番号:3の塩基配列の211番目~213番目のCGTをCAT、及び、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC
(ah)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをATG、配列番号:3の塩基配列の442番目~444番目のGGCをGAC、及び、配列番号:3の塩基配列の610番目~612番目のGTCをCGC
(ai)配列番号:4の塩基配列の28番目~30番目のACCをGAC、配列番号:4の塩基配列の352番目~354番目のTTCをGTC、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(aj)配列番号:4の塩基配列の109番目~111番目のTTCをCTC、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(ak)配列番号:4の塩基配列の109番目~111番目のTTCをGTC、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(al)配列番号:4の塩基配列の121番目~123番目のTTCをATC、配列番号:4の塩基配列の151番目~153番目のTTCをGTC、及び、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT
(am)配列番号:4の塩基配列の136番目~138番目のATGをAAG、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをCGG、及び、配列番号:4の塩基配列の634番目~636番目のTCCをTAC
(an)配列番号:4の塩基配列の142番目~144番目のCTGをGTG、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをCGG、及び、配列番号:4の塩基配列の634番目~636番目のTCCをTAC
(ao)配列番号:4の塩基配列の379番目~381番目のCTGをTCG、配列番号:4の塩基配列の478番目~480番目のCGGをTGG、及び、配列番号:4の塩基配列の556番目~558番目のCTGをCGG
(ap)配列番号:3の塩基配列の16番目~18番目のCTGをACG、配列番号:3の塩基配列の55番目~57番目のGCGをGTG、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC、配列番号:4の塩基配列の136番目~138番目のATGをAAG、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをCGG、及び、配列番号:4の塩基配列の634番目~636番目のTCCをTAC
(aq)配列番号:3の塩基配列の16番目~18番目のCTGをACG、配列番号:3の塩基配列の55番目~57番目のGCGをGTG、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC、配列番号:4の塩基配列の142番目~144番目のCTGをGTG、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをCGG、及び、配列番号:4の塩基配列の634番目~636番目のTCCをTAC
(ar)配列番号:3の塩基配列の16番目~18番目のCTGをGCG、配列番号:3の塩基配列の55番目~57番目のGCGをGTG、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC、配列番号:4の塩基配列の379番目~381番目のCTGをTCG、配列番号:4の塩基配列の478番目~480番目のCGGをTGG、及び、配列番号:4の塩基配列の556番目~558番目のCTGをCGG
(as)配列番号:3の塩基配列の16番目~18番目のCTGをACG、配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをATG、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC、配列番号:4の塩基配列の28番目~30番目のACCをGAC、配列番号:4の塩基配列の352番目~354番目のTTCをGTC、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(at)配列番号:3の塩基配列の55番目~57番目のGCGをGTG、配列番号:3の塩基配列の211番目~213番目のCGTをCAT、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC、配列番号:4の塩基配列の109番目~111番目のTTCをCTC、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(au)配列番号:3の塩基配列の55番目~57番目のGCGをGTG、配列番号:3の塩基配列の211番目~213番目のCGTをCAT、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC、配列番号:4の塩基配列の109番目~111番目のTTCをGTC、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(av)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをATG、配列番号:3の塩基配列の442番目~444番目のGGCをGAC、配列番号:3の塩基配列の610番目~612番目のGTCをCGC、配列番号:4の塩基配列の121番目~123番目のTTCをATC、配列番号:4の塩基配列の151番目~153番目のTTCをGTC、及び、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT
(aw)配列番号:3の塩基配列の442番目~444番目のGGCをGAC、配列番号:3の塩基配列の610番目~612番目のGTCをCGC、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(ax)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをGGG、及び、配列番号:3の塩基配列の562番目~564番目のACCをGGC
(ay)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをGCG、及び、配列番号:3の塩基配列の142番目~144番目のAACをCAA
(az)配列番号:3の塩基配列の142番目~144番目のAACをGAA、及び、配列番号:4の塩基配列の436番目~438番目のCGGをGGG
(ba)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをTGG、及び、配列番号:4の塩基配列の526番目~528番目のTACをTGC
(bb)配列番号:4の塩基配列の526番目~528番目のTACをATG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをGGC
(bc)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをTCG、及び、配列番号:4の塩基配列の97番目~99番目のGCGをGTG
(bd)配列番号:4の塩基配列の526番目~528番目のTACをGCC、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをGTC
(be)配列番号:4の塩基配列の118番目~120番目のACGをGTG、及び、配列番号:4の塩基配列の652番目~654番目のTGCをATG
(bf)配列番号:4の塩基配列の97番目~99番目のGCGをATG、及び、配列番号:4の塩基配列の526番目~528番目のTACをACC
(bg)配列番号:4の塩基配列の118番目~120番目のACGをCTG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをCTC
(bh)配列番号:4の塩基配列の118番目~120番目のACGをATT、及び、配列番号:4の塩基配列の181番目~183番目のGCCをGTC
(bi)配列番号:4の塩基配列の181番目~183番目のGCCをACG、及び、配列番号:4の塩基配列の652番目~654番目のTGCをTCC
(bj)配列番号:4の塩基配列の334番目~336番目のAAGをGTG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをATG
(bk)配列番号:4の塩基配列の181番目~183番目のGCCをTGG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをCAC
(bl)配列番号:4の塩基配列の181番目~183番目のGCCをCTC、及び、配列番号:4の塩基配列の334番目~336番目のAAGをATT
(bm)配列番号:4の塩基配列の436番目~438番目のCGGをGGG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをAGC
(bn)配列番号:4の塩基配列の511番目~513番目のAAGをGCG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをACC
(bo)配列番号:4の塩基配列の448番目~450番目のGCGをTCG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをTGT
(bp)配列番号:4の塩基配列の181番目~183番目のGCCをGGC、及び、配列番号:4の塩基配列の448番目~450番目のGCGをAAT
(bq)配列番号:4の塩基配列の181番目~183番目のGCCをTCG、及び、配列番号:4の塩基配列の478番目~480番目のCGGをATG
(br)配列番号:4の塩基配列の478番目~480番目のCGGをTGT、及び、配列番号:4の塩基配列の502番目~504番目のACGをGAG
[14][9]~[13]いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子の5'末端上流に更に、遺伝子の発現に必要とされるプロモーター配列を含むDNAと、該プロモーターの3'末端の下流に、配列番号:7に含まれるリボゾーム結合配列とを含む、連結されたDNA。
[15][14]に記載のDNAを含む、プラスミド。
[16][15]に記載のプラスミドによって宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
[17]ニトリルヒドラターゼ変異体の生産方法において、[16]に記載の形質転換体を培地で培養して、該形質転換体にプラスミドの有するニトリルヒドラターゼ遺伝子に基づくニトリルヒドラターゼ変異体を生産させる工程を含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体の生産方法。
鋳型として特許文献1の実施例3記載のプラスミドpPT-DB1、配列表の配列番号:7、及び、8に記載のプライマーを用いたPCR反応により、約0.7kbpの遺伝子断片を得た。上記PCR断片を制限酵素EcoRI及びNotIにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該DNA断片を精製した。同様に、EcoRI及びNotIによりpPT-DB1を切断、アガロースゲル電気泳動を行い、アガロースゲルから約3.9kbpのDNA断片のみを切り出した。この様にして得られた約0.7kbpと約3.9kbpのDNA断片をDNAライゲーションキット(宝酒造社製)を用いて連結させ、上記のリボゾーム結合配列が改変されたニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を作製した。
試験管に40μg/mLの硫酸第二鉄・七水和物及び10μg/mLの塩化コバルト・二水和物を含む5mLのLB液体培地を調製し、121℃・20分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が100μg/mLとなるようにアンピシリンを添加した後、各形質転換体を一白金耳植菌し、37℃・200rpmにて約20時間其々培養した。該培養終了液から40μLを取り、740μLの54mMトリス塩酸水溶液(pH8.0)に懸濁し、これに20μLのアクリロニトリルを添加して20℃で緩やかに攪拌しながら15分間反応させ、アクリルアミドを生成させた。反応終了後、HPLCを用いて反応液中のアクリルアミド含有量の分析を行った。
<酵素の熱安定性の比較>
上述の形質転換体の培養終了液から遠心分離(5000G、15分間)により各形質転換体を分離した。
各形質転換体0.1gを20mlの50mMトリス塩酸水溶液(pH8.0)に其々懸濁し、60℃にて2時間加熱処理した。加熱処理後に20℃に戻し、基質として0.5mlのアクリロニトリルを添加して、20℃で15分間反応させ、反応初速度を測定した。
〈分析条件〉
分析機器: 日本分光HPLC
カラム : YMC Pack ODS-A (150×6.00 mm)
分析温度: 40℃
移動相 : 3% アセトニトリル、10mM リン酸
反応及び分析は各形質転換体に対し3回以上行い、分注操作等でのデータのばらつきを補正した。
表2で示すようにニトリルヒドラターゼを(av)のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(2)を取得するために、特許文献2の実施例79に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(2)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(2)を得た。
表2で示すようにニトリルヒドラターゼを(bc)のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(3)を取得するために、宝酒造社製の「LA PCR in vitro mutagenesis Kit」(以後、変異導入キットと呼ぶ)を用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型としてPCR反応を行った。
アニーリング処理液にTaKaRa LA Taq(タカラバイオ株式会社製)を0.5μL加えて72℃で3分間加熱処理を行い、ヘテロ2本鎖を完成させた。
表2で示すようにニトリルヒドラターゼを(bh)のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(4)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号14、及び、15に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(4)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(4)を得た。
表3で示すようにニトリルヒドラターゼを(a)及び(av)のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(5)を取得するために、前記の参考例1記載の形質転換体(2)より回収したプラスミド(2)を鋳型とし、配列表の配列番号:16に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(5)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(5)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例1記載のプラスミド(2)に、αサブユニットの92番目のAspをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
表3で示すようにニトリルヒドラターゼを(a)及び(bc)のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(6)を取得するために、前記の参考例2記載の形質転換体(3)より回収したプラスミド(3)を鋳型とし、配列表の配列番号:16に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(6)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(6)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例2記載のプラスミド(3)に、αサブユニットの92番目のAspをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(6)、及び、そのベースとなった形質転換体(3)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表3で示すようにニトリルヒドラターゼを(a)及び(bh)のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(7)を取得するために、前記の参考例3記載の形質転換体(4)より回収したプラスミド(4)を鋳型とし、配列表の配列番号:16に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(7)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(7)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例3記載のプラスミド(4)に、αサブユニットの92番目のAspをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(7)、及び、そのベースとなった形質転換体(4)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表4で示すようにニトリルヒドラターゼを(ak)のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(8)を取得するために、特許文献2の実施例68に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(8)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(8)を得た。
表4で示すように(ap)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(9)を取得するために、特許文献2の実施例73に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(9)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(9)を得た。
表4で示すように(bp)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(10)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:17、及び、18に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(10)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(10)を得た。
表5で示すように(b)及び(ak)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(11)を取得するために、前記の参考例4記載の形質転換体(8)より回収したプラスミド(8)を鋳型とし、配列表の配列番号:19に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(11)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(11)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例4記載のプラスミド(8)に、αサブユニットの94番目のMetをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(11)、及び、そのベースとなった形質転換体(8)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表5で示すように(b)及び(ap)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(12)を取得するために、前記の参考例5記載の形質転換体(9)より回収したプラスミド(9)を鋳型とし、配列表の配列番号:19に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(12)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(12)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例5記載のプラスミド(9)に、αサブユニットの94番目のMetをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(12)、及び、そのベースとなった形質転換体(9)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表5で示すように(b)及び(bp)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(13)を取得するために、前記の参考例6記載の形質転換体(10)より回収したプラスミド(10)を鋳型とし、配列表の配列番号:19に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(13)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(13)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例6記載のプラスミド(10)に、αサブユニットの94番目のMetをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(13)、及び、そのベースとなった形質転換体(10)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表6で示すように(an)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(14)を取得するために、特許文献2の実施例71に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(14)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(14)を得た。
表6で示すように(be)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(15)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:20、及び、21に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(15)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(15)を得た。
表6で示すように(br)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(16)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:22、及び、23に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(16)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(16)を得た。
表7で示すように(c)及び(an)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(17)を取得するために、前記の参考例7記載の形質転換体(14)より回収したプラスミド(14)を鋳型とし、配列表の配列番号:24に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(17)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(17)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例7記載のプラスミド(14)に、αサブユニットの197番目のGlyをCysとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(17)、及び、そのベースとなった形質転換体(14)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表7で示すように(c)及び(be)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(18)を取得するために、前記の参考例8記載の形質転換体(15)より回収したプラスミド(15)を鋳型とし、配列表の配列番号:24に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(18)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(18)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例8記載のプラスミド(15)に、αサブユニットの197番目のGlyをCysとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(18)、及び、そのベースとなった形質転換体(15)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表7で示すように(c)及び(br)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(19)を取得するために、前記の参考例9記載の形質転換体(16)より回収したプラスミド(16)を鋳型とし、配列表の配列番号:24に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(19)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(19)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例9記載のプラスミド(16)に、αサブユニットの197番目のGlyをCysとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(19)、及び、そのベースとなった形質転換体(16)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表8で示すように(ar)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(20)を取得するために、特許文献2の実施例75に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(20)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(20)を得た。
表8で示すように(ax)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(21)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:25、及び、26に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(21)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(21)を得た。
表8で示すように(bd)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(22)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:27、及び、28に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(22)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(22)を得た。
表9で示すように(d)及び(ar)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(23)を取得するために、前記の参考例10記載の形質転換体(20)より回収したプラスミド(20)を鋳型とし、配列表の配列番号:29に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(23)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(23)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例10記載のプラスミド(20)に、βサブユニットの4番目のValをMetとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(23)、及び、そのベースとなった形質転換体(20)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表9で示すように(d)及び(ax)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(24)を取得するために、前記の参考例11記載の形質転換体(21)より回収したプラスミド(21)を鋳型とし、配列表の配列番号:29に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(24)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(24)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例11記載のプラスミド(21)に、βサブユニットの4番目のValをMetとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(24)、及び、そのベースとなった形質転換体(21)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表9で示すように(d)及び(bd)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(25)を取得するために、前記の参考例12記載の形質転換体(22)より回収したプラスミド(22)を鋳型とし、配列表の配列番号:29に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(25)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(19)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例12記載のプラスミド(22)に、βサブユニットの4番目のValをMetとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(25)、及び、そのベースとなった形質転換体(22)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表10で示すように(ao)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異したニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(26)を取得するために、特許文献2の実施例72に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(26)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(26)を得た。
表10で示すように(at)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(27)を取得するために、特許文献2の実施例77に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(27)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(27)を得た。
表11で示すようにβサブユニットの8番目及び(ao)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(28)を取得するために、前記の参考例13記載の形質転換体(26)より回収したプラスミド(26)を鋳型とし、配列表の配列番号:30に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(28)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(28)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例13記載のプラスミド(26)に、βサブユニットの8番目のGlyをAlaとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(28)、及び、そのベースとなった形質転換体(26)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表11で示すようにβサブユニットの8番目及び(at)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(29)を取得するために、前記の参考例14記載の形質転換体(27)より回収したプラスミド(27)を鋳型とし、配列表の配列番号:30に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(29)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(29)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例14記載のプラスミド(27)に、βサブユニットの8番目のGlyをAlaとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(29)、及び、そのベースとなった形質転換体(27)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表11で示すようにβサブユニットの8番目及び(br)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(30)を取得するために、前記の参考例9記載の形質転換体(16)より回収したプラスミド(16)を鋳型とし、配列表の配列番号:30に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(30)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(30)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例9記載のプラスミド(16)に、βサブユニットの8番目のGlyをAlaとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(30)、及び、そのベースとなった形質転換体(16)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表12で示すように(au)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(31)を取得するために、特許文献2の実施例78に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(31)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(31)を得た。
表12で示すように(bf)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(32)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:31、及び、32に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(32)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(32)を得た。
表13で示すように(f)及び(au)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(33)を取得するために、前記の参考例15記載の形質転換体(31)より回収したプラスミド(31)を鋳型とし、配列表の配列番号:33に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(33)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(33)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例15記載のプラスミド(31)に、βサブユニットの79番目のHisをAsnとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(33)、及び、そのベースとなった形質転換体(31)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表13で示すように(f)及び(bf)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(34)を取得するために、前記の参考例16記載の形質転換体(32)より回収したプラスミド(32)を鋳型とし、配列表の配列番号:33に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(34)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(34)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例16記載のプラスミド(32)に、βサブユニットの79番目のHisをAsnとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(34)、及び、そのベースとなった形質転換体(32)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表13で示すように(f)及び(bp)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(35)を取得するために、前記の参考例6記載の形質転換体(10)より回収したプラスミド(10)を鋳型とし、配列表の配列番号:33に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(35)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(35)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例6記載のプラスミド(10)に、βサブユニットの79番目のHisをAsnとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(35)、及び、そのベースとなった形質転換体(10)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表14で示すように(aa)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(36)を取得するために、特許文献2の実施例58に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(36)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(36)を得た。
表14で示すように(ah)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(37)を取得するために、特許文献2の実施例65に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(37)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(37)を得た。
表14で示すように(aq)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(38)を取得するために、特許文献2の実施例74に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(38)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(38)を得た。
表15で示すように(g)及び(aa)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(39)を取得するために、前記の参考例17記載の形質転換体(36)より回収したプラスミド(36)を鋳型とし、配列表の配列番号:34に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(39)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(39)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例17記載のプラスミド(36)に、βサブユニットの96番目のGlnをArgとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(39)、及び、そのベースとなった形質転換体(36)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表15で示すように(g)及び(ah)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(40)を取得するために、前記の参考例18記載の形質転換体(37)より回収したプラスミド(37)を鋳型とし、配列表の配列番号:34に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(40)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(40)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例18記載のプラスミド(37)に、βサブユニットの96番目のGlnをArgとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(40)、及び、そのベースとなった形質転換体(37)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表15で示すように(g)及び(aq)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(41)を取得するために、前記の参考例19記載の形質転換体(38)より回収したプラスミド(38)を鋳型とし、配列表の配列番号:34に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(41)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(41)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例19記載のプラスミド(38)に、βサブユニットの96番目のGlnをArgとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(41)、及び、そのベースとなった形質転換体(38)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表16で示すように(ae)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(42)を取得するために、特許文献2の実施例62に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(42)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(42)を得た。
表16で示すように(bk)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(43)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:35、及び、36に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(43)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(43)を得た。
表17で示すように(h)及び(ae)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(44)を取得するために、前記の参考例20記載の形質転換体(42)より回収したプラスミド(42)を鋳型とし、配列表の配列番号:37に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(44)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(44)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例20記載のプラスミド(42)に、βサブユニットの107番目のProをMetとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(44)、及び、そのベースとなった形質転換体(42)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表17で示すように(h)及び(au)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(45)を取得するために、前記の参考例15記載の形質転換体(31)より回収したプラスミド(31)を鋳型とし、配列表の配列番号:68に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(45)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(45)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例15記載のプラスミド(31)に、βサブユニットの107番目のProをMetとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(45)、及び、そのベースとなった形質転換体(31)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表17で示すように(h)及び(bk)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(46)を取得するために、前記の参考例21記載の形質転換体(43)より回収したプラスミド(43)を鋳型とし、配列表の配列番号:37に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(46)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(46)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例21記載のプラスミド(43)に、βサブユニットの107番目のProをMetとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(46)、及び、そのベースとなった形質転換体(43)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表18で示すように(i)及び(aa)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(47)を取得するために、前記の参考例17記載の形質転換体(36)より回収したプラスミド(36)を鋳型とし、配列表の配列番号:38に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(47)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(47)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例17記載のプラスミド(36)に、βサブユニットの226番目のValをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(47)、及び、そのベースとなった形質転換体(36)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表18で示すように(i)及び(ak)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(48)を取得するために、前記の参考例4記載の形質転換体(8)より回収したプラスミド(8)を鋳型とし、配列表の配列番号:38に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(48)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(48)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例4記載のプラスミド(8)に、βサブユニットの226番目のValをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(48)、及び、そのベースとなった形質転換体(8)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表18で示すように(i)及び(be)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異するニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(49)を取得するために、前記の参考例8記載の形質転換体(15)より回収したプラスミド(15)を鋳型とし、配列表の配列番号:38に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(49)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(49)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例8記載のプラスミド(15)に、βサブユニットの226番目のValをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(49)、及び、そのベースとなった形質転換体(15)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表19で示すように(af)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(50)を取得するために、特許文献2の実施例63に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(50)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(50)を得た。
表19で示すように(bq)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミドを取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:39、及び、40に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(51)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(51)を得た。
表19で示すように(bj)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(52)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:41、及び、42に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(52)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(52)を得た。
表20で示すように(m-1)及び(af)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(53)を取得するために、前記の参考例22記載の形質転換体(50)より回収したプラスミド(50)を鋳型とし、配列表の配列番号:43、及び、19に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(53)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(53)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例22記載のプラスミド(50)に、αサブユニットの13番目のIleをLeu、及び、αサブユニットの94番目のMetをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(53)、及び、そのベースとなった形質転換体(50)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表20で示すように(m-1)及び(bq)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(54)を取得するために、前記の参考例23記載の形質転換体(51)より回収したプラスミド(51)を鋳型とし、配列表の配列番号:43、及び、19に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(54)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(54)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例23記載のプラスミド(51)に、αサブユニットの13番目のIleをLeu、及び、αサブユニットの94番目のMetをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(54)、及び、そのベースとなった形質転換体(51)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表20で示すように(m-1)及び(bj)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(55)を取得するために、前記の参考例24記載の形質転換体(52)より回収したプラスミド(52)を鋳型とし、配列表の配列番号:43、及び、19に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(55)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(55)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例24記載のプラスミド(52)に、αサブユニットの13番目のIleをLeu、及び、αサブユニットの94番目のMetをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(55)、及び、そのベースとなった形質転換体(52)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表21で示すように(am)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(56)を取得するために、特許文献2の実施例70に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(56)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(56)を得た。
表21で示すように(ay)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(57)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:44、及び、45に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(57)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(57)を得た。
表22で示すように(m-2)及び(am)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(58)を取得するために、前記の参考例25記載の形質転換体(56)より回収したプラスミド(56)を鋳型とし、配列表の配列番号:43、及び、34に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(58)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(58)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例25記載のプラスミド(56)に、αサブユニットの13番目のIleをLeu、及び、βサブユニットの96番目のGlnをArgとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(58)、及び、そのベースとなった形質転換体(56)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表22で示すように(m-2)及び(at)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(59)を取得するために、前記の参考例14記載の形質転換体(27)より回収したプラスミド(27)を鋳型とし、配列表の配列番号:43、及び、34に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(59)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(59)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例14記載のプラスミド(27)に、αサブユニットの13番目のIleをLeu、及び、βサブユニットの96番目のGlnをArgとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(59)、及び、そのベースとなった形質転換体(27)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表22で示すように(m-2)及び(ay)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(60)を取得するために、前記の参考例26記載の形質転換体(57)より回収したプラスミド(57)を鋳型とし、配列表の配列番号:43、及び、34に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(60)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(60)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例26記載のプラスミド(57)に、αサブユニットの13番目のIleをLeu、及び、βサブユニットの96番目のGlnをArgとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(60)、及び、そのベースとなった形質転換体(57)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表23で示すように(n-1)及び(af)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(61)を取得するために、前記の参考例22記載の形質転換体(50)より回収したプラスミド(50)を鋳型とし、配列表の配列番号:46、及び、19に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(61)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(61)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例22記載のプラスミド(50)に、αサブユニットの27番目のMetをIle、及び、αサブユニットの94番目のMetをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(61)、及び、そのベースとなった形質転換体(50)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表23で示すように(n-1)及び(ao)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異したニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(62)を取得するために、前記の参考例13記載の形質転換体(26)より回収したプラスミド(26)を鋳型とし、配列表の配列番号:46、及び、19に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(62)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(62)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例13記載のプラスミド(26)に、αサブユニットの27番目のMetをIle、及び、αサブユニットの94番目のMetをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(62)、及び、そのベースとなった形質転換体(26)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表23で示すように(n-1)及び(ax)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(63)を取得するために、前記の参考例11記載の形質転換体(21)より回収したプラスミド(21)を鋳型とし、配列表の配列番号:46、及び、19に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(63)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(63)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例11記載のプラスミド(21)に、αサブユニットの27番目のMetをIle、及び、αサブユニットの94番目のMetをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(63)、及び、そのベースとなった形質転換体(21)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表24で示すように(aj)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(64)を取得するために、特許文献2の実施例67に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(64)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(64)を得た。
表24で示すように(as)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(65)を取得するために、特許文献2の実施例76に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(65)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(65)を得た。
表24で示すように(bb)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(66)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:47、及び、48に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(66)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(66)を得た。
表25で示すように(n-2)及び(aj)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(67)を取得するために、前記の参考例27記載の形質転換体(64)より回収したプラスミド(64)を鋳型とし、配列表の配列番号:46、及び、68に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(67)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(67)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例27記載のプラスミド(64)に、αサブユニットの27番目のMetをIle、及び、βサブユニットの107番目のProをMetとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(67)、及び、そのベースとなった形質転換体(64)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表25で示すように(n-2)及び(as)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(68)を取得するために、前記の参考例28記載の形質転換体(65)より回収したプラスミド(65)を鋳型とし、配列表の配列番号:46、及び、37に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(68)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(68)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例28記載のプラスミド(65)に、αサブユニットの27番目のMetをIle、及び、βサブユニットの107番目のProをMetとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(68)、及び、そのベースとなった形質転換体(65)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表25で示すように(n-2)及び(bb)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(69)を取得するために、前記の参考例29記載の形質転換体(66)より回収したプラスミド(66)を鋳型とし、配列表の配列番号:46、及び、37に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(69)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(69)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例29記載のプラスミド(66)に、αサブユニットの27番目のMetをIle、及び、βサブユニットの107番目のProをMetとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(69)、及び、そのベースとなった形質転換体(66)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表26で示すように(al)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(70)を取得するために、特許文献2の実施例69に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(70)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(70)を得た。
表26で示すように(aw)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(71)を取得するために、特許文献2実施例80に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(71)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(71)を得た。
表26で示すように(bl)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(72)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:49、及び、50に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(72)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(72)を得た。
表27で示すように(q)及び(al)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(73)を取得するために、前記の参考例30記載の形質転換体(70)より回収したプラスミド(70)を鋳型とし、配列表の配列番号:16、及び、38に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(73)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(73)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例30記載のプラスミド(70)に、αサブユニットの92番目のAspをGlu、及び、βサブユニットの226番目のValをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(73)、及び、そのベースとなった形質転換体(70)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表27で示すように(q)及び(aw)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(74)を取得するために、前記の参考例31記載の形質転換体(71)より回収したプラスミド(71)を鋳型とし、配列表の配列番号:16、及び、38に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(74)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(74)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例31記載のプラスミド(71)に、αサブユニットの92番目のAspをGlu、及び、βサブユニットの226番目のValをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(74)、及び、そのベースとなった形質転換体(71)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表27で示すように(q)及び(bl)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(75)を取得するために、前記の参考例32記載の形質転換体(72)より回収したプラスミド(72)を鋳型とし、配列表の配列番号:16、及び、38に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(75)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(75)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例32記載のプラスミド(72)に、αサブユニットの92番目のAspをGlu、及び、βサブユニットの226番目のValをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(75)、及び、そのベースとなった形質転換体(72)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表28で示すように(bi)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(76)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:51、及び、52に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(76)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(76)を得た。
表28で示すように(bm)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(77)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:53、及び、54に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(77)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(77)を得た。
表29で示すように(o)及び(an)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(78)を取得するために、前記の参考例7記載の形質転換体(14)より回収したプラスミド(14)を鋳型とし、配列表の配列番号:29、及び、33に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(78)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(78)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例7記載のプラスミド(14)に、βサブユニットの4番目のValをMet、及び、βサブユニットの79番目のHisをAsnとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(78)、及び、そのベースとなった形質転換体(14)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表29で示すように(o)及び(bi)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(79)を取得するために、前記の参考例33記載の形質転換体(76)より回収したプラスミド(76)を鋳型とし、配列表の配列番号:29、及び、33に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(79)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(79)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例33記載のプラスミド(76)に、βサブユニットの4番目のValをMet、及び、βサブユニットの79番目のHisをAsnとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(79)、及び、そのベースとなった形質転換体(76)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表29で示すように(o)及び(bm)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(80)を取得するために、前記の参考例34記載の形質転換体(77)より回収したプラスミド(77)を鋳型とし、配列表の配列番号:29、及び、33に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(80)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(80)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例34記載のプラスミド(77)に、βサブユニットの4番目のValをMet、及び、βサブユニットの79番目のHisをAsnとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(80)、及び、そのベースとなった形質転換体(77)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表30で示すように(ag)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(81)を取得するために、特許文献2の実施例64に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(81)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(81)を得た。
表30で示すように(ai)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(82)を取得するために、特許文献2の実施例66に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(82)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(82)を得た。
表31で示すように(p)及び(ag)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(83)を取得するために、前記の参考例35記載の形質転換体(81)より回収したプラスミド(81)を鋳型とし、配列表の配列番号:33、及び、60に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(83)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(83)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例35記載のプラスミド(81)に、βサブユニットの79番目のHisをAsn、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(83)、及び、そのベースとなった形質転換体(81)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表31で示すように(p)及び(ai)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(84)を取得するために、前記の参考例36記載の形質転換体(82)より回収したプラスミド(82)を鋳型とし、配列表の配列番号:33、及び、60に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(84)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(84)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例36記載のプラスミド(82)に、βサブユニットの79番目のHisをAsn、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(84)、及び、そのベースとなった形質転換体(82)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表31で示すように(p)及び(aq)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(85)を取得するために、前記の参考例19記載の形質転換体(38)より回収したプラスミド(38)を鋳型とし、配列表の配列番号:33、及び、60に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(85)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(85)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例31記載のプラスミド(38)に、βサブユニットの79番目のHisをAsn、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(85)、及び、そのベースとなった形質転換体(38)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表32で示すように(ad)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(86)を取得するために、特許文献2の実施例61に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(86)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(86)を得た。
表32で示すように(bg)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(87)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:55、及び、56に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(87)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(87)を得た。
表33で示すように(j)及び(ad)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(88)を取得するために、前記の参考例37記載の形質転換体(86)より回収したプラスミド(86)を鋳型とし、配列表の配列番号:57、及び、58に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(88)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(88)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例37記載のプラスミド(86)に、βサブユニットの110番目のGluをAsn、及び、βサブユニットの231番目のAlaをValとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(88)、及び、そのベースとなった形質転換体(86)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表33で示すように(j)及び(aj)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(89)を取得するために、前記の参考例27記載の形質転換体(64)より回収したプラスミド(64)を鋳型とし、配列表の配列番号:57、及び、58に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(89)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(89)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例27記載のプラスミド(64)に、βサブユニットの110番目のGluをAsn、及び、βサブユニットの231番目のAlaをValとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(89)、及び、そのベースとなった形質転換体(64)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表33で示すように(j)及び(bg)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(90)を取得するために、前記の参考例38記載の形質転換体(87)より回収したプラスミド(87)を鋳型とし、配列表の配列番号:57、及び、58に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(90)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(90)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例38記載のプラスミド(87)に、βサブユニットの110番目のGluをAsn、及び、βサブユニットの231番目のAlaをValとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(90)、及び、そのベースとなった形質転換体(87)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表34で示すように(k)及び(ad)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(91)を取得するために、をコードするプラスミドを取得するため、前記の参考例37記載の形質転換体(86)より回収したプラスミド(86)を鋳型とし、配列表の配列番号:59、及び、60に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(91)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(91)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例37記載のプラスミド(86)に、βサブユニットの206番目のProをLeu、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(91)、及び、そのベースとなった形質転換体(86)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表34で示すように(k)及び(as)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(92)を取得するために、前記の参考例28記載の形質転換体(65)より回収したプラスミド(65)を鋳型とし、配列表の配列番号:59、及び、60に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(92)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(92)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例28記載のプラスミド(65)に、βサブユニットの206番目のProをLeu、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(92)、及び、そのベースとなった形質転換体(65)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表34で示すように(k)及び(av)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(93)を取得するために、前記の参考例1記載の形質転換体(2)より回収したプラスミド(2)を鋳型とし、配列表の配列番号:59、及び、60に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(93)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(93)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例1記載のプラスミド(2)に、βサブユニットの206番目のProをLeu、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(93)、及び、そのベースとなった形質転換体(2)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表35で示すように(bo)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(94)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:61、及び、62に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(94)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(94)を得た。
表36で示すように(l)及び(ag)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(95)を取得するために、前記の参考例35記載の形質転換体(81)より回収したプラスミド(81)を鋳型とし、配列表の配列番号:43、46、及び、57に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(95)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(95)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例35記載のプラスミド(81)に、αサブユニットの13番目のIleをLeu、及び、αサブユニットの27番目のMetをIle、及び、βサブユニットの110番目のGluをAsnとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(95)、及び、そのベースとなった形質転換体(81)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表36で示すように(l)及び(am)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(96)を取得するために、前記の参考例25記載の形質転換体(56)より回収したプラスミド(56)を鋳型とし、配列表の配列番号:43、46、及び、57に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(96)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(96)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例25記載のプラスミド(56)に、αサブユニットの13番目のIleをLeu、及び、αサブユニットの27番目のMetをIle、及び、βサブユニットの110番目のGluをAsnとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(96)、及び、そのベースとなった形質転換体(56)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表36で示すように(l)及び(bo)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(97)を取得するために、前記の参考例39記載の形質転換体(94)より回収したプラスミド(94)を鋳型とし、配列表の配列番号:43、46、及び、57に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(97)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(97)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例39記載のプラスミド(94)に、αサブユニットの13番目のIleをLeu、及び、αサブユニットの27番目のMetをIle、及び、βサブユニットの110番目のGluをAsnとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(97)、及び、そのベースとなった形質転換体(94)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表37で示すように(ab)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(98)を取得するために、特許文献2の実施例59に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(98)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(98)を得た。
表38で示すように(r)及び(ab)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(99)を取得するために、前記の参考例40記載の形質転換体(98)より回収したプラスミド(98)を鋳型とし、配列表の配列番号:43、59、及び、38に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(99)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(99)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例40記載のプラスミド(98)に、αサブユニットの13番目のIleをLeu、及び、βサブユニットの206番目のProをLeu、及び、βサブユニットの226番目のValをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(99)、及び、そのベースとなった形質転換体(98)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表38で示すように(r)及び(ai)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(100)を取得するために、前記の参考例36記載の形質転換体(82)より回収したプラスミド(82)を鋳型とし、配列表の配列番号:43、59、及び、38に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(100)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(100)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例36記載のプラスミド(82)に、αサブユニットの13番目のIleをLeu、及び、βサブユニットの206番目のProをLeu、及び、βサブユニットの226番目のValをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(100)、及び、そのベースとなった形質転換体(82)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表38で示すように(r)及び(bh)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(101)を取得するために、前記の参考例3記載の形質転換体(4)より回収したプラスミド(4)を鋳型とし、配列表の配列番号:43、59、及び、38に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(101)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(101)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例3記載のプラスミド(4)に、αサブユニットの13番目のIleをLeu、及び、βサブユニットの206番目のProをLeu、及び、βサブユニットの226番目のValをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(101)、及び、そのベースとなった形質転換体(4)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表39で示すように(ac)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(102)を取得するために、特許文献2の実施例60に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例1記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(102)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(102)を得た。
表40で示すように(s)及び(ab)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(103)を取得するために、前記の参考例40記載の形質転換体(98)より回収したプラスミド(98)を鋳型とし、配列表の配列番号:16、29、及び、59に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(103)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(103)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例40記載のプラスミド(98)に、αサブユニットの92番目のAspをGlu、及び、βサブユニットの4番目のValをMet、及び、βサブユニットの206番目のProをLeuとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(103)、及び、そのベースとなった形質転換体(98)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表40で示すように(s)及び(ah)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(104)を取得するために、前記の参考例18記載の形質転換体(37)より回収したプラスミド(37)を鋳型とし、配列表の配列番号:16、29、及び、59に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(104)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(104)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例18記載のプラスミド(37)に、αサブユニットの92番目のAspをGlu、及び、βサブユニットの4番目のValをMet、及び、βサブユニットの206番目のProをLeuとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(104)、及び、そのベースとなった形質転換体(37)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表40で示すように(s)及び(ac)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(105)を取得するために、前記の参考例41記載の形質転換体(102)より回収したプラスミド(102)を鋳型とし、配列表の配列番号:16、29、及び、59に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(105)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(105)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例41記載のプラスミド(102)に、αサブユニットの92番目のAspをGlu、及び、βサブユニットの4番目のValをMet、及び、βサブユニットの206番目のProをLeuとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(105)、及び、そのベースとなった形質転換体(102)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表41で示すように(az)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(106)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:65、及び、53に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(106)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(106)を得た。
表42で示すように(t)及び(ac)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(107)を取得するために、前記の参考例41記載の形質転換体(102)より回収したプラスミド(102)を鋳型とし、配列表の配列番号:24、37、及び、60に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(107)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(107)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例41記載のプラスミド(102)に、αサブユニットの197番目のGlyをCys、及び、βサブユニットの107番目のProをMet、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(107)、及び、そのベースとなった形質転換体(102)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表42で示すように(t)及び(al)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(108)を取得するために、前記の参考例30記載の形質転換体(70)より回収したプラスミド(70)を鋳型とし、配列表の配列番号:24、37、及び、60に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(108)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(108)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例30記載のプラスミド(70)に、αサブユニットの197番目のGlyをCys、及び、βサブユニットの107番目のProをMet、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(108)、及び、そのベースとなった形質転換体(70)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表42で示すように(t)及び(az)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(109)を取得するために、前記の参考例42記載の形質転換体(106)より回収したプラスミド(106)を鋳型とし、配列表の配列番号:24、37、及び、60に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(109)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(109)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例43記載のプラスミド(106)に、αサブユニットの197番目のGlyをCys、及び、βサブユニットの107番目のProをMet、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(109)、及び、そのベースとなった形質転換体(106)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表43で示すように(ba)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(110)を取得するために、上記参考例2記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例1記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(1)を鋳型とし、配列表の配列番号:66、及び、67に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(110)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(110)を得た。
表44で示すように(u)及び(aq)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(111)を取得するために、前記の参考例19記載の形質転換体(38)より回収したプラスミド(38)を鋳型とし、配列表の配列番号:33、及び、69に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(111)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(111)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例19記載のプラスミド(38)に、βサブユニットの79番目のHisをAsn、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGlu、及び、βサブユニットの231番目のAlaをValとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(111)、及び、そのベースとなった形質転換体(38)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表44で示すように(u)及び(ap)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(112)を取得するために、前記の参考例5記載の形質転換体(9)より回収したプラスミド(9)を鋳型とし、配列表の配列番号:33、及び、69に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(112)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(112)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例5記載のプラスミド(9)に、βサブユニットの79番目のHisをAsn、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGlu、及び、βサブユニットの231番目のAlaをValとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(112)、及び、そのベースとなった形質転換体(9)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表44で示すように(u)及び(ba)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(113)を取得するために、前記の参考例43記載の形質転換体(110)より回収したプラスミド(110)を鋳型とし、配列表の配列番号:33、及び、69に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(113)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(113)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例43記載のプラスミド(110)に、βサブユニットの79番目のHisをAsn、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGlu、及び、βサブユニットの231番目のAlaをValとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(113)、及び、そのベースとなった形質転換体(110)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表45で示すように(v)及び(al)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(114)を取得するために、前記の参考例30記載の形質転換体(70)より回収したプラスミド(70)を鋳型とし、配列表の配列番号:16、38、及び、70に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(114)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(114)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例30記載のプラスミド(70)に、αサブユニットの92番目のAspをGlu、βサブユニットの24番目のValをIle、及び、βサブユニットの226番目のValをIleとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(114)、及び、そのベースとなった形質転換体(70)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表46で示すように(w)及び(al)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(115)を取得するために、前記の参考例30記載の形質転換体(70)より回収したプラスミド(70)を鋳型とし、配列表の配列番号:24、37、60及び、70に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(115)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(115)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例30記載のプラスミド(70)に、αサブユニットの197番目のGlyをCys、βサブユニットの24番目のValをIle、βサブユニットの107番目のProをMet、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(115)、及び、そのベースとなった形質転換体(70)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表46で示すように(w)及び(az)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(116)を取得するために、前記の参考例42記載の形質転換体(106)より回収したプラスミド(106)を鋳型とし、配列表の配列番号:24、37、60、及び、70に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(116)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(116)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例42記載のプラスミド(106)に、αサブユニットの197番目のGlyをCys、βサブユニットの24番目のValをIle、βサブユニットの107番目のProをMet、及び、βサブユニットの230番目のAlaをGluとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(116)、及び、そのベースとなった形質転換体(106)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
表47で示すように(x)及び(aq)のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体(117)を取得するために、前記の参考例19記載の形質転換体(38)より回収したプラスミド(38)を鋳型とし、配列表の配列番号:33、69、及び70に記載のプライマーを用い、参考例2に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド(117)を作製した。該プラスミドにて大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(117)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例19記載のプラスミド(38)に、βサブユニットの24番目のValをIle、βサブユニットの79番目のHisをAsn、βサブユニットの230番目のAlaをGlu、及び、βサブユニットの231番目のAlaをValとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体(117)、及び、そのベースとなった形質転換体(38)を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例1記載の方法と同様の方法により比較した。
Claims (17)
- 3以下1以上のアミノ酸置換により、ニトリルヒドラターゼの2以上の性質を改善する少なくとも1つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むことを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体。
- 請求項1に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、改善される前記性質が反応初速度及び熱安定性であることを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体。
- 請求項1又は2に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、
配列表の配列番号:1に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号:2に示されるβサブユニットとからなり、下記(a)~(l)からなるアミノ酸置換位置より選ばれる、少なくとも1つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むことを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体。
(a)αサブユニットの92番目
(b)αサブユニットの94番目
(c)αサブユニットの197番目
(d)βサブユニットの4番目
(e)βサブユニットの24番目
(f)βサブユニットの79番目
(g)βサブユニットの96番目
(h)βサブユニットの107番目
(i)βサブユニットの226番目
(j)βサブユニットの110番目、及び、βサブユニットの231番目
(k)βサブユニットの206番目、及び、βサブユニットの230番目
(l)αサブユニットの13番目、αサブユニットの27番目、及び、βサブユニットの110番目 - 請求項3に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、さらに下記(m)~(u)からなるアミノ酸置換位置より選ばれる、少なくとも1つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体。
(m)(b)又は(g)のとき、αサブユニットの13番目
(n)(b)又は(h)のとき、αサブユニットの27番目
(o)(d)及び(f)
(p)(f)のとき、βサブユニットの230番目
(q)(a)及び(i)
(r)(i)のとき、αサブユニットの13番目、及び、βサブユニットの206番目
(s)(a)及び(d)のとき、βサブユニットの206番目
(t)(c)及び(h)のとき、βサブユニットの230番目
(u)(f)のとき、βサブユニットの230番目、及び、βサブユニットの231番目 - 請求項3に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、(e)のとき、(a)、(c)、(f)、(i)、(h)、βサブユニットの230番目、及びβサブユニットの231番目からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換をさらに含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体。
- 請求項1乃至5いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、
αサブユニットの13番目のアミノ酸が置換されているとき、IleがLeuに置換されており、
αサブユニットの27番目のアミノ酸が置換されているとき、MetがIleに置換されており、
αサブユニットの92番目のアミノ酸が置換されているとき、AspがGluに置換されており、
αサブユニットの94番目のアミノ酸が置換されているとき、MetがIleに置換されており、
αサブユニットの197番目のアミノ酸が置換されているとき、GlyがCysに置換されており、
βサブユニットの4番目のアミノ酸が置換されているとき、ValがMetに置換されており、
βサブユニットの24番目のアミノ酸が置換されているとき、ValがIleに置換されており、
βサブユニットの79番目のアミノ酸が置換されているとき、HisがAsnに置換されており、
βサブユニットの96番目のアミノ酸が置換されているとき、GlnがArgに置換されており、
βサブユニットの107番目のアミノ酸が置換されているとき、ProがMetに置換されており、
βサブユニットの110番目のアミノ酸が置換されているとき、GluがAsnに置換されており、
βサブユニットの206番目のアミノ酸が置換されているとき、ProがLeuに置換されており、
βサブユニットの226番目のアミノ酸が置換されているとき、ValがIleに置換されており、
βサブユニットの230番目のアミノ酸が置換されているとき、AlaがGluに置換され
βサブユニットの231番目のアミノ酸が置換されているとき、AlaがValに置換されていることを特徴とするニトリルターゼ変異体。 - 請求項3乃至6いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、更に下記(aa)~(br)からなるアミノ酸置換より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸の置換を含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体。
(aa)αサブユニットの36番目のThrをMet、及び、αサブユニットの126番目のPheをTyr
(ab)αサブユニットの148番目のGlyをAsp、及び、αサブユニットの204番目のValをArg
(ac)βサブユニットの51番目のPheをVal、及び、βサブユニットの108番目のGluをAsp
(ad)βサブユニットの118番目のPheをVal、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(ae)βサブユニットの160番目のArgをTrp、及び、βサブユニットの186番目のLeuをArg
(af)αサブユニットの6番目のLeuをThr、αサブユニットの36番目のThrをMet、及び、αサブユニットの126番目のPheをTyr
(ag)αサブユニットの19番目のAlaをVal、αサブユニットの71番目のArgをHis、及び、αサブユニットの126番目のPheをTyr
(ah)αサブユニットの36番目のThrをMet、αサブユニットの148番目のGlyをAsp、及び、αサブユニットの204番目のValをArg
(ai)βサブユニットの10番目のThrをAsp、βサブユニットの118番目のPheをVal、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(aj)βサブユニットの37番目のPheをLeu、βサブユニットの108番目のGluをAsp、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(ak)βサブユニットの37番目のPheをVal、βサブユニットの108番目のGluをAsp、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(al)βサブユニットの41番目のPheをIle、βサブユニットの51番目のPheをVal、及び、βサブユニットの108番目のGluをAsp
(am)βサブユニットの46番目のMetをLys、βサブユニットの108番目のGluをArg、及び、βサブユニットの212番目のSerをTyr
(an)βサブユニットの48番目のLeuをVal、βサブユニットの108番目のGluをArg、及び、βサブユニットの212番目のSerをTyr
(ao)βサブユニットの127番目のLeuをSer、βサブユニットの160番目のArgをTrp、及び、βサブユニットの186番目のLeuをArg
(ap)αサブユニットの6番目のLeuをThr、αサブユニットの19番目のAlaをVal、αサブユニットの126番目のPheをTyr、βサブユニットの46番目のMetをLys、βサブユニットの108番目のGluをArg、及び、βサブユニットの212番目のSerをTyr
(aq)αサブユニットの6番目のLeuをThr、αサブユニットの19番目のAlaをVal、αサブユニットの126番目のPheをTyr、βサブユニットの48番目のLeuをVal、βサブユニットの108番目のGluをArg、及び、βサブユニットの212番目のSerをTyr
(ar)αサブユニットの6番目のLeuをAla、αサブユニットの19番目のAlaをVal、αサブユニットの126番目のPheをTyr、βサブユニットの127番目のLeuをSer、βサブユニットの160番目のArgをTrp、及び、βサブユニットの186番目のLeuをArg
(as)αサブユニットの6番目のLeuをThr、αサブユニットの36番目のThrをMet、αサブユニットの126番目のPheをTyr、βサブユニットの10番目のThrをAsp、βサブユニットの118番目のPheをVal、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(at)αサブユニットの19番目のAlaをVal、αサブユニットの71番目のArgをHis、αサブユニットの126番目のPheをTyr、βサブユニットの37番目のPheをLeu、βサブユニットの108番目のGluをAsp、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(au)αサブユニットの19番目のAlaをVal、αサブユニットの71番目のArgをHis、αサブユニットの126番目のPheをTyr、βサブユニットの37番目のPheをVal、βサブユニットの108番目のGluをAsp、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(av)αサブユニットの36番目のThrをMet、αサブユニットの148番目のGlyをAsp、αサブユニットの204番目のValをArg、βサブユニットの41番目のPheをIle、βサブユニットの51番目のPheをVal、及び、βサブユニットの108番目のGluをAsp
(aw)αサブユニットの148番目のGlyをAsp、αサブユニットの204番目のValをArg、βサブユニットの108番目のGluをAsp、及び、βサブユニットの200番目のAlaをGlu
(ax)αサブユニットの36番目のThrをGly、及び、αサブユニットの188番目のThrをGly
(ay)αサブユニットの36番目のThrをAla、及び、αサブユニットの48番目のAsnをGln
(az)αサブユニットの48番目のAsnをGlu、及び、βサブユニットの146番目のArgをGly
(ba)αサブユニットの36番目のThrをTrp、及び、βサブユニットの176番目のTyrをCys
(bb)βサブユニットの176番目のTyrをMet、及び、βサブユニットの217番目のAspをGly
(bc)αサブユニットの36番目のThrをSer、及び、βサブユニットの33番目のAlaをVal
(bd)βサブユニットの176番目のTyrをAla、及び、βサブユニットの217番目のAspをVal
(be)βサブユニットの40番目のThrをVal、及び、βサブユニットの218番目のCysをMet
(bf)βサブユニットの33番目のAlaをMet、及び、βサブユニットの176番目のTyrをThr
(bg)βサブユニットの40番目のThrをLeu、及び、βサブユニットの217番目のAspをLeu
(bh)βサブユニットの40番目のThrをIle、及び、βサブユニットの61番目のAlaをVal
(bi)βサブユニットの61番目のAlaをThr、及び、βサブユニットの218番目のCysをSer
(bj)βサブユニットの112番目のLysをVal、及び、βサブユニットの217番目のAspをMet
(bk)βサブユニットの61番目のAlaをTrp、及び、βサブユニットの217番目のAspをHis
(bl)βサブユニットの61番目のAlaをLeu、及び、βサブユニットの112番目のLysをIle
(bm)βサブユニットの146番目のArgをGly、及び、βサブユニットの217番目のAspをSer
(bn)βサブユニットの171番目のLysをAla、及び、βサブユニットの217番目のAspをThr
(bo)βサブユニットの150番目のAlaをSer、及び、βサブユニットの217番目のAspをCys
(bp)βサブユニットの61番目のAlaをGly、及び、βサブユニットの150番目のAlaをAsn
(bq)βサブユニットの61番目のAlaをSer、及び、βサブユニットの160番目のArgをMet
(br)βサブユニットの160番目のArgをCys、及び、βサブユニットの168番目のThrをGlu - 請求項1乃至7いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子。
- 配列表の配列番号:3に示されるαサブユニットをコードする遺伝子と、配列表の配列番号:4に示されるβサブユニットをコードする遺伝子とからなる、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子において、下記(a)~(l)からなる塩基置換位置より選ばれる、少なくとも1つの塩基置換を含むことを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子。
(a)配列番号:3の塩基配列の274番目~276番目
(b)配列番号:3の塩基配列の280番目~282番目
(c)配列番号:3の塩基配列の589番目~591番目
(d)配列番号:4の塩基配列の10番目~12番目
(e)配列番号:4の塩基配列の69番目~71番目
(f)配列番号:4の塩基配列の235番目~237番目
(g)配列番号:4の塩基配列の286番目~288番目
(h)配列番号:4の塩基配列の319番目~321番目
(i)配列番号:4の塩基配列の676番目~678番目
(j)配列番号:4の塩基配列の328番目~330番目、及び、配列番号:4の691番目~693番目
(k)配列番号:4の塩基配列の616番目~618番目、及び、配列番号:4の塩基配列の688番目~690番目
(l)配列番号:3の塩基配列の37番目~39番目、及び、配列番号:3の塩基配列の79番目~81番目、及び、配列番号:4の塩基配列の328番目~330番目 - 請求項9に記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子において、さらに下記(m)~(u)からなる塩基置換位置より選ばれる、少なくとも1つの塩基置換を含むことを特徴とする遺伝子。
(m)(b)又は(g)のとき、配列番号:3の塩基配列の37番目~39番目
(n)(b)又は(h)のとき、配列番号:3の塩基配列の79番目~81番目
(o)(d)及び(f)
(p)(f)のとき、配列番号:4の塩基配列の688番目~690番目
(q)(a)及び(i)
(r)(i)のとき、配列番号:3の塩基配列の37~39番目及び、配列番号:4の塩基配列の616番目~618番目
(s)(a)及び(d)のとき、配列番号:4の塩基配列の616番目~618番目
(t)(c)及び(h)のとき、配列番号:4の塩基配列の688番目~690番目
(u)(f)のとき、配列番号:4の塩基配列の688番目~690番目、及び、配列番号:4の塩基配列の691番目~693番目 - 請求項9に記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子において、(e)のとき、(a)、(c)、(f)、(i)、(h)、配列番号:4の塩基配列の688番目~690番目、及び配列番号:4の塩基配列の691番目~693番目からなる塩基置換位置から選択される少なくとも1つの塩基の他の塩基への置換をさらに含むことを特徴とする遺伝子。
- 請求項9乃至11いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子において、
配列番号:3の塩基配列の37番目~39番目が塩基置換されているとき、ATCがCTCに置換されており、
配列番号:3の塩基配列の79番目~81番目が塩基置換されているとき、ATGがATCに置換されており、
配列番号:3の塩基配列の274番目~276番目が塩基置換されているとき、GACがGAGに置換されており、
配列番号:3の塩基配列の280番目~282番目が塩基置換されているとき、ATGがATCに置換されており、
配列番号:3の塩基配列の589番目~591番目が塩基置換されているとき、GGCをTGCに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の10番目~12番目が塩基置換されているとき、GTGをATGに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の69番目~71番目が塩基置換されているとき、GTCがATCに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の235番目~237番目が塩基置換されているとき、CACがAACに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の286番目~288番目が塩基置換されているとき、CAGがCGTに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の319番目~321番目が塩基置換されているとき、CCCがATGに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の328番目~330番目が塩基置換されているとき、GAGがAACに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の616番目~618番目が塩基置換されているとき、CCGがCTGに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の676番目~678番目が塩基置換されているとき、GTCがATCに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の688番目~690番目が塩基置換されているとき、GCGがGAGに置換されており、
配列番号:4の塩基配列の691番目~693番目が塩基置換されているとき、GCCがGTCに置換されていることを特徴とする遺伝子。 - 請求項9乃至12いずれかに記載の遺伝子が、下記(aa)~(br)からなる塩基置換位置より選ばれる、少なくとも1つの塩基置換を含み、かつ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子。
(aa)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをATG、及び、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC
(ab)配列番号:3の塩基配列の442番目~444番目のGGCをGAC、及び、配列番号:3の塩基配列の610番目~612番目のGTCをCGC
(ac)配列番号:4の塩基配列の151番目~153番目のTTCをGTC、及び、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT
(ad)配列番号:4の塩基配列の352番目~354番目のTTCをGTC、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(ae)配列番号:4の塩基配列の478番目~480番目のCGGをTGG、及び、配列番号:4の塩基配列の556番目~558番目のCTGをCGG
(af)配列番号:3の塩基配列の16番目~18番目のCTGをACG、配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをATG、及び、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC
(ag)配列番号:3の塩基配列の55番目~57番目のGCGをGTG、配列番号:3の塩基配列の211番目~213番目のCGTをCAT、及び、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC
(ah)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをATG、配列番号:3の塩基配列の442番目~444番目のGGCをGAC、及び、配列番号:3の塩基配列の610番目~612番目のGTCをCGC
(ai)配列番号:4の塩基配列の28番目~30番目のACCをGAC、配列番号:4の塩基配列の352番目~354番目のTTCをGTC、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(aj)配列番号:4の塩基配列の109番目~111番目のTTCをCTC、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(ak)配列番号:4の塩基配列の109番目~111番目のTTCをGTC、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(al)配列番号:4の塩基配列の121番目~123番目のTTCをATC、配列番号:4の塩基配列の151番目~153番目のTTCをGTC、及び、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT
(am)配列番号:4の塩基配列の136番目~138番目のATGをAAG、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをCGG、及び、配列番号:4の塩基配列の634番目~636番目のTCCをTAC
(an)配列番号:4の塩基配列の142番目~144番目のCTGをGTG、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをCGG、及び、配列番号:4の塩基配列の634番目~636番目のTCCをTAC
(ao)配列番号:4の塩基配列の379番目~381番目のCTGをTCG、配列番号:4の塩基配列の478番目~480番目のCGGをTGG、及び、配列番号:4の塩基配列の556番目~558番目のCTGをCGG
(ap)配列番号:3の塩基配列の16番目~18番目のCTGをACG、配列番号:3の塩基配列の55番目~57番目のGCGをGTG、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC、配列番号:4の塩基配列の136番目~138番目のATGをAAG、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをCGG、及び、配列番号:4の塩基配列の634番目~636番目のTCCをTAC
(aq)配列番号:3の塩基配列の16番目~18番目のCTGをACG、配列番号:3の塩基配列の55番目~57番目のGCGをGTG、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC、配列番号:4の塩基配列の142番目~144番目のCTGをGTG、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをCGG、及び、配列番号:4の塩基配列の634番目~636番目のTCCをTAC
(ar)配列番号:3の塩基配列の16番目~18番目のCTGをGCG、配列番号:3の塩基配列の55番目~57番目のGCGをGTG、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC、配列番号:4の塩基配列の379番目~381番目のCTGをTCG、配列番号:4の塩基配列の478番目~480番目のCGGをTGG、及び、配列番号:4の塩基配列の556番目~558番目のCTGをCGG
(as)配列番号:3の塩基配列の16番目~18番目のCTGをACG、配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをATG、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC、配列番号:4の塩基配列の28番目~30番目のACCをGAC、配列番号:4の塩基配列の352番目~354番目のTTCをGTC、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(at)配列番号:3の塩基配列の55番目~57番目のGCGをGTG、配列番号:3の塩基配列の211番目~213番目のCGTをCAT、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC、配列番号:4の塩基配列の109番目~111番目のTTCをCTC、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(au)配列番号:3の塩基配列の55番目~57番目のGCGをGTG、配列番号:3の塩基配列の211番目~213番目のCGTをCAT、配列番号:3の塩基配列の376番目~378番目のTTCをTAC、配列番号:4の塩基配列の109番目~111番目のTTCをGTC、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(av)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをATG、配列番号:3の塩基配列の442番目~444番目のGGCをGAC、配列番号:3の塩基配列の610番目~612番目のGTCをCGC、配列番号:4の塩基配列の121番目~123番目のTTCをATC、配列番号:4の塩基配列の151番目~153番目のTTCをGTC、及び、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT
(aw)配列番号:3の塩基配列の442番目~444番目のGGCをGAC、配列番号:3の塩基配列の610番目~612番目のGTCをCGC、配列番号:4の塩基配列の322番目~324番目のGAGをGAT、及び、配列番号:4の塩基配列の598番目~600番目のGCCをGAG
(ax)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをGGG、及び、配列番号:3の塩基配列の562番目~564番目のACCをGGC
(ay)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをGCG、及び、配列番号:3の塩基配列の142番目~144番目のAACをCAA
(az)配列番号:3の塩基配列の142番目~144番目のAACをGAA、及び、配列番号:4の塩基配列の436番目~438番目のCGGをGGG
(ba)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをTGG、及び、配列番号:4の塩基配列の526番目~528番目のTACをTGC
(bb)配列番号:4の塩基配列の526番目~528番目のTACをATG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをGGC
(bc)配列番号:3の塩基配列の106番目~108番目のACGをTCG、及び、配列番号:4の塩基配列の97番目~99番目のGCGをGTG
(bd)配列番号:4の塩基配列の526番目~528番目のTACをGCC、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをGTC
(be)配列番号:4の塩基配列の118番目~120番目のACGをGTG、及び、配列番号:4の塩基配列の652番目~654番目のTGCをATG
(bf)配列番号:4の塩基配列の97番目~99番目のGCGをATG、及び、配列番号:4の塩基配列の526番目~528番目のTACをACC
(bg)配列番号:4の塩基配列の118番目~120番目のACGをCTG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをCTC
(bh)配列番号:4の塩基配列の118番目~120番目のACGをATT、及び、配列番号:4の塩基配列の181番目~183番目のGCCをGTC
(bi)配列番号:4の塩基配列の181番目~183番目のGCCをACG、及び、配列番号:4の塩基配列の652番目~654番目のTGCをTCC
(bj)配列番号:4の塩基配列の334番目~336番目のAAGをGTG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをATG
(bk)配列番号:4の塩基配列の181番目~183番目のGCCをTGG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをCAC
(bl)配列番号:4の塩基配列の181番目~183番目のGCCをCTC、及び、配列番号:4の塩基配列の334番目~336番目のAAGをATT
(bm)配列番号:4の塩基配列の436番目~438番目のCGGをGGG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをAGC
(bn)配列番号:4の塩基配列の511番目~513番目のAAGをGCG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをACC
(bo)配列番号:4の塩基配列の448番目~450番目のGCGをTCG、及び、配列番号:4の塩基配列の649番目~651番目のGACをTGT
(bp)配列番号:4の塩基配列の181番目~183番目のGCCをGGC、及び、配列番号:4の塩基配列の448番目~450番目のGCGをAAT
(bq)配列番号:4の塩基配列の181番目~183番目のGCCをTCG、及び、配列番号:4の塩基配列の478番目~480番目のCGGをATG
(br)配列番号:4の塩基配列の478番目~480番目のCGGをTGT、及び、配列番号:4の塩基配列の502番目~504番目のACGをGAG - 請求項9乃至13いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子の5'末端上流に更に、遺伝子の発現に必要とされるプロモーター配列を含むDNAと、該プロモーターの3'末端の下流に、配列番号:7に含まれるリボゾーム結合配列とを含む、連結されたDNA。
- 請求項14に記載のDNAを含む、プラスミド。
- 請求項15に記載のプラスミドによって宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
- ニトリルヒドラターゼ変異体の生産方法において、請求項16に記載の形質転換体を培地で培養して、該形質転換体にプラスミドの有するニトリルヒドラターゼ遺伝子に基づくニトリルヒドラターゼ変異体を生産させる工程を含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体の生産方法。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102492697A (zh) * | 2011-11-28 | 2012-06-13 | 江南大学 | 一种克隆表达腈水合酶调控蛋白的方法 |
WO2012169203A1 (ja) * | 2011-06-07 | 2012-12-13 | ダイヤニトリックス株式会社 | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
WO2018124247A1 (ja) * | 2016-12-28 | 2018-07-05 | 三井化学株式会社 | 変異型ニトリルヒドラターゼ、該変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター及び形質転換体、該変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法、並びにアミド化合物の製造方法 |
CN112210549A (zh) * | 2019-07-09 | 2021-01-12 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 腈水解酶突变蛋白及其在催化合成(r)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物中的应用 |
WO2024004661A1 (ja) * | 2022-06-30 | 2024-01-04 | 三井化学株式会社 | 変異型ニトリルヒドラターゼ、該変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸、該核酸を含むベクター及び形質転換体、該変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法、並びにアミド化合物の製造方法 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102517271B (zh) * | 2011-12-13 | 2013-04-03 | 清华大学 | 一种突变腈水合酶 |
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WO2020147031A1 (zh) * | 2019-01-16 | 2020-07-23 | 江南大学 | 一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用 |
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Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09275978A (ja) | 1996-02-14 | 1997-10-28 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 新規なニトリルヒドラターゼ |
JPH11253168A (ja) | 1998-03-16 | 1999-09-21 | Mitsui Chem Inc | ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子 |
WO2004056990A1 (ja) | 2002-12-19 | 2004-07-08 | Mitsui Chemicals, Inc. | 新規なニトリルヒドラターゼ |
JP2005160403A (ja) | 2003-11-10 | 2005-06-23 | Mitsui Chemicals Inc | ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の改変方法 |
WO2005116206A1 (ja) * | 2004-05-26 | 2005-12-08 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
JP2007143409A (ja) | 2005-11-24 | 2007-06-14 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
JP2008253182A (ja) | 2007-04-04 | 2008-10-23 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05160403A (ja) * | 1992-06-01 | 1993-06-25 | Seiko Epson Corp | 薄膜トランジスタ |
JPH08253182A (ja) * | 1995-03-16 | 1996-10-01 | Shiyouyou Seisakusho:Kk | 自転車等用荷かご着脱装置およびその掛止金具 |
CN1240833C (zh) * | 1996-02-14 | 2006-02-08 | 三井化学株式会社 | 新型腈水合酶 |
JP2003088384A (ja) | 2001-09-19 | 2003-03-25 | Mitsui Chemicals Inc | 新規なニトリルヒドラターゼ |
JP2005295815A (ja) | 2004-04-07 | 2005-10-27 | Mitsui Chemicals Inc | ニトリルヒドラターゼの安定化または活性化方法 |
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2014
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Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09275978A (ja) | 1996-02-14 | 1997-10-28 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 新規なニトリルヒドラターゼ |
JPH11253168A (ja) | 1998-03-16 | 1999-09-21 | Mitsui Chem Inc | ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子 |
WO2004056990A1 (ja) | 2002-12-19 | 2004-07-08 | Mitsui Chemicals, Inc. | 新規なニトリルヒドラターゼ |
JP2004194588A (ja) | 2002-12-19 | 2004-07-15 | Mitsui Chemicals Inc | 新規なニトリルヒドラターゼ |
JP2005160403A (ja) | 2003-11-10 | 2005-06-23 | Mitsui Chemicals Inc | ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の改変方法 |
WO2005116206A1 (ja) * | 2004-05-26 | 2005-12-08 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
JP2007143409A (ja) | 2005-11-24 | 2007-06-14 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
JP2008253182A (ja) | 2007-04-04 | 2008-10-23 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning", 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS |
MIYANAGA A. ET AL.: "Mutational and structural analysis of cobalt-containing nitrile hydratase on substrate and metal binding", EUR. J. BIOCHEM., vol. 271, no. 2, 2004, pages 429 - 438, XP055096861 * |
Cited By (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103635574B (zh) * | 2011-06-07 | 2016-04-13 | 三菱丽阳株式会社 | 改良型腈水合酶 |
US10066225B2 (en) | 2011-06-07 | 2018-09-04 | Mitsubishi Chemical Corporation | Nitrile hydratase |
KR20140002791A (ko) * | 2011-06-07 | 2014-01-08 | 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 | 개량형 니트릴 히드라타제 |
CN103635574A (zh) * | 2011-06-07 | 2014-03-12 | 三菱丽阳株式会社 | 改良型腈水合酶 |
EP2719760A1 (en) * | 2011-06-07 | 2014-04-16 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Improved nitrile hydratase |
EP2719760A4 (en) * | 2011-06-07 | 2014-04-16 | Mitsubishi Rayon Co | IMPROVED NITRIL HYDRATASE |
EP2811021A3 (en) * | 2011-06-07 | 2015-01-21 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Improved nitrile hydratase |
JPWO2012169203A1 (ja) * | 2011-06-07 | 2015-02-23 | 三菱レイヨン株式会社 | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
AU2012265680B2 (en) * | 2011-06-07 | 2015-05-28 | Mitsubishi Chemical Corporation | Improved nitrile hydratase |
KR20150092767A (ko) * | 2011-06-07 | 2015-08-13 | 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 | 개량형 니트릴 히드라타제 |
US9193966B2 (en) | 2011-06-07 | 2015-11-24 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Nitrile hydratase |
KR101586132B1 (ko) * | 2011-06-07 | 2016-01-19 | 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 | 개량형 니트릴 히드라타제 |
US9738885B2 (en) | 2011-06-07 | 2017-08-22 | Mitsubishi Chemical Corporation | Nitrile hydratase |
KR101698706B1 (ko) * | 2011-06-07 | 2017-01-20 | 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 | 개량형 니트릴 히드라타제 |
US10487320B2 (en) | 2011-06-07 | 2019-11-26 | Mitsubishi Chemical Corporation | Nitrile hydratase |
US10221410B2 (en) | 2011-06-07 | 2019-03-05 | Mitsubishi Chemical Corporation | Nitrile hydratase |
WO2012169203A1 (ja) * | 2011-06-07 | 2012-12-13 | ダイヤニトリックス株式会社 | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
CN102492697A (zh) * | 2011-11-28 | 2012-06-13 | 江南大学 | 一种克隆表达腈水合酶调控蛋白的方法 |
WO2018124247A1 (ja) * | 2016-12-28 | 2018-07-05 | 三井化学株式会社 | 変異型ニトリルヒドラターゼ、該変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター及び形質転換体、該変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法、並びにアミド化合物の製造方法 |
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