WO2010010211A2 - Biosensor amperométrico desechable, método de fabricación del mismo y método de determinación de la presencia de analitos en alimentos - Google Patents

Biosensor amperométrico desechable, método de fabricación del mismo y método de determinación de la presencia de analitos en alimentos Download PDF

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José Manuel PINGARRON CARRAZON
Susana Campuzano Ruiz
María GAMELLA CARBALLO
Valentín VINCENTE GARCIA-ECHAVE
Javier Manso Lorenzo
Ana Vazquez De Prada
Francisco Javier Ferero Martin
Juan Campo Rodriguez
Marta Valledor Llopis
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Definitions

  • the purpose of the present specification refers to a disposable amperometric biosensor for the determination of, for example, fructose in all types of foods containing the analyte to be detected.
  • Biosensors of fructose have been constructed using different immobilization strategies of the FDH: adsorption on colloidal gold particles that are subsequently deposited on the vitrified carbon electrode [Yabuki, S .; Mizutani, F. Electroanalysis 9 (1997) 23-25]; incorporation of the enzyme in carbon paste electrodes [Parellada, J .; Dominguez, E .; Fernández, V.M. Anal.Chim. Minutes 330 (1996) 71-77.], [Paredes, P.A .; Parellada, J .; Fernández, V.M .; Katakis, l .; Dominguez, E. Biosens. & Bioelectron.
  • the biosensor in which the enzyme has been immobilized in phospholipid bilayers deposited on the electrode has greater stability [Kinnear, K.T .; Monbouquette, H. G. Anal. Chem. 69 (1997) 1771-1775], but the immobilization stage is usually excessively long, requiring dialysis processes lasting several days (2-6 days).
  • the best results have been achieved with biosensors manufactured by modifying carbon paste with the enzyme [Ikeda, T .; Matsushita, F .; Senda, M. Biosens. & Bioelectron.
  • a fructose dehydrogenase biosensor has also been developed that improves the previous ones in which the co-mobilization of the FDH enzyme and the TTF redox mediator is produced by cross-linking with glutaraldehyde on a conventional gold electrode modified with a mercaptopropionic acid (MPA) monolayer [Campuzano , OA Loaiza, M. Pedrero, FJ Manuel de Villena, JM Pingarrón, Bioelectrochemistry 63 (2004) 199-206], this monolayer is necessary to separate the surface of the gold electrode from the enzyme so that the deactivation of Ia is not produced FDH Operational times of more than 30 days are achieved with this biosensor and more than 150 analyzes can be performed with the same biosensor. However, the time required for its manufacture is more than one day, because this time is necessary to deposit the MPA monolayer necessary so that the enzyme deactivation does not occur.
  • MPA mercaptopropionic acid
  • the gold deposited on the stainless steel surface by sputtering has a structure different from that of the conventional gold electrode that does not produce the deactivation of the enzyme and therefore the modification with MPA monolayers of the gold deposited on the surface of the stainless steel electrode is not necessary.
  • the gold-plated stainless steel electrode maintains all other characteristics of the conventional gold electrode in electrochemical applications.
  • the coating of quartz crystals with gold by sputtering is a usual technique in the construction of piezoelectric biosensors. Recently it has also been used in the construction of electrochemical biosensors mainly in the form of tracks on polymeric non-conductive materials or on other metals previously deposited on polymeric surfaces such as Cr as is done in the construction of piezoelectric crystals.
  • Biosensors have been constructed with gold deposited by sputtering for the construction of enzymatic biosensors [Masatoshi Hashimoto, Sanjay Upadhyay, Hiroaki Suzuki, Biosensors and Bioelectronics 21 (2006) 2224-2231; Huaqing Li, Zonghui Guoa, Hui Wang, Dafu Cui, Xinxia Cai; Sensors and Actuators B 119 (2006) 419-424] and immunosensors [Eva M. Abad-Villar, M. Maria Fernández-Abedul, Agusti ⁇ n Costa-Garc ⁇ a, Biosensors and Bioelectronics 17 (2002) 797-780; Eva M. Abad-Villar, M. Maria Fernández-Abedul, Agusti ⁇ n Costa-Garc ⁇ a, Analytica Chimica Acta 453 (2002) 63-69] who need to modify the gold surface to achieve good biosensor stability.
  • biosensors constructed by sputtering deposition have never been deposited directly on metal surfaces such as stainless steel.
  • the deposition of gold on stainless steel by sputtering is simple and economical to construct gold electrodes (biosensors) in which the enzyme is immobilized directly on the surface of the electrode without there being a deactivation of the enzyme as mentioned above.
  • the present invention relates to a disposable enzymatic electrode for the determination, preferably of fructose, in all types of foods containing this analyte.
  • the biosensor consists of an electronic matrix of stainless steel or any other conductive material embedded in an insulating material in which a gold film has been deposited by means of the sputtering technique on one of the surfaces of the matrix. electrode, the other surface being in contact with the potentiostat.
  • the corresponding enzyme is deposited on the gold film with the appropriate mediator and encapsulated with a dialysis membrane.
  • This method is based on the use of a device comprising the biosensor object of the invention, together with an Ag / AgCI reference electrode and an auxiliary electrode of a conductive material.
  • This device is immersed in a working solution to which an aliquot of the food sample is added.
  • the biosensor is connected to an instrument that in addition to being used as a potentiostat allows, by means of a previous calibration, to relate the current generated in the biosensor with the content of the analyte (in the appropriate units) in the analyzed food sample.
  • This measuring instrument has been specifically designed for the biosensor, solving communication and data logging problems to provide a reliable result.
  • the determination of the analyte content in the sample can be done in two different ways: a) by external calibration and b) using the standard addition method.
  • the present invention relates to a process for preparing disposable amperometric enzyme electrodes.
  • the procedure is characterized by preparing the bioelectrodes according to the methodology described below:
  • a thin layer of gold is placed by spputering, then, without performing any cleaning or conditioning treatment of the gold, the amount of enzyme is placed suitable in solution, the solution is allowed to dry, then an aliquot with the appropriate amount of mediator is added, the solution is allowed to dry. Finally, a dialysis membrane (or any other analyte permeable membrane) is placed on the gold surface containing the enzyme and the mediator.
  • a device that allows individual recognition by the measuring instrument is implemented to the biosensor in order to count the number of measurements.
  • the enzymatic biosensor is manufactured by simple physical entrapment between the surface of the gold and the membrane, without the need to separate by any type of procedure (normally self-assembled mono-layers of thiols) from the enzyme, since The enzyme in contact with the surface Conventional gold electrode is deactivated.
  • the non-deactivation of the enzyme by the gold particles deposited on the stainless steel surface is due to the different microscopic structure that it has with respect to conventional gold surfaces.
  • the stability of the disposable biosensor is good as evidenced when different aspects are considered: a) Repeatability of the amperometric response for a biosen ⁇ or, b) Reproducibility in the manufacture of different electrodes manufactured in the same way and c) Lifetime of the biosensor that is 1 month or 100 measures, once these requirements have been met the biosensor is discarded
  • the biosensor thus constructed is placed in the sensor unit and immersed in the working solution obtaining the analyte measurements in the working solution by amperometry, measuring the current when the steady state is reached at a constant potential of 150 mV versus Ag / AgCI.
  • the electronics of the device allows the currents obtained in the biosensor to be correlated with the analyte concentration in the sample, by means of a previously established calibration and taking into account the dilution factor for each sample in particular.
  • FIGURE 1 View of the disposable amperometric biosensor, object of the present invention, in an exploded view (figure 1a) and overall view (figure 1b).
  • FIGURE 2 View of the use device of the disposable amperometric biosensor, object of the present invention. Preferred embodiment of the invention.
  • the disposable amperometric biosensor (100) comprises, at least: a first conductive body (1), preferably cylindrical and steel
  • a second insulating body (2) preferably cylindrical, located on the first body (1) such that said first body (1) is embedded in the second body (2); and where, on the lower surface (12) of both bodies (1, 2) at least: a third layer of gold (3) deposited by sputtering is placed, on which the corresponding fourth layer of enzyme (4) is deposited with the right mediator; and where, in addition, said lower face (12) of the set of bodies (1, 2) is encapsulated with a dialysis membrane (5) closed with a ring (6).
  • the disposable amperometric biosensor (100), object of the present invention is used by a device shown in Figure 2.
  • Said device comprises, at least: a first body (200) container of the connections, including the connecting element (202) with a potentiostat, not shown in the figures, and configured for device calibration; a second body (201) located in the lower part of the first body (200), which in its lower part comprises, in turn: a first disposable amperometric biosensor (100), object of the present invention; a second reference electrode (203) preferably of Ag / AgCI; and a third auxiliary electrode of a conductive material (204); where said device is configured to be immersed in a working solution to which an aliquot sample of the food is added.
  • the manufacturing process of the biosensor, second aspect of the present invention comprises, at least, the following steps: (i) a first stage of placing a layer of gold by sputtering on a surface of a conductive material embedded in an insulating material;
  • the method of determining the presence of analytes in food comprises, at least, the following steps:

Abstract

Biosensor amperométrico desechable (100), método de fabricación del mismo y método de determinación de Ia presencia de analitos en alimentos, que comprende, básicamente el uso de una fina capa de oro (3) depositada por sputtering en un electrodo.

Description

BIOSENSOR AMPEROMÉTRICO DESECHABLE, MÉTODO DE FABRICACIÓN DEL MISMO Y MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANALITOS EN
ALIMENTOS.
Objeto de Ia invención
El objeto de Ia presente memoria descriptiva está referido a un biosensor amperométrico desechable para Ia determinación de, por ejemplo, fructosa en todo tipo de alimentos que contengan el analito a detectar.
Antecedentes de Ia invención.
Se han construido bíosensores de fructosa utilizando diferentes estrategias de inmovilización de Ia FDH: adsorción sobre partículas de oro coloidales que se depositan posteriormente sobre el electrodo de carbono vitrificado [Yabuki, S.; Mizutani, F. Electroanalysis 9 (1997) 23-25]; incorporación de Ia enzima en electrodos de pasta de carbono [Parellada, J.; Domínguez, E.; Fernández, V.M. Anal.Chim. Acta 330 (1996) 71-77.], [Paredes, P.A.; Parellada, J.; Fernández, V.M.; Katakis, l.;Domínguez, E. Biosens. & Bioelectron. 12 (1997) 1233-1243]; encapsulamiento de Ia enzima en membranas depositadas sobre el electrodo [Xie, X.; Kuan, S. S.; Guilbault, G.G. Biosens. & Bioelectron. 6 (1991) 49-54], [Ikeda, T.; Matsushita, F.; Senda, M. Biosens. & Bioelectron. 6 (1991 ) 299-304], [Antiochia, R.; Palleschi, G. Anal. Lett. 30 (1997) 683-697], [Tkác, J.; Vostiar, I.; Sturdík, E.; Gemeiner, P.; Mastíhuba, V.;Annus, J. Anal. Chim. Acta 439 (2001 ) 39-46], [Tkác, J.; Vostiar, I.; Gemeiner, P.; Sturdík, E. Bioelectrochem.55 (2002) 149-151]; atrapamiento de Ia enzima en películas conductoras (fundamentalmente polipirrol) [Khan, G. F.; Kobatake, E.; Shinohara, H.; Ikariyama, Y.; Aizawa, M. Anal. Chem. 64 (1992) 1254-1258], [Khan, G.F.; Kobatake, E.; Ikariyama, Y.; Aizawa, M. Anal.
Chim. Acta 281 (1993) 527-533], [Swann, M. J.; Bloor, D.; Haruyama, T.; Aizawa, M. Biosens. & Bioelectron. 12 (1997) 1 169-1 182], [García, C.A.B.; de Oliveira Neto, G.; Kubota, LT. Anal. Chim. Acta 374 (1998) 201-208] y no conductoras [Bassi, A.S.; Lee, E.; Zhu, J.-X. Food Research International 31 (1998) 119-127]; inmovilización en sílica-gel [García, C.A.B.; de Oliveira Neto, G.; Kubota, LT. ; Grandin, L.A. J. Electroanal. Chem. 418 (1996) 147-151]; adsorción sobre bicapas de fosfolípidos [Kinnear, K.T.; Monbouquette, H.G. Anal. Chem. 69 (1997) 1771-1775]; adsorción sobre monocapas autoensambladas de ODTNB [Darder, 20Darder, M.; Casero, E.; Pariente, F.; Lorenzo, E. Anal. Chem. 72 (2000) 3784-3792] e inmovilización mediante enlace covalente con glutaraldehído sobre una monocapa de cistamina [Watanabe, S.; Kubo, I. Electrochem. 70 (2002) 258-263],
En general, en cuanto a Ia estabilidad de los biosensores, aquellos que se han construido utilizando un método de inmovilización sencillo, como Ia adsorción directa sobre electrodos metálicos o de carbono ([Yabuki, S.; Mizutani, F. Electroanalysis 9 (1997) 23-25], [Begum, A.; Kobatake, E.; Suzawa, T.; Ikariyama, Y.; Aizawa, M. Anal. Chim. Acta 280 (1993) 31-36]), suelen presentar tan baja estabilidad que su aplicación a Ia determinación de fructosa en muestras reales no es posible. El biosensor en el que Ia enzima se ha inmovilizado en bicapas de fosfolípidos depositadas sobre el electrodo, presenta mayor estabilidad [Kinnear, K.T.; Monbouquette, H. G. Anal. Chem. 69 (1997) 1771-1775], pero Ia etapa de inmovilización suele ser excesivamente larga, requiriendo procesos de diálisis de varios días de duración (2-6 días). Los mejores resultados se han logrado con biosensores fabricados por modificación de pasta de carbono con Ia enzima [Ikeda, T.; Matsushita, F.; Senda, M. Biosens. & Bioelectron. 6 (1991 ) 299-304], [Paredes, P.A.; Parellada, J.; Fernández, V.M.; Katakis, I.; Domínguez, E. Biosens. & Bioelectron. 12 (1997) 1233-1243]. Estos dispositivos se pueden utilizar durante unos 7-15 días, con respuestas del orden del 30-50 % de Ia intensidad inicial. Sin embargo, como todos los biosensores desarrollados sobre pasta de carbono, presentan los inconvenientes de requerir un gasto de enzima elevado y de proporcionar una mala reproducibilidad.
También se ha desarrollado un biosensor de fructosa deshidrogenasa que mejora los anteriores en el que se produce Ia coinmovilizaciónde Ia enzima FDH y el mediador redox TTF mediante entrecruzamiento con glutaraldehído sobre un electrodo de oro convencional modificado con una monocapa de ácido mercaptopropiónico (MPA) [Campuzano, O. A. Loaiza, M. Pedrero, F. J. Manuel de Villena, J. M. Pingarrón, Bioelectrochemistry 63 (2004) 199-206], esta monocapa es necesaria para separar Ia superficie del electrodo de oro de Ia enzima para que no se produzca Ia desactivación de Ia FDH. Con este biosensor se consiguen tiempos de operatividad de más de 30 días y se pueden realizar más de 150 análisis con el mismo biosensor. Sin embargo, el tiempo requerido para su fabricación es de más de un día, debido a que es necesario este tiempo para depositar Ia monocapa de MPA necesaria para que no se produzca Ia desactivación de Ia enzima.
El oro depositado sobre Ia superficie de acero inoxidable mediante sputtering tiene una estructura diferente a Ia del electrodo de oro convencional que no produce Ia desactivación de Ia enzima y por tanto no es necesaria Ia modificación con monocapas de MPA del oro depositado sobre Ia superficie del electrodo de acero inoxidable. Además el electrodo de acero inoxidable recubierto con oro mantiene todas las demás característica del electrodo de oro convencional en aplicaciones electroquímicas. El recubrimiento de cristales de cuarzo con oro mediante sputteríng es una técnica usual en Ia construcción de biosensores piezoeléctricos. Recientemente también ha sido empleada en Ia construcción de biosensores electroquímicos principalmente en forma de pistas sobre materiales no conductores poliméricos o sobre otros metales previamente depositados sobre superficies poliméricas como Cr igual que se hace en Ia construcción de los cristales piezoeléctricos. Se han construido biosensores con oro depositado por sputtering para Ia construcción de biosensores enzimáticos [Masatoshi Hashimoto, Sanjay Upadhyay, Hiroaki Suzuki, Biosensors and Bioelectronics 21 (2006) 2224-2231 ; Huaqing Li, Zonghui Guoa, Hui Wang, Dafu Cui, Xinxia Cai; Sensors and Actuators B 119 (2006) 419-424] e inmunosensores [Eva M. Abad-Villar, M. Teresa Fernández-Abedul, Agustiín Costa-García, Biosensors and Bioelectronics 17 (2002) 797-780; Eva M. Abad-Villar, M. Teresa Fernández-Abedul, Agustiín Costa-García, Analytica Chimica Acta 453 (2002) 63-69] que necesitan modificar Ia superficie de oro para conseguir una buena estabilidad del biosensor.
Ninguno de los biosensores construidos por deposición mediante sputtering nunca se han depositado directamente sobre superficies de metales como acero inoxidable. La deposición de oro sobre acero inoxidable por sputtering es sencilla y económica de construir electrodos (biosensores) de oro en Ia que se inmoviliza Ia enzima directamente sobre Ia superficie del electrodo sin que haya una desactivación de Ia enzima como se ha comentado anteriormente.
Descripción de Ia invención.
La presente invención está referida a un electrodo enzimático desechable para Ia determinación, preferentemente de fructosa, en todo tipo de alimentos que contengan este analito. De forma más concreta, el biosensor consiste en una matriz electrónica de acero inoxidable o cualquier otro material conductor embebido en un material aislante en el que se ha depositado una película de oro mediante Ia técnica de "sputtering" sobre una de las superficies de Ia matriz electródica, estando Ia otra superficie en contacto con el potenciostato. Sobre Ia película de oro se deposita Ia enzima correspondiente con el mediador adecuado y se encapsula con una membrana de diálisis. Es un segundo aspecto de Ia presente invención, el procedimiento para Ia determinación de Ia presencia de analitos en alimentos, particularmente fructosa, mediante Ia medida de Ia señal amperométrica obtenida de Ia monitorización del analito en una disolución de trabajo a Ia que se Ie ha añadido una alícuota de Ia muestra.
Este método se basa en el empleo de un dispositivo que comprende el biosensor objeto de Ia invención, junto con un electrodo de referencia de Ag/AgCI y un electrodo auxiliar de un material conductor. Este dispositivo está sumergido en una disolución de trabajo a Ia que se añade una alícuota de Ia muestra del alimento. El biosensor está conectado a un instrumento que además de utilizarse como potenciostato permite, mediante una calibración previa, relacionar Ia corriente generada en el biosensor con el contenido del analito (en las unidades adecuadas) en Ia muestra de alimento analizada. En este instrumento de medida se ha diseñado específicamente para el biosensor, solucionando los problemas de comunicación y registro de datos para proporcionar un resultado fiable.
La determinación del contenido de analito en Ia muestra se puede realizar de dos maneras diferentes: a) mediante calibrado externo y b) empleando el método de adiciones estándar.
La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar electrodos enzimáticos amperométricos desechables. El procedimiento se caracteriza por preparar los bioelectrodos según Ia metodología que se expone a continuación:
Sobre una de las superficies del acero inoxidable (o cualquier otro material conductor) embutido en un material aislante, se coloca una fina capa de oro por spputering, a continuación, sin realizar ningún tratamiento de limpieza o acondicionamiento del oro se colocan Ia cantidad de enzima adecuada en disolución, se deja secar Ia disolución, posteriormente se adiciona una alícuota con Ia cantidad adecuada de mediador, se deja secar Ia disolución. Por último se coloca sobre Ia superficie de oro que contiene Ia enzima y el mediador una membrana de diálisis (o cualquier otra membrana permeable al analito). Además, al biosensor se implementa un dispositivo que permita su reconocimiento individual por el instrumento de medida con el fin de realizar un cuenteo del número de medidas.
Con este procedimiento de fabricación, el biosensor enzimático se fabrica por simple atrapamiento físico entre Ia superficie del oro y Ia membrana, sin necesidad de separar mediante cualquier tipo de procedimiento (normalmente mono-capas auto- ensambladas de tioles) de Ia enzima, ya que Ia enzima en contacto con Ia superficie de electrodos de oro convencionales se desactiva. La no desactivación de Ia enzima por las partículas de oro depositadas sobre Ia superficie de acero inoxidable es debido a Ia diferente estructura a nivel microscópico que tiene con respecto a las superficies de oro convencionales. Esta metodología diferente a los otros procedimientos de fabricación de biosensores hace que el proceso de fabricación sea más sencillo, rápido y barato sin perder las características de estabilidad y funcionamiento de los electrodos de oro convencionales y sin tener que volver a utilizarlo, es decir una vez que se ha agotado el tiempo de vida del biosensor se puede desechar, ya que el coste por biosensor es mucho menor que los electrodos de oro convencionales que tendrían que ser regenerados para tener un coste por medida aceptable.
La estabilidad del biosensor desechable es buena como se pone de manifiesto cuando se consideran diferentes aspectos: a) Repetibilidad de Ia respuesta amperométrica para un biosenεor, b) Reproducibilidad en Ia fabricación de diferentes electrodos fabricados de Ia misma forma y c) Tiempo de vida útil del biosensor que es de 1 mes o 100 medidas, una vez cumplidos estos requisitos el biosensor se desecha.
El biosensor así construido de coloca en Ia unidad sensora y se sumerge en Ia disolución de trabajo obteniéndose las medidas de analito en Ia disolución de trabajo por amperométria, midiendo Ia corriente cuando se alcanza el estado estacionario a un potencial constante de 150 mV frente a Ag/AgCI.
La electrónica del dispositivo además de ser un potenciostato al que se conecta Ia unidad sensora, permite correlacionar las corrientes obtenidas en el biosensor con Ia concentración de analito en Ia muestra, mediante un calibrado previamente establecido y teniendo en cuenta el factor de dilución para cada muestra en particular.
Breve descripción de las figuras.
A continuación se pasa a describir de manera muy breve una serie de dibujos que ayudan a comprender mejor Ia invención y que se relacionan expresamente con una realización de dicha invención que se presenta como un ejemplo no limitativo de ésta.
FIGURA 1.- Vista del biosensor amperométrico desechable, objeto de Ia presente invención, en una vista explosionada (figura 1a) y vista de conjunto (figura 1 b).
FIGURA 2.- Vista del dispositivo de empleo del biosensor amperométrico desechable, objeto de Ia presente invención. Realización preferente de Ia invención.
Tal y como puede observarse en Ia figura 1 el biosensor amperométrico desechable (100) comprende, al menos: un primer cuerpo conductor (1 ), preferentemente cilindrico y de acero
, inoxidable, sobre el que se sitúa un dispositivo de reconocimiento individual de cada sensor amperométrico desechable (7) configurado para que el instrumento de medida, no mostrado en las figuras, realice un cuenteo del número de medidas; un segundo cuerpo aislante (2), preferentemente cilindrico, situado sobre el primer cuerpo (1 ) de tal forma que dicho primer cuerpo (1 ) quede embutido en el segundo cuerpo (2); y donde, en Ia superficie inferior (12) de ambos cuerpos (1 ,2) se sitúan, al menos: una tercera capa de oro (3) depositada por sputtering, sobre Ia que se deposita Ia cuarta capa de enzima (4) correspondiente con el mediador adecuado; y donde, además, dicha cara inferior (12) del conjunto de cuerpos (1 ,2) se encapsula con una membrana de diálisis (5) cerrada con una anillo (6).
El biosensor amperométrico desechable (100), objeto de Ia presente invención, se utiliza mediante un dispositivo mostrado en Ia figura 2. Dicho dispositivo comprende, al menos: un primer cuerpo (200) contenedor de las conexiones, incluyendo el elemento conector (202) con un potenciostato, no mostrado en las figuras, y configurado para Ia calibración del dispositivo; un segundo cuerpo (201 ) situado en Ia parte inferior del primer cuerpo (200), que en su parte inferior comprende, a su vez: un primer biosensor amperométrico desechable (100), objeto de Ia presente invención; un segundo electrodo de referencia (203) preferentemente de Ag/AgCI; y un tercer electrodo auxiliar de un material conductor (204); donde dicho dispositivo está configurado para ser sumergido en una disolución de trabajo a Ia que se añade una muestra alícuota del alimento.
El procedimiento de fabricación del biosensor, segundo aspecto de Ia presente invención comprende, al menos, las siguientes etapas: (i) una primera etapa de colocación de una capa de oro por sputtering sobre una superficie de un material conductor embutido en un material aislante;
(ii) una segunda etapa de colocación de Ia enzima adecuada en disolución, secándose dicha disolución y adicionando una alícuota con Ia cantidad adecuada de mediador, secando Ia solución en conjunto; y
(íii) una tercera etapa de colocación de una membrana de diálisis u otra membrana permeable al analito sobre Ia superficie del conjunto formado por Ia enzima y el mediador junto con el oro.
El método de determinación de Ia presencia de analitos en alimentos comprende, al menos, las siguientes etapas:
(i) una primera etapa de calibrado del dispositivo de medida que incluye el biosensor amperométrico desechable (100), de tal forma que se configure para Ia relación entre Ia corriente generada en el biosensor con el contenido del analito en las unidades adecuadas y en Ia muestra de alimento analizada; (ii) una segunda etapa de inserción del dispositivo en una disolución de trabajo a Ia que se añade una alícuota de Ia muestra del alimento; y
(iii) una tercera etapa de medida y muestra de resultados.

Claims

Reivindicaciones.
1.- Biosensor amperométrico desechable (100) caracterizado porque comprende, al menos: un primer cuerpo conductor (1 ) sobre el que se sitúa un dispositivo de reconocimiento individua! de cada biosensor amperométrico desechable (7) configurado para que el instrumento de medida realice un cuenteo del número de medidas; un segundo cuerpo aislante (2), situado sobre el primer cuerpo (1) de tal forma que dicho primer cuerpo (1 ) quede embutido en el segundo cuerpo (2); y donde, en Ia superficie inferior (12) de ambos cuerpos (1 ,2) se sitúan, al menos: una tercera capa de oro (3) depositada por sputteríng, sobre Ia que se deposita Ia cuarta capa de enzima (4) correspondiente con el mediador adecuado; y donde, además, dicha cara inferior (12) del conjunto de cuerpos (1 ,2) se encapsula con una membrana de permeable al analito (5) cerrada con una anillo (6).
2.- Procedimiento de fabricación del biosensor amperométrico desechable (100) caracterizado porque comprende, al menos, las siguientes etapas:
(i) una primera etapa de colocación de una capa de oro (3) por sputteríng sobre una superficie de un material conductor (1 ) embutido en un material aislante (2); (ii) una segunda etapa de colocación de Ia enzima (4) adecuada en disolución, secándose dicha disolución y adicionando una alícuota con Ia cantidad adecuada de mediador, secando Ia solución en conjunto; y
(iii) una tercera etapa de colocación de una membrana de diálisis (5) u otra membrana permeable al analito sobre Ia superficie del conjunto formado por Ia enzima y el mediador (4) junto con el oro (3).
3.- Método de determinación de Ia presencia de analitos en alimentos caracterizado porque comprende, al menos, las siguientes etapas:
(i) una primera etapa de calibrado del dispositivo de medida que incluye el biosensor amperométrico desechable (100), de tal forma que se configure para Ia relación entre Ia corriente generada en el biosensor con el contenido del analito en las unidades adecuadas y en Ia muestra de alimento analizada;
(ii) una segunda etapa de inserción del dispositivo en una disolución de trabajo a Ia que se añade una alícuota de Ia muestra del alimento; y (iii) una tercera etapa de medida y muestra de resultados.
4.- Método, según reivindicación 3, caracterizado porque el dispositivo de medida que incluye el biosensor amperométrico desechable (100) comprende, al menos: un primer cuerpo (200) contenedor de las conexiones, incluyendo el elemento conector (202) con un potenciostato, no mostrado en las figuras, y configurado para Ia calibración del dispositivo; un segundo cuerpo (201 ) situado en Ia parte inferior del primer cuerpo (200), que en su parte inferior comprende, a su vez: un primer biosensor amperométrico desechable (100), objeto de Ia presente invención; un segundo electrodo de referencia (203) preferentemente de Ag/ Ag Cl; y un tercer electrodo auxiliar de un material conductor (204).
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