WO2010003506A1 - Beleuchtungsanordnung für die tirf-mikroskopie - Google Patents

Beleuchtungsanordnung für die tirf-mikroskopie Download PDF

Info

Publication number
WO2010003506A1
WO2010003506A1 PCT/EP2009/004267 EP2009004267W WO2010003506A1 WO 2010003506 A1 WO2010003506 A1 WO 2010003506A1 EP 2009004267 W EP2009004267 W EP 2009004267W WO 2010003506 A1 WO2010003506 A1 WO 2010003506A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tirf
microscope objective
lighting device
collimating optics
optical waveguide
Prior art date
Application number
PCT/EP2009/004267
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Wolleschensky
Original Assignee
Carl Zeiss Microimaging Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Microimaging Gmbh filed Critical Carl Zeiss Microimaging Gmbh
Publication of WO2010003506A1 publication Critical patent/WO2010003506A1/de
Priority to US12/968,788 priority Critical patent/US20110122491A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/56—Optics using evanescent waves, i.e. inhomogeneous waves
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B6/00—Light guides; Structural details of arrangements comprising light guides and other optical elements, e.g. couplings
    • G02B6/24—Coupling light guides
    • G02B6/26—Optical coupling means
    • G02B6/32—Optical coupling means having lens focusing means positioned between opposed fibre ends

Definitions

  • the invention relates to a lighting arrangement for TIRF microscopy.
  • TIRF total internal reflection fluorescence
  • WO 2006/127692 A2 describes the relationships:
  • the Fluorophore Fo sample 14 are excited to fluorescence Fi by means of an evanescent illumination field E exclusively in a thin layer behind the interface between coverslip 9 and sample 14.
  • the evanescent illumination field E in the sample 14 is generated in which the excitation radiation T within the cover glass 9 is at an angle ⁇ c which leads to total reflection, is directed to the cover glass-specimen interface.
  • the optical axial resolution of a TIRF microscope results from the penetration depth d of the evanescent field into the sample.
  • ⁇ is the excitation wavelength
  • ni the refractive index of the cover glass
  • x ⁇ z the refractive index of the medium of the sample.
  • FIG. 2 shows, by way of example, the axial resolution d of a TIRF microscope as a function of the angle of incidence ⁇ for different excitation wavelengths. It can be seen that as the angle of incidence ⁇ increases, the penetration depth decreases and thus the optical axial resolution d of the microscope increases. For axially high resolution images, therefore, a particularly large angle of incidence of the excitation radiation is necessary.
  • FIG. Part 3A shows on the left side an arrangement with a TIRF illumination by means of a prism 19.
  • the fluorescence is collected by the objective 5 and imaged onto a CCD camera (not shown).
  • the TIRF illumination T thus takes place on the side facing away from the lens 5 side.
  • This has the disadvantage that the sample to be examined prepares 14 on the prism 19 must be because the evanescent illumination field is excited at the interface between prism 19 and sample 14. This type of preparation is expensive. In contrast, samples are usually prepared on a thin coverslip.
  • the samples can be prepared by standard methods on a cover glass 9, since here the TIRF illumination takes place through the microscope objective 5.
  • the microscope objective 5 must have a high numerical aperture in order to enable the large angle of incidence necessary for a high resolution for the excitation light T.
  • immersion media and front lenses with a correspondingly high refractive index must be used.
  • the number of lenses generally increases for image correction, so that the manufacturing outlay increases and the transmission decreases.
  • the angle of incidence must be identical for all wavelengths in order to ensure a high resolution, which further increases the complexity of the microscope and thus the manufacturing outlay.
  • the invention has for its object to provide an arrangement and a method that allow for prepared on cover glasses samples TIRF illumination with high axial resolution with little effort.
  • the invention achieves this object by a TIRF illumination device having the features specified in claim 1, by a microscope objective having the features specified in claim 10, and by a method having the features specified in claim 20.
  • the TIRF lighting device is designed as a module and has an optical waveguide and a collimating optics, wherein the Collimating optics is fixed in front of a light exit opening of the optical waveguide so that it collimates divergently emerging light from the optical waveguide to Lichtb ⁇ ndel.
  • a module is an independent device for illumination, which is to be applied with a separate light source which emits at least one fluorescence excitation wavelength in the optical waveguide next to a detection microscope.
  • the invention also includes a method for TIRF excitation in a sample, wherein a collimated light beam is introduced as TIRF illumination outside a detection beam path to a sample.
  • a collimated light beam is introduced as TIRF illumination outside a detection beam path to a sample.
  • the collimated light beam is introduced to the sample on the same sample side as the detection beam path. But also the leading on the side facing away from the lens of the sample is possible.
  • the numerical aperture of the excitation of the numerical aperture of the detection is decoupled.
  • the numerical aperture of the illumination can be chosen to be larger than the numerical aperture of the detection, which is essentially predetermined by the pairing of front lens and immersion medium of the microscope objective, despite the illumination by a cover glass.
  • a microscope objective conventional in optical design can be used to detect the fluorescence that is less susceptible to aberrations caused in the preparation. This makes it possible to achieve high axial optical resolution with little effort.
  • the collimation also ensures a uniform angle of incidence with little effort even at several excitation wavelengths.
  • the collimating optics is designed as a gradient lens. This allows a compact, small-scale construction of the lighting device.
  • the end of the optical waveguide can in particular be connected directly to the collimation optics.
  • Particularly preferred embodiments are those in which the collimating optics and at least the end of the optical waveguide are surrounded by a housing. Thereby, the lighting device can be handled easily and fixed in alignment with the sample.
  • the housing can be used in particular for fixing optical waveguide and / or collimation optics.
  • the housing can advantageously taper at least in sections towards the collimation optics.
  • the position of the lighting device can be defined by the holder.
  • the housing may advantageously be rod-shaped.
  • the housing is then provided with a stop element.
  • the position of the lighting device can be defined by the holder.
  • a rod-shaped glass attachment is arranged on the side facing away from the light exit opening side of the collimating optics. If the cross section of the glass attachment adapted to the contour of the housing and the glass attachment is on all sides of the housing, so he protects the collimating optics from contamination.
  • the material of the glass attachment has a refractive index which is as identical as possible to the refractive index of the immersion medium to be used. As a result, at the interface between the glass attachment and the immersion medium, light refraction does not occur, but the collimated light beam retains its direction, even if the interface is not perpendicular to the propagation direction.
  • the end of the TIRF illumination device at which the collimated light beam exits, can be formed almost arbitrarily.
  • the glass attachment may be objected to by the collimating optics or disposed directly thereon.
  • the collimated bundle is not affected by this.
  • the optical waveguide consists of exactly one optical fiber.
  • the illumination device has a diameter transverse to the optical axis of the collimating optics of a maximum of 0.7 mm.
  • a focal length of the collimating optics is dimensioned so that a cross section of the light beam approximately corresponds to a diameter of a field of view of a microscope objective. This makes the best possible use of the field of view.
  • the optical waveguide consists exclusively of one or more polarization-maintaining single-mode Lichtleitfasem.
  • the modular TIRF illumination device is supplemented by a microscope objective with holding means for collimating optics and for an optical waveguide, wherein the collimating optics can be positioned in front of a light exit opening of the optical waveguide such that it collimates divergently exiting light from the optical waveguide to form a light bundle, wherein the holding means are formed are that the collimated light beam crosses the optical axis of the microscope objective at an angle greater than or equal to a total reflection angle.
  • the irradiation direction of a collimated TIRF illumination with respect to the microscope objective and with respect to the sample can be defined with high accuracy.
  • the holding means are formed by a recess for receiving a modular TIRF illumination device described above in a socket of the microscope objective and / or in a front lens of the microscope objective.
  • a recess for receiving a modular TIRF illumination device described above in a socket of the microscope objective and / or in a front lens of the microscope objective. This allows the definition of the position with little effort.
  • the recess can thereby pass through the front lens of the microscope objective and end in particular in the edge region of the front lens.
  • the collimating optics and a coupling port for the optical waveguide can be fixed by the holding means, in particular permanently, wherein the optical waveguide is detachably connectable to the coupling port.
  • the holding means in particular permanently, wherein the optical waveguide is detachably connectable to the coupling port.
  • No housing is necessary in this form.
  • the handling is simple, since only the fiber optic cable has to be connected to the coupling port for the TIRF illumination.
  • the collimated light beam can be guided through the microscope objective, in particular through its socket and / or front lens, to the sample.
  • a glass attachment can be arranged on the side facing away from the light exit opening side of the collimating optics. As with the modular lighting device, it protects the collimating optics from contamination. If the material of the glass attachment has a refractive index which is as identical as possible to the refractive index of the immersion medium to be used, light refraction does not occur at the interface between the glass attachment and the immersion medium. As a result, the shape of the glass attachment from which the collimated light beam exits can be adapted, for example, to the curvature of the front lens surface or to the shape of the lens mount. In particular, so the glass attachment flush with the surrounding front lens or the surrounding version. The glass attachment may be objected to by the collimating optics or disposed directly thereon. The collimated bundle is not affected by this.
  • the holder is advantageously adjustable so that between the light beam and the optical axis of the microscope objective different angles, which are each greater than or equal to a total reflection angle, are adjustable.
  • this enables the optimization of the total reflection as a function of the excitation wavelength and, on the other hand, a variable adjustment of the penetration depth of the excitation light into the sample.
  • the invention also encompasses a microscope with a microscope objective according to the invention and in particular with a TIRF illumination module according to the invention.
  • the illumination device according to the invention and the microscope objective can be used in all microscopic methods for which a TIRF excitation is advantageous. They are particularly suitable, for example, for photoactivated localization microscopy (PALM), disclosed, for example, in WO 2006/127692 A2.
  • PAM photoactivated localization microscopy
  • FIG. 6 shows a microscope objective according to the invention with a TIRF illumination device according to the invention
  • Fig. 8 is a schematic representation of the beam paths of a light microscope and the TIRF lighting device with light sources and
  • FIG. 9 shows a schematic illustration of the beam paths of a scanning microscope and the TIRF illumination device.
  • FIG. 4 shows a TIRF illumination bar 1, which consists of an optical waveguide 2 in the form of a glass fiber, a collimating optics 3 and a housing 4.
  • Part 4A shows a cross section.
  • Partial figure 4B schematically shows the effect of the collimating optics 3 on the TIRF excitation radiation T.
  • the glass fiber 2 is, for example, a single-mode design and polarization-preserving.
  • the light entry opening (not shown) of the glass fiber 2 can be connected, for example via a coupling optical system, to a laser light source (not shown) which emits a fluorescence-exciting wavelength.
  • the housing 4 encapsulates the TIRF illumination rod 1 in the region of the collimating optics 3 in a liquid-tight manner, so that, in particular, no immersion medium can penetrate into the housing. Also at the opposite end, the housing may be formed liquid-tight around the entrance of the optical waveguide 2 around.
  • the divergent emerging from the light exit opening of the optical fiber 2 light radiation is directed by means of the collimating optics 3 to a parallel beam.
  • the focal length of the collimating optics 3 is for example tuned such that the bundle cross-section D approximately corresponds to the visual field of a microscope objective to be used in the sample.
  • Particularly suitable for collimating the light beam from the glass fiber 2 is the use of a so-called "grin” optics ("gradient index"), since here the glass fiber 2 can be connected directly to the gradient lens (“spliced").
  • the housing 4, which accommodates the entire assembly, is a bar fuselage, for example of metal.
  • the entire arrangement of the TIRF lighting rod 1 has, for example, a diameter of about 0.6 mm.
  • FIG. 5 shows an embodiment of the TIRF lighting rod 1 which is expanded compared to FIG. Part 5A shows a cross section.
  • Part Figure 5B shows schematically the course of the TIRF excitation radiation T.
  • a glass attachment 21 with the same diameter as the housing 4, which is flush with the housing 4 on all sides, is arranged in a protective manner in front of the collimating optics 3. It encapsulates the TIRF illumination bar 1 in the area of the collimating optics 3 in a liquid-tight manner.
  • the glass attachment 21 has the same refractive index as during an immersion medium to be used for a TIRF measurement.
  • the glass attachment 21 has no optical effect, the collimated light beam T remains collimated.
  • Fig. 6 shows the arrangement of the TIRF illumination rod 1 on a microscope objective 5, whereby a complex objective as in Fig. 3B can be dispensed with.
  • the rod 1 is arranged on the lens 5 at an angle ⁇ .
  • the socket 6 of the front lens 7 is provided with a corresponding recess 8 in the form of a bore with the diameter of the rod 1.
  • the recess can also pass through the front lens 7.
  • the TIRF lighting rod 1 is releasably fixed in the recess 8, for example by complementary stop elements (not shown).
  • the objective 5 is fixed in a conventional manner to a microscope stand (not shown) by the reivanschraubung 20.
  • the recess 8 may be larger and have an adjustable support for the TIRF lighting rod 1, so that the angle ⁇ can be set to different values.
  • the recess with inserted TIRF illumination rod 1 must be close to the immersion medium (not shown) arranged between lens 5 and cover glass 9.
  • a corresponding plug (not shown) is provided for the use of the objective 5 without the TIRF illumination bar 1.
  • the microscope objective 5 thus defines a first optical axis OA1, while the collimating optics 3 of the TIRF illumination rod 1 for TIRF excitation defines a second optical axis OA2.
  • the sample (not shown) is prepared in the immediate vicinity of the cover glass 9.
  • the first and the second optical axis are at an angle ⁇ to each other, which is greater than the given by the numerical aperture of the lens 5 maximum angle and greater than the critical angle ⁇ c, from which occurs in dependence of the refractive indices total reflection, so that at the Interface between coverslip 9 and sample evanescent field arises.
  • the collimating optics 3 and a coupling port can be fixed in / on the lens 5 in holding means, for example a recess as shown above.
  • the optical waveguide 2 can then be required be released from the coupling port, while the collimating optics and the coupling port remain in the lens 5.
  • FIG. 7 two examples of the holder of a TIRF lighting rod 1 with a glass attachment 21 are shown schematically.
  • the recess 8 passes through the socket 6 and the front lens 7 of the microscope objective 5 therethrough.
  • the glass attachment 21 has the same refractive index as the front lens 7 and is shaped so that it does not protrude from the surface of the front lens 7.
  • the recess 8 passes only through the socket 6 therethrough.
  • the glass attachment 21 here also has the same refractive index as the front lens 7. It is shaped such that it does not protrude from the surface of the holder 6.
  • the collimating optics 3 and the glass attachment 21 can be fixed in the objective 5.
  • a housing is then not required.
  • a coupling port is then expediently provided (not shown).
  • the glass attachment 21 is then arranged at the lower end of the recess 8 as shown, while the collimating optics 3 with the coupling port is arranged at the upper end of the recess 8.
  • FIG. 8 schematically shows the optical arrangement of the objective 5 with TIRF illumination rod 1 on a microscope M.
  • Light of different lasers 10.1, 10.2, 10.3 is illuminated in the light source LQ1 via a light shutter 11 and an attenuator 12
  • the fiber 2 terminates in the TIRF lighting rod 1.
  • This is coupled to the lens 5 as described in Fig. 5, wherein the angle of incidence ⁇ is selected so that at the interface between cover glass 9 and sample
  • the evanescent field excites molecules in the region of the interface to fluoresce the sample fluorescence is collected with the microscope objective 5 and a tube lens 15, a filter 16 for suppressing the excitation radiation to a CCD camera 17, where the camera is located in an intermediate image of the microscope M.
  • FIG. 9 shows the use of a TIRF illumination bar 1 with a single excitation laser 10.5 on a laser scanning microscope (LSM), in which the focus volume can be moved over the sample by means of two scanner mirrors 22.
  • LSM laser scanning microscope
  • the LSM is modularly composed of an illumination module L, a scan module S, a detection module D and the microscope unit M.
  • the detection module D has a plurality of detection channels, each with a pinhole 23, a filter 16 and a photomultiplier 24, which are separated by color divider 25.
  • pinhole diaphragms slit diaphragms (not shown) can be used, for example in the case of line-shaped illumination.
  • the collimating optics 3 with a coupling port can be arranged directly in the objective 5.
  • the use of the TIRF illumination device does not necessarily require the use of a microscope objective with a special recess. Rather, the TIRF illumination module can also be aligned with a separate holder relative to the objective and the sample.
  • a TIRF lighting bar 1 can replace a prism in an application according to FIG. 3A.
  • the sample preparation is then significantly simplified.
  • the tip of the TIRF illumination module must be in an immersion medium to ensure the transition of the excitation light into the coverslip.
  • the immersion medium must be suitably provided with a sheath.
  • an opening for the implementation of the TIRF lighting device is provided.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

2.1. Die Beleuchtung für eine Totalreflexions-Fluoreszenzmessung erfolgt bisher entweder mittels eines Prismas auf der vom Mikroskopobjektiv abgewandten Seite, wobei die zu untersuchende Probe aufwendigerweise auf dem Prisma präpariert werden muss. Alternativ erfolgt die TIRF-Beleuchtung durch das Mikroskopobjektiv hindurch, was wegen der erforderlichen großen Einfallswinkel eine hohe numerische Apertur und damit ein aufwendiges Objektiv erfordert. Die Erfindung soll eine TIRF-Beleuchtung mit hoher axialer Auflösung unter geringem Aufwand ermöglichen. 2.2. Indem eine TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1) als Modul ausgebildet ist und einen Lichtwellenleiter (2) und eine Kollimationsoptik (3) aufweist, wobei die Kollimationsoptik vor einer Lichtaustrittsöffnung des Lichtwellenleiters so fixiert ist, dass sie aus dem Lichtwellenleiter divergent austretendes Licht zu einem Lichtbündel kollimiert, kann das Anregungslicht außerhalb des Detektionsstrahlengangs an eine Probe herangeführt werden. Dadurch wird die numerische Apertur der Anregung von der numerischen Apertur der Detektion entkoppelt, so dass ein Standardmikroskopobjektiv für die Detektion ausreicht. 2.3. Fluoreszenzmikroskopie.

Description

Beleuchtunqsanordnunq für die TIRF-Mikroskopie
Die Erfindung betrifft eine Beleuchtungsanordnung für die TIRF-Mikroskopie.
Die Mikroskopie unter Anwendung der sogenannten Totalreflexions-Fluoreszenz (engl, „total internal reflection fluorescence", TIRF) ist eine besondere Form der Fluoreszenzmikroskopie. Sie ist beispielsweise in WO 2006/127692 A2 offenbart. Fig. 1 erläutert die Zusammenhänge. Die Fluorophore Fo Probe 14 werden mittels eines evaneszenten Beleuchtungsfelds E ausschließlich in einer dünnen Schicht hinter der Grenzfläche zwischen Deckglas 9 und Probe 14 zur Fluoreszenz Fi angeregt. Das evaneszente Beleuchtungsfeld E in der Probe 14 wird erzeugt, in dem die Anregungsstrahlung T innerhalb des Deckglases 9 unter einem Winkel θc, der zur Totalreflexion führt, auf die Grenzfläche Deckglas-Probe geleitet wird.
Indem nur die dünne Schicht zur Fluoreszenz angeregt wird, kann eine besonders hohe axiale Auflösung erzielt werden. Die optische axiale Auflösung eines TIRF- Mikroskops ergibt sich aus der Eindringtiefe d des evaneszenten Feldes in die Probe. In Abhängigkeit des Einfallswinkels θ ergibt sich die axiale Auflösung aus
Figure imgf000003_0001
wobei λ die Anregungswellenlänge, ni die Brechzahl des Deckglases und x\z die Brechzahl des Mediums der Probe ist. In Fig. 2 ist beispielhaft die axiale Auflösung d eines TIRF-Mikroskops in Abhängigkeit des Einfallswinkels θ für verschiedene Anregungswellenlängen dargestellt. Es zeigt sich, dass mit steigendem Einfallswinkel θ die Eindringtiefe abnimmt und damit optische axiale Auflösung d des Mikroskops zunimmt. Für axial hochaufgelöste Abbildungen ist also ein besonders großer Einfallswinkel der Anregungsstrahlung notwendig.
Im Stand der Technik sind zwei Arten der TIRF-Beleuchtung bekannt, die in Fig. 3 schematisch dargestellt sind. Teilfigur 3A zeigt auf der linken Seite eine Anordnung mit einer TIRF-Beleuchtung mittels eines Prismas 19. Die Fluoreszenz wird durch das Objektiv 5 gesammelt und auf eine CCD Kamera (nicht dargestellt) abgebildet. Die TIRF-Beleuchtung T erfolgt also auf der vom Objektiv 5 abgewandten Seite. Dies hat den Nachteil, dass die zu untersuchende Probe 14 auf dem Prisma 19 präpariert werden muss, da das evaneszente Beleuchtungsfeld an der Grenzfläche zwischen Prisma 19 und Probe 14 angeregt wird. Diese Art der Präparation ist aufwendig. Im Gegensatz dazu werden Proben in der Regel auf einem dünnen Deckglas präpariert.
Bei der zweiten Art der TIRF-Beleuchtung gemäß Teilfigur 3B, offenbart beispielsweise in Fig. 9 der WO 2006/127692 A2, können die Proben mit Standardverfahren auf einem Deckglas 9 präpariert werden, da hier die TIRF- Beleuchtung durch das Mikroskopobjektiv 5 hindurch erfolgt. Diese Anordnung hat jedoch den Nachteil, dass das Mikroskopobjektiv 5 eine hohe numerische Apertur aufweisen muss, um die für eine hohe Auflösung notwendigen großen Einfallswinkel für das Anregungslicht T zu ermöglichen. Hierdurch entstehen erhöhte Anforderungen an die verwendeten Gläser, wodurch sich die Anzahl der zur Verfügung stehenden Glasarten reduziert. Beispielsweise müssen Immersionsmedien und Frontlinsen mit entsprechend hoher Brechzahl eingesetzt werden. Weiterhin erhöht sich zur Bildkorrektur in der Regel die Anzahl der Linsen, so dass der Fertigungsaufwand steigt und die Transmission sinkt. Soll die Probe zur TIRF-Anregung simultan mit unterschiedlichen Wellenlängen beleuchtet werden, so muss der Einfallswinkel, um eine hohe Auflösung zu gewährleisten, für alle Wellenlängen identisch sein, was die Komplexität des Mikroskops und damit den Fertigungsaufwand weiter erhöht.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Anordnung und ein Verfahren anzugeben, die bei auf Deckgläsern präparierten Proben eine TIRF-Beleuchtung mit hoher axialer Auflösung unter geringem Aufwand ermöglichen.
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch eine TIRF-Beleuchtungsvorrichtung, welche die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist, durch ein Mikroskopobjektiv, welches die in Anspruch 10 angegebenen Merkmale aufweist, und durch ein Verfahren, welches die in Anspruch 20 angegebenen Merkmale aufweist.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Erfindungsgemäß ist die TIRF-Beleuchtungsvorrichtung als Modul ausgebildet und weist einen Lichtwellenleiter und eine Kollimationsoptik auf, wobei die Kollimationsoptik vor einer Lichtaustrittsöffnung des Lichtwellenleiters so fixiert ist, dass sie aus dem Lichtwellenleiter divergent austretendes Licht zu einem Lichtbϋndel kollimiert. Im Sinne der Erfindung ist ein Modul ein eigenständiges Gerät zur Beleuchtung, das mit einer eigenen Lichtquelle, die mindestens eine Fluoreszenzanregungswellenlänge in den Lichtwellenleiter emittiert, neben einem Detektionsmikroskop anzuwenden ist.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur TIRF-Anregung in einer Probe, wobei ein kollimierter Lichtstrahl als TIRF-Beleuchtung außerhalb eines Detektionsstrahlengangs an eine Probe herangeführt wird. Vorzugsweise wird der kollimierte Lichtstrahl auf derselben Probenseite wie der Detektionsstrahlengang an die Probe herangeführt. Aber auch das Heranführen auf der vom Objektiv abgewandten Seite der Probe ist möglich.
Durch ein solches Beleuchtungsmodul beziehungsweise ein solches Verfahren wird die numerische Apertur der Anregung von der numerischen Apertur der Detektion entkoppelt. Dadurch kann die numerische Apertur der Beleuchtung trotz der Beleuchtung durch ein Deckglas insbesondere größer als die im wesentlichen durch die Paarung von Frontlinse und Immersionsmedium des Mikroskopobjektivs vorgegebene numerische Apertur der Detektion gewählt werden. Es kann somit ein bezüglich des optischen Aufbaus her übliches Mikroskopobjektiv für die Detektion der Fluoreszenz verwendet werden, das weniger anfällig gegenüber im Präparat hervorgerufenen Aberrationen ist. Das ermöglicht, mit geringem Aufwand eine hohe axiale optische Auflösung zu erzielen. Durch die Kollimation wird zudem mit geringem Aufwand auch bei mehreren Anregungswellenlängen ein einheitlicher Einfallswinkel sichergestellt.
Vorzugsweise ist die Kollimationsoptik als Gradientenlinse ausgebildet. Dies ermöglicht einen kompakten, kleinräumigen Aufbau der Beleuchtungsvorrichtung. Zu diesem Zweck kann das Ende des Lichtwellenleiters insbesondere direkt mit der Kollimationsoptik verbunden werden.
Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen die Kollimationsoptik und zumindest das Ende des Lichtwellenleiters von einem Gehäuse umgeben sind. Dadurch die Beleuchtungsvorrichtung einfach gehandhabt und unter Ausrichtung auf die Probe befestigt werden. Das Gehäuse kann insbesondere zur Fixierung von Lichtwellenleiter und/oder Kollimationsoptik dienen.
In einer ersten Ausgestaltungsvariante kann sich das Gehäuse vorteilhafterweise zur Kollimationsoptik hin zumindest abschnittsweise verjüngen. In Verbindung mit einer entsprechend geformten Halterung kann die Position der Beleuchtungsvorrichtung durch die Halterung definiert werden.
In einer zweiten Ausgestaltungsvariante kann das Gehäuse vorteilhafterweise stabförmig sein. Vorzugsweise ist das Gehäuse dann mit einem Anschlagelement versehen. In Verbindung mit einer Halterung mit einem komplementären Anschlagelement kann die Position der Beleuchtungsvorrichtung durch die Halterung definiert werden.
Vorzugsweise ist ein beispielsweise stabförmiger Glasvorsatz auf der von der Lichtaustrittsöffnung abgewandten Seite der Kollimationsoptik angeordnet. Ist der Querschnitt des Glasvorsatzes an die Kontur des Gehäuses angepasst und liegt der Glasvorsatz allseitig an dem Gehäuse an, so schützt er die Kollimationsoptik vor Verschmutzungen. Zweckmäßigerweise weist das Material des Glasvorsatzes eine Brechzahl auf, die möglichst identisch mit der Brechzahl des zu verwendenden Immersionsmediums ist. Dadurch kommt es an der Grenzfläche zwischen Glasvorsatz und Immersionsmedium nicht zur Lichtbrechung, sondern der kollimierte Lichtstrahl behält seine Richtung bei, selbst wenn die Grenzfläche nicht senkrecht zur Ausbreitungsrichtung ist. Dadurch kann das Ende der TIRF- Beleuchtungsvorrichtung, an dem der kollimierte Lichtstrahl austritt, nahezu beliebig geformt werden. Der Glasvorsatz kann von der Kollimationsoptik beanstandet oder unmittelbar daran angeordnet sein. Das kollimierte Bündel wird dadurch nicht beeinträchtigt.
Besonders kompakt und flexibel in der Handhabung sind Ausführungsformen, in denen der Lichtwellenleiter aus genau einer Lichtleitfaser besteht. Vorteilhafterweise hat die Beleuchtungsvorrichtung einen Durchmesser quer zur optischen Achse der Kollimationsoptik von maximal 0,7 mm. Dadurch ist die Positionierung neben dem Mikroskopobjektiv und gegenüber der Probe sehr flexibel.
Zweckmäßigerweise ist eine Brennweite der Kollimationsoptik so bemessen, dass ein Querschnitt des Lichtbündels etwa einem Durchmesser eines Sehfelds eines Mikroskopobjektivs entspricht. Dadurch wird das Sehfeld bestmöglich ausgenutzt.
In bevorzugten Ausführungsformen besteht der Lichtwellenleiter ausschließlich aus einer oder mehreren polarisationserhaltenden Single-Mode-Lichtleitfasem.
Die modulare TIRF-Beleuchtungsvorrichtung wird ergänzt durch ein Mikroskopobjektiv mit Halterungsmitteln für eine Kollimationsoptik und für einen Lichtwellenleiter, wobei die Kollimationsoptik vor einer Lichtaustrittsöffnung des Lichtwellenleiters so positionierbar ist, dass sie aus dem Lichtwellenleiter divergent austretendes Licht zu einem Lichtbündel kollimiert, wobei die Halterungsmittel so ausgebildet sind, dass das kollimierte Lichtbündel die optische Achse des Mikroskopobjektivs unter einem Winkel kreuzt, der größer oder gleich einem Totalreflexionswinkel ist. Durch solche Halterungsmittel kann die Einstrahlrichtung einer kollimierten TIRF-Beleuchtung gegenüber dem Mikroskopobjektiv und gegenüber der Probe mit hoher Genauigkeit definiert werden.
Vorzugsweise sind die Halterungsmittel durch eine Ausnehmung zur Aufnahme einer oben beschriebenen modularen TIRF-Beleuchtungsvorrichtung in einer Fassung des Mikroskopobjektivs und/oder in einer Frontlinse des Mikroskopobjektivs gebildet. Dies ermöglicht die Definition der Position mit geringem Aufwand. Die Ausnehmung kann dabei durch die Frontlinse des Mikroskopobjektivs hindurchführen und insbesondere im Randbereich der Frontlinse enden.
Alternativ können die Kollimationsoptik und ein Koppelport für den Lichtwellenleiter durch die Halterungsmittel fixiert sein, insbesondere permanent, wobei der Lichtwellenleiter lösbar mit dem Koppelport verbindbar ist. In dieser Form ist kein Gehäuse notwendig. Die Handhabung ist einfach, da zur TIRF-Beleuchtung lediglich der Lichtwellenleiter mit dem Koppelport verbunden werden muss. Generell kann der kollimierte Lichtstrahl durch das Mikroskopobjektiv, insbesondere durch dessen Fassung und/oder Frontlinse, an die Probe herangeführt werden.
In allen Fällen kann ein Glasvorsatz auf der von der Lichtaustrittsöffnung abgewandten Seite der Kollimationsoptik angeordnet sein. Wie bei der modularen Beleuchtungsvorrichtung schützt er die Kollimationsoptik vor Verschmutzungen. Weist das Material des Glasvorsatzes eine Brechzahl auf, die möglichst identisch mit der Brechzahl des zu verwendenden Immersionsmediums ist, so kommt es an der Grenzfläche zwischen Glasvorsatz und Immersionsmedium nicht zur Lichtbrechung. Dadurch kann die Form des Glasvorsatzes, aus dem der kollimierte Lichtstrahl austritt, beispielsweise an die Krümmung der Frontlinsenoberfläche oder an die Form der Objektivfassung angepasst werden. Insbesondere kann so der Glasvorsatz bündig mit der umgebenden Frontlinse beziehungsweise der umgebenden Fassung abschließen. Der Glasvorsatz kann von der Kollimationsoptik beanstandet oder unmittelbar daran angeordnet sein. Das kollimierte Bündel wird dadurch nicht beeinträchtigt.
In einer weitergehenden Ausgestaltung ist die Halterung vorteilhafterweise so einstellbar, dass zwischen Lichtbündel und optischer Achse des Mikroskopobjektivs unterschiedliche Winkel, die jeweils größer oder gleich einem Totalreflexionswinkel sind, einstellbar sind. Dies ermöglicht einerseits die Optimierung der Totalreflexion in Abhängigkeit der Anregungswellenlänge und andererseits eine variable Einstellung der Eindringtiefe des Anregungslichts in die Probe.
Die Erfindung umfasst auch ein Mikroskop mit einem erfindungsgemäßen Mikroskopobjektiv und insbesondere mit einem erfindungsgemäßen TIRF- Beleuchtungsmodul.
Die erfindungsgemäße Beleuchtungsvorrichtung und das Mikroskopobjektiv können in allen mikroskopischen Verfahren eingesetzt werden, für die eine TIRF-Anregung vorteilhaft ist. Besonders geeignet sind sie beispielsweise für die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (engl, „photo-activated localization microscopy"; PALM), offenbart beispielsweise in WO 2006/127692 A2. Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 die Funktionsweise von TIRF,
Fig. 2 die Eindringtiefe in Abhängigkeit des Einfallswinkels bei drei Wellenlängen,
Fig. 3 die TIRF-Beleuchtungsmöglichkeiten nach dem Stand der Technik,
Fig. 4 eine erfindungsgemäße TIRF-Beleuchtungsvorrichtung,
Fig. 5 eine weitere TIRF-Beleuchtungsvorrichtung,
Fig. 6 eine erfindungsgemäßes Mikroskopobjektiv mit einer erfindungsgemäßen TIRF-Beleuchtungsvorrichtung,
Fig. 7 weitere Anordnungsmöglichkeiten am Mikroskopobjektiv,
Fig. 8 eine schematische Darstellung der Strahlengänge eines Lichtmikroskops und der TIRF-Beleuchtungsvorrichtung mit Lichtquellen und
Fig. 9 eine schematische Darstellung der Strahlengänge eines Rastermikroskops (engl, „scanning microscope") und der TIRF-Beleuchtungsvorrichtung.
In allen Zeichnungen haben übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen.
Um eine bestimmte axiale Auflösung zu erzielen, muss der kollimierte Strahl der TIRF-Anregungsbeleuchtung unter einem durch obige Formel gegebenen Einfallswinkel θ auf die Grenzfläche zwischen Probe und Deckglas eingestrahlt werden. Erfindungsgemäß wurde erkannt, dass durch ein schmales, separates Beleuchtungsmodul zur TIRF-Anregung die numerische Apertur der Anregung von der numerischen Apertur der Detektion entkoppelt werden kann. Entsprechend zeigt Fig. 4 einen TIRF-Beleuchtungsstab 1 , der aus einem Lichtwellenleiter 2 in Form einer Glasfaser, einer Kollimationsoptik 3 und einem Gehäuse 4 besteht. Teilfigur 4A zeigt einen Querschnitt. Teilfigur 4B zeigt schematisch die Wirkung der Kollimationsoptik 3 auf die TIRF-Anregungsstrahlung T. Die Glasfaser 2 ist beispielsweise eine Single-Mode-Ausführung und polarisationserhaltend. Die Lichteintrittsöffnung (nicht abgebildet) der Glasfaser 2 kann, beispielsweise über eine Koppeloptik, an eine Laserlichtquelle (nicht abgebildet) angeschlossen werden, die eine fluoreszenzanregende Wellenlänge emittiert. Das Gehäuse 4 verkapselt den TIRF-Beleuchtungsstab 1 im Bereich der Kollimationsoptik 3 flüssigkeitsdicht, so dass insbesondere kein Immersionsmedium in das Gehäuse eindringen kann. Auch am entgegengesetzten Ende kann das Gehäuse um den Eintritt des Lichtwellenleiters 2 herum flüssigkeitsdicht ausgebildet sein.
Die aus der Lichtaustrittsöffnung der Glasfaser 2 divergent austretende Lichtstrahlung wird mittels der Kollimationsoptik 3 zu einem parallelen Strahlenbündel gerichtet. Die Brennweite der Kollimationsoptik 3 ist beispielsweise so abgestimmt, dass der Bündelquerschnitt D in etwa dem Sehfeld eines zu verwendenden Mikroskopobjektivs in die Probe entspricht. Besonders geeignet zur Kollimation des Lichtbündels aus der Glasfaser 2 ist die Verwendung einer sogenannten Grin-Optik (engl, „gradient index"), da hier die Glasfaser 2 direkt mit der Gradientenlinse verbunden (engl. „spliced")werden kann. Das Gehäuse 4, das die gesamte Anordnung aufnimmt, ist eine Stabferule, beispielsweise aus Metall. Die gesamte Anordnung des TIRF-Beleuchtungsstabs 1 hat beispielsweise einen Durchmesser von etwa 0,6 mm.
In Fig. 5 ist eine gegenüber Fig. 4 erweiterte Ausführungsform des TIRF- Beleuchtungsstabs 1 dargestellt. Teilfigur 5A zeigt einen Querschnitt. Teilfigur 5B zeigt schematisch den Verlauf der TIRF-Anregungsstrahlung T. Ein Glasvorsatz 21 mit demselben Durchmesser wie das Gehäuse 4, der allseits bündig mit dem Gehäuse 4 abschließt, ist schützend vor der Kollimationsoptik 3 angeordnet. Er verkapselt den TIRF-Beleuchtungsstab 1 im Bereich der Kollimationsoptik 3 flüssigkeitsdicht. Der Glasvorsatz 21 hat denselben Brechungsindex wie ein während einer TIRF-Messung zu verwendendes Immersionsmedium. Der Glasvorsatz 21 hat keine optische Wirkung, der kollimierte Lichtstrahl T bleibt kollimiert.
Fig. 6 zeigt die Anordnung des TIRF-Beleuchtungsstabs 1 an einem Mikroskopobjektiv 5, wodurch auf ein komplexes Objektiv wie in Fig. 3B verzichtet werden kann. Der Stab 1 ist am Objektiv 5 unter einem Winkel θ angeordnet. Zu diesem Zweck ist die Fassung 6 der Frontlinse 7 mit einer entsprechenden Ausnehmung 8 in Form einer Bohrung mit dem Durchmesser des Stabs 1 versehen. In alternativen Ausgestaltungen (nicht abgebildet) kann die Ausnehmung auch durch die Frontlinse 7 hindurchführen. Der TIRF-Beleuchtungsstab 1 ist in der Ausnehmung 8 lösbar fixiert, beispielsweise durch komplementäre Anschlagelemente (nicht abgebildet). Das Objektiv 5 wird auf herkömmliche Art und Weise an einem Mikroskopstativ (nicht abgebildet) durch die Objektivanschraubung 20 befestigt. In alternativen Ausgestaltungen (nicht abgebildet) kann die Ausnehmung 8 größer sein und eine verstellbare Halterung für den TIRF-Beleuchtungsstab 1 aufweisen, so dass der Winkel θ auf unterschiedliche Werte eingestellt werden kann. In jedem Fall muss die Ausnehmung mit eingesetztem TIRF-Beleuchtungsstab 1 dicht gegenüber dem zwischen Objektiv 5 und Deckglas 9 angeordneten Immersionsmedium (nicht abgebildet) sein. Für die Verwendung des Objektivs 5 ohne den TIRF-Beleuchtungsstab 1 ist ein entsprechender Stopfen (nicht abgebildet) vorgesehen.
Das Mikroskopobjektiv 5 definiert also eine erste optische Achse OA1 , während die Kollimationsoptik 3 des TIRF-Beleuchtungsstabs 1 zur TIRF-Anregung eine zweite optische Achse OA2 definiert. Die Probe (nicht abgebildet) ist in der unmittelbaren Nähe des Deckglases 9 präpariert. Die erste und die zweite optische Achse stehen unter dem Winkel θ zueinander, der größer als der durch die numerische Apertur des Objektivs 5 gegebene maximale Winkel und größer als der kritische Winkel θc ist, ab dem in Abhängigkeit der Brechzahlen Totalreflexion auftritt, so dass an der Grenzfläche zwischen Deckglas 9 und Probe ein evaneszentes Feld entsteht.
In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) können die Kollimationsoptik 3 und ein Koppelport in Halterungsmitteln, beispielsweise einer Ausnehmung wie oben gezeigt, am/im Objektiv 5 fixiert sein. Der Lichtwellenleiter 2 kann dann bei Bedarf vom Koppelport gelöst werden, während die Kollimationsoptik und der Koppelport im Objektiv 5 verbleiben.
In Fig. 7 sind zwei Beispiele für die Halterung eines TIRF-Beleuchtungsstabs 1 mit einem Glasvorsatz 21 schematisch dargestellt. In Teilfigur 7A führt die Ausnehmung 8 durch die Fassung 6 und die Frontlinse 7 des Mikroskopobjektivs 5 hindurch. Der Glasvorsatz 21 weist dieselbe Brechzahl auf wie die Frontlinse 7 und ist derart geformt, dass er nicht aus der Oberfläche der Frontlinse 7 herausragt. In Teilfigur 7B führt die Ausnehmung 8 nur durch die Fassung 6 hindurch. Der Glasvorsatz 21 weist auch hier dieselbe Brechzahl auf wie die Frontlinse 7. Er ist so geformt, dass er nicht aus der Oberfläche der Fassung 6 herausragt. In beiden Fällen können anstelle eines modularen Stabes 1 die Kollimationsoptik 3 und der Glasvorsatz 21 im Objektiv 5 fixiert sein. Ein Gehäuse ist dann nicht erforderlich. Zum Anschluss des Lichtwellenleiters ist dann zweckmäßigerweise ein Koppelport vorzusehen (nicht abgebildet). Typischerweise ist dann der Glasvorsatz 21 wie abgebildet am unteren Ende der Ausnehmung 8 angeordnet, während die Kollimationsoptik 3 mit dem Koppelport am oberen Ende der Ausnehmung 8 angeordnet ist.
Fig. 8 zeigt schematisch die optische Anordnung des Objektivs 5 mit TIRF- Beleuchtungsstab 1 an einem Mikroskop M. Licht verschiedener Laser 10.1 , 10.2, 10.3 wird in der Lichtquelle LQ1 über eine Lichtklappe 11 (engl, „shutter") und einen Abschwächer 12 mittels eines Faserkopplers 13 in die Glasfaser 2 eingekoppelt. Die Glasfaser 2 mündet in den TIRF Beleuchtungsstab 1. Dieser ist wie in Fig. 5 beschrieben an das Objektiv 5 gekoppelt, wobei der Einfallswinkel θ so gewählt ist, dass an der Grenzfläche zwischen Deckglas 9 und Probe 14 ein evaneszentes Strahlungsfeld (nicht abgebildet) entsteht. Durch das evaneszente Feld werden Moleküle im Bereich der Grenzfläche zur Fluoreszenz angeregt. Die Probenfluoreszenz wird mit dem Mikroskopobjektiv 5 gesammelt und über eine Tubuslinse 15, einen Filter 16 zur Unterdrückung der Anregungsstrahlung auf eine CCD-Kamera 17 abgebildet, wobei sich die Kamera in einem Zwischenbild des Mikroskops M befindet. Zusätzlich zur TIRF-Anregung durch den Beleuchtungsstab 1 können Lichtquellen (nicht abgebildet) aus einem weiteren Lichtquellenmodul LQ2 mittels eines dichroitischen Strahlteilers 18 gekoppelt werden. In Fig. 9 ist die Verwendung eines TIRF-Beleuchtungsstabs 1 mit einem einzelnen Anregungslaser 10.5 an einem Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) dargestellt, bei dem das Fokusvolumen mittels zweier Scannerspiegel 22 über die Probe bewegt werden kann. Das LSM ist modular aus einem Beleuchtungsmodul L, einem Scanmodul S, einem Detektionsmodul D und der Mikroskopeinheit M zusammengesetzt. Das Detektionsmodul D weist mehrere Detektionskanäle mit jeweils einer Lochblende 23, einem Filter 16 und einem Photovervielfacher 24 auf, die durch Farbteiler 25 separiert sind. Anstelle von Lochblenden können, beispielsweise bei linienförmiger Beleuchtung, auch Schlitzblenden (nicht abgebildet) verwendet werden.
Sowohl in Fig. 8 als auch in Fig. 9 kann anstelle eines TIRF-Beleuchtungsstabs 1 die Kollimationsoptik 3 mit einem Koppelport unmittelbar im Objektiv 5 angeordnet sein.
Die Anwendung der TIRF-Beleuchtungsvorrichtung erfordert nicht zwingend die Verwendung eines Mikroskopobjektivs mit spezieller Ausnehmung. Das TIRF- Beleuchtungsmodul kann vielmehr auch mit einem separaten Halter relativ zum Objektiv und zur Probe ausgerichtet werden. Ein TIRF-Beleuchtungsstab 1 kann beispielsweise ein Prisma in einer Anwendung gemäß Fig. 3A ersetzen. Die Probenpräparation ist dann deutlich vereinfacht. In jedem Fall muss die Spitze des TIRF-Beleuchtungsmoduls in einem Immersionsmedium liegen, um den Übergang des Anregungslichts in das Deckglas sicherzustellen. Das Immersionsmedium muss entsprechend mit einer Hülle versehen sein. In der Hülle ist eine Öffnung zur Durchführung der TIRF-Beleuchtungsvorrichtung vorzusehen.
Bezuqszeichenliste
1 TIRF-Beleuchtungsstab
2 Glasfaser
3 Kollimationsoptik
4 Gehäuse
5 Mikroskopobjektiv
6 Fassung
7 Frontlinse
8 Ausnehmung
9 Deckglas
10.1 , 10.2, 10.3, 10.4, 10.5 Laser
11 Lichtklappe
12 Abschwächer
13 Faserkoppler
14 Probe
15 Tubuslinse
16 Filter
17 CCD-Kamera
18 Dichroitischer Strahlteiler
19 Prisma
20 Gewinde
21 Glasvorsatz
22 Scannerspiegel
23 Lochblende
24 Photovervielfacher
F0 Fluorophor (Grundzustand)
Fi Fluorophor (Angeregter Zustand)
T TIRF-Anregungslicht
D Bündelquerschnitt
E Evaneszentes Beleuchtungsfeld
M Mikroskop
LQ1 Erste Lichtquelle LQ2 Zweite Lichtquelle
OA1 Erste optische Achse
OA2 Zweite optische Achse θ Winkel

Claims

Patentansprüche
1. Modulare TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1 ) für ein Mikroskop (M), aufweisend einen Lichtwellenleiter (2) und eine Kollimationsoptik (3), wobei die Kollimationsoptik (3) vor einer Lichtaustrittsöffnung des Lichtwellenleiters (2) so fixiert ist, dass sie aus dem Lichtwellenleiter (2) divergent austretendes Licht zu einem Lichtbündel kollimiert.
2. TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1 ) nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kollimationsoptik (3) als Gradientenlinse ausgebildet ist.
3. TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1 ) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kollimationsoptik (3) und zumindest die Lichtaustrittsöffnung des Lichtwellenleiters (2) von einem Gehäuse (4) umgeben sind.
4. TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1 ) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Gehäuse (4) zur Kollimationsoptik (3) hin zumindest abschnittsweise verjüngt.
5. TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse (4) stabförmig ist.
6. TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1 ) nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse (4) mit einem Anschlagelement versehen ist.
7. TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1 ) nach einem der Ansprüche 3 bis 6, gekennzeichnet durch einen Glasvorsatz (21 ), der auf der von der Lichtaustrittsöffnung abgewandten Seite der Kollimationsoptik (3) angeordnet ist.
8. TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtwellenleiter (2) aus genau einer Lichtleitfaser besteht.
9. TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen Durchmesser quer zur optischen Achse der Kollimationsoptik (3) von maximal 0,7 mm.
10. TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Brennweite der Kollimationsoptik (3) so bemessen ist, dass ein Querschnitt (D) des Lichtbündels etwa einem Durchmesser eines Sehfelds eines Mikroskopobjektivs (5) entspricht.
11.TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtwellenleiter (2) ausschließlich aus einer oder mehreren polarisationserhaltenden Single-Mode-Lichtleitfasern besteht.
12. Mikroskopobjektiv (5), gekennzeichnet durch Halterungsmittel für eine Kollimationsoptik (3) und für einen Lichtwellenleiter (2), wobei die Kollimationsoptik (3) vor einer Lichtaustrittsöffnung des Lichtwellenleiters (2) so positionierbar ist, dass sie aus dem Lichtwellenleiter (2) divergent austretendes Licht zu einem Lichtbündel kollimiert, wobei die Halterungsmittel so ausgebildet sind, dass das kollimierte Lichtbündel die optische Achse des Mikroskopobjektivs (5) unter einem Winkel kreuzt, der größer oder gleich einem Totalreflexionswinkel ist.
13. Mikroskopobjektiv (5) nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Halterungsmittel durch eine Ausnehmung (8) zur Aufnahme einer modularen TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 11 in einer Fassung (6) des Mikroskopobjektivs (5) und/oder in einer Frontlinse (7) des Mikroskopobjektivs (5) gebildet sind.
14. Mikroskopobjektiv (5) nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Kollimationsoptik (3) und ein Koppelport für den Lichtwellenleiter (2) durch die Halterungsmittel fixiert sind, wobei der Lichtwellenleiter (2) lösbar mit dem Koppelport verbindbar ist.
15. Mikroskopobjektiv (5) nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Halterung so einstellbar ist, dass zwischen Lichtbündel und optischer Achse des Mikroskopobjektivs (5) unterschiedliche Winkel, die jeweils größer oder gleich einem Totalreflexionswinkel sind, einstellbar sind.
16. Mikroskop (M) mit einem Mikroskopobjektiv (5) nach einem der Ansprüche 12 bis 15.
17. Mikroskop (M), insbesondere nach Anspruch 16, mit einer modularen TIRF- Beleuchtungsvorrichtung (1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
18. Verwendung einer modularen TIRF-Beleuchtungsvorrichtung (1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 11 neben einem Mikroskopobjektiv (5), insbesondere nach einem der Ansprüche 12 bis 15, zur Erzeugung einer evaneszenten Beleuchtung in einer Probe (14) während einer Totalreflexions-Fluoreszenz-Messung an einem Mikroskop (M).
19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei eine photoaktivierte Lokalisation erfolgt.
20. Verfahren zur TIRF-Anregung in einer Probe (14), wobei ein kollimierter Lichtstrahl als TIRF-Beleuchtung außerhalb eines Detektionsstrahlengangs an eine Probe herangeführt wird.
21. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der kollimierte Lichtstrahl (T) auf derselben Probenseite wie der Detektionsstrahlengang an die Probe (14) herangeführt wird.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Verfahrensansprüche, wobei der kollimierte Lichtstrahl (T) durch ein Mikroskopobjektiv (5), insbesondere durch dessen Fassung (6) und/oder Frontlinse (7), herangeführt wird.
PCT/EP2009/004267 2008-06-16 2009-06-12 Beleuchtungsanordnung für die tirf-mikroskopie WO2010003506A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/968,788 US20110122491A1 (en) 2008-06-16 2010-12-15 Illumination arrangement for tirf microscopy

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102008028490A DE102008028490A1 (de) 2008-06-16 2008-06-16 Beleuchtungsanordnung für die TIRF-Mikroskopie
DE102008028490.4 2008-06-16

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/968,788 Continuation US20110122491A1 (en) 2008-06-16 2010-12-15 Illumination arrangement for tirf microscopy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010003506A1 true WO2010003506A1 (de) 2010-01-14

Family

ID=40996653

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2009/004267 WO2010003506A1 (de) 2008-06-16 2009-06-12 Beleuchtungsanordnung für die tirf-mikroskopie

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20110122491A1 (de)
DE (1) DE102008028490A1 (de)
WO (1) WO2010003506A1 (de)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102009031231A1 (de) * 2009-06-26 2010-12-30 Carl Zeiss Microlmaging Gmbh Verfahren und Anordnungen für die Fluoreszenzmikroskopie
DE102009037366A1 (de) * 2009-08-13 2011-02-17 Carl Zeiss Microlmaging Gmbh Mikroskop, insbesondere zur Messung von Totalreflexions-Fluoreszenz, und Betriebsverfahren für ein solches
DE102010041426A1 (de) * 2010-09-27 2012-05-03 Siemens Aktiengesellschaft Messeinheit und Verfahren zur optischen Untersuchung einer Flüssigkeit zur Bestimmung einer Analyt-Konzentration
CN108368994B (zh) * 2015-08-05 2021-02-26 普莱哈德有限公司 用于星状分束器的***和方法
DE102019108696B3 (de) * 2019-04-03 2020-08-27 Abberior Instruments Gmbh Verfahren zum Erfassen von Verlagerungen einer Probe gegenüber einem Objektiv
DE102022129094B4 (de) * 2022-11-03 2024-06-27 push4impact GmbH Mikroskopobjektiv sowie Objektivrevolver und Mikroskop umfassend ein solches Mikroskopobjektiv

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5629213A (en) * 1995-03-03 1997-05-13 Kornguth; Steven E. Analytical biosensor
US6051437A (en) * 1998-05-04 2000-04-18 American Research Corporation Of Virginia Optical chemical sensor based on multilayer self-assembled thin film sensors for aquaculture process control
WO2003032039A1 (en) * 2001-10-09 2003-04-17 Crystal Fibre A/S Hermetically sealed optical fibre with voids or holes, method of its production, and its use
US20030091280A1 (en) * 2001-11-09 2003-05-15 Yao-Hao Chang Optical collimator and method for making same
US20030095748A1 (en) * 2001-11-21 2003-05-22 Ger-Sheng Lee Optical collimator and method for making same

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3417075A1 (de) * 1984-05-09 1985-11-14 Peter 3300 Braunschweig Stuht Mikroskop mit beleuchtungseinrichtung fuer auflichtuntersuchungen
DE29621092U1 (de) * 1996-12-05 1997-01-23 Carl Zeiss Jena Gmbh, 07745 Jena Anordnung zur Auflicht-Objektbeleuchtung
FR2808888B1 (fr) * 2000-05-15 2003-06-20 Trophos Dispositif d'observation sequentielle d'echantillons et procedes l'utilisant
DE10229935B4 (de) * 2002-07-04 2018-02-08 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mikroskopschieber zur Einkopplung von Licht in ein Mikroskop
DE10362401B3 (de) * 2002-08-28 2022-03-10 Carl Zeiss Meditec Ag Mikroskopiesystem und Mikroskopieverfahren
US7808699B2 (en) * 2003-09-25 2010-10-05 Leica Microsystems Cms Gmbh Microscope lens for total internal reflection microscopy and microscope
DE10355529A1 (de) * 2003-11-21 2005-07-07 Carl Zeiss Jena Gmbh Stereomikroskop
US7564623B2 (en) * 2004-04-16 2009-07-21 Auburn University Microscope illumination device and adapter therefor
EP1793256A4 (de) * 2004-06-14 2010-05-26 Olympus Corp Optisches rastermikroskop-beobachtungsgerät
EP3203235A1 (de) 2005-05-23 2017-08-09 Harald F. Hess Optische mikroskopie mit lichtumwandelbaren optischen etiketten

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5629213A (en) * 1995-03-03 1997-05-13 Kornguth; Steven E. Analytical biosensor
US6051437A (en) * 1998-05-04 2000-04-18 American Research Corporation Of Virginia Optical chemical sensor based on multilayer self-assembled thin film sensors for aquaculture process control
WO2003032039A1 (en) * 2001-10-09 2003-04-17 Crystal Fibre A/S Hermetically sealed optical fibre with voids or holes, method of its production, and its use
US20030091280A1 (en) * 2001-11-09 2003-05-15 Yao-Hao Chang Optical collimator and method for making same
US20030095748A1 (en) * 2001-11-21 2003-05-22 Ger-Sheng Lee Optical collimator and method for making same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H. SCHNECKENBURGER ET AL.: "Axially resolved Cell Imaging by Intensity Modulated Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (IM-TIRFM)", PROC. OF SPIE, vol. 6441, 2007, pages 64411E-1 - 64411E-6, XP002543845 *
K. STOCK ET AL.: "Variable angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device", JOUNAL OF MICROSCOPY, vol. 211, 1 July 2003 (2003-07-01), pages 19 - 29, XP002543846 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE102008028490A1 (de) 2009-12-17
US20110122491A1 (en) 2011-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1184701B1 (de) Beleuchtungseinrichtung
DE19758744C2 (de) Laser-Scanning-Mikroskop
EP1164406B1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts
EP1714187B1 (de) Mikroskop mit einer lichtquelle mit mehreren mikrostrukturierten optischen elementen
EP2045643B1 (de) Scanmikroskop zum Untersuchen mikroskopischer Präparate und Beleuchtungseinrichtung für ein Scanmikroskop
EP1423746A2 (de) Mikroskop
DE10243449A1 (de) Cars-Mikroskop und Verfahren zur Cars-Mikroskopie
EP1719998B1 (de) Laser-Mikrodissektionsgerät
WO2008125204A1 (de) Verfahren und anordnung zum positionieren eines lichtblattes in der fokusebene einer detektionsoptik
WO2010003506A1 (de) Beleuchtungsanordnung für die tirf-mikroskopie
WO2008141903A1 (de) Durchstimmbares akusto-optisches filterelement
WO2009021659A1 (de) Mikroskop mit innenfokussierung
EP1164400B1 (de) Anordnung zum Untersuchen mikroskopischer Präparate mit einem Scanmikroskop und Beleuchtungseinrichtung für ein Scanmikroskop
EP2225549B1 (de) Vorrichtung und verfahren zum evaneszenten beleuchten einer probe
DE102015001032A1 (de) Raman-Spektroskopie-Beleuchtungs- und Auslesesystem
WO2016012606A1 (de) Mikroskop und verfahren zum optischen untersuchen und/oder manipulieren einer mikroskopischen probe
WO2011018181A1 (de) Mikroskop zur messung von totalreflexions-fluoreszenz
DE10120424A1 (de) Scanmikroskop und Auskoppelelement
DE10031458B4 (de) Scan-Mikroskop mit einem Zirkulator
DE10336962B4 (de) Vorrichtung zur konfokalen Abbildung eines Objektes in einer Bildebene
DE20122785U1 (de) Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts
DE10044647A1 (de) Optische Anordnung zur Beleuchtung von Objekten

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09776722

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09776722

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1