WO2009107262A1 - 3”メチル化エピガロカテキンガレート含有抗癌剤組成物 - Google Patents
3”メチル化エピガロカテキンガレート含有抗癌剤組成物 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a novel anticancer agent composition.
- the water extract of green tea contains a plurality of polyphenols, which are known as catechins.
- catechins are known to have an anticancer effect
- EGCG epigallocatechin gallate
- Cell cycle arrest and anticancer effects by EGCG have been reported in cell lines or animal models derived from breast cancer, bladder cancer, colon cancer and prostate cancer (Non-patent Documents 2-6).
- EGCG epigallocatechin gallate
- EGCG is known to have an antioxidant effect
- other foods having an antioxidant effect are also known to have an anti-cancer effect
- This antioxidant action of EGCG is considered to be one of several mechanisms of the anticancer action of EGCG.
- Non-patent Documents 10 and 11 Oxidative stress activates phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) -Akt signaling, and this PI3K-Akt signaling system regulates cell growth (Non-patent Documents 10 and 11). It is known that PI3K-Akt is constantly activated in various tumor cells (Non-patent Documents 12 and 13). It has been reported that LY294002, an inhibitor of PI3K-Akt, suppresses cell proliferation (Non-patent Document 14). In addition, it has been reported that downregulation by EGCG of the PI3K-Akt signaling system induces cell cycle arrest (Non-patent Documents 4 and 15).
- Non-patent Document 16 The main methylation sites in the in vivo metabolism of EGCG are the 4 ′ and 4 ′′ positions (Non-patent Document 16), but 4 ′, 4 ”O-methylated EGCG loses the antioxidant activity known for EGCG. (Non-patent Document 17).
- 3 "O-methylepigallocatechin gallate (hereinafter” 3 "methylated EGCG”) which is O-methylated at the 3 "position of epigallocatechin gallate, is generally found in teas of cultivars generally cultivated in Japan. It is not included, and is contained only in tea leaves of certain varieties of assam hybrids from China and Taiwan, such as “Benifuuki”. Recently, it has been found that 3 "methylated EGCG has an antiallergic effect (Patent Document 1), but the action of 3" methylated EGCG on tumor cells is not known at all.
- a component of green tea (-)-epigallocatechin-3-gallate, promotes apoptosis in T24 human bladder cancer cells via modulation of the PI3K / Akt pathway and Bs-2 Biochem Biophys Res Commun 2007; 354: 852-7.
- Chen C Shen G, Hebbar V, Hu R, Owuor E, Kong A. Epigallocatechin-3-gallate-induced stress signals in HT-29 human colon adenocarcinoma cells. Carcinogenesis 2003; 24: 1369-78.
- Adhami V, Ahmad N, Mukhtar H Molecular targets for green tea in prostate cancer prevention. J Nutr 2003; 133: 2417S-24S.
- An object of the present invention is to provide a novel anticancer agent composition. Another object of the present invention is to provide a novel method for treating and / or preventing cancer.
- the present invention provides the following formula (I):
- the anticancer agent composition containing 3 "O-methyl epigallocatechin gallate (3" methylated EGCG) shown by these is provided.
- composition of the present invention is suitably used for the treatment and prevention of cancer and the prevention of recurrence after cancer treatment.
- the composition of the present invention may be provided as a pharmaceutical or a health food including a beverage.
- the present invention also provides a method for treating and / or preventing cancer comprising administering a compound represented by formula (I) to a subject in need thereof.
- treatment and / or prevention of cancer includes all management of cancer such as prevention, treatment, symptom reduction, symptom reduction, progression stop, metastasis suppression, recurrence prevention, etc. .
- 3 "methylated EGCG represented by the formula (I) suppresses tumor cell growth at a very low concentration. This tumor cell growth suppression is not due to induction of apoptosis. It is speculated that this is achieved by stopping the cell cycle.
- the present inventors further found that 3 "methylated EGCG suppresses phosphorylation of Akt (position 473). Phosphorylation of Akt is an indicator of the activity of the PI3K-Akt signaling system that is greatly involved in the cell cycle. Meaning that 3 ′′ methylated EGCG suppresses the activity of the PI3K-Akt signaling system.
- the present inventors have also found that 3 "methylated EGCG suppresses the expression of cyclin E involved in the transition from G1 to S in the cell cycle.
- 3 "methylated EGCG has an antioxidant effect. It is considered that the activation of the PI3K-Akt signal system by oxidative stress is involved in the growth of tumor cells. It is thought that 3 "methylated EGCG inactivates the PI3K-Akt signaling system by its antioxidant action and suppresses cell proliferation by stopping the cell cycle.
- the inventors further confirmed that 3 "methylated EGCG inhibits tumor cell growth in vivo and completed the present invention.
- composition of the present invention is suitable for cancer control such as cancer treatment, prevention and recurrence prevention, particularly for liver cancer control. Used.
- Figure 6 shows the effect of EGCG and 3 "methylated EGCG on cell proliferation of human liver tumor line Huh7.
- Figure 6 shows the effect of EGCG and 3 "methylated EGCG on cell proliferation of human liver tumor line HepG2.
- the cell cycle distribution of Huh7 cells treated with 0, 0.5 and 5 ⁇ M 3 ′′ methylated EGCG and EGCG for 48 hours is shown.
- the cell cycle distribution of Huh7 cells treated with 0, 0.5 and 5 ⁇ M 3 ′′ methylated EGCG and EGCG for 48 hours is shown.
- the percentage of S phase cells in Huh7 cells cultured for 48 hours in the presence of 0, 0.5 and 5 ⁇ M 3 ′′ methylated EGCG is shown.
- the results of examining the protein expression levels of phosphorylated Akt (P-Akt) and Akt after culturing Huh7 cells for 12 hours in the presence of each concentration of 3 "methylated EGCG are shown by Western blotting.
- the results of examining the protein expression levels of phosphorylated Akt (P-Akt) and Akt in Huh7 cells cultured in the presence of 5 ⁇ M and 10 ⁇ M EGCG and 3 ′′ methylated EGCG by Western blotting are shown.
- the relative ratio of the expression level of phosphorylated Akt and Akt of Huh7 cells cultured in the presence of 5 ⁇ M EGCG and 3 ′′ methylated EGCG is shown.
- FIG. 5 shows the antioxidant effect of 5 ⁇ M EGCG and 3 ′′ methylated EGCG against oxidative stress on Huh7 cells by H 2 O 2 .
- FIG. 5 shows the effect of 5 ⁇ M EGCG and 3 ′′ methylated EGCG on Akt phosphorylation induced by oxidative stress by H 2 O 2 .
- the change in tumor volume is shown when physiological saline, 1 mg / kg 3 "methylated EGCG is administered to nude mice transplanted with tumor in the dorsal skin.
- the state of the tumor of the 3rd week of the group which intraperitoneally administered physiological saline for 3 weeks to the nude mouse which transplanted the tumor in the back skin is shown.
- the state of the tumor in the 3rd week of the group in which 1 mg of 3 "methylated EGCG was intraperitoneally administered to nude mice transplanted with tumor in the dorsal skin for 3 weeks is shown.
- the 3 ′′ methylated EGCG used in the present invention may be prepared by chemical synthesis or extracted from natural products.
- Natural products containing 3 ′′ methylated EGCG include darjeelin hybrids such as Nibori, Beni-Fuji, Yaeho, Shigarase, Yutaka Midori, Kanaya Midori, Okumusashi, Blue Heart Large Bread, Blue Heart Oolong, Big Leaf Oolong, Safflower, Benihikari, Yamakai, Yamamidori, Kara Variety of tea leaves such as bonito, sofu, sofu and okumidori are known.
- it may be extracted with water or hot water, or any other known method.
- 3" methylated EGCG is contained, The purity may be low, or the tea leaf itself or a dried and crushed tea leaf may be used.
- the 3 ′′ methylated EGCG used in the present invention may be prepared using any known method such as the method described in JP-A-2007-306806.
- the anticancer agent composition of the present invention can be suitably used for cancer control such as cancer treatment and prevention, and recurrence prevention after cancer treatment.
- the anticancer agent composition of the present invention containing 3 ′′ methylated EGCG represented by the formula I as an active ingredient may be provided as a pharmaceutical composition or a health food for the purpose of maintaining and promoting health.
- the dosage form of the composition of the present application includes tablets, powders, granules, capsules, injections according to the administration route and purpose of oral administration or parenteral administration (intravenous, intradermal, intraperitoneal administration, etc.). Appropriate dosage forms such as ointments and suppositories may be used.
- composition of the present invention may contain an appropriate additive.
- Additives are not particularly limited, excipients, diluents, extenders, solvents, lubricants, adjuvants, binders, disintegrants, coating agents, encapsulating agents, emulsifiers, dispersing agents, suspending agents, thickening agents. Agents, tonicity agents, buffering agents, soothing agents, preservatives, antioxidants, flavoring agents, fragrances, coloring agents, etc. That's fine.
- composition of the present invention may contain other active ingredients as long as the object of the present invention is not violated.
- composition of the present invention may also be provided as a health food, or may be provided as a preparation such as powder, lump or liquid for blending with food or drink.
- examples of the food and drink include beverages containing the compound of formula I, such as tea beverages.
- the dosage of the anticancer agent composition of the present invention may be appropriately determined according to the age, sex, weight, symptom, route of administration, etc. of the subject and is not particularly limited.
- 3 "methylated EGCG may be administered 50 to 5000 mg per day, preferably 100 to 3000 mg, for example 500 mg once per day, 3 times per day.
- the 3 "methylated EGCG used in the present invention has no apparent toxicity, and it is considered that no health problems will occur even if a large amount is consumed.
- Naturally derived 3 "O-methylepigallocatechin gallate (3" methylated EGCG) was obtained from Nagara Science Co., Ltd. (Gifu City, Japan) (purity 98%).
- EGCG and 3 ′′ methylated EGCG were dissolved in PBS to prepare a 50 mM concentration stock solution and stored at 4 ° C. The stock solution was used within 48 hours of preparation.
- Effect on Cell Proliferation The effect of 3 "methylated EGCG and EGCG on cell proliferation of human hepatoma derived cell lines Huh7 and HepG2 was examined. Each cell line was seeded in a 96-well plate at 1250 cells / well.
- Western blot analysis Western blot analysis was performed as follows: Whole cell lysate was added to 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, protein inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich Japan), lysis buffer (0.1% Nodidet p-40, 50 mM HEPES; pH 7.5; 10 mM NaF and 1 mM Na3VO4), pH 7.5 , 250 mM NaCl; 20 mM EDTA). Cell lysates were incubated for 15 minutes at 4 ° C. and clarified by centrifugation (14000 ⁇ g) for 15 minutes at 4 ° C.
- the protein in the supernatant was measured using a DC protein assay kit (Bio-RAD Laboratories, Hercules, CA) according to the method indicated in the kit.
- the entire cell lysate was added to 2 ⁇ sample loading buffer containing equal volumes of 2% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 5% 2-mercaptoethanol and boiled for 5 minutes.
- Akt phosphorylation positive and negative proteins from cell total protein (50 ⁇ g) and Phosph-Akt detection kit (Cell Signaling Technologh, Inc., Bvely, MA, USA) were loaded onto SDS-polyacrylamide gel, respectively, for high sensitivity chemiluminescence (ECL) transferred to nitrocellulose membrane (Paul Life Science, Ann Arbor, MI, USA).
- the membrane was blocked with regular shaking for 1 hour at room temperature with TBS (TBST) containing 0.1% Twin 20 and 5% (w / v) non-fat dry milk for 1 hour. After washing with the same buffer at least 3 times, the membrane was incubated overnight at 4 ° C. with the following primary antibody appropriately diluted with regular shaking: Antibodies: Akt, phosphorylated Akt (Ser473) (Cell Signaling Technology, Inc.), cyclin A (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), cyclin E (Santa Cruz Biotechnology, Inc), cyclin D1 (Oncogene Research Producta, Cambridge, MA), p21 (BD Bioscience, San Jose, CA), actin antibody (Sigma-Aldrich).
- the membrane was washed with TBST buffer at least three times and incubated with a horseradish peroxidase (HRP) -conjugated second antibody at room temperature for 1 hour.
- HRP horseradish peroxidase
- the protein-antibody complex was detected by the method described in the manual using ECL (Amersham Biosciences Biotech, Buckinghamshire, United Kingdom).
- a positive signal from the target protein was visualized with an image analyzer LAS-1000 plus (Fuji Film, Tokyo, Japan). Each band was scanned and the optical density of the band was analyzed with the NIH Image J software program.
- Huh7 cells were cultured in non-added medium (control), 5 ⁇ M 3 ′′ methylated EGCG or 5 ⁇ MEGCG for 3 hours. Huh7 cells were then cultured in 50 mM 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF).
- DCF 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate
- DCF-DA Sigma-Aldrich
- the cells were treated with 0.1 mM or 1 mM hydrogen peroxide for 30 minutes, then collected by trypsin treatment, and washed twice with cold PBS.
- the change in fluorescence intensity of Huh7 cells was analyzed by flow cytometry using FacsCalibur at an excitation wavelength of 488 nm. Peak fluorescence intensity and cell number were measured.
- FIG. 2A shows the results of flow cytometry analysis
- Figure 2B shows the G1, S and G2 phases of the cell cycle in cells treated with 3 "methylated EGCG or EGCG at various concentrations for 48 hours. It is a graph which shows the ratio of the cell which exists in.
- FIG. 2C shows the fraction of cell fraction in S phase relative to total cells treated with 3 ′′ methylated EGCG at various concentrations for 48 hours. * P ⁇ 0.05 vs. control.
- 3 ”methylated EGCG had a function of arresting the cell cycle of tumor cells in the G1 phase in a concentration-dependent manner, but the cell cycle distribution even when treated with EGCG up to 5 ⁇ M.
- the ratio of S phase of Huh7 cells was untreated, but 43.3% was reduced to 30.5% by 5 ⁇ M 3 "methylated EGCG treatment (FIG. 2C).
- Huh7 cells were cultured for 12 hours in the presence of 3 ′′ methylated EGCG at concentrations of 0, 1, 5, 10, 20 ⁇ M. After 12 hours, activated Akt (phosphorylated Akt (Ser473), p ⁇ ) in each cell. The protein expression levels of Akt) and total Akt (Akt) were examined by Western blotting to obtain the relative ratio, and the results are shown in FIG. After treating Huh7 cells with 5 and 10 ⁇ M EGCG or 3 ′′ methylated EGCG for 12 hours, p-Akt / Akt was measured as described above. The results are shown in FIGS. 4A and 4B.
- FIG. 3 shows the protein expression levels of phosphorylated Akt and total Akt, and the graph shows the relative ratio of phosphorylated Akt to Akt.
- This p-Akt / Akt ratio is an indicator of the activity of the PI3K-Akt signaling system.
- 3 methylated EGCG inhibited Akt phosphorylation at concentrations of 5 ⁇ M or more.
- FIG. 4B after treatment with 5 ⁇ M EGCG and 3” methylated EGCG, The p-Akt / Akt relative ratio was 0.97 and 0.53, respectively.
- Huh7 cells were treated with 5 ⁇ M3" methylated EGCG or 5 ⁇ M EGCG for 3 hours, and then the cells 0.1 mM or 1 mM hydrogen peroxide was allowed to act for 30 minutes.
- the intracellular oxidation level was examined by incorporating it into DCF-DA cells, which serve as an index of oxidation, using flow cytometry. After treatment with 0.1 mM and 1 mM hydrogen peroxide, the oxidation levels of Huh7 cells were 2.3 times and 3.5 times that of the untreated control, respectively.
- Huh7 cells were recovered after treatment for 30 minutes in the presence or absence of 1 mM hydrogen peroxide.
- the Huh7 lysate was subjected to Western blot analysis for pAkt and Akt, and the optical density of the observed band was measured.
- the relative ratio of p-Akt / Akt increased 2.2-fold over the untreated control.
- Huh7 cells were treated with 5 ⁇ M methylated EGEG or 5 ⁇ M EGCG for 3 hours and then treated with 1 mM hydrogen peroxide for 30 minutes and then harvested.
- Western blot analysis was performed for p-Akt and Akt (FIG.
- In vivo anti-tumor activity The in vivo anti-tumor activity of 3 "methylated EGCG was investigated. 5x10 6 Huh7 cell lines were inoculated into the dorsal skin of nude mice. 1 mg / kg of 3 ′′ methylated EGCG or 1 mg / kg of EGCG was administered intraperitoneally once a day for 3 weeks. Tumor volume was measured every week. Physiological saline was similarly administered to the control group. The test was conducted with 7 animals in each group.
- FIG. 9 shows a graph of tumor volume in the 1 mg / kg 3" methylated EGCG-treated and control groups. * P ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 (vs. control)
- FIG. 10A shows a photograph of the third week mouse.
- FIG. 10A shows a control mouse (administered with physiological saline), and
- FIG. 10B shows a mouse administered with 1 mg / kg of methyl EGCG.
- FIG. 10 also shows that administration of 1 mg / kg of 3 ′′ methylated EGCG significantly suppressed tumor growth.
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Abstract
下式(I): で示される3”O-メチルエピガロカテキンガレートを含有する、抗癌剤組成物を提供する。
Description
本発明は、新規な抗癌剤組成物に関する。
緑茶の水抽出物には複数のポリフェノール類が含まれ、これらはカテキン類として知られている。一般にカテキン類には抗癌作用があることが知られており、そのうちエピガロカテキンガレート(以下「EGCG」)についてもっともよく研究されている(非特許文献1)。EGCGによる細胞周期停止並びに抗癌作用が、乳癌、膀胱癌、大腸癌および前立腺癌由来のセルラインあるいは動物モデルにおいて報告されている(非特許文献2-6)。Khanらの総説によれば、EGCGの抗癌作用の作用機序としては、幾つかの機序が考えられており細胞内シグナルの不活性化により誘導される細胞増殖抑制、細胞形質転換、アポトーシス、並びに血管新生、腫瘍浸潤および転移の抑制などが挙げられる(非特許文献7)。
一方、EGCGが抗酸化作用を有することが知られており、また抗酸化作用を有する他の食物が抗癌作用を有することも知られている(非特許文献8、9)。このEGCGの抗酸化作用はEGCGの抗癌作用の幾つかのメカニズムのうちの一つであると考えられている。
酸化ストレスはホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)-Aktシグナル伝達を活性化させ、このPI3K-Aktシグナル伝達系は細胞の増殖を調節している(非特許文献10、11)。種々の腫瘍細胞においてPI3K-Aktが恒常的に活性化していることが知られている(非特許文献12,13)。PI3K―Aktの抑制剤であるLY294002が細胞増殖を抑制すること(非特許文献14)が報告されている。またPI3K-Aktシグナル伝達系のEGCGによるダウンレギュレートが細胞の周期停止を誘導することが報告されている(非特許文献4、15)。
EGCGについての臨床上の報告はまだあまりないが、疫学的および実験室データからは緑茶の飲用により複数の癌を抑制できることが示唆されている(非特許文献2)。
EGCGのインビボ代謝物はO-メチル化物であることが知られている。O-メチル化EGCGを下式に示す:
EGCG:R1=R2=R3=R4=H
4”O-メチルEGCG:R1=R2=R3=H、R4=CH3
3”O-メチルEGCG:R1=R2=H、R3=CH3、R4=H
3’O-メチルEGCG:R1=CH3,R2=R3=R4=H
4’O-メチルEGCG:R1=H、R2=CH3,R3=R4=H
4’,4”ジ-O-メチルEGCG:R1=H、R”=CH3、R3=H、R4=CH3
EGCGのインビボ代謝物はO-メチル化物であることが知られている。O-メチル化EGCGを下式に示す:
4”O-メチルEGCG:R1=R2=R3=H、R4=CH3
3”O-メチルEGCG:R1=R2=H、R3=CH3、R4=H
3’O-メチルEGCG:R1=CH3,R2=R3=R4=H
4’O-メチルEGCG:R1=H、R2=CH3,R3=R4=H
4’,4”ジ-O-メチルEGCG:R1=H、R”=CH3、R3=H、R4=CH3
EGCGの生体内代謝において主なメチル化部位は4'および4"位であるが(非特許文献16)、4',4"O-メチル化EGCGはEGCGについて知られた抗酸化作用が消失することが報告されている(非特許文献17)。
エピガロカテキンガレートの3”位置がO-メチル化された3”O-メチルエピガロカテキンガレート(以下「3”メチル化EGCG」)は一般的に日本で栽培されている品種の茶にはほとんど含まれておらず、「べにふうき」などの中国、台湾系統のアッサム雑種の特定の品種の茶葉にのみ含有されている。最近になって3”メチル化EGCGに抗アレルギー作用があることが見出されたが(特許文献1)、3”メチル化EGCGの腫瘍細胞に対する作用については全く知られていない。
本発明は新規抗癌剤組成物を提供することを目的とする。本発明はまた、新規な癌の治療および/または予防法を提供することを目的とする。
本発明の組成物は癌の治療、予防、並びに癌治療後の再発予防に好適に用いられる。本発明の組成物は、医薬品として提供されてもよいし、または飲料を含む健康食品として提供されてもよい。
本発明はまた、式(I)で示される化合物を必要な対象に投与することを含む、癌の治療および/または予防方法を提供する。本明細書および請求の範囲において、「癌の治療および/または予防」とは、予防、治療、症状の軽減、症状の減退、進行停止、転移抑制、再発防止等、癌のあらゆる管理が含まれる。
本発明者らは、式(I)で示される3”メチル化EGCGが非常に低濃度で腫瘍細胞の増殖を抑制することを見出した。この腫瘍細胞の増殖抑制は、アポトーシスの誘導によるものではなく細胞周期を止めることによって達成されているものと推測される。
本発明者らはさらに、3”メチル化EGCGがAktのリン酸化(473位)を抑制することを見出した。Aktのリン酸化は細胞周期に大きく関与するPI3K-Aktシグナル伝達系の活性の指標であり、3”メチル化EGCGがPI3K-Aktシグナル伝達系の活性を抑制していることを意味する。また、本発明者らは細胞周期のG1からSへの移行に関与するサイクリンEの発現を3”メチル化EGCGが抑制することを見出した。
本発明者らはまた、3”メチル化EGCGが抗酸化作用を有していることを確認した。腫瘍細胞の増殖においては酸化ストレスによるPI3K-Aktシグナル系の活性化が関与しているものと考えられているが、3”メチル化EGCGはその抗酸化作用によりPI3K-Aktシグナル伝達系を不活性化し、細胞周期を止めることによって細胞増殖を抑制すると推察される。
本発明者らはさらに、3”メチル化EGCGがインビボにおいて腫瘍細胞の増殖を抑制することを確認して本願発明を完成した。
本発明の組成物の有効成分である3”メチル化EGCGは、強い腫瘍増殖抑制作用を有している。細胞増殖抑制効果は抗酸化作用による細胞周期の停止による細胞増殖抑制によるものと推察され、アポトーシスによるものでないことより正常細胞への障害が少ない可能性も示唆される。従って本発明の組成物は、癌の治療、予防、再発予防など癌の制御、特に肝臓癌の制御に好適に用いられる。
本発明において用いられる3”メチル化EGCGは、化学合成によって調製しても、天然物から抽出してもよい。3”メチル化EGCGを含有する天然物としては、ダージリン系雑種であるべにふうき、べにほまれ、べにふじ、やえほ、するがわせ、ゆたかみどり、かなやみどり、おくむさし、青心大パン、青心ウーロン、大葉ウーロン、紅花、べにひかり、やまかい、やまみどり、からべに、香駿、そうふう、および、おくみどり、などの品種の茶葉が知られている。茶葉より3”メチル化EGCGを抽出する場合は、水または湯で抽出しても、その他公知のいずれの方法にて抽出してもよい。3“メチル化EGCGが含有されていれば抽出物の純度は低くてもよく、または該茶葉そのもの、もしくは茶葉を乾燥、粉砕したものを用いても良い。その他本発明において用いられる3”メチル化EGCGは特開2007-306806記載の方法等、公知のいずれの方法を用いて調製されたものであってもよい。
本発明の抗癌剤組成物は、癌の治療、予防および癌の治療後の再発予防等、癌の制御に好適に用いることができる。式Iで示される3”メチル化EGCGを有効成分とする本発明の抗癌剤組成物は、医薬組成物として提供されても、健康の維持及び増進を目的とする健康食品として提供されてもよい。
本願の組成物の剤形としては、経口投与あるいは非経口投与(静脈内、皮内、腹腔内投与等)等の投与経路や投与目的に応じて錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤、軟膏、坐剤など適当な剤形とすればよい。
本発明の組成物には適当な添加剤を含有させてもよい。添加剤としては特に限定されず賦形剤、希釈剤、増量剤、溶剤、潤滑剤、補助剤、結合剤、崩壊剤、被覆剤、カプセル化剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、抗酸化剤、矯味剤、芳香剤、着色剤など、製剤学に関する一般書籍に記載されているものから必要に応じて適宜選択すればよい。
本発明の組成物には、本発明の目的に反しない限り他の有効成分を含有させてもよい。
本発明の組成物はまた、健康食品として提供されてもよいし、飲食物に配合するための粉、塊、液状等の製剤として提供されてもよい。飲食物としては、式Iの化合物を含有する飲料、例えば茶飲料が例示される。
本発明の抗癌剤組成物の投与量は対象者の年齢、性別、体重、症状、投与経路等によって適宜決定すればよく、特に限定されない。例えば、成人男性の癌の予防または治療のために経口投与する場合、3”メチル化EGCGを1日50~5000mg、好ましくは100~3000mg、例えば1回500mgを1日3回投与すればよい。本発明に用いられる3”メチル化EGCGには明らかな毒性は認められておらず、多量に摂取しても健康上の問題が生じることはないと考えられる。
以下実施例により本願を更に詳細に説明する。下記実施例は説明のためのものであって、本願を限定するものではない。
材料および方法
細胞および試薬
特に断らない限り、下記実施例において細胞の培養には10%牛胎児血清並びに100U/mlのペニシリンとストレプトマイシンを添加したDMEM培地を用い、37℃、5%CO2インキュベーター内で行った。
ヒト肝細胞由来細胞株Huh7およびHepG2は東北大学附属癌細胞保存施設(日本国仙台市)より入手した。
天然由来の(-)-エピガロカテキンガレート(EGCG)は和光純薬工業株式会社(日本国大阪市)より入手した(純度90%)。
天然由来の3”O-メチルエピガロカテキンガレート(3”メチル化EGCG)は長良サイエンス株式会社(日本国岐阜市)より入手した(純度98%)。
EGCGおよび3”メチル化EGCGはPBSに溶解して50mM濃度の保存溶液を調製し、4℃にて保存した。保存溶液は調製から48時間以内に使用した。
細胞増殖に対する作用
ヒト肝癌由来細胞株Huh7およびHepG2の細胞増殖に対する3”メチル化EGCGおよびEGCGの作用を調べた。各細胞株を、1250個/ウエルとなるよう96穴プレートへ播種した。ここへ各種濃度のEGCGまたは3”メチル化EGCGを添加し、48時間培養した。コントロールとしては何も添加しないで同様に培養した。48時間処理後の各細胞の増殖能を、ブロモデオキシウリジン(BrdU)取り込み(ELISA法)(Roche Applied Science, Penzberg, Germany)にて、キットの手順にしたがって測定した。
材料および方法
細胞および試薬
特に断らない限り、下記実施例において細胞の培養には10%牛胎児血清並びに100U/mlのペニシリンとストレプトマイシンを添加したDMEM培地を用い、37℃、5%CO2インキュベーター内で行った。
ヒト肝細胞由来細胞株Huh7およびHepG2は東北大学附属癌細胞保存施設(日本国仙台市)より入手した。
天然由来の(-)-エピガロカテキンガレート(EGCG)は和光純薬工業株式会社(日本国大阪市)より入手した(純度90%)。
天然由来の3”O-メチルエピガロカテキンガレート(3”メチル化EGCG)は長良サイエンス株式会社(日本国岐阜市)より入手した(純度98%)。
EGCGおよび3”メチル化EGCGはPBSに溶解して50mM濃度の保存溶液を調製し、4℃にて保存した。保存溶液は調製から48時間以内に使用した。
細胞増殖に対する作用
ヒト肝癌由来細胞株Huh7およびHepG2の細胞増殖に対する3”メチル化EGCGおよびEGCGの作用を調べた。各細胞株を、1250個/ウエルとなるよう96穴プレートへ播種した。ここへ各種濃度のEGCGまたは3”メチル化EGCGを添加し、48時間培養した。コントロールとしては何も添加しないで同様に培養した。48時間処理後の各細胞の増殖能を、ブロモデオキシウリジン(BrdU)取り込み(ELISA法)(Roche Applied Science, Penzberg, Germany)にて、キットの手順にしたがって測定した。
細胞周期に対する作用
Huh7細胞を3”メチル化EGCGまたはEGCGの存在下で48時間培養した後の細胞周期をフローサイトメトリーにて観察した。48時間培養後の細胞を2回PBSで洗浄し、0.1%トリトンX-100および50μg/mlのヨウ化プロピジウム(PI)を含有するバッファーに分散させた。フローサイトメトリー分析はFACScalibur(Becton Dickinson Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて行い、結果をQuad Statistics of CellQuest software program (Becton Dickinson)を用いて解析した。試験は3連で行った。
Huh7細胞を3”メチル化EGCGまたはEGCGの存在下で48時間培養した後の細胞周期をフローサイトメトリーにて観察した。48時間培養後の細胞を2回PBSで洗浄し、0.1%トリトンX-100および50μg/mlのヨウ化プロピジウム(PI)を含有するバッファーに分散させた。フローサイトメトリー分析はFACScalibur(Becton Dickinson Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて行い、結果をQuad Statistics of CellQuest software program (Becton Dickinson)を用いて解析した。試験は3連で行った。
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析は下記のごとく実施した:
細胞全体のライセートを1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド、タンパク質インヒビターカクテル(Sigma-Aldrich Japan)、10mMのNaFおよび1mMのNa3VO4を加えたリシスバッファー(0.1% Nodidet p-40, 50 mM HEPES; pH7.5, 250 mM NaCl; 20 mM EDTA)を用いて調製した。細胞ライセートを4℃にて15分間インキュベートし、4℃にて15分間遠心分離(14000×g)により清澄化した。上清中のタンパク質をDCタンパク質アッセイキット (Bio-RAD Laboratories, Hercules, CA)を用いて、キットに指示された方法にて測定した。細胞ライセート全体を等容量の2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および5%2-メルカプトエタノールを含有する2×サンプルローディングバッファーへ加え、5分間煮沸した。細胞全タンパク質(50μg)およびPhosph-Akt検出キット(Cell Signaling Technologh, Inc., Bvely, MA, USA)のAktリン酸化ポジティブ及びネガティブタンパク質を、それぞれSDS-ポリアクリルアミドゲルへロードし、高感度化学発光(ECL)ニトロセルロースメンブレン(Paul Life Science, Ann Arbor, MI, USA)に移した。メンブレンを1時間0.1%のツイン20を含有するTBS(TBST)および5%(w/v)の無脂肪ドライミルクとともに1時間室温で規則的に振とうしながらブロックした。少なくとも3回同じバッファーにて洗浄した後、メンブレンを規則的に振とうしながら適当に希釈した下記一次抗体とともに4℃にて一晩インキュベートした:
抗体: Akt、リン酸化Akt(Ser473)(Cell Signaling Technology, Inc.)、サイクリンA(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), サイクリンE(Santa Cruz Biotechnology, Inc),サイクリンD1 (Oncogene Research Producta, Cambridge, MA), p21 (BD Bioscience, San Jose, CA), アクチン抗体 (Sigma-Aldrich)。
ウエスタンブロット分析は下記のごとく実施した:
細胞全体のライセートを1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド、タンパク質インヒビターカクテル(Sigma-Aldrich Japan)、10mMのNaFおよび1mMのNa3VO4を加えたリシスバッファー(0.1% Nodidet p-40, 50 mM HEPES; pH7.5, 250 mM NaCl; 20 mM EDTA)を用いて調製した。細胞ライセートを4℃にて15分間インキュベートし、4℃にて15分間遠心分離(14000×g)により清澄化した。上清中のタンパク質をDCタンパク質アッセイキット (Bio-RAD Laboratories, Hercules, CA)を用いて、キットに指示された方法にて測定した。細胞ライセート全体を等容量の2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および5%2-メルカプトエタノールを含有する2×サンプルローディングバッファーへ加え、5分間煮沸した。細胞全タンパク質(50μg)およびPhosph-Akt検出キット(Cell Signaling Technologh, Inc., Bvely, MA, USA)のAktリン酸化ポジティブ及びネガティブタンパク質を、それぞれSDS-ポリアクリルアミドゲルへロードし、高感度化学発光(ECL)ニトロセルロースメンブレン(Paul Life Science, Ann Arbor, MI, USA)に移した。メンブレンを1時間0.1%のツイン20を含有するTBS(TBST)および5%(w/v)の無脂肪ドライミルクとともに1時間室温で規則的に振とうしながらブロックした。少なくとも3回同じバッファーにて洗浄した後、メンブレンを規則的に振とうしながら適当に希釈した下記一次抗体とともに4℃にて一晩インキュベートした:
抗体: Akt、リン酸化Akt(Ser473)(Cell Signaling Technology, Inc.)、サイクリンA(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), サイクリンE(Santa Cruz Biotechnology, Inc),サイクリンD1 (Oncogene Research Producta, Cambridge, MA), p21 (BD Bioscience, San Jose, CA), アクチン抗体 (Sigma-Aldrich)。
インキュベーション終了後、メンブレンを少なくとも3回TBSTバッファーにて洗浄し、室温でホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP)複合化第2抗体とともに1時間インキュベートした。タンパク質-抗体複合体はECL (Amersham Biosciences Biotech, Buckinghamshire, United Kingdom) にて説明書に記載の方法にて検出した。標的タンパク質からの陽性シグナルをイメージアナライザーLAS-1000プラス(富士フイルム、日本国東京)にて可視化した。各バンドをスキャンし、バンドの光学密度をNIHイメージJソフトウエアプログラムにて解析した。
細胞内酸化レベルに対する作用
Huh7細胞を無添加培地(コントロール)、5μMの3”メチル化EGCGまたは5μMEGCG添加培地で3時間培養した。Huh7細胞を次いで50mMの2,7-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCF-DA、Sigma-Aldrich)にて15分処理した。DCF-DAはフリーラジカルの生成を検出するために用いられる。この細胞浸透性剤の蛍光強度は酸化により増強される。即ちDCF-DA蛍光強度は細胞内酸化レベルを示す指標である。
Huh7細胞を無添加培地(コントロール)、5μMの3”メチル化EGCGまたは5μMEGCG添加培地で3時間培養した。Huh7細胞を次いで50mMの2,7-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCF-DA、Sigma-Aldrich)にて15分処理した。DCF-DAはフリーラジカルの生成を検出するために用いられる。この細胞浸透性剤の蛍光強度は酸化により増強される。即ちDCF-DA蛍光強度は細胞内酸化レベルを示す指標である。
細胞を0.1mMまたは1mMの過酸化水素にて30分間処理した後トリプシン処理にて回収し、冷PBSで2回洗浄した。Huh7細胞の蛍光強度の変化をFacsCaliburを用い、励起波長488nmとしてフローサイトメトリー分析を行った。ピークの蛍光強度及び細胞数を測定した。
結果
細胞増殖に対する作用
ヒト肝癌由来細胞株Huh7およびHepG2の細胞増殖に対する3”メチル化EGCGおよびEGCGの作用を調べた。
各細胞株を、1250個/ウエルとなるよう96穴プレートへ播種した。ここへ1、5、10、20μMとなるようにEGCGまたは3”メチル化EGCGを添加し、48時間培養した。コントロールとしては何も添加しないで同様に培養した。48時間処理後の各細胞の増殖能を、BrdU取り込み(ELISA法)にて測定した。結果を図1に示す。図1AはHuh7、図1BはHepG2細胞株の結果をそれぞれ示す。*p<0.05(対コントロール)。
細胞増殖に対する作用
ヒト肝癌由来細胞株Huh7およびHepG2の細胞増殖に対する3”メチル化EGCGおよびEGCGの作用を調べた。
各細胞株を、1250個/ウエルとなるよう96穴プレートへ播種した。ここへ1、5、10、20μMとなるようにEGCGまたは3”メチル化EGCGを添加し、48時間培養した。コントロールとしては何も添加しないで同様に培養した。48時間処理後の各細胞の増殖能を、BrdU取り込み(ELISA法)にて測定した。結果を図1に示す。図1AはHuh7、図1BはHepG2細胞株の結果をそれぞれ示す。*p<0.05(対コントロール)。
図1Aから明らかなように、Huh7細胞においてはBrdU取り込みは少なくとも5μMの3”メチル化EGCGにて48時間処理後に減少した。5μMの3”メチル化EGCG処理は、5μMのEGCG処理と比較してHuh7細胞において細胞増殖を48%、HepG2細胞において35%抑制した。
細胞周期に対する作用
Huh7細胞を0、0.5および5μMの3”メチル化EGCGまたはEGCGの存在下で48時間培養した時点における細胞周期をフローサイトメトリーにて観察した。試験は3連で行った。結果を図2A~Cに示す。図2Aはフローサイトメトリー分析結果を、図2Bは各濃度の3”メチル化EGCGまたはEGCGで48時間処理した細胞において、細胞周期のG1,SおよびG2相に有る細胞の割合を示すグラフである。図2Cは各濃度の3”メチル化EGCGにより48時間処理した全細胞に対するS相にある細胞フラクションの割合を示す。*p<0.05、対コントロール
Huh7細胞を0、0.5および5μMの3”メチル化EGCGまたはEGCGの存在下で48時間培養した時点における細胞周期をフローサイトメトリーにて観察した。試験は3連で行った。結果を図2A~Cに示す。図2Aはフローサイトメトリー分析結果を、図2Bは各濃度の3”メチル化EGCGまたはEGCGで48時間処理した細胞において、細胞周期のG1,SおよびG2相に有る細胞の割合を示すグラフである。図2Cは各濃度の3”メチル化EGCGにより48時間処理した全細胞に対するS相にある細胞フラクションの割合を示す。*p<0.05、対コントロール
図2Aから明らかなように、3”メチル化EGCGは濃度依存的に腫瘍細胞の細胞周期をG1相で停止させる作用を有していたが、5μMまでのEGCGで処理しても細胞周期の分布に変化は認められなかった。無処理、5μMのEGCG48時間処理、および5μMの3”メチル化EGCG48時間処理後のG1相の細胞はそれぞれ48%、41%および58%であった(図2B)。Huh7細胞のS相の割合は無処理で43.3%のものが5μMの3”メチル化EGCG処理にて30.5%に下がった(図2C)。これらの結果は3”メチル化EGCGが細胞周期の停止を誘導し、低濃度にて細胞増殖を抑制することを示唆するものである。
PI3K-Aktシグナル系に対する作用
Huh7細胞を0、1、5、10、20μMの濃度の3”メチル化EGCGの存在下で12時間培養した。12時間後の各細胞中の活性化Akt(リン酸化Akt(Ser473)、p-Akt)および全Akt(Akt)のタンパク質発現量をウエスタンブロット法により調べ、その相対比を得た。結果を図3に示す。
Huh7細胞を5および10μMのEGCGまたは3”メチル化EGCGにて12時間処理した後のp-Akt/Aktを上記と同様に測定した。結果を図4Aおよび図4Bに示す。
Huh7細胞を5および10μMのEGCGまたは3”メチル化EGCGにて12時間処理した後のp-Akt/Aktを上記と同様に測定した。結果を図4Aおよび図4Bに示す。
またHuh7細胞を5μMのEGCGまたは3”メチル化EGCGの存在下で0、3、6、12および24時間培養した後のAktおよびp-Aktタンパク質発現量をウエスタンブロット法にて調べた。結果を図5に示す。
図3はリン酸化Aktと全Aktのそれぞれのタンパク質発現量を示し、グラフはリン酸化AktのAktに対する相対比を示す。このp-Akt/Akt比はPI3K-Aktシグナル伝達系の活性の指標である。図3から明らかなように、3”メチル化EGCGは5μM以上の濃度でAktのリン酸化を抑制した。また図4Bより明らかなように5μMのEGCGおよび3”メチル化EGCGにて処理した後のp-Akt/Akt相対比はそれぞれ0.97および0.53であった。5μMの3”メチル化EGCGによる処理は同濃度のEGCGによる処理と比して有意に(p<0.05)p-Akt/Akt相対比を減少させた、即ち、3”メチル化EGCGはAktのリン酸化を抑制した。
また図5から明らかなように、5μMの3”メチル化EGCGにて6時間以上処理した後は、p-Akt/Akt相対比が減少したが、5μMのEGCGによる処理によってはこの比には変化なかった。
これらの結果は、3”メチル化EGCGがPI3K-Aktシグナル伝達経路の活性化を低濃度の処理により抑制することを強く示唆するものである。
これらの結果は、3”メチル化EGCGがPI3K-Aktシグナル伝達経路の活性化を低濃度の処理により抑制することを強く示唆するものである。
PI3K-Aktシグナル伝達系関連因子の発現に対する作用
Huh7細胞株を5μMの3”メチル化EGCGまたはEGCGの存在下で24時間培養した。0、3時間、6時間、12時間および24時間培養後のP-Akt(リン酸化Akt(Ser473))、Akt、サイクリンD1、サイクリンA、サイクリンEおよびアクチンの発現量をウエスタンブロット法により測定した。結果を図6に示す。
Huh7細胞株を5μMの3”メチル化EGCGまたはEGCGの存在下で24時間培養した。0、3時間、6時間、12時間および24時間培養後のP-Akt(リン酸化Akt(Ser473))、Akt、サイクリンD1、サイクリンA、サイクリンEおよびアクチンの発現量をウエスタンブロット法により測定した。結果を図6に示す。
サイクリンEのタンパク質の発現レベルが3”メチル化EGCG処理によって6時間以降下がった。しかしながら、p21は3”メチル化EGCGあるいはEGCG処理によって変化無かった。サイクリンD1は3”メチル化EGCG処理によっても減らなかった。この結果は、3”メチル化EGCG処理後の細胞周期のG1相停止は細胞周期の進行を調節するタンパク質に対する作用に起因することを示唆する。
細胞酸化に関する作用
Huh7細胞の過酸化水素処理後の酸化レベルに対する3”メチル化EGCGおよびEGCGの効果を調べた。Huh7細胞を5μM3”メチル化EGCGまたは5μMのEGCGで3時間処理し、次いでこの細胞へ0.1mMまたは1mMの過酸化水素を30分作用させた。細胞内酸化レベルをフローサイトメトリーを用い、酸化の指標となるDCF-DA細胞に取り込ませて調べた。0.1mMと1mMの過酸化水素処理の後、Huh7細胞の酸化レベルはそれぞれ無処理コントロールの2.3倍、3.5倍となった。0.1mMの過酸化水素処理による酸化レベルを3”メチル化EGCGとEGCGはそれぞれ1.5倍、0.8倍と顕著に抑制した。1mMの過酸化水素による細胞内酸化は、3”メチルEGCGでは抑制したが、EGCGは係る抑制作用を示さなかった(図7)。これらの結果は3”メチル化EGCGが低用量で酸化を抑制することができることを示す。
Huh7細胞の過酸化水素処理後の酸化レベルに対する3”メチル化EGCGおよびEGCGの効果を調べた。Huh7細胞を5μM3”メチル化EGCGまたは5μMのEGCGで3時間処理し、次いでこの細胞へ0.1mMまたは1mMの過酸化水素を30分作用させた。細胞内酸化レベルをフローサイトメトリーを用い、酸化の指標となるDCF-DA細胞に取り込ませて調べた。0.1mMと1mMの過酸化水素処理の後、Huh7細胞の酸化レベルはそれぞれ無処理コントロールの2.3倍、3.5倍となった。0.1mMの過酸化水素処理による酸化レベルを3”メチル化EGCGとEGCGはそれぞれ1.5倍、0.8倍と顕著に抑制した。1mMの過酸化水素による細胞内酸化は、3”メチルEGCGでは抑制したが、EGCGは係る抑制作用を示さなかった(図7)。これらの結果は3”メチル化EGCGが低用量で酸化を抑制することができることを示す。
次いで1mMの過酸化水素処理により誘導されるAktのリン酸化を観察した。1mM過酸化水素の存在、非存在下で30分間処理した後のHuh7細胞を回収した。Huh7のライセートにつき、pAktおよびAktについてのウエスタンブロット解析を行い、観察されたバンドの光学濃度を測定した。1mMの過酸化水素処理群では、p-Akt/Aktの相対比は無処理コントロールに対して2.2倍に増えた。Huh7細胞を5μMのメチル化EGEGまたは5μMのEGCGにて3時間処理し、次いで1mMの過酸化水素にて30分処理した後に回収した。p-AktとAktについてウエスタンブロット分析を行った(図8A)。p-Akt/Akt強度の相対比は5μMの3”メチル化EGCGと5μMのEGCGでそれぞれ0.9倍、1.6倍となった(図8B)。本データは5μMの3”メチル化EGCGによる前処理により酸化レベルを抑え、1mMの過酸化水素により誘導されるAktのリン酸化が抑制されることを示す。
インビボ抗腫瘍作用
3”メチル化EGCGのインビボでの抗腫瘍作用を検討した。ヌードマウスの背部皮内へHuh7細胞株を一匹当たり5×106個接種した。このマウスへ0.1mg/kg、1mg/kgの3”メチル化EGCG、または1mg/kgのEGCGを腹腔内へ1日1回、3週間投与した。1週間毎に腫瘍の体積を計測した。コントロール群には生理的食塩水を同様に投与した。試験は各群7匹で行った。
3”メチル化EGCGのインビボでの抗腫瘍作用を検討した。ヌードマウスの背部皮内へHuh7細胞株を一匹当たり5×106個接種した。このマウスへ0.1mg/kg、1mg/kgの3”メチル化EGCG、または1mg/kgのEGCGを腹腔内へ1日1回、3週間投与した。1週間毎に腫瘍の体積を計測した。コントロール群には生理的食塩水を同様に投与した。試験は各群7匹で行った。
0.1mg/kgの3”メチル化EGCG(n=7)、1mg/kgの3”メチル化EGCG(n=12)、1mg/kgのEGCG(n=7)および生理的食塩水コントロール(n=12)を投与した各群の腫瘍体積はそれぞれ1週間後は353±184mm3、149±33mm3、256±123mm3、および202±92mm3、2週間後はそれぞれ910±343mm3、418±218mm3、831±387mm3および834±365mm3、および3週間後はそれぞれ1634±551mm3、831±245mm3、1631±759mm3,および1601±587mm3であった。
1mg/kgの3”メチル化EGCGによる処理は腫瘍の増殖をコントロールの50%迄(2週間、p<0.05,3週間、p<0.01)抑制したが、同濃度のEGCG処理(ip投与、1mg/kg/日)はコントール群と相違がなかった。0.1mgの3”メチル化EGCGもまた、コントロール群と相違がなかった。処置期間中コントロール、EGCG処理または3”メチル化EGCG処理群間で体重には相違なかった。図9に、1mg/kgの3”メチル化EGCG処理群とコントロール群の腫瘍体積のグラフを示す。*p<0.05、**p<0.01(対コントロール)
また、図10Aに3週間目のマウスの写真を示す。図10Aがコントロールマウス(生理的食塩水投与)、図10BがメチルEGCG1mg/kgを投与したマウスである。図10からも、1mg/kgの3”メチル化EGCGの投与により有意に腫瘍の増殖が抑制されたことがわかる。
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WO (1) | WO2009107262A1 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011162320A1 (ja) | 2010-06-23 | 2011-12-29 | 国立大学法人九州大学 | Egcgまたはメチル化egcgとpde阻害剤との組み合わせ |
JP2012031101A (ja) * | 2010-07-30 | 2012-02-16 | Kurume Univ | 非アルコール性脂肪性肝炎の改善用組成物 |
CN107438423A (zh) * | 2014-12-09 | 2017-12-05 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 激活长寿基因的组合物 |
JP2019506147A (ja) * | 2016-01-26 | 2019-03-07 | ネステク ソシエテ アノニム | 3’−o−メチル−5−o−サルフェートエピカテキンを含む組成物及びかかる組成物の治療的使用 |
JP2022092966A (ja) * | 2020-12-11 | 2022-06-23 | トヨタ自動車株式会社 | ジペプチジルペプチダーゼiv阻害剤、機能性表示食品 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000159670A (ja) * | 1998-11-20 | 2000-06-13 | Natl Res Inst Of Vegetables Ornamental Plants & Tea | 抗アレルギー剤 |
JP2004222683A (ja) * | 2003-01-27 | 2004-08-12 | Bio Oriented Technol Res Advancement Inst | 抗アレルギー効果増強製造法及び本法を用いて製造された機能性飲食品 |
JP2005185292A (ja) * | 2005-03-02 | 2005-07-14 | National Agriculture & Bio-Oriented Research Organization | 機能性食品 |
JP2005312382A (ja) * | 2004-04-30 | 2005-11-10 | Kakegawashi Nogyo Kyodo Kumiai | 天然茶葉由来のカテキン類を含有する粉末茶 |
JP2006510658A (ja) * | 2002-12-06 | 2006-03-30 | エスアールアイ インターナショナル | 化学療法剤および化学予防剤としての緑茶ポリフェノールのアナログ |
-
2008
- 2008-08-22 WO PCT/JP2008/065006 patent/WO2009107262A1/ja active Application Filing
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000159670A (ja) * | 1998-11-20 | 2000-06-13 | Natl Res Inst Of Vegetables Ornamental Plants & Tea | 抗アレルギー剤 |
JP2006510658A (ja) * | 2002-12-06 | 2006-03-30 | エスアールアイ インターナショナル | 化学療法剤および化学予防剤としての緑茶ポリフェノールのアナログ |
JP2004222683A (ja) * | 2003-01-27 | 2004-08-12 | Bio Oriented Technol Res Advancement Inst | 抗アレルギー効果増強製造法及び本法を用いて製造された機能性飲食品 |
JP2005312382A (ja) * | 2004-04-30 | 2005-11-10 | Kakegawashi Nogyo Kyodo Kumiai | 天然茶葉由来のカテキン類を含有する粉末茶 |
JP2005185292A (ja) * | 2005-03-02 | 2005-07-14 | National Agriculture & Bio-Oriented Research Organization | 機能性食品 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
"66th Annual Meeting of the Japan Cancer Association Yokoshu", 2007, article KISE D. ET AL.: "Alkyl gallates: New candidates for cancer preventing agents", pages: 358 * |
HUANG, H. ET AL.: "Composition, structure, and inhibiting growth rate of lung- cancer cell by tea polyphenol and tea polyphenol-german", JOURNAL OF XIAMEN UNIVERSITY, NATURAL SCIENCE, vol. 46, no. 2, 2007, pages 258 - 261 * |
ISEMURA, M. ET AL.: "Tea catechins and related polyphenols as anti-cancer agents", BIOFACTORS, vol. 13, no. 1-4, 2000, pages 81 - 85 * |
LANDIS-PIWOWAR, K.R. ET AL.: "Methylation supresses the proteasome-inhibitory function of green tes polyphenols", JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY, vol. 213, no. 1, 2007, pages 252 - 260 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011162320A1 (ja) | 2010-06-23 | 2011-12-29 | 国立大学法人九州大学 | Egcgまたはメチル化egcgとpde阻害剤との組み合わせ |
JP2012031101A (ja) * | 2010-07-30 | 2012-02-16 | Kurume Univ | 非アルコール性脂肪性肝炎の改善用組成物 |
CN107438423A (zh) * | 2014-12-09 | 2017-12-05 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 激活长寿基因的组合物 |
JP2019506147A (ja) * | 2016-01-26 | 2019-03-07 | ネステク ソシエテ アノニム | 3’−o−メチル−5−o−サルフェートエピカテキンを含む組成物及びかかる組成物の治療的使用 |
JP2022092966A (ja) * | 2020-12-11 | 2022-06-23 | トヨタ自動車株式会社 | ジペプチジルペプチダーゼiv阻害剤、機能性表示食品 |
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