WO2009101017A1 - Verwendung von hydrophobinen zur verhinderung der eisbildung auf oberflächen - Google Patents

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WO2009101017A1
WO2009101017A1 PCT/EP2009/051292 EP2009051292W WO2009101017A1 WO 2009101017 A1 WO2009101017 A1 WO 2009101017A1 EP 2009051292 W EP2009051292 W EP 2009051292W WO 2009101017 A1 WO2009101017 A1 WO 2009101017A1
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WO
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hydrophobins
hydrophobin
ice
fusion
water
Prior art date
Application number
PCT/EP2009/051292
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ulf Baus
Thorsten Montag
Thomas Subkowski
Claus Bollschweiler
Ingo Grunwald
Klaus Rischka
Original Assignee
Basf Se
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K3/00—Materials not provided for elsewhere
    • C09K3/18—Materials not provided for elsewhere for application to surfaces to minimize adherence of ice, mist or water thereto; Thawing or antifreeze materials for application to surfaces
    • C09K3/185—Thawing materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B64—AIRCRAFT; AVIATION; COSMONAUTICS
    • B64D—EQUIPMENT FOR FITTING IN OR TO AIRCRAFT; FLIGHT SUITS; PARACHUTES; ARRANGEMENT OR MOUNTING OF POWER PLANTS OR PROPULSION TRANSMISSIONS IN AIRCRAFT
    • B64D15/00—De-icing or preventing icing on exterior surfaces of aircraft
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K3/00—Materials not provided for elsewhere
    • C09K3/18—Materials not provided for elsewhere for application to surfaces to minimize adherence of ice, mist or water thereto; Thawing or antifreeze materials for application to surfaces

Definitions

  • the present invention relates to the use of hydrophobins to prevent the formation of ice on surfaces, in particular the prevention of ice formation on hard surfaces.
  • Ice formation on surfaces can lead to significant safety problems, and in extreme cases, an icy plane or motor vehicle can no longer be operated.
  • the formation of ice on surfaces can also lead to undesirable changes in the properties of the corresponding components.
  • the aerodynamic properties of the wind turbine can change as a result of ice formation.
  • Various techniques are known for removing ice layers or preventing ice formation on surfaces.
  • the process is understood to actively free a surface of an existing snow or ice layer.
  • These include techniques such as the simple mechanical scraping of ice from the surface with a suitable tool.
  • boots which are rubber hoses, which are placed at particularly endangered areas of the aircraft, such as the wing leading edges, the wings or the rudder, and Further details of this can be found, for example, in GB 1 166,526 or WO 02/42150
  • ice can be melted with the waste heat redirected by piping systems of the engines, such as US 6,267,328
  • this method is only possible with larger aircraft and is becoming more and more inefficient as the engines of modern aircraft become more energy efficient and produce less waste heat.
  • Typical fizzy liquids usually consist of water and certain proportions of ethylene glycol and / or propylene glycol.
  • Typical fizzy liquids usually consist of water and certain proportions of ethylene glycol and / or propylene glycol.
  • the deicing liquid causes a depression of the freezing point and thus frees the surface from the ice.
  • flight deicing fluid can be injected from holes in the wings.
  • US 6,861,009 discloses deicing compositions containing proteins. In particular, it is proposed the use of proteins, which inevitably occur in agriculture or livestock farming.
  • the surface can be provided with ice-preventing coatings.
  • freezing-point-lowering coatings which consist of thickened mixtures of ethylene glycol and / or propylene glycol with water can be used for this purpose.
  • the adhesive forces of these coatings are so weak that they have drained from the wings of an aircraft within a few minutes to a maximum of a few hours and thus no longer offer any further protection against icing.
  • JP-A 60-208373 discloses a composition for coating comprising methylsiloxane, acryloylglycidyl ether, a silicone-based thickener, an epoxy resin, Teflon powder, and fluorophosphoric acid ester.
  • US Pat. No. 6,702,953 discloses a coating produced in the sol-gel process, which consists of a hydrophobic matrix and a multicomponent freezing point depressant.
  • the freezing point depressant consists of an alkoxide precursor which causes a slow release of a polyol to the surface of the coating.
  • Hydrophobins are small proteins of about 100 to 150 amino acids, which occur in filamentous fungi, for example Schizophyllum commune. They usually have 8 cysteine units. Hydrophobins can be isolated from natural sources, but can also be obtained by genetic engineering, as disclosed, for example, by WO 2006/082251 or WO 2006/131564.
  • WO 96/41882 proposes the use of hydrophobins as emulsifiers, thickeners, surface-active substances, for hydrophilicizing hydrophobic surfaces, for improving the water resistance of hydrophilic substrates, for producing oil-in-water emulsions or for water-in-oil emulsions. Furthermore, pharmaceutical applications such as the production of ointments or creams and cosmetic applications such as skin protection or the production of hair shampoos or hair rinses are proposed.
  • EP 1 252 516 discloses the coating of various substrates with a solution containing hydrophobins at a temperature of 30 to 80 0 C.
  • WO 2006/082253 discloses the coating of surfaces with Fusi- ons hydrophobins at a pH-value>. 4
  • US 2006 0024417 discloses air-filled or foamed foods, such as ice cream or mousse, which contains a hydrophobin.
  • US 2006 0024419 discloses a frozen composition, for example foods containing hydrophobins. It further discloses a method of inhibiting the growth of ice crystals in frozen products by adding a hydrophobin to the frozen product before or during freezing. In both cases, in each case hydrophobins of class II are preferably used. Class II hydrophobins are readily soluble in contrast to Class I hydrophobins.
  • the object of the invention was to provide a simple method for preventing ice formation on surfaces.
  • hydrophobins to inhibit the formation of ice on surfaces has been found by treating the non-ice-coated surface with at least one hydrophobin.
  • hydrophobins are to be understood below to mean polypeptides of the general structural formula (I)
  • X is selected for each of the 20 naturally occurring amino acids (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, Ala, Asp, Glu, GIy) can stand.
  • the radicals X may be the same or different.
  • the indices standing at X each represent the number of amino acids in the respective subsequence X
  • C stands for cysteine, alanine, serine, glycine, methionine or threonine, at least four of the radicals named C being cysteine
  • the indices n and m independently represent natural numbers between 0 and 500, preferably between 15 and 300.
  • the polypetides according to the formula (I) are further characterized by the property that at room temperature after coating a glass surface, they increase the contact angle of a water droplet of at least 20 °, preferably at least 25 ° and particularly preferably 30 °, in each case compared with the contact angle an equally large drop of water with the uncoated glass surface.
  • the amino acids designated C to C 8 are preferably cysteines; but they can also be replaced by other amino acids of similar space filling, preferably by alanine, serine, threonine, methionine or glycine. However, at least four, preferably at least 5, particularly preferably at least 6 and in particular at least 7 of the positions C to C 8 should consist of cysteines. Cysteines can either be reduced in the proteins according to the invention or can form disulfide bridges with one another. Particularly preferred is the intramolecular formation of CC bridges, in particular those with at least one, preferably 2, more preferably 3 and most preferably 4 intramolecular disulfide bridges. In the exchange of cysteines described above by amino acids of similar space filling, it is advantageous to exchange in pairs those C positions which are capable of forming intramolecular disulfide bridges with one another.
  • cysteines, serines, alanines, glycines, methionines or threonines are also used in the positions indicated by X, the numbering of the individual C positions in the general formulas may change accordingly.
  • X, C and the indices standing at X and C have the above meaning
  • the indices n and m are numbers between 0 and 350, preferably 15 to 300
  • the proteins further by the above-mentioned Distinguish contact angle change and it is still at least 6 of the radicals named C is cysteine. Most preferably, all of the C radicals are cysteine.
  • the proteins continue to be distinguished by the abovementioned contact angle change, and at least at least 6 of the residues named C are cysteine. Most preferably, all of the C radicals are cysteine.
  • radicals X n and X m may be peptide sequences, growing naturally linked to a hydrophobin. However, one or both of the residues may be peptide sequences that are not naturally linked to a hydrophobin. Including such radicals X N and / or X m are to be understood, in which a naturally occurring in a hydrophobin peptide sequence is extended by a non-naturally occurring in a hydrophobin peptide sequence.
  • X n and / or X m are naturally non-hydrophobin-linked peptide sequences, such sequences are generally at least 20, preferably at least 35 amino acids long. They may, for example, be sequences from 20 to 500, preferably 30 to 400 and particularly preferably 35 to 100 amino acids.
  • Such a residue, which is not naturally linked to a hydrophobin will also be referred to below as a fusion partner.
  • the proteins may consist of at least one hydrophobin part and one fusion partner part which in nature do not coexist in this form. Fusion-hydrophobins from fusion partner and hydrophobin part have been disclosed for example in WO 2006/082251, WO 2006/082253 and WO 2006/131564.
  • the fusion partner portion can be selected from a variety of proteins. Only a single fusion partner can be linked to the hydrophobin moiety, or several fusion partners can also be linked to a hydrophobin moiety, for example at the amino terminus (X n ) and at the carboxy terminus (X m ) of the hydrophobic moiety. However, it is also possible, for example, to link two fusion partners with a position (X n or X m ) of the protein according to the invention.
  • fusion partners are proteins that occur naturally in microorganisms, in particular in E. coli or Bacillus subtilis.
  • fusion partners are the sequences yaad (SEQ ID NO: 16 in WO 2006/082251), yaae (SEQ ID NO: 18 in WO 2006/082251), ubiquitin and thioredoxin.
  • fragments or derivatives of said sequences which comprise only a part, for example 70 to 99%, preferably 5 to 50%, and particularly preferably 10 to 40% of said sequences, or in which individual amino acids or nucleotides are opposite the said sequence are changed, wherein the percentages in each case refers to the number of amino acids.
  • the fusion hydrophobin has in addition to the fusion partner mentioned as one of the groups X n or X m or as a terminal Part of such a group on a so-called affinity domain (affinity tag / affinity tail) on.
  • affinity domains include (His) k, (Arg) k, (Asp) k, (Phe) k or (Cys) k groups, where k is generally a natural number from 1 to 10. It may preferably be a (His) k group, where k is 4 to 6.
  • the group X n and / or m X may consist exclusively of such an affinity domain or a naturally or non-naturally to a hydrophobin comparable knüpfter radical X n and X m is extended by a terminal affinity domain.
  • hydrophobins used according to the invention may also be modified in their polypeptide sequence, for example by glycosylation, acetylation or else by chemical crosslinking, for example with glutaric dialdehyde.
  • a characteristic of the hydrophobins or their derivatives used according to the invention is the change of surface properties when the surfaces are coated with the proteins.
  • the change in the surface properties can be experimentally determined, for example, by measuring the contact angle of a water drop before and after coating the surface with the protein and determining the difference between the two measurements.
  • contact angle measurements is known in principle to the person skilled in the art.
  • the measurements refer to room temperature and water drops of 5 ⁇ l and the use of glass slides as substrate.
  • the exact experimental conditions for an exemplary method for measuring the contact angle are shown in the experimental part.
  • the fusion proteins used according to the invention have the property of increasing the contact angle by at least 20 °, preferably at least 25 °, particularly preferably at least 30 °, in each case compared with the contact angle of a water droplet of the same size with the uncoated glass surface.
  • Particularly preferred hydrophobins for practicing the present invention are the dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, basf2 hydrophobins.
  • Hydrophobins including their sequences are disclosed, for example, in WO 2006/82251. Unless stated otherwise, the sequences given below refer to sequences disclosed in WO 2006/82251. An overview table with the SEQ-I D numbers can be found in WO 2006/82251 on page 20.
  • Particularly suitable according to the invention are the fusion proteins yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) or yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24) with the polypeptide sequences given in parentheses and the nucleic acid sequences coding therefor, in particular the sequences according to SEQ ID NO: 19, 21, 23.
  • proteins which, starting from the amino acid sequences shown in SEQ ID NO. 20, 22 or 24 shown by exchange, insertion or deletion of at least one, up to 10, preferably 5, more preferably 5% of all amino acids, and which still have at least 50% of the biological property of the starting proteins particularly preferred embodiments.
  • the biological property of the proteins is hereby understood as the change in the contact angle already described by at least 20 °.
  • Particularly suitable derivatives for carrying out the present invention are from yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) or yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) derivatives derived from truncation of the yaad fusion partner.
  • yaad-Xa-dewA-his SEQ ID NO: 20
  • yaad-Xa-rodA-his SEQ ID NO: 22
  • yaad-Xa-basf1-his SEQ ID NO: 24
  • the truncated residue should comprise at least 20, preferably at least 35, amino acids.
  • a truncated radical having 20 to 293, preferably 25 to 250, particularly preferably 35 to 150 and for example 35 to 100 amino acids can be used.
  • An example of such a protein is yaad40-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 26 in WO 2007/014897), which has a reduced to 40 amino acids yaad residue.
  • a cleavage site between the hydrophobin and the fusion partner or the fusion partners can be used to cleave off the fusion partner and release the pure hydrophobin in underivatized form (for example, by BrCN cleavage of methionine, factor Xa, enterokinase, thrombin, TEV cleavage Etc.).
  • hydrophobins used according to the invention for modifying open-cell foams can be prepared chemically by known methods of peptide synthesis, such as, for example, by Merrifield solid-phase synthesis.
  • Naturally occurring hydrophobins can be isolated from natural sources by suitable methods. As an example, let Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) or WO 96/41882.
  • a genetic engineering preparation for hydrophobins without fusion partner from TaIaria thermophilus is described by US 2006/0040349.
  • the production of fusion proteins can preferably be carried out by genetic engineering methods in which a nucleic acid sequence coding for the fusion partner and a hydrophobin part, in particular DNA sequence, are combined in such a way that the desired protein is produced in a host organism by gene expression of the combined nucleic acid sequence , Such a production method, for example, is disclosed by WO 2006/082251 or WO 2006/082253.
  • the fusion partners greatly facilitate the production of hydrophobins. Fusion hydrophobins are produced in genetically engineered processes with significantly better yields than hydrophobins without fusion partners.
  • the fusion hydrophobins produced by the host organisms by the genetic engineering process can be worked up in a manner known in principle and purified by known chromatographic methods.
  • the simplified work-up and purification process disclosed in WO 2006/082253, pages 11/12 can be used.
  • the fermented cells are first separated from the Fermetationsbrühe, digested and the cell debris of the inclusion bodies (inclusion bo) this separated. The latter can be done advantageously by centrifuging.
  • the inclusion bodies for example by acids, bases and / or detergents can be digested in a manner known in principle in order to liberate the fusion hydrophobins.
  • the inclusion bodies with the fusion hydrophobins used according to the invention can generally be completely dissolved within about 1 h already using 0.1 M NaOH.
  • the solutions obtained can -ggf. after adjusting the desired pH without further purification, may be used to practice this invention.
  • the fusion hydrophobins can also be isolated from the solutions as a solid. The isolation can preferably be carried out by means of spray granulation or spray drying, as described in WO 2006/082253, page 12.
  • the products obtained by the simplified work-up and purification process comprise, in addition to residues of cell debris, usually about 80 to 90% by weight of proteins.
  • the amount of fusion hydrophobins is generally from 30 to 80% by weight with respect to the amount of all proteins.
  • the isolated products containing fusion hydrophobins can be stored as solids and dissolved for use in the respective desired media.
  • the fusion hydrophobins can be used as "pure" hydrophobins for carrying out this invention, and cleavage is advantageously carried out after isolation of the inclusion bodies and their dissolution.
  • the hydrophobins are used to prevent the formation of ice on surfaces.
  • the non-ice-covered surfaces are treated with hydrophobins.
  • ice is to be understood below in the usual way frozen water, which can form on the surface of bodies at sufficiently low temperatures.
  • This can be all kinds of ice, for example, massive ice, snow, frost or Freezing wetness, especially ice, which forms on contact of cold surfaces with air of a certain humidity.
  • the surfaces can be all types of surfaces which are to be protected against ice formation.
  • they may be hard surfaces, such as surfaces of metals such as steel or aluminum, glass, plastics, wood, stone and concrete surfaces.
  • it may be the surface of paint layers, which are located on other materials.
  • Examples include the surfaces of aircraft and spacecraft, automobiles, motorcycle helmets, all types of windows such as window panes, car windows, aircraft windshields, steel structures such as power line masts, power lines such as power lines of overhead power lines, industrial plants or electrical equipment.
  • a preferred embodiment of the invention relates to the surface of aircraft, in particular aircraft, and to the surface of refrigerated articles, such as refrigerators and freezers, and lines of cooled liquids or cooled gases.
  • a formulation which comprises at least water or aqueous solvent mixture and at least one hydrophobin.
  • Suitable aqueous solvent mixtures include water and one or more water-miscible solvents.
  • the selection of such components is limited only insofar as the hydrophobins and the other components in the mixture must be sufficiently soluble.
  • such mixtures comprise at least 50% by weight, preferably at least 65% by weight and more preferably at least 80% by weight, of water.
  • suitable water-miscible solvents include monoalcohols such as methanol, ethanol or propanol, higher alcohols such as Ethylene glycol, propylene glycol or polyether polyols and ether alcohols such as Butylgly- kol or methoxypropanol.
  • water-miscible solvents depending on the desired properties of the formulation. For example, it may be useful for use at low temperatures to use the water ethylene glycol and / or propylene glycol for freezing point depression.
  • the formulation used for the treatment preferably has a pH of> 4, preferably> 6 and particularly preferably> 7.
  • the pH is in the range from 4 to 11, preferably 6 to 10, particularly preferably 7 to 9.5 and very particularly preferably 7.5 to 9.
  • the pH may be 7.5 to 8.5 or 8.5 to 9.
  • the formulation preferably comprises a suitable buffer.
  • a suitable buffer depending on the pH range intended for the coating. Examples include potassium dihydrogen phosphate buffer, tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (Tris buffer), borax buffer, sodium bicarbonate buffer or sodium hydrogen phosphate buffer. Preferred is Tris buffer.
  • the concentration of the buffer in the solution will be determined by the skilled person depending on the desired properties of the formulation. The skilled person will usually pay attention to a sufficient buffer capacity to achieve the most constant coating conditions. A concentration of 0.001 mol / l to 1 mol / l, preferably 0.005 mol / l to 0.1 mol / l and particularly preferably 0.01 mol / l to 0.05 mol / l, has proven useful.
  • the formulation comprises at least one hydrophobin.
  • hydrophobins can be used as hydrophobins.
  • yaad-Xa-dewA-his SEQ ID NO: 20 from WO 2006/082251
  • products with a shortened yaad residue such as, for example, yaad40-Xa-dewA-his.
  • the products produced by the simplified cleaning method described above can be used.
  • the concentration of hydrophobins in the formulation will be selected by the skilled person depending on the desired properties of the coating. With higher concentrations, a faster coating can usually be achieved. As a rule, a concentration of 0.1 ⁇ g / ml to 1000 ⁇ g / ml, preferably 1 ⁇ g / ml to 500 ⁇ g / ml, more preferably 10 ⁇ g / ml to 250 ⁇ g / ml, very particularly preferably 30 ⁇ g / ml, has proven useful to 200 ⁇ g / ml and, for example, 50 to 100 ⁇ g / ml.
  • the formulation used may optionally comprise further components or additives.
  • Suitable surfactants are, for example, nonionic surfactants which comprise polyalkoxy groups, in particular polyethylene oxide groups. Examples include polyoxyethylene stearates, alkoxylated phenols and the like. Further examples of suitable surfactants include polyethyleneglycol (20) sorbitan monolaurate (Tween ® 20), polyethyleneglycol (20) sorbitanmonopal- palmitate (Tween ® 40), polyethyleneglycol (20) sorbitan monostearate (Tween ® 60), polyethyleneglycol (20) sorbitan monooleate ( Tween ® 80), cyclohexyl-methyl-ß-D maltoside, cyclohexyl-ethyl-.beta.-D maltoside, cyclohexyl-n-hexyl-ß-D maltoside, n-undecyl-beta D-maltoside, n-octyl
  • surfactants are disclosed, for example, in WO 2005/68087 page 9, line 10 to page 10, line 2.
  • the concentration of surfactants is generally 0.001% by weight to 0.5% by weight, preferably 0.01% by weight to 0.25% by weight and particularly preferably 0.1% by weight. % to 0.2% by weight, in each case based on the amount of all components of the formulation.
  • metal ions in particular divalent metal ions
  • metal ions can contribute to a more uniform coating.
  • suitable divalent metal ions include, for example, alkaline earth metal ions such as Ca 2+ ions.
  • Such metal ions may preferably be added as formulation-soluble salts, for example in the form of chlorides, nitrates or carbonate, acetate, citrate, gluconate, hydroxide, lactate, sulfate, succinate, tartrate.
  • CaCb or MgCb can be added.
  • the solubility can optionally also be increased by suitable auxiliaries, for example complexing agents.
  • the concentration of such metal ions is generally 0.01 mmol / l to 10 mmol / l, preferably 0.1 mmol / l to 5 mmol / l and particularly preferably 0.5 mmol / l to 2 mmol / l.
  • the formulations can be obtained by mixing the workup solutions described above with the desired additional components and diluting to the desired concentration.
  • the formulations can also be obtained by dissolving isolated solid hydrophobins accordingly.
  • the surfaces to be protected from ice formation are treated with the formulation.
  • the articles to be protected may be immersed in the formulation or sprayed with the formulation.
  • the type of treatment depends on the type of surface to be protected and is chosen by the expert.
  • aircraft for example, the usual facilities available at airports may used for spraying aircraft with de-icing agents.
  • the treatment of automobiles can take place, for example, by means of a suitable spraying device in a car wash, in particular during or after rinsing and before drying.
  • the hydrophobins can also be sprayed onto the car window, for example by means of the windscreen washer system.
  • the hydrophobin solution can also be supplied via a separate tank or container. Even manual spraying of the surface is possible.
  • the hydrophobin can also be applied as a liquid foam to prevent premature flow of the spray solution.
  • the hydrophobin solution is first foamed by mechanical stirring of air or by supplying a suitable gas such as air or nitrogen and then sprayed onto the surface.
  • a certain exposure time is required to deposit the hydrophobins on the surface.
  • the person skilled in the art will choose a suitable exposure time depending on the desired result. Examples of typical exposure times are from 0.1 to 12 h, without the invention being restricted thereto.
  • the reaction time depends on the temperature as well as on the concentration of the hydrophobin in the solution. The higher the temperature and the higher the concentration in the course of the coating process, the shorter the exposure time can be.
  • the temperature in the course of the coating process may be at room temperature or it may be elevated temperatures. For example, it may be temperatures of 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, or
  • 120 0 C act. Preference is given to temperatures of 15 to 120 0 C, more preferably 20 to 100 ° C, and for example 40 to 100 0 C or 70 to 90 ° C.
  • the temperature of a dip bath can be adjusted accordingly, or the solution is heated before spraying.
  • the solvent is removed.
  • the removal of the solvent can be done for example by simple evaporation in air.
  • the removal of the solvent can also be facilitated by raising the temperature and / or with suitable gas streams and / or applying a vacuum.
  • the evaporation can be facilitated by, for example, heated objects in a drying oven or blown with a heated gas stream.
  • the methods can also be combined, for example by drying in a circulating air drying cabinet or a drying tunnel.
  • the coating for removing the solvent can also be heated by means of radiation, in particular IR radiation.
  • IR radiation for this purpose, all types of broadband IR emitters, for example. NIR, MIR or NIR steel can be used. However, it is also possible, for example, to use IR lasers.
  • Such radiation sources are in various radiation geometries commercially available. Whether a temperature application is possible depends naturally on the nature of the objects to be treated. Smaller items can be heat treated relatively easily in a warming cabinet. The surfaces of larger objects can be heated, for example, with heat blowers. For coating cars, for example, the blowers used to dry the cars can be used for temperature treatment.
  • the temperature and the drying time in the course of drying is determined by the person skilled in the art. Has proven to have a drying temperature of 10 to 130 0 C, preferably 20 to 120 0 C, more preferably 70 to 1 10 0 C, most preferably 75 to 105 0 C and, for example, 85 to 100 0 C. What is meant here is the temperature of Coating itself.
  • the temperature in a dryer can of course also be higher. Of course, the drying time is shorter, the higher the drying temperature is.
  • the temperature treatment in the course of coating and drying can advantageously be combined with one another.
  • a surface can first be treated with the formulation at room temperature and then dried and tempered at elevated temperatures.
  • the surfaces treated with the hydrophobins have a much stronger icing resistance than untreated surfaces.
  • the hydrophobin layers adhere very well to the surfaces.
  • a fusion hydrophobin with the complete fusion partner yaad was used (yaad-Xa-dewA-his, hereinafter called hydrophobin A) and a fusion hydrophobin with a reduced to 40 amino acids fusion partner yaad40-Xa-dewA-his (hydrophobin B ).
  • hydrophobin A yaad-Xa-dewA-his
  • hydrophobin B fusion hydrophobin with a reduced to 40 amino acids fusion partner yaad40-Xa-dewA-his
  • Substrate glass (window glass, Süd Weg Glas, Mannheim)
  • the samples are air-dried and the contact angle (in degrees) of a drop of 5 ⁇ l of water at room temperature is determined.
  • the contact angle measurement was performed on a device Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002). The measurement was carried out according to the manufacturer's instructions.
  • Untreated glass gave a contact angle of 15 ° to 30 ° ⁇ 5 °.
  • Coating with the fusion hydrophobin yaad-Xa-dewA-his ⁇ gave a contact angle increase of more than 30 °; a coating with the fusion hydrophobin yaad40-Xa-dewA-his also gave a contact angle increase of more than 30 °.
  • the climate chamber (1) consists of an air conditioner (6) for cooling and targeted humidification of the air (2) and a fan for targeted control of the flow velocity.
  • the sample (3) is mounted on a temperature-controlled sample holder (4). This sample holder is cooled by a cryostat (5). To visualize the ice forming processes is located in the chamber of a camera.
  • Sample is placed on sample holder and blown with cold, moist air (2).
  • the sample holder is undercooled.
  • the moist and cold air flows through the sample.
  • frost builds up.
  • the formation of frost can be documented during the experiment by camera.
  • FIGS 2 to 5 each show the sample holders in front of us after the experiment.
  • hydrophobin A and hydrophobin B significantly affect the formation of crystals compared to the control without the use of hydrophobin. This is evident both in the appearance of the frost layer and in the amount of the frosted surface.

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Abstract

Verwendung von Hydrophobinen zur Verhinderung der Bildung von Eis auf Oberflächen, insbesondere die Verhinderung der Eisbildung auf Flugzeugoberflächen.

Description

Verwendung von Hydrophobinen zur Verhinderung der Eisbildung auf Oberflächen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verwendung von Hydrophobinen zur Verhinderung der Bildung von Eis auf Oberflächen, insbesondere die Verhinderung von Eisbildung auf harten Oberflächen.
Die Eisbildung auf Oberflächen, z.B. den Oberflächen von Flugzeugen oder Kraftfahrzeugen, kann zu erheblichen sicherheitstechnischen Problemen führen, und im Extremfalle kann ein vereistes Flugzeug oder Kraftfahrzeug nicht mehr betrieben werden. Die Eisbildung auf Oberflächen kann auch zu unerwünschten Veränderungen der Eigenschaften der entsprechenden Bauteile führen. So können sich beispielsweise bei einem Windrad die aerodynamischen Eigenschaften des Windrades durch die Eisbildung verändern. Es sind daher verschiedene Techniken zur Beseitigung von Eisschichten oder zur Verhinderung der Eisbildung auf Oberflächen bekannt.
Unter Enteisung (deicing) im eigentlichen Sinne wird der Vorgang verstanden, eine Oberfläche aktiv von einer bereits vorhandenen Schnee- oder Eisschicht zu befreien. Hierzu gehören Techniken, wie das einfache mechanische Abkratzen des Eises von der Oberfläche mit einem geeigneten Werkzeug. Da dieses bei einem Flugzeug während eines Fluges naturgemäß nicht möglich ist, sind viele Flugzeuge mit so genannten „boots" ausgestattet. Diese sind Gummischläuche, die an besonders gefährdeten Stellen des Flugzeugs, wie beispielsweise den Flügelvorderkanten, den Tragflächen oder dem Ruder platziert sind, und die bei Bedarf aufgeblasen werden können, um das Eis weg zu sprengen. Nähere Einzelheiten hierzu sind beispielsweise von GB 1 ,166,526 oder WO 02/42150 offenbart. Außerdem kann Eis mit der durch Rohrsysteme umgeleiteten Abwärme der Triebwerke geschmolzen werden, wie beispielsweise von US 6,267,328 offenbart. Allerdings ist diese Methode nur bei größeren Flugzeugen möglich und wird zudem immer ineffizienter, da die Triebwerke moderner Flugzeuge immer energieeffizienter werden und weniger Abwärme produzieren. Weiterhin können thermoelektrische Heizfolien an besonders gefährdeten Stellen platziert werden (GB 787954).
Es ist auch bekannt, Chemikalien zum Enteisen einzusetzen. Typische Eineisungsflüs- sigkeiten bestehen in der Regel aus Wasser sowie bestimmten Anteilen von Ethylen- glykol und/oder Propylenglykol. Beispielhaft wird auf GB 2,050,398, WO 00/00568 oder WO 07/104996 verwiesen. Die Enteisungsflüssigkeit bewirkt eine Gefrierpunktserniedrigung und befreit die Oberfläche so vom Eis. Im Flug kann Enteisungsflüssigkeit aus Löchern in den Tragflächen gespritzt werden. US 6,861 ,009 offenbart Zusammensetzungen zum Enteisen, welche Proteine enthalten. Vorgeschlagen wird insbesondere die Verwendung von Proteinen, welche im Ackerbau oder der Viehhaltung zwangsläufig anfallen.
Neben dem aktiven Enteisen bereits vereister Oberflächen sind auch Techniken vorge- schlagen worden, mit denen die Eisbildung an einer Oberfläche von Anfang an verhindert werden soll (Anti-icing), so dass kein nachträgliches Enteisen mehr notwendig ist.
Hierzu kann beispielsweise die Oberfläche mit Eis verhindernden Beschichtungen versehen werden. In der Luftfahrt können hierzu beispielsweise gefrierpunktserniedrigen- de Beschichtungen verwendet werden, welche aus verdickten Mischungen von Ethy- len-glykol und/oder Propylenglykol mit Wasser bestehen. Die Adhäsivkräfte dieser Beschichtungen sind jedoch so schwach, dass sie binnen weniger Minuten bis maximal einigen Stunden von den Tragflächen eines Flugzeugs abgeflossen sind und somit keinen weiteren Schutz vor Vereisung mehr bieten.
Weiterhin sind hydrophobe Beschichtungen zur Verhinderung der Eisbildung bekannt. So offenbart beispielsweise JP-A 60-208373 eine Zusammensetzung zur Beschich- tung, welche Methylsiloxan, Acryloylglycidylether, einen Verdicker auf Siliconbasis, ein Epoxyharz, Teflon-Pulver sowie Fluorphosphorsäureester umfasst. US 6,702,953 of- fenbart eine im SoI-GeI Verfahren hergestellte Beschichtung, welche aus einer hydro- phobischen Matrix und einem Multikomponentengefrierpunkterniedriger besteht. Der Gefrierpunkterniedriger besteht aus einem Alkoxidprecursor, welcher ein langsames Austreten eines Polyols an die Oberfläche der Beschichtung bewirkt.
Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 bis 150 Aminosäuren, welche in fila- mentösen Pilzen, beispielsweise Schizophyllum commune, vorkommen. Sie weisen in aller Regel 8 Cystein-Einheiten auf. Hydrophobine können aus natürlichen Quellen isoliert werden, können aber auch mittels gentechnischer Verfahren gewonnen werden, wie beispielsweise von WO 2006/082251 oder WO 2006/131564 offenbart.
Im Stand der Technik ist die Verwendung von Hydrophobinen für verschiedene Anwendungen vorgeschlagen worden.
WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen als Emulgatoren, Verdicker, oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate, zur Herstellung von Öl-inWasser-Emulsionen oder von Wasser-in-ÖI-Emulsionen vor. Weiterhin werden pharmazeutische Anwendungen wie die Herstellung von Salben oder Cremes sowie kosmetische Anwendungen wie Hautschutz oder die Herstellung von Haarshampoos oder Haarspülungen vorgeschlagen. EP 1 252 516 offenbart die Beschichtung verschiedener Substrate mit einer Hydrophobine enthaltenden Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 800C. WO 2006/082253 offenbart die Beschichtung von Oberflächen mit Fusi- ons-Hydrophobinen bei einem pH-Wert > 4.
US 2006 0024417 offenbart luftgefüllte bzw. geschäumte Lebensmittel, wie beispiels- weise Eiskrem oder Mousse, welche ein Hydrophobin enthält. US 2006 0024419 offenbart eine gefrorene Zusammensetzung, beispielsweise Lebensmittel, welche Hydrophobine enthalten. Sie offenbart weiterhin ein Verfahren zum Inhibieren des Wachstums von Eiskristallen in gefrorenen Produkten, bei dem man dem einzufrierenden Produkt vor oder während des Einfrierens ein Hydrophobin zusetzt. In beiden Fällen werden jeweils Hydrophobine der Klasse Il bevorzugt eingesetzt. Hydrophobine der Klasse Il sind im Gegensatz zu Hydrophobinen der Klasse I gut löslich.
Die Verwendung von Hydrophobinen zur Verhinderung der Eisbildung auf Oberflächen ist bislang noch nicht bekannt.
Aufgabe der Erfindung war es, ein einfaches Verfahren zum Verhindern der Eisbildung auf Oberflächen bereitzustellen.
Dementsprechend wurde die Verwendung von Hydrophobinen zur Verhinderung der Bildung von Eis auf Oberflächen gefunden, indem man die nicht mit Eis bedeckte Oberfläche mit mindestens einem Hydrophobin behandelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um die Oberfläche von Flugzeugen.
Zu der Erfindung ist im Einzelnen das Folgende auszuführen:
Unter dem Begriff „Hydrophobine" im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen im Folgenden Polypeptide der allgemeinen Strukturformel (I)
Xn-C1-Xi-5o-C2-Xo-5-C3-Xi-ioo-C4-Xi-ioo-C5-Xi-5o-C6-Xo-5-C7-Xi-5o-C8-Xm (I)
verstanden werden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann. Dabei können die Reste X jeweils gleich oder verschieden sein. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren in der jeweiligen Teilsequenz X dar, C steht für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen zwischen 0 und 500, bevorzugt zwischen 15 und 300. Die Polypetide gemäß der Formel (I) sind weiterhin durch die Eigenschaft charakterisiert, dass sie bei Raumtemperatur nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergrößerung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens von mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25° und besonders bevorzugt 30° bewirken, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.
Die mit C bis C8 benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C bis C8 aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemäßen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Di- sulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.
Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der einzelnen C-Positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.
Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II)
Xn-C1-X3-25-C2-Xθ-2-C3-X5-5O-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-Xθ-2-C7-X3-35-C8-Xm (I I)
zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X, C und die bei X und C stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 350, bevorzugt 15 bis 300 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich weiterhin bei mindestens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein.
Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (III)
Xn-C1-X5-9-C2-C3-Xi1-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm
eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 200 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich bei mindes- tens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein.
Bei den Resten Xn und Xm kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicher- weise auch mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einem oder bei beiden Resten um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Darunter sind auch solche Reste Xn und/oder Xm zu verstehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Pep- tidsequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptidsequenz verlängert ist.
Falls es sich bei Xn und/oder Xm um natürlicherweise nicht mit Hydrophobinen verknüpfte Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren lang. Es kann sich beispielsweise um Se- quenzen aus 20 bis 500, bevorzugt 30 bis 400 und besonders bevorzugt 35 bis 100 Aminosäuren handeln. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden. Damit soll ausgedrückt werden, dass die Proteine aus mindestens einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen können, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen. Fusions-Hydrophobine aus Fusionspartner und Hydrophobinteil sind beispielsweise in WO 2006/082251 , WO 2006/082253 und WO 2006/131564 offenbart worden.
Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es kann nur ein einziger Fusionspartner mit dem Hydrophobinteil verknüpft sein, oder es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (Xn) und am Carboxyterminus (Xm) des Hydropho- binteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartner mit einer Position (Xn oder Xm) des erfindungsgemäßen Proteins verknüpft werden.
Besonders geeignete Fusionspartner sind Proteine, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartner sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 16 in WO 2006/082251), yaae (SEQ ID NO:18 in WO 2006/082251 ), Ubiquitin und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, beispielsweise 70 bis 99 %, bevorzugt 5 bis 50 %, und besonders bevorzugt 10 bis 40 % der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind, wobei sich die Prozentangaben jeweils auf die Anzahl der Aminosäuren bezieht.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform weist das Fusion-Hydrophobin neben dem genannten Fusionspartner als eine der Gruppen Xn oder Xm oder als terminaler Bestandteil einer solchen Gruppe noch eine sogenannte Affinitätsdomäne (affinity tag / affinity tail) auf. Hierbei handelt es sich in prinzipiell bekannter Art und Weise um Ankergruppen, welche mit bestimmten komplementären Gruppen wechselwirken können und der leichteren Aufarbeitung und Reinigung der Proteine dienen können. Beispiele derartiger Affinitätsdomänen umfassen (His)k- , (Arg)k-, (Asp)k-, (Phe)k- oder (Cys)k- Gruppen, wobei k im allgemeinen für eine natürliche Zahl von 1 bis 10 steht. Bevorzugt kann es sich um eine (His)k-Gruppe handeln, wobei k für 4 bis 6 steht. Hierbei kann die Gruppe Xn und/oder Xm ausschließlich aus einer derartigen Affinitätsdomäne bestehen oder aber ein natürlicherweise oder nicht natürlicherweise mit einem Hydrophobin ver- knüpfter Rest Xn bzw. Xmwird um eine terminal angeordnete Affinitätsdomäne verlängert.
Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine können auch noch in ihrer Polypep- tidsequenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.
Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine bzw. deren Derivaten ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell beispielsweise dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung der Oberfläche mit dem Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.
Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die Messungen beziehen sich auf Raumtemperatur sowie Wassertropfen von 5 μl und die Verwendung von Glasplättchen als Substrat. Die genauen experimentellen Bedingungen für eine beispielhaft geeignete Methode zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Fusionsproteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30° zu vergrößern, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.
Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl , basf2. Diese
Hydrophobine inklusive ihrer Sequenzen sind beispielsweise in WO 2006/82251 offenbart. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die nachfolgend angegebenen Sequenzen auf in WO 2006/82251 offenbarten Sequenzen. Eine Übersichtstabelle mit den SEQ-I D-Nummern befindet sich in WO 2006/82251 auf Seite 20. Erfindungsgemäß insbesondere geeignet sind die Fusionsproteine yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24) mit den in Klammern angegebenen Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 19, 21 , 23. Besonders bevorzugt kann yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20) eingesetzt werden. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 20, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von mindestens einer, bis hin zu 10, bevorzugt 5, besonders bevorzugt 5% aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu min- destens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die bereits beschriebene Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden.
Besonders zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignete Derivate sind von yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad- Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) durch Verkürzung des yaad-Fusionspartners abgeleitete Derivate. Anstelle des vollständigen yaad-Fusionspartners (SEQ ID NO: 16) mit 294 Aminosäuren kann vorteilhaft ein verkürzter yaad-Rest eingesetzt werden. Der verkürzte Rest sollte aber zumindest 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren umfassen. Beispielsweise kann ein verkürzter Rest mit 20 bis 293, bevorzugt 25 bis 250, besonders bevorzugt 35 bis 150 und beispielsweise 35 bis 100 Aminosäuren eingesetzt werden. Ein Beispiel für ein derartiges Protein ist yaad40-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 26 in WO 2007/014897), welches einen auf 40 Aminosäuren verkürzten yaad-Rest aufweist.
Eine Spaltstelle zwischen dem Hydrophobin und dem Fusionspartner bzw. den Fusionspartnern kann dazu genutzt werden, den Fusionspartner abzuspalten und das reine Hydrophobin in underivatisierter Form freizusetzen (beispielsweise durch BrCN- Spaltung an Methionin, Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin-, TEV-Spaltung etc.).
Die erfindungsgemäß zur Modifizierung offenzelliger Schaumstoffe verwendeten Hydrophobine lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, wie beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield herstellen.
Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels ge- eigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen.
Ein gentechnisches Herstellverfahren für Hydrophobine ohne Fusionspartner aus TaIa- romyces thermophilus ist von US 2006/0040349 beschrieben. Die Herstellung von Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäure- sequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren beispielsweise ist von WO 2006/082251 oder WO 2006/082253 offenbart. Die Fusionspartner erleichtern die Herstellung der Hydrophobine erheblich. Fusions-Hydrophobine werden bei den gentechnischen Verfahren mit deutlich besseren Ausbeuten produziert als Hydrophobine ohne Fusionspartner.
Die nach dem gentechnischen Verfahren von den Wirtsorganismen produzierten Fusions-Hydrophobine können in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgearbeitet und mittels bekannter chromatographischer Methoden gereinigt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das in WO 2006/082253, Seiten 11/12 offenbarte, vereinfachte Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren eingesetzt werden. Hierzu werden die fermentierten Zellen zunächst aus der Fermetationsbrühe abgetrennt, aufgeschlossen und die Zelltrümmer von den Einschlusskörpern (inclusion bo- dies) getrennt. Letzteres kann vorteilhaft durch Zentrifugieren erfolgen. Schließlich können die Einschlusskörper, beispielsweise durch Säuren, Basen und/oder Detergen- tien in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgeschlossen werden, um die Fusions- Hydrophobine freizusetzen. Die Einschlusskörper mit den erfindungsgemäß verwendeten Fusion-Hydrophobinen können in der Regel schon unter Verwendung von 0,1 m NaOH innerhalb von ca. 1 h vollständig gelöst werden.
Die erhaltenen Lösungen können -ggf. nach Einstellen des gewünschten pH-Wertesohne weitere Reinigung zur Ausführung dieser Erfindung eingesetzt werden. Die Fusions-Hydrophobine können aus den Lösungen aber auch als Feststoff isoliert werden. Bevorzugt kann die Isolierung mittels Sprühgranulieren oder Sprühtrocknen erfolgen, wie in WO 2006/082253, Seite 12 beschrieben. Die nach dem vereinfachten Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren erhaltenen Produkte umfassen neben Resten von Zelltrümmern in der Regel ca. 80 bis 90 Gew. % Proteine. Die Menge an Fusions- Hydrophobinen beträgt je nach Fusionskonstrukt und Fermentationsbedingungen in der Regel 30 bis 80 Gew. % bezüglich der Menge aller Proteine.
Die isolierten, Fusions-Hydrophobine enthaltenden Produkte können als Feststoffe gelagert werden und zum Einsatz in den jeweils gewünschten Medien gelöst werden.
Die Fusions-Hydrophobine können als solche oder auch nach Abspaltung und Abtren- nung des Fusionspartners als „reine" Hydrophobine zur Ausführung dieser Erfindung verwendet werden. Eine Spaltung nimmt man vorteilhaft nach der Isolierung der Einschlusskörper und deren Auflösung vor. Erfindungsgemäß werden die Hydrophobine zur Verhinderung der Bildung von Eis auf Oberflächen verwendet. Hierzu werden die nicht mit Eis bedeckten Oberflächen mit Hydrophobinen behandelt.
Unter dem Begriff „Eis" soll nachfolgend in üblicher Art und Weise gefrorenes Wasser verstanden werden, welches sich bei ausreichend tiefen Temperaturen auf der Oberfläche von Körpern bilden kann. Es kann sich hierbei alle Arten von Eis handeln, beispielsweise massives Eis, Schnee, Reif oder überfrierende Nässe. Insbesondere handelt es sich um Eis, welches sich beim Kontakt kalter Oberflächen mit Luft einer be- stimmten Luftfeuchtigkeit bildet.
Bei den Oberflächen kann es sich um alle Arten von Oberflächen handeln, welche vor Eisbildung geschützt werden sollen. Es kann sich insbesondere um harte Oberflächen handeln, wie beispielsweise um Oberflächen aus Metallen wie Stahl oder Aluminium, Glas, Kunststoffen, Holz, Stein- und Betonoberflächen. Weiterhin kann es sich um die Oberfläche von Lackschichten handeln, welche sich auf anderen Materialien befinden.
Beispiele umfassen die Oberflächen von Luft- und Raumfahrzeugen, Kraftfahrzeugen, Motorradhelmen, Scheiben aller Art wie beispielsweise Fensterglasscheiben, Auto- Scheiben, Flugzeugscheiben, Stahlbauten, wie beispielsweise Masten von Überlandleitungen, Stromleitungen, wie beispielsweise die Stromleitungen von Überlandleitungen sowie im Industrieanlagen oder elektrische Anlagen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um die Oberflä- che von Luftfahrzeugen, insbesondere Flugzeugen, sowie um die Oberfläche gekühlter Gegenstände wie Kühl- und Gefrierschränke und Leitungen von gekühlten Flüssigkeiten oder gekühlten Gasen.
Es kann sich aber auch um weiche Oberflächen handeln, beispielsweise die Oberflä- chen von Obst und Gemüse.
Zur erfindungsgemäßen Verwendung wird bevorzugt eine Formulierung eingesetzt, welche mindestens Wasser oder wässriges Lösemittelgemisch sowie mindestens ein Hydrophobin umfasst.
Geeignete wässrige Lösemittelgemische umfassen Wasser sowie eines oder mehrere, mit Wasser mischbare Lösemittel. Die Auswahl derartiger Komponenten ist nur insofern beschränkt, als die Hydrophobine und die anderen Komponenten im Gemisch in ausreichendem Maße löslich sein müssen. Im Regelfalle umfassen derartige Gemische zumindest 50 Gew. %, bevorzugt mindestens 65 Gew. % und besonders bevorzugt mindestens 80 Gew. % Wasser. Beispiele geeigneter, mit Wasser mischbarer Lösemittel umfassen Monoalkohole wie Methanol, Ethanol oder Propanol, höhere Alkohole wie Ethylenglykol, propylenglykol oder Polyetherpolyole sowie Etheralkohole wie Butylgly- kol oder Methoxypropanol. Der Fachmann trifft unter den mit Wasser mischbaren Lösemitteln je nach den gewünschten Eigenschaften der Formulierung eine geeignete Auswahl. Beispielsweise kann es zum Einsatz bei tiefen Temperaturen sinnvoll sein, dem Wasser Ethylenglykol und/oder Propylenglykol zur Gefrierpunktserniedrigung einzusetzen.
Bevorzugt weist die zur Behandlung eingesetzte Formulierung einen pH-Wert > 4, bevorzugt > 6 und besonders bevorzugt > 7 auf. Insbesondere liegt der pH-Wert im Be- reich von 4 bis 11 , bevorzugt 6 bis 10, besonders bevorzugt 7 bis 9,5 und ganz besonders bevorzugt 7,5 bis 9. Beispielsweise kann der pH-Wert 7,5 bis 8,5 oder 8,5 bis 9 betragen.
Zur Einstellung des pH-Wertes umfasst die Formulierung bevorzugt einen geeigneten Puffer. Der Fachmann wählt je nach dem zur Beschichtung vorgesehenen pH-Bereich einen geeigneten Puffer. Zu nennen sind beispielsweise Kaliumdihydrogenphosphat- Puffer, Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (Tris-Puffer), Borax-Puffer, Natrium- hydrogencarbonat-Puffer oder Natriumhydrogenphosphat-Puffer. Bevorzugt ist Tris- Puffer.
Die Konzentration des Puffers in der Lösung wird vom Fachmann je nach den gewünschten Eigenschaften der Formulierung bestimmt. Der Fachmann wird in der Regel auf eine ausreichende Pufferkapazität achten, um möglichst konstante Beschichtungs- bedingungen zu erreichen. Bewährt hat sich eine Konzentration von 0,001 mol/l bis 1 mol/l, bevorzugt 0,005 mol/l bis 0,1 mol/l und besonders bevorzugt 0,01 mol/l bis 0,05 mol/l.
Weiterhin umfasst die Formulierung mindestens ein Hydrophobin. Selbstverständlich können auch Gemische verschiedener Hydrophobine eingesetzt werden. In bevorzug- ten Ausführungsform der Erfindung können als Hydrophobine die oben erwähnten Fu- sions-Hydrophobine eingesetzt werden. Beispielsweise kann yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20 aus WO 2006/082251) eingesetzt werden, sowie insbesondere Produkte mit verkürztem yaad-Rest, wie beispielsweise yaad40-Xa-dewA-his. Vorteilhaft können die nach dem oben beschriebenen, vereinfachten Reinigungsverfahren hergestellten Pro- dukte eingesetzt werden.
Die Konzentration der Hydrophobine in der Formulierung wird vom Fachmann je nach den gewünschten Eigenschaften der Beschichtung gewählt. Mit höheren Konzentrationen lässt sich in der Regel eine schnellere Beschichtung erreichen. Bewährt hat sich im Regelfalle eine Konzentration von 0,1 μg/ml bis 1000 μg/ml, bevorzugt 1 μg/ml bis 500 μg/ml, besonders bevorzugt 10 μg/ml bis 250 μg/ml, ganz besonders bevorzugt 30 μg/ml bis 200 μg/ml und beispielsweise 50 bis 100 μg/ml. Die eingesetzte Formulierung kann darüber hinaus optional weitere Komponenten bzw. Additive umfassen.
Beispiele zusätzlicher Komponenten umfassen Tenside. Geeignete Tenside sind bei- spielsweise nichtionische Tenside, welche Polyalkoxygruppen, insbesondere Polyethy- lenoxidgruppen umfassen. Beispiele umfassen Polyoxyethylenstearate, alkoxylierte Phenole und dergleichen. Weitere Beispiele geeigneter Tenside umfassen Polyethyle- neglycol(20)sorbitanmonolaurat (Tween® 20), Polyethyleneglycol(20)sorbitanmonopal- mitat (Tween® 40), Polyethyleneglycol(20)sorbitanmonostearat (Tween® 60), Polyethy- leneglycol(20)sorbitanmonooleat (Tween® 80), Cyclohexyl-methyl-ß D-Maltosid, Cyclo- hexyl-ethyl-ß D-Maltosid, Cyclohexyl-n-hexyl-ß D-Maltosid, n-Undecyl-ß D-Malto-sid, n-Octyl-ß D-Maltopyranosid, n-Octyl-ß D-Glucopyranosid, n-Octyl-α D-Glucopy-ranosid, n-Dodecanoylsucrose. Weitere Tenside sind beispielsweise in WO 2005/68087 Seite 9, Zeile 10 bis Seite 10, Zeile 2 offenbart. Die Konzentration an Tensiden beträgt in der Regel 0,001 Gew. % bis 0,5 Gew. %, bevorzugt 0,01 Gew. % bis 0,25 Gew. %und besonders bevorzugt 0,1Gew. % bis 0,2% Gew. %, jeweils bezogen auf die Menge aller Komponenten der Formulierung.
Weiterhin können der Formulierung noch Metallionen, insbesondere zweiwertige Metal- lionen zugegeben werden. Metallionen können zu einer gleichmäßigeren Beschichtung beitragen. Beispiele geeigneter zweiwertiger Metallionen umfassen, beispielsweise Erdalkalimetallionen wie Ca2+-lonen. Derartige Metallionen können bevorzugt als in der Formulierung lösliche Salze zugegeben werden, beispielsweise in Form von Chloriden, Nitraten oder Carbonat, Acetat, Citrat, Gluconat, Hydroxid, Lactat, Sulfat, Succinat, Tartrat. Beispielsweise können CaCb oder MgCb zugegeben werden. Die Löslichkeit kann optional auch durch geeignete Hilfsmittel, beispielsweise Komplexbildner gesteigert werden. Falls vorhanden, beträgt die Konzentration derartiger Metallionen in der Regel 0,01 mmol/l bis 10 mmol/l, bevorzugt 0,1 mmol/l bis 5 mmol/l und besonders bevorzugt 0,5 mmol/l bis 2 mmol/l.
Die Formulierungen können erhalten werden, indem die oben beschriebenen Lösungen aus der Aufarbeitung mit den gewünschten zusätzlichen Komponenten mischt und auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Selbstverständlich können die Formulierungen auch erhalten werden, indem man isolierte, feste Hydrophobine entsprechend löst.
Zur erfindungsgemäßen Anwendung werden die vor Eisbildung zu schützenden Oberflächen mit der Formulierung behandelt. Die zu schützenden Gegenstände können beispielsweise in die Formulierung eingetaucht werden oder mit der Formulierung be- sprüht werden. Die Art der Behandlung richtet sich dabei nach der Art der zu schützenden Oberfläche und wird vom Fachmann entsprechend gewählt. Zur Behandlung von Flugzeugen können beispielsweise die üblichen, auf Flughäfen vorhandenen AnIa- gen zum Besprühen von Flugzeugen mit Enteisungsmitteln verwendet werden. Das Behandeln von Automobilen kann beispielsweise mittels einer geeigneten Sprühvorrichtung in einer Autowaschanlage erfolgen, insbesondere beim oder nach dem Nachspülen und vor dem Trocknen. Die Hydrophobine können auf die Autoscheibe auch beispielsweise mittels der Scheibenwaschanlage aufgesprüht werden. Hierzu kann die Hydrophobinlösung auch über einen separaten Tank oder Behälter zugeführt werden. Auch manuelles Besprühen der Oberfläche ist möglich.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, kann das Hydrophobin auch als flüssiger Schaum aufgebracht werden, um ein vorzeitiges Abfließen der Sprühlösung zu verhindern. Hierzu wird die Hydrophobin-Lösung zunächst durch mechanisches Einrühren von Luft oder durch Zuführung eines geeigneten Gases wie Luft oder Stickstoff aufgeschäumt und anschließend auf die Oberfläche gesprüht.
In der Regel ist eine gewisse Einwirkzeit erforderlich, um die Hydrophobine auf der Oberfläche abzuscheiden. Der Fachmann wählt je nach dem gewünschten Ergebnis eine geeignete Einwirkzeit. Beispiele typischer Einwirkzeiten liegen bei 0,1 bis 12 h, ohne dass die Erfindung hierauf beschränkt sein soll.
Im Regelfalle ist die Einwirkzeit von der Temperatur sowie von der Konzentration des Hydrophobins in der Lösung abhängig. Je höher die Temperatur und je höher die Konzentration im Zuge des Beschichtungsvorganges, desto kürzer kann die Einwirkzeit sein. Die Temperatur im Zuge des Beschichtungsvorganges kann bei Raumtemperatur liegen oder aber es kann sich um erhöhte Temperaturen handeln. Beispielsweise kann es sich um Temperaturen von 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, oder
1200C handeln. Bevorzugt handelt es sich um Temperaturen von 15 bis 1200C, besonders bevorzugt 20 bis 100°C, und beispielsweise 40 bis 1000C oder 70 bis 90°C. Hierzu kann beispielsweise die Temperatur eines Tauchbad entsprechend eingestellt werden, oder die Lösung wird vor dem Aufsprühen erwärmt.
Nach dem Beschichten wird das Lösungsmittel entfernt. Das Entfernen des Lösemittels kann beispielsweise durch einfaches Abdampfen an Luft erfolgen. Das Entfernen des Lösemittels kann aber auch durch Erhöhen der Temperatur und/oder mit geeigneten Gasströmen und/oder Anlegen eines Vakuums erleichtert werden. Das Abdampfen kann erleichtert werden, indem man beispielsweise beschichtete Gegenstände in einem Trockenschrank erwärmt oder mit einem erwärmten Gasstrom anbläst. Die Methoden können auch kombiniert werden, beispielsweise indem man in einem Umlufttro- ckenschrank oder einem Trockenkanal trocknet. Weiterhin kann die Beschichtung zum Entfernen des Lösemittels auch mittels Strahlung, insbesondere IR-Stahlung erwärmt werden. Hierzu können alle Arten von breitbandigen IR-Strahlern, bspw. NIR-, MIR- oder NIR-Stahler eingesetzt werden. Es können aber beispielsweise auch IR-Laser eingesetzt werden. Derartige Strahlungsquellen sind in diversen Strahlungsgeometrien kommerziell erhältlich. Ob eine Temperaturanwendung möglich ist richtet sich naturgemäß nach der Art der zu behandelnden Gegenstände. Kleinere Gegenstände können relativ problemlos in einem Wärmeschrank temperaturbehandelt werden. Die Oberflächen größerer Gegenstände können beispielsweise mit Wärmegebläsen er- wärmt werden. Zur Beschichtung von Autos können beispielsweise die Gebläse, welche zum Trocknen der Autos verwendet werden zur Temperaturbehandlung verwendet werden.
Die Temperatur sowie die Trockenzeit im Zuge des Trocknens wird vom Fachmann festgelegt. Bewährt hat sich eine Trocknungstemperatur von 10 bis 1300C, bevorzugt 20 bis 1200C, besonders bevorzugt 70 bis 1 100C, ganz besonders bevorzugt 75 bis 1050C und beispielsweise 85 bis 1000C. Gemeint ist hierbei die Temperatur der Beschichtung selbst. Die Temperatur in einem Trockner kann selbstverständlich auch höher sein. Die Trockenzeit ist naturgemäß umso kürzer, je höher die Trockentempera- tur ist.
Die Temperaturbehandlung im Zuge des Beschichtens und die Trocknung können vorteilhaft miteinander kombiniert werden. So kann beispielsweise eine Oberfläche zunächst mit der Formulierung bei Raumtemperatur behandelt werden und anschließend bei erhöhten Temperaturen getrocknet und getempert werden.
Die mit den Hydrophobinen behandelten Oberflächen weisen eine viel stärkere Widerstandskraft gegen Vereisung auf als unbehandelte Oberflächen. Die Hydrophobin- Schichten haften sehr gut auf den Oberflächen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:
Bereitstellung der Hydrophobine
Für die Beispiele wurde ein Fusions-Hydrophobin mit dem vollständigen Fusionspartner yaad eingesetzt (yaad-Xa-dewA-his; nachfolgend Hydrophobin A genannt) sowie ein Fusions-Hydrophobin mit einem auf 40 Aminosäuren verkürzten Fusionspartner yaad40-Xa-dewA-his (Hydrophobin B). Die Herstellung erfolgte gemäß der in WO 2006/082253 beschriebenen Prozedur. Anwendungstechnische Prüfung: Charakterisierung der Fusions-Hydrophobine durch Kontaktwinkeländerung eines Wassertropfens auf Glas
Substrat: Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim)
Für die Tests wurden die sprühgetrockneten, Fusions-Hydrophobine enthaltenden Produkte in Wasser unter Zusatz von 5O mM Na-Acetat pH 4 und 0,1 Gew. % Polyoxy- ethylen(20)-sorbitanmonolaureat (Tween® 20) gelöst. Konzentration des Produktes: 100 μg/mL in wässriger Lösung.
Vorgehensweise:
Inkubation von Glasplättchen über Nacht (Temperatur 800C), danach Beschich- tung waschen in destilliertem Wasser, danach Inkubation 10min / 800C / 1 % Natrium-Dodecylsulfat (SDS) -Lösung in dest. Wasser,
Waschen in dest. Wasser
Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser bei Raumtemperatur bestimmt.
Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäss den Herstellerangaben.
Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 15° bis 30° ± 5°. Eine Beschich- tung mit dem Fusions-Hydrophobin yaad-Xa-dewA-hisβ ergab eine Kontaktwinkelvergrößerung von mehr als 30°; eine Beschichtung mit dem Fusions-Hydrophobin y- aad40-Xa-dewA-his ergab ebenfalls eine Kontaktwinkelvergrößerung von mehr als 30°.
Versuche zur Verhinderung der Eisbildung
Untersuchte Probe:
Eingesetzt wurde ein Glasobjekträger (ca. 1 ,6 x 2,6 cm). Das Glas wurde mit Isopropa- nol und bidestilliertem Wasser gereinigt und wie oben beschrieben mit Hydrophobin beschichtet. Das Hydrophobin wurde zur Beschichtung in einer Konzentration von 0,1 % (w/v) eingesetzt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Schüttler (250 rpm; 3 cm Petrischale). Versuchsaufbau
Für die Versuche wurde eine Klimakammer gemäß Abbildung 1 eingesetzt. Die Klimakammer (1) besteht aus einem Klimagerät (6) zur Kühlung und gezielten Befeuchtung der Luft (2) sowie einem Gebläse zur gezielten Kontrolle der Strömungsgeschwindigkeit. Die Probe (3) wird auf einem temperierbaren Probenhalter (4) befestigt. Dieser Probenhalter wird über einen Kryostaten (5) gekühlt. Zur Visualisierung der Eisbildungsvorgänge befindet sich in der Kammer einer Kamera.
Testablauf
Probe wird auf Probenhalter gelegt und mit kalter, feuchter Luft (2) angeblasen. Der Probenhalter wird unterkühlt. Die feuchte und kalte Luft beströmt die Probe. Beim Auftreffen der Luft auf die Probe setzt eine Reifbildung ein. Die Reifbildung kann wäh- ren des Versuches per Kamera dokumentiert werden.
Versuchsparameter:
Temperatur des Probenhalters: -4°C Lufttemperatur: 1 °C
Relative Luftfeuchtigkeit: 88% Luftgeschwindigkeit: 9 m/s Versuchsdauer: 4 Stunden
Ergebnis des Versuches:
Die Abbildungen 2 bis 5 zeigen jeweils die Probenhalter vor uns nach dem Versuch.
Figure imgf000016_0001
Sowohl Hydrophobin A als auch Hydrophobin B beeinflussen deutlich die Reifbildung im Vergleich zum Kontrollversuch ohne Verwendung von Hydrophobin. Dies ist sowohl ersichtlich im Aussehen der Reifschicht als auch in der Menge der bereiften Fläche.
Während eine unbehandelte Vergleichsprobe vollständig bereift war (der auf den Objektträger aufgemalte Buchstabe war vollständig bedeckt), war die Vereisung der mit Hydrophobin beschichteten Objektträger deutlich reduziert. Die auf den Objektträger aufgemalten Buchstaben sind durch die dünne Reifschicht noch deutlich zu sehen. Weiterhin ist die Größe Eiskritallite auf den mit Hydrophobin behandelten Trägern deutlich kleiner als bei dem unbehandelten Objektträger.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Hydrophobinen zur Verhinderung der Bildung von Eis auf Oberflächen, indem man die nicht mit Eis bedeckte Oberfläche mit mindestens einem Hydrophobin behandelt.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man zur Behandlung eine wässrige Formulierung einsetzt, welche Wasser oder ein mindestens 50 Gew. % Wasser enthaltendes Lösungsmittelgemisch sowie mindestens ein Hydrophobin umfasst.
3. Verwendung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung neben Wasser mindestens einen Alkohol umfasst.
4. Verwendung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung Ethylenglykol und/oder Propylenglykol umfasst.
5. Verwendung gemäß einen dem Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Hydrophobin um ein Fusions-Hydrophobin handelt.
6. Verwendung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um harte Oberflächen handelt.
7. Verwendung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet dass es sich bei der Oberfläche um die Oberfläche von Luft- und Raumfahrzeugen, Kraftfahrzeugen,
Motorradhelmen, Scheiben, Stahlbauten, Stromleitungen, elektrische Anlagen oder Industrieanlagen handelt.
8. Verwendung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Oberfläche von Flugzeugen handelt.
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