WO2009037258A1 - Improved-performance proteases and detergents and cleaning agents comprising said proteases - Google Patents

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WO2009037258A1
WO2009037258A1 PCT/EP2008/062309 EP2008062309W WO2009037258A1 WO 2009037258 A1 WO2009037258 A1 WO 2009037258A1 EP 2008062309 W EP2008062309 W EP 2008062309W WO 2009037258 A1 WO2009037258 A1 WO 2009037258A1
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WO
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protease
amino acid
seq
proteases
bacillus
Prior art date
Application number
PCT/EP2008/062309
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German (de)
French (fr)
Inventor
Petra Siegert
Susanne Wieland
Angrit Weber
Karl-Heinz Maurer
Cornelius Bessler
Marion Merkel
Stefan Evers
Original Assignee
Henkel Ag & Co. Kgaa
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase

Definitions

  • the present application relates to proteases whose proteolytic performance has been improved by changing the amino acid sequence, in particular with regard to their use in detergents and cleaners, all sufficiently similar proteases with a comparable change and nucleic acids and technical applications for these proteases, especially their use in washing - And cleaning agents and appropriate means themselves.
  • proteases of the subtilisin type are particularly important, which are attributed to the serine proteases due to the catalytically active amino acids. They act as nonspecific endopeptidases, that is, they hydrolyze any acid amide linkages that are internal to peptides or proteins. Their pH optimum is usually in the clearly alkaline range.
  • Subtilases become natural formed by microorganisms; Of these, in particular, the subtilisins formed and secreted by Bacillus species are to be mentioned as the most important group within the subtilases.
  • Proteases are, in addition to other enzymes, established active ingredients of detergents and cleaners. They cause the breakdown of protein-containing stains on the items to be cleaned. At best, there are synergies between the enzymes and the remaining components of the funds concerned.
  • the detergent and detergent proteases subtilases occupy an outstanding position due to their favorable enzymatic properties such as stability or pH optimum. They are also suitable for a variety of other technical uses, for example as components of cosmetics or in the organic-chemical synthesis.
  • subtilisin-type proteases preferably used in detergents and cleaners are the subtilisins BPN 'and Carlsberg, the protease PB92, the subtilisins 147 and 309, the alkaline protease from Bacillus lentus, subtilisin DY and those the subtilases, but no longer Enzymes Thermitase, Proteinase K, and Proteases TW3 and TW7, which can be classified as subtilisins in the narrower sense.
  • subtilisin BPN ' which is derived from Bacillus amyloliquefaciens, or B. subtilis, is known from the work of Vasantha et al. (1984) in J. Bacteriol., Volume 159, pp. 811-819 and JA Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Volume 11, pp. 7911-7925.
  • Subtilisin BPN ' is used in particular with regard to the numbering of the positions as reference enzyme of Subtilisins.
  • Subtilisin Carlsberg is available in a further developed form under the trade name Alcalase® from Novozymes A / S, Bagsvaerd, Denmark. It is described in the publications of EL Smith et al.
  • protease PB92 is naturally derived from the alkaliphilic bacterium Bacillus nov. spec. 92 and was available under the trade name Maxacal® from Gist-Brocades, Delft, The Netherlands. In its original sequence, it is described in the patent application EP 283075 A2.
  • the subtilisins 147 and 309 are sold under the trade names Esperase®, and Savinase® by the company Novozymes.
  • Bacillus strains which are disclosed in the application GB 1243784 A.
  • the protease from Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1) is derived from the variants described under the name BLAP®, which are described in particular in WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1, WO 02/088340 A2 and WO 03 / 038082 A2.
  • Subtilisin DY is originally from Nedkov et al. Chem., 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 366, pp. 421-430.
  • proteases are, for example, those under the trade names Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® and Ovozyme® from Novozymes, which are available under the trade names, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime and Properase ® from Genencor, sold under the trade name Protosol® by Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, under the trade name Wuxi® by Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, under the trade names Proleather® and Protease P From Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, and that available under the name Proteinase K-16 from Kao Corp., Tokyo, Japan.
  • Proteases are selectively or randomly modified by methods known from the prior art and thus optimized, for example, for use in detergents and cleaners. These include point mutagenesis, deletion or insertion mutagenesis or fusion with other proteins or protein parts or other modifications. Thus, correspondingly optimized variants are known for most proteases known from the prior art.
  • proteases there is still a high demand for proteases in various technical applications.
  • their usability in detergents and cleaners even for the family of subtilisin proteases established in the prior art there is still a need for optimization concerning, for example, their catalytic activity, the reaction conditions, the stability or the substrate specificity.
  • a protease in detergents and cleaning agents it is generally not possible to conclude on the basis of the measurable or calculable enzymatic properties of the enzyme per se on its behavior in washing or cleaning formulations.
  • other factors such as stability to oxidizing agents, denaturation by surfactants, folding effects or synergies with other ingredients play a role, which influence the behavior of the enzyme or enzymes in detergents or in the resulting washing or cleaning solutions.
  • the object of the present invention is therefore to further develop an alkaline protease of the alkaline protease type from Bacillus gibsonii DSM 14391 and to obtain performance-improved variants which show improved performance in industrial applications.
  • those should be found whose performance improves an increased cleaning performance of detergents and / or detergents.
  • those protease variants should be generated which are one of the starting proteases improved wash performance with respect to at least one soiling, preferably with respect to multiple soils.
  • proteases in particular of the subtilisin type, which have improved stability with respect to the prior art to temperature influences, pH fluctuations, denaturing or oxidizing agents, proteolytic degradation, high temperatures, acidic or alkaline conditions or to a change in the redox ratios. Further objects may be seen in the provision of proteases with reduced immunogenicity or decreased allergenic activity.
  • an alkaline protease alkaline protease from Bacillus gibsonii DSM 14391 should be further developed such that the resulting protease variant has improved detergency relative to the parent protease with respect to at least one soiling, preferably multiple soils.
  • proteases Other subtasks have been to provide nucleic acids encoding such proteases, and to provide vectors, host cells, and methods of production that can be used to obtain such proteases. Furthermore, appropriate means, in particular washing and cleaning agents, appropriate washing and cleaning methods and corresponding uses for such proteases should be made available. Finally, technical applications for the proteases found should be defined.
  • An object of the invention thus forms a protease which comprises an amino acid sequence which is at least 78.5% identical to the amino acid sequence given in SEQ ID NO. 2, and which is characterized in that it comprises in the counting method according to SEQ ID NO. 2 at position 21 1 or position 212 or at positions 211 and 212 has an amino acid modified in comparison to the amino acid indicated in SEQ ID NO.
  • protease modified according to the invention as described above differs markedly from other subtilisins, such as, for example, subtilisin 309, PB92, the alkaline protease from Bacillus lentus DSM 5483, BPN ' , proteinase K-16, etc.
  • the protease is characterized by comprising an amino acid sequence identical to that shown in SEQ ID NO. 2, more preferably at least 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95% , 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, and most preferably 99.25%.
  • a further subject of the invention is therefore a protease, which is characterized in that the protease is selected from a) a protease, which in the counting manner according to SEQ ID NO.
  • amino acid 2 at position 211 has an amino acid selected from the group consisting of: alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan , Tyrosine and valine b) a protease, which in the counting manner according to SEQ ID NO.
  • alanine arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan , Tyrosine and valine c) a protease which is in the counting manner according to SEQ ID NO. 2 at position 211 has an amino acid according to feature a) and has at position 212 an amino acid according to feature b).
  • protease is characterized in that the protease is selected from a) a protease which is in the counting manner according to SEQ ID NO. 2 at position 21 1 has a serine residue b) a protease which is in the counting manner according to SEQ ID NO. 2 at position 212 has an asparagine residue c) a protease which is in the counting manner according to SEQ ID NO. 2 at position 21 1 has a serine residue and at position 212 an asparagine residue.
  • the likewise preferred variants according to the invention therefore have the amino acid changes M21 1S (the amino acid methionine at position 211 has been replaced by the amino acid serine) or P212N (the amino acid proline at position 212 has been replaced by the amino acid Asparagine) alone or in combination.
  • proteases of the invention may have other amino acid changes, especially amino acid substitutions, insertions or deletions.
  • nucleic acids With all the subject invention mentioned above are as further subjects of the invention the associated nucleic acids, corresponding host cells, suitable methods for their identification, in particular based on the nucleic acids molecular biological methods and process elements and agents, detergents and cleaners, washing and cleaning processes and on the relevant proteases identified uses connected. Due to the provided nucleic acids, an additional optimization of this enzyme is possible, for example via further point mutations. Furthermore, this DNA can be incorporated into shuffling approaches and thus used to generate completely new proteases.
  • an enzyme is to be understood as meaning a protein which has a specific biocatalytic function.
  • protease is understood as meaning an enzyme which catalyzes the hydrolysis of peptide bonds and is thereby able to cleave peptides or proteins.
  • a protein is a largely linear composition composed of the natural amino acids and usually performs one of its functions three-dimensional structure accepting polypeptide.
  • a peptide consists of amino acids that are covalently linked to each other via peptide bonds.
  • polypeptide clarifies in this regard the fact that this peptide chain usually consists of many amino acids, which are connected to each other via peptide bonds.
  • Amino acids may be in an L and a D configuration, with the amino acids that make up proteins in the L configuration. They are called proteinogenic amino acids.
  • the proteinogenic, naturally occurring L-amino acids are designated by the internationally used 1- and 3-letter codes.
  • pre-proteins ie together with a signal peptide.
  • the N-terminal part of the protein the function of which is usually to ensure the discharge of the protein formed from the producing cell into the periplasm or the surrounding medium and / or its correct folding.
  • the signal peptide is cleaved under natural conditions by a signal peptidase from the rest of the protein, so that this exerts its actual catalytic activity without the initially present N-terminal amino acids.
  • Pro-proteins are inactive precursors of proteins. Their signal sequence precursors are referred to as pre-pro proteins.
  • the mature, ie mature, peptides, ie the enzymes processed after their preparation are preferred over the preproteins.
  • the proteins may be modified by the cells producing them after production of the polypeptide chain, for example, by attachment of sugar molecules, formylations, aminations, etc. Such modifications are referred to as post-translational modifications. These post-translational modifications may or may not have an effect on the function of the protein.
  • the enzymatic activity of a considered enzyme can be deduced from the amino acid or nucleotide sequence. This can be qualitatively or quantitatively modified by other regions of the protein that are not involved in the actual reaction. This could, for example, relate to enzyme stability, activity, reaction conditions or substrate specificity.
  • a sequence comparison is done by assigning similar sequences in the nucleotide sequences or the amino acid sequences to each other. This is called homologization.
  • a The tabular assignment of the relevant positions is referred to as alignment.
  • alignments are created using computer programs, such as the algorithms FASTA or BLAST; This procedure is described, for example, by DJ Lipman and WR Pearson (1985) in Science, Vol. 227, pp. 1435-1441.
  • a summary of all matching positions in the compared sequences is called a consensus sequence.
  • Such a comparison also allows a statement about the similarity or homology of the compared sequences to each other. This is represented in percent identity, that is the proportion of identical nucleotides or amino acid residues at the same or in an alignment corresponding positions.
  • a broader concept of homology involves conserved amino acid substitutions in amino acid sequences in this value. It then speaks of percent similarity. Such statements can be made about whole proteins or genes or only over individual areas.
  • Homologous or identical regions of different nucleic acid or amino acid sequences are defined by matches in the sequences. These can also be identified by identical function. It goes as far as complete identities in the smallest areas, so-called boxes, which comprise only a few nucleotides or amino acids and which usually perform essential functions for the overall activity of the nucleic acid or amino acid sequence. Examples of such functions may be the interaction with specific molecules in the case of nucleic acids, for example the interaction with specific transcription factors in the case of promoter sequences. In the case of amino acid sequences, such functions can also be understood as meaning the smallest subfunctions of the function carried out by the entire protein, such as the formation of individual hydrogen bonds for complexing a substrate or transition complex.
  • the protease is characterized in that its washing performance corresponds at least to that of a protease which comprises an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2, wherein the washing performance is determined in a washing system containing a detergent in a dosage between 4.5 and 7.0 grams per liter of wash liquor and the protease, wherein the proteases to be compared are used in the same activity and the washing performance against one or more of the stains blood milk / ink on cotton, VoII- egg / pigment (whole / soot) on cotton, chocolate milk / ink on cotton, peanut oil pigment / ink on polyester / cotton, grass on cotton and Cocoa on cotton, in particular against one or more of the stains
  • Full egg / pigment (whole egg / carbon black) on cotton Product No. 1ON available from the company wfk Testgewebe GmbH; Brüggen-Bracht, Germany, or product CS-37 available from CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Netherlands
  • whole egg / carbon black or whole egg / pigment are to be regarded as equivalent and mutually corresponding with regard to soiling.
  • a preferred liquid detergent for such a washing system is composed as follows (all figures in weight percent): 0.3- 0.5% xanthan gum, 0.2-0.4% anti-foaming agent, 6-7% glycerol, 0.3-0.5% ethanol, 4-7% FAEOS (fatty alcohol ether sulfate), 24-28% nonionic surfactants, 1% boric acid, 1-2% sodium citrate (dihydrate), 2-4% soda, 14-16% coconut Fatty acids, 0.5% HEDP (1-hydroxyethane- (1, 1-di-phosphonic acid)), 0-0.4% PVP (polyvinylpyrrolidone), 0-0.05% optical brightener, 0-0.001% dye, Rest demineralized water.
  • the dosage of the liquid detergent is between 4.5 and 6.0 grams per liter of wash liquor, for example, 4.7, 4.9 or 5.9 grams per liter of wash liquor. Preference is given to washing in a pH range between pH 8 and pH 10.5, preferably between pH 8 and pH 9.
  • a preferred powdered detergent for such a washing system is composed as follows (all figures in weight percent): 10% linear alkylbenzenesulfonate (sodium salt), 1.5% C12-C18 fatty alcohol sulfate (sodium salt), 2.0% C12-C18 fatty alcohol with 7 EO, 20% sodium carbonate, 6.5% sodium bicarbonate, 4.0% amorphous sodium disilicate, 17 % Sodium carbonate peroxohydrate, 4.0% TAED, 3.0% polyacrylate, 1, 0% carboxymethylcellulose, 1, 0% phosphonate, 25% sodium sulfate, remainder: optional foam inhibitors, optical brightener, fragrances and, if necessary, water ad 100%.
  • the dosage of the powdered detergent is between 5.5 and 7.0 grams per liter of wash liquor, for example, 5.6, 5.9 or 6.7 grams per liter of wash liquor.
  • the degree of whiteness i. the brightening of the stains, is preferably determined by optical measuring methods, preferably photometrically.
  • a suitable device for this purpose is for example the spectrometer Minolta CM508d.
  • the devices used for the measurement are previously calibrated with a white standard, preferably a supplied white standard.
  • the activity-like use ensures that, even if the ratio of active substance to total protein (the values of the specific activity) diverge, the respective enzymatic properties, for example the washing performance of certain soils, are compared. In general, a low specific activity can be compensated by adding a larger amount of protein.
  • Methods for the determination of the protease activities are familiar to the expert in the field of enzyme technology and are routinely used by him. For example, such methods are disclosed in Tenside, Vol. 7 (1970), pp. 125-132.
  • the protease activity is preferably indicated in PE (protease units).
  • suitable protease activities are 5 or 10 PE (protease units) per ml wash liquor. However, the protease activity is not equal to zero.
  • Proteins can also be grouped into groups of immunologically related proteins by reaction with an antiserum or antibody.
  • the members of a group are characterized by having the same antigenic determinant recognized by an antibody.
  • a further subject of the invention therefore proteases, which are characterized in that they have at least one and increasingly preferably two, three or four matching antigenic determinants with a protease according to the invention.
  • Proteases or enzymes in general can be further developed by various methods, for example targeted genetic modification by mutagenesis methods, and optimized for specific purposes or with regard to specific properties, for example catalytic activity, stability, etc.
  • Changes in the nucleotide sequence as can be brought about, for example, by molecular biological methods known per se, are accordingly termed mutations.
  • mutations are accordingly termed mutations.
  • the associated organisms are called mutants.
  • the proteins derived from mutant nucleic acids are called variants.
  • deletion, insertion, substitution mutations or fusions lead to deletion, insertion, substitution mutated or fusion genes and at the protein level to corresponding deletion, insertion or substitution variants or fusion proteins.
  • the strategy of introducing targeted point mutations into the known molecules for example to improve the washing performance of proteases, for example subtilisins, is also referred to as rational protein design.
  • a similar performance improvement strategy is to change the surface charges and / or the isoelectric point of the molecules and, above that, their interactions with the substrate.
  • the net charge of the subtilisins can be changed via point mutations in order to influence the substrate binding, in particular for use in detergents and cleaners.
  • Another, and in particular complementary, strategy is to increase the stability of the proteases in question and thereby increase their effectiveness. Such stabilization can be carried out, for example, via coupling to a polymer or, in particular for detergents and cleaners, by point mutations.
  • chimeras or hybrid proteins are to be understood as meaning those proteins whose sequence comprises the sequences or partial sequences of at least two starting proteins.
  • the source proteins may be derived from different or from the same organism.
  • Chimeric or hybrid proteins may be obtained, for example, by recombinant mutagenesis.
  • the purpose of such recombination may be to induce or modify a particular enzymatic function using the fused protein portion.
  • it is irrelevant whether such a chimeric protein consists of a single polypeptide chain or several subunits on which different functions can be distributed.
  • proteins obtained by insertion mutation are meant those variants obtained by inserting a protein fragment into the starting sequences. They are due to their principle similarity to the chimeric proteins. They differ from those only in the size ratio of the unchanged protein part to the size of the entire protein. In such insertionsmut elected proteins, the proportion of foreign protein is lower than in chimeric proteins.
  • Inversion mutagenesis ie a partial sequence reversal
  • a further subject of the invention is a protease which is characterized in that it is obtainable from a protease according to the invention as the starting molecule by fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis and comprises an amino acid sequence which is over a length of at least 266 and increasingly preferred at least 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 and 50 contiguous amino acid positions matches the parent molecule.
  • Insertions and substitutions can also give positive results. In principle, this also includes single substitutions of amino acids, but it can also be several contiguous amino acids exchanged for others. This also includes recombinations of larger enzyme sections with other proteases or proteins of other functions.
  • proteins according to the invention can also be linked with amylases or cellulases, for example, in order to perform a dual function.
  • a further subject of the invention is a protease, which is characterized in that it is obtainable from a protease according to the invention as the starting molecule and has one or more amino acid substitutions in positions which correspond to the positions 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 224, 229, 236, 237, 242 , 243, 255 and 268 of the Bacillus lentus alkaline protease according to SEQ ID NO. 3 in an alignment.
  • amino acid positions are hereby assigned by an alignment of the amino acid sequence of a protease according to the invention with the amino acid sequence of the alkaline protease from Bacillus lentus, as indicated in SEQ ID NO. In this way, so-called homologous positions are determined.
  • An example of such an alignment is given in FIG.
  • substitutions 3T, 4I, 61A, 99G, 99A, 99S, 154D, 154E, 211D, 211G and 211E are, for example, substitutions 3T, 4I, 61A, 99G, 99A, 99S, 154D, 154E, 211D, 211G and 211E, provided that the correspondingly homologous positions are not naturally taken up by one of these preferred amino acids.
  • the Bacillus lentus alkaline protease wildtype molecule has the following amino acid residues: S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61, T69, E87, A96, R99, A101, 1102, S104, N114, H118, A120 , S130, S139, T141, S142, S154, S157, A188, V193, V199, G205, L211, A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255 and T268, respectively.
  • derivatives are understood as meaning those proteins whose pure amino acid chain has been chemically modified. It is preferably a covalent modification, but may also be given a non-covalent modification. Such modifications may affect, for example, stability, substrate specificity, or binding strength to the substrate or enzymatic activity. They can also serve to reduce the allergenicity and / or immunogenicity of the protein and thus, for example, increase its skin compatibility.
  • modifications may be made biologically in the context of protein biosynthesis by the host cell.
  • couplings of low molecular weight compounds such as lipids or oligosaccharides are particularly noteworthy.
  • molecular biological methods can be used for this purpose.
  • modifications may also be made chemically, such as by the chemical transformation of a side chain of an amino acid or by covalent attachment of another compound to the protein, for example the coupling of amines to carboxyl groups of an enzyme to alter the isoelectric point.
  • a compound can also be, for example, macromolecules, including other proteins, which are bound, for example via bifunctional chemical compounds (so-called "linkers"), to proteins according to the invention.
  • a protein of the invention with a specific binding domain.
  • Such derivatives are particularly suitable for use in detergents or cleaners.
  • protease inhibitors optionally via linkers, in particular amino acid linkers, can also be bound to a protein according to the invention. This can be useful, for example, for the period of storage. Couplings with other macromolecular compounds, such as polyethylene glycol, can also improve a protein of the invention for other properties, such as stability or skin tolerance.
  • derivatization is understood to mean covalent attachment to a macromolecular carrier, as well as noncovalent inclusion in suitable macromolecular cage structures.
  • a derivative can also be understood in a broader sense to mean a preparation of the protein.
  • a protein may be associated with various other substances, for example from the culture of the producing microorganisms.
  • a protein may also have been deliberately added to certain other substances, for example to increase its storage stability. Therefore, all preparations of a protein according to the invention are also according to the invention. This is also independent of whether or not it actually exhibits this enzymatic activity in a particular preparation. Because it can be desired be that it has little or no activity during storage, and only at the time of use unfolds its proteolytic function. This can be controlled, for example, via appropriate accompanying substances.
  • the joint preparation of proteases with protease inhibitors is advantageous.
  • a further preferred embodiment of the invention is a protease described above, which is additionally stabilized, in particular by coupling to a polymer.
  • those stabilizations are also suitable which are possible by means of point mutagenesis of the molecule itself (and because of the sequence differences already fall under the embodiments described above). Because these stabilizations require after the protein recovery no further steps.
  • Some point mutations suitable for this purpose are known per se from the prior art. For example, proteases can also be stabilized by replacing certain tyrosine residues with others.
  • Changing the binding of metal ions, in particular the calcium binding sites for example by exchanging one or more of the amino acids involved in the calcium binding for one or more negatively charged amino acids and / or introducing point mutations in at least one of the sequences of the two amino acids arginine / glycine;
  • Preferred embodiments are those in which the molecule is stabilized in several ways. Because it can be assumed that several stabilizing mutations act additive or synergistic.
  • the solution of a partial task and thus an independent subject of the invention form nucleic acid molecules which code for a protease according to the invention as well as vectors containing such nucleic acid molecules.
  • nucleic acids are understood to mean the molecules which are naturally constructed from nucleotides and serve as information carriers, which code for the linear amino acid sequence in proteins or enzymes. They can be present as a single strand, as a single strand that is complementary to this single strand, or as a double strand. As the naturally more durable information carrier, the nucleic acid DNA is preferred for molecular biology work. In contrast, for the realization of the invention in natural environment, such as in a nucleic acid expressing cell, an RNA is formed, which is why corresponding RNA molecules are also embodiments of the present invention.
  • the information unit corresponding to a protein is also referred to as gene within the meaning of the present application.
  • a person skilled in the art will be able to produce the corresponding nucleic acids by methods known today, such as, for example, chemical synthesis or polymerase chain reaction (PCR) in combination with molecular biological and / or proteinchemical standard methods, using known DNA and / or amino acid sequences.
  • methods known today such as, for example, chemical synthesis or polymerase chain reaction (PCR) in combination with molecular biological and / or proteinchemical standard methods, using known DNA and / or amino acid sequences.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the nucleic acid molecule which codes for a protease according to the invention is characterized in that it is increasingly preferably at least 78.5%, 80%, 82.5%, 85% to the nucleic acid sequence indicated in SEQ ID NO %, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97% , 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, and most preferably 99.25%.
  • This aspect relates to the heterologous expression of the proteases in question.
  • every organism in particular every production strain, has a certain codon usage. This can lead to bottlenecks in protein biosynthesis, if the lying on the transgenic nucleic acid codons in the host cell of a relatively small number of loaded tRNAs face. Synonymous codons encode the same amino acids and can be better translated depending on the host. This possibly necessary rewriting thus depends on the choice of the expression system. Especially with samples from unknown, possibly non-cultivable organisms, a corresponding adaptation may be necessary.
  • the present invention involves the production of recombinant proteins.
  • these are to be understood as meaning all genetic engineering or microbiological processes which are based on the genes for the proteins of interest being introduced into a suitable host cell for the production and being transcribed and translated by it.
  • the introduction of the relevant genes via vectors, in particular expression vectors; but also those that cause the gene of interest in the host cell to be inserted into an already existing genetic element, such as the chromosome or other vectors.
  • the functional unit of gene and promoter and any other genetic elements is called an expression cassette. However, it does not necessarily have to exist as a physical entity.
  • the nucleic acid is suitably cloned into a vector.
  • Another molecular biological aspect of the invention thus consists in vectors with the genes for the corresponding proteins. These may include, for example, those derived from bacterial plasmids, viruses or bacteriophages, or predominantly synthetic vectors or plasmids with elements of various origins. With the other genetic elements present in each case, vectors are able to establish themselves as stable units in the relevant host cells over several generations. It is irrelevant in the context of the invention whether they establish themselves as extrachomosomal units or integrate into a chromosome or chromosomal DNA. Which of the numerous systems known from the prior art is chosen depends on the individual case. Decisive factors may be, for example, the achievable copy number, the selection systems available, in particular antibiotic resistances, or the cultivability of the host cells capable of accepting the vectors.
  • the vectors form suitable starting points for molecular biological and biochemical investigations of the relevant gene or protein and for further developments according to the invention and ultimately for the amplification and production of proteins according to the invention.
  • Expression vectors are chemically similar to the cloning vectors, but differ in those partial sequences that enable them to be used for the production of proteins provided host cells or host organisms to replicate and there to bring the gene contained expression, ie to realize the genetic information of the gene of interest in the host cell as a protein.
  • Preferred embodiments are expression vectors which themselves carry the genetic elements necessary for expression.
  • the expression is influenced, for example, by promoters which regulate the transcription of the gene.
  • expression may be by the natural promoter originally located upstream of this gene, but also by genetic engineering, both by a host cell promoter provided on the expression vector and by a modified or completely different promoter from another organism or host cell.
  • a further embodiment represents expression systems in which additional genes, for example those which are provided on other vectors, influence the production of proteins according to the invention. These may be modifying gene products or those which are to be purified together with the protein according to the invention, for example in order to influence its enzymatic function. These may be, for example, other proteins or enzymes, inhibitors or elements that influence the interaction with various substrates.
  • Alternative embodiments of the present invention may also be cell-free expression systems in which protein biosynthesis is understood in vitro. Such expression systems are also established in the art.
  • a further subject of the invention is a non-human host cell which contains a protease according to the invention or which can be excited to produce it, preferably using an expression vector.
  • the in vivo synthesis of an enzyme according to the invention ie by living cells, requires the transfer of the associated gene into a host cell, the so-called transformation thereof.
  • all cells that is to say prokaryotic or eukaryotic cells, are suitable as host cells.
  • preferred host cells are characterized by good microbiological and biotechnological handling.
  • Preferred embodiments represent such host cells, which are regulatable in their activity due to genetic regulatory elements which are provided, for example, on the expression vector, but may also be present in these cells from the outset. For example, by controlled addition of chemical compounds that serve as activators, by changing the culture conditions or when reaching a specific cell density, these can be excited for expression. This allows a very economical production of the proteins of interest.
  • Preferred host cells are prokaryotic or bacterial cells.
  • bacteria are distinguished from eukaryotes by shorter generation times and lower demands on culturing conditions.
  • cost-effective methods for obtaining proteins according to the invention can be established.
  • Gram-negative bacteria such as Escherichia coli (E. coli)
  • E. coli Escherichia coli
  • a large number of proteins are secreted into the periplasmic space, ie into the compartment between the two membranes enclosing the cells. This can be advantageous for special applications.
  • Gram-positive bacteria such as Bacilli or Actinomycetes or other representatives of Actinomycetales
  • have no outer membrane so that secreted proteins are released immediately into the nutrient medium surrounding the cells, from which, according to a further preferred embodiment, the expressed proteins according to the invention can be purified directly.
  • a further embodiment of the invention thus represents host cells which are characterized in that they secrete a protease according to the invention into the medium surrounding the host cell.
  • the host cell according to the invention is characterized in that it is a bacterium, in particular one which is selected from the genera of Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas and Pseudomonas.
  • the host cell is a bacterium which is selected from the group of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii gibsonii, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor and Stenotrophomonas maltophilia.
  • the host cells may be altered in their culture conditions requirements, have different or additional selection markers, or express other or additional proteins.
  • these may be those host cells which, in addition to the protein produced according to the invention, also express further, in particular economically interesting, proteins.
  • the host cell may also be a eukaryotic cell, which is characterized in that it has a cell nucleus.
  • a further subject of the invention therefore represents a host cell, which is characterized in that it has a cell nucleus.
  • eukaryotic cells are capable of post-translationally modifying the protein formed.
  • fungi such as Actinomycetes or yeasts such as Saccharomyces or Kluyveromyces.
  • yeasts such as Saccharomyces or Kluyveromyces.
  • Modifications that eukaryotic systems perform, especially in connection with protein synthesis include, for example, the binding of low molecular weight compounds such as membrane anchors or oligosaccharides.
  • Oligosaccharide modifications may be desirable, for example, to reduce allergenicity.
  • coexpression with the enzymes naturally produced by such cells, such as cellulases may be advantageous.
  • thermophilic fungal expression systems may be particularly suitable for the expression of temperature-resistant variants.
  • the host cells according to the invention are cultured and fermented in a manner known per se, for example in discontinuous or continuous systems.
  • a suitable nutrient medium is inoculated with the host cells and the product is harvested from the medium after an experimentally determined period of time.
  • Continuous fermentations are characterized by achieving a flow equilibrium in which over a relatively long period of time cells partly die off but also regrow and at the same time product can be removed from the medium.
  • Fermentation processes are known per se from the prior art and represent the actual large-scale production step, usually followed by a suitable purification method of the product produced, for example the recombinant protein. All fermentation processes which are based on one of the above-described processes for the preparation of the recombinant proteins represent correspondingly preferred embodiments of this subject matter of the invention.
  • the optimum conditions for the production processes used, for the host cells and / or the proteins to be produced must be experimentally determined on the basis of the previously optimized culture conditions of the relevant strains according to the knowledge of the person skilled in the art, for example regarding fermentation volume, media composition, oxygen supply or stirrer speed.
  • Fermentation processes which are characterized in that the fermentation is carried out via a feed strategy, are also contemplated.
  • the media components consumed by the ongoing cultivation are fed;
  • considerable increases in both the cell density and in the dry biomass and / or especially the activity of the protein of interest can be achieved.
  • the fermentation can also be designed so that unwanted metabolic products are filtered out or neutralized by the addition of buffer or matching counterions.
  • the produced protein can be harvested subsequently from the fermentation medium. This fermentation process is preferred over dry matter product processing, but requires the provision of suitable secretion markers and transport systems. Without secretion, it may be necessary to purify the protein from the cell mass, and various methods are known, such as precipitation, for example, by ammonium sulfate or ethanol, or chromatographic purification, if necessary, to homogeneity. However, the majority of the described technical methods should manage with an enriched, stabilized preparation.
  • An independent subject matter of the invention thus also provides methods for producing a protease according to the invention.
  • This includes any method which is suitable for producing a protease according to the invention described above or which makes it possible to obtain a protease according to the invention. These include, for example, chemical synthesis methods.
  • nucleotide sequence has been adapted in one, preferably a plurality of codons, to the codon usage of the host strain.
  • An inventive subject matter represents an agent which is characterized in that it contains at least one protease according to the invention as described above.
  • compositions especially mixtures, formulations, solutions, etc., the utility of which is improved by addition of a protein of the invention described above, within the scope of the present invention.
  • these may be, for example, solid mixtures, for example powders with freeze-dried or encapsulated proteins, or gel or liquid agents.
  • Preferred formulations contain, for example, buffer substances, stabilizers, reaction partners and / or cofactors of the proteases and / or other ingredients synergistic with the proteases.
  • this appropriation is to be understood as the areas of application set out below. Further fields of application emerge from the prior art and are described, for example, in the manual "Industrial Enzymes and their Applications" by H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998.
  • a combination of a protease according to the invention with one or more further ingredients of the compositions proves to be advantageous, since such an agent has an improved cleaning performance by resulting synergisms, in particular between the protease and the further ingredient.
  • the agent effects an improved removal of stains, for example proteinaceous stains, in comparison with an agent which either contains only one of the two components or also in comparison with the expected cleaning performance of an agent with both components due to the mere addition of respective individual contributions of these two components to the cleaning performance of the agent.
  • the combination of a protease according to the invention with one of the surfactants and / or builders and / or bleaches described below achieves such a synergism.
  • compositions according to the invention may comprise one or more surfactants, in particular anionic surfactants, nonionic surfactants and mixtures thereof, but also cationic, zwitterionic and amphoteric surfactants.
  • Suitable nonionic surfactants are in particular alkyl glycosides and ethoxylation and / or propoxylation of alkyl glycosides or linear or branched alcohols each having 12 to 18 carbon atoms in the alkyl moiety and 3 to 20, preferably 4 to 10 alkyl ether groups. Furthermore, corresponding ethoxylation and / or propoxylation of N-alkyl-amines, vicinal diols, fatty acid esters and fatty acid amides, which correspond to said long-chain alcohol derivatives with respect to the alkyl moiety, and of alkylphenols having 5 to 12 carbon atoms in the alkyl radical.
  • the nonionic surfactants used are preferably alkoxylated, advantageously ethoxylated, especially primary alcohols having preferably 8 to 18 carbon atoms and an average of 1 to 12 moles of ethylene oxide (EO) per mole of alcohol, in which the alcohol radical is linear or preferably 2-position may be methyl-branched or may contain linear and methyl-branched radicals in the mixture, as they are usually present in Oxoalkoholresten.
  • EO ethylene oxide
  • alcohol ethoxylates with linear radicals of alcohols of natural origin having 12 to 18 carbon atoms, for example of coconut, palm, tallow or oleyl alcohol, and on average 2 to 8 EO per mole of alcohol are preferred.
  • Preferred alcohol ethoxylates have a narrow homolog distribution (narrow rank ethoxylates, NRE).
  • fatty alcohols with more than 12 EO can also be used. Examples of these are (TaIg) fatty alcohols with 14 EO, 16 EO, 20 EO, 25 EO, 30 EO or 40 EO.
  • agents for use in mechanical processes usually extremely low-foam compounds are used. These include, preferably, C 12 -C 18 -alkyl polyethylene glycol polypropylene glycol ethers, each containing up to 8 moles of ethylene oxide and propylene oxide units in the molecule.
  • the nonionic surfactants also include alkyl glycosides of the general formula RO (G) x in which R is a primary straight-chain or methyl-branched, in particular 2-methyl-branched aliphatic radical having 8 to 22, preferably 12 to 18 carbon atoms and G represents a glycose unit having 5 or 6 C atoms, preferably glucose.
  • the degree of oligomerization x which indicates the distribution of monoglycosides and oligoglycosides, is an arbitrary number - which, as a variable to be determined analytically, may also assume fractional values - between 1 and 10; preferably x is 1, 2 to 1, 4.
  • polyhydroxy fatty acid amides of the formula (III) in which R 1 CO is an aliphatic acyl radical having 6 to 22 carbon atoms, R 2 is hydrogen, an alkyl or hydroxyalkyl radical having 1 to 4 carbon atoms and [Z] is a linear or branched polyhydroxyalkyl radical having 3 to 10 carbon atoms and 3 to 10 hydroxyl groups:
  • nonionic surfactants used either as the sole nonionic surfactant or in combination with other nonionic surfactants, in particular together with alkoxylated fatty alcohols and / or alkyl glycosides, are alkoxylated, preferably ethoxylated or ethoxylated and propoxylated fatty acid alkyl esters, preferably from 1 to 4 carbon atoms in the alkyl chain, especially fatty acid methyl ester.
  • Nonionic surfactants of the amine oxide type for example N-cocoalkyl-N, N-dimethylamine oxide and N-tallowalkyl-N, N-dihydroxyethylamine oxide, and the fatty acid alkanolamides may also be suitable.
  • the anionic surfactants may be in the form of their sodium, potassium or ammonium salts and as soluble salts of organic bases, such as mono-, di- or triethanolamine.
  • the anionic surfactants are preferably present in the form of their sodium or potassium salts, in particular in the form of the sodium salts.
  • organic builder substances may be present in amounts of up to 40% by weight, in particular up to 25% by weight and preferably from 1% by weight to 8% by weight. Quantities close to the stated upper limit are preferably used in paste-form or liquid, in particular water-containing, agents according to the invention.
  • Suitable water-soluble inorganic builder materials are, in particular, alkali metal silicates, alkali metal carbonates and alkali metal phosphates, which may be in the form of their alkaline, neutral or acidic sodium or potassium salts.
  • detergent grade crystalline sodium aluminosilicates particularly zeolite A, P and optionally X, alone or in mixtures, for example in the form of a cocrystal of zeolites A and X (Vegobond® AX, a commercial product of Condea Augusta SpA)
  • zeolites A and X a cocrystal of zeolites A and X
  • Amounts near the above upper limit are preferably used in solid, particulate agents.
  • suitable aluminosilicates have no particles with a particle size greater than 30 .mu.m and preferably consist of at least 80% by weight of particles having a size of less than 10 .mu.m.
  • Their calcium binding capacity which can be determined according to the specifications of the German patent DE 24 12 837, is generally in the range of 100 to 200 mg CaO per gram.
  • amorphous alkali silicates can be used in inventive compositions.
  • a crystalline sodium layer silicate with a modulus of 2 to 3 is used, as can be prepared from sand and soda.
  • Crystalline sodium silicates with a modulus in the range of 1.9 to 3.5 are used in a further preferred embodiment of compositions according to the invention.
  • Crystalline layered silicates of the above Formula (I) are sold by the company.
  • Na-SKS Clariant GmbH under the trade name Na-SKS, for example Na-SKS-1 (Na 2 Si 22 O 45 XH 2 O, kenyaite), Na-SKS-2 (Na 2 Si 14 O 29 XH 2 O, magadiite), Na-SKS-3 (Na 2 Si 8 O 17 XH 2 O) or Na-SKS-4 (Na 2 Si 4 O 9 XH 2 O, makatite).
  • Na-SKS-5 OC-Na 2 Si 2 O 5
  • Na-SKS-7 ⁇ -Na 2 Si 2 0 5 , natrosilite
  • Na-SKS-9 NaHSi 2 O 5 3H 2 O
  • Na-SKS-10 NaHSi 2 O 5 3H 2 O, kanemite
  • Na-SKS-11 t-Na 2 Si 2 0 5
  • Na-SKS-13 NaHSi 2 O 5
  • Na-SKS-6 5-Na 2 Si 2 O 5 .
  • composition according to the invention a granular compound of crystalline phyllosilicate and citrate, of crystalline phyllosilicate and of the above-mentioned (co-) polymeric polycarboxylic acid, or of alkali silicate and alkali metal carbonate, such as, for example, commercially available under the name Nabion® 15, is used ,
  • an agent according to the invention contains peroxygen compounds, they are present in amounts of preferably up to 50% by weight, in particular from 5% by weight to 30% by weight.
  • bleach stabilizers such as phosphonates, borates or metaborates and metasilicates and magnesium salts such as magnesium sulfate may be useful.
  • bleach activators it is possible to use compounds which, under perhydrolysis conditions, give aliphatic peroxycarboxylic acids having preferably 1 to 10 C atoms, in particular 2 to 4 C atoms, and / or optionally substituted perbenzoic acid.
  • Suitable substances are those which carry O- and / or N-acyl groups of the stated C atom number and / or optionally substituted benzoyl groups.
  • hydrophilic substituted acyl acetals and the acyl lactams are also preferably used.
  • Combinations of conventional bleach activators can also be used.
  • Such bleach activators can, in particular in the presence of the abovementioned hydrogen peroxide-supplied bleach, in the usual amount range, preferably in amounts of from 0.5 wt .-% to 10 wt .-%, in particular 1 wt .-% to 8 wt .-%, based on However, total agent, be included, missing when using percarboxylic acid as the sole bleach, preferably completely.
  • sulfone imines and / or bleach-enhancing transition metal salts or transition metal complexes may also be present as so-called bleach catalysts.
  • organic solvents which can be used in addition to water include alcohols having 1 to 4 C atoms, in particular methanol, ethanol, isopropanol and tert-butanol, diols having 2 to 4 C -Ato- men, in particular ethylene glycol and propylene glycol, and mixtures thereof and derived from the said classes of compounds ethers.
  • Such water-miscible solvents are preferably present in the compositions according to the invention in amounts of not more than 30% by weight, in particular from 6% by weight to 20% by weight.
  • Graying inhibitors have the task of keeping suspended from the textile fiber dirt suspended in the fleet.
  • Water-soluble colloids of mostly organic nature are suitable for this purpose, for example starch, glue, gelatin, salts of ether carboxylic acids or ether sulfonic acids of starch or of cellulose or salts of acidic sulfuric acid esters of cellulose or starch.
  • water-soluble polyamides containing acidic groups are suitable for this purpose.
  • starch derivatives can be used, for example aldehyde starches.
  • cellulose ethers such as carboxymethylcellulose (Na salt), Methylcellulose, hydroxyalkylcellulose and mixed ethers, such as methylhydroxyethylcellulose, methylhydroxypropylcellulose, methylcarboxymethylcellulose and mixtures thereof, for example in amounts of 0.1 to 5 wt .-%, based on the means used.
  • Detergents according to the invention may contain, for example, derivatives of diaminostilbenedisulfonic acid or their alkali metal salts as optical brighteners, although they are preferably free of optical brighteners for use as color detergents.
  • optical brighteners for use as color detergents.
  • salts of 4,4'-bis (2-anilino-4-morpholino-1, 3,5-triazinyl-6-amino) stilbene-2,2'-disulphonic acid or compounds of similar construction which are used instead of the morpholino Group carry a diethanolamino group, a methylamino group, an anilino group or a 2-methoxyethylamino group.
  • brighteners of the substituted diphenylstyrene type may be present, for example, the alkali salts of 4,4'-bis (2-sulfostyryl) -diphenyl, 4,4'-bis (4-chloro-3-sulfostyryl) -diphenyl, or 4 - (4-chlorostyryl) -4 '- (2-sulfostyryl).
  • Mixtures of the aforementioned optical brightener can be used.
  • foam inhibitors are, for example, soaps of natural or synthetic origin, which have a high proportion of C 18 -C 24 fatty acids.
  • Suitable non-surfactant foam inhibitors are, for example, organopolysiloxanes and mixtures thereof with microfine, optionally silanized silica and paraffins, waxes, microcrystalline waxes and mixtures thereof with silanated silica or bis-fatty acid alkylene diamides. It is also advantageous to use mixtures of various foam inhibitors, for example those of silicones, paraffins or waxes.
  • the foam inhibitors in particular silicone and / or paraffin-containing foam inhibitors, are bound to a granular, water-soluble or dispersible carrier substance.
  • a granular, water-soluble or dispersible carrier substance In particular, mixtures of paraffins and bistearylethylenediamide are preferred.
  • the ingredients to be selected as well as the conditions under which the agent is used, such as temperature, pH, ionic strength, redox ratios or mechanical influences, should be optimized for the particular cleaning problem.
  • usual temperatures for detergents and cleaning agents are present in areas of 1O 0 C for manual compositions over 4O 0 C and 6O 0 C to 95 ° for machine agents or industrial applications. Since the temperature is usually infinitely adjustable in modern washing machines and dishwashers, all intermediate stages of the temperature are included.
  • the ingredients of the respective agents are coordinated. Synergies in terms of cleaning performance are preferred.
  • an agent according to the invention in particular a washing or cleaning agent, further comprises
  • grayness inhibitor 0.01 to 5% by weight of grayness inhibitor and / or
  • the agent may further comprise optical brighteners, preferably from 0.01% to 5% by weight.
  • compositions according to the invention presents no difficulties and can be carried out in a known manner, for example by spray-drying or granulation, enzymes and possibly other thermally sensitive ingredients such as, for example, bleaching agents optionally being added separately later.
  • inventive compositions having an increased bulk density in particular in the range from 650 g / l to 950 g / l, a process comprising an extrusion step is preferred.
  • compositions according to the invention in tablet form, which may be monophasic or multiphase, monochromatic or multicolor and in particular consist of one or more layers, in particular two layers
  • the procedure is preferably such that all constituents - if appropriate one per layer - in one Mixer mixed together and the mixture by means of conventional tablet presses, such as eccentric or rotary presses, pressed with compressive forces in the range of about 50 to 100 kN, preferably at 60 to 70 kN.
  • a tablet produced in this way has a weight of 10 g to 50 g, in particular 15 g up to 40 g.
  • the spatial form of the tablets is arbitrary and can be round, oval or angular, with intermediate forms are also possible. Corners and edges are advantageously rounded.
  • round Tablets preferably have a diameter of 30 mm to 40 mm.
  • the size of rectangular or cuboid-shaped tablets, which are introduced predominantly via the metering device, for example the dishwasher is dependent on the geometry and the volume of this metering device.
  • Exemplary preferred embodiments have a base area of (20 to 30 mm) x (34 to 40 mm), in particular of 26x36 mm or 24x38 mm.
  • Liquid or pasty compositions according to the invention in the form of customary solvent-containing solutions are generally prepared by simply mixing the ingredients, which can be added in bulk or as a solution in an automatic mixer.
  • Embodiments of the present invention thus comprise all such solid, powdered, liquid, gelatinous or paste-like administration forms of the agents, which if appropriate can also consist of several phases and can be present in compressed or uncompressed form.
  • a further embodiment of the invention therefore represents agents which are characterized in that they are present as a one-component system. Such means preferably consist of one phase. Of course, means according to the invention may also consist of several phases.
  • the washing or cleaning agent is therefore characterized in that it is divided into several components.
  • the solid dosage forms according to the invention also include extrudates, granules, tablets or pouches, which may be present both in large packages and in portions.
  • the agent is present as a free-flowing powder, in particular with a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l or 600 g / l to 850 g / l.
  • agents according to the invention may also be liquid, gelatinous or pasty.
  • a further embodiment of the invention is therefore characterized in that the washing or cleaning agent is in liquid, gel or pasty form, in particular in the form of a non-aqueous liquid detergent or a non-aqueous paste or in the form of an aqueous liquid detergent or a water-containing paste.
  • an agent according to the invention is characterized in that it contains the protease in an amount of from 2 ⁇ g to 20 mg, preferably from 5 ⁇ g to 17.5 mg, more preferably from 20 ⁇ g to 15 mg and most preferably from 50 ⁇ g to 10 mg contains per g of the agent.
  • the washing or cleaning agent according to the invention may be packaged in a container, preferably an air-permeable container, from which it is ready for use shortly before use or during the Washing process is released.
  • the protease contained in the composition and / or other ingredients of the composition may further be coated with a substance which is impermeable to the enzyme at room temperature or in the absence of water, which becomes permeable to the enzyme under conditions of use of the agent.
  • Such an embodiment of the invention is thus characterized in that the protease is coated with a substance which is impermeable to the protease at room temperature or in the absence of water.
  • compositions according to the invention may contain only one protease. Alternatively, they may also contain other proteases or other enzymes in a concentration effective for the effectiveness of the agent.
  • a further subject of the invention thus represents agents which further comprise one or more further enzymes, wherein in principle all enzymes established in the prior art for these purposes can be used.
  • Preferred enzymes which can be used as enzymes are all enzymes which can develop a catalytic activity in the agent according to the invention, in particular proteases, amylases, cellulases, hemicellulases, mannanases, tannases, xylanases, xanthanases, .beta.-glucosidases, carrageenases, oxidases, oxidoreductases or lipases, and preferably their mixtures.
  • These enzymes are basically of natural origin; Starting from the natural molecules, improved variants are available for use in detergents and cleaners, which are preferably used accordingly.
  • compositions according to the invention preferably contain enzymes in total amounts of 1 ⁇ 10 -8 to 5 percent by weight, based on active protein.
  • the enzymes are from 0.001 to 5% by weight, more preferably from 0.01 to 5% by weight, even more preferably from 0.05 to 4% by weight and most preferably from 0.075 to 3.5% by weight.
  • the protein concentration can be determined by known methods, for example, the BCA method (bicinchoninic acid, 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the biuret method (AG Gornall, CS Bardawill and MM David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766).
  • the further enzymes particularly preferably support the effect of the agent, for example the cleaning performance of a washing or cleaning agent, with regard to certain stains or stains.
  • the enzymes show synergistic effects with respect to their action against certain stains or stains, ie the enzymes contained in the middle composition mutually support each other in their cleaning performance.
  • the agent according to the invention is therefore characterized in that it contains at least one further enzyme which comprises a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, ⁇ -glucosidase, carrageenase, oxidase, oxidoreductase or a lipase.
  • the enzymes used in agents of the invention are either originally from microorganisms, such as the genera Bacillus, Streptomyces, Humicola, or Pseudomonas, and / or are produced by biotechnological methods known per se by suitable microorganisms, for example by transgenic expression hosts of the genera Bacillus or by filamentous fungi ,
  • protease activity in such agents can be determined by the method described in Tenside, Vol. 7 (1970), pp. 125-132. It is given in PE (protease units).
  • a separate subject of the invention is the use of an above-described agent according to the invention for the removal of protease-sensitive stains on textiles or hard surfaces, i. for cleaning textiles or hard surfaces.
  • agents according to the invention can be used, in particular in accordance with the properties described above, to remove proteinaceous impurities from textiles or from hard surfaces.
  • Embodiments include, for example, hand washing, manual removal of stains from fabrics or hard surfaces, or use in conjunction with a machine process.
  • the relevant agents according to the invention preferably detergents or cleaning agents, are provided according to one of the embodiments set forth above.
  • a further subject of the invention are processes for cleaning textiles or hard surfaces, in which at least one of the process steps involves an inventive appropriate means is used.
  • the process for the cleaning of textiles or hard surfaces is accordingly characterized in that an agent according to the invention is used in at least one process step.
  • Methods for cleaning textiles are generally distinguished by the fact that various cleaning-active substances are applied to the items to be cleaned in a plurality of process steps and washed off after the action time, or that the items to be cleaned are otherwise treated with a detergent or a solution of this agent.
  • a single substep of such a process for the mechanical cleaning of textiles may consist in optionally adding, in addition to stabilizing compounds, Salts or buffer substances is applied as the only cleaning-active component of an enzyme according to the invention.
  • Another object of the invention are methods for the purification of textiles or hard surfaces, which are characterized in that in at least one method step, a protease according to the invention is proteolytically active, in particular such that the protease in an amount of 40 micrograms to 4 g, preferably from 50 ⁇ g to 3 g, more preferably from 100 ⁇ g to 2 g and most preferably from 200 ⁇ g to 1 g per application.
  • Alternative embodiments of this subject matter of the invention are also processes for the treatment of textile raw materials or for textile care in which a protease according to the invention becomes active in at least one of the process steps.
  • methods for textile raw materials, fibers or textiles with natural components are preferred, and especially for those with wool or silk.
  • These may be, for example, processes in which materials for processing in textiles are prepared, for example for anti-fungal finishing, or, for example, for processes which enrich the cleaning of worn textiles with a nourishing component.
  • processes in which materials for processing in textiles are prepared for example for anti-fungal finishing, or, for example, for processes which enrich the cleaning of worn textiles with a nourishing component.
  • they are processes for the treatment of textile raw materials, fibers or textiles with natural constituents, in particular with wool or silk.
  • enzymes according to the invention are advantageously usable in agents according to the invention, in particular detergents and cleaners, and processes, in particular washing and cleaning processes. They can be used to remove proteinaceous contaminants from textiles or hard surfaces. Embodiments include, for example, hand washing, manual removal of stains from fabrics or hard surfaces, or use in conjunction with a machine process.
  • Another object of the invention is therefore the use of a protease according to the invention, as described above for the cleaning of textiles or hard surfaces.
  • the protease is used in an amount of from 40 ⁇ g to 4 g, preferably from 50 ⁇ g to 3 g, more preferably from 100 ⁇ g to 2 g and most preferably from 200 ⁇ g to 1 g per application.
  • the relevant enzymes according to the invention are provided within the scope of an agent according to the invention, preferably a washing or cleaning agent according to the invention.
  • Another embodiment of this subject invention is the use of a protease according to the invention for activating or deactivating ingredients of detergents or cleaners.
  • proteolysis activates another component, such as when it is a hybrid protein from the actual enzyme and the corresponding inhibitor.
  • Another example of such regulation is that in which an active component is used to protect or control its activity in encapsulated in a material which is attacked by proteolysis.
  • Proteases according to the invention can thus be used for inactivation, activation or release reactions, in particular in multiphase agents.
  • protease for the recovery or treatment of raw materials or intermediates in textile production, in particular for the removal of protective layers on fabrics;
  • the present invention is also realized in the form of such a protease-containing agent of the present invention, which are cosmetics. This is understood to mean all types of cleansing and conditioning agents for human skin or hair, in particular cleansing agents.
  • proteases are also used as bioactive components in skin care agents to aid in the breakdown of desmosome structures that are increased in dry skin.
  • proteases according to the invention can be developed further, for example via amino acid substitutions and / or point mutations.
  • proteases according to the invention in particular those which are controlled in their activity, for example after mutagenesis or by addition of corresponding substances interacting with them, are also suitable as active components in skin or hair cleansing or care preparations.
  • Particularly preferred are those preparations of these enzymes, which are stabilized as described above, for example by coupling to macromolecular carrier and / or derivatized by point mutations at highly allergenic positions, so that they have a higher skin compatibility for humans.
  • subtilases In addition to the use in detergents and cleaners and cosmetics numerous applications of proteases, in particular subtilases are established in the prior art. a For example, the handbook “Industrial Enzymes and their Applications” by H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998 provides an overview of this. All of these techniques can be enriched by proteases according to the invention.
  • protease for biochemical analysis or for the synthesis of low molecular weight compounds or of proteins
  • protease for the preparation, purification or synthesis of natural substances or biological valuable substances, preferably in the context of corresponding agents or processes;
  • protease for the synthesis of proteins or other low molecular weight chemical compounds
  • protease for the treatment of natural raw materials, in particular for surface treatment, more particularly in a process for the treatment of leather, preferably in the context of appropriate agents or processes;
  • proteases according to the invention in all other fields of technology is included in the scope of protection of the present application, for which it has proven to be suitable.
  • protease variants were prepared by site-directed mutagenesis of the alkaline
  • Amino acid position 211 (nucleotides 631-633) in the counting method according to SEQ ID NO. 2 of ATG changed, for example, to TCT, so that an exchange of the amino acid methionine (M) takes place against the amino acid serine (S).
  • Counting according to SEQ ID NO. 2 changed from CCT, for example, after AAT, so that a
  • the nucleic acid coding for the particular protease is cloned in the vector pAWA22.
  • This is a pBC16-derived expression vector for use in Bacillus species (Bernhard et al., (1978) J. Bacteriol., Vol. 133 (2), pp. 897-903).
  • This vector was transformed into the host strain Bacillus subtilis DB 104 (Kawamura and Doi (1984), J. Bacteriol., Vol. 160 (1), pp. 442-444) by standard methods.
  • the transformants were first on DM3 medium (8 g / l agar, 0.5 M succinic acid, 3.5 g / l K 2 HPO 4 , 1, 5 g / l KH 2 PO 4 , 20 mM MgCl 2 , 5 g / l casiaminoacids, 5 g / l yeast extract, 6 g / l glucose, 0.1 g / l BSA) and then on TBY Skimmilk plates (10 g / l peptone, 10 g / l milk powder (see above), 5 g / l yeast, 5 g / l NaCl, 15 g / l agar).
  • Proteolytically active clones were identified by their lysis sites. From the resulting proteolytically active clones, one was selected, the plasmid isolated and the insert sequenced by standard methods to check for correctness. The desired protease activity is contained in culture supernatants according to verified clones and can be further processed therefrom if necessary.
  • Example 3 Determination of the Washing Performance When Used in a Commercially Available Powdered Detergent
  • Testmaterialien AG (St. Gallen, Switzerland), wfk Testgewebe GmbH (Brüggen-Bracht,
  • the control detergent used was a detergent base formulation of the following composition (all figures in percent by weight): 10% linear alkylbenzenesulfonate (sodium salt), 1.5% C12-C18 fatty alcohol sulfate (sodium salt), 2.0 % C12-C18 fatty alcohol with 7 EO, 20% sodium carbonate, 6.5% sodium bicarbonate, 4.0% amorphous sodium disilicate, 17% sodium carbonate peroxohydrate, 4.0% TAED, 3.0% polyacrylate, 1.0% carboxymethylcellulose , 1, 0% phosphonate, 25% sodium sulfate, balance: foam inhibitors, optical brightener, fragrances.
  • the detergent base formulation was treated with the same activity for the different test series with the following proteases: protease according to SEQ ID NO. 2 (WO 03/054185), protease according to SEQ ID NO. 2 with the amino acid substitution P212N and the alkaline protease from Bacillus lentus variant F49 (WO 95/23221).
  • the protease variant shows an improved performance compared to the starting molecule according to SEQ ID NO.2 on different soils, in particular on the soils B and D, and in comparison with the Bacillus lentus protease established in the prior art.
  • the control detergent used was a detergent base formulation of the following composition (all figures in percent by weight): 0.3- 0.5% xanthan gum, 0.2-0.4% anti-foaming agent, 6-7% glycerol, 0 , 3-0.5% ethanol, 4-7% FAEOS, 24-28% nonionic surfactants, 1% boric acid, 1-2% sodium citrate (dihydrate), 2-4% soda, 14-16% coconut fatty acids, 0 , 5% HEDP, 0-0.4% PVP, 0-0.05% optical brightener, 0-0.001% dye, balance demineralized water.
  • the detergent base formulation was treated with the same activity for the different test series with the following proteases: protease according to SEQ ID NO.
  • the protease variant shows markedly improved performance in comparison to the starting molecule according to SEQ ID NO.2 and in comparison with the protease established in the prior art ("reference") on various soils, in particular on soils A, B and D.
  • Test Materials AG St. Gallen, Switzerland
  • CFT Center For Testmaterials
  • the dosage of the detergent was 5.6 g / l (solid) or 4.7 g / l (liquid) at a water hardness of 16 ° German hardness.
  • the respective detergent formulations without enzymes represent the basis and thus the control value.
  • Proteases according to the invention were used as indicated in the tables below and a performance-improved variant of the alkaline protease from Bacillus lentus, which is disclosed as SEQ ID NO. 16 in EP 0701605 (hereinafter referred to as "reference")
  • the enzymes were used in the same activity (1080 PE / 200 ml in solid detergents, 2300 PE / 200 ml in liquid detergents).
  • FIG. 1 Alignment of the mature starting protease according to the invention (SEQ ID NO).
  • SEQ ID NO. 2 Starting protease according to the invention according to SEQ ID NO.
  • BLAP Alkaline protease from Bacillus lentus DSM 5483
  • Subtilisin 309 Subtilisin 309 according to SEQ ID NO.4

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Abstract

The present invention relates to proteases, the proteolytic performance of which has been improved by modifying the amino acid sequence, particularly with regard to the use thereof in detergents and cleaning agents, all sufficiently similar proteases having a comparable modification and nucleic acids, and potential technical applications for said proteases, primarily the use thereof in detergents and cleaning agents, and corresponding agents.

Description

Leistungsverbesserte Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese Proteasen Performance-enhanced proteases and detergents and cleaners containing these proteases
Die vorliegende Anmeldung betrifft Proteasen, deren proteolytische Leistung durch Veränderung der Aminosäuresequenz inbesondere im Hinblick auf deren Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbessert wurde, alle hinreichend ähnlichen Proteasen mit einer vergleichbaren Veränderung und Nukleinsäuren sowie technische Einsatzmöglichkeiten für diese Proteasen, vor allem ihren Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln sowie entsprechende Mittel selbst.The present application relates to proteases whose proteolytic performance has been improved by changing the amino acid sequence, in particular with regard to their use in detergents and cleaners, all sufficiently similar proteases with a comparable change and nucleic acids and technical applications for these proteases, especially their use in washing - And cleaning agents and appropriate means themselves.
Proteasen gehören zu den technisch bedeutendsten Enzymen überhaupt. Hierunter sind wiederum Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subtilopeptidasen, EC 3.4.21.62) besonders wichtig, welche aufgrund der katalytisch wirksamen Aminosäuren den Serin-Proteasen zugerechnet werden. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen, das heißt, sie hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Ihr pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über diese Familie bietet beispielsweise der Artikel „Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in „Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996. Subtilasen werden natürlicherweise von Mikroorganismen gebildet; hierunter sind insbesondere die von Bacillus-Spezies gebildeten und sekretierten Subtilisine als bedeutendste Gruppe innerhalb der Subtilasen zu erwähnen.Proteases are among the most technically important enzymes of all. Of these, in turn, proteases of the subtilisin type (subtilases, subtilopeptidases, EC 3.4.21.62) are particularly important, which are attributed to the serine proteases due to the catalytically active amino acids. They act as nonspecific endopeptidases, that is, they hydrolyze any acid amide linkages that are internal to peptides or proteins. Their pH optimum is usually in the clearly alkaline range. For an overview of this family, see for example the article "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" by R. Siezen, pages 75-95 in "Subtilisin enzymes", edited by R. Bott and C. Betzel, New York, 1996. Subtilases become natural formed by microorganisms; Of these, in particular, the subtilisins formed and secreted by Bacillus species are to be mentioned as the most important group within the subtilases.
Proteasen sind neben anderen Enzymen etablierte aktive Inhaltsstoffe von Wasch- und Reinigungsmitteln. Sie bewirken dabei den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Günstigenfalls ergeben sich Synergieeffekte zwischen den Enzymen und den übrigen Bestandteilen der betreffenden Mittel. Unter den Wasch- und Reinigungsmittelproteasen nehmen Subtilasen aufgrund ihrer günstigen enzymatischen Eigenschaften wie Stabilität oder pH- Optimum eine herausragende Stellung ein. Sie eignen sich daneben noch für eine Vielzahl weiterer technischer Verwendungsmöglichkeiten, beispielsweise als Bestandteile von Kosmetika oder in der organisch-chemischen Synthese.Proteases are, in addition to other enzymes, established active ingredients of detergents and cleaners. They cause the breakdown of protein-containing stains on the items to be cleaned. At best, there are synergies between the enzymes and the remaining components of the funds concerned. Among the detergent and detergent proteases subtilases occupy an outstanding position due to their favorable enzymatic properties such as stability or pH optimum. They are also suitable for a variety of other technical uses, for example as components of cosmetics or in the organic-chemical synthesis.
Beispiele für die in Wasch- und Reinigungsmitteln bevorzugt eingesetzten Proteasen vom Subtilisin-Typ sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7.Examples of the subtilisin-type proteases preferably used in detergents and cleaners are the subtilisins BPN 'and Carlsberg, the protease PB92, the subtilisins 147 and 309, the alkaline protease from Bacillus lentus, subtilisin DY and those the subtilases, but no longer Enzymes Thermitase, Proteinase K, and Proteases TW3 and TW7, which can be classified as subtilisins in the narrower sense.
Das Subtilisin BPN', welches aus Bacillus amyloliquefaciens, beziehungsweise B. subtilis stammt, ist aus den Arbeiten von Vasantha et al. (1984) in J. Bacteriol., Volume 159, S. 811-819 und von J. A. Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Volume 11 , S. 7911-7925 bekannt. Subtilisin BPN' dient insbesondere hinsichtlich der Numerierung der Positionen als Referenzenzym der Subtilisine. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase® von der Firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich. Es wird in den Publikationen von E. L. Smith et al. (1968) in J. Biol. Chem., Volume 243, S. 2184-2191 , und von Jacobs et al. (1985) in Nucl. Acids Res., Band 13, S. 8913-8926 beschrieben und wird natürlicherweise von Bacillus licheniformis gebildet. Die Protease PB92 wird natürlicherweise von dem alkaliphilen Bakterium Bacillus nov. spec. 92 produziert und war unter dem Handelsnamen Maxacal® von der Fa. Gist- Brocades, Delft, Niederlande, erhältlich. In ihrer ursprüglichen Sequenz wird sie in der Patentanmeldung EP 283075 A2 beschrieben. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase®, beziehungsweise Savinase® von der Firma Novozymes vertrieben. Sie stammen ursprünglich aus Bacillus-Stämmen, die mit der Anmeldung GB 1243784 A offenbart werden. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1 ) leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP® geführten Varianten ab, die insbesondere in WO 92/21760 A1 , WO 95/23221 A1 , WO 02/088340 A2 und WO 03/038082 A2 beschrieben werden. Subtilisin DY ist ursprünglich von Nedkov et al. 1985 in Biol. Chem Hoppe-Seyler, Band 366, S. 421-430 beschrieben. Weitere verwendbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® und Ovozyme® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime und Properase® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme.The subtilisin BPN ', which is derived from Bacillus amyloliquefaciens, or B. subtilis, is known from the work of Vasantha et al. (1984) in J. Bacteriol., Volume 159, pp. 811-819 and JA Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Volume 11, pp. 7911-7925. Subtilisin BPN 'is used in particular with regard to the numbering of the positions as reference enzyme of Subtilisins. Subtilisin Carlsberg is available in a further developed form under the trade name Alcalase® from Novozymes A / S, Bagsvaerd, Denmark. It is described in the publications of EL Smith et al. (1968) in J. Biol. Chem., Volume 243, pp. 2184-2191, and Jacobs et al. (1985) in Nucl. Acids Res., Vol. 13, pp. 8913-8926 and is naturally produced by Bacillus licheniformis. The protease PB92 is naturally derived from the alkaliphilic bacterium Bacillus nov. spec. 92 and was available under the trade name Maxacal® from Gist-Brocades, Delft, The Netherlands. In its original sequence, it is described in the patent application EP 283075 A2. The subtilisins 147 and 309 are sold under the trade names Esperase®, and Savinase® by the company Novozymes. They are originally from Bacillus strains, which are disclosed in the application GB 1243784 A. The protease from Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1) is derived from the variants described under the name BLAP®, which are described in particular in WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1, WO 02/088340 A2 and WO 03 / 038082 A2. Subtilisin DY is originally from Nedkov et al. Chem., 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 366, pp. 421-430. Further useful proteases are, for example, those under the trade names Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® and Ovozyme® from Novozymes, which are available under the trade names, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime and Properase ® from Genencor, sold under the trade name Protosol® by Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, under the trade name Wuxi® by Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, under the trade names Proleather® and Protease P From Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, and that available under the name Proteinase K-16 from Kao Corp., Tokyo, Japan.
Proteasen werden durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren gezielt oder zufallsbasiert verändert und so beispielsweise für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln optimiert. Dazu gehören Punktmutagenese, Deletions- oder Insertionsmutagenese oder Fusion mit anderen Proteinen oder Proteinteilen oder über sonstige Modifikationen. So sind für die meisten aus dem Stand der Technik bekannten Proteasen entsprechend optimierte Varianten bekannt.Proteases are selectively or randomly modified by methods known from the prior art and thus optimized, for example, for use in detergents and cleaners. These include point mutagenesis, deletion or insertion mutagenesis or fusion with other proteins or protein parts or other modifications. Thus, correspondingly optimized variants are known for most proteases known from the prior art.
Eine Besonderheit stellen die in der internationalen Patentanmeldung WO 03/054185 offenbarten alkalischen Proteasen aus Bacillus gibsonii (DSM 14391 ) dar. Dieser Stamm ist gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen vom 28. April 1977 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) unter der Bezeichnung ID 01-192 und der Eingangsnummer DSM 14391 hinterlegt. Gegenüber den vorstehend genannten Proteasen weisen diese Proteasen erhebliche Unterschiede in der Aminosäuresequenz auf, so dass ein Identitätsvergleich der Aminosäuresequenzen Identitätswerte ergibt, die unter 80% Identität liegen. Nachfolgende Tabelle 1 verdeutlicht diesen Sachverhalt an konkreten Beispielen:A special feature are the alkaline proteases from Bacillus gibsonii (DSM 14391) disclosed in international patent application WO 03/054185. This strain is in accordance with the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms of 28 April 1977 in the German Collection of Microorganisms and cell cultures GmbH, Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) under the name ID 01-192 and the accession number DSM 14391 deposited. Compared with the abovementioned proteases, these proteases have considerable differences in the amino acid sequence Identity comparison of the amino acid sequences gives identity values less than 80% identity. Table 1 below illustrates this fact with concrete examples:
Tabelle 1 :Table 1 :
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Für die alkalischen Proteasen aus Bacillus gibsonii (DSM 14391 ) sind keine für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln leistungsverbesserte Protease-Varianten im Stand der Technik bekannt, insbesondere keine Varianten, die eine Veränderung an den Positionen 211 und/oder 212 in der Zählweise der alkalischen Proteasen aus Bacillus gibsonii (DSM 14391 ), bezogen auf das reife Enzym, aufweisen.For the alkaline proteases from Bacillus gibsonii (DSM 14391), no protease variants which are improved in performance for use in detergents and cleaners are known in the prior art, in particular no variants which show a change at positions 211 and / or 212 in the counting method of alkaline proteases from Bacillus gibsonii (DSM 14391), based on the mature enzyme.
Es besteht nach wie vor ein hoher Bedarf an Proteasen in diversen technischen Einsatzgebieten. Insbesondere hinsichtlich ihrer Verwendbarkeit in Wasch- und Reinigungsmitteln besteht selbst für die im Stand der Technik etablierte Familie der Subtilisin-Proteasen nach wie vor ein Optimierungsbedarf betreffend beispielsweise deren katalytische Aktivität, die Reaktionsbedingungen, die Stabilität oder die Substratspezifität. Gerade hinsichtlich der Verwendung einer Protease in Wasch- und Reinigungsmitteln ist es jedoch in der Regel nicht möglich, auf Grund der mess- oder kalkulierbaren enzymatischen Eigenschaften des Enzyms per se auf dessen Verhalten in Waschoder Reinigungsmittelrezepturen zu schließen. Diesbezüglich spielen weitere Faktoren wie Stabilität gegenüber oxidierenden Agentien, Denaturierung durch Tenside, Faltungseffekte oder Synergien mit anderen Inhaltsstoffen eine Rolle, die das Verhalten des Enzyms bzw. der Enzyme in Wasch- oder Reinigungsmitteln bzw. in den resultierenden Wasch- bzw. Reinigungslösungen beeinflussen.There is still a high demand for proteases in various technical applications. In particular with regard to their usability in detergents and cleaners, even for the family of subtilisin proteases established in the prior art there is still a need for optimization concerning, for example, their catalytic activity, the reaction conditions, the stability or the substrate specificity. Especially with regard to the use of a protease in detergents and cleaning agents, however, it is generally not possible to conclude on the basis of the measurable or calculable enzymatic properties of the enzyme per se on its behavior in washing or cleaning formulations. In this regard, other factors such as stability to oxidizing agents, denaturation by surfactants, folding effects or synergies with other ingredients play a role, which influence the behavior of the enzyme or enzymes in detergents or in the resulting washing or cleaning solutions.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine alkalische Protease vom Typ der alkalischen Proteasen aus Bacillus gibsonii DSM 14391 weiterzuentwickeln und leistungsverbesserte Varianten zu erhalten, die in technischen Anwendungen verbesserte Leistungen zeigen. Insbesondere sollten solche gefunden werden, deren Leistungsverbesserung eine gesteigerte Reinigungsleistung von Wasch- und/oder Reinigungsmitteln bewirkt. Diesbezüglich sollten solche Protease-Varianten erzeugt werden, die in Bezug auf die Ausgangsprotease eine verbesserte Waschleistung in Bezug auf zumindest eine Anschmutzung, vorzugsweise in Bezug auf mehrere Anschmutzungen, aufweisen.The object of the present invention is therefore to further develop an alkaline protease of the alkaline protease type from Bacillus gibsonii DSM 14391 and to obtain performance-improved variants which show improved performance in industrial applications. In particular, those should be found whose performance improves an increased cleaning performance of detergents and / or detergents. In this regard, those protease variants should be generated which are one of the starting proteases improved wash performance with respect to at least one soiling, preferably with respect to multiple soils.
Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung können darin gesehen werden, Proteasen, insbesondere vom Subtilisin-Typ, bereitzustellen, die gegenüber dem Stand der Technik eine verbesserte Stabilität gegenüber Temperatureinflüssen, pH-Wert-Schwankungen, denaturierenden oder oxidierenden Agentien, proteolytischem Abbau, hohen Temperaturen, sauren oder alkalischen Bedingungen oder gegenüber einer Veränderung der Redox-Verhältnisse aufweisen. Weitere Aufgaben können in der Bereitstellung von Proteasen mit einer verringerten Immunogenität bzw. verringerten allergenen Wirkung gesehen werden.Further objects of the present invention can be seen to provide proteases, in particular of the subtilisin type, which have improved stability with respect to the prior art to temperature influences, pH fluctuations, denaturing or oxidizing agents, proteolytic degradation, high temperatures, acidic or alkaline conditions or to a change in the redox ratios. Further objects may be seen in the provision of proteases with reduced immunogenicity or decreased allergenic activity.
Eine weitere besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Proteasen bereitzustellen, die bei Temperaturen von 20 bis 6O0C eine gute Waschleistung, vorzugsweise eine verbesserte Waschleistung im Vergleich zu mindestens einer im Stand der Technik etablierten Protease, insbesondere einer vom Subtilisin-Typ, aufweisen. Insbesondere sollte eine alkalische Protease vom Typ der alkalischen Proteasen aus Bacillus gibsonii DSM 14391 derart weiterentwickelt werden, dass die erhaltene Protease-Variante im Vergleich mit der Ausgangsprotease eine verbesserte Waschleistung in Bezug auf zumindest eine Anschmutzung, vorzugsweise in Bezug auf mehrere Anschmutzungen, aufweist.A further particular object of the present invention to provide proteases at temperatures of 20 to 6O 0 C a good washing performance, preferably improved wash performance as compared to at least one established in the prior art protease, in particular a having the subtilisin type, , In particular, an alkaline protease alkaline protease from Bacillus gibsonii DSM 14391 should be further developed such that the resulting protease variant has improved detergency relative to the parent protease with respect to at least one soiling, preferably multiple soils.
Weitere Teilaufgaben bestanden darin, Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die für derartige Proteasen kodieren, und Vektoren, Wirtszellen und Herstellverfahren zur Verfügung zu stellen, die zur Gewinnung derartiger Proteasen genutzt werden können. Ferner sollten entsprechende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten für derartige Proteasen zur Verfügung gestellt werden. Schließlich sollten technische Einsatzmöglichkeiten für die gefundenen Proteasen definiert werden.Other subtasks have been to provide nucleic acids encoding such proteases, and to provide vectors, host cells, and methods of production that can be used to obtain such proteases. Furthermore, appropriate means, in particular washing and cleaning agents, appropriate washing and cleaning methods and corresponding uses for such proteases should be made available. Finally, technical applications for the proteases found should be defined.
Eine Lösung für die vorstehend genannte Aufgabe ergibt sich erfindungsgemäß aus der Lehre des ersten Anspruchs. Einen Gegenstand der Erfindung bildet somit eine Protease, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO.2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 78,5% identisch ist, und die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 21 1 oder Position 212 oder an den Positionen 211 und 212 eine im Vergleich zu der in SEQ ID NO.2 angegebenen Aminosäure veränderte Aminosäure aufweist.A solution to the above object results according to the invention from the teaching of the first claim. An object of the invention thus forms a protease which comprises an amino acid sequence which is at least 78.5% identical to the amino acid sequence given in SEQ ID NO. 2, and which is characterized in that it comprises in the counting method according to SEQ ID NO. 2 at position 21 1 or position 212 or at positions 211 and 212 has an amino acid modified in comparison to the amino acid indicated in SEQ ID NO.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass eine Veränderung der Positionen 211 und/oder 212 in einer Protease, die eine zu der in SEQ ID NO.2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 78,5% identische Aminosäuresequenz umfasst, eine verbesserte Leistung dieser veränderten Protease in Wasch- und Reinigungsmitteln bewirkt im Vergleich zu einer entsprechenden Protease, die diese Veränderungen nicht aufweist. Dies ist insbesondere deshalb überraschend, da sich die erfindungsgemäß veränderte Protease wie vorstehend beschrieben von weiteren Subtilisinen - wie beispielsweise Subtilisin 309, PB92, der alkalische Protease aus Bacillus lentus DSM 5483, BPN', Proteinase K-16, etc. - deutlich unterscheidet. Es war somit keinesfalls zu erwarten, dass für alkalische Proteasen aus Bacillus gibsonii (DSM 14391 ) für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln leistungsverbesserte Protease-Varianten erhalten werden durch eine Veränderung an den Positionen 211 und/oder 212 in der Zählweise der alkalischen Proteasen aus Bacillus gibsonii (DSM 14391 ), bezogen auf das reife Enzym. Unerwarteterweise führen genau diese Veränderungen bei diesen Enzymen zu einer Leistungsverbesserung, die sich von den klassischen, etablierten Proteasen vom Subtilisin-Typ unterscheiden.Surprisingly, it has been found that a change in the positions 211 and / or 212 in a protease having an amino acid sequence given in SEQ ID NO at least 78.5% identical amino acid sequence, an improved performance of this modified protease in detergents and cleaners effected compared to a corresponding protease that does not have these changes. This is particularly surprising since the protease modified according to the invention as described above differs markedly from other subtilisins, such as, for example, subtilisin 309, PB92, the alkaline protease from Bacillus lentus DSM 5483, BPN ' , proteinase K-16, etc. It was therefore unlikely that performance-enhanced protease variants would be obtained for alkaline proteases from Bacillus gibsonii (DSM 14391) for use in detergents and cleaners by altering at positions 211 and / or 212 in the alkaline protease counting mode Bacillus gibsonii (DSM 14391) based on the mature enzyme. Unexpectedly, these very changes in these enzymes lead to a performance improvement that is different from the classical, established subtilisin-type proteases.
In einer bevozugten Ausführungsform der Erfindung ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 99,25% identisch ist.In a preferred embodiment of the invention, the protease is characterized by comprising an amino acid sequence identical to that shown in SEQ ID NO. 2, more preferably at least 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95% , 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, and most preferably 99.25%.
Überraschenderweise wurde ferner festgestellt, dass mehrere Möglichkeiten vorhanden sind, die vorhandene Aminosäure in den Positionen 21 1 und/oder 212 zu verändern, um eine Leistungsverbesserung der resultierenden Protease zu erhalten. Grundsätzlich ist es von Bedeutung, dass die Protease an einer dieser Positionen überhaupt verändert ist, d.h. die an der jeweiligen Position vorhandene Aminosäure durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt ist. Alternativ können auch beide Positionen derart verändert sein. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildet daher eine Protease, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Protease ausgewählt ist aus a) einer Protease, die in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 211 eine Aminosäure aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin b) einer Protease, die in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 212 eine Aminosäure aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin c) einer Protease, die in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 211 eine Aminosäure gemäß Merkmal a) aufweist und an Position 212 eine Aminosäure gemäß Merkmal b) aufweist. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist Protease dadurch gekennzeichnet, dass die Protease ausgewählt ist aus a) einer Protease, die in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 21 1 einen Serinrest aufweist b) einer Protease, die in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 212 einen Asparaginrest aufweist c) einer Protease, die in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 21 1 einen Serinrest und an Position 212 einen Asparaginrest aufweist.Surprisingly, it has also been found that there are several possibilities to alter the amino acid present in positions 21 1 and / or 212 in order to obtain an improvement in the performance of the resulting protease. In principle, it is important that the protease at any one of these positions is altered at all, ie that the amino acid present at the respective position has been replaced by another proteinogenic amino acid. Alternatively, both positions can be changed in this way. A further subject of the invention is therefore a protease, which is characterized in that the protease is selected from a) a protease, which in the counting manner according to SEQ ID NO. 2 at position 211 has an amino acid selected from the group consisting of: alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan , Tyrosine and valine b) a protease, which in the counting manner according to SEQ ID NO. 2 at position 212 has an amino acid selected from the group consisting of: alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan , Tyrosine and valine c) a protease which is in the counting manner according to SEQ ID NO. 2 at position 211 has an amino acid according to feature a) and has at position 212 an amino acid according to feature b). In a further preferred embodiment of the invention, protease is characterized in that the protease is selected from a) a protease which is in the counting manner according to SEQ ID NO. 2 at position 21 1 has a serine residue b) a protease which is in the counting manner according to SEQ ID NO. 2 at position 212 has an asparagine residue c) a protease which is in the counting manner according to SEQ ID NO. 2 at position 21 1 has a serine residue and at position 212 an asparagine residue.
Denn für alle vorstehend genannten Substitutionen wurde eine besonders vorteilhafte Leistungsverbesserung festgestellt bei einem Einsatz dieser Protease-Varianten in Wasch- und Reinigungsmitteln, insbesondere in Waschmittelformulierungen. Ausgehend und in der Zählweise von SEQ ID NO.2 weisen die ebenfalls bevorzugten erfindungsgemäßen Varianten daher die Aminosäureveränderungen M21 1S (die Aminosäure Methionin an Position 211 wurde ersetzt durch die Aminosäure Serin) beziehungsweise P212N (die Aminosäure Prolin an Position 212 wurde ersetzt durch die Aminosäure Asparagin) alleine oder in Kombination auf.Because for all the abovementioned substitutions, a particularly advantageous performance improvement was found in a use of these protease variants in detergents and cleaners, especially in detergent formulations. Starting and in the counting mode of SEQ ID NO. 2, the likewise preferred variants according to the invention therefore have the amino acid changes M21 1S (the amino acid methionine at position 211 has been replaced by the amino acid serine) or P212N (the amino acid proline at position 212 has been replaced by the amino acid Asparagine) alone or in combination.
Zusätzlich zu den vorstehend erläuterten Aminosäureveränderungen können erfindungsgemäße Proteasen weitere Aminosäureveränderungen, insbesondere Aminosäure-Substitutionen, -Insertionenen oder -Deletionen, aufweisen.In addition to the amino acid changes discussed above, proteases of the invention may have other amino acid changes, especially amino acid substitutions, insertions or deletions.
Mit allen vorstehend genannten Erfindungsgegenständen sind als weitere Erfindungsgegenstände die zugehörigen Nukleinsäuren, entsprechende Wirtszellen, geeignete Verfahren zu ihrer Identifizierung, insbesondere auf den Nukleinsäuren aufbauende molekularbiologische Verfahren und Verfahrenselemente sowie Mittel, Wasch- und Reinigungsmittel, Wasch- und Reinigungsverfahren und über die betreffenden Proteasen gekennzeichnete Verwendungsmöglichkeiten verbunden. Aufgrund der zur Verfügung gestellten Nukleinsäuren ist eine zusätzliche Optimierung dieses Enzyms, beispielsweise über weitere Punktmutationen möglich. Ferner kann diese DNA in Shuffling-Ansätze eingebracht und damit zur Erzeugung völlig neuartiger Proteasen genutzt werden.With all the subject invention mentioned above are as further subjects of the invention the associated nucleic acids, corresponding host cells, suitable methods for their identification, in particular based on the nucleic acids molecular biological methods and process elements and agents, detergents and cleaners, washing and cleaning processes and on the relevant proteases identified uses connected. Due to the provided nucleic acids, an additional optimization of this enzyme is possible, for example via further point mutations. Furthermore, this DNA can be incorporated into shuffling approaches and thus used to generate completely new proteases.
Unter einem Enzym ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein Protein zu verstehen, das eine bestimmte biokatalytische Funktion ausübt. Unter Protease im Sinne der vorliegenden Anmeldung wird ein Enzym verstanden, welches die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert und dadurch in der Lage ist, Peptide oder Proteine zu spalten.For the purposes of the present application, an enzyme is to be understood as meaning a protein which has a specific biocatalytic function. For the purposes of the present application, protease is understood as meaning an enzyme which catalyzes the hydrolysis of peptide bonds and is thereby able to cleave peptides or proteins.
Ein Protein ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein aus den natürlichen Aminosäuren zusammengesetztes, weitgehend linear aufgebautes, zur Ausübung seiner Funktion zumeist eine dreidimensionale Struktur annehmendes Polypeptid. Ein Peptid besteht aus Aminosäuren, die über Peptidbindungen miteinander kovalent verbunden sind. Die Bezeichnung Polypeptid verdeutlicht diesbezüglich den Sachverhalt, dass diese Peptidkette in der Regel aus vielen Aminosäuren besteht, die über Peptidbindungen miteinander verbunden sind. Aminosäuren können in einer L- und einer D-Konfiguration vorliegen, wobei die Aminosäuren, aus denen Proteine bestehen, in der L-Konfiguration vorliegen. Sie werden als proteinogene Aminosäuren bezeichnet. In der vorliegenden Anmeldung werden die proteinogenen, natürlich vorkommenden L-Aminosäuren mit den international gebräuchlichen 1- und 3-Buchstaben-Codes bezeichnet. Zahlreiche Proteine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem Signalpeptid gebildet. Darunter ist dann der N-terminale Teil des Proteins zu verstehen, dessen Funktion zumeist darin besteht, die Ausschleusung des gebildeten Proteins aus der produzierenden Zelle in das Periplasma oder das umgebende Medium und/oder dessen korrekte Faltung zu gewährleisten. Anschließend wird das Signalpeptid unter natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase vom übrigen Protein abgespalten, so dass dieses seine eigentliche katalytische Aktivität ohne die zunächst vorhandenen N-terminalen Aminosäuren ausübt. Pro-Proteine sind inaktive Vorstufen von Proteinen. Deren Vorläufer mit Signalsequenz werden als Prä-Pro-Proteine bezeichnet. Für technische Anwendungen sind aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität die maturen, d.h. reifen Peptide, d.h. die nach ihrer Herstellung prozessierten Enzyme gegenüber den Präproteinen bevorzugt. Die Proteine können von den sie produzierenden Zellen nach der Herstellung der Polypeptidkette modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche Modifikationen werden als posttranslationale Modifikationen bezeichnet. Diese posttranslationalen Modifizierungen können, müssen jedoch nicht einen Einfluss auf die Funktion des Proteins ausüben.For the purposes of the present application, a protein is a largely linear composition composed of the natural amino acids and usually performs one of its functions three-dimensional structure accepting polypeptide. A peptide consists of amino acids that are covalently linked to each other via peptide bonds. The term polypeptide clarifies in this regard the fact that this peptide chain usually consists of many amino acids, which are connected to each other via peptide bonds. Amino acids may be in an L and a D configuration, with the amino acids that make up proteins in the L configuration. They are called proteinogenic amino acids. In the present application, the proteinogenic, naturally occurring L-amino acids are designated by the internationally used 1- and 3-letter codes. Numerous proteins are formed as so-called pre-proteins, ie together with a signal peptide. By this is meant the N-terminal part of the protein, the function of which is usually to ensure the discharge of the protein formed from the producing cell into the periplasm or the surrounding medium and / or its correct folding. Subsequently, the signal peptide is cleaved under natural conditions by a signal peptidase from the rest of the protein, so that this exerts its actual catalytic activity without the initially present N-terminal amino acids. Pro-proteins are inactive precursors of proteins. Their signal sequence precursors are referred to as pre-pro proteins. For technical applications, due to their enzymatic activity, the mature, ie mature, peptides, ie the enzymes processed after their preparation, are preferred over the preproteins. The proteins may be modified by the cells producing them after production of the polypeptide chain, for example, by attachment of sugar molecules, formylations, aminations, etc. Such modifications are referred to as post-translational modifications. These post-translational modifications may or may not have an effect on the function of the protein.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden alle Enzyme, Proteine, Fragmente und Derivate, sofern sie nicht explizit als solche angesprochen zu werden brauchen, unter dem Oberbegriff Proteine zusammengefasst.For the purposes of the present invention, all enzymes, proteins, fragments and derivatives, unless they need to be addressed explicitly as such, are summarized under the generic term proteins.
Durch Vergleich mit bekannten Enzymen, die beispielsweise in allgemein zugänglichen Datenbanken hinterlegt sind, lässt sich aus der Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenz die enzymatische Aktivität eines betrachteten Enzyms folgern. Diese kann durch andere Bereiche des Proteins, die nicht an der eigentlichen Reaktion beteiligt sind, qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Dies könnte beispielsweise die Enzymstabilität, die Aktivität, die Reaktionsbedingungen oder die Substratspezifität betreffen.By comparison with known enzymes, which are deposited for example in generally accessible databases, the enzymatic activity of a considered enzyme can be deduced from the amino acid or nucleotide sequence. This can be qualitatively or quantitatively modified by other regions of the protein that are not involved in the actual reaction. This could, for example, relate to enzyme stability, activity, reaction conditions or substrate specificity.
Ein Sequenzvergleich geschieht dadurch, dass ähnliche Abfolgen in den Nukleotidsequenzen oder den Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Dies nennt man Homologisierung. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Bei der Analyse von Nukleotidsequenzen sind wiederum beide komplementären Stränge und jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen; ebenso die Degeneriertheit des genetischen Codes und die organismenspezifische Verwendung der Codons (Codon-Usage). Inzwischen werden Alignments über Computerprogramme erstellt, wie beispielsweise durch die Algorithmen FASTA oder BLAST; dieses Vorgehen wird beispielsweise von D. J. Lipman und W. R. Pearson (1985) in Science, Band 227, S. 1435-1441 beschrieben.A sequence comparison is done by assigning similar sequences in the nucleotide sequences or the amino acid sequences to each other. This is called homologization. A The tabular assignment of the relevant positions is referred to as alignment. In the analysis of nucleotide sequences, in turn, both complementary strands and all three possible reading frames are to be taken into account; as well as the degeneracy of the genetic code and the organism-specific use of codons (codon usage). Meanwhile, alignments are created using computer programs, such as the algorithms FASTA or BLAST; This procedure is described, for example, by DJ Lipman and WR Pearson (1985) in Science, Vol. 227, pp. 1435-1441.
Eine Zusammenstellung aller in den verglichenen Sequenzen übereinstimmenden Positionen wird als Konsensus-Sequenz bezeichnet.A summary of all matching positions in the compared sequences is called a consensus sequence.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit oder Homologie der verglichenen Sequenzen zueinander. Diese wird in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben bzw. in einem Alignment einander entsprechenden Positionen wiedergegeben. Ein weiter gefasster Homologiebegriff bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in diesen Wert mit ein. Es ist dann von Prozent Ähnlichkeit die Rede. Solche Aussagen können über ganze Proteine oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden.Such a comparison also allows a statement about the similarity or homology of the compared sequences to each other. This is represented in percent identity, that is the proportion of identical nucleotides or amino acid residues at the same or in an alignment corresponding positions. A broader concept of homology involves conserved amino acid substitutions in amino acid sequences in this value. It then speaks of percent similarity. Such statements can be made about whole proteins or genes or only over individual areas.
Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Diese können auch durch identische Funktion gekennzeichnet sein. Sie geht bis zu völligen Identitäten in kleinsten Bereichen, sogenannten Boxen, die nur wenige Nukleotide bzw. Aminosäuren umfassen und die meist für die Gesamtaktivität der Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz essentielle Funktionen ausüben. Beispiele für solche Funktionen können bei Nukleinsäuren die Wechselwirkung mit speziellen Molekülen sein, beispielsweise bei Promotorsequenzen die Wechselwirkung mit bestimmten Transkriptionsfaktoren. Bei Aminosäuresequenzen können unter solchen Funktionen auch kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten Funktion verstanden werden wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes.Homologous or identical regions of different nucleic acid or amino acid sequences are defined by matches in the sequences. These can also be identified by identical function. It goes as far as complete identities in the smallest areas, so-called boxes, which comprise only a few nucleotides or amino acids and which usually perform essential functions for the overall activity of the nucleic acid or amino acid sequence. Examples of such functions may be the interaction with specific molecules in the case of nucleic acids, for example the interaction with specific transcription factors in the case of promoter sequences. In the case of amino acid sequences, such functions can also be understood as meaning the smallest subfunctions of the function carried out by the entire protein, such as the formation of individual hydrogen bonds for complexing a substrate or transition complex.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass ihre Waschleistung mindestens derjenigen einer Protease entspricht, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, wobei die Waschleistung in einem Waschsystem bestimmt wird, das ein Waschmittel in einer Dosierung zwischen 4,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte sowie die Protease enthält, wobei die zu vergleichenden Proteasen aktivitätsgleich eingesetzt sind und die Waschleistung gegenüber einer oder mehrerer der Anschmutzungen Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle, VoII- Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle, Schokolade-Milch/Tusche auf Baumwolle, Erdnuss Öl- Pigment/Tusche auf Polyester/Baumwolle, Gras auf Baumwolle und Kakao auf Baumwolle, insbesondere gegenüber einer oder mehrerer der AnschmutzungenIn a further preferred embodiment of the invention, the protease is characterized in that its washing performance corresponds at least to that of a protease which comprises an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2, wherein the washing performance is determined in a washing system containing a detergent in a dosage between 4.5 and 7.0 grams per liter of wash liquor and the protease, wherein the proteases to be compared are used in the same activity and the washing performance against one or more of the stains blood milk / ink on cotton, VoII- egg / pigment (whole / soot) on cotton, chocolate milk / ink on cotton, peanut oil pigment / ink on polyester / cotton, grass on cotton and Cocoa on cotton, in particular against one or more of the stains
- Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle: Produkt Nr. C5 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Niederlande- Blood milk / cotton ink: Product # C5 available from CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Netherlands
- Voll-Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle: Produkt Nr. 1ON erhältlich von der Firma wfk Testgewebe GmbH; Brüggen-Bracht, Deutschland, oder Produkt CS-37 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, NiederlandeFull egg / pigment (whole egg / carbon black) on cotton: Product No. 1ON available from the company wfk Testgewebe GmbH; Brüggen-Bracht, Germany, or product CS-37 available from CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Netherlands
- Schokolade-Milch/Tusche auf Baumwolle: Produkt Nr. C3 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Niederlande- Chocolate milk / cotton ink: Product # C3 available from CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Netherlands
- Erdnuss Öl-Pigment/Tusche auf Polyester/Baumwolle: Produkt Nr. PC10 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Niederlande- Peanut oil pigment / ink on polyester / cotton: Product No. PC10 available from CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Netherlands
- Gras auf Baumwolle: Produkt Nr. 164 erhältlich von der Firma Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz- Grass on cotton: Product No. 164 available from the company Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Switzerland
- Kakao auf Baumwolle: Produkt Nr. 112 erhältlich von der Firma Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz, bestimmt wird durch Messung des Weißheitsgrades der gewaschenen Textilien, der Waschvorgang für mindestens 30 Minuten, optional 60 Minuten, bei einer Temperatur von 4O0C erfolgt und das Wasser eine Wasserhärte zwischen 15,5 und 16,5° (deutsche Härte) aufweist.- Cocoa on cotton: Product No. 112 available from the company Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Switzerland, is determined by measuring the whiteness of the washed fabrics, the washing process for at least 30 minutes, optionally 60 minutes , at a temperature of 4O 0 C and the water has a water hardness between 15.5 and 16.5 ° (German hardness).
Erfindungsgemäß sind die Begriffe Ganzei/Ruß bzw. Vollei/Pigment hinsichtlich der Anschmutzungen als gleichwertig und einander entsprechend zu betrachten.In accordance with the invention, the terms whole egg / carbon black or whole egg / pigment are to be regarded as equivalent and mutually corresponding with regard to soiling.
Ein bevorzugtes flüssiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3- 0,5% Xanthan Gum, 0,2-0,4% Anti-Schaummittel, 6-7% Glycerin, 0,3-0,5% Ethanol, 4-7% FAEOS (Fettalkoholethersulfat) , 24-28% nichtionische Tenside, 1 % Borsäure, 1-2% Natriumeitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP (1-Hydroxyethan-(1 ,1-di-phosphonsäure)), 0-0,4% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0-0,05% optischer Aufheller, 0-0,001 % Farbstoff, Rest demineralisiertes Wasser. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 4,5 und 6,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 4,7, 4,9 oder 5,9 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 8 und pH 10,5, bevorzugt zwischen pH 8 und pH 9.A preferred liquid detergent for such a washing system is composed as follows (all figures in weight percent): 0.3- 0.5% xanthan gum, 0.2-0.4% anti-foaming agent, 6-7% glycerol, 0.3-0.5% ethanol, 4-7% FAEOS (fatty alcohol ether sulfate), 24-28% nonionic surfactants, 1% boric acid, 1-2% sodium citrate (dihydrate), 2-4% soda, 14-16% coconut Fatty acids, 0.5% HEDP (1-hydroxyethane- (1, 1-di-phosphonic acid)), 0-0.4% PVP (polyvinylpyrrolidone), 0-0.05% optical brightener, 0-0.001% dye, Rest demineralized water. Preferably, the dosage of the liquid detergent is between 4.5 and 6.0 grams per liter of wash liquor, for example, 4.7, 4.9 or 5.9 grams per liter of wash liquor. Preference is given to washing in a pH range between pH 8 and pH 10.5, preferably between pH 8 and pH 9.
Ein bevorzugtes pulverförmiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 10 % lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 1 ,5 % C12-C18-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 2,0 % C12-C18-Fettalkohol mit 7 EO, 20 % Natriumcarbonat, 6,5 % Natriumhydrogencarbonat, 4,0 % amorphes Natriumdisilikat, 17 % Natriumcarbonat-peroxohydrat, 4,0 % TAED, 3,0 % Polyacrylat, 1 ,0 % Carboxymethylcellulose, 1 ,0 % Phosphonat, 25 % Natriumsulfat, Rest: optional Schauminhibitoren, optischer Aufheller, Duftstoffe und ggfs. Wasser ad 100%. Bevorzugt beträgt die Dosierung des pulverförmigen Waschmittels zwischen 5,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 5,6, 5,9 oder 6,7 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 9 und pH 11.A preferred powdered detergent for such a washing system is composed as follows (all figures in weight percent): 10% linear alkylbenzenesulfonate (sodium salt), 1.5% C12-C18 fatty alcohol sulfate (sodium salt), 2.0% C12-C18 fatty alcohol with 7 EO, 20% sodium carbonate, 6.5% sodium bicarbonate, 4.0% amorphous sodium disilicate, 17 % Sodium carbonate peroxohydrate, 4.0% TAED, 3.0% polyacrylate, 1, 0% carboxymethylcellulose, 1, 0% phosphonate, 25% sodium sulfate, remainder: optional foam inhibitors, optical brightener, fragrances and, if necessary, water ad 100%. Preferably, the dosage of the powdered detergent is between 5.5 and 7.0 grams per liter of wash liquor, for example, 5.6, 5.9 or 6.7 grams per liter of wash liquor. Preference is given to washing in a pH range between pH 9 and pH 11.
Der Weißheitsgrad, d.h. die Aufhellung der Anschmutzungen, wird bevorzugt mit optischen Messverfahren bestimmt, bevorzugt photometrisch. Ein hierfür geeignetes Gerät ist beispielsweise das Spektrometer Minolta CM508d. Üblicherweise werden die für die Messung eingesetzten Geräte zuvor mit einem Weißstandard, bevorzugt einem mitgelieferten Weißstandard, kalibriert.The degree of whiteness, i. the brightening of the stains, is preferably determined by optical measuring methods, preferably photometrically. A suitable device for this purpose is for example the spectrometer Minolta CM508d. Usually, the devices used for the measurement are previously calibrated with a white standard, preferably a supplied white standard.
Durch den aktivitätsgleichen Einsatz wird sichergestellt, dass auch bei einem etwaigen Auseinanderklaffen des Verhältnisses von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften, also beispielsweise die Waschleistung an bestimmten Anschmutzungen, verglichen werden. Generell gilt, dass eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann. Verfahren zur Bestimmung der Proteaseaktivitäten sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie geläufig und werden von ihm routinemäßig angewendet. Beispielsweise sind solche Verfahren offenbart in Tenside, Band 7 (1970), S. 125-132. Die Proteaseaktivität wird vorzugsweise in PE (Protease-Einheiten) angegeben. Beispielsweise geeignete Proteaseaktivitäten betragen 5 oder 10 PE (Protease-Einheiten) pro ml Waschflotte. Die Proteaseaktivität ist jedoch nicht gleich Null.The activity-like use ensures that, even if the ratio of active substance to total protein (the values of the specific activity) diverge, the respective enzymatic properties, for example the washing performance of certain soils, are compared. In general, a low specific activity can be compensated by adding a larger amount of protein. Methods for the determination of the protease activities are familiar to the expert in the field of enzyme technology and are routinely used by him. For example, such methods are disclosed in Tenside, Vol. 7 (1970), pp. 125-132. The protease activity is preferably indicated in PE (protease units). For example, suitable protease activities are 5 or 10 PE (protease units) per ml wash liquor. However, the protease activity is not equal to zero.
Proteine können auch über die Reaktion mit einem Antiserum oder einem bestimmten Antikörper zu Gruppen immunologisch verwandter Proteine zusammengefaßt werden. Die Angehörigen einer Gruppe zeichnen sich dadurch aus, dass sie dieselbe, von einem Antikörper erkannte antigene Determinante aufweisen. Einen weiteren Erfindungsgegenstand bilden daher Proteasen, dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei oder vier übereinstimmende antigene Determinanten mit einer erfindungsgemäßen Protease aufweisen.Proteins can also be grouped into groups of immunologically related proteins by reaction with an antiserum or antibody. The members of a group are characterized by having the same antigenic determinant recognized by an antibody. A further subject of the invention therefore proteases, which are characterized in that they have at least one and increasingly preferably two, three or four matching antigenic determinants with a protease according to the invention.
Proteasen bzw. Enzyme im allgemeinen können durch verschiedene Verfahren, z.B. gezielte genetische Veränderung durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften, beispielsweise katalytische Aktivität, Stabilität, usw., optimiert werden. Änderungen der Nukleotidsequenz, wie sie beispielsweise durch an sich bekannte molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden können, werden demnach als Mutationen bezeichnet. Je nach Art der Änderung kennt man beispielsweise Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen oder solche, bei denen verschiedene Gene oder Teile von Genen miteinander fusioniert (shuffling) werden; dies sind Genmutationen. Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. Die von mutierten Nukleinsäuren abgeleiteten Proteine werden als Varianten bezeichnet. So führen beispielsweise Deletions-, Insertions-, Substitutionsmutationen oder Fusionen zu deletions-, insertions-, substitutionsmutierten oder Fusionsgenen und auf Proteinebene zu entsprechenden Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten, beziehungsweise Fusionsproteinen. Die Strategie, in die bekannten Moleküle gezielte Punktmutationen einzuführen, etwa um die Waschleistung der Proteasen, beispielsweise Subtilisinen, zu verbessern, wird auch als Rationales Protein-Design bezeichnet. Eine ähnliche Strategie der Leistungsverbesserung besteht darin, die Oberflächenladungen und/oder den isoelektrischen Punkt der Moleküle und darüber ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat zu verändern. So kann beispielsweise über Punktmutationen die Nettoladung der Subtilisine verändert werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Eine weitere, insbesondere ergänzende Strategie besteht darin, die Stabilität der betreffenden Proteasen zu erhöhen und damit ihre Wirksamkeit zu erhöhen. Eine solche Stabilisierung kann beispielsweise über Kopplung an ein Polymer oder, insbesondere für Wasch- und Reinigungsmittel, durch Punktmutationen erfolgen.Proteases or enzymes in general can be further developed by various methods, for example targeted genetic modification by mutagenesis methods, and optimized for specific purposes or with regard to specific properties, for example catalytic activity, stability, etc. Changes in the nucleotide sequence, as can be brought about, for example, by molecular biological methods known per se, are accordingly termed mutations. Depending on the nature of the change, for example, deletion, insertion or substitution mutations or those in which different genes or parts of Genes are shuffled together; these are gene mutations. The associated organisms are called mutants. The proteins derived from mutant nucleic acids are called variants. Thus, for example, deletion, insertion, substitution mutations or fusions lead to deletion, insertion, substitution mutated or fusion genes and at the protein level to corresponding deletion, insertion or substitution variants or fusion proteins. The strategy of introducing targeted point mutations into the known molecules, for example to improve the washing performance of proteases, for example subtilisins, is also referred to as rational protein design. A similar performance improvement strategy is to change the surface charges and / or the isoelectric point of the molecules and, above that, their interactions with the substrate. Thus, for example, the net charge of the subtilisins can be changed via point mutations in order to influence the substrate binding, in particular for use in detergents and cleaners. Another, and in particular complementary, strategy is to increase the stability of the proteases in question and thereby increase their effectiveness. Such stabilization can be carried out, for example, via coupling to a polymer or, in particular for detergents and cleaners, by point mutations.
Eine moderne Richtung der Enzymentwicklung besteht darin, Elemente aus bekannten, miteinander verwandten Proteinen über statistische Verfahren zu neuen Enzymen mit bislang nicht erreichten Eigenschaften zu kombinieren. Solche Verfahren werden auch unter dem Oberbegriff Directed Evolution zusamengefaßt. Dazu gehören beispielsweise die sogenannte „StEP"-Methode, „Random priming recombination", „DNA-Shuffling", „RACHITT" oder „Recombining ligation reaction" (RLR).A modern direction of enzyme development is to combine elements from known, related proteins via statistical methods into new enzymes with previously unattainable properties. Such methods are also summarized under the generic term Directed Evolution. These include, for example, the so-called "StEP" method, "random priming recombination", "DNA shuffling", "RACHITT" or "recombining ligation reaction" (RLR).
Für die Beschreibung von Punktmutationen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausche), wird folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben-Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. Mehrere Austausche innerhalb derselben Polypeptidkette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt.For the description of point mutations which concern exactly one amino acid position (amino acid substitutions), the following convention is used: first, the naturally occurring amino acid is designated in the form of the international one-letter code, followed by the associated sequence position and finally the inserted amino acid. Several exchanges within the same polypeptide chain are separated by slashes.
Es ist aus dem Stand der Technik weiterhin allgemein bekannt, dass sich vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z.B. einzelner Punktmutationen, ergänzen können. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften bereits optimierte Protease, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber Tensiden oder anderen Komponenten, kann erfindungsgemäß zusätzlich weiterentwickelt werden. Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als natürliche Proteine und beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen können sie den betreffenden vollständigen Proteinen zugeordnet werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder proteolytische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben, wie beispielsweise die Komplexierung eines Substrats. Fragmente und Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen sind prinzipiell gleichartig; während Fragmente eher kleinere Bruchstücke darstellen, fehlen den Deletionsmutanten eher nur kurze Bereiche, und damit nur einzelne Teilfunktionen.It is furthermore generally known from the prior art that advantageous properties of individual mutations, for example individual point mutations, can complement one another. An already optimized with respect to certain properties protease, for example, in terms of their stability to surfactants or other components, according to the invention can be further developed. Fragments are understood as meaning all proteins or peptides which are smaller than natural proteins and, for example, can be obtained synthetically. Due to their amino acid sequences, they can be assigned to the relevant complete proteins. For example, they may adopt the same structures or perform proteolytic or partial activities, such as the complexation of a substrate. Fragments and deletion variants of starting proteins are in principle similar; while fragments tend to be smaller fragments, the deletion mutants tend to lack only short regions, and thus only individual subfunctions.
Unter Chimären oder hybriden Proteinen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine zu verstehen, deren Sequenz die Sequenzen oder Teilsequenzen von mindestens zwei Ausgangsproteinen umfasst. Die Ausgangsproteine können diesbezüglich aus verschiedenen oder aus demselben Organismus stammen. Chimäre oder hybride Proteine können beispielsweise durch Rekombinationsmutagenese erhalten werden. Der Sinn einer solchen Rekombination kann beispielsweise darin bestehen, mithilfe des heranfusionierten Proteinteils eine bestimmte enzymatische Funktion herbeizuführen oder zu modifizieren. Es ist dabei im Sinne der vorliegenden Erfindung unwesentlich, ob solch ein chimäres Protein aus einer einzelnen Polypeptidkette oder mehreren Untereinheiten besteht, auf weiche sich unterschiedliche Funktionen verteilen können.For the purposes of the present application, chimeras or hybrid proteins are to be understood as meaning those proteins whose sequence comprises the sequences or partial sequences of at least two starting proteins. The source proteins may be derived from different or from the same organism. Chimeric or hybrid proteins may be obtained, for example, by recombinant mutagenesis. For example, the purpose of such recombination may be to induce or modify a particular enzymatic function using the fused protein portion. For the purposes of the present invention, it is irrelevant whether such a chimeric protein consists of a single polypeptide chain or several subunits on which different functions can be distributed.
Unter durch Insertionsmutation erhaltene Proteine sind solche Varianten zu verstehen, die durch Einfügen eines Proteinfragments in die Ausgangssequenzen erhalten worden sind. Sie sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den Chimären Proteinen zuzuordnen. Sie unterscheiden sich von jenen lediglich im Größenverhältnis des unveränderten Proteinteils zur Größe des gesamten Proteins. In solchen insertionsmutierten Proteinen ist der Anteil an Fremdprotein geringer als in Chimären Proteinen.By proteins obtained by insertion mutation are meant those variants obtained by inserting a protein fragment into the starting sequences. They are due to their principle similarity to the chimeric proteins. They differ from those only in the size ratio of the unchanged protein part to the size of the entire protein. In such insertionsmutierten proteins, the proportion of foreign protein is lower than in chimeric proteins.
Inversionsmutagenese, also eine partielle Sequenzumkehrung, kann als Sonderform sowohl der Deletion, als auch der Insertion angesehen werden. Dasselbe gilt für eine von der ursprünglichen Aminosäureabfolge abweichende Neugruppierung verschiedener Molekülteile. Sie kann sowohl als Deletionsvariante, als Insertionsvariante, als auch als Shuffling-Variante des ursprünglichen Proteins angesehen werden.Inversion mutagenesis, ie a partial sequence reversal, can be regarded as a special form of both the deletion and the insertion. The same applies to a new grouping of different parts of the molecule which deviates from the original amino acid sequence. It can be regarded as a deletion variant, as an insertion variant, as well as a shuffling variant of the original protein.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt eine Protease dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Protease als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 266 und zunehmend bevorzugt mindestens 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 und 50 zusammenhängenden Aminosäurepositionen mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.A further subject of the invention is a protease which is characterized in that it is obtainable from a protease according to the invention as the starting molecule by fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis and comprises an amino acid sequence which is over a length of at least 266 and increasingly preferred at least 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 and 50 contiguous amino acid positions matches the parent molecule.
So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren ohne dass dadurch die proteolytische Aktivität verlorengeht. Durch derartige Deletionen kann beispielsweise oftmals auch die Allergenizität betreffender Proteasen gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden. Die Fragmentierung kommt dem Aspekt der Insertions- oder Substitutionsmutagenese und/oder auch einer möglichen Fusion mit anderen Enzymen zugute. Hinsichtlich des beabsichtigten Einsatzes dieser Enzyme ist es besonders bevorzugt, wenn sie auch nach der Fragmentierung oder Deletionsmutagenese eine proteolytische Aktivität besitzen.Thus it is possible, for example, to delete individual amino acids at the termini or in the loops of the enzyme without thereby losing the proteolytic activity. Such deletions, for example, can often also reduce the allergenicity of proteases in question and thus improve their overall applicability. Fragmentation benefits the aspect of insertion or substitution mutagenesis and / or possible fusion with other enzymes. With regard to the intended use of these enzymes, it is particularly preferred if they also have a proteolytic activity after fragmentation or deletion mutagenesis.
Auch Insertionen und Substitionen können voteilhafte Wirkungen begründen. Prinzipiell gehören hierzu auch Einzelaustausche von Aminosäuren, es können aber auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren gegen andere ausgetauscht werden. Hierzu gehören auch Neukombinationen von größeren Enzymabschnitten mit anderen Proteasen oder Proteinen anderer Funktion. So ist es beispielsweise möglich, ein erfindungsgemäßes Protein oder Teile davon über peptidische Linker oder direkt als Fusionsprotein mit Bindungsdomänen aus anderen Proteinen, etwa der Cellulose-Bindungsdomäne, zu versehen und dadurch die Hydrolyse des Substrats effektiver zu gestalten. Ebenso können erfindungsgemäße Proteine beispielsweise auch mit Amylasen oder Cellulasen verknüpft werden, um eine Doppelfunktion auszuüben.Insertions and substitutions can also give positive results. In principle, this also includes single substitutions of amino acids, but it can also be several contiguous amino acids exchanged for others. This also includes recombinations of larger enzyme sections with other proteases or proteins of other functions. Thus, for example, it is possible to provide a protein of the invention or parts thereof via peptidic linkers or directly as a fusion protein with binding domains of other proteins, such as the cellulose-binding domain, and thereby make the hydrolysis of the substrate more effective. Likewise, proteins according to the invention can also be linked with amylases or cellulases, for example, in order to perform a dual function.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt eine Protease dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Protease als Ausgangsmolekül erhaltbar ist und einen oder mehrere Aminosäureaustausche in Positionen aufweist, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO.3 in einem Alignment zugeordnet sind. Die Aminosäurepositionen werden hierbei durch ein Alignment der Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen Protease mit der Aminosäuresequenz der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus, wie sie in SEQ ID NO.3 angegeben ist, zugeordnet. Auf diese Art und Weise werden so genannte homologe Positionen bestimmt. Ein Beispiel für ein solches Alignment ist in Figur 1 angegeben.A further subject of the invention is a protease, which is characterized in that it is obtainable from a protease according to the invention as the starting molecule and has one or more amino acid substitutions in positions which correspond to the positions 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 224, 229, 236, 237, 242 , 243, 255 and 268 of the Bacillus lentus alkaline protease according to SEQ ID NO. 3 in an alignment. The amino acid positions are hereby assigned by an alignment of the amino acid sequence of a protease according to the invention with the amino acid sequence of the alkaline protease from Bacillus lentus, as indicated in SEQ ID NO. In this way, so-called homologous positions are determined. An example of such an alignment is given in FIG.
Eine endgültige Bestätigung in der Zuordnung homologer Positionen, d.h. insbesondere deren funktionelle Entsprechung, können letztlich nur Vergleichsversuche liefern, wonach die beiden auf der Basis eines Alignments einander zugeordneten Positionen in beiden miteinander verglichenen Proteasen auf die gleiche Weise punktmutiert werden und beobachtet wird, ob bei beiden die enzymatische Aktivität auf gleiche Weise verändert wird. Geht beispielsweise ein Aminosäure- austausch in einer bestimmten Position der Bacillus lentus-Alkalische Protease (BLAP) mit einer Erhöhung von KM oder einem anderen enzymatischen Parameter einher, und wird tendenziell die gleiche Verschiebung des KM-Werts in einer erfindungsgemäßen Protease-Variante beobachtet, deren Aminosäureaustausch durch dieselbe eingeführte Aminosäure erreicht wurde, so ist hierin die Bestätigung dieses Erfindungsaspekts zu sehen.A final confirmation in the assignment of homologous positions, ie in particular their functional correspondence, can ultimately only provide comparative experiments, according to which the two positions assigned to each other on the basis of an alignment in both compared proteases are point mutated in the same way and observed whether in both the enzymatic activity is changed in the same way. For example, if an amino acid exchange in a particular position of the Bacillus lentus alkaline protease (BLAP) with an increase of K M or another enzymatic parameter is accompanied, and the same shift of the K M value in a protease variant according to the invention is tended to be observed, their amino acid exchange by the same Introduced amino acid has been achieved, so here is the confirmation of this aspect of the invention to see.
Da die Bacillus lentus-Alkalische Protease im Stand der Technik ein wichtiges Referenzmolekül zur Beschreibung neuer Proteasen und von Punktmutationen darstellt und die hier beschriebenen neuen Proteasen und somit auch ihre Sequenz bislang unbekannt sind, erscheint es vorteilhaft, in der Zuordnung der Punktmutationen auf die Zählung der Alkalische Protease aus Bacillus lentus (SEQ ID NO. 3) Bezug zu nehmen. Weiterhin richtet sich die Zählung im Allgemeinen nach dem reifen (maturen) Protein. Vorteilhafte Positionen für Sequenzveränderungen, beispielsweise durch Punktmutationen, der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus, die übertragen auf homologe Positionen der erfindungsgemäßen Proteasen bevorzugt von Bedeutung sind und der Protease vorteilhafte funktionelle Eigenschaften verleihen, werden nachfolgend angegeben. Es sind die Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268, zuzuordnen in einem Alignment mit SEQ ID NO. 3 und damit in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 3. Vorteilhaft sind insbesondere beispielsweise Substitutionen 3T, 4I, 61A, 99G, 99A, 99S, 154D, 154E, 21 1 D, 211G und 211 E, sofern die entsprechend homologen Positionen nicht schon natürlicherweise von einer dieser bevorzugten Aminosäuren eingenommen werden.Since the Bacillus lentus alkaline protease in the prior art is an important reference molecule for the description of new proteases and point mutations and the novel proteases described here and thus also their sequence are unknown, it seems advantageous in the assignment of point mutations on the count of Alkaline protease from Bacillus lentus (SEQ ID NO: 3). Furthermore, the count generally depends on the mature (mature) protein. Advantageous positions for sequence alterations, for example by point mutations, of the Bacillus lentus alkaline protease, which are preferably important in transferring to homologous positions of the proteases of the invention and confer advantageous functional properties on the protease, are given below. They are the positions 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 and 268, to be assigned in an alignment with SEQ ID NO. 3 and thus in the count according to SEQ ID NO. 3. Particularly advantageous are, for example, substitutions 3T, 4I, 61A, 99G, 99A, 99S, 154D, 154E, 211D, 211G and 211E, provided that the correspondingly homologous positions are not naturally taken up by one of these preferred amino acids.
In den genannten Positionen liegen in dem Wildtypmolekül der Bacillus lentus-Alkalischen Protease folgende Aminosäurereste: S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61 , T69, E87, A96, R99, A101 , 1102, S104, N114, H118, A120, S130, S139, T141 , S142, S154, S157, A188, V193, V199, G205, L211 , A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255 beziehungsweise T268.In said positions, the Bacillus lentus alkaline protease wildtype molecule has the following amino acid residues: S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61, T69, E87, A96, R99, A101, 1102, S104, N114, H118, A120 , S130, S139, T141, S142, S154, S157, A188, V193, V199, G205, L211, A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255 and T268, respectively.
Die Austausche 3T und 4I führen vermutlich über einen Stabilisierungseffekt auf das Molekül zu einer Verbesserung dessen Beitrags zur Wasch leistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels.Substitutions 3T and 4I presumably have a stabilizing effect on the molecule to improve its contribution to the washing performance of a detergent or cleaner.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die erfindungsgemäße Protease dadurch gekennzeichnet, dass sie derivatisiert ist. Bevorzugt weist sie mindestens eine chemische Modifikation auf. Eine solche Protease wird als Derivat bezeichnet.In a further embodiment of the invention, the protease according to the invention is characterized in that it is derivatized. Preferably, it has at least one chemical modification. Such a protease is called a derivative.
Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Bevorzugt handelt es sich um eine kovalente Modifikation, jedoch kann auch eine nichtkovalente Modifikation gegeben sein. Derartige Modifikationen können beispielsweise die Stabilität, Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat oder die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sie können auch dazu dienen, um die Allergenizität und/oder Immunogenizität des Proteins herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen.For the purposes of the present application, derivatives are understood as meaning those proteins whose pure amino acid chain has been chemically modified. It is preferably a covalent modification, but may also be given a non-covalent modification. Such modifications may affect, for example, stability, substrate specificity, or binding strength to the substrate or enzymatic activity. They can also serve to reduce the allergenicity and / or immunogenicity of the protein and thus, for example, increase its skin compatibility.
Solche Modifikationen können beispielsweise biologisch im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch die Wirtszelle erfolgen. Diesbezüglich sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben. Auch können hierfür molekularbiologische Methoden eingesetzt werden.For example, such modifications may be made biologically in the context of protein biosynthesis by the host cell. In this regard, couplings of low molecular weight compounds such as lipids or oligosaccharides are particularly noteworthy. Also molecular biological methods can be used for this purpose.
Modifikationen können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein, beispielsweise die Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts. Bei einer solchen Verbindung kann es sich aber beispielsweise auch um Makromoleküle, darunter andere Proteine, handeln, die beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen (sogenannte „Linker") an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden.However, modifications may also be made chemically, such as by the chemical transformation of a side chain of an amino acid or by covalent attachment of another compound to the protein, for example the coupling of amines to carboxyl groups of an enzyme to alter the isoelectric point. However, such a compound can also be, for example, macromolecules, including other proteins, which are bound, for example via bifunctional chemical compounds (so-called "linkers"), to proteins according to the invention.
So ist es beispielsweise möglich, ein erfindungsgemäßes Protein mit einer spezifischen Bindungsdomäne zu versehen. Solche Derivate eignen sich besonders für den Einsatz in in Wasch- oder Reinigungsmitteln. Ferner können auch Protease-Inhibitoren, optional über Linker, insbesondere Aminosäure-Linker, an ein erfindungsgemäßes Protein gebunden werden. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Kopplungen mit sonstigen makromolekularen Verbindungen, wie etwa Polyethylenglykol, können ein erfindungsgemäßes Protein auch hinsichtlich weiterer Eigenschaften wie Stabilität oder Hautverträglichkeit verbessern.For example, it is possible to provide a protein of the invention with a specific binding domain. Such derivatives are particularly suitable for use in detergents or cleaners. Furthermore, protease inhibitors, optionally via linkers, in particular amino acid linkers, can also be bound to a protein according to the invention. This can be useful, for example, for the period of storage. Couplings with other macromolecular compounds, such as polyethylene glycol, can also improve a protein of the invention for other properties, such as stability or skin tolerance.
Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen, genauso wie auch ein nichtkovalenter Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen.Also, derivatization is understood to mean covalent attachment to a macromolecular carrier, as well as noncovalent inclusion in suitable macromolecular cage structures.
Unter einem Derivat kann im weiteren Sinne auch eine Präparation des Proteins verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit bestimmten anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, dass es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine proteolytische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe gesteuert werden. Insbesondere die gemeinsame Präparation von Proteasen mit Protease-Inhibitoren ist vorteilhaft.A derivative can also be understood in a broader sense to mean a preparation of the protein. Depending on the extraction, processing or preparation, a protein may be associated with various other substances, for example from the culture of the producing microorganisms. A protein may also have been deliberately added to certain other substances, for example to increase its storage stability. Therefore, all preparations of a protein according to the invention are also according to the invention. This is also independent of whether or not it actually exhibits this enzymatic activity in a particular preparation. Because it can be desired be that it has little or no activity during storage, and only at the time of use unfolds its proteolytic function. This can be controlled, for example, via appropriate accompanying substances. In particular, the joint preparation of proteases with protease inhibitors is advantageous.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine zuvor beschriebene Protease, die zusätzlich stabilisiert ist, insbesondere durch Kopplung an ein Polymer.A further preferred embodiment of the invention is a protease described above, which is additionally stabilized, in particular by coupling to a polymer.
Denn eine Erhöhung der Stabilität bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozess führt dazu, daß ihre Aktivität länger anhält und damit in der Wirkung verstärkt wird. Als Stabilisierungsmöglichkeiten kommen alle im Stand der Technik beschriebenen und zweckmäßigen Strategien in Betracht.For an increase in the stability during storage and / or during use, for example during the washing process means that their activity lasts longer and is thus enhanced in the effect. Possible stabilization options are all suitable strategies described in the prior art.
Alternativ hierzu sind auch solche Stabilisierungen geeignet, die über Punktmutagenese des Moleküls selbst möglich sind (und aufgrund der Sequenzunterschiede bereits unter die oben beschriebenen Ausführungsformen fallen). Denn diese Stabilisierungen erfordern im Anschluß an die Proteingewinnung keine weiteren Arbeitsschritte. Einige hierfür geeignete Punktmutationen sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt. So können Proteasen beispielsweise auch dadurch stabilisiert werden, dass man bestimmte Tyrosin-Reste gegen andere austauscht.Alternatively, those stabilizations are also suitable which are possible by means of point mutagenesis of the molecule itself (and because of the sequence differences already fall under the embodiments described above). Because these stabilizations require after the protein recovery no further steps. Some point mutations suitable for this purpose are known per se from the prior art. For example, proteases can also be stabilized by replacing certain tyrosine residues with others.
Weitere Möglichkeiten sind beispielsweise:Other options include:
- Veränderung der Bindung von Metallionen, insbesondere der Calcium-Bindungsstellen, beispielsweise durch Austauschen von einer oder mehreren der an der Calcium-Bindung beteiligten Aminosäuren gegen eine oder mehrere negativ geladene Aminosäuren und/oder durch Einführen von Punktmutationen in mindestens einer der Folgen der beiden Aminosäuren Arginin/Glycin;Changing the binding of metal ions, in particular the calcium binding sites, for example by exchanging one or more of the amino acids involved in the calcium binding for one or more negatively charged amino acids and / or introducing point mutations in at least one of the sequences of the two amino acids arginine / glycine;
- Schutz gegen den Einfluß von denaturierenden Agentien wie Tensiden durch Mutationen, die eine Veränderung der Aminosäuresequenz auf bzw. an der Oberfläche des Proteins bewirken;Protection against the influence of denaturing agents, such as surfactants, on mutations causing an alteration of the amino acid sequence on or at the surface of the protein;
- Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die vermutlich über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten.Replacement of amino acids located near the N-terminus against those likely to contact non-covalent interactions with the rest of the molecule, thus contributing to the maintenance of the globular structure.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen das Molekül auf mehrere Arten stabilisiert wird. Denn es kann davon ausgegangen werden, dass mehrere stabilisierende Mutationen additiv oder synergistisch wirken. Die Lösung einer Teilaufgabe und somit einen eigenständigen Erfindungsgegenstand bilden Nukleinsäuremoleküle, die für eine erfindungsgemäße Protease kodieren sowie Vektoren, enthaltend solche Nukleinsäuremoleküle.Preferred embodiments are those in which the molecule is stabilized in several ways. Because it can be assumed that several stabilizing mutations act additive or synergistic. The solution of a partial task and thus an independent subject of the invention form nucleic acid molecules which code for a protease according to the invention as well as vectors containing such nucleic acid molecules.
Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen kodieren. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Als der natürlicherweise dauerhaftere Informationsträger ist die Nukleinsäure DNA für molekularbiologische Arbeiten bevorzugt. Demgegenüber wird für die Realisierung der Erfindung in natürlicher Umgebung, wie beispielsweise in einer die Nukleinsäure exprimierenden Zelle, eine RNA gebildet, weshalb entsprechende RNA-Moleküle ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.For the purposes of the present application, nucleic acids are understood to mean the molecules which are naturally constructed from nucleotides and serve as information carriers, which code for the linear amino acid sequence in proteins or enzymes. They can be present as a single strand, as a single strand that is complementary to this single strand, or as a double strand. As the naturally more durable information carrier, the nucleic acid DNA is preferred for molecular biology work. In contrast, for the realization of the invention in natural environment, such as in a nucleic acid expressing cell, an RNA is formed, which is why corresponding RNA molecules are also embodiments of the present invention.
Bei DNA sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codon-Triplets für dieselben Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäure-Abfolge von mehreren unterschiedlichen und möglicherweise nur geringe Identität aufweisenden Nukleotid- sequenzen abgeleitet werden kann, was als Degeneriertheit des genetischen Codes bezeichnet wird. Außerdem weisen verschiedene Organismen Unterschiede im Gebrauch dieser Codons auf. Aus diesen Gründen müssen sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleotidsequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen werden. Daher sind sämtliche Nukleotidsequenzen in die Erfindung mit eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Proteasen kodieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleotidsequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind.For DNA, consider the sequences of both complementary strands in all three possible reading frames. Further, it should be appreciated that different codon triplets may encode the same amino acids so that a particular amino acid sequence may be derived from a plurality of different and possibly low identity nucleotide sequences, which is referred to as the degeneracy of the genetic code. In addition, various organisms have differences in the use of these codons. For these reasons, both amino acid sequences and nucleotide sequences must be included in the consideration of the scope. Therefore, all nucleotide sequences are included in the invention which can encode any of the proteases described above. The skilled person is able to determine these nucleotide sequences beyond doubt, because despite the degeneracy of the genetic code individual codons defined amino acids are assigned.
Die einem Protein entsprechende Informationseinheit wird im Sinne der vorliegenden Anmeldung auch als Gen bezeichnet.The information unit corresponding to a protein is also referred to as gene within the meaning of the present application.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3. Edition CoId Spring Laboratory Press, bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül, das für eine erfindungsgemäße Protease kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass es zu der in SEQ ID NO.1 angegebenen Nukleinsäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 78,5%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 99,25% identisch ist.A person skilled in the art will be able to produce the corresponding nucleic acids by methods known today, such as, for example, chemical synthesis or polymerase chain reaction (PCR) in combination with molecular biological and / or proteinchemical standard methods, using known DNA and / or amino acid sequences. Such methods are known, for example, from Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition CoId Spring Laboratory Press. In a preferred embodiment of the invention, the nucleic acid molecule which codes for a protease according to the invention is characterized in that it is increasingly preferably at least 78.5%, 80%, 82.5%, 85% to the nucleic acid sequence indicated in SEQ ID NO %, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97% , 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, and most preferably 99.25%.
Bevorzugt sind solche Nukleinsäuren, die für reife (mature) Proteine codieren, und zunehmend bevorzugt sind besonders solche, die für zunehmend aktive Varianten der erfindungsgemäßen Proteine codieren.Preference is given to those nucleic acids which code for mature proteins, and those which code for increasingly active variants of the proteins according to the invention are increasingly preferred.
Weiterhin bevorzugt sind solche Nukleinsäuren, von denen eines oder vorzugsweise mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt worden sind.Further preferred are those nucleic acids of which one or preferably several codons have been replaced by synonymous codons.
Dieser Aspekt bezieht sich auf die heterologe Expression der betreffenden Proteasen. So besitzt jeder Organismus, insbesondere jeder Produktionsstamm, eine gewisse Codon-Usage. Hierbei kann es zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der transgenen Nukleinsäure liegenden Codons in der Wirtszelle einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNAs gegenüberstehen. Synonyme Codons codieren dagegen für dieselben Aminosäuren und können in Abhängigkeit vom Wirt besser translatiert werden. Dieses gegebenenfalls notwendige Umschreiben hängt somit ab von der Wahl des Expressionssystems. Insbesondere bei Proben aus unbekannten, eventuell nicht kultivierbaren Organismen kann eine entsprechende Anpassung notwendig sein.This aspect relates to the heterologous expression of the proteases in question. Thus every organism, in particular every production strain, has a certain codon usage. This can lead to bottlenecks in protein biosynthesis, if the lying on the transgenic nucleic acid codons in the host cell of a relatively small number of loaded tRNAs face. Synonymous codons encode the same amino acids and can be better translated depending on the host. This possibly necessary rewriting thus depends on the choice of the expression system. Especially with samples from unknown, possibly non-cultivable organisms, a corresponding adaptation may be necessary.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Herstellung rekombinanter Proteine. Hierunter sind erfindungsgemäß alle gentechnischen oder mikrobiologischen Verfahren zu verstehen, die darauf beruhen, dass die Gene für die interessierenden Proteine in eine für die Produktion geeignete Wirtszelle eingebracht und von dieser transkribiert und translatiert werden. Geeigneterweise erfolgt die Einschleusung der betreffenden Gene über Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren; aber auch über solche, die bewirken, dass das interessierende Gen in der Wirtszelle in ein bereits vorhandenes genetisches Element wie das Chromosom oder andere Vektoren eingefügt werden kann. Die funktionelle Einheit aus Gen und Promotor und eventuellen weiteren genetischen Elementen wird als Expressionskassette bezeichnet. Sie muss jedoch nicht notwendigerweise auch als physische Einheit vorliegen.The present invention involves the production of recombinant proteins. According to the invention, these are to be understood as meaning all genetic engineering or microbiological processes which are based on the genes for the proteins of interest being introduced into a suitable host cell for the production and being transcribed and translated by it. Suitably, the introduction of the relevant genes via vectors, in particular expression vectors; but also those that cause the gene of interest in the host cell to be inserted into an already existing genetic element, such as the chromosome or other vectors. The functional unit of gene and promoter and any other genetic elements is called an expression cassette. However, it does not necessarily have to exist as a physical entity.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich ein interessierendes Gen bzw. Nukleinsäuremolekül enthalten. Sie vermögen dieses in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkuläre genetische Elemente.For the purposes of the present invention, vectors are understood as consisting of nucleic acids which contain a gene or nucleic acid molecule of interest as a characteristic nucleic acid region. You can do this in a species or cell line to establish multiple generations or cell divisions as a stable genetic element. Vectors, especially when used in bacteria, are special plasmids, ie circular genetic elements.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure geeigneterweise in einen Vektor kloniert. Ein weiterer molekularbiologischer Aspekt der Erfindung besteht somit in Vektoren mit den Genen für die entsprechenden Proteine. Dazu können beispielsweise solche gehören, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Viren oder von Bacteriophagen ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Es ist dabei im Sinne der Erfindung unerheblich, ob sie sich extrachomosomal als eigene Einheiten etablieren oder in ein Chromosom bzw. chromosomale DNA integrieren. Welches der zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Systeme gewählt wird, hängt vom Einzelfall ab. Ausschlaggebend können beispielsweise die erreichbare Kopienzahl, die zur Verfügung stehenden Selektionssysteme, darunter vor allem Antibiotikaresistenzen, oder die Kultivierbarkeit der zur Aufnahme der Vektoren befähigten Wirtszellen sein.In the context of the present invention, the nucleic acid is suitably cloned into a vector. Another molecular biological aspect of the invention thus consists in vectors with the genes for the corresponding proteins. These may include, for example, those derived from bacterial plasmids, viruses or bacteriophages, or predominantly synthetic vectors or plasmids with elements of various origins. With the other genetic elements present in each case, vectors are able to establish themselves as stable units in the relevant host cells over several generations. It is irrelevant in the context of the invention whether they establish themselves as extrachomosomal units or integrate into a chromosome or chromosomal DNA. Which of the numerous systems known from the prior art is chosen depends on the individual case. Decisive factors may be, for example, the achievable copy number, the selection systems available, in particular antibiotic resistances, or the cultivability of the host cells capable of accepting the vectors.
Die Vektoren bilden geeignete Ausgangspunkte für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins und für erfindungsgemäße Weiterentwicklungen und letztlich für die Amplifikation und Produktion erfindungsgemäßer Proteine.The vectors form suitable starting points for molecular biological and biochemical investigations of the relevant gene or protein and for further developments according to the invention and ultimately for the amplification and production of proteins according to the invention.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Vektoren dar, die mindestens ein Nukleinsäuremolekül beinhalten, welches für eine erfindungsgemäße Protease kodiert, insbesondere ein Nukleinsäuremolekül, wie es vorstehend beschrieben ist. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Vektor dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor ist. Klonierungsvektoren eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifikation oder der Selektion des interessierenden Gens für die Charakterisierung des betreffenden Gens, etwa über das Erstellen einer Restriktionskarte oder die Sequenzierung. Klonierungsvektoren sind auch deshalb bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, weil sie eine transportierbare und lagerfähige Form der beanspruchten DNA darstellen. Sie sind auch bevorzugte Ausgangspunkte für molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion.A further aspect of the invention thus provides vectors which contain at least one nucleic acid molecule which codes for a protease according to the invention, in particular a nucleic acid molecule as described above. In a further embodiment of the invention, the vector is characterized in that the vector is a cloning vector or an expression vector. Cloning vectors are suitable in addition to the storage, the biological amplification or the selection of the gene of interest for the characterization of the gene in question, such as the creation of a restriction map or sequencing. Cloning vectors are also preferred embodiments of the present invention because they are a transportable and storable form of the claimed DNA. They are also preferred starting points for molecular biology techniques that are not bound to cells, such as the polymerase chain reaction.
Expressionsvektoren sind chemisch den Klonierungsvektoren ähnlich, unterscheiden sich aber in jenen Teilsequenzen, die sie dazu befähigen, in den für die Produktion von Proteinen vorgesehenen Wirtszellen oder Wirtsorganismen zu replizieren und dort das enthaltene Gen zur Expression zu bringen, d.h. die genetische Information des interessierenden Gens in der Wirtszelle als Protein zu realisieren. Bevorzugte Ausführungsformen sind Expressionsvektoren, die selbst die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen. Die Expression wird beispielsweise von Promotoren beeinflußt, welche die Transkription des Gens regulieren. So kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch nach gentechnischer Fusion sowohl durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle als auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle.Expression vectors are chemically similar to the cloning vectors, but differ in those partial sequences that enable them to be used for the production of proteins provided host cells or host organisms to replicate and there to bring the gene contained expression, ie to realize the genetic information of the gene of interest in the host cell as a protein. Preferred embodiments are expression vectors which themselves carry the genetic elements necessary for expression. The expression is influenced, for example, by promoters which regulate the transcription of the gene. Thus, expression may be by the natural promoter originally located upstream of this gene, but also by genetic engineering, both by a host cell promoter provided on the expression vector and by a modified or completely different promoter from another organism or host cell.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche Expressionsvektoren, die über Änderungen der Kulturbedingungen oder Zugabe von bestimmten Verbindungen, wie beispielsweise die Zelldichte oder spezielle Faktoren, regulierbar sind, beispielsweise induzierbare Vektoren. Expressionsvektoren ermöglichen, dass das zugehörige Protein heterolog, also in einer anderen Zelle bzw. Wirtszelle als derjenigen, aus der es natürlicherweise gewonnen werden kann, produziert wird. Die Zellen können dabei durchaus zu verschiedenen Organismen zugehörig sein oder von verschiedenen Organismen stammen. Auch eine homologe Proteingewinnung aus einer das Gen natürlicherweise exprimierenden Wirtszelle über einen passenden Vektor liegt innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Diese kann den Vorteil aufweisen, dass natürliche, mit der Translation in einem Zusammenhang stehende Modifikationsreaktionen an dem entstehenden Protein genauso durchgeführt werden, wie sie auch natürlicherweise ablaufen würden.Preferred embodiments are those expression vectors which are regulatable via changes in culture conditions or addition of certain compounds, such as cell density or specific factors, for example inducible vectors. Expression vectors allow the associated protein to be produced heterologously, that is in a cell or host cell other than that from which it can naturally be obtained. The cells may well belong to different organisms or come from different organisms. Also, homologous protein recovery from a gene cell naturally expressing the gene via an appropriate vector is within the scope of the present invention. This may have the advantage that natural translational-related modification reactions on the resulting protein are performed exactly as they would naturally occur.
Eine weitere Ausführungsform stellen Expressionssysteme dar, bei denen zusätzliche Gene, beispielsweise solche, die auf anderen Vektoren zur Verfügung gestellt werden, die Produktion erfindungsgemäßer Proteine beeinflussen. Hierbei kann es sich um modifizierende Genprodukte handeln oder um solche, die mit dem erfindungsgemäßen Protein gemeinsam aufgereinigt werden sollen, etwa um dessen enzymatische Funktion zu beeinflussen. Dabei kann es sich beispielsweise um andere Proteine oder Enzyme, um Inhibitoren oder um solche Elemente handeln, die die Wechselwirkung mit verschiedenen Substraten beinflussen.A further embodiment represents expression systems in which additional genes, for example those which are provided on other vectors, influence the production of proteins according to the invention. These may be modifying gene products or those which are to be purified together with the protein according to the invention, for example in order to influence its enzymatic function. These may be, for example, other proteins or enzymes, inhibitors or elements that influence the interaction with various substrates.
Alternative Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Derartige Expressionssysteme sind im Stand der Technik ebenfalls etabliert.Alternative embodiments of the present invention may also be cell-free expression systems in which protein biosynthesis is understood in vitro. Such expression systems are also established in the art.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Protease beinhaltet oder die zu deren Herstellung angeregt werden kann, vorzugsweise unter Einsatz eines Expressionsvektors. Die in-vivo-Synthese eines erfindungsgemäßen Enzyms, also die durch lebende Zellen, erfordert den Transfer des zugehörigen Gens in eine Wirtszelle, deren sogenannte Transformation. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor und/oder dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Häufig müssen aus der Fülle an verschiedenen im Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systemen die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermittelt werden. Jedes erfindungsgemäße Protein kann auf diese Weise aus einer Vielzahl von Wirtszellen gewonnen werden. Auch solche Wirtszellen sind bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie nach Transformation mit einem der oben beschriebenen Vektoren erhalten worden sind. Dabei kann es sich beispielsweise auch um Klonierungsvektoren handeln, die zur Lagerung und/oder Modifikation beispielsweise in einen beliebigen Bakterienstamm oder eine andere erfindungsgemäße Wirtszelle eingebracht worden sind. Solche Schritte sind in der Lagerung und in der Weiterentwicklung betreffender genetischer Elemente allgemein verbreitet. Da aus diesen Wirtszellen die betreffenden genetischen Elemente in nachfolgende, zur Expression geeignete Wirtszellen unmittelbar übertragen werden können, handelt es sich auch bei den vorangegangenen Transformationsprodukten um Verwirklichungen des betreffenden Erfindungsgegenstands.A further subject of the invention is a non-human host cell which contains a protease according to the invention or which can be excited to produce it, preferably using an expression vector. The in vivo synthesis of an enzyme according to the invention, ie by living cells, requires the transfer of the associated gene into a host cell, the so-called transformation thereof. In principle, all cells, that is to say prokaryotic or eukaryotic cells, are suitable as host cells. Preference is given to those host cells which can be handled genetically advantageously, for example, the transformation with the expression vector and / or its stable establishment, for example, unicellular fungi or bacteria. In addition, preferred host cells are characterized by good microbiological and biotechnological handling. This concerns, for example, easy culturing, high growth rates, low demands on fermentation media and good production and secretion rates for foreign proteins. Frequently, the optimal expression systems for the individual case must be determined experimentally from the abundance of different systems available in the prior art. Each protein of the invention can be obtained in this way from a variety of host cells. Also, those host cells are preferred, which are characterized in that they have been obtained after transformation with one of the vectors described above. These may, for example, also be cloning vectors which have been introduced for storage and / or modification, for example in any bacterial strain or another host cell according to the invention. Such steps are common in the storage and further development of related genetic elements. Since the relevant genetic elements can be directly transferred from these host cells into subsequent host cells suitable for expression, the preceding transformation products are also realizations of the subject matter of the invention.
Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Expressionsvektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Proteine.Preferred embodiments represent such host cells, which are regulatable in their activity due to genetic regulatory elements which are provided, for example, on the expression vector, but may also be present in these cells from the outset. For example, by controlled addition of chemical compounds that serve as activators, by changing the culture conditions or when reaching a specific cell density, these can be excited for expression. This allows a very economical production of the proteins of interest.
Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich gegenüber Eukaryonten in der Regel durch kürzere Generationszeiten und geringere Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren zur Gewinnung erfindungsgemäßer Proteine etabliert werden. Bei gram-negativen Bakterien, wie beispielsweise Escherichia coli (E. coli), werden eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Grampositive Bakterien, wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales, besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium abgegeben werden, aus welchem sich nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine direkt aufreinigen lassen.Preferred host cells are prokaryotic or bacterial cells. As a rule, bacteria are distinguished from eukaryotes by shorter generation times and lower demands on culturing conditions. As a result, cost-effective methods for obtaining proteins according to the invention can be established. In Gram-negative bacteria, such as Escherichia coli (E. coli), a large number of proteins are secreted into the periplasmic space, ie into the compartment between the two membranes enclosing the cells. This can be advantageous for special applications. Gram-positive bacteria, such as Bacilli or Actinomycetes or other representatives of Actinomycetales, in contrast, have no outer membrane, so that secreted proteins are released immediately into the nutrient medium surrounding the cells, from which, according to a further preferred embodiment, the expressed proteins according to the invention can be purified directly.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellen somit Wirtszellen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine erfindungsgemäße Protease in das die Wirtszelle umgebende Medium sezernieren.A further embodiment of the invention thus represents host cells which are characterized in that they secrete a protease according to the invention into the medium surrounding the host cell.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, insbesondere eines, welches ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas.In a further preferred embodiment, the host cell according to the invention is characterized in that it is a bacterium, in particular one which is selected from the genera of Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas and Pseudomonas.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Wirtszelle um ein Bakterium, welches ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii gibsonii, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.Particularly preferably, the host cell is a bacterium which is selected from the group of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii gibsonii, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor and Stenotrophomonas maltophilia.
Die Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere um solche Wirtszellen handeln, die zusätzlich zu dem erfindungsgemäß hergestellten Protein noch weitere, insbesondere wirtschaftlich interessante Proteine exprimieren.The host cells may be altered in their culture conditions requirements, have different or additional selection markers, or express other or additional proteins. In particular, these may be those host cells which, in addition to the protein produced according to the invention, also express further, in particular economically interesting, proteins.
Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt.The host cell may also be a eukaryotic cell, which is characterized in that it has a cell nucleus. A further subject of the invention therefore represents a host cell, which is characterized in that it has a cell nucleus.
Im Gegensatz zu prokaryontischen Zellen sind eukaryontische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen, kann vorteilhaft sein. Ferner können sich beispielsweise thermophile pilzliche Expressionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger Varianten eignen.In contrast to prokaryotic cells, eukaryotic cells are capable of post-translationally modifying the protein formed. Examples thereof are fungi such as Actinomycetes or yeasts such as Saccharomyces or Kluyveromyces. This may be particularly advantageous, for example, if the proteins are to undergo specific modifications in the context of their synthesis that enable such systems. Modifications that eukaryotic systems perform, especially in connection with protein synthesis, include, for example, the binding of low molecular weight compounds such as membrane anchors or oligosaccharides. such Oligosaccharide modifications may be desirable, for example, to reduce allergenicity. Also, coexpression with the enzymes naturally produced by such cells, such as cellulases, may be advantageous. Furthermore, for example, thermophilic fungal expression systems may be particularly suitable for the expression of temperature-resistant variants.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in an sich bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig Produkt aus dem Medium entnommen werden kann.The host cells according to the invention are cultured and fermented in a manner known per se, for example in discontinuous or continuous systems. In the first case, a suitable nutrient medium is inoculated with the host cells and the product is harvested from the medium after an experimentally determined period of time. Continuous fermentations are characterized by achieving a flow equilibrium in which over a relatively long period of time cells partly die off but also regrow and at the same time product can be removed from the medium.
Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, beispielsweise des rekombinanten Proteins. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem der oben ausgeführten Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Proteine beruhen, stellen entsprechend bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.Fermentation processes are known per se from the prior art and represent the actual large-scale production step, usually followed by a suitable purification method of the product produced, for example the recombinant protein. All fermentation processes which are based on one of the above-described processes for the preparation of the recombinant proteins represent correspondingly preferred embodiments of this subject matter of the invention.
Hierbei müssen die für die eingesetzten Herstellungsverfahren, für die Wirtszellen und/oder die herzustellenden Proteine jeweils optimalen Bedingungen anhand der zuvor optimierten Kulturbedingungen der betreffenden Stämme nach dem Wissen des Fachmanns, beispielsweise hinsichlich Fermentationsvolumen, Medienzusammensetzung, Sauerstoffversorgung oder Rührergeschwindigkeit experimentell ermittelt werden.In this case, the optimum conditions for the production processes used, for the host cells and / or the proteins to be produced must be experimentally determined on the basis of the previously optimized culture conditions of the relevant strains according to the knowledge of the person skilled in the art, for example regarding fermentation volume, media composition, oxygen supply or stirrer speed.
Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen ebenfalls in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert; man spricht auch von einer Zufütterungsstrategie. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte, als auch in der Biotrockenmasse und/oder vor allem der Aktivität des interessierenden Proteins erreicht werden.Fermentation processes, which are characterized in that the fermentation is carried out via a feed strategy, are also contemplated. Here, the media components consumed by the ongoing cultivation are fed; One also speaks of a feeding strategy. As a result, considerable increases in both the cell density and in the dry biomass and / or especially the activity of the protein of interest can be achieved.
Analog dazu kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden. Das hergestellte Protein kann nachträglich aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Dieses Fermentationsverfahren ist gegenüber der Produktaufbereitung aus der Trockenmasse bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung geeigneter Sekretionsmarker und Transportsysteme. Ohne Sekretion ist möglicherweise die Aufreinigung des Proteins aus der Zellmasse erforderlich, auch dazu sind verschiedene Verfahren bekannt, wie Fällung z.B. durch Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder die chromatographische Reinigung, wenn erforderlich bis zur Homogenität. Die Mehrzahl der beschriebenen technischen Verfahren dürfte jedoch mit einer angereicherten, stabilisierten Präparation auskommen.Similarly, the fermentation can also be designed so that unwanted metabolic products are filtered out or neutralized by the addition of buffer or matching counterions. The produced protein can be harvested subsequently from the fermentation medium. This fermentation process is preferred over dry matter product processing, but requires the provision of suitable secretion markers and transport systems. Without secretion, it may be necessary to purify the protein from the cell mass, and various methods are known, such as precipitation, for example, by ammonium sulfate or ethanol, or chromatographic purification, if necessary, to homogeneity. However, the majority of the described technical methods should manage with an enriched, stabilized preparation.
Einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen somit auch Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Protease dar. Dazu gehört jedes Verfahren, das zur Herstellung einer oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Protease geeignet ist beziehungsweise das den Erhalt einer erfindungsgemäßen Protease ermöglicht. Hierzu zählen beispielsweise auch chemische Syntheseverfahren.An independent subject matter of the invention thus also provides methods for producing a protease according to the invention. This includes any method which is suitable for producing a protease according to the invention described above or which makes it possible to obtain a protease according to the invention. These include, for example, chemical synthesis methods.
Demgegenüber bevorzugt sind jedoch alle im Stand der Technik etablierten, oben in einzelnen Aspekten bereits angesprochenen molekularbiologischen, mikrobiologischen beziehungsweise biotechnologischen Herstellverfahren, die auf den oben bezeichneten erfindungsgemäßen Proteinen, Nukleinsäuremolekülen, Vektoren oder Wirtszellen aufbauen. Hierfür kann entsprechend dem oben Gesagten beispielsweise auf die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 1 angegebene Nukleinsäure oder hieraus erhaltene Mutanten oder Teilsequenzen zurückgegriffen werden.In contrast, however, preference is given to all molecular-biological, microbiological or biotechnological preparation methods which are established in the prior art and are already mentioned above in individual aspects and which are based on the abovementioned proteins, nucleic acid molecules, vectors or host cells according to the invention. For this purpose, in accordance with the above, for example, in the sequence listing under SEQ ID NO. 1 nucleic acid or mutants or partial sequences derived therefrom are used.
Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren, die unter Einsatz einer zuvor bezeichneten Nukleinsäure, vorzugsweise unter Einsatz eines vorstehend beschriebenen Vektors und besonders bevorzugt vorzugsweise unter Einsatz einer zuvor bezeichneten, vorteilhafterweise gentechnisch modifizierten Wirtszelle erfolgen. Denn hierdurch wird die entsprechend bevorzugte genetische Information in mikrobiologisch verwertbarer Form zur Verfügung gestellt.These are preferably processes which are carried out using a previously described nucleic acid, preferably using a vector as described above, and more preferably preferably using a previously identified, advantageously genetically modified host cell. Because this provides the correspondingly preferred genetic information in a microbiologically usable form.
Alle vorstehend ausgeführten Elemente können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar, so dass optimale Verfahren für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden müssen.All of the elements listed above can be combined into methods to produce proteins of the invention. For each protein according to the invention, a multitude of possible combinations of process steps is conceivable, so that optimal processes must be determined experimentally for each specific individual case.
Entsprechend dem oben Gesagten sind unter den genannten Verfahren weiterhin solche bevorzugt, bei denen die Nukleotidsequenz in einem, vorzugsweise mehreren Codons an die Codon-Usage des Wirtsstamms angepasst worden ist. Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt ein Mittel dar, das dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine erfindungsgemäße Protease wie vorstehend beschrieben enthält.According to what has been said above, among the methods mentioned, preference is furthermore given to those in which the nucleotide sequence has been adapted in one, preferably a plurality of codons, to the codon usage of the host strain. An inventive subject matter represents an agent which is characterized in that it contains at least one protease according to the invention as described above.
Hiermit werden alle Arten von Mitteln, insbesondere Gemische, Rezepturen, Lösungen etc., deren Einsetzbarkeit durch Zugabe eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins verbessert wird, in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Es kann sich dabei je nach Einsatzgebiet beispielsweise um feste Gemische, beispielsweise Pulver mit gefriergetrockeneten oder verkapselten Proteinen, oder um gelförmige oder flüssige Mittel handeln. Bevorzugte Rezepturen enthalten beispielsweise Puffersubstanzen, Stabilisatoren, Reaktionspartner und/oder Cofaktoren der Proteasen und/oder andere mit den Proteasen synergistische Inhaltsstoffe. Insbesondere sind darunter Mittel für die weiter unten ausgeführten Einsatzgebiete zu verstehen. Weitere Einsatzgebiete gehen aus dem Stand der Technik hervor und werden beispielsweise in dem Handbuch „Industrial enyzmes and their applications" von H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998 dargestellt.This includes all types of compositions, especially mixtures, formulations, solutions, etc., the utility of which is improved by addition of a protein of the invention described above, within the scope of the present invention. Depending on the field of application, these may be, for example, solid mixtures, for example powders with freeze-dried or encapsulated proteins, or gel or liquid agents. Preferred formulations contain, for example, buffer substances, stabilizers, reaction partners and / or cofactors of the proteases and / or other ingredients synergistic with the proteases. In particular, this appropriation is to be understood as the areas of application set out below. Further fields of application emerge from the prior art and are described, for example, in the manual "Industrial Enzymes and their Applications" by H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es ein Waschmittel, Handwaschmittel, Spülmittel, Handgeschirrspülmittel, Maschinengeschirrspülmittel, Reinigungsmittel, Zahnprothesen- oder Kontaktlinsenpflegemittel, Nachspülmittel, Desinfektionsmittel, kosmetisches Mittel, pharmazeutisches Mittel oder ein Mittel zur Behandlung von Filtermedien, Textilien, Pelzen, Papier, Fellen oder Leder, ist, insbesondere ein Wäschewaschmittel oder ein Geschirrspülmittel.In preferred embodiments of the invention, an agent according to the invention is characterized in that it comprises a detergent, hand washing detergent, dishwashing detergent, hand dishwashing detergent, machine dishwashing detergent, cleaning agent, denture or contact lens care agent, rinse aid, disinfectant, cosmetic agent, pharmaceutical agent or a means for treating filter media, textiles , Furs, paper, skins or leather, especially a laundry detergent or dishwashing detergent.
Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Wasch- bzw. Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Hand-Wäsche beziehungsweise -Reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder; für solche wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet.This invention includes all conceivable types of detergents or cleaners, both concentrates and undiluted agents to be used on a commercial scale, in the washing machine or in hand washing or cleaning. These include, for example, detergents for textiles, carpets, or natural fibers, for which according to the present invention the term laundry detergent is used. These include, for example, dishwashing detergents for dishwashers or manual dishwashing detergents or cleaners for hard surfaces such as metal, glass, porcelain, ceramics, tiles, stone, painted surfaces, plastics, wood or leather; for such according to the present invention, the term cleaning agent is used.
Ein erfindungsgemäßes Mittel kann sowohl ein Mittel für Großverbraucher oder technische Anwender als auch ein Produkt für den Privatverbraucher sein, wobei alle im Stand der Technik etablierten Wasch- und Reinigungsmittelarten ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen. Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel, die als insbesondere pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können außer dem erfindungsgemäß eingesetzten Wirkstoff - einer erfindungsgemäßen Protease - im Prinzip alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die erfindungsgemäßen Mittel können insbesondere Buildersubstanzen, oberflächenaktive Tenside, Bleichmittel auf Basis organischer und/oder anorganischer Persauerstoffverbindungen, Bleichaktivatoren, wassermischbare organische Lösungsmittel, Enzyme, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Schaumregulatoren sowie Färb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten.An agent according to the invention can be either a means for large consumers or technical users as well as a product for the private consumer, wherein all types of detergents and cleaning agents established in the prior art also constitute embodiments of the present invention. The detergents or cleaning agents according to the invention, which may be in the form of homogeneous solutions or suspensions, especially in powdered solids, may contain, in addition to the active ingredient used according to the invention - a protease according to the invention - in principle all known ingredients customary in such agents, where at least another ingredient is present in the agent. The agents according to the invention may in particular be builders, surface-active surfactants, bleaches based on organic and / or inorganic peroxygen compounds, bleach activators, water-miscible organic solvents, enzymes, sequestering agents, electrolytes, pH regulators and other auxiliaries such as optical brighteners, grayness inhibitors, foam regulators and dyes and fragrances and combinations thereof.
Insbesondere eine Kombination einer erfindungsgemäßen Protease mit einem oder mehreren weiteren lnhaltsstoff(en) der Mittel erweist sich als vorteilhaft, da ein solches Mittel eine verbesserte Reinigungsleistung durch sich ergebende Synergismen, insbesondere zwischen der Protease und dem weiteren Inhaltsstoff, aufweist. Dies bedeutet, dass das Mittel eine verbesserte Entfernung von Anschmutzungen, beispielsweise proteinhaltigen Anschmutzungen, bewirkt im Vergleich mit einem Mittel, welches entweder nur eine der beiden Komponenten beinhaltet, oder auch im Vergleich zur erwarteten Reinigungsleistung eines Mittels mit beiden Komponenten auf Grund der bloßen Addition der jeweiligen Einzelbeiträge dieser beiden Komponenten zur Reinigungsleistung des Mittels. Insbesondere durch die Kombination einer erfindungsgemäßen Protease mit einem der nachfolgend beschriebenen Tenside und/oder Buildersubstanzen und/oder Bleichmittel wird ein solcher Synergismus erreicht.In particular, a combination of a protease according to the invention with one or more further ingredients of the compositions proves to be advantageous, since such an agent has an improved cleaning performance by resulting synergisms, in particular between the protease and the further ingredient. This means that the agent effects an improved removal of stains, for example proteinaceous stains, in comparison with an agent which either contains only one of the two components or also in comparison with the expected cleaning performance of an agent with both components due to the mere addition of respective individual contributions of these two components to the cleaning performance of the agent. In particular, the combination of a protease according to the invention with one of the surfactants and / or builders and / or bleaches described below achieves such a synergism.
Die erfindungsgemäßen Mittel können ein Tensid oder mehrere Tenside enthalten, wobei insbesondere anionische Tenside, nichtionische Tenside und deren Gemische, aber auch kationische, zwitterionische und amphotere Tenside in Frage kommen.The compositions according to the invention may comprise one or more surfactants, in particular anionic surfactants, nonionic surfactants and mixtures thereof, but also cationic, zwitterionic and amphoteric surfactants.
Geeignete nichtionische Tenside sind insbesondere Alkylglykoside und Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von Alkylglykosiden oder linearen oder verzweigten Alkoholen mit jeweils 12 bis 18 C-Atomen im Alkylteil und 3 bis 20, vorzugsweise 4 bis 10 Alkylethergruppen. Weiterhin sind entsprechende Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von N-Alkyl-aminen, vicinalen Diolen, Fettsäureestern und Fettsäureamiden, die hinsichtlich des Alkylteils den genannten langkettigen Alkoholderivaten entsprechen, sowie von Alkylphenolen mit 5 bis 12 C- Atomen im Alkylrest brauchbar.Suitable nonionic surfactants are in particular alkyl glycosides and ethoxylation and / or propoxylation of alkyl glycosides or linear or branched alcohols each having 12 to 18 carbon atoms in the alkyl moiety and 3 to 20, preferably 4 to 10 alkyl ether groups. Furthermore, corresponding ethoxylation and / or propoxylation of N-alkyl-amines, vicinal diols, fatty acid esters and fatty acid amides, which correspond to said long-chain alcohol derivatives with respect to the alkyl moiety, and of alkylphenols having 5 to 12 carbon atoms in the alkyl radical.
Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann beziehungsweise lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-Atomen, z.B. aus Kokos-, Palm-, Taigfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören beispielsweise C12- Ci4-Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C9-Ci i-Alkohole mit 7 EO, Ci3-Ci5-Alkohole mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C12-C18-AIkOhOIe mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus C12-C14-Alkohol mit 3 EO und C12-C18-Alkohol mit 7 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow ränge ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind (TaIg-) Fettalkohole mit 14 EO, 16 EO, 20 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO. Insbesondere in Mitteln für den Einsatz in maschinellen Verfahren werden üblicherweise extrem schaumarme Verbindungen eingesetzt. Hierzu zählen vorzugsweise C12-C18-Alkylpolyethylenglykol- polypropylenglykolether mit jeweils bei zu 8 Mol Ethylenoxid- und Propylenoxideinheiten im Molekül. Man kann aber auch andere bekannt schaumarme nichtionische Tenside verwenden, wie zum Beispiel C12-C18-Alkylpolyethylenglykol-polybutylenglykolether mit jeweils bis zu 8 Mol Ethylenoxid- und Butylenoxideinheiten im Molekül sowie endgruppenverschlossene Alkylpolyalkylenglykol- mischether. Besonders bevorzugt sind auch die hydroxylgruppenhaltigen alkoxylierten Alkohole, wie sie in der europäischen Patentanmeldung EP 0 300 305 beschrieben sind, sogenannte Hydroxymischether. Zu den nichtionischen Tensiden zählen auch Alkylglykoside der allgemeinen Formel RO(G)x eingesetzt werden, in der R einen primären geradkettigen oder methylverzweigten, insbesondere in 2-Stellung methylverzweigten aliphatischen Rest mit 8 bis 22, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G für eine Glykoseeinheit mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht. Der Oligomerisierungsgrad x, der die Verteilung von Monoglykosiden und Oligoglykosiden angibt, ist eine beliebige Zahl - die als analytisch zu bestimmende Größe auch gebrochene Werte annehmen kann - zwischen 1 und 10; vorzugsweise liegt x bei 1 ,2 bis 1 ,4. Ebenfalls geeignet sind Polyhydroxyfettsäureamide der Formel (III), in der R1CO für einen aliphatischen Acylrest mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, R2 für Wasserstoff, einen Alkyl- oder Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und [Z] für einen linearen oder verzweigten Polyhydroxyalkylrest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen und 3 bis 10 Hydroxylgruppen steht:The nonionic surfactants used are preferably alkoxylated, advantageously ethoxylated, especially primary alcohols having preferably 8 to 18 carbon atoms and an average of 1 to 12 moles of ethylene oxide (EO) per mole of alcohol, in which the alcohol radical is linear or preferably 2-position may be methyl-branched or may contain linear and methyl-branched radicals in the mixture, as they are usually present in Oxoalkoholresten. In particular, however, alcohol ethoxylates with linear radicals of alcohols of natural origin having 12 to 18 carbon atoms, for example of coconut, palm, tallow or oleyl alcohol, and on average 2 to 8 EO per mole of alcohol are preferred. Preferred ethoxylated alcohols include, for example, C 12 - C 4 alcohols containing 3 EO or 4 EO, C 9 -C i-alcohols containing 7 EO, C 3 -C 5 alcohols containing 3 EO, 5 EO, 7 EO or 8 EO, C 12 -C 18 -AlkOhOIe with 3 EO, 5 EO or 7 EO and mixtures of these, such as mixtures of C 12 -C 14 alcohol with 3 EO and C 12 -C 18 alcohol with 7 EO. The degrees of ethoxylation given represent statistical means which, for a particular product, may be an integer or a fractional number. Preferred alcohol ethoxylates have a narrow homolog distribution (narrow rank ethoxylates, NRE). In addition to these nonionic surfactants, fatty alcohols with more than 12 EO can also be used. Examples of these are (TaIg) fatty alcohols with 14 EO, 16 EO, 20 EO, 25 EO, 30 EO or 40 EO. In particular, agents for use in mechanical processes usually extremely low-foam compounds are used. These include, preferably, C 12 -C 18 -alkyl polyethylene glycol polypropylene glycol ethers, each containing up to 8 moles of ethylene oxide and propylene oxide units in the molecule. However, it is also possible to use other known low-foam nonionic surfactants, such as, for example, C 12 -C 18 -alkylpolyethyleneglycol-polybutylene glycol ethers having up to 8 mol of ethylene oxide and butylene oxide units in the molecule as well as end-capped alkylpolyalkylene glycol mixed ethers. Also particularly preferred are the hydroxyl-containing alkoxylated alcohols, as described in European Patent Application EP 0 300 305, so-called hydroxy mixed ethers. The nonionic surfactants also include alkyl glycosides of the general formula RO (G) x in which R is a primary straight-chain or methyl-branched, in particular 2-methyl-branched aliphatic radical having 8 to 22, preferably 12 to 18 carbon atoms and G represents a glycose unit having 5 or 6 C atoms, preferably glucose. The degree of oligomerization x, which indicates the distribution of monoglycosides and oligoglycosides, is an arbitrary number - which, as a variable to be determined analytically, may also assume fractional values - between 1 and 10; preferably x is 1, 2 to 1, 4. Also suitable are polyhydroxy fatty acid amides of the formula (III) in which R 1 CO is an aliphatic acyl radical having 6 to 22 carbon atoms, R 2 is hydrogen, an alkyl or hydroxyalkyl radical having 1 to 4 carbon atoms and [Z] is a linear or branched polyhydroxyalkyl radical having 3 to 10 carbon atoms and 3 to 10 hydroxyl groups:
R2 R 2
R1-C0-N-[Z] (III) Vorzugsweise leiten sich die Polyhydroxyfettsäureamide von reduzierenden Zuckern mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere von der Glucose ab. Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören auch Verbindungen der Formel (IV),R 1 -CO-N- [Z] (III) The polyhydroxy fatty acid amides are preferably derived from reducing sugars having 5 or 6 carbon atoms, in particular from glucose. The group of polyhydroxy fatty acid amides also includes compounds of the formula (IV)
R4-O-R5
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R 4 -OR 5
Figure imgf000029_0001
in der R3 für einen linearen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, R4 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylenrest oder einen Arylenrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen und R5 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, wobei C-ι-C4-Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind, und [Z] für einen linearen Polyhydroxyalkylrest, dessen Alkylkette mit mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte Derivate dieses Restes steht. [Z] wird auch hier vorzugsweise durch reduktive Aminierung eines Zuckers wie Glucose, Fructose, Maltose, Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose erhalten. Die N-Alkoxy- oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können dann beispielsweise durch Umsetzung mit Fettsäuremethylestern in Gegenwart eines Alkoxids als Katalysator in die gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt werden. Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden, insbesondere zusammen mit alkoxylierten Fettalkoholen und/oder Alkylglykosiden, eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester. Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl-N,N-dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanolamide können geeignet sein. Die Menge dieser nichtionischen Tenside beträgt vorzugsweise nicht mehr als die der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere nicht mehr als die Hälfte davon. Als weitere Tenside kommen sogenannte Gemini-Tenside in Betracht. Hierunter werden im Allgemeinen solche Verbindungen verstanden, die zwei hydrophile Gruppen pro Molekül besitzen. Diese Gruppen sind in der Regel durch einen sogenannten "Spacer" voneinander getrennt. Dieser Spacer ist in der Regel eine Kohlenstoffkette, die lang genug sein sollte, dass die hydrophilen Gruppen einen ausreichenden Abstand haben, damit sie unabhängig voneinander agieren können. Derartige Tenside zeichnen sich im Allgemeinen durch eine ungewöhnlich geringe kritische Micellkonzentration und die Fähigkeit, die Oberflächenspannung des Wassers stark zu reduzieren, aus. In Ausnahmefällen werden unter dem Ausdruck Gemini-Tenside nicht nur derartig "dimere", sondern auch entsprechend "trimere" Tenside verstanden. Geeignete Gemini-Tenside sind beispielsweise sulfatierte Hydroxymischether oder Dimeralkohol-bis- und Trimeralkohol-tris-sulfate und -ethersulfate. Endgruppenverschlossene dimere und trimere Mischether zeichnen sich insbesondere durch ihre Bi- und M u Itif u nktional ität aus. So besitzen die genannten endgruppen- verschlossenen Tenside gute Netzeigenschaften und sind dabei schaumarm, so dass sie sich insbesondere für den Einsatz in maschinellen Wasch- oder Reinigungsverfahren eignen. Eingesetzt werden können aber auch Gemini-Polyhydroxyfettsäureamide oder Poly-Polyhydroxy- fettsäureamide. Geeignet sind auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C7-C2i-Alkohole, wie 2-Methylverzweigte C9-C11- Alkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C12-C18-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO. Zu den bevorzugten Aniontensiden gehören auch die Salze der Alkylsulfobernsteinsäure, die auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester bezeichnet werden, und die Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure mit Alkoholen, vorzugsweise Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten Fettalkoholen darstellen. Bevorzugte Sulfosuccinate enthalten C8- bis C18- Fettalkoholreste oder Mischungen aus diesen. Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von ethoxylierten Fettalkoholen ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside darstellen. Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettalkohol-Reste sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung ableiten, besonders bevorzugt. Ebenso ist es auch möglich, Alk(en)ylbernsteinsäure mit vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen in der Alk(en)ylkette oder deren Salze einzusetzen. Als weitere anionische Tenside kommen Fettsäure-Derivate von Aminosäuren, beispielsweise von N-Methyltaurin (Tauride) und/oder von N-Methylglycin (Sarkoside) in Betracht. Insbesondere bevorzugt sind dabei die Sarkoside beziehungsweise die Sarkosinate und hier vor allem Sarkosinate von höheren und gegebenenfalls einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie Oleylsarkosinat. Als weitere anionische Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Geeignet sind insbesondere gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, hydrierten Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, zum Beispiel Kokos-, Palmkern- oder Taigfettsäuren, abgeleitete Seifengemische. Zusammen mit diesen Seifen oder als Ersatzmittel für Seifen können auch die bekannten Alkenylbernsteinsäuresalze eingesetzt werden.in the R 3 is a linear or branched alkyl or alkenyl radical having 7 to 12 carbon atoms, R 4 is a linear, branched or cyclic alkylene radical or an arylene radical having 2 to 8 carbon atoms and R 5 is a linear, branched or cyclic alkyl radical or a Aryl radical or an oxy-alkyl radical having 1 to 8 carbon atoms, wherein C-ι-C 4 alkyl or phenyl radicals are preferred, and [Z] is a linear polyhydroxyalkyl radical whose alkyl chain is substituted with at least two hydroxyl groups, or alkoxylated, preferably ethoxylated or propoxylated derivatives of this group. [Z] is also obtained here preferably by reductive amination of a sugar such as glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, mannose or xylose. The N-alkoxy- or N-aryloxy-substituted compounds can then be converted into the desired polyhydroxy fatty acid amides, for example by reaction with fatty acid methyl esters in the presence of an alkoxide as catalyst. Another class of preferred nonionic surfactants used either as the sole nonionic surfactant or in combination with other nonionic surfactants, in particular together with alkoxylated fatty alcohols and / or alkyl glycosides, are alkoxylated, preferably ethoxylated or ethoxylated and propoxylated fatty acid alkyl esters, preferably from 1 to 4 carbon atoms in the alkyl chain, especially fatty acid methyl ester. Nonionic surfactants of the amine oxide type, for example N-cocoalkyl-N, N-dimethylamine oxide and N-tallowalkyl-N, N-dihydroxyethylamine oxide, and the fatty acid alkanolamides may also be suitable. The amount of these nonionic surfactants is preferably not more than that of the ethoxylated fatty alcohols, especially not more than half thereof. Other suitable surfactants are so-called gemini surfactants. These are generally understood as meaning those compounds which have two hydrophilic groups per molecule. These groups are usually separated by a so-called "spacer". This spacer is typically a carbon chain that should be long enough for the hydrophilic groups to be spaced sufficiently apart for them to act independently of each other. Such surfactants are generally characterized by an unusually low critical micelle concentration and the ability to greatly reduce the surface tension of the water. In exceptional cases, the term gemini surfactants not only such "dimer", but also corresponding to "trimeric" surfactants understood. Suitable gemini surfactants are, for example, sulfated hydroxy mixed ethers or dimer alcohol bis and trimer alcohol tris sulfates and ether sulfates. End-capped dimeric and trimeric mixed ethers are outstanding in particular through their affinities and subsidiarity. Thus, the end-capped surfactants mentioned have good wetting properties and are low-foaming, so that they are particularly suitable for use in machine washing or cleaning processes. However, it is also possible to use gemini-polyhydroxy fatty acid amides or poly-polyhydroxy fatty acid amides. Also suitable are the sulfuric acid monoesters of the straight-chain or branched C 7 -C 2 -substituted alcohols ethoxylated with from 1 to 6 mol of ethylene oxide, such as 2-methyl-branched C 9 -C 11 -alcohols having on average 3.5 mol of ethylene oxide (EO) or C 12 C 18 fatty alcohols with 1 to 4 EO. The preferred anionic surfactants also include the salts of alkylsulfosuccinic acid, which are also referred to as sulfosuccinates or as sulfosuccinic acid esters, and the monoesters and / or diesters of sulfosuccinic acid with alcohols, preferably fatty alcohols and in particular ethoxylated fatty alcohols. Preferred sulfosuccinates contain C 8 - to C 18 - fatty alcohol residues or mixtures of these. Particularly preferred sulfosuccinates contain a fatty alcohol residue derived from ethoxylated fatty alcohols, which by themselves are nonionic surfactants. Sulfosuccinates, whose fatty alcohol residues are derived from ethoxylated fatty alcohols with a narrow homolog distribution, are again particularly preferred. Likewise, it is also possible to use alk (en) ylsuccinic acid having preferably 8 to 18 carbon atoms in the alk (en) yl chain or salts thereof. Suitable further anionic surfactants are fatty acid derivatives of amino acids, for example N-methyltaurine (Tauride) and / or N-methylglycine (sarcosides). Particularly preferred are the sarcosides or the sarcosinates and here especially sarcosinates of higher and optionally monounsaturated or polyunsaturated fatty acids such as oleyl sarcosinate. As further anionic surfactants are particularly soaps into consideration. Particularly suitable are saturated fatty acid soaps, such as the salts of lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, hydrogenated erucic acid and behenic acid and, in particular, soap mixtures derived from natural fatty acids, for example coconut, palm kernel or tallow fatty acids. Together with these soaps or as a substitute for soaps, it is also possible to use the known alkenylsuccinic acid salts.
Die anionischen Tenside, einschließlich der Seifen, können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze sowie als lösliche Salze organischer Basen, wie Mono-, Di- oder Triethanolamin, vorliegen. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor.The anionic surfactants, including soaps, may be in the form of their sodium, potassium or ammonium salts and as soluble salts of organic bases, such as mono-, di- or triethanolamine. The anionic surfactants are preferably present in the form of their sodium or potassium salts, in particular in the form of the sodium salts.
Tenside sind in erfindungsgemäßen Mitteln in Mengenanteilen von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, enthalten.Surfactants are present in inventive compositions in proportions of preferably 5 wt .-% to 50 wt .-%, in particular from 8 wt .-% to 30 wt .-%.
Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält vorzugsweise mindestens einen wasserlöslichen und/oder wasserunlöslichen, organischen und/oder anorganischen Builder. Zu den wasserlöslichen organischen Buildersubstanzen gehören Polycarbonsäuren, insbesondere Citronensäure und Zuckersäuren, monomere und polymere Aminopolycarbonsäuren, insbesondere Methylglycin- diessigsäure, Nitrilotriessigsäure und Ethylendiamintetraessigsäure sowie Polyasparaginsäure, Polyphosphonsäuren, insbesondere Aminotris(methylenphosphonsäure), Ethylendiamintetra- kis(methylenphosphonsäure) und 1-Hydroxyethan-1 ,1-diphosphonsäure, polymere Hydroxy- verbindungen wie Dextrin sowie polymere (Poly-)carbonsäuren, insbesondere die durch Oxidation von Polysacchariden beziehungsweise Dextrinen zugänglichen Polycarboxylate, polymere Acryl- säuren, Methacrylsäuren, Maleinsäuren und Mischpolymere aus diesen, die auch geringe Anteile polymerisierbarer Substanzen ohne Carbonsäurefunktionalität einpolymerisiert enthalten können. Die relative Molekülmasse der Homopolymeren ungesättiger Carbonsäuren liegt im allgemeinen zwischen 3 000 und 200 000, die der Copolymeren zwischen 2 000 und 200 000, vorzugsweise 30 000 bis 120 000, jeweils bezogen auf freie Säure. Ein besonders bevorzugtes Acrylsäure- Maleinsäure-Copolymer weist eine relative Molekülmasse von 30 000 bis 100 000 auf. Handelsübliche Produkte sind zum Beispiel Sokalan® CP 5, CP 10 und PA 30 der Firma BASF. Geeignete, wenn auch weniger bevorzugte Verbindungen dieser Klasse sind Copolymere der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Vinylethern, wie Vinylmethylethern, Vinylester, Ethylen, Propy- len und Styrol, in denen der Anteil der Säure mindestens 50 Gew.-% beträgt. Als wasserlösliche organische Buildersubstanzen können auch Terpolymere eingesetzt werden, die als Monomere zwei ungesättigte Säuren und/oder deren Salze sowie als drittes Monomer Vinylalkohol und/oder einem veresterten Vinylalkohol oder ein Kohlenhydrat enthalten. Das erste saure Monomer beziehungsweise dessen Salz leitet sich von einer monoethylenisch ungesättigten C3-C8-Carbonsäure und vorzugsweise von einer C3-C4-Monocarbonsäure, insbesondere von (Meth)-acrylsäure ab. Das zweite saure Monomer beziehungsweise dessen Salz kann ein Derivat einer C4-C8-Dicarbonsäure, wobei Maleinsäure besonders bevorzugt ist, und/oder ein Derivat einer Allylsulfonsäure, die in 2- Stellung mit einem Alkyl- oder Arylrest substituiert ist, sein. Derartige Polymere weisen im Allgemeinen eine relative Molekülmasse zwischen 1 000 und 200 000 auf. Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Vinylacetat aufweisen. Die organischen Buildersubstanzen können, insbesondere zur Herstellung flüssiger Mittel, in Form wäßriger Lösungen, vorzugsweise in Form 30- bis 50- gewichtsprozentiger wäßriger Lösungen eingesetzt werden. Alle genannten Säuren werden in der Regel in Form ihrer wasserlöslichen Salze, insbesondere ihre Alkalisalze, eingesetzt.An agent according to the invention preferably contains at least one water-soluble and / or water-insoluble, organic and / or inorganic builder. To the water-soluble Organic builder substances include polycarboxylic acids, in particular citric acid and sugar acids, monomeric and polymeric aminopolycarboxylic acids, in particular methylglycine diacetic acid, nitrilotriacetic acid and ethylenediaminetetraacetic acid and polyaspartic acid, polyphosphonic acids, in particular aminotris (methylenephosphonic acid), ethylenediaminetetrakis (methylenephosphonic acid) and 1-hydroxyethane-1,1-diphosphonic acid , polymeric hydroxy compounds such as dextrin and polymeric (poly) carboxylic acids, in particular the accessible by oxidation of polysaccharides or dextrins polycarboxylates, polymeric acrylic acids, methacrylic acids, maleic acids and copolymers of these, which may also contain small amounts of polymerizable substances without carboxylic acid functionality in copolymerized form , The molecular weight of the homopolymers of unsaturated carboxylic acids is generally between 3,000 and 200,000, of the copolymers between 2,000 and 200,000, preferably 30,000 to 120,000, each based on the free acid. A particularly preferred acrylic acid-maleic acid copolymer has a molecular weight of from 30,000 to 100,000. Commercially available products are, for example, Sokalan® CP 5, CP 10 and PA 30 from BASF. Suitable, although less preferred, compounds of this class are copolymers of acrylic acid or methacrylic acid with vinyl ethers, such as vinylmethyl ethers, vinyl esters, ethylene, propylene and styrene, in which the proportion of the acid is at least 50% by weight. It is also possible to use terpolymers which contain two unsaturated acids and / or salts thereof as monomers and also vinyl alcohol and / or an esterified vinyl alcohol or a carbohydrate as the third monomer as water-soluble organic builder substances. The first acidic monomer or its salt is derived from a monoethylenically unsaturated C 3 -C 8 -carboxylic acid and preferably from a C 3 -C 4 -monocarboxylic acid, in particular from (meth) -acrylic acid. The second acidic monomer or its salt may be a derivative of a C 4 -C 8 -dicarboxylic acid, with maleic acid being particularly preferred, and / or a derivative of an allylsulfonic acid substituted in the 2-position with an alkyl or aryl radical. Such polymers generally have a molecular weight between 1,000 and 200,000. Further preferred copolymers are those which preferably have as monomers acrolein and acrylic acid / acrylic acid salts or vinyl acetate. The organic builder substances can be used, in particular for the preparation of liquid agents, in the form of aqueous solutions, preferably in the form of 30 to 50 percent by weight aqueous solutions. All of the acids mentioned are generally used in the form of their water-soluble salts, in particular their alkali metal salts.
Derartige organische Buildersubstanzen können gewünschtenfalls in Mengen bis zu 40 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-% und vorzugsweise von 1 Gew.-% bis 8 Gew.-% enthalten sein. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in pastenförmigen oder flüssigen, insbesondere wasserhaltigen, erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt. Als wasserlösliche anorganische Buildermaterialien kommen insbesondere Alkalisilikate, Alkalicarbonate und Alkaliphosphate, die in Form ihrer alkalischen, neutralen oder sauren Natriumoder Kaliumsalze vorliegen können, in Betracht. Beispiele hierfür sind Trinatriumphosphat, Tetra- natriumdiphosphat, Dinatriumdihydrogendiphosphat, Pentanatriumtriphosphat, sogenanntes Natriumhexametaphosphat, oligomeres Trinatriumphosphat mit Oligomerisierungsgraden von 5 bis 1000, insbesondere 5 bis 50, sowie die entsprechenden Kaliumsalze beziehungsweise Gemische aus Natrium- und Kaliumsalzen. Als wasserunlösliche, wasserdispergierbare anorganische Buildermaterialien werden insbesondere kristalline oder amorphe Alkalialumosilikate, in Mengen von bis zu 50 Gew.-%, vorzugsweise nicht über 40 Gew.-% und in flüssigen Mitteln insbesondere von 1 Gew.-% bis 5 Gew.-%, eingesetzt. Unter diesen sind die kristallinen Natriumalumosilikate in Waschmittelqualität, insbesondere Zeolith A, P und gegebenenfalls X, allein oder in Mischungen, beispielsweise in Form eines Co-Kristallisats aus den Zeolithen A und X (Vegobond® AX, ein Handelsprodukt der Condea Augusta S.p.A.), bevorzugt. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in festen, teilchenförmigen Mitteln eingesetzt. Geeignete Alumosilikate weisen insbesondere keine Teilchen mit einer Korngröße über 30 μm auf und bestehen vorzugsweise zu wenigstens 80 Gew.-% aus Teilchen mit einer Größe unter 10 μm. Ihr Calcium- bindevermögen, das nach den Angaben der deutschen Patentschrift DE 24 12 837 bestimmt werden kann, liegt in der Regel im Bereich von 100 bis 200 mg CaO pro Gramm.If desired, such organic builder substances may be present in amounts of up to 40% by weight, in particular up to 25% by weight and preferably from 1% by weight to 8% by weight. Quantities close to the stated upper limit are preferably used in paste-form or liquid, in particular water-containing, agents according to the invention. Suitable water-soluble inorganic builder materials are, in particular, alkali metal silicates, alkali metal carbonates and alkali metal phosphates, which may be in the form of their alkaline, neutral or acidic sodium or potassium salts. Examples of these are trisodium phosphate, tetra sodium diphosphate, disodium dihydrogen diphosphate, pentasodium triphosphate, so-called sodium hexametaphosphate, oligomeric trisodium phosphate with degrees of oligomerization of from 5 to 1000, in particular from 5 to 50, and the corresponding potassium salts or mixtures of sodium and potassium salts. Crystalline or amorphous alkali metal aluminosilicates, in amounts of up to 50% by weight, preferably not more than 40% by weight, and in liquid agents, in particular from 1% by weight to 5% by weight, are particularly suitable as water-insoluble, water-dispersible inorganic builder materials. used. Among these, preferred are the detergent grade crystalline sodium aluminosilicates, particularly zeolite A, P and optionally X, alone or in mixtures, for example in the form of a cocrystal of zeolites A and X (Vegobond® AX, a commercial product of Condea Augusta SpA) , Amounts near the above upper limit are preferably used in solid, particulate agents. In particular, suitable aluminosilicates have no particles with a particle size greater than 30 .mu.m and preferably consist of at least 80% by weight of particles having a size of less than 10 .mu.m. Their calcium binding capacity, which can be determined according to the specifications of the German patent DE 24 12 837, is generally in the range of 100 to 200 mg CaO per gram.
Geeignete Substitute beziehungsweise Teilsubstitute für das genannte Alumosilikat sind kristalline Alkalisilikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können. Die in den erfindungsgemäßen Mitteln als Gerüststoffe brauchbaren Alkalisilikate weisen vorzugsweise ein molares Verhältnis von Alkalioxid zu SiO2 unter 0,95, insbesondere von 1 :1 ,1 bis 1 :12 auf und können amorph oder kristallin vorliegen. Bevorzugte Alkalisilikate sind die Natriumsilikate, insbesondere die amorphen Natriumsilikate, mit einem molaren Verhältnis Na2O:SiO2 von 1 :2 bis 1 :2,8. Als kristalline Silikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können, werden vorzugsweise kristalline Schichtsilikate der allgemeinen Formel Na2SixO2x+1 y H2O eingesetzt, in der x, das sogenannte Modul, eine Zahl von 1 ,9 bis 22, insbesondere 1 ,9 bis 4 und y eine Zahl von 0 bis 33 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4 sind. Bevorzugte kristalline Schichtsilikate sind solche, bei denen x in der genannten allgemeinen Formel die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl ß- als auch δ-Natriumdisilikate (Na2Si2O5 y H2O) bevorzugt. Auch aus amorphen Alkalisilikaten hergestellte, praktisch wasserfreie kristalline Alkalisilikate der obengenannten allgemeinen Formel, in der x eine Zahl von 1 ,9 bis 2,1 bedeutet, können in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel wird ein kristallines Natriumschichtsilikat mit einem Modul von 2 bis 3 eingesetzt, wie es aus Sand und Soda hergestellt werden kann. Kristalline Natriumsilikate mit einem Modul im Bereich von 1 ,9 bis 3,5 werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel eingesetzt. Kristalline schichtförmige Silikate der oben angegebenen Formel (I) werden von der Fa. Clariant GmbH unter dem Handelsnamen Na-SKS vertrieben, z.B. Na-SKS-1 (Na2Si22O45XH2O, Kenyait), Na-SKS-2 (Na2Si14O29XH2O, Magadiit), Na-SKS-3 (Na2Si8O17XH2O) oder Na-SKS-4 (Na2Si4O9XH2O, Makatit). Von diesen eignen sich vor allem Na- SKS-5 (OC-Na2Si2O5), Na-SKS-7 (ß-Na2Si205, Natrosilit), Na-SKS-9 (NaHSi2O53H2O), Na-SKS-10 (NaHSi2O53H2O, Kanemit), Na-SKS-11 (t-Na2Si205) und Na-SKS-13 (NaHSi2O5), insbesondere aber Na-SKS-6 (5-Na2Si2O5). In einer bevorzugten Ausgestaltung erfindungsgemäßer Mittel setzt man ein granuläres Compound aus kristallinem Schichtsilikat und Citrat, aus kristallinem Schichtsilikat und oben genannter (co-)polymerer Polycarbonsäure, oder aus Alkalisilikat und Alkalicarbonat ein, wie es beispielsweise unter dem Namen Nabion® 15 im Handel erhältlich ist.Suitable substitutes or partial substitutes for the said aluminosilicate are crystalline alkali silicates which may be present alone or in a mixture with amorphous silicates. The alkali metal silicates useful as builders in the compositions according to the invention preferably have a molar ratio of alkali metal oxide to SiO 2 of less than 0.95, in particular of 1: 1, 1 to 1: 12, and may be amorphous or crystalline. Preferred alkali metal silicates are the sodium silicates, in particular the amorphous sodium silicates, with a molar ratio of Na 2 O: SiO 2 of 1: 2 to 1: 2.8. The crystalline silicates which may be present alone or in admixture with amorphous silicates, are crystalline layer silicates with the general formula Na 2 Si x O y are used 2x + 1 H 2 O, in which x, known as the modulus, an integer of 1, 9 to 22, in particular 1, 9 to 4 and y is a number from 0 to 33 and preferred values for x are 2, 3 or 4. Preferred crystalline phyllosilicates are those in which x in the abovementioned general formula assumes the values 2 or 3. In particular, both β- and δ-sodium disilicates (Na 2 Si 2 O 5 y H 2 O) are preferred. Also prepared from amorphous alkali silicates, practically anhydrous crystalline alkali silicates of the abovementioned general formula in which x is a number from 1, 9 to 2.1, can be used in inventive compositions. In a further preferred embodiment of the composition according to the invention, a crystalline sodium layer silicate with a modulus of 2 to 3 is used, as can be prepared from sand and soda. Crystalline sodium silicates with a modulus in the range of 1.9 to 3.5 are used in a further preferred embodiment of compositions according to the invention. Crystalline layered silicates of the above Formula (I) are sold by the company. Clariant GmbH under the trade name Na-SKS, for example Na-SKS-1 (Na 2 Si 22 O 45 XH 2 O, kenyaite), Na-SKS-2 (Na 2 Si 14 O 29 XH 2 O, magadiite), Na-SKS-3 (Na 2 Si 8 O 17 XH 2 O) or Na-SKS-4 (Na 2 Si 4 O 9 XH 2 O, makatite). Of these, especially Na-SKS-5 (OC-Na 2 Si 2 O 5 ), Na-SKS-7 (β-Na 2 Si 2 0 5 , natrosilite), Na-SKS-9 (NaHSi 2 O 5 3H 2 O), Na-SKS-10 (NaHSi 2 O 5 3H 2 O, kanemite), Na-SKS-11 (t-Na 2 Si 2 0 5) and Na-SKS-13 (NaHSi 2 O 5), but especially Na-SKS-6 (5-Na 2 Si 2 O 5 ). In a preferred embodiment of the composition according to the invention, a granular compound of crystalline phyllosilicate and citrate, of crystalline phyllosilicate and of the above-mentioned (co-) polymeric polycarboxylic acid, or of alkali silicate and alkali metal carbonate, such as, for example, commercially available under the name Nabion® 15, is used ,
Buildersubstanzen sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in Mengen bis zu 75 Gew.-%, insbesondere 5 Gew.-% bis 50 enthalten.Builder substances are preferably present in the compositions according to the invention in amounts of up to 75% by weight, in particular 5% by weight to 50.
Als für den Einsatz in erfindungsgemäßen Mitteln geeignete Persauerstoffverbindungen kommen insbesondere organische Persäuren beziehungsweise persaure Salze organischer Säuren, wie Phthalimidopercapronsäure, Perbenzoesäure oder Salze der Diperdodecandisäure, Wasserstoffperoxid und unter den Waschbedingungen Wasserstoffperoxid abgebende anorganische Salze, zu denen Perborat, Percarbonat, Persilikat und/oder Persulfat wie Caroat gehören, in Betracht. Sofern feste Persauerstoffverbindungen eingesetzt werden sollen, können diese in Form von Pulvern oder Granulaten verwendet werden, die auch in im Prinzip bekannter Weise umhüllt sein können. Falls ein erfindungsgemäßes Mittel Persauerstoffverbindungen enthält, sind diese in Mengen von vorzugsweise bis zu 50 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, vorhanden. Der Zusatz geringer Mengen bekannter Bleichmittelstabilisatoren wie beispielsweise von Phosphonaten, Boraten beziehungsweise Metaboraten und Metasilikaten sowie Magnesiumsalzen wie Magnesiumsulfat kann zweckdienlich sein.As for the use in agents according to the invention suitable peroxygen compounds are in particular organic peracids or pers acid salts of organic acids, such as phthalimidopercaproic acid, perbenzoic acid or salts of diperdodecanedioic acid, hydrogen peroxide and under the washing conditions hydrogen peroxide donating inorganic salts, which include perborate, percarbonate, persilicate and / or persulfate Caroat belong into consideration. If solid peroxygen compounds are to be used, they can be used in the form of powders or granules, which can also be enveloped in a manner known in principle. If an agent according to the invention contains peroxygen compounds, they are present in amounts of preferably up to 50% by weight, in particular from 5% by weight to 30% by weight. The addition of small amounts of known bleach stabilizers such as phosphonates, borates or metaborates and metasilicates and magnesium salts such as magnesium sulfate may be useful.
Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1 ,5- Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1 ,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glykolurile, insbesondere Tetraacetylglykoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate, insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- bzw. iso- NOBS), Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin, Ethylenglykoldiacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und Enolester sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol beziehungsweise deren beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zuckerderivate, insbesondere Pentaacetylglukose (PAG), Pentaacetylfruktose, Tetraacetylxylose und Octaacetyllactose sowie acetyliertes, gegebenenfalls N-alkyliertes Glucamin und Gluconolacton, und/oder N-acylierte Lactame, beispielsweise N- Benzoylcaprolactam. Die hydrophil substituierten Acylacetale und die Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Auch Kombinationen konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Derartige Bleichaktivatoren können, insbesondere bei Anwesenheit obengenannter Wasserstoffperoxid-Iiefernder Bleichmittel, im üblichen Mengenbereich, vorzugsweise in Mengen von 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 8 Gew.-%, bezogen auf gesamtes Mittel, enthalten sein, fehlen bei Einsatz von Percarbonsäure als alleinigem Bleichmittel jedoch vorzugsweise ganz.As bleach activators, it is possible to use compounds which, under perhydrolysis conditions, give aliphatic peroxycarboxylic acids having preferably 1 to 10 C atoms, in particular 2 to 4 C atoms, and / or optionally substituted perbenzoic acid. Suitable substances are those which carry O- and / or N-acyl groups of the stated C atom number and / or optionally substituted benzoyl groups. Preference is given to polyacylated alkylenediamines, in particular tetraacetylethylenediamine (TAED), acylated triazine derivatives, in particular 1,5-diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazine (DADHT), acylated glycolurils, in particular tetraacetylglycoluril (TAGU), N- Acylimides, in particular N-nonanoylsuccinimide (NOSI), acylated phenolsulfonates, in particular n-nonanoyl or isononanoyloxybenzenesulfonate (n- or iso-NOBS), carboxylic anhydrides, in particular phthalic anhydride, acylated polyhydric alcohols, in particular triacetin, ethylene glycol diacetate, 2,5-diacetoxy- 2,5-dihydrofuran and enol ester, as well as acetylated sorbitol and mannitol or their described Mixtures (SORMAN), acylated sugar derivatives, in particular pentaacetylglucose (PAG), pentaacetylfruktose, tetraacetylxylose and octaacetyllactose as well as acetylated, optionally N-alkylated glucamine and gluconolactone, and / or N-acylated lactams, for example N-benzoylcaprolactam. The hydrophilic substituted acyl acetals and the acyl lactams are also preferably used. Combinations of conventional bleach activators can also be used. Such bleach activators can, in particular in the presence of the abovementioned hydrogen peroxide-supplied bleach, in the usual amount range, preferably in amounts of from 0.5 wt .-% to 10 wt .-%, in particular 1 wt .-% to 8 wt .-%, based on However, total agent, be included, missing when using percarboxylic acid as the sole bleach, preferably completely.
Zusätzlich zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch Sulfonimine und/oder bleichverstärkende Übergangsmetallsalze beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe als sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein.In addition to the conventional bleach activators or in their place, sulfone imines and / or bleach-enhancing transition metal salts or transition metal complexes may also be present as so-called bleach catalysts.
Zu den in den erfindungsgemäßen Mitteln, insbesondere wenn sie in flüssiger oder pastöser Form vorliegen, neben Wasser verwendbaren organischen Lösungsmitteln gehören Alkohole mit 1 bis 4 C-Atomen, insbesondere Methanol, Ethanol, Isopropanol und tert.-Butanol, Diole mit 2 bis 4 C-Ato- men, insbesondere Ethylenglykol und Propylenglykol, sowie deren Gemische und die aus den genannten Verbindungsklassen ableitbaren Ether. Derartige wassermischbare Lösungsmittel sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in Mengen nicht über 30 Gew.-%, insbesondere von 6 Gew.-% bis 20 Gew.-%, vorhanden.Among the solvents according to the invention, in particular when they are in liquid or pasty form, organic solvents which can be used in addition to water include alcohols having 1 to 4 C atoms, in particular methanol, ethanol, isopropanol and tert-butanol, diols having 2 to 4 C -Ato- men, in particular ethylene glycol and propylene glycol, and mixtures thereof and derived from the said classes of compounds ethers. Such water-miscible solvents are preferably present in the compositions according to the invention in amounts of not more than 30% by weight, in particular from 6% by weight to 20% by weight.
Zur Einstellung eines gewünschten, sich durch die Mischung der übrigen Komponenten nicht von selbst ergebenden pH-Werts können die erfindungsgemäßen Mittel System- und umweltverträgliche Säuren, insbesondere Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure und/oder Adipinsäure, aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure, oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide, enthalten. Derartige pH-Regulatoren sind in den erfindungsgemäßen Mitteln in Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1 ,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten.In order to establish a desired pH, which does not naturally result from the mixture of the other components, the compositions according to the invention may contain system and environmentally acceptable acids, in particular citric acid, acetic acid, tartaric acid, malic acid, lactic acid, glycolic acid, succinic acid, glutaric acid and / or adipic acid, but also mineral acids, in particular sulfuric acid, or bases, in particular ammonium or alkali metal hydroxides. Such pH regulators are present in the compositions according to the invention in amounts of preferably not more than 20% by weight, in particular from 1.2% by weight to 17% by weight.
Vergrauungsinhibitoren haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz in der Flotte suspendiert zu halten. Hierzu sind wasserlösliche Kolloide meist organischer Natur geeignet, beispielsweise Stärke, Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder Ethersulfonsäuren der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren Schwefelsäureestern der Cellulose oder der Stärke. Auch wasserlösliche, saure Gruppen enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck geeignet. Weiterhin lassen sich andere als die obengenannten Stärkederivate verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Bevorzugt werden Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-SaIz), Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methyl- hydroxypropylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren Gemische, beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Mittel, eingesetzt.Graying inhibitors have the task of keeping suspended from the textile fiber dirt suspended in the fleet. Water-soluble colloids of mostly organic nature are suitable for this purpose, for example starch, glue, gelatin, salts of ether carboxylic acids or ether sulfonic acids of starch or of cellulose or salts of acidic sulfuric acid esters of cellulose or starch. Also, water-soluble polyamides containing acidic groups are suitable for this purpose. Furthermore, other than the above-mentioned starch derivatives can be used, for example aldehyde starches. Preference is given to cellulose ethers, such as carboxymethylcellulose (Na salt), Methylcellulose, hydroxyalkylcellulose and mixed ethers, such as methylhydroxyethylcellulose, methylhydroxypropylcellulose, methylcarboxymethylcellulose and mixtures thereof, for example in amounts of 0.1 to 5 wt .-%, based on the means used.
Erfindungsgemäße Textilwaschmittel können als optische Aufheller beispielsweise Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise deren Alkalimetallsalze enthalten, obgleich sie für den Einsatz als Colorwaschmittel vorzugsweise frei von optischen Aufhellern sind. Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1 ,3,5-triazinyl-6-amino)stilben-2,2'- disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholino-Gruppe eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine Anilinogruppe oder eine 2- Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können Aufheller vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein, zum Beispiel die Alkalisalze des 4,4'-Bis(2-sulfostyryl)-diphenyls, 4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyls, oder 4-(4-Chlorstyryl)-4'-(2-sulfostyryl)-diphenyls. Auch Gemische der vorgenannten optischen Aufheller können verwendet werden.Detergents according to the invention may contain, for example, derivatives of diaminostilbenedisulfonic acid or their alkali metal salts as optical brighteners, although they are preferably free of optical brighteners for use as color detergents. For example, salts of 4,4'-bis (2-anilino-4-morpholino-1, 3,5-triazinyl-6-amino) stilbene-2,2'-disulphonic acid or compounds of similar construction which are used instead of the morpholino Group carry a diethanolamino group, a methylamino group, an anilino group or a 2-methoxyethylamino group. Further, brighteners of the substituted diphenylstyrene type may be present, for example, the alkali salts of 4,4'-bis (2-sulfostyryl) -diphenyl, 4,4'-bis (4-chloro-3-sulfostyryl) -diphenyl, or 4 - (4-chlorostyryl) -4 '- (2-sulfostyryl). Mixtures of the aforementioned optical brightener can be used.
Insbesondere beim Einsatz in maschinellen Verfahren kann es von Vorteil sein, den Mitteln übliche Schauminhibitoren zuzusetzen. Als Schauminhibitoren eignen sich beispielsweise Seifen natürlicher oder synthetischer Herkunft, die einen hohen Anteil an C18-C24-Fettsäuren aufweisen. Geeignete nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise Organopolysiloxane und deren Gemische mit mikrofeiner, gegebenenfalls silanierter Kieselsäure sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische mit silanierter Kieselsäure oder Bisfettsäurealkylen- diamiden. Mit Vorteilen werden auch Gemische aus verschiedenen Schauminhibitoren verwendet, zum Beispiel solche aus Silikonen, Paraffinen oder Wachsen. Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder Paraffin-haltige Schauminhibitoren, an eine granuläre, in Wasser lösliche beziehungsweise dispergierbare Trägersubstanz gebunden. Insbesondere sind dabei Mischungen aus Paraffinen und Bistearylethylendiamid bevorzugt.In particular, when used in mechanical processes, it may be advantageous to add conventional foam inhibitors to the compositions. As foam inhibitors are, for example, soaps of natural or synthetic origin, which have a high proportion of C 18 -C 24 fatty acids. Suitable non-surfactant foam inhibitors are, for example, organopolysiloxanes and mixtures thereof with microfine, optionally silanized silica and paraffins, waxes, microcrystalline waxes and mixtures thereof with silanated silica or bis-fatty acid alkylene diamides. It is also advantageous to use mixtures of various foam inhibitors, for example those of silicones, paraffins or waxes. Preferably, the foam inhibitors, in particular silicone and / or paraffin-containing foam inhibitors, are bound to a granular, water-soluble or dispersible carrier substance. In particular, mixtures of paraffins and bistearylethylenediamide are preferred.
Die zu wählenden Inhaltsstoffe wie auch die Bedingungen, unter denen das Mittel eingesetzt wird, wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert, lonenstärke, Redox-Verhältnisse oder mechanische Einflüsse, sollten für das jeweilige Reinigungsproblem optimiert sein. So liegen übliche Temperaturen für Wasch- und Reinigungsmittel in Bereichen von 1O0C bei manuellen Mitteln über 4O0C und 6O0C bis hin zu 95° bei maschinellen Mitteln oder bei technischen Anwendungen. Da bei modernen Wasch- und Spülmaschinen die Temperatur meist stufenlos einstellbar ist, sind auch alle Zwischenstufen der Temperatur eingeschlossen. Vorzugsweise werden die Inhaltsstoffe der betreffenden Mittel aufeinander abgestimmt. Bevorzugt sind Synergien hinsichtlich der Reinigungsleistung. Besonders bevorzugt diesbezüglich sind Synergien, die in einem Temperaturbereich zwischen 2O0C und 6O0C vorhanden sind, da auch die in den erfindungsgemäßen Mitteln enthaltene Protease in diesem Temperaturbereich katalytisch aktiv ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Mittel, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, fernerThe ingredients to be selected as well as the conditions under which the agent is used, such as temperature, pH, ionic strength, redox ratios or mechanical influences, should be optimized for the particular cleaning problem. Thus, usual temperatures for detergents and cleaning agents are present in areas of 1O 0 C for manual compositions over 4O 0 C and 6O 0 C to 95 ° for machine agents or industrial applications. Since the temperature is usually infinitely adjustable in modern washing machines and dishwashers, all intermediate stages of the temperature are included. Preferably, the ingredients of the respective agents are coordinated. Synergies in terms of cleaning performance are preferred. Particularly preferred in this regard are synergies that exist in a temperature range between 2O 0 C and 6O 0 C, as well as the protease contained in the agents is catalytically active in this temperature range. In a further embodiment, an agent according to the invention, in particular a washing or cleaning agent, further comprises
- 5 Gew.-% bis 70 Gew.-%, insbesondere 5 Gew.-% bis 30 Gew.-% Tenside und/oder- 5 wt .-% to 70 wt .-%, in particular 5 wt .-% to 30 wt .-% of surfactants and / or
- 10 Gew.-% bis 65 Gew.-%, insbesondere 12 Gew.-% bis 60 Gew. -% wasserlösliches oder wasserdispergierbares anorganisches Buildermaterial und/oderFrom 10% by weight to 65% by weight, in particular from 12% by weight to 60% by weight, of water-soluble or water-dispersible inorganic builder material and / or
- 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 8 Gew.-%, wasserlösliche organische Buildersubstanzen und/oderFrom 0.5% by weight to 10% by weight, in particular from 1% by weight to 8% by weight, of water-soluble organic builders and / or
- 0,01 bis 15 Gew.-% feste anorganische und/oder organische Säuren beziehungsweise saure Salze und/oder0.01 to 15% by weight of solid inorganic and / or organic acids or acid salts and / or
- 0,01 bis 5 Gew.-% Komplexbildner für Schwermetalle und/oder0.01 to 5% by weight complexing agent for heavy metals and / or
- 0,01 bis 5 Gew.-% Vergrauungsinhibitor und/oder0.01 to 5% by weight of grayness inhibitor and / or
- 0,01 bis 5 Gew. -% Farbübertragungsinhibitor und/oder0.01 to 5% by weight of color transfer inhibitor and / or
- 0,01 bis 5 Gew.-% Schauminhibitor.- 0.01 to 5 wt .-% foam inhibitor.
Optional kann das Mittel ferner optische Aufheller umfassen, bevorzugt von 0,01 bis 5 Gew-%.Optionally, the agent may further comprise optical brighteners, preferably from 0.01% to 5% by weight.
Die Herstellung erfindungsgemäßer fester Mittel bietet keine Schwierigkeiten und kann auf bekannte Weise, zum Beispiel durch Sprühtrocknen oder Granulation, erfolgen, wobei Enzyme und eventuelle weitere thermisch empfindliche Inhaltsstoffe wie zum Beispiel Bleichmittel gegebenenfalls später separat zugesetzt werden. Zur Herstellung erfindungsgemäßer Mittel mit erhöhtem Schüttgewicht, insbesondere im Bereich von 650 g/l bis 950 g/l, ist ein einen Extrusionschritt aufweisendes Verfahren bevorzugt.The preparation of solid compositions according to the invention presents no difficulties and can be carried out in a known manner, for example by spray-drying or granulation, enzymes and possibly other thermally sensitive ingredients such as, for example, bleaching agents optionally being added separately later. For the preparation of inventive compositions having an increased bulk density, in particular in the range from 650 g / l to 950 g / l, a process comprising an extrusion step is preferred.
Zur Herstellung von erfindungsgemäßen Mitteln in Tablettenform, die einphasig oder mehrphasig, einfarbig oder mehrfarbig und insbesondere aus einer Schicht oder aus mehreren, insbesondere aus zwei Schichten bestehen können, geht man vorzugsweise derart vor, dass man alle Bestandteile - gegebenenfalls je einer Schicht - in einem Mischer miteinander vermischt und das Gemisch mittels herkömmlicher Tablettenpressen, beispielsweise Exzenterpressen oder Rundläuferpressen, mit Preßkräften im Bereich von etwa 50 bis 100 kN, vorzugsweise bei 60 bis 70 kN verpreßt. Insbesondere bei mehrschichtigen Tabletten kann es von Vorteil sein, wenn mindestens eine Schicht vorverpreßt wird. Dies wird vorzugsweise bei Preßkräften zwischen 5 und 20 kN, insbesondere bei 10 bis 15 kN durchgeführt. Man erhält so problemlos bruchfeste und dennoch unter Anwendungsbedingungen ausreichend schnell lösliche Tabletten mit Bruch- und Biegefestigkeiten von normalerweise 100 bis 200 N, bevorzugt jedoch über 150 N. Vorzugsweise weist eine derart hergestellte Tablette ein Gewicht von 10 g bis 50 g, insbesondere von 15 g bis 40 g auf. Die Raumform der Tabletten ist beliebig und kann rund, oval oder eckig sein, wobei auch Zwischenformen möglich sind. Ecken und Kanten sind vorteilhafterweise abgerundet. Runde Tabletten weisen vorzugsweise einen Durchmesser von 30 mm bis 40 mm auf. Insbesondere die Größe von eckig oder quaderförmig gestalteten Tabletten, welche überwiegend über die Dosiervorrichtung beispielsweise der Geschirrspülmaschine eingebracht werden, ist abhängig von der Geometrie und dem Volumen dieser Dosiervorrichtung. Beispielhaft bevorzugte Ausführungsformen weisen eine Grundfläche von (20 bis 30 mm) x (34 bis 40 mm), insbesondere von 26x36 mm oder von 24x38 mm auf.For the preparation of compositions according to the invention in tablet form, which may be monophasic or multiphase, monochromatic or multicolor and in particular consist of one or more layers, in particular two layers, the procedure is preferably such that all constituents - if appropriate one per layer - in one Mixer mixed together and the mixture by means of conventional tablet presses, such as eccentric or rotary presses, pressed with compressive forces in the range of about 50 to 100 kN, preferably at 60 to 70 kN. Particularly in the case of multilayer tablets, it may be advantageous if at least one layer is pre-compressed. This is preferably carried out at pressing forces between 5 and 20 kN, in particular at 10 to 15 kN. This gives fracture-resistant, yet sufficiently rapidly soluble tablets under application conditions with fracture and flexural strengths of normally 100 to 200 N, but preferably above 150 N. Preferably, a tablet produced in this way has a weight of 10 g to 50 g, in particular 15 g up to 40 g. The spatial form of the tablets is arbitrary and can be round, oval or angular, with intermediate forms are also possible. Corners and edges are advantageously rounded. round Tablets preferably have a diameter of 30 mm to 40 mm. In particular, the size of rectangular or cuboid-shaped tablets, which are introduced predominantly via the metering device, for example the dishwasher, is dependent on the geometry and the volume of this metering device. Exemplary preferred embodiments have a base area of (20 to 30 mm) x (34 to 40 mm), in particular of 26x36 mm or 24x38 mm.
Flüssige beziehungsweise pastöse erfindungsgemäße Mittel in Form von übliche Lösungsmittel enthaltenden Lösungen werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können, hergestellt.Liquid or pasty compositions according to the invention in the form of customary solvent-containing solutions are generally prepared by simply mixing the ingredients, which can be added in bulk or as a solution in an automatic mixer.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen somit alle derartigen festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen der Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellen daher Mittel dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen bevorzugt aus einer Phase. Selbstverständlich können erfindungsgemäße Mittel aber auch aus mehreren Phasen bestehen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel daher dadurch gekennzeichnet sind, dass es in mehrere Komponenten aufgeteilt ist.Embodiments of the present invention thus comprise all such solid, powdered, liquid, gelatinous or paste-like administration forms of the agents, which if appropriate can also consist of several phases and can be present in compressed or uncompressed form. A further embodiment of the invention therefore represents agents which are characterized in that they are present as a one-component system. Such means preferably consist of one phase. Of course, means according to the invention may also consist of several phases. In a further embodiment of the invention, the washing or cleaning agent is therefore characterized in that it is divided into several components.
Zu den erfindungsgemäßen festen Darreichungsformen zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, die sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt vorliegen können. Alternativ liegt das Mittel als rieselfähiges Pulver vor, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l.The solid dosage forms according to the invention also include extrudates, granules, tablets or pouches, which may be present both in large packages and in portions. Alternatively, the agent is present as a free-flowing powder, in particular with a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l or 600 g / l to 850 g / l.
Ferner können erfindungsgemäße Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist daher dadurch gekennzeichnet, dass das Wasch- oder Reinigungsmittel in flüssiger, gelförmiger oder pastöser Form vorliegt, insbesondere in Form eines nicht-wäßrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wäßrigen Paste oder in Form eines wäßrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste.Furthermore, agents according to the invention may also be liquid, gelatinous or pasty. A further embodiment of the invention is therefore characterized in that the washing or cleaning agent is in liquid, gel or pasty form, in particular in the form of a non-aqueous liquid detergent or a non-aqueous paste or in the form of an aqueous liquid detergent or a water-containing paste.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es die Protease in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels enthält.Preferably, an agent according to the invention is characterized in that it contains the protease in an amount of from 2 μg to 20 mg, preferably from 5 μg to 17.5 mg, more preferably from 20 μg to 15 mg and most preferably from 50 μg to 10 mg contains per g of the agent.
Das erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel kann in einem Behältnis, vorzugsweise einem luftdurchlässigen Behältnis, verpackt sein, aus dem es kurz vor Gebrauch oder während des Waschvorgangs freigesetzt wird. Insbesondere kann ferner die in dem Mittel enthaltene Protease und/oder weitere Inhaltsstoffe des Mittels mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym undurchlässigen Substanz umhüllt sein, welche unter Anwendungsbedingungen des Mittels durchlässig für das Enzym wird. Eine solche Ausführungsform der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, dass die Protease mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für die Protease undurchlässigen Substanz umhüllt ist.The washing or cleaning agent according to the invention may be packaged in a container, preferably an air-permeable container, from which it is ready for use shortly before use or during the Washing process is released. In particular, the protease contained in the composition and / or other ingredients of the composition may further be coated with a substance which is impermeable to the enzyme at room temperature or in the absence of water, which becomes permeable to the enzyme under conditions of use of the agent. Such an embodiment of the invention is thus characterized in that the protease is coated with a substance which is impermeable to the protease at room temperature or in the absence of water.
Erfindungsgemäße Mittel können ausschließlich eine Protease enthalten. Alternativ können sie auch weitere Proteasen oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere Proteasen, Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Mannanasen, Tannasen, Xylanasen, Xanthanasen, ß-Glucosidasen, Carrageenasen, Oxidasen, Oxidoreduktasen oder Lipasen, sowie vorzugsweise deren Gemische. Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Mittel enthalten Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 x 10~8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein. Bevorzugt sind die Enzyme von 0,001 bis 5 Gew.-%, weiter bevorzugt von 0,01 bis 5 Gew.-%, noch weiter bevorzugt von 0,05 bis 4 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,075 bis 3,5 Gew.-% in erfindungsgemäßen Mitteln enthalten, wobei jedes enthaltene Enzym in den genannten Mengenverhältnissen vorliegen kann.Compositions according to the invention may contain only one protease. Alternatively, they may also contain other proteases or other enzymes in a concentration effective for the effectiveness of the agent. A further subject of the invention thus represents agents which further comprise one or more further enzymes, wherein in principle all enzymes established in the prior art for these purposes can be used. Preferred enzymes which can be used as enzymes are all enzymes which can develop a catalytic activity in the agent according to the invention, in particular proteases, amylases, cellulases, hemicellulases, mannanases, tannases, xylanases, xanthanases, .beta.-glucosidases, carrageenases, oxidases, oxidoreductases or lipases, and preferably their mixtures. These enzymes are basically of natural origin; Starting from the natural molecules, improved variants are available for use in detergents and cleaners, which are preferably used accordingly. Compositions according to the invention preferably contain enzymes in total amounts of 1 × 10 -8 to 5 percent by weight, based on active protein. Preferably, the enzymes are from 0.001 to 5% by weight, more preferably from 0.01 to 5% by weight, even more preferably from 0.05 to 4% by weight and most preferably from 0.075 to 3.5% by weight. % contained in agents according to the invention, wherein each enzyme contained can be present in the stated proportions.
Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M. M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751-766) bestimmt werden. Besonders bevorzugt unterstützen die weiteren Enzyme die Wirkung des Mittels, beispielsweise die Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, hinsichtlich bestimmter Anschmutzungen oder Flecken. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Effekte hinsichtlich ihrer Wirkung gegenüber bestimmter Anschmutzungen oder Flecken, d.h. die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig. Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße Mittel somit dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein weiteres Enzym enthält, welches eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, ß-Glucosidase, Carrageenase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase ist. Die in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzten Enzyme stammen entweder ursprünglich aus Mikroorganismen, etwa der Gattungen Bacillus, Streptomyces, Humicola, oder Pseudomonas, und/oder werden nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, beispielsweise durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder durch filamentöse Fungi.The protein concentration can be determined by known methods, for example, the BCA method (bicinchoninic acid, 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the biuret method (AG Gornall, CS Bardawill and MM David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766). The further enzymes particularly preferably support the effect of the agent, for example the cleaning performance of a washing or cleaning agent, with regard to certain stains or stains. Particularly preferably, the enzymes show synergistic effects with respect to their action against certain stains or stains, ie the enzymes contained in the middle composition mutually support each other in their cleaning performance. Synergistic effects can occur not only between different enzymes, but also between one or more enzymes and other ingredients of the composition according to the invention. In a further preferred embodiment of the invention, the agent according to the invention is therefore characterized in that it contains at least one further enzyme which comprises a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, β-glucosidase, carrageenase, oxidase, oxidoreductase or a lipase. The enzymes used in agents of the invention are either originally from microorganisms, such as the genera Bacillus, Streptomyces, Humicola, or Pseudomonas, and / or are produced by biotechnological methods known per se by suitable microorganisms, for example by transgenic expression hosts of the genera Bacillus or by filamentous fungi ,
Die Proteaseaktivität in derartigen Mitteln kann nach der in Tenside, Band 7 (1970), S. 125-132 beschriebenen Methode ermittelt werden. Sie wird in PE (Protease-Einheiten) angegeben.The protease activity in such agents can be determined by the method described in Tenside, Vol. 7 (1970), pp. 125-132. It is given in PE (protease units).
Bei dem Vergleich der Leistungen zweier Waschmittelenzyme muss zwischen proteingleichem und aktivitätsgleichem Einsatz unterschieden werden. Insbesondere bei gentechnisch erhaltenen, weitgehend nebenaktivitätsfreien Präparationen ist der proteingleiche Einsatz angebracht. Denn damit ist eine Aussage darüber möglich, ob dieselben Proteinmengen - als Maß für den Ertrag der fermentativen Produktion - zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Klaffen die jeweiligen Verhältnisse von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) auseinander, so ist ein aktivitätsgleicher Vergleich zu empfehlen, weil hierüber die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften verglichen werden. Generell gilt, daß eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann. Hierbei handelt es sich letztlich um eine ökonomische Erwägung.When comparing the performance of two detergent enzymes, a distinction must be made between protein-like and activity-equivalent use. Particularly in the case of genetically engineered, largely side-activity-free preparations, the use of the same protein is appropriate. Because this is a statement on whether the same amounts of protein - as a measure of the yield of fermentative production - lead to comparable results. If the respective ratios of active substance to total protein (the values of the specific activity) diverge, then an activity-equivalent comparison is recommended because this compares the respective enzymatic properties. In general, a low specific activity can be compensated by adding a larger amount of protein. This is ultimately an economic consideration.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines oben beschriebenen erfindungsgemäßen Mittels zur Entfernung von protease-sensitiven Anschmutzungen auf Textilien oder harten Oberflächen, d.h. zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, dar.A separate subject of the invention is the use of an above-described agent according to the invention for the removal of protease-sensitive stains on textiles or hard surfaces, i. for cleaning textiles or hard surfaces.
Denn erfindungsgemäße Mittel können, insbesondere entsprechend den oben beschriebenen Eigenschaften, dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen. Ausführungsformen stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren dar.For agents according to the invention can be used, in particular in accordance with the properties described above, to remove proteinaceous impurities from textiles or from hard surfaces. Embodiments include, for example, hand washing, manual removal of stains from fabrics or hard surfaces, or use in conjunction with a machine process.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden die betreffenden erfindungsgemäßen Mittel, vorzugsweise Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittel, nach einer der oben ausgeführten Ausführungsform bereitgestellt.In a preferred embodiment of this use, the relevant agents according to the invention, preferably detergents or cleaning agents, are provided according to one of the embodiments set forth above.
Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, bei denen wenigstens in einem der Verfahrensschritte ein erfindungs- gemäßes Mittel verwendet wird. Das Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen ist demnach dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Mittel angewendet ist.A further subject of the invention are processes for cleaning textiles or hard surfaces, in which at least one of the process steps involves an inventive appropriate means is used. The process for the cleaning of textiles or hard surfaces is accordingly characterized in that an agent according to the invention is used in at least one process step.
Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was beispielsweise die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind.This includes both manual and mechanical processes, with mechanical processes being preferred on account of their more precise controllability, for example with regard to the quantities and reaction times used.
Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung dieses Mittels behandelt wird. Entsprechendes gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, welche unter dem Begriff harte Oberflächen zusammengefasst werden. Alle denkbaren Waschoder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um ein erfindungsgemäßes Mittel bereichert werden, und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.Methods for cleaning textiles are generally distinguished by the fact that various cleaning-active substances are applied to the items to be cleaned in a plurality of process steps and washed off after the action time, or that the items to be cleaned are otherwise treated with a detergent or a solution of this agent. The same applies to processes for cleaning all other materials than textiles, which are summarized by the term hard surfaces. All conceivable washing or cleaning methods can be enriched in at least one of the method steps by an agent according to the invention, and then represent embodiments of the present invention.
Da bevorzugte erfindungsgemäße Enzyme natürlicherweise bereits eine proteinauflösende Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen, wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner Teilschritt eines solchen Verfahrens zur maschinellen Reinigung von Textilien darin bestehen, daß gewünschtenfalls neben stabilisierenden Verbindungen, Salzen oder Puffersubstanzen als einzige reinigungsaktive Komponente ein erfindungsgemäßes Enzym aufgebracht wird. Dies stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.Since preferred enzymes according to the invention naturally already have a protein-dissolving activity and also unfold them in media which otherwise have no cleaning power, for example in pure buffer, a single substep of such a process for the mechanical cleaning of textiles may consist in optionally adding, in addition to stabilizing compounds, Salts or buffer substances is applied as the only cleaning-active component of an enzyme according to the invention. This represents another embodiment of the present invention.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Protease proteolytisch aktiv ist, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.Another object of the invention are methods for the purification of textiles or hard surfaces, which are characterized in that in at least one method step, a protease according to the invention is proteolytically active, in particular such that the protease in an amount of 40 micrograms to 4 g, preferably from 50 μg to 3 g, more preferably from 100 μg to 2 g and most preferably from 200 μg to 1 g per application.
Alternative Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem der Verfahrensschritte eine erfindungsgemäße Protease aktiv wird. Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.Alternative embodiments of this subject matter of the invention are also processes for the treatment of textile raw materials or for textile care in which a protease according to the invention becomes active in at least one of the process steps. Among these, methods for textile raw materials, fibers or textiles with natural components are preferred, and especially for those with wool or silk.
Es kann sich dabei beispielsweise um Verfahren handeln, in denen Materialien zur Verarbeitung in Textilien vorbereitet werden, etwa zur Antifilzausrüstung, oder beispielsweise um Verfahren, welche die Reinigung getragener Textilien um eine pflegende Komponente bereichern. Wegen der oben beschriebenen Wirkung von Proteasen auf natürliche, proteinhaltige Rohstoffe handelt es sich in bevorzugten Ausführungsformen um Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen, insbesondere mit Wolle oder Seide.These may be, for example, processes in which materials for processing in textiles are prepared, for example for anti-fungal finishing, or, for example, for processes which enrich the cleaning of worn textiles with a nourishing component. Because of the above-described effect of proteases on natural, proteinaceous raw materials, in preferred embodiments, they are processes for the treatment of textile raw materials, fibers or textiles with natural constituents, in particular with wool or silk.
Erfindungsgemäße Enzyme sind entsprechend der vorstehenden Ausführungen vorteilhaft in erfindungsgemäßen Mitteln, insbesondere Wasch- und Reinigungsmitteln, und Verfahren, insbesondere Wasch- und Reinigungsverfahren, einsetzbar. Sie können dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen. Ausführungsformen stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren dar.According to the above statements, enzymes according to the invention are advantageously usable in agents according to the invention, in particular detergents and cleaners, and processes, in particular washing and cleaning processes. They can be used to remove proteinaceous contaminants from textiles or hard surfaces. Embodiments include, for example, hand washing, manual removal of stains from fabrics or hard surfaces, or use in conjunction with a machine process.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildet daher die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease, wie sie vorstehend beschreiben wurde zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen. Bevorzugt wird die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt.Another object of the invention is therefore the use of a protease according to the invention, as described above for the cleaning of textiles or hard surfaces. Preferably, the protease is used in an amount of from 40 μg to 4 g, preferably from 50 μg to 3 g, more preferably from 100 μg to 2 g and most preferably from 200 μg to 1 g per application.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden die betreffenden erfindungsgemäßen Enzyme im Rahmen eines erfindungsgemäßen Mittels, vorzugsweise eines erfindungsgemäßen Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittels, bereitgestellt.In a preferred embodiment of this use, the relevant enzymes according to the invention are provided within the scope of an agent according to the invention, preferably a washing or cleaning agent according to the invention.
Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Waschoder Reinigungsmitteln dar.Another embodiment of this subject invention is the use of a protease according to the invention for activating or deactivating ingredients of detergents or cleaners.
Denn Protein-Bestandteile von Wasch- oder Reinigungsmitteln können durch das Einwirken einer Protease inaktiviert werden. Diesen ansonsten eher unerwünschten Effekt gezielt einzusetzen, ist ebenfalls ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Ebenso ist es möglich, dass durch Proteolyse eine andere Komponente erst aktiviert wird, etwa, wenn sie ein Hybridprotein aus dem eigentlichen Enzym und dem dazu passenden Inhibitor darstellt. Ein anderes Beispiel für eine solche Regulation ist die, bei der eine aktive Komponente zum Schutz oder zur Kontrolle ihrer Aktivität in einem Material verkapselt vorliegt, das durch Proteolyse angegriffen wird. Erfindungsgemäße Proteasen können somit zu Inaktivierungs-, Aktivierungs- oder Freisetzungsreaktionen verwendet werden, insbesondere in mehrphasigen Mitteln.Because protein components of detergents or cleaning agents can be inactivated by the action of a protease. Targeting this otherwise undesirable effect is also an aspect of the present invention. Likewise, it is possible that proteolysis activates another component, such as when it is a hybrid protein from the actual enzyme and the corresponding inhibitor. Another example of such regulation is that in which an active component is used to protect or control its activity in encapsulated in a material which is attacked by proteolysis. Proteases according to the invention can thus be used for inactivation, activation or release reactions, in particular in multiphase agents.
Entsprechend dem oben Gesagten stellen auch folgende Verwendungen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar:In accordance with the above, the following uses are embodiments of the present invention:
- Die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben;The use of a protease according to the invention for the recovery or treatment of raw materials or intermediates in textile production, in particular for the removal of protective layers on fabrics;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege und hierunter bevorzugtthe use of a protease according to the invention for the treatment of textile raw materials or for textile care and is preferred among these
- die entsprechende Verwendung für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.- the corresponding use for textile raw materials, fibers or textiles with natural components and especially for those with wool or silk.
Die vorliegende Erfindung wird auch in Form von solchen eine erfindungsgemäße Protease enthaltenden Mitteln verwirklicht, bei denen es sich um Kosmetika handelt. Hierunter werden alle Arten von reinigenden und pflegenden Mitteln für menschliche Haut oder Haar verstanden, insbesondere reinigende Mittel.The present invention is also realized in the form of such a protease-containing agent of the present invention, which are cosmetics. This is understood to mean all types of cleansing and conditioning agents for human skin or hair, in particular cleansing agents.
Denn Proteasen spielen auch im Zellerneuerungsprozeß der menschlichen Haut (Desquamation) eine entscheidende Rolle. Dementsprechend werden Proteasen auch als bioaktive Komponenten in Hautpflegemitteln verwendet, um den Abbau der in trockener Haut vermehrten Desmosomenstrukturen zu unterstützen. Wie vorstehend ausführlich erläutert können erfindungsgemäße Proteasen weiterentwickelt werden, beispielsweise über Aminosäuresubstitutionen und/oder Punktmutationen. Somit eignen sich auch erfindungsgemäße Proteasen, insbesondere solche, die etwa nach Mutagenese oder durch Zugabe entsprechender, mit ihnen wechselwirkender Stoffe in ihrer Aktivität kontrolliert sind, als aktive Komponenten in Haut- oder Haar-Reinigungs- oder Pflegemitteln. Besonders bevorzugt sind solche Präparationen dieser Enzyme, die wie oben beschrieben, beispielsweise durch Kopplung an makromolekulare Träger stabilisiert und/oder durch Punktmutationen an hochallergenen Positionen derivatisiert sind, so daß sie für den Menschen eine höhere Hautverträglichkeit aufweisen.Because proteases also play a crucial role in the cell renewal process of human skin (desquamation). Accordingly, proteases are also used as bioactive components in skin care agents to aid in the breakdown of desmosome structures that are increased in dry skin. As explained in detail above, proteases according to the invention can be developed further, for example via amino acid substitutions and / or point mutations. Thus, proteases according to the invention, in particular those which are controlled in their activity, for example after mutagenesis or by addition of corresponding substances interacting with them, are also suitable as active components in skin or hair cleansing or care preparations. Particularly preferred are those preparations of these enzymes, which are stabilized as described above, for example by coupling to macromolecular carrier and / or derivatized by point mutations at highly allergenic positions, so that they have a higher skin compatibility for humans.
Dementsprechend werden auch entsprechende kosmetische Reinigungs- und Pflegeverfahren und die Verwendung derartiger proteolytischer Enzyme zu kosmetischen Zwecken in diesen Erfindungsgegenstand einbezogen.Accordingly, corresponding cosmetic cleaning and care methods and the use of such proteolytic enzymes for cosmetic purposes are also included in this subject of the invention.
Neben dem Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln und Kosmetika sind im Stand der Technik zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten von Proteasaen, insbesondere Subtilasen etabliert. Einen Überblick hierüber bietet beispielsweise das Handbuch „Industrial enyzmes and their applications" von H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998. All diese Techniken können durch erfindungsgemäße Proteasen bereichert werden. Hierzu gehören insbesondere folgende Einsatzgebiete:In addition to the use in detergents and cleaners and cosmetics numerous applications of proteases, in particular subtilases are established in the prior art. a For example, the handbook "Industrial Enzymes and their Applications" by H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998 provides an overview of this. All of these techniques can be enriched by proteases according to the invention.
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur biochemischen Analyse oder zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen;the use of a protease according to the invention for biochemical analysis or for the synthesis of low molecular weight compounds or of proteins;
- darunter bevorzugt die Verwendung zur Endgruppenbestimmung im Rahmen einer Peptid- Sequenzanalyse;- including preferred use for end-group determination in a peptide sequence analysis;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen, vorzugsweise im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren;the use of a protease according to the invention for the preparation, purification or synthesis of natural substances or biological valuable substances, preferably in the context of corresponding agents or processes;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Synthese von Proteinen oder anderen niedermolekularen chemischen Verbindungen;the use of a protease according to the invention for the synthesis of proteins or other low molecular weight chemical compounds;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen, insbesondere zur Oberflächenbehandlung, ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung von Leder, vorzugsweise im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren;the use of a protease according to the invention for the treatment of natural raw materials, in particular for surface treatment, more particularly in a process for the treatment of leather, preferably in the context of appropriate agents or processes;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Behandlung von photographischen Filmen, insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten; undthe use of a protease according to the invention for the treatment of photographic films, in particular for the removal of gelatin-containing or similar protective layers; and
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln.the use of an alkaline protease according to the invention for the production of food or feed.
Grundsätzlich wird der Einsatz erfindungsgemäßer Proteasen in allen weiteren Technikgebieten in den Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung eingeschlossen, für die es sich als geeignet herausstellt.In principle, the use of proteases according to the invention in all other fields of technology is included in the scope of protection of the present application, for which it has proven to be suitable.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter, ohne sie jedoch darauf einzuschränken. The following examples further illustrate the invention without, however, limiting it thereto.
BeispieleExamples
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.All molecular biology procedures are followed by standard methods as described, for example, in the Handbook of Fritsch, Sambrook and Maniatis "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989, or similar pertinent works ) were used according to the instructions of the respective manufacturers.
Beispiel 1 : Ortsgerichtete MutageneseExample 1: Site-directed mutagenesis
Die Protease-Varianten wurden durch ortsgerichtete („site-directed") Mutagenese der alkalischenThe protease variants were prepared by site-directed mutagenesis of the alkaline
Protease aus Bacillus gibsonii DSM 14391 hergestellt. Es wurde eine übliche Mutagenesemethode verwendet unter Einsatz des „Quick Change Site-directed Mutagenesis Kit" des UnternehmensProtease made from Bacillus gibsonii DSM 14391. A standard mutagenesis method was used using the company's "Quick Change Site-directed Mutagenesis Kit."
Stratagene (Katalog-Nr. 200518, Stratagene, La JoIIa, Ca, USA). Es wurde das Codon für dieStratagene (Catalog No. 200518, Stratagene, La JoIIa, Ca, USA). It became the codon for the
Aminosäureposition 211 (Nukleotide 631-633) in der Zählweise gemäß SEQ ID NO.2 von ATG beispielsweise nach TCT geändert, so dass ein Austausch der Aminosäure Methionin (M) gegen die Aminosäure Serin (S) erfolgt.Amino acid position 211 (nucleotides 631-633) in the counting method according to SEQ ID NO. 2 of ATG changed, for example, to TCT, so that an exchange of the amino acid methionine (M) takes place against the amino acid serine (S).
Alternativ oder in Ergänzung wurde das Codon für die Position 212 (Nukleotide 634-636) in derAlternatively or in addition, the codon for position 212 (nucleotides 634-636) in the
Zählweise gemäß SEQ ID NO.2 von CCT beispielsweise nach AAT geändert, so dass einCounting according to SEQ ID NO. 2 changed from CCT, for example, after AAT, so that a
Austausch der Aminosäure Prolin (P) gegen die Aminosäure Asparagin (N) erfolgt.Replacement of the amino acid proline (P) against the amino acid asparagine (N) takes place.
Beispiel 2: Expression der ProteasevariantenExample 2: Expression of the protease variants
Die für die jeweilige Protease codierende Nukleinsäure liegt in dem Vektor pAWA22 kloniert vor. Dabei handelt es sich um einen von pBC16 abgeleiteten Expressionsvektor für den Einsatz in Bacillus-Spezies (Bernhard et al. (1978), J. Bacteriol., Band 133 (2), S. 897-903). Dieser Vektor wurde in den Wirtsstamm Bacillus subtilis DB 104 (Kawamura und Doi (1984), J. Bacteriol., Band 160 (1 ), S. 442-444) mit Standardmethoden transformiert.The nucleic acid coding for the particular protease is cloned in the vector pAWA22. This is a pBC16-derived expression vector for use in Bacillus species (Bernhard et al., (1978) J. Bacteriol., Vol. 133 (2), pp. 897-903). This vector was transformed into the host strain Bacillus subtilis DB 104 (Kawamura and Doi (1984), J. Bacteriol., Vol. 160 (1), pp. 442-444) by standard methods.
Die Transformanten wurden zunächst auf DM3-Medium (8 g/l Agar, 0,5 M Bernsteinsäure, 3,5 g/l K2HPO4, 1 ,5 g/l KH2PO4, 20 mM MgCI2, 5 g/l Casiaminoacids, 5 g/l Hefeextrakt, 6 g/l Glucose, 0,1 g/l BSA) regeneriert und dann auf TBY-Skimmilk-Platten (10 g/l Pepton, 10 g/l Milchpulver (siehe oben), 5 g/l Hefe, 5 g/l NaCI, 15 g/l Agar) überimpft. Proteolytisch aktive Klone wurden anhand ihrer Lysehöfe identifiziert. Aus den erhaltenen proteolytisch aktiven Klonen wurde einer ausgewählt, dessen Plasmid isoliert und das Insert nach Standardmethoden sequenziert, um es auf Korrektheit zu überprüfen. Die gewünschte Proteaseaktivität ist in Kulturüberständen entsprechend verifizierter Klone enthalten und kann bei Bedarf hieraus weiter prozessiert werden. Beispiel 3: Ermittlung der Wasch leistung bei Einsatz in einem handelsüblichen pulverförmigen WaschmittelThe transformants were first on DM3 medium (8 g / l agar, 0.5 M succinic acid, 3.5 g / l K 2 HPO 4 , 1, 5 g / l KH 2 PO 4 , 20 mM MgCl 2 , 5 g / l casiaminoacids, 5 g / l yeast extract, 6 g / l glucose, 0.1 g / l BSA) and then on TBY Skimmilk plates (10 g / l peptone, 10 g / l milk powder (see above), 5 g / l yeast, 5 g / l NaCl, 15 g / l agar). Proteolytically active clones were identified by their lysis sites. From the resulting proteolytically active clones, one was selected, the plasmid isolated and the insert sequenced by standard methods to check for correctness. The desired protease activity is contained in culture supernatants according to verified clones and can be further processed therefrom if necessary. Example 3 Determination of the Washing Performance When Used in a Commercially Available Powdered Detergent
Für dieses Beispiel wurden standardisiert verschmutze Textilien eingesetzt, die von der EMPAFor this example, standardized soiled textiles were used by the EMPA
Testmaterialien AG (St. Gallen, Schweiz), der wfk Testgewebe GmbH (Brüggen-Bracht,Testmaterialien AG (St. Gallen, Switzerland), wfk Testgewebe GmbH (Brüggen-Bracht,
Deutschland) oder dem Center For Testmaterials (CFT, Viaardingen, Niederlande) bezogen worden waren. Dabei wurden folgende Anschmutzungen und Textilien verwendet:Germany) or the Center For Testmaterials (CFT, Viaardingen, The Netherlands). The following stains and textiles were used:
A Gras auf Baumwolle, EMPA 164 (EMPA Testmaterialien AG)A grass on cotton, EMPA 164 (EMPA Testmaterialien AG)
B Schokolade-Milch/Tusche auf Baumwolle, C3 (Center For Testmaterials (CFT))B Chocolate milk / ink on cotton, C3 (Center For Testmaterials (CFT))
C Kakao auf Baumwolle, EMPA 1 12 (EMPA Testmaterialien AG)C cocoa on cotton, EMPA 1 12 (EMPA Testmaterialien AG)
D Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle, C5 (Center For Testmaterials (CFT))D Blood Milk / Ink on cotton, C5 (Center For Testmaterials (CFT))
Mit diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen auf ihre Waschleistung hin untersucht. Dafür wurden die Ansätze für 60 Minuten bei einer Temperatur von 4O0C gewaschen. Die Dosierung lag bei 5,9 g des Waschmittels pro Liter Waschflotte. Es wurde mit Stadtwasser mit einer Wasserhärte von etwa 16° deutscher Härte gewaschen.With this test material different detergent formulations were examined for their washing performance. For this, the approaches were washed for 60 minutes at a temperature of 4O 0 C. The dosage was 5.9 g of the detergent per liter of wash liquor. It was washed with city water with a water hardness of about 16 ° German hardness.
Als Kontroll-Waschmittel diente eine Waschmittel-Basis-Rezeptur folgender Zusammensetzung (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 10 % lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 1 ,5 % C12- C18-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 2,0 % C12-C18-Fettalkohol mit 7 EO, 20 % Natriumcarbonat, 6,5 % Natriumhydrogencarbonat, 4,0 % amorphes Natriumdisilikat, 17 % Natriumcarbonat- peroxohydrat, 4,0 % TAED, 3,0 % Polyacrylat, 1 ,0 % Carboxymethylcellulose, 1 ,0 % Phosphonat, 25 % Natriumsulfat, Rest: Schauminhibitoren, optischer Aufheller, Duftstoffe. Die Waschmittel- Basis-Rezeptur wurde für die verschiedenen Versuchsreihen aktivitätsgleich mit folgenden Proteasen versetzt: Protease gemäß SEQ ID NO.2 (WO 03/054185), Protease gemäß SEQ ID NO.2 mit der Aminosäuresubstitution P212N und die alkalische Protease aus Bacillus lentus Variante F49 (WO 95/23221 ).The control detergent used was a detergent base formulation of the following composition (all figures in percent by weight): 10% linear alkylbenzenesulfonate (sodium salt), 1.5% C12-C18 fatty alcohol sulfate (sodium salt), 2.0 % C12-C18 fatty alcohol with 7 EO, 20% sodium carbonate, 6.5% sodium bicarbonate, 4.0% amorphous sodium disilicate, 17% sodium carbonate peroxohydrate, 4.0% TAED, 3.0% polyacrylate, 1.0% carboxymethylcellulose , 1, 0% phosphonate, 25% sodium sulfate, balance: foam inhibitors, optical brightener, fragrances. The detergent base formulation was treated with the same activity for the different test series with the following proteases: protease according to SEQ ID NO. 2 (WO 03/054185), protease according to SEQ ID NO. 2 with the amino acid substitution P212N and the alkaline protease from Bacillus lentus variant F49 (WO 95/23221).
Nach dem Waschen wurde der Weißheitsgrad der gewaschenen Textilien gemessen. Die Messung erfolgte an einem Spektrometer Minolta CM508d (Lichtart D65, 10°). Das Gerät wurde zuvor mit einem mitgelieferten Weißstandard kalibriert. Die erhaltenen Ergebnisse sind die Differenzremissionen zwischen einem Waschvorgang mit einem Waschmittel enthaltend eine Protease und einem parallel durchgeführten Kontrollwaschgang mit einem Waschmittel ohne Protease. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengestellt. Sie erlauben einen unmittelbaren Rückschluss auf den Beitrag des jeweils enthaltenen Enzyms zur Waschleistung des verwendeten Mittels. Tabelle 2: Waschergebnisse mit einem pulverförmigen Waschmittel bei 4O0CAfter washing, the whiteness of the washed fabrics was measured. The measurement was carried out on a Minolta CM508d spectrometer (illuminant D65, 10 °). The device was previously calibrated with a supplied white standard. The results obtained are the differential remissions between a wash with a detergent containing a protease and a parallel control wash with a detergent without protease. The results are summarized in Table 2 below. They allow a direct conclusion on the contribution of each contained enzyme to the washing performance of the agent used. Table 2: washing results with a powdered detergent at 4O 0 C
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Die Protease-Variante zeigt an verschiedenen Anschmutzungen, insbesondere an den Anschmutzungen B und D, eine verbesserte Leistung im Vergleich zum Ausgangsmolekül gemäß SEQ ID NO.2 und im Vergleich mit der im Stand der Technik etablierten Protease aus Bacillus lentus.The protease variant shows an improved performance compared to the starting molecule according to SEQ ID NO.2 on different soils, in particular on the soils B and D, and in comparison with the Bacillus lentus protease established in the prior art.
Beispiel 4: Ermittlung der Waschleistung bei Einsatz in einem handelsüblichen flüssigen WaschmittelExample 4 Determination of the Washing Performance When Used in a Commercial Liquid Detergent
Die Versuchsdurchführung erfolgte im Wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben. Dabei wurden folgende Anschmutzungen und Textilien verwendet:The experiment was carried out essentially as described in Example 3. The following stains and textiles were used:
A Gras auf Baumwolle, EMPA 164 (EMPA Testmaterialien AG)A grass on cotton, EMPA 164 (EMPA Testmaterialien AG)
B Voll-Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle, 10N (wfk Testgewebe GmbH)B Full egg / pigment (whole egg / soot) on cotton, 10N (wfk Testgewebe GmbH)
C Schokolade-Milch/Tusche auf Baumwolle, C3 (Center For Testmaterials (CFT))C Chocolate Milk / Ink on Cotton, C3 (Center For Testmaterials (CFT))
D Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle, C5 (Center For Testmaterials (CFT))D Blood Milk / Ink on cotton, C5 (Center For Testmaterials (CFT))
Mit diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen auf ihre Waschleistung hin untersucht. Dafür wurden die Ansätze für 60 Minuten bei einer Temperatur von 4O0C gewaschen. Die Dosierung lag bei 5,9 g des Waschmittels pro Liter Waschflotte. Es wurde mit Stadtwasser mit einer Wasserhärte von etwa 16° deutscher Härte gewaschen.With this test material different detergent formulations were examined for their washing performance. For this, the approaches were washed for 60 minutes at a temperature of 4O 0 C. The dosage was 5.9 g of the detergent per liter of wash liquor. It was washed with city water with a water hardness of about 16 ° German hardness.
Als Kontrollwaschmittel diente eine Waschmittel-Basis-Rezeptur folgender Zusammensetzung (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3- 0,5% Xanthan Gum, 0,2-0,4% Anti-Schaummittel, 6-7% Glycerin, 0,3-0,5% Ethanol, 4-7% FAEOS, 24-28% Nichtionische Tenside, 1 % Borsäure, 1-2% Natriumeitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP, 0-0,4% PVP, 0- 0,05% optischer Aufheller, 0-0,001 % Farbstoff, Rest demineralisiertes Wasser. Die Waschmittel- Basis-Rezeptur wurde für die verschiedenen Versuchsreihen aktivitätsgleich mit folgenden Proteasen versetzt: Protease gemäß SEQ ID NO.2 (WO 03/054185), Protease gemäß SEQ ID NO.2 mit der Aminosäuresubstitution M21 1S und die Protease, die in Figur 2 bzw. SEQ ID NO. 3 der internationalen Offenlegungsschrift WO 03/057713 offenbart ist (nachfolgend als „Referenz" bezeichnet). Nach dem Waschen wurde der Weißheitsgrad der gewaschenen Textilien gemessen. Die Messung erfolgte an einem Spektrometer Minolta CM508d (Lichtart D65, 10°). Das Gerät wurde zuvor mit einem mitgelieferten Weißstandard kalibriert. Die erhaltenen Ergebnisse sind die Differenzremissionen zwischen einem Waschvorgang mit einem Waschmittel enthaltend eine Protease und einem parallel durchgeführten Kontrollwaschgang mit einem Waschmittel ohne Protease. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 zusammengestellt. Sie erlauben einen unmittelbaren Rückschluss auf den Beitrag des jeweils enthaltenen Enzyms zur Waschleistung des verwendeten Mittels.The control detergent used was a detergent base formulation of the following composition (all figures in percent by weight): 0.3- 0.5% xanthan gum, 0.2-0.4% anti-foaming agent, 6-7% glycerol, 0 , 3-0.5% ethanol, 4-7% FAEOS, 24-28% nonionic surfactants, 1% boric acid, 1-2% sodium citrate (dihydrate), 2-4% soda, 14-16% coconut fatty acids, 0 , 5% HEDP, 0-0.4% PVP, 0-0.05% optical brightener, 0-0.001% dye, balance demineralized water. The detergent base formulation was treated with the same activity for the different test series with the following proteases: protease according to SEQ ID NO. 2 (WO 03/054185), protease according to SEQ ID NO. 2 with the amino acid substitution M21 1S and the protease shown in FIG 2 or SEQ ID NO. 3 of International Publication WO 03/057713 (hereinafter referred to as "reference"). After washing, the whiteness of the washed fabrics was measured. The measurement was carried out on a Minolta CM508d spectrometer (illuminant D65, 10 °). The device was previously calibrated with a supplied white standard. The results obtained are the differential remissions between a wash with a detergent containing a protease and a parallel control wash with a detergent without protease. The results are summarized in Table 3 below. They allow a direct conclusion on the contribution of each contained enzyme to the washing performance of the agent used.
Tabelle 3: Waschergebnisse mit einem flüssigen Waschmittel bei 4O0CTable 3: Results washing with a liquid detergent at 4O 0 C
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Die Protease-Variante zeigt an verschiedenen Anschmutzungen, insbesondere an den Anschmutzungen A, B und D, eine deutlich verbesserte Leistung im Vergleich zum Ausgangsmolekül gemäß SEQ ID NO.2 und im Vergleich mit der im Stand der Technik etablierten Protease („Referenz").The protease variant shows markedly improved performance in comparison to the starting molecule according to SEQ ID NO.2 and in comparison with the protease established in the prior art ("reference") on various soils, in particular on soils A, B and D.
Beispiel 5: Ermittlung der Waschleistung bei Einsatz in handelsüblichen WaschmittelnExample 5 Determination of the Washing Performance When Used in Commercially available Detergents
Für dieses Beispiel wurden standardisiert verschmutze Textilien eingesetzt, die von der EMPAFor this example, standardized soiled textiles were used by the EMPA
Testmaterialien AG (St. Gallen, Schweiz) oder dem Center For Testmaterials (CFT, Viaardingen,Test Materials AG (St. Gallen, Switzerland) or the Center For Testmaterials (CFT, Viaardingen,
Niederlande) bezogen worden waren. Dabei wurde eine Auswahl aus folgenden Anschmutzungen und Textilien verwendet:Netherlands). A selection of the following stains and textiles was used:
A Gras auf Baumwolle, EMPA 164 (EMPA Testmaterialien AG)A grass on cotton, EMPA 164 (EMPA Testmaterialien AG)
B Schokolade-Milch/Tusche auf Baumwolle, C3 (Center For Testmaterials (CFT))B Chocolate milk / ink on cotton, C3 (Center For Testmaterials (CFT))
C Kakao auf Baumwolle, EMPA 112 (EMPA Testmaterialien AG)C cocoa on cotton, EMPA 112 (EMPA Testmaterialien AG)
D Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle, C5 (Center For Testmaterials (CFT))D Blood Milk / Ink on cotton, C5 (Center For Testmaterials (CFT))
Die Waschversuche wurden sowohl in handelsüblichen Flüssigwaschmitteln als auch in handelsüblichen Pulverwaschmitteln durchgeführt wie in den Beispielen 3 und 4 angegeben.The washing tests were carried out both in commercial liquid detergents and in commercially available powder detergents as indicated in Examples 3 and 4.
Die Dosierung des Waschmittels betrug 5.6 g/l (fest) bzw. 4,7 g/l (flüssig) bei einer Wasserhärte von 16° deutscher Härte. Jeweils 2 Testlappen (mit Anschmutzung) wurden zusammen mit 6 Füll- Lappen in 200 ml Volumen in Anwesenheit von 10 Stahlkugeln für mindestens 30 min bei 4O0C inkubiert, so dass das Flottenverhältnis 1 :12 (16.8g Gewebe = Summe der 8 Läppchen / 200ml) betrug.The dosage of the detergent was 5.6 g / l (solid) or 4.7 g / l (liquid) at a water hardness of 16 ° German hardness. Each 2 test cloths (with soiling) were together with 6 filling cloths in 200 ml volume in the presence of 10 steel balls for at least 30 min at 4O 0 C. incubated so that the liquor ratio was 1: 12 (16.8g tissue = sum of 8 lobules / 200ml).
Die jeweiligen Waschmittelrezepturen ohne Enzyme stellen die Basis und damit den Kontrollwert dar. Verwendet wurden erfindungsgemäße Proteasen wie in den nachstehenden Tabellen angegeben sowie eine leistungsverbesserte Variante der alkalischen Protease aus Bacillus lentus, die offenbart ist als SEQ ID NO. 16 in EP 0701605 (nachstehend bezeichnet als „Referenz"). Die Enzyme wurden aktivitätsgleich eingesetzt (1080 PE/200ml in festen Waschmitteln; 2300 PE/200ml in flüssigen Waschmitteln).The respective detergent formulations without enzymes represent the basis and thus the control value. Proteases according to the invention were used as indicated in the tables below and a performance-improved variant of the alkaline protease from Bacillus lentus, which is disclosed as SEQ ID NO. 16 in EP 0701605 (hereinafter referred to as "reference") The enzymes were used in the same activity (1080 PE / 200 ml in solid detergents, 2300 PE / 200 ml in liquid detergents).
Alle Messwerte wurden dreifach bestimmt. Die Auswertung erfolgte durch photometrische Messung des Farbwertes Y. Dieser ist ein Maß für die Helligkeit des Gewebes: je höher der Wert, desto heller ist das Gewebe und desto höher ist die Waschleistung (rein und damit weiß entspricht dem Wert 100, schwarz dem Wert 0). Dargestellt in den nachfolgenden Tabellen sind jeweils der Differenzwert des Farbwertes Y bei Einsatz einer Waschmittelrezeptur mit dem angegebenen Enzym und der entsprechenden Waschmittelrezeptur ohne Enzyme als Kontrolle. Die Standardabweichung ist ebenfalls angegeben (LSD). Aus den nachstehenden Ergebnissen geht zweifelsfrei hervor, dass erfindungsgemäße Proteasen eine vorteilhafte und überlegene Leistung aufweisen.All measured values were determined in triplicate. The evaluation was carried out by photometric measurement of the color value Y. This is a measure of the brightness of the tissue: the higher the value, the lighter the tissue and the higher the washing performance (pure and thus white corresponds to the value 100, black to the value 0) ). Shown in the following tables are each the difference value of the color value Y when using a detergent formulation with the specified enzyme and the corresponding detergent formulation without enzymes as a control. The standard deviation is also given (LSD). From the results below, it is clear that proteases of the invention have advantageous and superior performance.
Tabelle 4a: Waschergebnisse mit einem pulverförmigen WaschmittelTable 4a: Wash results with a powdered detergent
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Tabelle 4b: Waschergebnisse mit einem pulverförmigen WaschmittelTable 4b: Washing results with a powdered detergent
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Tabelle 5: Waschergebnisse mit einem flüssigen Waschmittel
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Table 5: Wash results with a liquid detergent
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Beschreibung der FigurenDescription of the figures
Figur 1 : Alignment der erfindungsgemäßen reifen Ausgangsprotease (SEQ ID NO.2) mitFIG. 1: Alignment of the mature starting protease according to the invention (SEQ ID NO
Proteasen aus dem Stand der Technik, errechnet mit dem Programm Vector NTI Suite Ver.7 (Fa. InforMax, Inc. Bethesda, USA) unter Standardparametern (angegeben ist jeweils das reife (mature) Enzym).Prior art proteases, calculated using the program Vector NTI Suite Ver.7 (InforMax, Inc. Bethesda, USA) under standard parameters (the mature enzyme is indicated in each case).
Darin bedeuten:In this mean:
SEQ ID NO.2: Erfindungsgemäße Ausgangsprotease gemäß SEQSEQ ID NO. 2: Starting protease according to the invention according to SEQ
ID NO.2 (reifes Enzym)ID NO.2 (mature enzyme)
BLAP: Alkalische Protease aus Bacillus lentus DSM 5483BLAP: Alkaline protease from Bacillus lentus DSM 5483
(WO 92/21760 A1 ) gemäß SEQ ID NO.3(WO 92/21760 A1) according to SEQ ID NO.3
Subtilisin 309: Subtilisin 309 gemäß SEQ ID NO.4 Subtilisin 309: Subtilisin 309 according to SEQ ID NO.4

Claims

Patentansprüche claims
1. Protease umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO.2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 78,5% identisch ist, zunehmend bevorzugt zu mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 99,25% identisch ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 211 oder Position 212 oder an den Positionen 211 und 212 eine im Vergleich zu der in SEQ ID NO.2 angegebenen Aminosäure veränderte Aminosäure aufweist.A protease comprising an amino acid sequence which is at least 78.5% identical to the amino acid sequence given in SEQ ID NO. 2, more preferably at least 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98 , 5%, 99% and most preferably 99.25% identical, characterized in that they are in the counting method according to SEQ ID NO. 2 at position 211 or position 212 or at positions 211 and 212 has an amino acid modified in comparison to the amino acid indicated in SEQ ID NO.
2. Protease nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Protease ausgewählt ist aus a) einer Protease, die in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 21 1 eine Aminosäure aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin, insbesondere eine Protease, die in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 211 einen Serinrest aufweist, b) einer Protease, die in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 212 eine Aminosäure aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin, insbesondere eine Protease, die in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 212 einen Asparaginrest aufweist, c) einer Protease, die in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 211 eine Aminosäure gemäß Merkmal a) aufweist und an Position 212 eine Aminosäure gemäß Merkmal b) aufweist, insbesondere eine Protease, die in der Zählweise gemäß SEQ ID NO. 2 an Position 211 einen Serinrest und an Position 212 einen Asparaginrest aufweist.2. Protease according to claim 1, characterized in that the protease is selected from a) a protease which in the counting method according to SEQ ID NO. 2 at position 21 1 has an amino acid selected from the group consisting of: alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, phenylalanine, proline, serine, threonine, Tryptophan, tyrosine and valine, in particular a protease which in the counting method according to SEQ ID NO. 2 at position 211 has a serine residue, b) a protease which is in the counting manner according to SEQ ID NO. 2 at position 212 has an amino acid selected from the group consisting of: alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan , Tyrosine and valine, in particular a protease, which in the counting manner according to SEQ ID NO. 2 at position 212 has an asparagine residue, c) a protease which is in the counting manner according to SEQ ID NO. 2 at position 211 has an amino acid according to feature a) and has at position 212 an amino acid according to feature b), in particular a protease which is in the counting method according to SEQ ID NO. 2 at position 211 has a serine residue and at position 212 an asparagine residue.
3. Protease, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease nach einem der Ansprüche 1 oder 2 als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 266 und zunehmend bevorzugt mindestens 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 und 50 zusammenhängenden Aminosäurepositionen mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt. 3. Protease, characterized in that it is obtainable from a protease according to any one of claims 1 or 2 as the starting molecule by fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis and an amino acid sequence comprising over a length of at least 266 and more preferably at least 260th , 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 and 50 contiguous amino acid positions matches the parent molecule.
4. Protease, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Ausgangsmolekül erhaltbar ist und einen oder mehrere weitere Aminosäureaustausche in Positionen aufweist, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO.3 in einem Alignment zugeordnet sind.4. protease, characterized in that it is obtainable from a protease according to one of claims 1 to 3 as the starting molecule and has one or more further amino acid substitutions in positions corresponding to the positions 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 and 268 of the alkaline protease from Bacillus lentus according to SEQ ID NO.3 are assigned in an alignment.
5. Nukleinsäuremolekül, kodierend für eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 4, insbesondere eines, das zu der in SEQ ID NO.1 angegebenen Nukleinsäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 78,5%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 99,25% identisch ist.5. Nucleic acid molecule encoding a protease according to one of claims 1 to 4, in particular one which, to the nucleic acid sequence given in SEQ ID NO.1, is increasingly preferably at least 78.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97 , 5%, 98%, 98.5%, 99% and most preferably 99.25% is identical.
6. Vektor enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.6. Vector comprising a nucleic acid molecule according to claim 5, in particular a cloning vector or an expression vector.
7. Nicht menschliche Wirtszelle, die eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 4 beinhaltet oder die zu deren Herstellung angeregt werden kann, vorzugsweise unter Einsatz eines Vektors gemäß Anspruch 6, insbesondere eine, die die Protease in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert.Non-human host cell comprising or capable of being stimulated to produce a protease according to any one of claims 1 to 4, preferably using a vector according to claim 6, in particular one which secretes the protease into the medium surrounding the host cell.
8. Wirtszelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii gibsonii, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.8. A host cell according to claim 7, characterized in that it is a bacterium, preferably one selected from the group of the genera of Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas and Pseudomonas, more preferably one, which is selected from the group of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii gibsonii, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor and Stenotrophomonas maltophilia.
9. Wirtszelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Zellkern besitzt.9. host cell according to claim 7, characterized in that it has a cell nucleus.
10. Verfahren zur Herstellung einer Protease gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, insbesondere unter Einsatz eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 5, vorzugsweise unter Einsatz eines Vektors nach Anspruch 6, besonders bevorzugt unter Einsatz einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 7 bis 9. 10. A method for producing a protease according to any one of claims 1 to 4, in particular using a nucleic acid molecule according to claim 5, preferably using a vector according to claim 6, particularly preferably using a host cell according to any one of claims 7 to 9.
11. Mittel, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält, insbesondere ein Waschmittel, Handwaschmittel, Spülmittel, Handgeschirrspülmittel, Maschinengeschirrspülmittel, Reinigungsmittel, Zahnprothesen- oder Kontaktlinsenpflegemittel, Nachspülmittel, Desinfektionsmittel, kosmetisches Mittel, pharmazeutisches Mittel oder ein Mittel zur Behandlung von Filtermedien, Textilien, Pelzen, Papier, Fellen oder Leder, insbesondere ein Wäschewaschmittel oder ein Geschirrspülmittel.11. Composition, characterized in that it contains at least one protease according to one of claims 1 to 4, in particular a detergent, hand washing detergent, dishwashing detergent, hand dishwashing detergent, machine dishwashing detergent, cleaning agent, denture or contact lens care, rinse aid, disinfectant, cosmetic, pharmaceutical agent or an agent for the treatment of filter media, textiles, furs, paper, furs or leather, in particular a laundry detergent or a dishwashing detergent.
12. Mittel nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass es als Einkomponentensystem vorliegt oder dass es in mehrere Komponenten aufgeteilt ist, und insbesondere eines, das die Protease in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels enthält.12. A composition according to claim 11, characterized in that it is present as a one-component system or that it is divided into several components, and in particular one, the protease in an amount of 2 micrograms to 20 mg, preferably from 5 micrograms to 17.5 mg , more preferably from 20 μg to 15 mg and most preferably from 50 μg to 10 mg per g of the agent.
13. Mittel nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass es in fester Form vorliegt, insbesondere als rieselfähiges Pulver mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l, oder dass es in pastöser oder in flüssiger Form vorliegt.13. Composition according to one of claims 11 or 12, characterized in that it is in solid form, in particular as a free-flowing powder having a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l, or that it is in pasty or liquid form.
14. Mittel nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für die Protease undurchlässigen Substanz umhüllt ist.14. A composition according to any one of claims 11 to 13, characterized in that the protease is coated with a at room temperature or in the absence of water for the protease impermeable substance.
15. Mittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, ferner umfassend eines oder mehrere weitere Enzyme, insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, ß-Glucosidase, Carrageenase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase.15. Composition according to one of claims 11 to 14, further comprising one or more further enzymes, in particular a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, ß-glucosidase, carrageenase, oxidase, oxidoreductase or a lipase.
16. Verwendung eines Mittels nach einem der Ansprüche 11 bis 15 zur Entfernung von protease- sensitiven Anschmutzungen auf Textilien oder harten Oberflächen.16. Use of a composition according to any one of claims 11 to 15 for the removal of protease-sensitive stains on textiles or hard surfaces.
17. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel nach einem der Ansprüche 11 bis 15 angewendet ist.17. A method for cleaning textiles or hard surfaces, characterized in that in at least one method step, an agent according to any one of claims 11 to 15 is applied.
18. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 4 proteolytisch aktiv ist, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.18. A process for the purification of textiles or hard surfaces, characterized in that in at least one process step, a protease according to any one of claims 1 to 4 is proteolytically active, in particular such that the protease in an amount of 40 micrograms 4 g, preferably from 50 μg to 3 g, more preferably from 100 μg to 2 g and most preferably from 200 μg to 1 g per application is used.
19. Verwendung einer Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist. 19. Use of a protease according to any one of claims 1 to 4 for the purification of textiles or hard surfaces, in particular such that the protease in an amount of 40 micrograms to 4 g, preferably from 50 micrograms to 3 g, particularly preferably of 100 micrograms to 2 g and most preferably from 200 micrograms to 1 g per application is used.
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