WO2008074425A1 - New high-throughput assay for identifying kinase inhibitors - Google Patents

Abstract

The invention relates to a new high-throughput assay for measuring kinase activity and for identifying a kinase inhibitor by determining the hydrolysis of ATP.

Description

Neuer High-Throughput-Assay zur Identifizierung von Kinase-Inhibitoren New high-throughput assay for the identification of kinase inhibitors

Die Erfindung betrifft einen neuen High-Throughput-Assay zum Messen der Kinaseaktivität und zum Identifizieren eines Kinase-Inhibitors durch Bestimmen der Hydrolyse von ATP.The invention relates to a novel high-throughput assay for measuring kinase activity and for identifying a kinase inhibitor by determining the hydrolysis of ATP.

Eine Kinase ist ein enzymatisches Protein, welches die Übertragung einer Phosphorylgruppe von ATP auf ein Substrat katalysiert. Das Substrat kann beispielsweise die Kinase selbst, ein anderes Protein, ein Peptid, ein Zucker oder ein Lipid sein. Phosphorylierung eines Proteinsubstrats kann dessen Funktion modulieren, z. B. seine Aktivität inhibieren. Wenn das Protein src beispielsweise an einem speziellen Tyrosin phosphoryliert wird, schützt es seine eigene Kinase-Domäne davor, mit einem Substrat in Wechselwirkung zu treten. Die Phosphorylierung eines Proteins kann in anderen Fällen zur Bindung des phosphorylierten Proteins durch andere Proteine führen, die eine Erkennungsdomäne für ein spezielles phosphoryliertes Proteinmotiv haben. Die größte Gruppe der Proteinkinasen wirkt auf spezifische Proteine und modifiziert diese, um Signale zu übertragen und komplexe Prozesse in Zellen zu steuern. Derartige phosphorylierte Proteine ändern üblicherweise ihre funktionale Aktivität. Das Genom des Menschen enthält etwa 500 Proteinkinasegene.A kinase is an enzymatic protein that catalyzes the transfer of a phosphoryl group from ATP to a substrate. The substrate may be, for example, the kinase itself, another protein, a peptide, a sugar or a lipid. Phosphorylation of a protein substrate can modulate its function, e.g. B. inhibit its activity. For example, when the protein src is phosphorylated on a specific tyrosine, it protects its own kinase domain from interacting with a substrate. Phosphorylation of a protein may in other cases lead to binding of the phosphorylated protein by other proteins that have a recognition domain for a particular phosphorylated protein motif. The largest group of protein kinases acts on specific proteins and modifies them to transmit signals and control complex processes in cells. Such phosphorylated proteins usually change their functional activity. The genome of humans contains about 500 protein kinase genes.

Die Detektierung einer Kinase-Aktivität wird unter Laborbedingungen üblicherweise durchgeführt, indem eine Kinase unter definierten Bedingungen mit einem speziellen Substrat inkubiert wird. Die Phosphorylierung des Substrats wird nach Abschluss der Inkubierung bestimmt, indem z. B. die eingebaute Radioaktivität gemessen wird oder ein Antikörper verwendet wird, der das phosphorylierte Produkt spezifisch erkennt. Es war aus dem Stand der Technik bekannt, dass Proteinkinase A in der Lage sein würde, ATP direkt zu hydrolysieren (Armstrong et al., PNAS 76, 722, 1976). Es war jedoch nicht möglich, diesen Effekt zur Bestimmung der Aktivität einer Kinase auszunutzen. Es wurde insbesondere nie untersucht, ob die ATP hydrolysierende Aktivität als Maß für die Proteinphosphorylierungsaktivität verwendet werden kann, und ob bekannte Kinase-Inhibitoren die ATP-Hydrolyse in einer ähnlichen Weise inhibieren, wie sie die Phosphorylierung von Protein- oder Peptidsubstraten blockieren. Es konnte zudem nicht gefolgert werden und wurde nicht untersucht, ob die ATP hydrolysierende Aktivität ein gemeinsames Merkmal vieler Kinasen sein könnte.The detection of kinase activity is usually carried out under laboratory conditions by incubating a kinase under defined conditions with a specific substrate. The phosphorylation of the substrate is determined after completion of the incubation by z. B. the incorporated radioactivity is measured or an antibody is used which specifically recognizes the phosphorylated product. It was known in the art that protein kinase A would be able to hydrolyze ATP directly (Armstrong et al., PNAS 76, 722, 1976). However, it was not possible to exploit this effect to determine the activity of a kinase. In particular, it has never been investigated whether the ATP hydrolyzing activity can be used as a measure of protein phosphorylation activity and whether known kinase inhibitors inhibit ATP hydrolysis in a manner similar to blocking the phosphorylation of protein or peptide substrates. In addition, it could not be concluded and it was not investigated whether the ATP hydrolyzing activity could be a common feature of many kinases.

Durch die Erfindung konnte gezeigt werden, dass direkte Hydrolyse von ATP durch unterschiedliche Kinasen eine effiziente Weise zur Bestimmung der Aktivität einer Kinase liefert, ohne dass eine Phosphorylgruppe auf ein Protein-, Peptid-, Zuckeroder Lipidsustrat übertragen werden muss. Es konnte ferner gezeigt werden, dass eine derartige Aktivität zum Arzneimittelscreening verwendet werden kann, insbesondere unter den Bedingungen des HTS (High-Throughput-Screening) in Bezug auf alle Typen von Kinasen. Der große Vorteil eines derartigen Verfahrens wäre das effektive Screening von Verbindungen auf ihre Kinase modulierende Aktivität, ohne dass ein spezifisches Substrat in ausreichend großen Mengen zur Verfügung stehen muss.The invention has demonstrated that direct hydrolysis of ATP by different kinases provides an efficient way of determining the activity of a kinase without having to transfer a phosphoryl group to a protein, peptide, sugar or lipid substrate. It has further been shown that such activity can be used for drug screening, especially under the conditions of HTS (High Throughput Screening) for all types of kinases. The big advantage of such a method would be the effective screening of compounds for their kinase modulating activity without having to have a specific substrate available in sufficiently large amounts.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP (Adenosintriphosphat). Die Proteinkinase kann jegliches Kinaseprotein oder ein Fragment davon sein. Die Aktivität bezieht sich auf den biologisch aktiven Zustand der Proteine, die insbesondere andere Proteine, Proteinfragmente oder Peptide, Zucker oder Lipide phosphorylieren, die entweder aus natürlichen Quellen isoliert oder chemisch synthetisiert wurden. Das Verfahren zum Detektieren dieser Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP wird jedoch erfindungsgemäß ohne Zugabe eines Protein-, Peptid-, Zucker- oder Lipidsubstrats der entsprechenden Kinase durchgeführt.The invention relates to a method for detecting the activity of a kinase by quantifying the hydrolysis of ATP (adenosine triphosphate). The protein kinase may be any kinase protein or a fragment thereof. The activity refers to the biologically active state of the proteins which, in particular, phosphorylate other proteins, protein fragments or peptides, sugars or lipids either isolated from natural sources or chemically synthesized. However, the method for detecting this activity of a kinase by quantifying the hydrolysis of ATP is carried out according to the invention without addition of a protein, peptide, sugar or lipid substrate of the corresponding kinase.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase a) das Inkubieren eines Kinaseproteins zusammen mit ATP in einer wässrigen Lösung und b) das Bestimmen der Menge an ATP, die hydrolysiert worden ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Menge an ATP mittels des Materials Luciferase bestimmt.In a preferred embodiment of the invention, the method for detecting the activity of a kinase comprises a) incubating a kinase protein together with ATP in an aqueous solution and b) determining the amount of ATP that has been hydrolyzed. In a further preferred embodiment of the invention, the amount of ATP is determined by means of the material luciferase.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase a) das Inkubieren eines Kinaseproteins zusammen mit ATP in einer wässrigen Lösung und b) das Bestimmen der Menge an ADP (Adenosindiphosphat) und/oder Pi (anorganischem Phosphat), die durch die Hydrolyse von ATP freigesetzt worden ist.In a further preferred embodiment of the invention, the method for detecting the activity of a kinase comprises a) incubating a kinase protein b) determining the amount of ADP (adenosine diphosphate) and / or Pi (inorganic phosphate) released by the hydrolysis of ATP.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase:In a further preferred embodiment of the invention, the method for detecting the activity of a kinase comprises:

a) das Inkubieren eines Kinaseproteins zusammen mit ATP und einem Detektierungssystem (z. B. Luciferin/Luciferase),a) incubating a kinase protein together with ATP and a detection system (eg luciferin / luciferase),

b) das Bestimmen der Menge an ATP, die hydrolysiert worden ist, mittels des Detektierungssystems von a).b) determining the amount of ATP that has been hydrolyzed by the detection system of a).

Ein derartiges Detektierungssystem, das mit dem Kinaseprotein und ATP inkubiert werden soll, wäre Luciferin/Luciferase, wie bereits genannt, oder einSuch a detection system to be incubated with the kinase protein and ATP would be luciferin / luciferase, as already mentioned, or a

Detektierungssystem, das für die Erkennung von ADP und/oder Pi spezifisch ist (z. B. spezifische Antikörper; kleine organische Moleküle).Detection system specific for recognition of ADP and / or Pi (eg, specific antibodies, small organic molecules).

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kinase ausgewählt aus einer Tyrosinkinase oder einer Serin/Threonin-Kinase.In a preferred embodiment of the invention, the kinase is selected from a tyrosine kinase or a serine / threonine kinase.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kinase aus der folgenden Gruppe EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1 , ROCK, MCK ausgewählt.In a particularly preferred embodiment of the invention, the kinase is selected from the following group: EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK.

In einer weiteren speziellen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kinase aus TAK1 , ABL oder PDK4 ausgewählt.In a further specific preferred embodiment of the invention, the kinase is selected from TAK1, ABL or PDK4.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst in irgendeiner der zuvor genannten Ausführungsformen die wässrige Lösung mehr als ein Kinaseprotein. Die wässrige Lösung könnte z. B. zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn und mehr Kinaseproteine von unterschiedlichem Typ, unterschiedlicher Spezifizität, der Herkunft aus unterschiedlichen Spezies, unterschiedlicher Reinigungsweise, unterschiedlicher Modifikation des Proteingrundgerüsts, unterschiedlicher Größe, unterschiedlichem Molekulargewicht, unterschiedlichem Zuckergehalt oder anderen Charakterisierungen enthalten.In another preferred embodiment of the invention, in any of the aforementioned embodiments, the aqueous solution comprises more than one kinase protein. The aqueous solution could, for. B. two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten and more kinase proteins of different types, different specificity, origin from different species, different methods of purification, different modification of the protein backbone, different size, different molecular weight, different Contain sugar content or other characterizations.

Das Verfahren zur Bestimmung der Menge an ATP, die hydrolysiert worden ist, und/oder an ADP und/oder Pi, die aus der ATP-Hydrolyse freigesetzt worden ist bzw. sind, kann unter Verwendung eines Kalibrierungsverfahrens, das unterThe method of determining the amount of ATP which has been hydrolyzed and / or of ADP and / or Pi released from ATP hydrolysis may be determined using a calibration procedure described in U.S. Pat

Berücksichtigung der entsprechenden relevanten experimentellen Bedingungen durchgeführt worden ist (z. B. Puffer, pH-Wert, Temperatur, Protein, Lösungsmittel, Ionen, Cofaktoren, Konzentrationen von ATP und/oder ADP und/oder Pi) und/oder unter Verwendung eines internen oder externen, fixierten oder flexiblen Referenzsystems erfolgen (z. B. Nullpunkt und/oder Basisniveau des spektroskopischen Systems).Considering the relevant relevant experimental conditions has been performed (eg buffer, pH, temperature, protein, solvents, ions, cofactors, concentrations of ATP and / or ADP and / or Pi) and / or using an internal or external, fixed or flexible reference system (eg zero point and / or base level of the spectroscopic system).

Im Kontext des Verfahrens zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP in einer oder mehreren Ausführungsformen wie beschrieben sollten zuvor experimentelle Aufbauten zu Kontroll- oderIn the context of the method of detecting the activity of a kinase by quantifying the hydrolysis of ATP in one or more embodiments as described above, experimental setups should be used to control or

Vergleichszwecken durchgeführt werden, insbesondere zu Zwecken der verbesserten Genauigkeit und Wiederholbarkeit oder aus anderen Gründen. Ein Kontrollexperiment könnte beispielsweise aus einem weiteren experimentellen Aufbau (zur Kontrolle) bestehen, wobei im Unterschied zu dem vollständigen experimentellen Aufbau, der einen vollständigen Satz der Komponenten zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens aufweist, mindestens eine der Komponenten (insbesondere das Protein und/oder ATP) weggelassen wurde.For purposes of comparison, in particular for purposes of improved accuracy and repeatability or for other reasons. For example, a control experiment could consist of a further experimental set-up (for control), wherein, in contrast to the complete experimental set-up comprising a complete set of components for carrying out the method according to the invention, at least one of the components (in particular the protein and / or ATP) was omitted.

Das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP in einer oder mehreren der Ausführungsformen wie bereits erwähnt kann in einer diskreten (einem oder mehreren, zeitlich getrennten Bestimmungspunkten) oder in einer kontinuierlichen Weise (aufeinanderfolgende Bestimmung) durchgeführt werden.The method for detecting the activity of a kinase by quantifying the hydrolysis of ATP in one or more of the embodiments as already mentioned may be carried out in a discrete one or more time-separated manner Destinations) or in a continuous manner (sequential determination).

Das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP in einer oder mehreren der zuvor beschriebenenThe method of detecting the activity of a kinase by quantifying the hydrolysis of ATP in one or more of the previously described

Ausführungsformen kann zur Identifizierung oder Profilierung einer chemischen Verbindung verwendet werden, die in der Lage ist, die Aktivität eines Kinaseproteins zu inhibieren oder zu stimulieren, oder kann zur Bestimmung der Aktivität einer Kinase in einer biologischen Probe verwendet werden. Eine biologische Probe besteht aus lebenden oder toten Zellen von eukariontischen (einschließlich Wirbeltieren, insbesondere Säugern, speziell Hund, Ratte, Maus, Rind, Schwein sowie Menschen) oder prokariontischen Organismen (einschließlich Bakterien, Hefe) Organismen.Embodiments may be used to identify or profile a chemical compound capable of inhibiting or stimulating the activity of a kinase protein, or may be used to determine the activity of a kinase in a biological sample. A biological sample consists of living or dead cells from eukaryotic (including vertebrates, especially mammals, especially dogs, rats, mice, cattle, pigs and humans) or prokaryotic organisms (including bacteria, yeast) organisms.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten einer Kinase, wobeiThe invention further relates to a method for identifying an antagonist of a kinase, wherein

a) eine Kinase (z. B. Tyrosinkinase, Serin/Threonin-Kinase, EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1 , ROCK, MCK, TAK1 , ABL, PDK4 oder andere) in wässriger Lösung bereitgestellt wird,a) a kinase (eg tyrosine kinase, serine / threonine kinase, EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK, TAK1, ABL, PDK4 or others) is provided in aqueous solution,

b) eine Lösung, die ATP enthält, bereitgestellt wird,b) providing a solution containing ATP,

c) eine Lösung, die Luciferin und Luciferase enthält, bereitgestellt wird,c) providing a solution containing luciferin and luciferase,

d) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,d) a chemical compound is provided,

e) die Kinase in wässriger Lösung aus a) und die chemische Verbindung aus d) inkubiert werden,e) the kinase is incubated in aqueous solution from a) and the chemical compound from d),

f) die Aktivität der Proteinkinase z. B. mittels ATP, Luciferin und Luciferase bestimmt wird. Dies kann durchgeführt werden, indem entweder Kinase, Verbindung und ATP für eine bestimmte Zeitdauer inkubiert werden und danach Luciferin/Luciferase zur Bestimmung des restlichen ATP zugefügt werden, oder indem Kinase, Verbindung, ATP und Luciferin/Luciferase zusammen inkubiert werden und das Abklingen der ATP- Konzentration überwacht wird,f) the activity of the protein kinase z. B. by ATP, luciferin and luciferase is determined. This can be done by incubating either kinase, compound and ATP for a certain period of time and then luciferin / luciferase Determination of residual ATP may be added or by co-incubation of kinase, compound, ATP and luciferin / luciferase and monitoring of ATP concentration decay,

g) das Ergebnis von d) möglicherweise durch Ergebnisse von einem oder mehreren Kontrollexperimenten abgewogen wird, wobei die Inkubierung gemäß c) durchgeführt wird, indem die chemische Verbindung und/oder die Kinase weggelassen wird,g) the result of d) is possibly weighed by results of one or more control experiments, wherein the incubation according to c) is carried out by omitting the chemical compound and / or the kinase,

h) das Ergebnis von d) und/oder e) möglicherweise durch die Ergebnisse aus einem Kontrollexperiment abgewogen wird, wobei die Verbindung gemäß b) ein bekannter Kinaseantagonist ist.h) the result of d) and / or e) is possibly weighed by the results of a control experiment, the compound according to b) being a known kinase antagonist.

Da ein Antagonist eine Verbindung ist, die die Aktivität einer Kinase inhibiert, wird ein positives Ergebnis zum Identifizieren eines Antagonisten durGh diesen Assay durch verringerte Aktivität der Kinase gezeigt, die dazu führt, dass weniger ATP hydrolysiert wird.Since an antagonist is a compound that inhibits the activity of a kinase, a positive result for identifying an antagonist by this assay is demonstrated by decreased kinase activity that results in less ATP being hydrolyzed.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Identifizieren eines Agonisten einer Kinase, wobeiThe invention also relates to a method for identifying an agonist of a kinase, wherein

a) eine Kinase (z. B. Tyrosinkinase, Serin/Threonin-Kinase, EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDk2, MKK1 , ROCK, MCK, TAK1 , ABL, PDK4 oder andere) in wässriger Lösung, die ferner ATP, Luciferin, Luciferase und möglicherweise zusätzliche Verbindungen, jedoch kein Peptid-, Protein-, Zucker- oder Lipidsubstrat der Kinase umfasst, bereitgestellt wird,a) a kinase (eg tyrosine kinase, serine / threonine kinase, EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDk2, MKK1, ROCK, MCK, TAK1, ABL, PDK4 or others) in aqueous solution, which also contains ATP, luciferin , Luciferase and possibly additional compounds, but does not include a peptide, protein, sugar or lipid substrate of the kinase is provided,

b) eine Lösung bereitgestellt wird, die ATP und mögliche zusätzliche Komponenten umfasst,b) providing a solution comprising ATP and possible additional components,

c) eine Lösung bereitgestellt wird, die Luciferin, Luciferase und mögliche zusätzliche Komponenten umfasst, d) ein Inhibitor der Kinase bereitgestellt wird,c) providing a solution comprising luciferin, luciferase and possible additional components, d) an inhibitor of the kinase is provided,

e) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,e) a chemical compound is provided,

f) die Kinase in wässriger Lösung gemäß a), der Inhibitor gemäß b) und die chemische Verbindung gemäß c) inkubiert werden,f) the kinase is incubated in aqueous solution according to a), the inhibitor according to b) and the chemical compound according to c),

g) die Aktivität der Kinase z. B. mittels ATP, Luciferin und Luciferase bestimmt wird,g) the activity of the kinase z. B. determined by ATP, luciferin and luciferase,

h) das Ergebnis von e) möglicherweise durch die Ergebnisse von einem oder mehreren Kontrollexperimenten abgewogen wird, wobei die Inkubation gemäß d) durchgeführt wird, indem die chemische Verbindung und/oder die Kinase weggelassen wird; dies kann erfolgen, indem entweder Kinase, Inhibitor, Verbindung und ATP für eine bestimmte Zeitdauer inkubiert werden und danach zur Bestimmung des restlichen ATP Luciferin/Luciferase zugegeben wird, oder indem Kinase, Inhibitor, Verbindung, ATP und Luciferin/Luciferase zusammen inkubiert werden und das Abklingen der ATP- Konzentration aufgezeichnet wird,h) the result of e) is possibly weighed by the results of one or more control experiments, wherein the incubation according to d) is carried out by omitting the chemical compound and / or the kinase; this can be done by incubating either kinase, inhibitor, compound and ATP for a certain period of time and then adding to the residual ATP luciferin / luciferase, or by incubating the kinase, inhibitor, compound, ATP and luciferin / luciferase together, and Decay of the ATP concentration is recorded

i) das Ergebnis von e) und/oder f) möglicherweise durch die Ergebnisse aus einem Kontrollexperiment abgewogen wird, wobei die Verbindung gemäß b) ein bekannter Kinaseagonist ist.i) the result of e) and / or f) is possibly weighed by the results of a control experiment, the compound according to b) being a known kinase agonist.

Da ein Agonist eine Verbindung ist, die die Aktivität einer Kinase stimuliert, wird ein positives Ergebnis zum Identifizieren eines Agonisten durch diesen Assay durch erhöhte Aktivität der Kinase gezeigt, die dazu führt, dass mehr ATP hydrolysiert wird.Since an agonist is a compound that stimulates the activity of a kinase, a positive result for identifying an agonist by this assay is demonstrated by increased activity of the kinase resulting in more ATP being hydrolyzed.

Das Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten oder Agonisten wie zuvor beschrieben kann in einer Ausführungsform der Erfindung als High-Throughput- Screening (HTS) durchgeführt werden.The method of identifying an antagonist or agonist as described above may be performed in one embodiment of the invention as high throughput screening (HTS).

Die Erfindung wird nachfolgend genauer definiert, ohne den Schutzumfang der Ansprüche auf eine einzige Definition zu begrenzen. Eine Proteinkinase ist ein Enzym, das andere Proteine oder sich selbst (Autophosphorylierung) phosphoryliert. Proteinphosphorylierung ist ein Regulierungsmechanismus einer lebenden Zelle, der eine Rolle bei der Steuerung von Zellfunktionen spielt (z. B. Differenzierung, Entwicklung, Signalgebung, Metabolismus, Zellzyklus, Fortpflanzung und anderen). Die Phosphorylierung eines Proteins ändert üblicherweise die funktionale Aktivität des Proteins. Deregulierte Kinasen können zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen, wie z. B. Krebs, metabolischen Erkrankungen (z. B. Diabetes), verringerter Fähigkeit zur Bekämpfung von viralen oder bakteriellen Infektionen, Erkrankungen der Atemwege, Erkrankungen des zentralen Nervensystems, Erkrankungen vitaler Organfunktionen (z. B. Herz, Lunge) und dergleichen.The invention will be further defined below without limiting the scope of the claims to a single definition. A protein kinase is an enzyme that phosphorylates other proteins or itself (autophosphorylation). Protein phosphorylation is a regulatory mechanism of a living cell that plays a role in the control of cellular functions (eg, differentiation, development, signaling, metabolism, cell cycle, reproduction, and others). The phosphorylation of a protein usually changes the functional activity of the protein. Deregulated kinases can lead to serious side effects such. Cancer, metabolic diseases (e.g., diabetes), reduced ability to control viral or bacterial infections, respiratory diseases, central nervous system disorders, vital organ function disorders (e.g., heart, lung), and the like.

Der Begriff Proteinkinase soll sich auf die Enzymklasse als solche beziehen, um die Proteinkinasegruppe von anderen Enzymen oder Rezeptoren (z. B. Phosphatasen, GPCR) zu differenzieren. Der Begriff Proteinkinaseprotein oder Kinaseprotein wird zur Bezeichnung des Proteins oder eines Fragments eines Proteins einer Proteinkinase verwendet. Tyrosinkinasen (EC 2.7.10.1 ) phosphorylieren Tyrosin-Aminosäurereste.The term protein kinase is intended to refer to the enzyme class as such to differentiate the protein kinase group from other enzymes or receptors (eg, phosphatases, GPCRs). The term protein kinase protein or kinase protein is used to refer to the protein or a fragment of a protein of a protein kinase. Tyrosine kinases (EC 2.7.10.1) phosphorylate tyrosine amino acid residues.

Tyrosinkinasen sind an der Signalweiterleitung beteiligt. Sie spielen eine bedeutende Rolle als Wachstumsfaktorrezeptoren (z. B. Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor - EGFR; Insulinrezeptor - IR und andere) sowie in der nachgeordneten Signalgebung von Wachstumsfaktoren. Serin/Threonin-Kinasen (EC 2.7.11.1 ) phosphorylieren die OH-Gruppe von Serin oder Threonin. Diese Kinasen werden oft durch chemische Signale reguliert, wie z. B. cAMP, cGMP, Diacylglycerin, Ca²⁺ oder andere. Serin/Threonin-Kinasen sind beispielsweise Phosphorylasekinase, Proteinkinase A, Proteinkinase B oder Proteinkinase C. Phosphorylasekinase (EC 2.7.11.19) ist ein hexadecameres Enzym, das aus vier unterschiedlichen Untereinheiten aufgebaut ist. Proteinkinase A (EC 2.7.11.1 ) besteht aus zwei Domänen. Die Bindungsstellen für ATP und Substrat sind zwischen den beiden Domänen angeordnet. Proteinkinase B (auch als Akt-Kinase bekannt) ist ein Schlüsselenzym von zahlreichen intrazellulären Signalgebungswegen. Die Aktivierung von Proteinkinase B stört die apoptotische Signalweiterleitung. Gleichzeitig führt sie zur Proliferation von Zellen. Proteinkinase C (EC 2.7.11.1 ) besteht aus einer Familie von etwa 10 Isozymen.Tyrosine kinases are involved in signal transduction. They play an important role as growth factor receptors (eg epidermal growth factor receptor - EGFR, insulin receptor - IR and others) as well as in the downstream signaling of growth factors. Serine / threonine kinases (EC 2.7.11.1) phosphorylate the OH group of serine or threonine. These kinases are often regulated by chemical signals, such as. CAMP, cGMP, diacylglycerol, Ca ²⁺ or others. Serine / threonine kinases are, for example, phosphorylase kinase, protein kinase A, protein kinase B or protein kinase C. Phosphorylase kinase (EC 2.7.11.19) is a hexadecameric enzyme which is composed of four different subunits. Protein kinase A (EC 2.7.11.1) consists of two domains. The binding sites for ATP and substrate are located between the two domains. Protein kinase B (also known as Akt kinase) is a key enzyme of numerous intracellular signaling pathways. The activation of protein kinase B disturbs the apoptotic Signaling. At the same time it leads to the proliferation of cells. Protein kinase C (EC 2.7.11.1) consists of a family of about 10 isozymes.

Andere wichtige Kinasen sind die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK; EC 2.7.11.1 ). Die MAPKs werden durch extrazelluläre Signalmoleküle (Mitogene) getriggert. Sie sind an der Regulierung zahlreicher zellulärer Aktivitäten beteiligt, z. B.Other important kinases are the mitogen-activated protein kinases (MAPK; EC 2.7.11.1). The MAPKs are triggered by extracellular signaling molecules (mitogens). They are involved in the regulation of numerous cellular activities, eg. B.

Differenzierung, Genexpression, Mitose und Apoptose. Extrazelluläre Stimuli führen die Aktivierung einer MAPK über eine Signalgebungskaskade herbei, die MAPK,Differentiation, gene expression, mitosis and apoptosis. Extracellular stimuli cause activation of MAPK via a signaling cascade called MAPK,

MAPK-Kinase (MAPKK) und MAPKK-Kinase (MAPKKK) umfasst.MAPK kinase (MAPKK) and MAPKK kinase (MAPKKK).

Bei Säugern sind unterschiedliche Gruppen von MAPKs bekannt: ERK (extrazelluläre signalregulierte Kinase), JNK (c-Jun N-terminale Kinase), p38-lsoformen und andere.In mammals, different groups of MAPKs are known: ERK (extracellular signal-regulated kinase), JNK (c-Jun N-terminal kinase), p38 isoforms, and others.

MEK (= MAP/ERK-Kinase) ist eine gemischte Serin/Threonin- und Tyrosinkinase. MEK spielt die Rolle einer MAPKK.MEK (= MAP / ERK kinase) is a mixed serine / threonine and tyrosine kinase. MEK plays the role of MAPKK.

Andere wichtige Kinasen sind z. B.Other important kinases are z. B.

EGFR (epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor),EGFR (epidermal growth factor receptor),

VEGFR (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktorrezeptor),VEGFR (vascular endothelial growth factor receptor),

NGFR (Nervenwachstumsfaktorrezeptor),NGFR (Nerve Growth Factor Receptor),

CDK2 (Cyclin-abhängige Kinase 2),CDK2 (cyclin-dependent kinase 2),

RocK (Rho-assozierte Kinase),RocK (Rho-associated kinase),

MLK (Myosin-Leichtkettenkinase),MLK (myosin light chain kinase),

ABL (Abelson-Kinase) oder PDK4 (Phosphoinositid-abhängige Kinase 4) oder andere. TGF-ß-assoziierte Kinase 1 (TAK1 ) ist eine Serin/Threonin-Kinase, die ein Mitglied der Mitogen-aktivierten Kinase Kinase Kinase- (MAPKKK)-Familie ist. Sie gehört zu dem entzündungsfördernden zellulären Signalgebungsweg, indem die JNK, p38- und NF- vcB-Wege aktiviert werden. In der Zelle ist TAK1 Teil eines Proteinkomplexes, der Adapterproteine wie TAB1 , TAB2 oder TAB3 enthält. Dieser Komplex wird wiederum durch TRAF6 aktiviert, eine RING-Domänen-Ubiquitinligase, die die Synthese von Lys63-verlinkten Polyubiquitinketten erleichtert.ABL (Abelson kinase) or PDK4 (phosphoinositide-dependent kinase 4) or others. TGF-β-associated kinase 1 (TAK1) is a serine / threonine kinase that is a member of the mitogen-activated kinase kinase kinase (MAPKKK) family. It belongs to the proinflammatory cellular signaling pathway by activating the JNK, p38 and NF-vcB pathways. In the cell, TAK1 is part of a protein complex that contains adapter proteins such as TAB1, TAB2 or TAB3. This complex is in turn activated by TRAF6, a RING domain ubiquitin ligase that facilitates the synthesis of Lys63-linked polyubiquitin chains.

Es ist gezeigt worden, dass TAK1 im Myokard nach Drucküberlastung aktiviert wird. Ihre Inhibierung könnte für die Behandlung der koronaren Herzerkrankung und der Prävention von Herzversagen vorteilhaft sein.It has been shown that TAK1 is activated in the myocardium after pressure overload. Their inhibition could be beneficial for the treatment of coronary heart disease and the prevention of heart failure.

Die wässrige Lösung einer Kinase enthält die Kinase in einer Menge von üblicherweise 1 ng bis zu 100 μg pro ml. Die wässrige Lösung kann neben der Kinase eine Puffersubstanz (z. B. Tris oder Hepes bei einem definierten pH-Wert, z. B. zwischen 6,5 bis zu 7,5), zweiwertige oder einwertige Kationen oder Anionen (z. B. Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Cl ), Stabilisierungsmittel (z. B. Glykol oder Glycerin), Konservierungsmittel (z. B. Alkohole, Antibiotika) oder andere Substanzen enthalten. Lyophilisierte Proteine (wie z. B. Proteinkinasen) sind einem Dehydratisierungsprozess (Lyophilisierung, auch als Gefriertrocknen bekannt) unterzogen worden, wobei das gefrorene Material unter reduziertem Umgebungsdruck angeordnet wird, damit das gefrorene Wasser in dem Material direkt aus der festen Phase in die Gasphase sublimieren kann.The aqueous solution of a kinase contains the kinase in an amount of usually 1 ng up to 100 μg per ml. The aqueous solution may contain, in addition to the kinase, a buffer substance (eg Tris or Hepes at a defined pH, eg. between 6.5 to 7.5), divalent or monovalent cations or anions (e.g., Na ⁺ , K ⁺ , Mg ²⁺ , Ca ²⁺ , Cl), stabilizing agents (e.g., glycol or glycerin), Preservatives (eg alcohols, antibiotics) or other substances. Lyophilized proteins (such as protein kinases) have undergone a dehydration process (lyophilization, also known as freeze-drying) wherein the frozen material is placed under reduced ambient pressure to sublime the frozen water in the material directly from the solid phase to the gas phase can.

Ein Antagonist ist eine Substanz (z. B. chemische Verbindung, kleines organisches Molekül, Peptid, Protein oder andere), die die normale physiologische Funktion eines Proteins inhibiert, wie z. B. eines Enzyms oder Rezeptors oder anderer.An antagonist is a substance (eg, chemical compound, small organic molecule, peptide, protein, or others) that inhibits the normal physiological function of a protein, such as a protein. As an enzyme or receptor or other.

Antagonisten können mit einem Agonisten um die Bindungsstelle eines Proteins konkurrieren (= kompetitiver Antagonist) oder können durch andere Mittel antagonisieren (= nicht-kompetitive Antagonisten). Ein Agonist ist eine Substanz (z. B. chemische Verbindung, kleines organisches Molekül, Peptid, Protein oder andere), die an ein Protein (z. B. ein Enzym, einen Rezeptor oder andere) bindet, um die jeweilige Aktivität in einer Zelle zu triggem. Sowohl Antagonisten als auch Agonisten können als aktive Bestandteile in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit beitragen.Antagonists can compete with an agonist for the binding site of a protein (= competitive antagonist) or can antagonize by other means (= non-competitive antagonists). An agonist is a substance (eg, chemical compound, small organic molecule, peptide, protein, or others) that binds to a protein (eg, an enzyme, a receptor, or others) to the respective one Activity in a cell too triggem. Both antagonists and agonists may contribute to the treatment of a disease as active ingredients in a pharmaceutical composition.

Eine chemische Verbindung wird insbesondere durch chemische Synthese oder durch Reinigung aus einer biologischen Quelle bereitgestellt.In particular, a chemical compound is provided by chemical synthesis or by purification from a biological source.

Der Fachmann verwendet Routineverfahren zur chemischen Synthese einer Verbindung oder zur Reinigung aus einer biologischen Quelle. Derartige Verfahren stehen dem Fachmann in Lehrbüchern wie "Organic Synthesis Workbook", 1995, John Wiley & Sons, ISBN 3-527-30187-9, "The Organic Chemistry of Drug Synthesis", 1998, John Wiley & Sons, ISBN 0-471-24510-0, oder "Bioactive Compounds from Natural Sources", 2001 , Taylor & Francis, ISBN 0-7484-0890-8 zur Verfügung.The person skilled in the art uses routine methods for the chemical synthesis of a compound or for purification from a biological source. Such methods are known to those of skill in textbooks such as "Organic Synthesis Workbook", 1995, John Wiley & Sons, ISBN 3-527-30187-9, "The Organic Chemistry of Drug Synthesis", 1998, John Wiley & Sons, ISBN 0-471 -24510-0, or "Bioactive Compounds from Natural Sources", 2001, Taylor & Francis, ISBN 0-7484-0890-8.

Die durch Synthese oder Reinigung erhaltenen Verbindungen können in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst werden. Geeignete Lösungsmittel können Wasser, Puffersubstanzen (z. B. Tris, HEPES, MOPS, usw.), einwertige und/oder zweiwertige Ionen (z. B. K⁺, Na⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, usw.), Säuren (z. B. HCl, H₂SO₄, Ameisensäure, Essigsäure, usw.), Basen (z. B. NaOH, usw.), Alkohol (z. B. Methanol, Ethanol, Glycerin), Detergentien (z. B. Na-Dodecylsulfat), organische Lösungsmittel (z. B. Formamid, Aceton, Dimethylsulfoxid, usw.) und andere Komponenten (z. B. Solubilisierungsmittel oder Stabilisatoren) enthalten.The compounds obtained by synthesis or purification can be dissolved in a suitable solvent. Suitable solvents may be water, buffering agents (eg, Tris, HEPES, MOPS, etc.), monovalent and / or divalent ions (eg, K ⁺ , Na ⁺ , Mg ²⁺ , Ca ²⁺ , etc.), Acids (e.g., HCl, H ₂ SO ₄ , formic acid, acetic acid, etc.), bases (e.g., NaOH, etc.), alcohol (e.g., methanol, ethanol, glycerin), detergents (e.g. Na-dodecyl sulfate), organic solvents (e.g., formamide, acetone, dimethyl sulfoxide, etc.) and other components (e.g., solubilizers or stabilizers).

Das Inkubieren von z. B. einer Proteinkinase und einer chemischen Verbindung wird durchgeführt, indem diese Komponenten in Kontakt gebracht werden und für eine bestimmte Zeit (z. B. 1 , 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 Minuten oder mehr) auf einer vorgewählten Temperatur (zwischen 20⁰C und 40⁰C, z. B. 37°C) gehalten werden.Incubating z. A protein kinase and a chemical compound is performed by contacting these components and for a certain time (e.g., 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 minutes or more) on a preselected one Temperature (between 20 ⁰ C and 40 ⁰ C, eg 37 ° C) are kept.

Der Fachmann kann die Komponenten des erfindungsgemäßen Assays unter Verwendung von Routinelaborverfahren in Kontakt miteinander bringen. Das Kontaktieren kann beispielsweise in Erlenmeyer-Kolben, Röhrchen, Eppendorf- Gefäßen oder in Mikrotiterplatten stattfinden. Für das Kontaktieren können temperaturgeregelte Inkubatoren verwendet werden, bei denen eine konstante Temperatur von beispielsweise 30⁰C oder 37°C und feste CO2- oder Feuchtigkeitsbedingungen eingestellt werden können. Das Kontaktieren kann insbesondere auch in Laborrobotervorrichtungen durchgeführt werden. Es kann für unterschiedliche Zeitspannen von wenigen Sekunden bis Minuten und bis zu mehrere Stunden kontaktiert werden. Die in jedem Fall zu wählenden Bedingungen hängen von der Identität und Konzentration der Kinase, der Zusammensetzung des Lösungsmittels und der chemischen Verbindung ab.The person skilled in the art can bring the components of the assay according to the invention into contact with one another using routine laboratory procedures. The contacting can take place, for example, in Erlenmeyer flasks, tubes, Eppendorf tubes or in microtiter plates. For the contact can temperature-controlled incubators are used, in which a constant temperature of, for example, 30 ⁰ C or 37 ° C and fixed CO2 or humidity conditions can be set. The contacting can also be carried out in particular in laboratory robot devices. It can be contacted for different time periods from a few seconds to minutes and up to several hours. The conditions to be chosen in each case depend on the identity and concentration of the kinase, the composition of the solvent and the chemical compound.

ATP ist Adenosin-δ'-triphosphat.ATP is adenosine delta-triphosphate.

Luciferin ist ein Licht emittierendes Pigment, das sich in Organismen wie Glühwürmchen, Bakterien oder Dinoflagelaten findet. Luciferase ist ein Enzym, das Luciferin unter Erzeugung von Oxyluciferin und Licht oxidieren kann.Luciferin is a light-emitting pigment found in organisms such as fireflies, bacteria or dinoflagelates. Luciferase is an enzyme that can oxidize luciferin to produce oxyluciferin and light.

Screening bedeutet das Untersuchen einer großen Anzahl von Verbindungen, um pharmakologisch aktive Substanzen bei der Arzneimittelforschung zu identifizieren.Screening involves examining a large number of compounds to identify pharmacologically active substances in drug discovery.

Beim High-Throughput-Screening (HTS) werden große Bibliotheken, die aus chemischen Verbindungen bestehen, auf ihre Fähigkeit zum Aktivieren oder Inhibieren eines Ziels (Targets) (z. B. Proteinkinase) getestet. Eine weitere Anwendung von HTS ist das Testen der Selektivität einer Verbindung.In high-throughput screening (HTS), large libraries of chemical compounds are tested for their ability to activate or inhibit a target (eg, protein kinase). Another application of HTS is to test the selectivity of a compound.

Das Testen wird bei HTS üblicherweise auf Platten (Platten mit 24, 96, 384, 1536 (und mehr) Mulden) in einem automatisierten Verfahren mittels Laborrobotern durchgeführt.Testing in HTS is usually performed on plates (plates with 24, 96, 384, 1536 (and more) wells) in an automated procedure using laboratory robots.

3. Materialien und Verfahren 3.1. Materialien3. Materials and Methods 3.1. materials

Charakteristika des Enzyms:Characteristics of the enzyme:

1 ) TAK1-TAB1 Fusion, aktiv1) TAK1-TAB1 fusion, active

2) humanes rekombinantes Enzym, exprimiert in Sf21 -Zellen, N-terminal His-markiert2) human recombinant enzyme expressed in Sf21 cells, His-tagged N-terminally

3) enthält TAK1 -Aminosäuren 1-303, fusioniert an TAB1 -Aminosäuren 437-Ende3) contains TAK1 -amino acids 1-303 fused to TAB1-amino acids 437-end

4) MW = 42,8 kD4) MW = 42.8 kD

5) gereinigt unter Verwendung von Ni²⁺/NTA-Agarose, Reinheit > 90 % gemäß Coomassie SDS PAGE 6) geliefert als 0,92 mg/ml Lösung in 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 30 mM NaCI, 0,1 mM EGTA, 0,03 % Brij-35, 0,2 mM PMSF, 1 mM Benzamidin, 0,1 % 2-Mercaptoethanol 7) aliquotiert und gelagert bei -70⁰C. 3.2. Herstellung der Reagentien5) purified using Ni ²⁺ / NTA agarose, purity> 90% according to Coomassie SDS PAGE 6) as 0.92 mg / ml solution in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 30 mM NaCl, 0.1 mM EGTA, 0.03% Brij-35, 0.2 mM PMSF, 1 mM benzamidine , 0.1% 2-mercaptoethanol 7) aliquoted and stored at -70 ⁰ C. 3.2. Preparation of the reagents

3.2.1. Vorratslösungen3.2.1. stock solutions

3.2.2. Puffer und Reagentien

3.2.2. Buffers and reagents

3.3. Experimentelles Verfahren:3.3. Experimental procedure:

3.3.1. Pipettierstufen3.3.1. pipetting steps

1 ) 2 μl Verbindung (60 μM in Reaktionspuffer, 3 % DMSO, Kotrollen: Reaktionspuffer, 3 % DMSO)1) 2 μl of compound (60 μM in reaction buffer, 3% DMSO, control rolls: reaction buffer, 3% DMSO)

2) + 2 μl Enzymlösung (2,3 μg/ml TAK1 in Reaktionspuffer, niedrige Kontrolle: Reaktionspuffer) 3) 30 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur2) + 2 μl enzyme solution (2.3 μg / ml TAK1 in reaction buffer, low control: reaction buffer) 3) Incubate at room temperature for 30 minutes

4) + 2 μl ATP-Lösung (6 μM in Reaktionspuffer)4) + 2 μl ATP solution (6 μM in reaction buffer)

5) 60 Minuten Inkubieren bei 32⁰C5) 60 minutes incubation at 32 ⁰ C

6) + 6 μl Detektierungslösung6) + 6 μl detection solution

7) Zentrifugieren, 10 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur7) Centrifuge, incubate for 10 minutes at room temperature

8) Ablesen der Lumineszenz mit Tecan Ultra8) Reading the luminescence with Tecan Ultra

3.3.2. Kontrollen und Standards:3.3.2. Controls and standards:

1 ) hohe Kontrolle: Tris-Puffer, 4 % DMSO anstelle von Verbindungslösung1) high control: Tris buffer, 4% DMSO instead of compound solution

2) niedrige Kontrolle: Tris-Puffer, 4 % DMSO anstelle von Verbindung, Reaktionspuffer anstelle von Enzymlösung2) low control: Tris buffer, 4% DMSO instead of compound, reaction buffer instead of enzyme solution

3) Standard: 5Z-7-Oxozeaenol, 200 nM in Tris-Puffer, 4 % DMSO3) Standard: 5Z-7-Oxozeaenol, 200 nM in Tris buffer, 4% DMSO

3.3.3. Reagenzkonzentrationen in dem Assay3.3.3. Reagent concentrations in the assay

3.3.4. Anmerkungen:

3.3.4. Remarks:

1 ) Die Pipettierstufen wurden mit einem CyBio Cybi-Well 384-Spitzensystem durchgeführt.1) The pipetting steps were performed with a CyBio Cybi-Well 384 tip system.

2) Die Luciferin/Luciferase-Lösung ist lichtempfindlich. Sie wird durch Verwendung von schwarzen Urplatten und Abdecken der Testplatten nach dem Pipettieren vor Licht geschützt.2) The luciferin / luciferase solution is photosensitive. It is protected from light by using black parent plates and covering the test plates after pipetting.

3) Die Spitzen wurden während des Verbindungstransfers zwischen den3) The spikes were made during the connection transfer between the

Verbindungstransferstufen mit 10 % Isopropanol, 0,001 % Pluronic F-68 in H₂O und bei allen anderen Abgabestufen mit 10 % Isopropanol in Tris-Puffer gewaschen.Compound transfer steps were washed with 10% isopropanol, 0.001% Pluronic F-68 in H ₂ O, and 10% isopropanol in Tris buffer for all other delivery steps.

3.3.5. Dosis-Reaktions-Messungen3.3.5. Dose-response measurements

Verbindungen:Links:

1 ) 3 μl 10 mM in DMSO, es wurden 24 μl Reaktionspuffer zugeben, 3 % DMSO, ergab 1 ,1 mM Verbindung in Reaktionspuffer, 13,8 % DMSO1) Add 3 μl 10 mM in DMSO, add 24 μl reaction buffer, add 3% DMSO, give 1, 1 mM compound in reaction buffer, 13.8% DMSO

2) 19,5 μl wurden auf Tochterplatte überführt, 70 μl Reaktionspuffer ohne DMSO wurden zugegeben, ergab 240 μM Verbindung in Reaktionspuffer, 3 % DMSO (80 μM Verbindung, 1 % DMSO in Kinasereaktion)2) 19.5 μl were transferred to daughter plate, 70 μl reaction buffer without DMSO was added, giving 240 μM compound in reaction buffer, 3% DMSO (80 μM compound, 1% DMSO in kinase reaction).

3) Serielle Verdünnung: 1 + 1 (25 + 25 μl) in Reaktionspuffer, 3 % DMSO3) Serial dilution: 1 + 1 (25 + 25 μl) in reaction buffer, 3% DMSO

4) Testkonzentrationen: 80, 40 0,625 μl, [DMSO] = 1 %4) Test concentrations: 80, 40 0.625 μl, [DMSO] = 1%

Reaktion:Reaction:

• Protokoll wie für primäres Screening beschrieben 3.4. Datenanalyse• Protocol as described for primary screening 3.4. data analysis

3.4.1. Berechnung der prozentualen Inhibierungswerte3.4.1. Calculation of percent inhibition values

Die Daten sind als relative Zählwerte angegeben:The data is given as relative counts:

RLU(+TAK1 )RLU (+ TAK1)

R =R =

RLU(-TAKI )RLU (-TAKI)

wobei RLU relative Lumineszenzeinheiten sind.where RLU are relative luminescent units.

Die prozentualen Inhibierungswerte wurden wie folgt berechnet:The percent inhibition values were calculated as follows:

1 — R % Inhibierung = 100 ^■ | I —1 - R% inhibition = 100 ^■ | I -

I ~ ^AoAe KontrolleI ~ ^ AoAe control

3.4.2. Berechnung der IC₅₀-Werte3.4.2. Calculation of IC ₅₀ values

IC₅₀-Werte wurden bestimmt, indem die Datenpunkte an die nachfolgend gezeigte Gleichung (Parameter C) angepasst wurden. Parameter A wurde auf Null gesetzt. Wenn durch die Daten kein klares Maximum definiert war, wurde Parameter B auf 100 gesetzt.IC ₅₀ values were determined by fitting the data points to the equation shown below (parameter C). Parameter A has been set to zero. If no clear maximum was defined by the data, parameter B was set to 100.

3.4.3. Berechnung der Assay-Qualitätsparameter3.4.3. Calculation of the Assay Quality Parameters

Die Assay-Qualitätsparameter wurden auf Basis von hohen und niedrigen Kontrollen bestimmt, die als interne Standard auf jeder Assay-Platte laufen gelassen wurden. Die folgenden Qualitätsparameter gemäß Referenz 4 wurden als Maß zur Beurteilung der Eignung eines Assays für High-Throughput-Screening verwendet. Signal zu Hintergrund (S/B)The assay quality parameters were determined based on high and low controls run as internal standards on each assay plate. The following quality parameters according to Reference 4 were used as a measure to assess the suitability of an assay for high throughput screening. Signal to background (S / B)

Mittelwerthohe KontrolleMean high control

Q/R =Q / R =

Mittelwertniedπge KontrolleMean value control

Z-FaktorZ factor

(3 * SD Verbindungen + 3 * SD niedrige Kontrolle ,(3 * SD connections + 3 * SD low control,

Z = I -Z = I -

[Mittelwert _{hoheKontrolle} - Mittelwert niedrige Kontrolle[Mean _{high control} - mean low control

Z'-Faktor (Ref. 4)Z'-factor (ref 4)

, ₁ \^{J 0}^ hohe Kontrolle ^ -^{1 0}^ niedrige Kontrolle ), ₁ \ ^{J 0} ^ high control ^ - ^{1 0} ^ low control)

Mittelwert _{hoheKontrolle} - Mittelwert _{medngeKontrolle} Mean _{high control} - mean median _control

4. Ergebnisse4. Results

4.1. TAK1-Assay-Entwicklung4.1. TAK1 Assay Development

Die Abhängigkeit der TAK1 -katalysierten ATP-Hydrolyse von der Mg²⁺-Konzentration wurde getestet. Die Maximalgeschwindigkeit wurde bei einer Konzentration von 10 mM beobachtet. Die Abnahme bei höherer Mg²⁺-Konzentration könnte auf die Bindung eines zweiten Mg²⁺ an die aktive Stelle zurückzuführen sein (Fig. 1 ).The dependence of TAK1-catalyzed ATP hydrolysis on Mg ²⁺ concentration was tested. The maximum rate was observed at a concentration of 10 mM. The decrease at higher Mg ²⁺ concentration could be due to the binding of a second Mg ²⁺ to the active site (Figure 1).

Der Km-Wert von ATP in Bezug auf TAK 1 ist 32 μM (Fig. 2).The Km value of ATP with respect to TAK 1 is 32 μM (Figure 2).

Der ICso-Wert von 5Z-7-Oxozeaenol (resorcyclisches Lacton aus einem Pilz) war gemäß Bestimmung 50 nM. TAK 1 war mit 1 μM ATP (Fig. 3) inkubiert worden.The IC 50 value of 5Z-7-oxozeaenol (mushroom resorcylic lactone) was 50 nM as determined. TAK 1 had been incubated with 1 μM ATP (Figure 3).

TAK 1 erwies sich unter Reaktionsbedingungen für mehr als 6 Stunden als stabil (Fig. 4). Die DMSO-Toleranz für TAK 1 war akzeptabel (Fig. 5).TAK 1 proved stable under reaction conditions for more than 6 hours (Figure 4). The DMSO tolerance for TAK 1 was acceptable (Figure 5).

4.2. TAK1-Validierungs-Screening4.2. TAK1 validation screening

Eine Validierungsbibliothek, die aus 1540 Testverbindungen bestand, wurde einem Screening auf TAK1 -Inhibitoren unterzogen.A validation library consisting of 1540 test compounds was screened for TAK1 inhibitors.

Die Screening-Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:The screening results are summarized in the following table:

^* Für Verbindungen mit zwischen -50 und 50 % Inhibierung. Der hohe mittlere % Inhibierungswert und die vergleichsweise hohe SD sind das Ergebnis der hohen Trefferrate. ^* For compounds with between -50 and 50% inhibition. The high mean% inhibition value and the comparatively high SD are the result of the high hit rate.

4.3. Test von TBK14.3. Test of TBK1

Protokoll TBK 1Protocol TBK 1

Reaktionspuffer:Reaction buffer:

1 ) 50 mM Hepes-NaOH, pH 7,51) 50 mM Hepes-NaOH, pH 7.5

2) 5 mM DTT2) 5 mM DTT

3) 0,1 % Tween 20 4) 1O mM MgCI₂ 3) 0.1% Tween 20 4) 10 mM MgCl ₂

Konzentrationen während der enzymatischen Reaktion:Concentrations during the enzymatic reaction:

1 ) [Enzym] = 6O nM1) [enzyme] = 6O nM

2) [ATP] = 1 μM2) [ATP] = 1 μM

Pipettierstufen:pipetting steps:

1 ) Vorwärmen aller Reagentien auf 30⁰C1) preheat all reagents to 30 ⁰ C.

2) 2 μl Reaktionspuffer, 16 % DMSO (oder Verbindung in Reaktionspuffer, 16 % DMSO)2) 2 μl reaction buffer, 16% DMSO (or compound in reaction buffer, 16% DMSO)

3) + 3 μl Enzym in Reaktionspuffer3) + 3 μl of enzyme in reaction buffer

4) + 3 μl ATP in Reaktionspuffer4) + 3 μl of ATP in reaction buffer

5) Inkubieren bei 30⁰C5) incubate at 30 ⁰ C.

6) + 8 μl ATP Monitoringlösung (Cambrex, LT07-111 ) 1 :3 in 50 mM Tris-HCI, pH 7,46) + 8 μl ATP monitoring solution (Cambrex, LT07-111) 1: 3 in 50 mM Tris-HCl, pH 7.4

7) Ablesen der Lumineszenz mit Tecan Ultra7) Reading the luminescence with Tecan Ultra

ErgebnisResult

Die Aktivität von TBK1 und Inhibierung der Aktivität von TBK1 konnten erfolgreich bestimmt werden, indem die Veränderung der ATP-Konzentration gemessen wurde. Es war kein Proteinkinasesubstrat, z. B. Peptid oder Protein, vorhanden (Fig. 6).The activity of TBK1 and inhibition of TBK1 activity could be successfully determined by measuring the change in ATP concentration. It was not a protein kinase substrate, e.g. Peptide or protein (Figure 6).

4.4. Anwendung des Assays auf die Kinasen PKA und AbI Die Inhibierung von PKA und AbI konnte genau bestimmt werden, indem die Assaybedingungen wie bereits genannt verwendet wurden (Figuren 7, 8).4.4. Application of the assay to the kinases PKA and AbI The inhibition of PKA and AbI could be accurately determined using the assay conditions as previously mentioned (Figures 7, 8).

Es konnte gezeigt werden, dass die PKA-Inhibierung durch PKA-Inhiitor zu einem IC50- Wert von 105 nm führte (Fig. 9). Der entsprechende Literaturwert für die Inhibierung der durch PKA katalysierten Phosphorylierung eines Peptidsubstrats ist 135 nM (Davies et al., Biochem. J. 351 , 95-105 (2000)).It could be shown that PKA inhibition by PKA inhibitor led to an IC50 value of 105 nm (FIG. 9). The corresponding literature value for the inhibition of PKA-catalyzed phosphorylation of a peptide substrate is 135 nM (Davies et al., Biochem J. 351, 95-105 (2000)).

4.5. Dosis-Reaktions-Messungen für TAKI4.5. Dose-response measurements for TAKI

1 ) Beispiele für Dosis-Reaktions-Kurven, die für Verbindungen erhalten wurden, die TAK1 inhibieren, sind in Figur 10 gezeigt.1) Examples of dose-response curves obtained for compounds that inhibit TAK1 are shown in FIG.

4.6. Detektierung der TAK1 -Aktivität durch Bestimmung des erzeugten ADP4.6. Detection of TAK1 activity by determination of the generated ADP

Beschreibung der FigurenDescription of the figures

Fig. 1 : Mg²⁺-Abhängigkeit von TAK1 -katalysierter ATP-Hydrolyse.Fig. 1: Mg ²⁺ dependence of TAK1-catalyzed ATP hydrolysis.

Fig. 2: ATP-Abhängigkeit von TAK1 -ATPase-Aktivität.Fig. 2: ATP dependence on TAK1 ATPase activity.

Fig. 3: IC₅₀ von 5Z-7-OxozeaenolFig. 3: IC ₅₀ of 5Z-7-oxozeaenol

Fig. 4: Stabilität von TAK1 bei RaumtemperaturFig. 4: Stability of TAK1 at room temperature

Fig. 5: DMSO-ToleranzFig. 5: DMSO tolerance

Fig. 6: Inhibierung von TBK 1FIG. 6: Inhibition of TBK 1. FIG

Fig. 7: Hydrolyse von ATP durch AbIFig. 7: Hydrolysis of ATP by AbI

Fig. 8: Hydrolyse von ATP durch PKA Fig. 9: Inhibierung von PKA durch PKA-Inhibitor H89 Fig. 10: Inhibierung von TAK1 durch Testverbindungen Fig. 11 : Bestimmung der TAK 1 -Aktivität durch Messen der Menge an erzeugtem ADP. Fig. 8: Hydrolysis of ATP by PKA Fig. 9: Inhibition of PKA by PKA inhibitor H89 Fig. 10: Inhibition of TAK1 by test compounds Fig. 11: Determination of TAK 1 activity by measuring the amount of ADP produced.

Claims

Ansprüche: Claims:

1. Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP.A method of detecting the activity of a kinase by quantifying the hydrolysis of ATP.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei a) ein Kinaseprotein zusammen mit ATP in einer wässrigen Lösung inkubiert wird, b) die Menge an ATP, die hydrolysiert worden ist, bestimmt wird.2. The method of claim 1, wherein a) a kinase protein is incubated together with ATP in an aqueous solution, b) the amount of ATP that has been hydrolyzed is determined.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Menge an ATP, die hydrolysiert worden ist, mittels Luciferin/Luciferase bestimmt wird.The method of claim 2, wherein the amount of ATP that has been hydrolyzed is determined by luciferin / luciferase.

4. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei a) ein Kinaseprotein zusammen mit ATP in einer wässrigen Lösung inkubiert wird, b) die Menge an ADP und/oder Pi, die freigesetzt worden ist, bestimmt wird.4. The method of claim 1, wherein a) a kinase protein is incubated together with ATP in an aqueous solution, b) the amount of ADP and / or Pi that has been released is determined.

5. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei a) ein Kinaseprotein zusammen mit ATP und einem Detektierungssystem inkubiert wird, b) die Menge an ATP, die hydrolysiert wird, mittels des Detektierungssystems von a) bestimmt wird.The method of claim 1, wherein a) a kinase protein is incubated together with ATP and a detection system, b) the amount of ATP that is hydrolyzed is determined by means of the detection system of a).

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Detektierungssystem Luciferin/Luciferase ist.The method of claim 5, wherein the detection system is luciferin / luciferase.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Detektierungssystem für ADP und/oder Pi spezifisch ist.The method of claim 5, wherein the detection system is specific to ADP and / or Pi.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Kinase aus einer Tyrosinkinase oder einem Serin/Threonin-Kinasetyp von Kinasen ausgewählt ist. 8. The method according to one or more of claims 1 to 7, wherein the kinase is selected from a tyrosine kinase or a serine / threonine kinase type of kinases.

9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Proteinkinase aus der folgenden Gruppe EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1 , ROCK, MCK ausgewählt ist.9. The method according to one or more of claims 1 to 8, wherein the protein kinase is selected from the following group EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK.

10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Proteinkinase aus TAK1 , ABL, PDK4 ausgewählt ist.10. The method according to one or more of claims 1 to 9, wherein the protein kinase is selected from TAK1, ABL, PDK4.

11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, wobei die wässrige Lösung mehr als ein Proteinkinaseprotein umfasst.11. The method according to one or more of claims 1 to 9, wherein the aqueous solution comprises more than one protein kinase protein.

12. Verwendung eines Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 zur Identifizierung oder Profilierung einer Verbindung, die in der Lage ist, die Aktivität eines Kinaseproteins zu inhibieren oder zu stimulieren.12. Use of a method according to one or more of claims 1 to 11 for the identification or profiling of a compound which is able to inhibit or stimulate the activity of a kinase protein.

13. Verwendung eines Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 zur Bestimmung der Aktivität einer Kinase in einer biologischen Probe.13. Use of a method according to one or more of claims 1 to 11 for determining the activity of a kinase in a biological sample.

14. Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten einer Kinase, wobei a) eine Kinase in wässriger Lösung bereitgestellt wird, die mögliche zusätzliche Komponenten umfasst, b) eine Lösung bereitgestellt wird, die ATP und mögliche zusätzliche Komponenten enthält, c) eine Lösung bereitgestellt wird, die Luciferin, Luciferase und mögliche zusätzliche Komponenten enthält, d) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, e) die Kinase in wässriger Lösung aus a) und die chemische Verbindung aus b) inkubiert werden, f) die Aktivität der Kinase mittels ATP, Luciferin und Luciferase bestimmt wird, g) das Ergebnis von d) möglicherweise durch Ergebnisse von einem oder mehreren Kontrollexperimenten abgewogen wird, wobei die Inkubierung gemäß c) durchgeführt wird, indem die chemische Verbindung und/oder das Proteinkinaseprotein weggelassen wird bzw. werden. A method of identifying a kinase antagonist comprising: a) providing an aqueous solution kinase comprising possible additional components, b) providing a solution containing ATP and possible additional components, c) providing a solution comprising Luciferin, luciferase and possible additional components, d) a chemical compound is provided, e) the kinase is incubated in aqueous solution from a) and the chemical compound from b), f) the activity of the kinase is determined by means of ATP, luciferin and luciferase g) the result of d) is possibly weighed by results of one or more control experiments, wherein the incubation according to c) is performed by omitting the chemical compound and / or protein kinase protein.

15. Verfahren zum Identifizieren eines Agonisten einer Proteinkinase, wobei a) eine Kinase in wässriger Lösung bereitgestellt wird, die mögliche zusätzliche Verbindungen umfasst, b) eine Lösung bereitgestellt wird, die ATP und mögliche zusätzliche Komponenten enthält, c) eine Lösung bereitgestellt wird, die Luciferin, Luciferase und mögliche zusätzliche Komponenten enthält, d) ein Inhibitor der Proteinkinase bereitgestellt wird, e) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, f) die Kinase in wässriger Lösung gemäß a), der Inhibitor gemäß b) und die chemische Verbindung gemäß c) inkubiert werden, g) die Aktivität der Proteinkinase mittels ATP, Luciferin und Luciferase bestimmt wird, h) das Ergebnis von e) möglicherweise durch Ergebnisse von einem oder mehreren Kontrollexperimenten abgewogen wird, wobei die Inkubierung gemäß d) durchgeführt wird, indem die chemische Verbindung und/oder dieA method for identifying an agonist of a protein kinase comprising: a) providing an aqueous solution kinase comprising possible additional compounds, b) providing a solution containing ATP and possible additional components, c) providing a solution comprising Luciferin, luciferase and possible additional components, d) an inhibitor of the protein kinase is provided, e) a chemical compound is provided, f) the kinase is incubated in aqueous solution according to a), the inhibitor according to b) and the chemical compound according to c) g) the activity of the protein kinase is determined by means of ATP, luciferin and luciferase, h) the result of e) is possibly weighed out by results of one or more control experiments, wherein the incubation according to d) is carried out by the chemical compound and / or or the

Proteinkinase weggelassen wird bzw. werden.Protein kinase is omitted or become.

16. Verfahren zum Identifizieren eines Agonisten nach Anspruch 15, wobei kein Inhibitor enthalten ist.A method of identifying an agonist according to claim 15, wherein no inhibitor is included.

17. Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten oder Agonisten nach den Ansprüchen 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Kinaseprotein aus einer Tyrosinkinase oder einem Serin/Threonin-Kinasetyp der Proteinkinasen ausgewählt wird.17. A method for identifying an antagonist or agonist according to claims 14 to 16, characterized in that the kinase protein is selected from a tyrosine kinase or a serine / threonine kinase type of protein kinases.

18. Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten oder Agonisten nach den Ansprüchen 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Proteinkinaseprotein aus der Gruppe von EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1 , ROCK, MCK ausgewählt ist. 18. A method for identifying an antagonist or agonist according to claims 14 to 16, characterized in that the protein kinase protein from the group of EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK is selected.

19. Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten oder Agonisten nach den Ansprüchen 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Proteinkinaseprotein aus TAK1 , ABL oder PDK4 ausgewählt wird.19. A method for identifying an antagonist or agonist according to claims 11 to 13, characterized in that the protein kinase protein is selected from TAK1, ABL or PDK4.

20. Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten oder Agonisten nach einem oder mehreren der Ansprüche 14 bis 19, wobei ein derartiges Verfahren als High- Throughput-Screening (HTS) durchgeführt wird. 20. A method for identifying an antagonist or agonist according to one or more of claims 14 to 19, wherein such a method is performed as a high-throughput screening (HTS).