WO2008071684A2 - Spezialextrakt und seine verwendung zur hemmung des abbaus von cyclischem guanosinmonophosphat (cgmp) - Google Patents

Spezialextrakt und seine verwendung zur hemmung des abbaus von cyclischem guanosinmonophosphat (cgmp) Download PDF

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Björn FEISTEL
Matthias-Heinrich Kreuter
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    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
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    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence

Definitions

  • the following invention relates to a process for the preparation of extracts of a plant from the family Turneraceae, the extracts thus obtained and their use.
  • the WHO defines the human right in terms of sexuality and others. as a right to the highest achievable standard of sexual health, and to be able to lead a satisfying, safe, and enjoyable sex life. (WHO Progress in Reproductive Health Research 2004, No. 67, pp. 3).
  • the penis contains the dorsolateral corpora corpora cervenosa, as well as the medioventral corpus corpus spongiosum, which are spongy structures of cavernous spaces. These cavernous spaces are lined with vascular epithelial cells and pass over the arteria pudenda interna supplied with blood. About the vena dorsalis penis profunda the blood drains off again.
  • Erection and detuning are hemodynamic processes that are regulated by relaxation and contraction of the cavernous musculature.
  • nitric oxide acts as an "endothelium-derived relaxing factor.” It diffuses into the smooth muscle cells and activates guanylate cyclase, inducing the formation of cGMP from GTP.
  • CGMP leads to a relaxation of the smooth muscle of the corpus cavernosum. V) to guanosine monophosphate (GMP) and thus inactivated (Chew et al., Med. J. Aust. 172, 279-283, 2000).
  • sildenafil among other things, reduced blood pressure, headache, dyspepsia and muscle pain (Source: http://www.medhost.de/impotenz/sildenafil.html).
  • Herbal preparations are known to have a very low spectrum of side effects.
  • search for aphrodisiacs from nature one quickly arrives at a large number of sometimes obscure "remedies", which have often been used for centuries.
  • a limited to vegetable preparations viewing the subject still results in almost all primitives to a variety of plants and used preparationsutzster qualities and potencies (plant powder, tea 's, decoctions, liquid extracts).
  • the object of the present invention was to find a plant which is active with respect to ED and to convert its active constituents into a reproducible extract form. Thus, a therapeutically uniform and effective dose is to be ensured.
  • the shape of a highly concentrated plant extract is particularly suitable compared to the original plant part.
  • a pharmacological in vitro screening traditionally aphrodisiac plants were examined for potential PDE-V inhibition. In this case, an active plant family was discovered, the saffron mallow family (Turneraceae).
  • a plant of this genus, the Turnera diffusa, German name Damiana, is native to the Gulf of Mexico and the Caribbean. Traditionally, the dried leaves of Turnera diffusa and its varieties the strengthening of the sex drive in the form of drug powder, tea 's or tonic are consumed.
  • the object is achieved by the inventive method for producing the extracts.
  • the invention therefore firstly a method for producing an extract of a plant from the family Turneraceae comprising the steps
  • Turneraceae are suitable as starting plants, in particular Turnera acaulis, Turnera acuta, Turnera alba, Turnera albicans, Turnera amapaensis, Turnera angustifolia, Turnera annectens, Turnera annularis, Turnera annularis var.
  • Turnera caroliniana Turnera carpinifolia, Turnera castilloi, Turnera chamaedrifolie, Turnera chamaedrys, Turnera chrysocephala, Turnera chrysodo-xa, Turnera cicatricosa, Turnera cipoensis, Turnera cistoides, Turnera clausenia-na, Turnera coerulea, Turnera collotricha, Turnera concinna, Turnera corchorifolia, Turnera corchoroides, Turnera coriacea, Turnera crulsii, Turnera cuneifolia, Turnera cu- Neiformis, Turnera curassavica, Turnera dasystyla, Turnera dasytricha, Turnera decipiens, Turnera desvauxii, Turnera dichotoma, Turnera dichotoma var.
  • Turnera hilaireana var. oblongifo-lia, Turnera hilaireana var. ovatifolia Turnera hindsiana, Turnera hindsiana subsp.
  • Lycopifolia Turnera poh-liana, Turnera prancei, Turnera princeps, Turnera pringlei, Turnera procumbens, Turnera pumila, Turnera pumilea, Turnera pumilea var.
  • Piauhyensis Turnera pumileoides, Turnera purpurascens, Turnera racemosa, Turnera ramosissima, Turnera refracta, Turnera revoluta, Turnera riedeliana, Turnera rosea, Turnera rubrobracteata, Turnera rugosa, Turnera rupestris, Turnera rupestris var.
  • holo-sericea Turnera sidoides subsp. integrifolia, Turnera sidoides subsp. pinnatifida, Turnera sidoides var. angustiloba, Turnera sidoides var. grisebachiana, Turnera sidoides var. herteriana, Turnera sidoides var. hispida, Turnera sidoides var. holosericea, Turnera sidoides var. incisa, Turnera sidoides var. lycopifolia, Turnera simulans, Turnera Turnera stachydifolia var.
  • a preferred genus is the plants of the genus Turnera diffusa WILLD, in particular Turnera diffusa var. Aphrodisiaca Urb. In particular, leaves or herbs are suitable as plant parts which are typically used in a cut or ground form for plant extraction.
  • the extractants used are aqueous solutions of water-miscible organic solvents selected from ethanol, methanol, propanol, isopropanol, acetone and mixtures thereof.
  • the extractant contains the solvent or solvent mixture in an amount of 20 to 90, preferably 30 to 80 and more preferably 50 to 70 wt .-%.
  • the remainder of the extractant is water.
  • the primary extraction is carried out exhaustively, while the extraction at elevated temperature, for example 30 to 50 0 C, preferably 40 to 50 0 C are performed.
  • Multi-stage extractions can also be used.
  • Amounts of 1 to 20 parts by weight, preferably 6 to 12 parts by weight of extractant have proven to be particularly suitable per part by weight of extractable plant parts.
  • the extract obtained is concentrated to a thick extract. This can be done by methods known to the person skilled in the art, for example by evaporation in vacuo on a rotary evaporator, on a thin-film evaporator or on a plate evaporator.
  • a key step in increasing the efficacy of the extract is a subsequent step of enrichment of lipophilic substances associated with the depletion of hydrophilic substances.
  • the dispersion of the thick extract it has proven particularly suitable to select the amount of water such that about 2 to 12 parts by weight of the thickness extract are used per 100 parts by weight of water.
  • Another method for enriching the lipophilic substances in the concentrate and thus for depleting the hydrophilic substances is a liquid / liquid extraction, with which a distribution of the ingredients between water and a non-water-soluble, lipophilic solvent is achieved.
  • the aqueous phase is discarded and the lipophilic liquid extract continues to be used.
  • Enrichment of lipophilic extracts can also be achieved by chromatographic methods in which lipophilic components, for example, are bound to RP materials and the unbound substances are removed before the bound substances are eluted.
  • the above-described method of dispersing the thickness extract in water is particularly preferable.
  • the preferred embodiment of dispersing produces an extracitric precipitate that is reextracted in an aqueous solution with an organic solvent of from 30 to 90 weight percent selected from methanol, ethanol, propanol, isopropanol, acetone, and mixtures thereof.
  • organic solvent selected from 30 to 90 weight percent selected from methanol, ethanol, propanol, isopropanol, acetone, and mixtures thereof.
  • the extractives available hereinafter are separated from the undissolved constituents and added to a spissum extract.
  • dry excipients are preferably added and the resulting mixture dried.
  • dry extracts are obtained which are easy to process.
  • drying auxiliaries in particular those of polysaccharides such as gum arabic, xanthan gum, etc. and dry adjuvants based on crystalline cellulose and silicon dioxide have proven to be suitable.
  • 0.1 to 0.6 parts by weight of gum arabic, 0.05 to 0.5 parts by weight of microcrystalline cellulose and 0.01 to 0.1 parts by weight of silica are used as dry auxiliaries per part by weight of the crude extract obtained.
  • the invention also provides the extract obtainable by the process according to the invention, in particular in the form of a dry extract. This shows a marked inhibition of human phosphodiesterase V.
  • the IC 50 value is preferably from 4 to 10 ⁇ g / ml according to the method described in the examples.
  • the invention furthermore relates to the use of the extract according to the invention for the preparation of a preparation, in particular a medicament for the treatment of conditions in which an increase in the cellular cGMP level is desired by a delayed degradation of cGMP.
  • the extract is therefore particularly suitable for the production of a preparation, in particular a medicament for the treatment of erectile dysfunctions, in particular insofar as the erectile dysfunction is caused by an organ-selective deficiency of cGMP.
  • FIG. 1 shows the PDE-V inhibition of the extracts according to the invention in comparison to sildenafil according to Example 5.
  • Figure Ia shows the PDE-V inhibition of sildenafil control.
  • FIG. 1 b shows the PDE-V inhibition of the Damiana spissum extract according to the invention without drying auxiliaries [extract pattern 5-1].
  • FIG. 1c shows the PDE-V inhibition of the Damiana dry extract according to the invention [extract pattern 5-2]
  • extract pattern 5-2 the same amounts of native dry extract equivalent were used for the PDE-V test, so they are directly comparable.
  • FIG. 2 shows schematically the preparation according to Example 3.
  • FIG. 3 and FIG. 4 show thin-layer chromatographic analyzes of extracts.
  • test system was characterized as follows - PDE-V assay
  • the reaction was started by adding the substrate [ 3 H] -CGMP Tracer (0.003 ⁇ Ci / ⁇ l). Subsequently, the assay mixture was incubated at 30 0 C for 20 min. Zero controls t (0) were performed without addition of enzyme.
  • IC 50 values were determined using a Tritium Scintillation Proximity Assay (PDE- [ 3 H] -CGMP SPA Amersham Biosciences TRKQ 7100) according to the instructions of the manufacturer Amersham. The measured values for the samples were determined from at least two experiments per concentration.
  • Example 4 Dry Materials
  • the liquid extract thus obtained can, however, neither be concentrated to a homogeneous spissum extract by a routine method, nor dried to a powder, since a large number of lipophilic substances, e.g. Chlorophyll is extracted, which is known to lead to precipitation and phase separations in spissum extracts. Only the transfer into a dry extract and its grinding can lead to a homogeneous product. However, the influence of various drying auxiliaries was surprising.
  • the precipitated extractant precipitate was separated from the supernatant and then reextracted with ethanol 50% m / m in the ratio 1: 4. Insolubles were separated and discarded.
  • the extractives thus obtained are clarified by filtration and evaporated to an ethanolic-aqueous liquid extract.
  • the resulting liquid extract was mixed with the drying auxiliaries in dissolved or suspended form, homogenized and then evaporated solvent-free and dried under vacuum at 50 0 C.
  • Confluent extract 70% Native / 70% Native / 70% Native / 70% Native use without auxiliary 25% GA / 25% GA / 25% MD / 25% PVPP / Damiana fabrics 5% PVP 5% Prosolv TM 5% Prosolv TM 5% Prosolv TM
  • the test in the pharmacological test system shows that a special extract can be produced by the process steps and process parameters according to the invention, which is obtained by a multiple extraction compared to conventional extracts. increased activity against the phosphodiesterase V distinguished.
  • the invention additionally enables the conversion of the obtained liquid extract into a storage-stabilized dry extract.
  • the resulting liquid extract was added proportionally with the drying aids gum arabic (25%) and Prosolv TM (5%) in dissolved or suspended form, homogenized and solvent-free and dried under vacuum at 50 0 C (extract pattern 5-2).
  • Extract pattern 5-1 8 ⁇ g / mL
  • Extract pattern 5-2 5 ⁇ g / mL
  • a comparative extract according to Arletti et al. produced. For this, leaves were macerated with ethanol 30% (v / v) at room temperature overnight. The extractant was separated and the residue was squeezed out. The squeezed liquid was combined with the extract. It was concentrated to a dry extract and redissolved to a fluid extract (1: 1).
  • FIG. 3 shows a chromatographic examination for hydroquinone derivatives (silica gel 60 F 254 , anhydrous formic acid: water: ethyl acetate (6: 6: 88, v / v / v)) after evaporation with ammonia solution.
  • Lane 1 shows the extract of Arletti, lane 3 the extract according to the invention.
  • the extract according to Example 6 (Arletti) and the extract according to the invention were tested in concentrations of 1, 3, 10, 30 and 60 ⁇ g / ml in a PDE-5 assay.
  • PDE-5 protein content 13.5 ⁇ g / ml
  • 3 H-GMP 0.003 ⁇ Ci / ⁇ l
  • the assay mixture was incubated at 30 ° C. for 20 min. Zero controls were performed without addition of PDE-V.
  • the IC 50 - Values were determined using a Tricium Scintillation Proximity Assay (PDE [ 3 H] -CGMP; Amersham Biosciences TRKQ 7100) according to the manufacturer's instructions.
  • the measured values for the samples were determined from two experiments and are given as mean values with respective deviations from the mean value.
  • the dose-dependent reduction in enzyme activity under the effect of the particular sample or reference substance is expressed in a percentage dose-response curve.
  • the IC 5 o values (sample concentration which causes a 50% inhibition of the maximum enzyme activity) were determined using the program GraphPad- Prism (version 4, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).
  • Extract of the invention IC 50 2.5 ⁇ g / ml (95% confidence interval 2.13 to 2.86 ⁇ g / ml).

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Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus einer Pflanze aus der Familie der Turneraceae umfassend die Schritte Extraktion von Pflanzenteilen mit einem Extraktionsmittel, dass neben Wasser ein organisches Lösungsmittel ausgewählt aus Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Aceton und Mischungen davon, enthält Einengen des Extraktes zu einem Dickextrakt, Anreichern lipophiler Substanzen zu einem Konzentrat. Der so hergestellte Extrakt eignet sich damit insbesondere zur Herstellung einer Zubereitung, insbesondere eines Arzneimittels zur Behandlung erektiler Dysfunktionen, insbesondere soweit die erektile Dysfunktion durch einen organselektiven Mangel an cGMP verursacht ist.

Description

Spezialextrakt und seine Verwendung zur Hemmung des Abbaus von cvclischem Guanosinmonophosphat fcGMP)
Die folgende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Extrakten einer Pflanze aus der Familie der Turneraceae, die so erhaltenen Extrakte und ihre Verwendung.
Die WHO definiert das Menschenrecht in Bezug auf die Sexualität u.a. als Recht auf den höchsten erreichbaren Standard sexueller Gesundheit, sowie darauf, ein befriedigendes, sicheres und angenehmes Sexualleben führen zu können. (WHO Progress in Reproductive Health Research 2004; Nr. 67, pp. 3).
Nach einer globalen Studie ist für 84% der Männer Sexualität ein wichtiger Bestandteil ihres Lebens und wirkt sich ein befriedigendes Sexualleben positiv auf die empfundene Lebensqualität aus. Ein Großteil der Männer ab dem 40. Lebensjahr leiden an Erektionsstörungen = Erektile Dysfunktion (ED). Dies beschreibt die Unfähigkeit, eine Erektion zu erreichen oder aufrecht zu erhalten, die für ein befriedigendes Sexualleben ausreicht.
Ursachen für Erektionsstörungen können organischer und/oder psychischer Natur sein. Chronische Krankheiten, zunehmendes Alter, Medikamente und Genussmittel wie Alkohol und Nikotin dürfen ebenso als Risikofaktoren angenommen werden, wie Stress, Partnerschaftskonflikte, Depressionen oder Versagensangst. Durch den Verlust der Potenz wird das körperliche, seelische und soziale Selbstverständnis des Mannes, insbesondere des jungen Mannes, stark erschüttert. Patienten mit chronischer ED sind in ihrer Sexualität und Persönlichkeit derart verunsichert, das sie als krank anzusehen sind.
Um dieses Krankheitsbild zu verstehen, bedarf es der Grundlagen der Anatomie der Erektion : Der Penis enthält die dorsolateralen Schwellkörper Corpora caver- nosa, sowie den medioventralen Schwellkörper Corpus spongiosum, welche schwammartige Gebilde aus kavernösen Räumen darstellen. Diese kavernösen Räume sind mit Gefäßepithelzellen ausgekleidet und werden über die Arteria pudenda interna mit Blut versorgt. Über die Vena dorsalis penis profunda fließt das Blut wieder ab.
Ebenso muss der Einfluss der Physiologie betrachtet werden. Erektion und Detu- meszenz sind hämodynamische Vorgänge, welche über Relaxation und Kontrak- tion der Schwellkörpermuskulatur reguliert werden.
Im Ruhezustand liegt die sympathisch inervierte glatte Muskulatur der Schwellkör perarterien kontrahiert vor. Der Blutfluss durch die Schwellkörper ist daher minimal. Bei sexueller Stimulation steigt die parasympathische Aktivität, wodurch sich die Arterien weiten und der Blutdurchfluss der Schwellkörper ansteigt. Durch die Volumenzunahme werden die abführenden Venen zwischen Schwellkörpern und Tunica albuginea komprimiert und der Blutabfluss verringert. Die Folge dieses venooklusiven Mechanismus ist eine rigide Erektion.
Molekularphysiologisch kommt es zu folgendem Ablaufschema : Die sexuelle Stimulation führt über nonadrenerge / noncholinerge Nervenfasern zur L-Arginin- basierten Produktion von Stickstoffmonoxid (NO). NO wirkt als „endothelium derived relaxing factor". Es diffundiert in die glatten Muskelzellen und aktiviert dort die Guanylatcyclase. Dies induziert die Bildung von cGMP aus GTP. cGMP führt zu einer Erschlaffung der glatten Schwellkörpermuskulatur. cGMP wird schließlich durch Phosphodiesterase Typ V (PDE-V) zu Guanosinmonophosphat (GMP) abgebaut und damit inaktiviert (Chew et al., Med. J. Aust. 172, 279 - 283, 2000).
Bei ED wird in vielen Fällen zu wenig NO in Relation zur benötigten Wirkung freigesetzt. Auch wird dies durch andere krankheitsbedingte Effekte wie Gefäßschädigungen oder erhöhter NO-Toleranz begünstigt. Der Weg über eine Steigerung der endothelial vermittelten NO-Produktion wird für viele „Heilmittel" beschrieben, oft in Zusammenhang mit der Gabe von L-Arginin als Kombinationspartner.
Der Zusammenhang von positiv getesteten NO-Donatoren (Bildung von cGMP) und der Auswirkung auf die Hemmung der PDE-V (Abbau von cGMP) ist nicht beschrieben. Um nun eine stabile Erektion zu gewährleisten, bietet es sich ebenfalls an, den Abbaumechanismus des cGMP selektiv zu stören und somit eine längere Halbwertszeit des cGMP zu erreichen. Dieser Abbau wird durch die Phosphodiesterasen unterbunden. Um Nebenwirkungen weitgehend vermeiden zu können, hat es sich in der Vergangenheit als nützlich erwiesen, die Phosphodiesterase Typ V möglichst selektiv zu inhibieren, da diese fast ausschließlich in den Schwellkörpern vorhanden ist, während andere Subtypen wie PDE-I und PDE-II im Körper ubiquitär vorkommen. Dieser Wirkmechanismus ist für Sildenafil bekannt (Chew et al., Med. J. Aust. 172, 279 - 283, 2000).
Für diese synthetisch gewonnene Substanz ist neben dieser Wirkung der PDE-V- Hemmung auch eine ganze Reihe von Nebenwirkungen beschrieben. So sollte Sildenafil nicht kurz nach dem Essen oder nach Alkoholgenuss eingenommen werden, da sich die Wirkung dadurch deutlich vermindert, ebenfalls nicht bei Hypotonie, bekanntem Schlaganfallrisiko, Angina pectoris oder Herzinsuffiziens.
Für Sildenafil sind als Nebenwirkung unter anderem Blutdruckabfall, Kopfschmerzen, Dyspepsie und Muskelschmerzen beschrieben (Quelle: http://www.medhost.de/impotenz/sildenafil.html).
Von pflanzlichen Zubereitungen ist bekannt, dass sie ein sehr geringes Nebenwirkungsspektrum aufweisen. Auf der Suche nach Aphrodisiaka aus der Natur gelangt man schnell zu einer Vielzahl teils obskurer "Heilmittel", welche oft seit Jahrhunderten eingesetzt werden. Eine auf pflanzliche Präparate eingeschränkte Betrachtung der Thematik führt bei fast allen Naturvölkern immer noch zu einer Vielzahl unterschiedlicher verwendeter Pflanzen und Zubereitungen unterschiedlichster Qualitäten bzw. Wirkstärken (Pflanzenpulver, Tee' s, Dekokte, Flüssig- Auszüge).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine bezüglich der ED wirksame Pflanze zu finden und deren wirksame Bestandteile in eine reproduzierbare Extraktform zu überführen. Somit ist eine therapeutisch gleichmäßige und effektive Dosis zu gewährleisten. Hierfür ist gegenüber dem ursprünglichen Pflanzenteil die Form eines hochkonzentrierten Pflanzenextraktes besonders geeignet. Im Rahmen eines pharmakologischen in vitro Screenings wurden traditionell aphrodisierend angewandte Pflanzen hinsichtlich einer potentiellen PDE-V- Hemmung untersucht. Hierbei wurde eine diesbezüglich aktive Pflanzenfamilie entdeckt, die Safranmalvengewächse (Turneraceae).
Eine Pflanze dieser Gattung, die Turnera diffusa, deutsche Bezeichnung Damiana, ist originär heimisch am Golf von Mexiko und in der Karibik. Traditionell werden die getrockneten Laubblätter der Turnera diffusa und ihrer Varietäten zur Stärkung des Geschlechtstriebes in Form von Drogenpulver, Tee' s oder auch Tonika konsumiert.
Ein solches Tonikum wurde durch Arletti et al. in Psycho Pharmacology (143, 1999, S. 15-19) beschrieben. Hiernach erweist sich ein traditioneller 1 : 1-Fluid im Tierversuch als wirksam bei lustlosen, impotenten Ratten. Ein Zusammenhang hinsichtlich der Art des Extraktes (Fluid-Extrakt: Einfluss des Ethanol-Anteils?) oder zur pharmakologischen Wirkungsweise wurde nicht herausgearbeitet. Tha- rakan et al. zitiert diese Arbeit in Phytotherapy Research (19, 2005, 457-463).
Pharmazeutisch verwendet werden in Deutschland ebenfalls traditionell alkoho- lisch-wässrige Einfachextrakte aus Damiana-Blättern, ohne jemals den wissenschaftlichen Beleg in Form einer Humanstudie erbracht zu haben (Handbuch der Phytotherapie, S. 106; Wiss. Verlagsgesellschaft Stuttgart 2003). Zu diesem Ergebnis kam bereits 1989 die Kommission E des früheren Bundesgesundheitsamtes, indem sie eine Negativ-Monographie vorlegte.
Es besteht daher immer noch ein Bedürfnis nach wirksamen pflanzlichen Extrakten, insbesondere zur Behandlung der erektilen Dysfunktion.
Gelöst wird die Aufgabe durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Extrakte.
Völlig überraschenderweise wurde festgestellt, dass die Wirkungsstärke eines Damiana-Blattextraktes in Abhängigkeit gewählter Extraktions- und Verfahrensparameter für die erhaltenen Extrakte von nahezu inaktiv bis hochaktiv variierte. Ebenso unerwartet erwiesen sich sowohl Extraktionen mit rein hydrophilen Lö- sungsmitteln (Wasser) als auch Extraktionen mit hoch lipophilen Lösungsmitteln (reiner Ethanol) als ungeeignete Verfahrensweisen zur Erzielung einer hohen Aktivität in dem pharmakologischen Testsystem. Mittelpolare Auszugsmittel (z.B. Ethanol-Wasser Mischungen) zeigten vergleichsweise bessere Resultate.
Gegenstand der Erfindung ist daher zunächst ein Verfahren zur Herstellung eines Extraktes einer Pflanze aus der Familie der Turneraceae umfassend die Schritte
Extraktion von Pflanzenteilen mit einem Extraktionsmittel, dass neben Wasser ein organisches Lösungsmittel ausgewählt aus Methanol, Ethanol, Pro- panol, Isopropanol, Aceton und Mischungen davon enthält
Einengen des Extraktes zu einem Dickextrakt, - Anreichern der lipophilen Substanzen zu einem Konzentrat.
Als Ausgangspflanzen eignen sich verschiedene Mitglieder der Familie der Turneraceae, insbesondere Turnera acaulis, Turnera acuta, Turnera alba, Turnera albicans, Turnera amapaensis, Turnera angustifolia, Turnera annectens, Turnera annularis, Turnera annularis var. conglomerata, Turnera aphrodisiaca, Turnera apifera, Turnera arcuata, Turnera arenaria, Turnera argentea, Turnera arillosa, Turnera armata, Turnera aromatica, Turnera aspera, Turnera asymmetrica, Turnera aturensis, Turnera urantiaca, Turnera aurea, Turnera aurelii, Turnera aure- lioi, Turnera bahiensis, Turnera benthamiana, Turnera berneriana, Turnera ber- nieriana, Turnera etonicaefolia, Turnera blanchetiana var. aequalifolia, Turnera blanchetiana var. capituliflora, Turnera blanchetiana var. subspicata, Turnera blanchettana, Turnera brasiliensis, Turnera brasiliensis var. breviflora, Turnera brasiliensis var. brevifolia, Turnera breviflora, Turnera caatingana, Turnera caerulea var. surinamensis, Turnera callosa, Turnera calyptrocarpa, Turnera Candida, Turnera capensis, Turnera capitata, Turnera capitata subsp. intermedia, Tur- nera caroliniana, Turnera carpinifolia, Turnera castilloi, Turnera chamaedrifolie, Turnera chamaedrys, Turnera chrysocephala, Turnera chrysodo-xa, Turnera cicatricosa, Turnera cipoensis, Turnera cistoides, Turnera clausenia-na, Turnera coerulea, Turnera collotricha, Turnera concinna, Turnera corchorifo-lia, Turnera corchoroides, Turnera coriacea, Turnera crulsii, Turnera cuneifolia, Turnera cu- neiformis, Turnera curassavica, Turnera dasystyla, Turnera dasytricha, Turnera decipiens, Turnera desvauxii, Turnera dichotoma, Turnera dichotoma var. steno- phylla, Turnera dichotoma var. stricta, Turnera diffusa, Turnera diffusa var. a- phrodisiaca, Turnera diffusa var. diffusa, Turnera discolor, Turnera doli- chostigma, Turnera duarteana, Turnera duarteana var. rotundifolia, Turnera eichleriana, Turnera elegans, Turnera elliptica, Turnera flammea, Turnera foliosa, Turnera frutescens, Turnera frutescens var. latifolia, Turnera gardneriana, Turnera genistoides, Turnera glabra, Turnera glaziovii, Turnera goyazensis, Turnera grandidentata, Turnera grandiflora, Turnera grandifolia, Turnera guia-nensis, Turnera harleyi, Turnera hassleriana var. lobulata, Turnera hatschbachii, Turnera hatschbachii var. miniata, Turnera hebepetala, Turnera helianthemoides, Turnera hermannioides, Turnera hexandra, Turnera hilaireana, Turnera hilaireana var. lanceolata, Turnera hilaireana var. minor, Turnera hilaireana var. oblongifo-lia, Turnera hilaireana var. ovatifolia, Turnera hindsiana, Turnera hindsiana subsp. brachyantha, Turnera hirsuta, Turnera hirsutissima, Turnera hirta, Turnera hispi- dissima, Turnera huberi, Turnera humboldtii, Turnera humifusa, Turnera ignota, Turnera incana, Turnera integrifolia, Turnera joelii, Turnera joel-lii, Turnera kra- povickasii, Turnera lamiifolia, Turnera lanceolata, Turnera lep-tosperma, Turnera lineata, Turnera longiflora, Turnera longipes, Turnera lucida, Turnera luetzelbur- gii, Turnera luminosa, Turnera lutescens, Turnera macrophylla, Turnera madaga- scariensis, Turnera maracasana, Turnera marmorata, Turnera martii, Turnera melanorhiza, Turnera melanorhiza var. latifolia, Turnera melo-chia, Turnera me- lochioides, Turnera melochioides var. angustifolia, Turnera me-lochioides var. arenaria, Turnera melochioides var. genuina, Turnera melochioi-des var. oblongi- folia, Turnera melochioides var. ramosissima, Turnera microphylla, Turnera mol- lis, Turnera muricata, Turnera nana, Turnera nervosa, Turnera oblongifolia, Turnera obtusifolia, Turnera oculata, Turnera oculta var. paucipilosa, Turnera odorata, Turnera opifera, Turnera orientalis, Turnera ovata, Turnera palmeri, Turnera panamensis, Turnera paniculata, Turnera paruana, Turnera parviflora, Turnera pernambucensis, Turnera peruviana, Turnera pilosu-la, Turnera pinifolia, Turnera pinnatifida, Turnera pinnatifida var. angustiloba, Turnera pinnatifida var. carnea, Turnera pinnatifida var. lycopifolia, Turnera poh-liana, Turnera prancei, Turnera princeps, Turnera pringlei, Turnera procumbens, Turnera pumila, Turne- ra pumilea, Turnera pumilea var. piauhyensis, Turnera pumileoides, Turnera purpurascens, Turnera racemosa, Turnera ramosissima, Turnera refracta, Turnera revoluta, Turnera riedeliana, Turnera rosea, Turnera rubrobracteata, Turnera rugosa, Turnera rupestris, Turnera rupestris var. frutes-cens, Turnera salicifolia, Turnera schomburgkiana, Turnera schwackeana, Turnera sedoides, Turnera sel- loi, Turnera sericea, Turnera serrata, Turnera ser-rata var. angustifolia, Turnera serrata var. brevifolia, Turnera serrata var. latifo-lia, Turnera serrata var. schwa- ckei, Turnera setifera, Turnera setosa, Turnera setosa var. entreriana, Turnera setosa var. integrifolia, Turnera sidaefolia, Turnera sidoides, Turnera sidoides subsp. carnea, Turnera sidoides subsp. holo-sericea, Turnera sidoides subsp. integrifolia, Turnera sidoides subsp. pinnatifida, Turnera sidoides var. angustilo- ba, Turnera sidoides var. grisebachiana, Turnera sidoides var. herteriana, Turnera sidoides var. hispida, Turnera sidoides var. holosericea, Turnera sidoides var. incisa, Turnera sidoides var. lycopifolia, Turnera simulans, Turnera stachydifolia, Turnera stachydifolia var. flexuosa, Turnera stenophylla, Turnera steyermarkii, Turnera stipularis, Turnera subglabra, Turnera subnuda, Turnera subulata, Turnera surinamensis, Turnera tapajoensis, Turnera tenuicaulis, Turnera thomasii, Turnera tomentosa, Turnera tortuosa, Turnera triglandulosa, Turnera trigona, Turnera trioniflora, Turnera uleana, Turnera ulmifolia, Turnera ulmifolia var. acuta, Turnera ulmifolia var. alba, Turnera ulmifolia var. coerulea, Turnera ulmifolia var. cuneiformis, Turnera ulmi-folia var. elegans, Turnera ulmifolia var. elliptica, Turnera ulmifolia var. grandi-dentata, Turnera ulmifolia var. grandiflora, Turnera ulmifolia var. intermedia, Turnera ulmifolia var. orientalis, Turnera ulmi- folia var. velutina, Turnera urbanii, Turnera valleana, Turnera velutina, Turnera venosa, Turnera villosa, Turnera violacea, Turnera virgata, Turnera viscosa, Turnera waltherioides, Turnera wed-delliana, Turnera weddelliana var. brachyphylla, Turnera weddelliana var. norma-lis, Turnera whitei, Turnera xanthotricha, Turnera zanthotricha oder Turnera zeasperma. Eine bevorzugte Gattung sind die Pflan- zen aus der Gattung Turnera diffusa WILLD, insbesondere Turnera diffusa var. aphrodisiaca Urb. Als Pflanzenteile sind insbesondere Blätter oder Kraut geeignet, die für eine Pflanzenextraktion typisch in geschnittener oder gemahlener Form eingesetzt werden.
Als Extraktionsmittel werden wässrige Lösungen von wassermischbaren organi- sehen Lösungsmitteln, ausgewählt aus Ethanol, Methanol, Propanol, Isopropanol, Aceton und Mischungen davon, eingesetzt.
Bevorzugt enthält das Extraktionsmittel das Lösungsmittel oder die Lösungsmittelmischung in einer Menge von 20 bis 90, bevorzugt 30 bis 80 und noch mehr bevorzugt 50 bis 70 Gew.-%. Der Rest des Extraktionsmittels ist Wasser.
Bevorzugt wird die primäre Extraktion erschöpfend durchgeführt, dabei kann die Extraktion bei erhöhter Temperatur beispielsweise 30 bis 500C, bevorzugt 40 bis 500C durchgeführt werden.
Auch mehrstufige Extraktionen können eingesetzt werden.
Pro Gewichtsteil zu extrahierender Pflanzenteile haben sich Mengen an 1 bis 20 Gewichtsteile, bevorzugt 6 bis 12 Gewichtsteile Extraktionsmittel als besonders geeignet erwiesen.
Nach der Extraktion wird der erhaltene Extrakt zu einem Dickextrakt eingeengt. Dieses kann durch dem Fachmann bekannte Methoden geschehen, beispielweise einer Beidampfung im Vakuum am Rotationsverdampfer, an einem Dünnfilmver- dampfer oder an einem Plattenverdampfer.
Ein entscheidender Schritt zur Erhöhung der Wirksamkeit des Extrakts ist ein anschließender Schritt zur Anreicherung lipophiler Substanzen, verbunden mit der Abreicherung hydrophiler Substanzen.
Als besonders geeignet hierfür hat sich ein Verfahren erwiesen, bei dem zu dem Dickextrakt Wasser zugegeben wird, der Dickextrakt dispergiert wird und der wässrige Überstand verworfen wird. Der Rückstand, das sogenannte Extrak- tivstoff-Präzipitat, wird durch eine Reextraktion mit einem Gemisch aus organi- schem Lösungsmittel und Wasser von unlöslichen Bestandteilen abgetrennt. Die so gewonnenen Extraktivstoffe werden beigedampft, mit Trocknungshilfstoffen versetzt und getrocknet.
Als besonders geeignet hat es sich erwiesen, für die Dispergierung des Dickex- traktes die Menge an Wasser so auszuwählen, dass auf 100 Gewichtsteile Wasser etwa 2 bis 12 Gewichtsteile des Dickextraktes eingesetzt werden.
Ein anderes Verfahren zur Anreicherung der lipophilen Substanzen in dem Konzentrat und damit zur Abreicherung der hydrophilen Substanzen ist eine Flüs- sig/Flüssig-Extraktion, mit der eine Verteilung der Inhaltsstoffe zwischen Wasser und einem nicht mit Wasser löslichen, lipophilen Lösungsmittel erreicht wird. Die wässrige Phase wird verworfen und der lipophilere Flüssig-Extrakt weiter verwendet.
Eine Anreicherung lipophiler Extrakte ist auch durch chromatographische Methoden zu erreichen, bei der lipophile Komponenten beispielsweise an RP-Materialien gebunden werden und die nicht gebundenen Substanzen entfernt werden, bevor die gebundenen Substanzen eluiert werden.
Das oben beschriebene Verfahren des Dispergierens des Dickextraktes in Wasser ist besonders bevorzugt.
Aus der bevorzugten Ausführungsform des Dispergierens geht ein Extra ktivstoff- Präzipitat hervor, das in einer wässrigen Lösung mit einem organischem Lösungsmittel von 30 bis 90 Gew.-%, ausgewählt aus Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Aceton und Mischungen davon, reextrahiert wird. Die hiernach erhältlichen Extraktivstoffe werden von den ungelösten Bestandteilen separiert und zu einem Spissumextrakt beigedampft.
Zu einem erfindungsgemäßen Extrakt, der an lipophilen Komponenten vermindert ist, werden bevorzugt Trocken hilfsstoffe gegeben und das so erhaltene Gemisch getrocknet. Trotz des relativ hohen co-extrahierten Chlorophyllgehaltes im Extrakt werden hierdurch Trockenextrakte erhalten, die gut zu verarbeiten sind. Als Trocknungshilfsstoffe haben sich insbesondere solche aus Polysacchariden wie beispielsweise Gummi arabicum, Xanthan Gum, etc. sowie Trockenhilfsstoffe auf Basis kristalliner Cellulose und Siliziumdioxid als geeignet erwiesen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden pro Gewichtsteil des erhaltenen Rohextraktes 0,1 bis 0,6 Gewichtsteile an Gummi arabicum, 0,05 bis 0,5 Gewichtsteile an mikrokristalliner Cellulose und 0,01 bis 0,1 Gewichtsteile an Siliziumdioxid als Trockenhilfsstoffe eingesetzt.
Gegenstand der Erfindung ist auch der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältliche Extrakt, insbesondere in Form eines Trockenextraktes. Dieser zeigt eine deutliche Hemmung der humanen Phosphodiesterase V.
Bevorzugt liegt der IC-50 Wert gemäß dem in den Beispielen beschrieben Verfahren bei 4 bis 10 μg/mL .
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung des erfindungsgemäßen Extraktes zur Herstellung einer Zubereitung, insbesondere eines Arzneimittels zur Behandlung von Zuständen, bei denen eine Erhöhung des zellulären cGMP- Spiegels durch einen verzögerten Abbau von cGMP gewünscht wird.
Der Extrakt eignet sich damit insbesondere zur Herstellung einer Zubereitung, insbesondere eines Arzneimittels zur Behandlung erektiler Dysfunktionen, insbesondere soweit die erektile Dysfunktion durch einen organselektiven Mangel an cGMP verursacht ist.
Figur 1 zeigt die PDE-V Hemmung der erfindungsgemäßen Extrakte im Vergleich zu Sildenafil gemäß Beispiel 5.
Figur Ia) zeigt die PDE-V-Hemmung der Sildenafil-Kontrolle.
Figur Ib) zeigt die PDE-V-Hemmung des erfindungsgemäßen Damiana- Spissumextraktes ohne Trocknungshilfstoffe [Extraktmuster 5-1].
Figur Ic) zeigt die PDE-V-Hemmung des erfindungsgemäßen Damiana - Trockenextraktes [Extraktmuster 5-2] Für beide Extrakte wurden jeweils die gleichen Mengen an nativem Trocken- extraktequivalent für den PDE-V Test verwendet, sie sind daher direkt vergleichbar.
Figur 2 zeigt schematisch die Herstellung gemäß Beispiel 3.
Figur 3 und Figur 4 zeigen dünnschichtchromatographische Analysen von Extrakten.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1: PDE-V Hemmung in Abhängigkeit vom Extraktionsmittel
Zunächst wurde die Hemmung der Phosphodiesterase V in Abhängigkeit der Lösemittelkonzentration getestet. Dazu wurden Dickextrakte aus Folia Damiana mit den unten angegebenen Lösungsmitteln im Droge-Lösungsmittelverhältnis
1 : 12 bei 400C hergestellt, eingeengt und die Extrakte auf ihre Hemmung der
PDE-V getestet. Das Testsystem war wie folgt charakterisiert - PDE-V Assay
(Durchführung nach Schilling, RJ. et al. : Anal. Biochem. 216, 154-158 (1994) und Mullershausen F. et al. : J. Cell Biology 160, 719-727 (2003) :
Nach Vorinkubation der Assaymischung (PDE-V- Proteingehalt 32 mg/ml) mit den Extraktproben bei 24°C für 15 min, wurde die Reaktion durch Zugabe des Substrates [3H]-CGMP Tracer (0.003 μCi/μl) gestartet. Anschließend wurde die Assaymischung bei 300C für 20 min inkubiert. Nullkontrollen t(0) wurden ohne Zugabe von Enzym durchgeführt.
IC50-Werte wurden unter Zuhilfenahme eines Tritium Scintillation Proximity As- says (PDE-[3H]-CGMP SPA Amersham Biosciences TRKQ 7100) gemäß den Vorschriften des Herstellers Amersham ermittelt. Die Messwerte für die Proben wurden aus mind. zwei Versuchen je Konzentration ermittelt.
Dabei ergaben sich die in Tabelle angegebenen Werte Tab. 1 - Hemmung der PDE-V in Abhängigkeit der Lösemittelauswahl (Testkonzentration der Extrakte 0,3 / 3,0 / 30,0 μg/mL; alle auf native Trockenextrakte- quivalente bezogen)
Figure imgf000014_0001
* Keine Inhibierung in diesem Konzentrationsbereich messbar.
Beispiel 2: Variation der Turnera Species
Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde versucht, eine näherer Differenzierung der in der Literatur aufgeführten Turnera Species zu den im Handel geführten Qualitäten von Blättern der Turneraceen gegenüberzustellen. Verschiedene Species und Varietäten von Turnera diffusa wurden hinsichtlich Ihrer PDE-V Aktivität geprüft. Hierzu wurden Extrakte aus deren Blättern gemäß den Extraktionsangaben von Bsp. l mit Ethanol 60 % m/m extrahiert.
Tab. 2 - Hemmung der PDE-V in Abhängigkeit der Turnera-Species; (Testkonzentration der Extrakte 0,3 / 3,0 / 30,0 μg/mL ; auf native Trockenextraktäquivalente bezogen)
Figure imgf000014_0002
Beispiel 3: Aufreinigung von lipophilen Bestandteilen
Im Rahmen von weiteren Arbeiten wurde dann überraschenderweise gefunden, dass durch eine mehrstufige Prozessführung, beginnend mit einer Primärextraktion mit einem Wasser-Ethanolgemisch von 60 - 80% m/m, einer anschließenden Beidampfung zum Dickextrakt, einer folgenden Präzipitation in wässrigem Milieu und Separation des Überstandes, anschließender Reextraktion des Präzipi- tates mit einem Wasser-Ethanolgemisch von 40-60 %m/m, ein Spezialextrakt resultierte, der eine gegenüber dem Primärextrakt mehrfach erhöhte Aktivität und gegenüber rein lipophilen Extrakten eine rund 10-fach erhöhte Aktivität im pharmakologischen Testsystem der Phosphodiesterase V Hemmung aufwies.
20 kg Folia Damiana werden erschöpfend mit 60% m/m Ethanol bei 400C im Perkolator extrahiert. Die Eluate werden von der Droge getrennt, filtriert und am Plattenverdampfer bei max. 500C zu einem lösemittelfreien Spissum eingeengt. Es resultierten 5800 g mit einem Trockensubstanzanteil von 60,3% (= Extraktstufe A).
331,7 g des obigen Spissumextraktes (= 200 g natives Trockenextraktäquivalent) werden in demineralisiertem Wasser unter Rühren portionsweise disper- giert. Dabei wird die Menge an Wasser so gewählt, das der Trockenrückstand der entstehenden Mischung bei 10% m/m liegt. Diese Mischung wird für 1 Stunde weiter gerührt und anschließend über 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das ausgefallene Extraktivstoff-Präzipitat wurde vom Überstand abgetrennt.
Die Lösung des Überstandes wurde filtriert und beigedampft. Es resultierten 216 g Spissum mit einem Arbutingehalt von 3,8% (bezogen auf nativen Trockenextrakt) und mit einem Trockensubstanzanteil von 60% (= Extraktstufe B). Das so erhaltene, unbehandelte Extraktivstoff-Präzipitat wurde homogenisiert (Extraktstufe C).
Das Extraktivstoff-Präzipitat wird anschließend mit Ethanol 50% m/m im Verhältnis 1 : 5 reextrahiert. Dabei fällt neben den löslichen Extraktivstoffen ein unlöslicher Niederschlag an, der verworfen wird. Die gewonnenen Extraktivstoffe werden klarfiltriert und zu einem ethanolisch-wässrigen Flüssig-Extrakt beigedampft. Es resultierten 284 g Flüssig-Extrakt mit einem Arbutingehalt von 2,2% (bezogen auf nativen Trockenextrakt) und mit einem Trockensubstanzanteil von 23% (= Extraktstufe D). Dies ist der erfindungsgemäße Extrakt. Der Ablauf ist in Figur 2 schematisch dargestellt. Tab. 3 - Hemmung der PDE-V in Abhängigkeit der Extraktionsstufen (Testkonzentration der Extrakte 0,3 / 3,0 / 30,0 μg/mL ; auf native Trockenextraktäquivalente bezogen)
Figure imgf000016_0001
Beispiel 4: Trocken hi If sstoffe Der so erhaltene Flüssigextrakt lässt sich allerdings weder mittels Routineverfahren zu einem homogenen Spissumextrakt aufkonzentrieren, noch zu einem Pulver trocknen, da bei diesem Herstellweg eine Vielzahl von lipohilen Substanzen wie z.B. Chlorophyll mitextrahiert wird, was bekanntlich zu Ausfällungen und Phasentrennungen in Spissumextrakten führt. Nur die Überführung in einen Tro- ckenextrakt und dessen Mahlung kann zu einem homogenen Produkt führen. Überraschend zeigte sich jedoch der Einfluss verschiedener Trocknungshilfsstoffe.
Während mit üblichen Trocknungshilfsstoffen der Trocknungsprozess ausreichend erfolgreich gelingt, konnte nur eine Verschlechterung oder annähernde gleich- bleibende Wirkung auf die PDE-V-Hemmung festgestellt werden.
Durch Zusatz von einem Gemisch einer wässrigen Lösung von Gummi arabicum und dem Hilfsstoff Prosolv™ (silizilierte mikrokristalline Cellulose), während des Beidampfungsprozesses gelang es, das Auftreten von Phasentrennungen und Ausfällungen zu verhindern und nach Konzentrierung zum Spissumextrakt, das erhaltene Extrakt- H ilfsstoff-Gemisch zu trocknen und ein freifließendes Pulver zu gewinnen.
750 kg Folia Damiana werden erschöpfend mit 60% m/m Ethanol bei 45°C im Perkolator extrahiert. Die Eluate werden von der Droge getrennt, filtriert und am Plattenverdampfer bei max. 500C zu einem lösemittelfreien Spissum eingeengt. Es resultierten 250 kg mit einem Trockensubstanzanteil von 74,9% 1335 g des obigen Spissumextraktes (= 1000 g natives Trockenextraktäquivalent) werden in demineralisiertem Wasser unter Rühren portionsweise disper- giert. Dabei wird die Menge an Wasser so gewählt, das der Trockenrückstand der entstehenden Mischung bei 5% m/m liegt. Diese Mischung wird für 1 Stunde weiter gerührt und anschließend über 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das ausgefallene Extraktivstoff-Präzipitat wurde vom Überstand abgetrennt und anschließend mit Ethanol 50% m/m im Verhältnis 1 :4 reextrahiert. Unlöslichen Bestandteile wurden abgetrennt und verworfen. Die so gewonnenen Extraktivstoffe werden klarfiltriert und zu einem ethanolisch-wäßrigen Flüssig- Extrakt beigedampft. Der resultierende Flüssig-Extrakt wurde mit den Trocknungshilfsstoffen in gelöster bzw. suspendierter Form versetzt, homogenisert und lösemittelfrei beigedampft und unter Vakuum bei 500C getrocknet.
Tab. 4 - Hemmung der PDE-V in Abhängigkeit der eingesetzten Trocknungshilfsstoffe (70% Nativanteil / 30% Hilfsstoffe); (Testkonzentration der Extrakte 0,3 / 3,0 / 30,0 μg/mL ; auf native Trockenextraktäquivalente bezogen)
ZusammenFlüssigextrakt 70% Nativ / 70^ /o Nativ / 70^ /o Nativ / 70° /o Nativ / setzung ohne Hilfs25 % GA / 25 % GA / 25 % MD / 25 % PVPP / der Damiana- Stoffe 5% PVP 5% Prosolv™ 5% Prosolv™ 5% Prosolv™
Extraktzube- reitung
IC so μg/mL 6 7 4 6 6
GA - Gummi arabicum PVP - Lösliches Polyvidon PVPP - Unlösliches Polyvidon Prosolv™ - silizilierte, mikrokristalline Cellulose MD - Maltodextrin
Beispiel 5: Prüfung der PDE-V Hemmung
Die Prüfung im pharmakologischen Testsystem zeigt, dass durch die erfindungsgemäßen Verfahrensschritte und Prozess- Parameter ein Spezialextrakt herstell- bar ist, der sich gegenüber herkömmlichen Extrakten durch eine mehrfach er- höhte Aktivität gegenüber der Phosphodiesterase V auszeichnet. Die Erfindung ermöglicht zusätzlich die Umwandlung des erhaltenen Flüssigextraktes in einen lagerstabilisierten Trockenextrakt.
750 kg Folia Damiana werden erschöpfend mit 60% m/m Ethanol bei 45°C im Perkolator extrahiert. Die Eluate werden von der Droge getrennt, filtriert und am Plattenverdampfer bei max. 500C zu einem lösemittelfreien Spissum eingeengt. Es resultierten 250 kg mit einem Trockensubstanzanteil von 74,9%
2003 g des obigen Spissumextraktes (= 1500 g natives Trockenextraktäquivalent) werden in demineralisiertem Wasser unter Rühren portionsweise disper- giert. Dabei wird die Menge an Wasser so gewählt, das der Trockenrückstand der entstehenden Mischung bei 5% m/m liegt. Diese Mischung wird für 1 Stunde weiter gerührt und anschließend über 12 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Das ausgefallene Extraktivstoff- Präzipitat wurde vom Überstand abgetrennt und anschließend mit Ethanol 50% m/m im Verhältnis 1 : 1 reextrahiert. Unlösliche Bestandteile wurden abgetrennt und verworfen. Die so gewonnenen Extraktivstoffe werden klarfiltriert und zu einem ethanolisch-wäßrigen Flüssig-Extrakt beigedampft. Es resultierten 8900 g (41% Trockensubstanzanteil) lipophiler Flüssigextrakt (= Extraktmuster 5-1).
Der resultierende Flüssig-Extrakt wurde anteilig mit den Trocknungshilfsstoffen Gummi arabicum (25%) und Prosolv™ (5%) in gelöster bzw. suspendierter Form versetzt, homogenisert und lösemittelfrei beigedampft und unter Vakuum bei 500C getrocknet (Extraktmuster 5-2).
Die Prüfung im PDE-V-Assay ergab folgende IC 50 - Konzentrationen (alle Angaben bezogen auf native Trockenextraktequivalente) :
Extraktmuster 5-1 = 8 μg/mL
Extraktmuster 5-2 = 5 μg/mL
Die graphische Auswertung dieser PDE-V-Hemmung im Vergleich zu Sildenafil ist in der Figur 1 dargestellt. Beispiel 6: Vergleichsextrakt
Zunächst wurde ein Vergleichsextrakt gemäß Arletti et al. hergestellt. Hierzu wurden Blätter mit Ethanol 30% (v/v) bei Raumtemperatur über Nacht mazeriert. Das Extraktionsmittel wurde abgetrennt und der Rückstand ausgepresst. Die ausgepresste Flüssigkeit wurde mit dem Extrakt vereint. Es erfolgte eine Einengung zu einem Trockenextrakt und Rücklösen zu einem Fluidextrakt (1 : 1).
Beispiel 7: Dünnschichtchromatographische Analyse
Der Extrakt von Arletti gemäß Beispiel 6 und der erfindungsgemäße Extrakt gemäß Beispiel 3 wurden dünnschichtchromatographisch untersucht.
Figur 3 zeigt eine chromatographische Untersuchung auf Hydrochinon-Derivate (Kieselgel 60 F254, wasserfreie Ameisensäure: Wasser: Ethylacetat (6:6:88, v/v/v)) nach Bedampfen mit Ammoniaklösung. Bahn 1 zeigt den Extrakt von Arletti, Bahn 3 den erfindungsgemäßen Extrakt.
Es zeigt sich, dass der Arletti- Extrakt einen höheren Anteil hydrophiler Substanze hat, während dieser Anteil bei dem erfindungsgemäßen Extrakt gering ist.
Figur 4 zeigt eine dünnschichtchromatographische Untersuchung auf polare Inhaltsstoffe (Kieselgel 60 F254, Dichlormethan : Essigsäure: Methanol :Wasser (50: 25: 15: 15 v/v/v/v) Sprühreagenz: Anisaldehyd. Bahn 1 ist der Extrakt nach Arletti, Bahn 3 der erfindungsgemäße Extrakt. Es zeigt sich der stärkere lipophile Anteil im erfindungsgemäßen Extrakt.
Beispiel 8: Vergleich der PDE-5-Hemmung
Der Extrakt gemäß Beispiel 6 (Arletti) und der erfindungsgemäße Extrakt wurden in Konzentrationen von 1, 3, 10, 30 und 60 μg/ml in einem PDE-5-Assay getestet. Hierzu wurde PDE-5 (Proteingehalt 13,5 μg/ml) mit den Extrakten bei 24°C für 10 min vorinkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von 3H- GMP (0,003 μCi/μl) gestartet. Die Assay-Mischung wurde für 20 min bei 300C inkubiert. Nullkontrollen wurden ohne Zugabe von PDE-V durchgeführt. Die IC50- Werte wurden unter Zuhilfenahme eines Tricium Scintillation Proximity Assays (PDE- [3H]-CGMP; Amersham Biosciences TRKQ 7100) gemäß den Vorschriften des Herstellers ermittelt.
Die Messwerte für die Proben wurden aus zwei Versuchen ermittelt und sind als Mittelwerte mit jeweiliger Abweichung vom Mittelwert angegeben. Die dosisabhängige Reduktion der Enzymaktivität unter Einwirkung der jeweiligen Probe oder Referenzsubstanz ist ausgedrückt in einer prozentualen Dosis- Wirkungskurve. Die IC5o-Werte (Probenkonzentration, die eine 50% Inhibition der maximalen Enzymaktivität bewirkt) wurden mit dem Programm GraphPad- Prism (Version 4, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) bestimmt.
Vergleichsextrakt gemäß Beispiel 6:IC5o = 18,5 μg/ml (95% Vertrauensintervall 17,63 bis 19,32 μg/ml).
Erfindungsgemäßer Extrakt: IC50 2,5 μg/ml (95% Vertrauensintervall 2,13 bis 2,86 μg/ml).
Um eine 50%ige Inhibierung des Enzyms PDE-V zu erreichen, wird vom erfindungsgemäßen Extrakt eine deutlich geringere Substanzmenge benötigt. Der erfindungsgemäße Extrakt ist um den Faktor 7,4 stärker.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus einer Pflanze aus der Familie der Turneraceae umfassend die Schritte
Extraktion von Pflanzenteilen mit einem Extraktionsmittel, dass neben Wasser ein organisches Lösungsmittel ausgewählt aus Methanol, Etha- nol, Propanol, Isopropanol, Aceton und Mischungen davon, enthält
Einengen des Extraktes zu einem Dickextrakt, Anreichern lipophiler Substanzen zu einem Konzentrat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Anreicherung lipophiler Substanzen zu einem Konzentrat durch Dispergieren des Dickextraktes in Wasser und Abtrennen und Verwerfen des wässrigen Überstandes, um ein Extraktivstoff- Präzipitat zu erhalten, Reextraktion des Extraktivstoff-Präzipitates und Separation ungelöster Substanzen von gelösten Extraktivstoffen oder - durch eine Flüssig/Flüssig-Extraktion oder durch chromatographische Methoden erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Dispergieren ein Extraktivstoff-Präzipitat hervorbringt, das in einer wässrigen Lösung mit einem Lösungsmittel von 30 bis 90 Gew.-% ausgewählt aus Methanol,
Ethanol, Propanol, Isopropanol, Aceton und Mischungen davon, reextrahiert und mindestens die in diesem Lösemittelgemisch löslichen Extraktivstoffe von ungelösten Bestandteilen separiert und gewonnen werden.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Dispergieren ein Extraktivstoff-Präzipitat hervorbringt, das in einer wässrigen Lösung mit
Ethanol 40 bis 60 Gew.-% reextrahiert wird und die in diesem Lösemittel- gemisch löslichen Extraktivstoffe von ungelösten Bestandteilen separiert und gewonnen werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzenteile Blätter oder Kraut sind, wobei die Blätter oder das Kraut in ge- schnittener oder gemahlener Form extrahiert werden.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Extraktionsmittel das organische Lösungsmittel in einer Menge von 20 bis 90, bevorzugt 50 bis 70 Gew.-% enthält.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn- zeichnet, dass pro Gewichtsteil zu extrahierender Pflanzenteile 1 bis 20 Gewichtsteile, bevorzugt 6 bis 12 Gewichtsteile Extraktionsmittel eingesetzt werden.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene Konzentrat mit Trocknungshilfsstoffen versetzt wird und dieses Gemisch getrocknet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknungshilfsstoffe ausgewählt werden aus Polysacchariden, wie Gummi arabicum, Xanthan Gum oder kristallinen Cellulosen und/oder Siliziumdioxiden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass pro Gewichtsteil an gewonnenen Extraktivstoffen von 0,1 bis 0,6 Gewichtsteile an Gummi arabicum, und 0,05 bis 0,5 Gewichtsteile an mikrokristalliner Cellulose und 0,01 bis 0,1 Gewichtsteile an Siliziumdioxid eingesetzt werden.
11. Extrakt, erhältlich gemäss dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
12. Extrakt nach Anspruch 11 in Form eines Trockenextraktes.
13. Extrakt nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass dieser Extrakt eine Hemmung der humanen Phosphodiesterase V (PDE-5) bewirkt.
14. Verwendung eines Extraktes nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 13 zur Herstellung einer Zubereitung zur Behandlung von Zuständen, bei denen eine Erhöhung des zellulären c-GMP-Gehaltes (Cyclo-Guanosin-
Monophosphat) gewünscht wird.
15. Verwendung eines Extraktes nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 13, zur Herstellung einer Zubereitung zur Behandlung erektiler Dysfunktionen.
16. Verwendung eines Extraktes nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 13, zur Herstellung einer Zubereitung zur Behandlung von Störungen, die mit einer zu niedrigeren Konzentration des zellulären c-GMP-Gehaltes einhergehen.
17. Verwendung eines Extraktes nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 13 zur Herstellung einer Zubereitung zur Behandlung von c-GMP beeinfluss- ten Krankheiten, insbesondere Sehschwäche, Diabetes oder zur organselektiven Regeneration der glatten Muskulatur.
PCT/EP2007/063668 2006-12-11 2007-12-11 Spezialextrakt und seine verwendung zur hemmung des abbaus von cyclischem guanosinmonophosphat (cgmp) WO2008071684A2 (de)

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