WO2008059625A1 - Utilization of the function of rare sugar as promoter for the migration of glucokinase from nucleus to cytoplasm - Google Patents

Utilization of the function of rare sugar as promoter for the migration of glucokinase from nucleus to cytoplasm Download PDF

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WO2008059625A1
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darcokinase
psicose
food
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glucose
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PCT/JP2007/056445
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Masaaki Tokuda
Ken Izumori
Yukiyasu Toyoda
Kazutomo Miwa
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National University Corporation Kagawa University
Matsutani Chemical Industry Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating the onset of pathological conditions related to darcokinase activity, comprising rare sugar D-psicose and / or D-tagatose as active ingredients.
  • Darcokinase (EC 2.7.1.1) is one of four hexokinases found in mammals. Hexokinase catalyzes the first step in the metabolism of D-glucose, namely the conversion of glucose to D-glucose 6-phosphate. Darcokinase has a limited cell distribution and is found mainly in spleen ⁇ cells, liver parenchymal cells, hypothalamus, and intestinal tract. The liver is an important organ for maintaining blood glucose homeostasis.
  • Darcokinase one of the rate-determining enzymes of glycolysis in liver glucose metabolism, binds to darcokinase regulatory protein in the cell nucleus during fasting and exists in an inactive form, increasing the extracellular D-glucose concentration. In the presence of low concentrations of D-fructose, it dissociates from the protein that regulates the activity of dalcokinase and moves to the nuclear cytoplasm, promoting D-glucose metabolism. The translocation of dalcokinase between the nucleus I and the cytoplasm is regulated by hormones. Insulin transfers darcokinase to the nuclear cytoplasm and glucagon to the cytoplasmic nucleus.
  • D-glucose production is due to the release of D-darcose from stored glycogen or gluconeogenesis (de novo intracellular synthesis of D-glucose from gluconeogenic precursors, D-glucose-6-phosphatase Induced by an enzyme-mediated process).
  • type 2 diabetes decreased glucose utilization and increased gluconeogenesis in the liver are observed.
  • Liver D-glucose production cannot be adequately controlled and / or increased, and in some cases fasting D-glucose production may more than double.
  • Some patients with impaired glucose tolerance may have hyperglycemia after meals even though their fasting blood glucose levels are normal.
  • Insufficient insulin secretion Increase in postprandial blood glucose level due to abnormalities in hepatic glucose utilization and / or sugar production after meals due to insulin resistance and decreased sugar utilization in muscle and adipose tissue.
  • dalcokinase is also present in the hypothalamus and functions as a glucose sensor. Even in the hypothalamus, the presence of dalcokinase activity-regulating protein, and the presence of dalcokinase in both bound and free forms, the nucleokines of dalcokinase by rare sugars in the hypothalamus contribute to the cytoplasm. Increased darcokinase activity due to migration, or increased darcokinase activity due to increased free dalcokinase from bound dalcokinase, the change is transmitted to peripheral tissues via the nervous system, and glucose utilization is increased in peripheral tissues It will help to prevent and treat glucose tolerance, diabetes, obesity, and metabolic syndrome.
  • darcokinase is present in the cytoplasm and part of the insulin secretory condyles in the nucleus, so that glucose tolerance is also increased in spleen j8 cells through an increase in insulin secretion due to an increase in dalcokinase activity by rare sugars. It can be expected to help prevent and treat abnormalities and diabetes.
  • Darcokinase activators increase the rate of glucose metabolism in cells and hepatocytes, coupled with increased insulin secretion. Such drugs would be useful for the treatment of type 2 diabetes.
  • Patent Document 1 genes encoding dalcokinase, D_darcosose, cAMP, retinoic acid, etc.
  • Patent Document 2 substituted furacetamide
  • Patent Document 3 heteroaryl rubamoylbenzene derivative
  • aminobenzamide derivatives Patent Document 4
  • Patent Document 5 pyridine 2 carboxamide derivatives
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-018403
  • Patent Document 2 Reissue 2003-532718
  • Patent Document 3 Reissue 2004-076420
  • Patent Document 4 Reissue Table 2003-080585
  • Patent Document 5 Reissue 2004- 080001
  • the present inventors investigated the signal transduction system of the nuclear I-cytoplasmic transition of hepatic darcokinase by insulin and glucagon for the purpose of developing a therapeutic agent for diabetes by promoting the transition of liver darcokinase from the nucleus to the cytoplasm.
  • the present invention provides a treatment (prevention or treatment) for a medical condition associated with darcokinase activity by simply eating, drinking, or orally administering the food additive, food material, food or drink, health food or drink, pharmaceutical, or feed. It is intended to provide technology for the use of rare sugars D-psicose and / or D-tagatose.
  • the gist of the present invention is the promoter for the transition from the nucleus to the cytoplasm of dalcokinase described in (1) below.
  • a promoter for the transfer of darcokinase from the nucleus to the cytoplasm comprising D-psicose and / or D-tagatose as active ingredients.
  • the gist of the present invention is a composition for preventing or treating the onset of a disease state associated with darcokinase activity described in any of (2) to (6) below.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating the onset of a disease state associated with darcokinase activity, which comprises D-psicose and / or D-tagatose as an active ingredient.
  • the above thread composition is used for the prevention or treatment of pathological conditions related to darcokinase activity, which contains D-psicose and / or D-tagatose as an active ingredient.
  • Food additives, food ingredients, foods and drinks, health foods and drinks, pharmaceuticals, and feed strength that can be selected
  • the condition associated with the activity of dalcokinase is selected from impaired glucose tolerance, type 2 diabetes, hyperlipidemia, metabolic syndrome and obesity ability, or related to dalcokinase activity according to (2) or (3)
  • a composition for preventing or treating the onset of a disease state is selected from impaired glucose tolerance, type 2 diabetes, hyperlipidemia, metabolic syndrome and obesity ability, or related to dalcokinase activity according to (2) or (3)
  • a composition for preventing or treating the onset of a disease state is selected from impaired glucose tolerance, type 2 diabetes, hyperlipidemia, metabolic syndrome and obesity ability, or related to dalcokinase activity according to (2) or (3)
  • a composition for preventing or treating the onset of a disease state is selected from impaired glucose tolerance, type 2 diabetes, hyperlipidemia, metabolic syndrome and obesity ability, or related to dalcokinase activity according to (2) or (3)
  • a medicament which comprises D-psicose and / or D-tagatose together with one or more pharmaceutically acceptable carriers (3) or (4)
  • a composition for the prevention or treatment of pathological conditions related to kinase activity is provided.
  • the gist of the present invention is a food and drink with a label indicating that it is used for the prevention or treatment of pathological conditions related to the dalcokinase activity described in any of (7) to (11) below. To do.
  • the food or drink according to (7) which is used for the prevention or treatment of pathological conditions related to darcokinase activity selected from impaired glucose tolerance, type 2 diabetes, hyperlipidemia, metabolic syndrome and obesity.
  • the food or drink according to (7) or (8) which is a supplement, functional food, health food, food for specified health use, dietary supplement food or food for the sick.
  • the effective amount of D-psicose and / or the amount of D-tagatose is 0.5 to 5 Og per day.
  • the present invention treats a disease state related to darcokinase activity (prevention) simply by eating and drinking or oral administration in the form of food additives, food materials, food and drink, health food and drink, pharmaceuticals and feed. It is possible to provide a technique for using rare sugars D-psicose and / or D-tagatose that can be treated.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating darcokinase.
  • FIG. 2 is a drawing for explaining the influence of D-fructose concentration on the rate of glucose phosphate in cultured hepatocytes.
  • FIG. 3 is a drawing for explaining the mechanism of regulation of darcokinase activity by a darcokinase activity regulatory protein in hepatocytes.
  • FIG. 4 is a drawing showing the results of examining the distribution of darcokinase in hepatocytes by a fluorescent antibody method using an anti-darcokinase antibody.
  • FIG. 5 is a drawing explaining the mechanism of hepatic glucose metabolism due to translocation of darcokinase between the nucleus I cytoplasm and the disorder in type 2 diabetes.
  • FIG. 6 shows changes in the distribution of dalcokinase in hepatocytes 30 minutes after loading after oral administration of D-glucose or D-fructose.
  • FIG. 7 is a drawing illustrating the presence ratio of dalcokinase in the cytoplasm whose migration was promoted by low-concentration D-fructose.
  • FIG. 8 shows changes in blood glucose levels in portal blood and peripheral blood after oral administration of D-glucose in type 2 diabetes model rats and healthy rats.
  • FIG. 9 is a drawing explaining that when a small amount of D-fructose is administered to a rat type 2 diabetic patient, an increase in blood glucose level can be suppressed.
  • FIG. 10 is a diagram showing the effect of D-ketose on the transfer of darcokinase to nuclear force cytoplasm.
  • FIG. 11 is a diagram showing the effect of L-ketose on the transfer of Darcokinase to the nuclear force cytoplasm.
  • FIG. 12 is a drawing showing the effect of D-ketose on lactic acid production.
  • FIG. 13 A drawing illustrating the effect of D-psicose on the nuclear force cytoplasmic transition of darcokinase.
  • FIG. 14 is a drawing showing the protocol of an experiment for confirming the transfer of Darcokinase to the nuclear force cytoplasm in animal experiments.
  • FIG. 15 is a drawing showing a comparison of the results obtained by examining the intracellular distribution of darcokinase in the system of FIG. 14 by the fluorescent antibody method using an anti-darcokinase antibody.
  • FIG. 16 is a drawing showing the protocol of an experiment for confirming the transfer of Darcokinase to the cytoplasm in animal experiments using a combination of D-glucose and D-psicose or D-fructose.
  • FIG. 17 is a drawing showing a comparison of the results obtained by examining the distribution of darcokinase in hepatocytes by the fluorescent antibody method using an anti-darcokinase antibody in the system of FIG.
  • FIG.18 Experimental protocol for investigating changes in the blood glucose level and insulin concentration in the tail vein and portal vein in the Goto-Kakizaki rat, a type 2 diabetes model animal, from the nucleus to the cytoplasm.
  • FIG. 19 A drawing comparing the distribution of dalcokinase in the liver cells in the system of FIG. 18 by examining the distribution of nucleocytoplasm and cytoplasm of dalcokinase by the fluorescent antibody method using an anti-darcokinase antibody. is there.
  • FIG. 20 is a drawing showing a comparison of cytoplasmic dalcokinase results obtained by analyzing the fluorescence image of FIG. 19.
  • FIG. 21 is a drawing showing a comparison of blood glucose levels in the tail vein and portal vein in the system of FIG. 18.
  • FIG. 22 is a drawing comparing the results of insulin concentration in the tail vein and portal vein in the system of FIG. 18. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a compound that binds to the allosteric site of darcokinase and activates darcokinase is referred to as a “darcokinase activator”, a compound that promotes the transition of liver darcokinase between the nucleus and the cytoplasm.
  • a “darcokinase activator” a compound that promotes the transition of liver darcokinase between the nucleus and the cytoplasm.
  • promoters of the transition of darcokinase from nucleus to cytoplasm are called “promoters of the transition of darcokinase from nucleus to cytoplasm”.
  • the above-mentioned “promoting agent for the transfer of darcokinase to nuclear force cytoplasm” causes an increase in the active darcokinase of inactive darcokinase, which is not limited to the transfer of darcokinase to the nuclear force cytoplasm. Also, ie, an active darcokinase increasing agent.
  • cytoplasmic dalcokinase or nuclear force Darcokinase transferred to cytoplasm interacts with cytoplasmic proteins and organelles.
  • darcokinase binds to fructose 2,6 bisphosphate synthase, which is involved in the regulation of glycolytic enzymes.
  • darcokinase binds to other proteins to increase darcokinase activity. They suggest the possibility that darcokinase binds to mitochondria.
  • dalcokinase binds to propiol CoA carboxylase present in mitochondria, the darcokinase activity increases. This is the force disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 2001-333778. If this effect is achieved with a rare sugar, do not experiment like this! /. In the present invention, this possibility is proved by an embodiment!
  • Intracellular organelles or intracellular proteins interact with dalcokinase to change darcokinase activity, or the function of proteins interacting with intracellular organelles or dalcokinase changes.
  • the above-mentioned “promoting agent of darcokinase nuclear power to the cytoplasm” is darcokina. It is defined to include an active darcokinase-increasing agent, ie, an active darcokinase-increasing agent, that causes an increase in inactive darcokinase, not limited to the transition to the cytoplasm.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining darcokinase.
  • hexokinase is an enzyme that converts D-glucose into D-glucose 6-phosphate.
  • There are four types of isozymes typel, typell, typeIII, typelV
  • hexokinase typelV is dalcokinase.
  • darcokinase has low affinity for glucose (Km; 5-10mM) and is not subject to feedback inhibition by D-glucose 6-phosphate. This enzyme is distributed in the splenic islets of Langeron, liver, brain, and intestinal tract.
  • darcokinase plays an important role in homeostasis of blood glucose in the living body.
  • Splenic Langerhans Islet ⁇ -cell Darcokinase has been demonstrated to be a glucose sensor that regulates insulin secretion by D-glucose stimulation.
  • liver In the liver, it works to suppress the increase in blood glucose level after meals by promoting the use of sugar.
  • Dalcokinase is also present in the nucleus of the hypothalamus, which is the center of the autonomic nervous system, and in the lining cells of the ventricular wall, so that this enzyme is also present in the brain parenchyma and cerebrospinal fluid. It is thought to function as a glucose sensor that senses
  • FIG. 2 is a drawing for explaining the influence of D-fructose concentration on the rate of glucose phosphate in cultured hepatocytes.
  • FIG. 3 is a drawing for explaining the mechanism of regulation of darcokinase activity by a darcokinase activity regulatory protein in hepatocytes.
  • Figure 3 summarizes the mechanism of regulation of dalcokinase activity by the dalcokinase activity regulatory protein.
  • a darcokinase activity regulatory protein binds to and inhibits the activity of darcokinase.
  • the affinity between dalcokinase and dalcokinase activity-regulating protein is increased by D-fructose 6-phosphate and decreased by D-fructose 1-phosphate and high concentrations of glucose.
  • darcokinase becomes inactive when bound to darcokinase activity-regulating protein, and becomes active when dissociated from darcokinase activity-regulating protein.
  • D-glucose concentration outside the hepatocyte rises, the intracellular glucose concentration rises, the dalcokinase and the dalcokinase activity-regulating protein dissociate, and the darcokinase becomes inactive, and glucose phosphate becomes active. Increases, and D-glucose utilization increases.
  • D-fructose is converted to D-fructose 1-phosphate by ketohexokinase.
  • the resulting D-fructose 1-phosphate dissociates the dalcokinase and the dalcokinase activity regulating protein, and as with D-glucose, the darcokinase becomes an inactive form and becomes an active form of dalcoselin. Oxidation increases, and D-Dulcose use increases.
  • FIG. 4 is a drawing showing the results of examining the distribution of dalcokinase in hepatocytes by a fluorescent antibody method using an anti-darcokinase antibody.
  • the present inventors investigated the distribution of dalcokinase in hepatocytes by a fluorescent antibody method using an anti-darcokinase antibody, and found that darcokinase exists mainly in the cell nucleus. In addition, when D-glucose is orally administered to rats, darcokinase is transferred to the nuclear cytoplasm. Found out to do.
  • Figure 4 shows primary cultured hepatocytes at 37 ° in the presence of 5 mM D-glucose, 25 mM D-glucose, 5 mM D-glucose + 0.5 mM D-fructose, or 25 mM D-glucose + 0.5 mM D-fructose.
  • C incubated for 30 minutes, fixed hepatocytes with 4% paraformaldehyde, and examined the distribution of dalcokinase by the fluorescent antibody method. Green fluorescence indicates the distribution of darcokinase. At 5 mM D-glucose, gnorecokinase was mainly present in the cell nucleus.
  • the distribution in hepatocytes was examined by the fluorescent antibody method using the anti-darcokinase activity regulating protein, and it was found that the darcokinase activity regulating protein was also present in the nucleus.
  • FIG. 5 is a drawing for explaining the mechanism of liver glucose metabolism by translocation of darcokinase between the nucleus I cytoplasm.
  • the present inventors proposed “the existence of a hepatic glucose metabolism mechanism by translocation of darcokinase between nucleus I and cytoplasm.” Subsequent research has ensured it. Regarding the mechanism of hepatic glucose metabolism by translocation between the nucleus I and cytoplasm of the nucleus, dalcokinase exists as an inactive form in combination with a darcokinase activity-regulating protein in the nucleus, in contrast to normal blood glucose levels.
  • Darcokinase dissociates from the dalcokinase activity-regulating protein due to an increase in postprandial blood glucose or the presence of D-fructose, and then becomes active, moving to the nuclear cytoplasm to promote D-glucose metabolism, and then the blood glucose level is increased. When it decreases, it returns to the nucleus and binds to the darcokinase activity regulatory protein to become an inactive form (Fig. 5).
  • FIG. 6 is a drawing showing changes in the distribution of darcokinase in liver cells after 30 minutes of loading with D-glucose! /, Administered orally with D-fructose.
  • Goto-Kakizaki rats were orally administered to give 2 g glucose / kg body weight or 2 gD-darcose + 0.2 gD-fructose, and the distribution of dalcokinase in hepatocytes after 30 minutes of loading was examined. (Fig. 6) In Goto-Kakizaki rats, the transfer of darcokinase from the nucleus to the cytoplasm was incomplete. These results suggest that the failure of darcokinase to enter the nuclear cytoplasm may be associated with decreased hepatic glucose utilization and increased hepatic glucose production in patients with type 2 diabetes.
  • Fig. 7 is a drawing for explaining the inhibitory action on glucose elevation by low concentration of D-fructose due to changes in the distribution of dalcokinase in hepatocytes.
  • FIG. 8 is a drawing showing changes in blood glucose level after glucose loading.
  • FIG. 9 is a diagram illustrating that an increase in blood glucose level can be suppressed by administration of a small amount of D-fructose.
  • FIG. 10 is a drawing showing the effect of D-ketose in the transfer of darcokinase from the nucleus to the cytoplasm.
  • Hepatocytes were incubated in MEM medium containing 5 mM or 15 mM glucose supplemented with D-ketose, and the translocation of darcokinase from the nucleus to the cytoplasm was examined. The results are shown in Fig. 10.
  • glucokinase was transferred from the nucleus to the cytoplasm by the addition of D-fructose.
  • D-fructose the addition of D-fructose to ImM or more gradually attenuated the transfer of darcokinase into the nuclear cytoplasm.
  • D-psicose was added, darcokinase was transferred from the nucleus to the cytoplasm at any D-glucose concentration.
  • D-tagatose was added to ImM
  • dalcokinase also transferred nuclear power to the cytoplasm at any D-glucose concentration.
  • the D-tagatose concentration was 10 mM or higher, the nuclear power of dalcokinase was not transferred to the cytoplasm.
  • D-sorbose had little effect on dalcokinase translocation at any concentration.
  • FIG. 11 is a drawing showing the effect of L-ketose on the transfer of darcokinase to the nuclear force cytoplasm.
  • Liver cells were incubated in MEM medium containing 5 mM or 15 mM D-glucose supplemented with L-ketose, and the transfer of darcokinase to the nuclear cytoplasm was examined. The results are shown in FIG.
  • FIG. 12 is a drawing showing the effect of D-ketose on lactic acid production.
  • Hepatocytes were incubated in MEM medium containing 15 mM glucose supplemented with 5 mM or 20 mM D-ketose, and the time course of the amount of lactic acid in the MEM medium was examined.
  • D as control
  • FIG. 13 is a diagram illustrating the effect of D-psicose on the transition of darcokinase from the nucleus to the cytoplasm.
  • D-psicose has the effect of promoting the transition of darcokinase from the nucleus to the cytoplasm. It can be expected to suppress the increase in blood sugar. The same is also possible with low concentrations of D-tagatose.
  • Psicose is one of hexoses having a ketone group among monosaccharides. This psicose is known to have D and L isomers as optical isomers.
  • D-psicose is a known substance but rarely exists in nature, so it is defined as “rare sugar” according to the definition of the International Society of Rare Sugars.
  • D-psicose used in the present invention is a D-form of psicose classified as ketose and is a hexose (C H 0). Such a D-psi course
  • D-psicose may be obtained by any means including those extracted from natural forces, those synthesized by chemical or biosynthesis methods, and the like.
  • D-psicose is also produced by enzymatically producing D-fructose by epimerase, and may be completely purified, or may contain impurities contained in a small amount when enzymatically produced. That is, it is relatively easily prepared, for example, by a technique using epimerase (see, for example, JP-A No. 6-125776).
  • the obtained D-psicose solution can be purified by methods such as deproteinization, decolorization, and desalting, if necessary, and concentrated to collect a syrup-like D-psicose product. 99% or more highly pure preparation can be easily obtained by fractionation and purification by chromatography.
  • Such D-psicose can be used as a simple sugar.
  • L-psicose is, for example, as described in JP-A-9-56390.
  • sugar alcohol called aritol
  • aritol can be produced as a raw material.
  • the raw material, aritol can be easily obtained by the reduction reaction of D-psicose and can be used advantageously for the production of large amounts of L-psicose.
  • L-psicose Bacteria used to produce L-psicose also have the ability to produce L-psicose, and belong to the genus Darconobacter.
  • Gluconobacter flutula IF03254 or a mutant thereof can be advantageously used.
  • these bacteria are cultured in a nutrient medium containing a carbon source such as glycerol, D-manntol, D-fructose, L-sorbose or xylitol, and preferably aerobic such as shaking or aeration agitation.
  • L-psicose to be produced may be collected by culturing under conditions, converting aritol in the aqueous solution to L-psicose during culturing or using the obtained bacteria (viable cells).
  • the obtained aqueous L-psicose solution can be purified by methods such as ammonium sulfate salting-out, deproteinization by zinc hydroxide adsorption, decolorization by activated carbon adsorption, and desalting by H-type or OH-type ion exchange resin.
  • the syrupy L-psicose product can be collected by concentration. Further, a fraction having a purity of 99% or more can be easily obtained by fractionation, purification, and concentration by column chromatography using ion exchange resin.
  • D-tagatose hydrolyzes ratatose or a ratatoose-containing substance into a mixture of D-galactose and D-glucose, optionally using ratase. It is produced by removing D-glucose and then chemical isomerization of D-galactose to D-tagatose.
  • US Pat. No. 6057135 describes the production of D-tagatose from cheese whey or milk that is hydrolyzed to prepare a mixture of galactose and glucose. D-glucose is separated from D-galactose by fermentation of D-darcose and is subjected to isomerism using L-arabinose isomerase.
  • D-psicose A compound obtained by converting the structure of a molecule from a certain starting compound by a chemical reaction is called a derivative of the starting compound.
  • Derivatives of hexose containing D-psicose include sugar alcohols (when monosaccharides are reduced, aldehyde groups and keton groups become alcohol groups, resulting in the same number of polyhydric alcohols as carbon atoms), uronic acid ( It is an oxidized monosaccharide alcohol group, naturally known as D-glucuronic acid, galacturonic acid, and mannuronic acid), and amino sugar (substituted with NH group of OH group of sugar molecule).
  • the present invention relates to a disease associated with dalcokinase activity, and the symptom is ameliorated or promoted by promoting the transfer of darcokinase to the nuclear cytoplasm, for example, impaired glucose tolerance,
  • the present invention relates to food additives, food materials, food and drink, health food and drink, pharmaceuticals and feed that can be used for the prevention and treatment of type 2 diabetes, hyperlipidemia, metabolic syndrome, metabolic syndrome, obesity and the like.
  • the composition targeted by the present invention is a food additive, food, health food, food for patient, food material, food material for health, food material for patient, food additive, food additive for health, food for patient Additives, beverages, health beverages, patient beverages, drinking water, health drinking water, patient drinking water, pharmaceuticals, pharmaceutical ingredients, feed, livestock and animal feed, D-psicose and / or It is characterized by containing as an active ingredient a yarn and composition containing D-tagatose.
  • the present invention relates to an agent (formulation) for promoting the transfer of darcokinase from the nucleus to the cytoplasm, comprising D-psicose and / or D-tagatose as an active ingredient.
  • D-psicoose and / or D-tagatose as an active ingredient is associated with a disease state associated with darcokinase activity (selected from glucose intolerance, type 2 diabetes, hyperlipidemia, metabolic syndrome and obesity) It relates to foods and drinks with indications that they are used for the prevention or treatment of pathological conditions. Accordingly, the preparation targeted for the present invention or the food for specified health use is characterized by containing the blended D-psicose and / or D-tagatose as an active ingredient.
  • D-psicose and / or D-tagatose When D-psicose and / or D-tagatose is used as a preparation, it can be carried out by a known method. Specifically, for example, it can be carried out as described below.
  • the preparation of the present invention comprises tablets, pills, and capsules that are sugar-coated or coated as necessary. It is preferably used orally as agents (including node capsules, soft capsules, microcapsules), powders, granules, fine granules, troches, liquids (including syrups, emulsions and suspensions).
  • agents including node capsules, soft capsules, microcapsules
  • powders including granules, fine granules, troches
  • liquids including syrups, emulsions and suspensions.
  • a physiologically acceptable carrier or the like can be blended as long as the effects of the present invention are not inhibited.
  • physiologically acceptable carriers various organic or inorganic carrier substances commonly used as formulation materials are used. Excipients, binders, disintegrants, lubricants in solid formulations; solvents in liquid formulations, dissolution Auxiliaries, suspending agents, buffering agents, thickeners, emulsifiers and the like can be mentioned.
  • preparation additives such as a coloring agent, a sweetening agent, and an anti-acid agent can be used as necessary.
  • the preparation of the present invention may be coated.
  • excipient examples include lactose, sucrose, D-mannitol, D-sorbitol, starch, pregelatinized starch, dextrin, crystalline cellulose (for example, microcrystalline cellulose), low-substituted hydroxypropylcellulose, and the like. , Sodium carboxymethyl cellulose, gum arabic gum, dextrin, pullulan, light caustic anhydride, synthetic aluminum silicate, magnesium magnesium metasilicate, and the like.
  • binders include pregelatinized starch, sucrose, gelatin, macrogol, gum arabic, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, crystalline cellulose, sucrose, D-mann-tonole, trenorose, dextrin, punoreran. , Hydroxypropylcellulose (HPC), hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), polybulurpyrrolidone (PVP) and the like.
  • HPC Hydroxypropylcellulose
  • HPMC hydroxypropylmethylcellulose
  • PVP polybulurpyrrolidone
  • Disintegrants include, for example, lactose, sucrose, starch, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, cross-linked polybutylpyrrolidone, carmellose sodium, croscarmellose sodium, carboxymethylstarch sodium, light anhydrous key acid, low substituted hydroxy
  • examples include propylcellulose, cation exchanged rosin, partially pregelatinized starch, and corn starch.
  • the lubricant include stearic acid, magnesium stearate, calcium stearate, talc, waxes, colloidal silica, DL-leucine, sodium lauryl sulfate, magnesium lauryl sulfate, macrogol, and aerosil.
  • Examples of the solvent include water for injection, physiological saline, Ringer's solution, alcohol, propylene.
  • examples include render glycol, polyethylene glycol, medium chain fatty acid triglycerides (MCT), vegetable oils (eg safflower oil, sesame oil, corn oil, olive oil, cottonseed oil, soybean lecithin).
  • solubilizers include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate, sodium salicylate, Examples thereof include sodium acetate.
  • suspending agent examples include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate; Hydrophilic polymers such as alcohol, polybulyl pyrrolidone, carboxymethylenosulellose sodium, methinoresenorelose, hydroxymethinolesellose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose; polysorbates, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, etc. can give.
  • the buffer examples include buffer solutions of phosphate, acetate, carbonate, citrate, and the like.
  • Examples of the thickener include natural gums and cellulose derivatives.
  • Examples of the emulsifier include fatty acid esters (eg, sucrose fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester), wax (eg, beeswax, rapeseed hydrogenated oil, safflower hydrogenated oil). , Palm hydrogenated oil, sitosterol, stigmasterol, campesterol, brush casterol, cacao butter powder, carnauba wax, rice wax, molasses, paraffin, etc.), lecithin (eg, egg yolk lecithin, soybean lecithin, etc.).
  • fatty acid esters eg, sucrose fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester
  • wax eg, beeswax, rapeseed hydrogenated oil, s
  • Examples of the colorant include water-soluble edible tar dyes (eg, edible dyes such as edible red Nos. 2 and 3, edible yellows Nos. 4 and 5, edible blue Nos. 1 and 2, and water-insoluble lakes).
  • Examples include pigments (eg, aluminum salts of the above-mentioned water-soluble edible tar pigments), natural pigments (eg, j8-branch chin, chlorophyll, bengara, etc.)
  • Sweeteners include, for example, sucrose, lactose, Examples include sodium saccharin, dipotassium glycyrrhizinate, aspartame, stevia, etc.
  • Examples of the antioxidant include sulfite, ascorbic acid and their alkali metal salts, alkaline earth metal salts, and the like.
  • coating may be performed by a usual method using a coating substrate.
  • the coating base include sugar coating base, water-soluble film coating substrate, enteric film coating substrate and the like.
  • sugar coating base examples include sucrose, and one or more kinds of talc, precipitated calcium carbonate, gelatin, gum arabic, pullulan, carnaparou and the like can also be selected.
  • water-soluble film coating bases include, for example, senorelose such as hydroxypropylcellulose (HPC), hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), ethylcellulose, hydroxy chineno resenorelose, and methino lesino xyeno resenorelose.
  • senorelose such as hydroxypropylcellulose (HPC), hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), ethylcellulose, hydroxy chineno resenorelose, and methino lesino xyeno resenorelose.
  • Polymers Polyvinylacetal Jetylaminoacetate, Aminoalkyl Metaatalylate Copolymer E (Eudragit E (trade name), ROHM FALMA) Polyburylpyrrolidone, etc. Synthetic polymers; Polysaccharides such as pullulan .
  • enteric film coating bases include cellulose polymers such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, carboxymethylethylcellulose, and cellulose acetate phthalate; methacrylic acid copolymer L Acrylic acids such as Eudragit L (trade name) Rohm Falma), methacrylic acid copolymer LD (Eudragit L—30D 55 (trade name) Rohm Falma) methacrylic acid copolymer S (Eudragit S (trade name) Mouth Pharma) -Based polymers; natural products such as shellac. These coating bases may be coated singly or in combination of two or more at an appropriate ratio, or two or more may be sequentially coated.
  • cellulose polymers such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, carboxymethylethylcellulose, and cellulose acetate phthalate
  • methacrylic acid copolymer L Acrylic acids such as Eudragit L (trade
  • the food composition or food or drink of the present invention is a functional food, health food, It is preferably prepared as a functional food that may be prepared as a food for specified health use, a food for the sick, a supplement or the like.
  • the shape of the food composition or food / beverage product of the present invention include tablets, rounds, capsules (including node capsules, soft capsules, and microcapsules), powders, granules, fine granules, and troches. And liquid (including syrup, milk, and suspension), and tablet-like and capsule-like are preferred.
  • the food composition of the present invention is particularly preferably in the form of a tablet or a capsule.
  • the food composition of the present invention can be produced, for example, by incorporating D-psicose and / or D-tagatose in the food by a known method.
  • a tablet-like food yarn and composition includes, for example, D-psicose and / or D-tagatose, and excipients (for example, lactose, sucrose, mannitol, etc.), sweeteners, It can be produced by adding raw materials such as a flavoring agent, mixing them, and applying pressure with a tableting machine to form a tablet. If necessary, other ingredients (for example, vitamins such as vitamins, minerals such as iron, dietary fiber, etc.) can be added.
  • the capsule-like food composition is, for example, filled with a liquid, suspension, paste, powder or granular food composition containing D-psicose and / or D-tagatose, or a capsule It can be manufactured by encapsulating with a base.
  • a physiologically acceptable carrier for example, various conventional organic or inorganic carrier materials are used, and excipients, binders, disintegrants, lubricants, coloring agents, sweeteners, preservatives, antioxidants are used. , Thickeners and emulsifiers.
  • food additives include coloring agents, sweetening agents, preservatives, antioxidants, and flavoring agents.
  • other materials for example, minerals such as iron, dietary fibers such as pectin, carrageenan and mannan may be contained.
  • Excipients binders, disintegrants, lubricants, solvents, solubilizers, suspending agents, buffers, thickeners, coloring agents, sweeteners, preservatives, antioxidants are Examples thereof are the same as those used in the preparation of the present invention described above.
  • the vitamins may be water-soluble or fat-soluble, such as retinol palmitate, tocopherol, bisbenchamine, riboflavin, pyridoxine hydrochloride, cyanonoramine, sodium ascorbate, cholecalcifer. Rolls, nicotinic acid amide, calcium pantothenate, folic acid, piotin, choline bitartrate and the like.
  • a coating substrate is used for the purpose of masking taste, improving light stability, improving appearance, or enteric properties. It may be coated by a method known per se. Examples of the coating substrate include those similar to those used in the above-mentioned preparation of the present invention, and can be carried out in the same manner.
  • the composition of the present invention is in the form of a medicament and is associated with dalcokinase activity comprising D-psicose and / or D-tagatose together with one or more pharmaceutically acceptable carriers. It is a composition for prevention or treatment of pathological conditions.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is enteral, for example, oral or rectal, transdermal and non-human to mammals including humans, in order to promote and activate the translocation of dalcokinase to the cytoplasm. Suitable for enteral administration and for the treatment of conditions associated with dalcokinase activity. Examples of such medical conditions include impaired glucose tolerance, type 2 diabetes, hyperlipidemia, metabolic syndrome, metabolic syndrome, obesity and the like.
  • the pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount of a pharmacologically active compound of the invention, alone or in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • the pharmacologically active compound of the present invention is used in the manufacture of a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount in association or mixing with an excipient or carrier suitable for enteral or parenteral administration.
  • Diluents such as latatos, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and Z or glycine; lubricants such as silica, talcum, stearic acid, its magnesium or calcium salts and z or polyethylene renders Also for tablets, binders such as aluminum silicate magnesium, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and z or polyvinylpyrrolidone; optionally disintegrants such as starch, agar , Alginic acid or a sodium salt thereof; or an effervescent mixture; and
  • compositions are preferably aqueous isotonic solutions or suspensions, and suppositories are advantageously prepared with fatty emulsions or suspensions.
  • Such compositions are sterilized and may contain Z or adjuvants such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution promoters, osmotic salts and Z or buffering agents. Good. In addition, they may also contain other therapeutically valuable substances.
  • the compositions are each prepared according to conventional mixing, granulating or coating methods and contain about 0.1-75%, preferably about 1-50%, of the active ingredient.
  • Formulations suitable for transdermal applications include a therapeutically effective amount of a compound of the present invention with a carrier.
  • a transdermal device is a backing member, a reservoir containing the compound, optionally with a carrier, and optionally the compound over a long period of time at a predetermined controlled rate to the host skin.
  • the rate of delivery is in the form of a bandage including a control noria and means for securing the device to the skin.
  • the pharmaceutical formulation is a therapeutically effective compound of the invention as defined above, either alone or in combination with another therapeutic agent, eg, in each therapeutically effective amount as reported in the art.
  • Possible therapeutic agents include insulin, insulin derivatives or mimetics; insulin secretagogues; insulin secretion-enhancing sulfo-urea receptor ligands; PPAR ligands; insulin sensitizers; , GLP-1 analogs or mimetics; DPPIV inhibitors; HMG—CoA reductase inhibitors; squalene synthase inhibitors; FXR or LXR ligands; cholestyramine; fibrate; nicotinic acid or aspirin
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a compound of the invention in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • the present invention is preferably selected from an antidiabetic agent, lipid lowering agent, antiobesity agent, antihypertensive agent or cardiotonic agent, most preferably from the antidiabetic agent or lipid lowering agent described above. It relates to a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a compound of the invention in combination with a therapeutically effective amount of another selected therapeutic agent.
  • Disease conditions associated with dalcokinase activity more specifically impaired glucose tolerance, type 1 or type 2 diabetes, hyperlipidemia, metabolic syndrome, metabolic syndrome and obesity, preferably Relates to the use of a pharmaceutical composition or combination as described above for the manufacture of a medicament for the treatment of type 2 diabetes, impaired glucose tolerance and obesity.
  • composition as described above for the treatment of conditions associated with dalcokinase activity preferably impaired glucose tolerance, type 1 or type 2 diabetes, hyperlipidemia, metabolic syndrome, metabolic syndrome and obesity About.
  • a unit dose for a mammal of about 50-70 kg is about 1 mg to 20000 mg, advantageously about 5
  • the therapeutically effective amount of the compound depends on the species of warm-blooded animal (mammal), the body weight, age, and individual condition, mode of administration and the compound involved.
  • the compounds D-psicose and / or D-tagatose of the present invention are dalcokinase translocation promoters from the nucleus to the cytoplasm, and thus pathologies associated with glucocokinase activity as described herein, For example, impaired glucose tolerance, type 2 diabetes, hyperlipidemia
  • the present invention provides the following.
  • at least one other pharmaceutical composition comprising at least one other therapeutic agent (preferably selected from antidiabetic agents, lipid lowering agents, antiobesity agents, antihypertensive agents or cardiotonic agents).
  • at least one other therapeutic agent preferably selected from antidiabetic agents, lipid lowering agents, antiobesity agents, antihypertensive agents or cardiotonic agents.
  • therapeutic agents preferably selected from antidiabetic agents, lipid lowering agents, antiobesity agents, antihypertensive agents or cardiotonic agents.
  • kits, parts for use in any of the above methods comprising a compound of formula I in free form or in the form of a pharmaceutically acceptable salt
  • the kit may include instructions for its administration.
  • a pharmaceutical composition of the invention (ii) an antidiabetic agent, an antiobesity agent, an antihypertensive agent, a cardiotonic agent or a lipid lowering agent, in the form of two separate units, components (i) and (ii) Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a kit of parts comprising a pharmaceutical composition comprising a selected compound.
  • the compounds of the invention are administered to a mammal in need thereof.
  • the compounds of the invention are used for the treatment of diseases that respond to the activity of dalcokinase activity.
  • the pathology associated with dalcokinase activity is impaired glucose tolerance, type 2 diabetes, hyperlipidemia, metabolic syndrome and obesity, most preferably type 2 diabetes, impaired glucose tolerance. Selected from normal and obesity.
  • a method or use of the invention comprising administration of said compound in combination with a therapeutically effective amount of an antidiabetic, antiobesity, antihypertensive, cardiotonic or lipid lowering agent.
  • a method or use of the invention comprising administering said compound in the form of a pharmaceutical composition as described herein.
  • treatment encompasses all various forms or modes of treatment known to those of skill in the art and is particularly prophylactic, Includes curative, delayed progression and palliative treatment.
  • the above properties are advantageously demonstrated in in vitro and in vivo tests using mammals such as mice, rats, dogs, monkeys or isolated organs, tissues and preparations thereof.
  • the compounds are applied in vitro in solution, for example preferably in the form of an aqueous solution, and enterally, parenterally, advantageously intravenously, eg in vivo as a suspension or aqueous solution. Can be done.
  • the dosage in vitro may range from about 10_ 2 molar 10_ of 6 molar.
  • In vivo therapeutically effective amounts may range from about 0.1 to 200 OOmgZkg, preferably ⁇ 1 to 5000mgZkg, depending on the route of administration.
  • the liver is an important organ for maintaining blood glucose homeostasis.
  • Darcokinase (EC 2.7.1.1), one of the rate-determining enzymes of glycolysis in liver glucose metabolism, exists as an inactive form in the nucleus when it binds to a darcokinase activity-regulating protein in the nucleus. Due to the increase in D-glucose concentration and the presence of low concentration of D-fructose, the dalcokinase regulatory protein dissociates and shifts to the cytoplasm from the nuclear force and promotes D-glucose metabolism. The translocation of darcokinase between the nucleus I and the cytoplasm is regulated by hormones. Insulin transfers darcokinase to the nuclear cytoplasm and glucagon to the cytoplasmic nucleus.
  • Wistar rats male, 5-8 weeks old were used.
  • Rat primary hepatocytes were incubated in MEM medium containing 25 mM D-glucose supplemented with hormones and various compounds for a certain period of time. Hepatocytes were fixed with 4% paraformaldehyde and stained by a fluorescent antibody method using an anti-darcokinase antibody. The fluorescence image acquired with the confocal laser microscope was analyzed with NIH Image to calculate the fluorescence intensity of the nucleus and cytoplasm, and the amount of darcokinase in the nucleus and cytoplasm was calculated.
  • Rat primary cultured hepatocytes were incubated for a certain period of time in MEM medium containing 5 mM or 15 mM D-glucose supplemented with ketose. In the same manner as described above, the intracellular nuclear and cytoplasmic dalcokinase levels were determined.
  • Cytoplasmic dalcokinase decreased.
  • KT-5720 was allowed to act in the presence of glucagon, there was almost no decrease in cytoplasmic dalcokinase by glucagon. It is considered that the nuclear force of Darcokinase by insulin is transferred to the cytoplasm via PI3 kinase, and the transfer of Darcokinase by glucagon to the cytoplasmic force nucleus is via cAMP-dependent kinase. 2.Promoting translocation of darcokinase from nucleus to cytoplasm by glucose
  • Ketose promotes the nuclear power of Darcokinase into the cytoplasm
  • darcokinase was transferred from the nucleus to the cytoplasm in the presence of 5 mM or 15 mM D-glucose.
  • D-tagatose was added at a concentration of 10 mM or more, there was no change in the migration of darcokinase.
  • D-sorbose did not affect the migration of darcokinase at any concentration.
  • D-psicose showed a facilitating action of darcokinase from the nucleus to the cytoplasm even at high concentrations. (Fig. 11)
  • the nuclear power of Darcokinase by insulin is also transferred to the cytoplasm via PI3 kinase, and the transfer of Darcokinase from the cytoplasm to the nucleus by glucagon occurs via cAMP-A kinase.
  • Psicose and low concentrations of tagatose cause the transfer of darcokinase from the nucleus to the cytoplasm.
  • Figure 14 shows the protocol. -2g / kg for Wistar male rats fasted D-gnolecose, D-psicose, D-funoclectose, and a 1: 3 mixture of D-psicose and D-funoclectose were orally administered. Thirty minutes later, under anesthesia, the liver was removed immediately after fixation with 4% paraformaldehyde, and a frozen section was prepared. We analyzed the nuclear and cytoplasmic distribution of dalcokinase using a fluorescent antibody method using an anti-darcokinase antibody. At the same time, tail vein and portal force blood were collected and blood glucose levels were measured.
  • Figure 16 shows the protocol. -Orally administer 2g / kg D-glucose to fasted Wistar male rats. Simultaneously, 0.2 g / kg D-psicose, D-fructose, and a 1: 3 mixture of D-psicose and D-fructose were orally administered. 30 minutes later under anesthesia In addition, after perfusion fixation with 4% baraformaldehyde, the liver was immediately removed and frozen sections were prepared. We analyzed the nuclear and cytoplasmic distribution of dalcokinase using a fluorescent antibody method using an anti-darcokinase antibody. At the same time, blood was collected from the tail vein and portal vein, and the blood glucose level was measured.
  • Example 4 To investigate whether D-psicose has a pathologic improving effect in patients with type 2 diabetes, IGT (Impaired Glucose Tolerance), and patients with metabolic syndrome, It was orally administered to Goto-Kakizaki rats, a type 2 diabetes model animal, and liver darcokinase was transferred to the nuclear cytoplasm, and blood glucose and insulin concentrations in the tail vein and portal vein were measured.
  • IGT Impaired Glucose Tolerance
  • Figure 18 shows the protocol. -Orally administer 2g / kg D-glucose to fasted Goto-Kakizaki male rats. At the same time, 0.2 g / kg D-psicose was orally administered. After 30 and 60 minutes, under anesthesia, the liver was perfused and fixed with 4% paraformaldehyde, and the liver was removed and frozen sections were prepared. The nuclear and cytoplasmic distribution of hepatic dalcokinase was analyzed by a fluorescent antibody method using an anti-darcokinase antibody. At the same time, blood was collected from the tail vein and portal vein, and blood glucose and insulin concentrations were measured.
  • the liver is divided into a portal vein region and a central vein region, and dalcokinase is known to be 1.3 times more potent and 1.5 times more active in the central vein region than the portal vein region.
  • the nuclear and cytoplasmic distribution of dalcokinase in venous and portal vein regions was analyzed.
  • Figure 19 shows the results of oral administration of D-glucose alone or D-glucose and D-psicose at the same time, and the distribution of dalcokinase by fluorescent antibody method in livers 30 and 60 minutes after administration. Show.
  • Figure 20 shows the results of analyzing the fluorescence intensity of the nucleus and cytoplasm in the image of Figure 19.
  • Figure 21 shows the results of changes in blood glucose levels in the tail vein and portal vein.
  • the glucose concentration in the tail vein and portal vein at 30 and 60 minutes after simultaneous administration of D-psicose and D-glucose was significantly lower than that in the group administered with D-glucose alone. This result shows that D-psicose increases the active form of dalcokinase by translocation of dalcokinase into the nuclear cytoplasm, promotes hepatic glucose utilization, and suppresses the increase in blood glucose level.
  • Figure 22 shows the results of changes in insulin concentration in the tail vein and portal vein due to glucose load.
  • the insulin concentration in the tail vein and portal vein at 30 and 60 minutes after simultaneous administration of D-psicose and D-glucose was significantly lower than that in the group administered with D-glucose alone.
  • This result suggests that D-psicose promotes hepatic glucose utilization and suppresses the increase in blood glucose level due to the transfer of dalcokinase from the nucleus to the cytoplasm, and suppresses insulin secretion such as splenic B cell strength. Show. Inhibition of insulin secretion is thought to conserve splenic B cells.
  • D-psicose was found to be effective in patients with type 2 diabetes, IGT (Impaired Glucose Tolerance glucose intolerant, pre-diabetes group) patients, or patients with metabolic syndrome. It is thought to have an effect of improving the pathological condition. D-tagatose is considered to have the same effect as D-psicose.
  • D-psicosose When D-psicosose is orally administered simultaneously to D-glucose in Goto-Kakizaki rats, a type 2 diabetes model animal, it shifts from the liver darcokinase nucleus to the cytoplasm and uses hepatic glucose more than D-glucose alone. Promotes to lower blood glucose levels and insulin levels.
  • Darcokinase is not only for insulin secretion but also for insulin resistance under high fat diet. Compensation for spleen ⁇ 8 cell hyperplasia, because of the genetic predisposition to decrease insulin secretion, obesity by high-fat diet's obesity 'added insulin resistance, darcokinase or darcokinase activator Is an effective treatment method for type 2 diabetes because it promotes insulin secretion from spleen cells and also improves insulin secretion ability by increasing the amount of spleen
  • D-psicose and D-tagatose are naturally occurring monosaccharides and are expected to have few side effects.
  • D-fructose is said to have an effect of promoting the transition from the nucleus to the cytoplasm.
  • D-fructose has energy, and excessive use of D-fructose is a problem.
  • D-psicose and D-tagatose have the same effect of promoting the transition from the nucleus to the cytoplasm of dalcokinase, similar to D-fructose. Since the possibility of evil is low, it is considered useful.

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Description

明 細 書
希少糖のダルコキナーゼの核から細胞質への移行の促進化剤としての機 能の利用
技術分野
[0001] 本発明は、希少糖 D-プシコースおよび/または D-タガトースを有効成分とするダル コキナーゼ活性に関連する病状発症の予防ないし治療用組成物に関する。
背景技術
[0002] ダルコキナーゼ (EC 2.7.1.1)は哺乳類で発見された 4つのへキソキナーゼのうちの 1 つである。へキソキナーゼは D-グルコースの代謝の第一工程、すなわちグルコース の D-グルコース 6—リン酸への変換を触媒する。ダルコキナーゼは限定された細胞 分布を有し、主に脾臓 β細胞、肝臓実質細胞、脳視床下部、腸管などに見られる。 肝臓は、血糖の恒常性の維持に重要な臓器である。肝糖代謝における解糖系の律 速酵素の一つであるダルコキナーゼは、空腹時には細胞核内においてダルコキナー ゼ調節タンパク質と結合して不活性型として存在し、細胞外の D-グルコース濃度の 上昇、低濃度の D-フルクトースの存在により、ダルコキナーゼ活性調節タンパク質か ら解離して核力 細胞質へ移行し、 D-グルコース代謝を促進する。ダルコキナーゼ の核 I細胞質間の移行はホルモンによって調節されており、インスリンはダルコキナ ーゼを核力 細胞質へ移行させ、グルカゴンは細胞質力 核へ移行させる。
[0003] 健康な個体でも糖尿病の個体でも、低血糖症にならな ヽように肝臓力 ¾ -ダルコ一 スを産生する。こうした D-グルコース産生は、貯蔵されたグリコーゲンからの D -ダルコ ースの放出により、あるいは糖新生 (糖新生前駆体からの D-グルコースのデノボ細胞 内合成であり、 D-グルコース- 6-ホスファターゼ酵素によって媒介されるプロセス)に より誘導される。しかしながら 2型糖尿病においては、肝臓における糖利用の低下と 糖新生の亢進が認められる。肝臓の D-グルコース産生が適切に制御できないか、お よび/または増大し、場合によっては空腹時の D-グルコース産生量が 2倍以上になる ことがある。また、耐糖能異常 (糖尿病予備群)や 2型糖尿病患者の中には、空腹時の 血糖値は正常であっても、食後に高血糖を示す場合がある。インスリン分泌不足ゃィ ンスリン抵抗性などにより食後の肝糖利用あるいは/および糖産生の異常、筋肉や脂 肪組織における糖利用の低下により食後の血糖値の上昇をまねく。
また、脳視床下部にもダルコキナーゼが存在し、グルコースセンサーとして機能して Vヽると考えられて ヽる。脳視床下部にお 、てもダルコキナーゼ活性調節タンパク質が 存在していること、ダルコキナーゼが結合型と遊離型として存在することなどより、視 床下部において希少糖によるダルコキナーゼの核力 細胞質への移行によるダルコ キナーゼ活性の増大、あるいは結合型ダルコキナーゼから遊離型ダルコキナーゼの 増大によるダルコキナーゼ活性の増加が起こり、その変化が神経系を介して末梢組 織に伝わり、末梢組織におけるグルコース利用の亢進や摂食が抑制されることになり 、耐糖能異常、糖尿病、肥満症、メタボリックシンドロームの予防と治療に役立つこと になる。
脾臓 j8細胞では、ダルコキナーゼは核内ではなぐ細胞質と一部インスリン分泌顆 粒に存在しているので、脾臓 j8細胞でも希少糖によるダルコキナーゼ活性の増大に よるインスリン分泌の上昇を介して耐糖能異常や糖尿病の予防及び治療に役立つこ とが期待できる。
[0004] 最近、ダルコキナーゼ活性を増加し、血糖降下作用を有するダルコキナーゼ活性 ィ匕剤が報告されている。
ダルコキナーゼ活性化剤は、インスリン分泌の増加と結び付けられる、 細胞と肝 細胞におけるグルコース代謝速度を増加させる。そのような薬剤は 2型糖尿病の治療 に有用であろう。
ダルコキナーゼ活性剤としては、ダルコキナーゼをコードする遺伝子、 D_ダルコ一 ス、 cAMP、レチノイン酸等 (特許文献 1)、置換フ -ルァセトアミド (特許文献 2)、 ヘテロァリール力ルバモイルベンゼン誘導体 (特許文献 3)、ァミノべンズアミド誘導体 ( (特許文献 4)、ピリジン 2 カルボキサミド誘導体 (特許文献 5)が提示されている
[0005] また希少糖の大量生産方法が開発され、その機能に注目が集まって!/、る
[0006] 特許文献 1：特開 2004— 018403号公報
特許文献 2：再表 2003— 532718号公報 特許文献 3：再表 2004— 076420号公報
特許文献 4：再表 2003 - 080585号公報
特許文献 5：再表 2004— 080001号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明者らは、肝ダルコキナーゼの核から細胞質への移行促進による糖尿病治療 薬の開発を目的にインスリンとグルカゴンによる肝ダルコキナーゼの核 I細胞質間移 行のシグナル伝達系について調べ、次なるステップとして、 D-フルクトースに代わる 糖を探索する目的で、希少糖ケトースによるダルコキナーゼの核 I細胞質間移行に 及ぼす影響を調べた。
すなわち、本発明は、希少糖の中にダルコキナーゼの活性ィ匕物質を探索し、該活 性ィ匕物質を有効成分とするダルコキナーゼ活性に関連する（=ダルコキナーゼの核 から細胞質への移行の促進に関連する）病状の処置（予防な 、し治療)用組成物を 提供することを目的とする。また、本発明は、食品添加物、食品素材、飲食品、健康 飲食品、医薬品、飼料の形態で飲食、あるいは経口投与するだけで、ダルコキナー ゼ活性に関連する病状の処置（予防な 、し治療)することができる希少糖 D-プシコ一 スおよび/または D-タガトースの使用技術を提供しょうとするものである。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明は、下記の（1)記載のダルコキナーゼの核から細胞質への移行の促進剤を 要旨とする。
(1) D-プシコースおよび/または D-タガトースを有効成分とするダルコキナーゼの 核から細胞質への移行の促進剤。
[0009] また、本発明は、下記の（2)ないし (6)のいずれかに記載のダルコキナーゼ活性に 関連する病状発症の予防ないし治療用組成物を要旨とする。
(2)本発明は、 D-プシコースおよび/または D-タガトースを有効成分とするダルコ キナーゼ活性に関連する病状発症の予防ないし治療用組成物。
(3)上記糸且成物が、 D-プシコースおよび/または D-タガトースを有効成分として配 合した、ダルコキナーゼ活性に関連する病状発症の予防ないし治療に用いることが できる食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品および飼料力 なる群 力 選ばれる形態のものである（2)に記載のダルコキナーゼ活性に関連する病状発 症の予防な!/、し治療用組成物。
(4)ダルコキナーゼ活性に関連する病状が、耐糖能異常、 2型糖尿病、高脂血症、 メタボリックシンドロームおよび肥満症力 選択される、（2)または（3)に記載のダルコ キナーゼ活性に関連する病状発症の予防ないし治療用組成物。
(5)医薬品の形態のものであって、 1またはそれ以上の医薬上許容される担体とと もに、 D-プシコースおよび/または D-タガトースを含む（3)または (4)に記載のグノレコ キナーゼ活性に関連する病状発症の予防ないし治療用組成物。
(6)有効量が、 D-プシコースおよび/または D-タガトースの量が 1日当たり 0. 5〜5 Ogである、 (2)な 、し (5)の 、ずれかに記載のダルコキナーゼ活性に関連する病状 発症の予防な!/、し治療用組成物。
また、本発明は、下記の（7)ないし（11)のいずれかに記載のダルコキナーゼ活性 に関連する病状発症の予防ないし治療に用いられるものである旨の表示を付した飲 食品を要旨とする。
(7) D-プシコースおよび/または D-タガトースを有効成分として配合した、ダルコキナ ーゼ活性に関連する病状発症の予防ないし治療に用いられるものである旨の表示を 付した飲食品。
(8)耐糖能異常、 2型糖尿病、高脂血症、メタボリックシンドロームおよび肥満症から 選択されるダルコキナーゼ活性に関連する病状発症の予防ないし治療に用いられる (7)に記載の飲食品。
(9)サプリメント、機能性食品、健康食品、特定保健用食品、栄養補助飲食品または 病者用食品である（7)または（8)に記載の飲食品。
(10)タブレット状、丸状、カプセル状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状または液 状である（7)、 (8)または（9)に記載の飲食品。
(11)有効量が、 D-プシコースおよび/または D-タガトースの量が 1日当たり 0. 5〜5 Ogである、 (7)な 、し（10)の 、ずれかに記載の飲食品。
発明の効果 [0011] すなわち、本発明は、希少糖の中に D-プシコースおよび/または D-タガトースとい うダルコキナーゼの核力 細胞質への移行の促進物質を見つけ出すことができた。 すなわち本発明は、希少糖 D-プシコースおよび/または D-タガトースを有効成分と するダルコキナーゼの核から細胞質への移行の促進剤、およびかかる化合物を用い るダルコキナーゼ活性に関連する（=ダルコキナーゼの核力も細胞質への移行の促 進に関連する)病状発症の予防ないし治療用組成物を提供することができる。より具 体的には本発明は、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品、飼料の 形態で飲食、あるいは経口投与するだけで、ダルコキナーゼ活性に関連する病状の 処置（予防な 、し治療)することができる希少糖 D-プシコースおよび/または D-タガト ースの使用技術を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]ダルコキナーゼを説明する図面である。
[図 2]培養肝細胞中のグルコースリン酸ィ匕の速度における D-フルクトース濃度の影響 を説明する図面である。
[図 3]肝細胞内におけるダルコキナーゼ活性調節タンパク質によるダルコキナーゼ活 性の調節機序を説明する図面である。
[図 4]ダルコキナーゼの肝細胞内分布を抗ダルコキナーゼ抗体を用いた蛍光抗体法 により調べた結果を示す図面である。
[図 5]ダルコキナーゼの核 I細胞質間の移行による肝糖代謝機構と、 2型糖尿病で の障害を説明する図面である。
[図 6]D-グルコースあるいは D-フルクトース経口投与し、負荷 30分後の肝細胞内の ダルコキナーゼ分布の変化を示す図面である。
[図 7]低濃度 D-フルクトースにより移行が促進されたダルコキナーゼの細胞質での存 在比率を説明する図面である。
[図 8]2型糖尿病モデルラットと健常ラットにおいて、 D-グルコースの経口投与後の門 脈血中および末梢血中の血糖値の変化を示す図面である。
[図 9]少量の D-フルクトースをラットゃ 2型糖尿病患者に投与すると血糖値の上昇が 抑えられることを説明する図面である。 [図 10]ダルコキナーゼの核力 細胞質への移行における D-ケトースの効果を示す図 面である。
[図 11]ダルコキナーゼの核力 細胞質への移行における L-ケトースの効果を示す図 面である。
[図 12]乳酸産生における D-ケトースの効果を示す図面である。
[図 13]ダルコキナーゼの核力 細胞質への移行における D-プシコースの効果を説 明する図面である。
[図 14]動物実験におけるダルコキナーゼの核力 細胞質への移行を確認する実験 のプロトコールを示す図面である。
[図 15]図 14の系において、ダルコキナーゼの肝細胞内分布を抗ダルコキナーゼ抗 体を用いた蛍光抗体法により調べた結果を比較して示す図面である。
[図 16]動物実験におけるダルコキナーゼの核力 細胞質への移行を、 D-グルコース と D-プシコースや D-フルクトースとの併用による系で確認する実験のプロトコールを 示す図面である。
[図 17]図 16の系において、ダルコキナーゼの肝細胞内分布を抗ダルコキナーゼ抗 体を用いた蛍光抗体法により調べた結果を比較して示す図面である。
[図 18]2型糖尿病モデル動物の Goto-Kakizakiラットにおけるダルコキナーゼの核か ら細胞質への移行、尾静脈内と門脈内の血糖値とインスリン濃度の変化を調べる実 験のプロトコ一ノレを示す図面である。
[図 19]図 18の系において、ダルコキナーゼの肝細胞内分布を抗ダルコキナーゼ抗 体を用いた蛍光抗体法によりダルコキナーゼの核と細胞質の分布を調べた結果を比 較して示す図面である。
[図 20]図 19の蛍光画像を解析して求めた細胞質のダルコキナーゼ量の結果を比較 して示す図面である。
[図 21]図 18の系において、尾静脈と門脈内の血糖値の結果を比較して示す図面で ある。
[図 22]図 18の系において、尾静脈内と門脈内のインスリン濃度の結果を比較して示 す図面である。 発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明においては、ダルコキナーゼのァロステリック部位に結合してダルコキナーゼ を活性ィ匕する化合物、を「ダルコキナーゼ活性化剤」、肝ダルコキナーゼの核と細胞 質間の移行を促進する化合物を、「ダルコキナーゼの核から細胞質への移行の促進 剤」という。
なお、上記の「ダルコキナーゼの核力 細胞質への移行の促進剤」は、ダルコキナー ゼの核力 細胞質への移行に限定することではなぐ不活性型ダルコキナーゼの活 性型ダルコキナーゼの増加を引き起こすィ匕合物、すなわち、活性型ダルコキナーゼ 増加剤も含む。
[0014] 視床下部と脾 B細胞では、結合型ダルコキナーゼ力 活性型ダルコキナーゼの増 加によって、両組織における変化が生じる可能性があり、それらは本発明の実施例 で裏付けている。
細胞質のダルコキナーゼが、ある 、は核力 細胞質へ移行したダルコキナーゼが 細胞質のタンパク質や細胞内小器官と相互作用する。たとえば、ダルコキナーゼが 解糖系の酵素の調節にかかわるフルクトース 2, 6 ビスリン酸合成分解酵素に結合 すること、すなわち解糖系の調節に関与する可能性がある。またダルコキナーゼが他 のタンパク質と結合してダルコキナーゼ活性が増加する可能性もある。それらからは ダルコキナーゼがミトコンドリアに結合する可能性が示唆される。上記の中で、ダルコ キナーゼがミトコンドリアに存在するプロピオ-ル CoAカルボキシラーゼと結合すると ダルコキナーゼ活性が増加することは特開 2001— 333778号公報に開示されてい る力 該公報では D-プシコースや他の希少糖でこの効果がでると 、うような実験はさ れて 、な！/、。本発明では実施例でこの可能性につ!、て裏付けて!/、る。
そこで、背景技術の中で述べた視床下部と脾 B細胞を中心に考えて上記の事につ いて説明する。
細胞内小器官あるいは細胞内タンパク質とダルコキナーゼが相互作用してダルコ キナーゼ活性が変化することや、細胞内小器官やダルコキナーゼと相互作用するタ ンパク質の機能が変化することで、細胞内の代謝や細胞の機能が調節される意味を 含めて、上記の「ダルコキナーゼの核力も細胞質への移行の促進剤」は、ダルコキナ ーゼの核力 細胞質への移行に限定することではなぐ不活性型ダルコキナーゼの 活性型ダルコキナーゼの増加を引き起こすィ匕合物、すなわち、活性型ダルコキナー ゼ増加剤も含むと、定義した。
[0015] 図 1はダルコキナーゼについて説明する図面である。
図 1に示すように、へキソキナーゼは， D-グルコースを D-グルコース 6-リン酸に変 換する酵素である。へキソキナーゼには 4種類のアイソザィム（typel、 typell、 typeIII、 typelV)が存在し、へキソキナーゼ typelVがダルコキナーゼである。ダルコキナーゼは 他のアイソザィム（へキソキナーゼ types！〜 III)と異なりグルコースとの親和性が低く (Km;5〜10mM)、 D-グルコース 6-リン酸によるフィードバック阻害を受けない。本酵 素は、脾ランゲルノヽンス氏島、肝臓、脳、腸管に分布している。これらのことより、ダル コキナーゼは生体内の血糖の恒常性に重要な役割を担って 、ると考えられて 、る。 脾ランゲルハンス氏島 β細胞のダルコキナーゼは、 D-グルコース刺激によるインス リン分泌を調節して 、るグルコースセンサーであることが実証されて 、る。
肝臓では、糖利用を促進して食後の血糖値の上昇を抑える働きをして 、る。
また、自律神経の中枢である視床下部の神経核や脳室壁の上衣細胞などにもダル コキナーゼが存在しているので、本酵素が脳実質内および脳脊髄液中の D -ダルコ ース濃度を感知するグルコースセンサーとして機能して 、ると考えられて 、る。
[0016] 図 2は、培養肝細胞中のグルコースリン酸ィ匕の速度における D-フルクトース濃度の 影響を説明する図面である。
低濃度のフルクトースは、肝臓におけるグルコースリン酸ィ匕を促進することが知られ ている。結果を図 2に示した。
ラット初代培養肝細胞を 0. 5mM D-フルクトースの存在下と非存在下でグルコース 濃度を変えてインキュベートした。フルクトースの存在により肝細胞のグルコースリン 酸化は増加した（図 2の左図）。次に、 25mM D-グルコースの存在下で D-フルクトー ス濃度を変えてインキュベートした。 D-フルクトース濃度が 0. 5mMまでは、 D-フルク トース濃度の上昇とともにグルコースリン酸ィ匕は増加し、それ以上の濃度になると、逆 にグルコースリン酸ィ匕は低下した（図 2の右図）。これまでに報告されて 、る結果と一 致した。 [0017] 図 3は、肝細胞内におけるダルコキナーゼ活性調節タンパク質によるダルコキナー ゼ活性の調節機序を説明する図面である。
低濃度の D-フルクトース（0. 5mMまで）が存在すると肝臓におけるグルコース代謝 の増加が認められる事実より、肝細胞内にはダルコキナーゼと結合してその活性を 調節するダルコキナーゼ活性調節タンパク質の存在が明らかにされた。
図 3は、ダルコキナーゼ活性調節タンパク質によるダルコキナーゼ活性の調節機序 をまとめたものである。ダルコキナーゼ活性調節タンパク質はダルコキナーゼと結合 してその活性を阻害する。ダルコキナーゼとダルコキナーゼ活性調節タンパク質との 親和性は D-フルクトース 6-リン酸によって増加し、 D-フルクトース 1-リン酸や高濃 度のグルコースによって低下する。このこと力 、ダルコキナーゼはダルコキナーゼ活 性調節タンパク質と結合して ヽるときは不活性型となり、ダルコキナーゼ活性調節タ ンパク質と解離すると活性型となる。
食後、肝細胞外の D-グルコース濃度が上昇すると、細胞内のグルコース濃度が上 昇してダルコキナーゼとダルコキナーゼ活性調節タンパク質は解離してダルコキナー ゼは不活性型力も活性型となり、グルコースリン酸ィ匕が増加し、 D-グルコース利用が 増加する。また、細胞外に低濃度の D-フルクトースが存在すると、 D-フルクトースは ケトへキソキナーゼによって D-フルクトース 1-リン酸へ変換される。生じた D-フルクト ース 1-リン酸によってダルコキナーゼとダルコキナーゼ活性調節タンパク質が解離し 、 D-グルコースの場合と同様に、ダルコキナーゼは不活性型カゝら活性型になり、ダル コースリン酸化が増加し、 D-ダルコース利用が増加する。
[0018] 図 4は、ダルコキナーゼの肝細胞内分布を抗ダルコキナーゼ抗体を用いた蛍光抗 体法により調べた結果を示す図面である。
イギリスの Agiusらは、ダルコキナーゼが肝細胞内の細胞骨格タンパク質と結合して いることを見出した。細胞外のグルコース濃度の増加や低濃度 D-フルクトースの存 在で、細胞骨格タンパク質力も解離することを見出した。
本発明者らは、ダルコキナーゼの肝細胞内分布を抗ダルコキナーゼ抗体を用いた 蛍光抗体法で調べ、ダルコキナーゼは主に細胞核内に存在していることを見出した 。また、ラットに D-グルコースを経口投与するとダルコキナーゼは核力 細胞質へ移 行することを見出した。
図 4は、初代培養肝細胞を 5mM D-グルコース、 25mM D-グルコース、 5mM D-グ ルコース + 0. 5mM D-フルクトース、あるいは 25mM D-グルコース + 0. 5mM D-フ ルクトース存在下で 37°C、 30分間インキュベートし、肝細胞を 4%パラホルムアルデ ヒドで固定し、蛍光抗体法でダルコキナーゼの分布を調べた結果である。緑色蛍光 はダルコキナーゼの分布を示している。 5mM D-グルコースでは、グノレコキナーゼは 主に細胞核内に存在した。 25mM D-グルコースとのインキュベーションにより、核の ダルコキナーゼは低下し、細胞質のダルコキナーゼは増加した。 0. 5mM D-フルクト ースが存在すると、 D-フルクトースが存在しない場合と比べて、ダルコキナーゼの核 力も細胞質への移行は増加した。
ダルコキナーゼ活性調節タンパク質についても抗ダルコキナーゼ活性調節タンパク 質を用いて蛍光抗体法で肝細胞内分布を調べたところ、ダルコキナーゼ活性調節タ ンパク質も核内に存在していることを見出した。
[0019] 図 5は、ダルコキナーゼの核 I細胞質間の移行による肝糖代謝機構にっ 、て説明 する図面である。
本発明者らは、これらの結果から、 "ダルコキナーゼの核 I細胞質間の移行による 肝糖代謝機構"の存在"を提唱した。その後の研究により、それを確実なものにした。 "ダルコキナーゼの核 I細胞質間の移行による肝糖代謝機構"について、ダルコキ ナーゼは、通常の血糖値にぉ 、ては核内でダルコキナーゼ活性調節タンパク質と結 合して、不活性型として存在している。ダルコキナーゼは食後の血糖上昇あるいは D -フルクトースの存在によりダルコキナーゼ活性調節タンパク質カゝら解離して活性型と なり、核力 細胞質へ移行して D-グルコース代謝を促進し、その後血糖値が低下し てくると核に戻り、ダルコキナーゼ活性調節タンパク質と結合して不活性型となる調節 機序である（図 5)。
[0020] 図 6は、 D-グルコースある!/、は D-フルクトースを経口投与し、負荷 30分後の肝細 胞内のダルコキナーゼ分布の変化を示す図面である。
2型糖尿病患者では、肝糖利用の低下と肝糖新生の亢進が認められていることから 、 2型糖尿病患者ではダルコキナーゼの核力も細胞質への移行が低下して 、ること が考えられた。そこで、 2型糖尿病モデル動物の Goto-Kakizakiラットに D-グルコース あるいは D-フルクトース経口投与時の肝ダルコキナーゼの核から細胞質への移行を 調べた。 Goto- Kakizakiラットに、体重 lkgあたり 2gグルコース、あるいは 2gD -ダルコ ース + 0. 2gD-フルクトースとなるように経口投与し、負荷 30分後の肝細胞内のダル コキナーゼの分布を調べた。（図 6) Goto-Kakizakiラットでは、ダルコキナーゼの核か ら細胞質への移行は不全であった。この結果より、ダルコキナーゼの核力 細胞質へ の移行の不全が 2型糖尿病患者の肝糖利用の低下と肝糖産生の亢進にかかわって いる可能性が示唆された。
[0021] 図 7は、低濃度 D-フルクトースによるダルコキナーゼの肝細胞内分布変化による血 糖上昇抑制作用を説明する図面である。
低濃度 D-フルクトースによる血糖上昇抑制作用につ 、て調べた。 2型糖尿病モデ ル動物の Goto- Kakizakiラットに、体重 lkgあたり 2g D-グルコース、あるいは 2gD-グ ルコース + 0. 2gD-フルクトースとなるように経口投与し、肝細胞内ダルコキナーゼの 核から細胞質への移行の変化と、門脈と尾静脈の血糖値の変化を調べた。 D-ダル コースの経口投与によりダルコキナーゼは核から細胞質へ移行した。 D-フルクトース 添カ卩により、ダルコキナーゼの核力ゝら細胞質への移行は D-グルコース単独投与時と 比較して有意な増加を示した (図 7)。
[0022] 図 8は、糖負荷後の血糖値の変化を示す図面である。
門脈血糖値は糖負荷によって上昇した（図 8)。 D-フルクトース負荷による差異は認 められな力つた力 尾静脈血糖値では D-グルコース単独投与時と比較して D-フルク トース添カ卩による有意な血糖上昇抑制が認められた。 D-フルクトースによる尾静脈血 糖値の上昇抑制は、ダルコキナーゼの核力ゝら細胞質への移行が D-グルコース単独 投与時よりも増加したことによるものと考えられた。
[0023] 図 9は、少量の D-フルクトースの投与により血糖値の上昇が抑えられることを説明 する図面である。
少量の D-フルクトースをラットゃ 2型糖尿病患者に投与すると血糖値の上昇が抑え られる（図 9)。それは、肝ダルコキナーゼの核力も細胞質への移行が起こり、肝糖利 用が促進したことによるものと考えられている。このことから、糖尿病患者の甘味料とし て D-フルクトースを用いることが考えられる力 D-フルクトースの大量摂取は血中脂 質や尿酸の上昇、肝脂質の蓄積を招く可能性がある。そこで、希少糖が D-フルクト ースと同様な作用を有するかどうかは興味あるところである。
[0024] 図 10は、ダルコキナーゼの核から細胞質への移行における D-ケトースの効果を示 す図面である。
D-ケトースを添カ卩した 5 mMあるいは 15mMグルコース含有 MEM培地中で肝細胞 をインキュベートし、ダルコキナーゼの核から細胞質への移行を調べた。結果を図 10 に示した。
5mMあるいは 15mMの D-グルコース存在下において、 D-フルクトース添カ卩によりグ ルコキナーゼは核から細胞質へ移行した。しかし D-フルクトースを ImM以上添加す るとダルコキナーゼの核力 細胞質への移行は徐々に減弱した。 D-プシコースを添 加すると、いずれの D-グルコース濃度においても、ダルコキナーゼは核から細胞質 へ移行した。また、 D-タガトースを ImMまで添カ卩した場合、いずれの D-グルコース濃 度にお 、てもダルコキナーゼは核力も細胞質へ移行した。 D-タガトース濃度が 10m M以上になるとダルコキナーゼの核力も細胞質への移行は認められなくなった。 D-ソ ルボースは、いずれの濃度においてもダルコキナーゼの移行にほとんど影響を与え なかった。
[0025] 図 11は、ダルコキナーゼの核力 細胞質への移行における L-ケトースの効果を示 す図面である。
L-ケトースを添カ卩した 5mMあるいは 15mM D-グルコース含有 MEM培地中で肝細 胞をインキュベートし、ダルコキナーゼの核力 細胞質への移行を調べた。結果を図 11に示した。
L-フルクトースを添カ卩すると、 5mMある!/、は 15mMの D -ダルコース存在下にお！/、て 、ダルコキナーゼは核から細胞質へ移行した。し力し、 L-フルクトースを 20mM以上 添加するとダルコキナーゼの核力 細胞質への移行は減少した。 L-プシコースを添 カロすると、 5mMあるいは 15mMの D-グルコース存在下において、ダルコキナーゼは 核力ゝら細胞質に移行した。 L-タガトースは、ダルコキナーゼの移行に影響を与えない ことが分力つた。 L-ソルボースを添加した場合、 L-ソルボース濃度の上昇により、グ ルコキナーゼは核力 細胞質へ移行した。
[0026] 図 12は、乳酸産生における D-ケトースの効果を示す図面である。
5mMあるいは 20mMの D-ケトースを添カ卩した 15mMグルコース含有 MEM培地中で 肝細胞をインキュベートし、 MEM培地中の乳酸量の時間経過を調べた。対照として D
MSOを添カロした。結果を図 12に示した。
D-ケトースをそれぞれ 0. 5mM添カ卩したところ、乳酸生成は、 D-フルクトース、 D-プ シコースの添カ卩によって増加した。
[0027] 図 13は、ダルコキナーゼの核から細胞質への移行における D-プシコースの効果を 説明する図面である。
図 10に示すとおり、 D-プシコースは、ダルコキナーゼの核から細胞質への移行の 促進作用を持つ。それによる血糖上昇抑制が期待できる。また、低濃度の D-タガト ースによっても同様のことが考えられる。
[0028] プシコースは、単糖類の中で、ケトン基を持つ六炭糖の一つである。このプシコース には光学異性体として D体と L体とが有ることが知られている。ここで、 D-プシコース は既知物質であるが自然界に希にしか存在しないので、国際希少糖学会の定義に よれば「希少糖」と定義されている。本発明で使用する D-プシコースは、ケトースに分 類されるプシコースの D体であり六炭糖（C H 0 )である。このような D-プシコースは
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、 自然界力 抽出されたもの、化学的またはバイオ的な合成法により合成されたもの 等を含めて、どのような手段により入手してもよい。 D-プシコースは、 D-フルクトース 力もェピメラーゼによって酵素的に生産されたもので、完全に精製されたものでも良 いし、酵素的に生産される際に少量含まれる不純物を含んだものでもよい。すなわち 、比較的容易には、例えば、ェピメラーゼを用いた手法 (例えば、特開平 6-125776 号公報参照）により調製される。得られた D—プシコース液は、必要により、例えば、 除蛋白、脱色、脱塩などの方法で精製され、濃縮してシロップ状の D—プシコース製 品を採取することができ、さらに、カラムクロマトグラフィーで分画、精製することにより 99%以上の高純度の標品も容易に得ることができる。このような D—プシコースは単 糖としてそのまま利用できる。
[0029] 一方、 L-プシコースは、たとえば特開平 9— 56390号公報に記載されているように 、ダルコノバクター属に属する微生物を用いて、ァリトールという糖アルコールを原料 として生産できる。原料となるァリトールは D-プシコースの還元反応によって容易に 得られるので大量の Lープシコースの生産に有利に利用できる。
ァリトール力も L-プシコースを製造するのに使用される細菌はダルコノバクター属に 属し、ァリトール力も L-プシコース産生能を有する細菌である。その一例としては、グ ルコノバクタ一 ·フラテゥリ IF03254又は、これの変異株などが有利に利用できる。 通常、これら細菌をグリセロール、 D-マン-トール、 D-フルクトース、 L-ソルボースあ るいはキシリトール等の炭素源を含有する栄養培地で培養し、望ましくは、振盪、通 気撹拌などの好気的条件下で培養し、培養中に、又は得られた細菌 (生菌体)を用 いて、水溶液中のァリトールを L-プシコースに変換させて、生成する L-プシコースを 採取すればよい。
得られた L-プシコース水溶液は、必要により、例えば、硫安塩析、水酸化亜鉛吸着 などによる除蛋白、活性炭吸着による脱色、 H型、 OH型イオン交換榭脂による脱塩 などの方法で精製し、濃縮してシロップ状の L-プシコース製品を採取することができ る。更にイオン交換榭脂を用いるカラムクロマトグラフィーで分画、精製、濃縮すること により、 99%以上の高純度の標品も容易に得ることができる。
[0030] 米国特許第 5002612号及び第 5078796号によれば、 D—タガトースは、ラタター ゼを使用して、ラタトースまたはラタトース含有物質を D-ガラクトースと D-グルコース の混合物に加水分解し、任意に D-グルコースを除去し、その後 D-ガラクトースの D- タガトースへの化学的異性ィ匕によって製造されている。米国特許第 6057135号は、 ガラクトースとグルコースの混合物を調製するために加水分解する、チーズホエーま たはミルクからの D—タガトースの製造を記載している。 D-グルコースは、 D -ダルコ ースの発酵によって D-ガラクトース力 分離され、 L-ァラビノースイソメラーゼを使用 して異性ィ匕にかけられる。
[0031] D-プシコースの誘導体について説明する。ある出発化合物から分子の構造を化学 反応により変換した化合物を出発化合物の誘導体と呼称する。 D-プシコースを含む 六炭糖の誘導体には、糖アルコール (単糖類を還元すると、アルデヒド基およびケト ン基はアルコール基となり、炭素原子と同数の多価アルコールとなる）や、ゥロン酸（ 単糖類のアルコール基が酸化したもので、天然では D-グルクロン酸、ガラクチュロン 酸、マンヌロン酸が知られている）、アミノ糖 (糖分子の OH基力NH基で置換されたも
2
の、ダルコサミン、コンドロサミン、配糖体などがある）などが一般的である力 それら に限定されるものではない。 L-プシコース、 D-タガトースの誘導体についても上記と 同様である。
[0032] 本発明は、ダルコキナーゼ活性に関連する疾患で、ダルコキナーゼの核力 細胞 質への移行を促進することにより症状が改善される、あるいは発病が予防される、例 えば耐糖能異常、 2型糖尿病、高脂血症、代謝性症候群、メタボリックシンドローム、 肥満症などの予防および治療に用いることができる食品添加物、食品素材、飲食品 、健康飲食品、医薬品および飼料に関するものである。
本発明が対象とする組成物は、食品添加物、食品、保健用食品、患者用食品、食品 素材、保健用食品素材、患者用食品素材、食品添加物、保健用食品添加物、患者 用食品添加物、飲料、保健用飲料、患者用飲料、飲料水、保健用飲料水、患者用 飲料水、薬剤、製剤原料、飼料、患畜および患獣用飼料であり、 D-プシコースおよ び/または D-タガトースを配合した糸且成物が有効成分として含有されていることを特 徴とする。
[0033] 本発明は、 D-プシコースおよび/または D-タガトースを有効成分とするダルコキナ ーゼの核から細胞質への移行の促進剤 (製剤）に関するものである。また、 D-プシコ ースおよび/または D-タガトースを有効成分として配合した、ダルコキナーゼ活性に 関連する病状 (耐糖能異常、 2型糖尿病、高脂血症、メタボリックシンドロームおよび 肥満症から選択される病状)発症の予防な 、し治療に用いられるものである旨の表 示を付した飲食品に関するものである。したがって、本発明が対象とする製剤、また は特定保健用食品は、配合した D-プシコースおよび/または D-タガトースが有効成 分として含有されて!ヽることを特徴とする。
[0034] D-プシコースおよび/または D-タガトースを製剤として使用する場合には、公知の 方法によって実施することができる。具体的には、例えば、以下に記載するとおりに 実施することができる。
[0035] 本発明の製剤は、必要に応じて糖衣やコーティングを施した錠剤、丸剤、カプセル 剤（ノヽードカプセル、ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、細粒 剤、トローチ剤、液剤（シロップ剤、乳剤、懸濁剤を含む)などとして経口的に使用す るのが好ましい。
[0036] 本発明の製剤には、本発明の効果を阻害しない限り、生理学的に許容される担体 などを配合することができる。生理学的に許容される担体などとしては、製剤材料とし て慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、 結合剤、崩壊剤、滑沢剤;液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、緩衝剤 、増粘剤、乳化剤などがあげられる。また、必要に応じて、着色剤、甘味剤、抗酸ィ匕 剤などの製剤添加剤も用いることができる。さらに本発明の製剤をコーティングしても よい。
[0037] 賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、 D-マン-トール、 D-ソルビトール、デンプン 、 α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース（例えば、微結晶セルロースなど）、低 置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ァラビ ァゴム、デキストリン、プルラン、軽質無水ケィ酸、合成ケィ酸アルミニウム、メタケイ酸 アルミン酸マグネシウムなどがあげられる。結合剤としては、例えば、 α化デンプン、 ショ糖、ゼラチン、マクロゴール、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチル セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、 白糖、 D-マン -トーノレ、トレノヽロース、デキストリン、プノレラン、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC) 、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC)、ポリビュルピロリドン（PVP)などが あげられる。崩壊剤としては、例えば、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセル ロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、架橋ポリビュルピロリドン、カルメロ ースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、軽 質無水ケィ酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、陽イオン交換榭脂、部分 α 化でんぷん、トウモロコシデンプンなどがあげられる。滑沢剤としては、例えば、ステア リン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ワックス類、コロイ ドシリカ、 DL-ロイシン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、マクロゴー ル、エアロジルなどがあげられる。
[0038] 溶剤としては、例えば、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピ レンダリコール、ポリエチレングリコール、中鎖脂肪酸トリグリセリド (MCT)、植物油（ 例えば、サフラワー油、ゴマ油、トウモロコシ油、ォリーブ油、綿実油、大豆レシチンな ど）などがあげられる。溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピ レングリコール、 D-マン-トール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリ スァミノメタン、コレステロール、トリエタノールァミン、炭酸ナトリウム、クェン酸ナトリウ ム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどがあげられる。懸濁化剤としては、例え ば、ステアリルトリエタノールァミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸 、レシチン、塩化ベンザルコ-ゥム、塩化べンゼトニゥム、モノステアリン酸グリセリンな どの界面活性剤；例えばポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシメチ ノレセノレロースナトリウム、メチノレセノレロース、ヒドロキシメチノレセノレロース、ヒドロキシェ チルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート 類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などがあげられる。緩衝剤としては、例えば、リン 酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クェン酸塩などの緩衝液などがあげられる。増粘剤としては 、例えば、天然ガム類、セルロース誘導体などがあげられる。乳化剤としては、例えば 、脂肪酸エステル類 (例えば、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ソ ルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルなど）、ワックス（例え ば、ミツロウ、菜種水素添加油、サフラワー水素添加油、パーム水素添加油、シトステ ロール、スチグマステロール、カンペステロール、ブラシカステロール、カカオ脂粉末 、カルナウパロウ、ライスワックス、モクロウ、パラフィンなど）、レシチン（例えば、卵黄 レシチン、大豆レシチンなど）などがあげられる。
[0039] 着色剤としては、例えば、水溶性食用タール色素（例、食用赤色 2号および 3号、食 用黄色 4号および 5号、食用青色 1号および 2号などの食用色素、水不溶性レーキ色 素（例、前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩など）、天然色素（例、 j8—力口 チン、クロロフィル、ベンガラなど)などがあげられる。甘味剤としては、例えば、ショ糖 、乳糖、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビア などがあげられる。抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、ァスコルビン酸及びそれら のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩などがあげられる。
[0040] 錠剤、顆粒剤、細粒剤などに関しては、味のマスキング、光安定性の向上、外観の 向上あるいは腸溶性などの目的のため、コーティング基材を用いて通常の方法でコ 一ティングしてもよい。このコーティング基剤としては、糖衣基剤、水溶性フィルムコー ティング基材、腸溶性フィルムコ一ティング基材などがあげられる。
[0041] 糖衣基剤としては、例えば、白糖があげられ、さらにタルク、沈降炭酸カルシウム、 ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、カルナパロウなど力も選ばれる 1種または 2種以上 を併用してもよい。
[0042] 水溶性フィルムコーティング基剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC)、ェチルセルロース、ヒドロキ シェチノレセノレロース、メチノレヒドロキシェチノレセノレロースなどのセノレロース系高分子； ポリビニルァセタールジェチルァミノアセテート、アミノアルキルメタアタリレートコポリ マー E (オイドラギット E (商品名）、ロームフアルマ社)ポリビュルピロリドンなどの合成 高分子;プルランなどの多糖類などがあげられる。腸溶性フィルムコーティング基剤と しては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメ チルセルロースアセテートサクシネート、カルボキシメチルェチルセルロース、酢酸フ タル酸セルロースなどのセルロース系高分子；メタアクリル酸コポリマー L (オイドラギッ ト L (商品名）ロームフアルマ社）、メタアクリル酸コポリマー LD (オイドラギット L— 30D 55 (商品名）ロームフアルマ社)メタアクリル酸コポリマー S (オイドラギット S (商品名）口 ームフアルマ社)などのアクリル酸系高分子；セラックなどの天然物などがあげられる。 これらのコーティング基剤は、単独で、または 2種以上を適宜の割合で混合してコー ティングしてもよぐまた 2種以上を順次コーティングしてもよい。
[0043] 飲食品の形態の組成物、ある!/、は機能 ·効能などの表示を付した飲食品である場 合、本発明の食品組成物あるいは飲食品は、機能性食品、健康食品、特定保健用 食品、病者用食品、サプリメントなどとして調製されてもよぐ機能性食品として調製 されるのが好ましい。このような本発明の食品組成物あるいは飲食品の形状としては 、例えば、タブレット状、丸状、カプセル（ノヽードカプセル、ソフトカプセル、マイクロ力 プセルを含む)状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状、液状 (シロップ状、乳状、 懸濁状をふくむ）などがあげられ、タブレット状、カプセル状であるのが好ましい。
[0044] 本発明の食品組成物としては、特にタブレット状、カプセル状であるのが好ましぐ とりわけタブレット状の機能性食品、カプセル状の機能性食品であるのが好ま 、。
[0045] 本発明の食品組成物は、例えば、公知の方法によって食品中に D-プシコースお よび/または D-タガトースを含有させることによって製造することができる。具体的に は、例えば、タブレット状の食品糸且成物は、例えば、 D-プシコースおよび/または D- タガトース、および、賦形剤 (例えば、乳糖、白糖、マン-トールなど）、甘味剤、着香 剤などの原料を添加、混合し、打錠機などで圧力をかけてタブレット状に成形するこ とにより製造することができる。必要に応じて、その他の材料 (例えば、ビタミンじなど のビタミン類、鉄などミネラル類、食物繊維など）を添加することもできる。カプセル状 の食品組成物は、例えば、 D-プシコースおよび/または D-タガトースを含有する液 状、懸濁状、のり状、粉末状または顆粒状の食品組成物をカプセルに充填するか、 またはカプセル基剤で被包成形して製造することができる。
[0046] 本発明の食品組成物には、本発明の効果を阻害しない限り、通常用いられる食品 素材、食品添加物、各種の栄養素、ビタミン類、風味物質 (例えば、チーズやチョコレ ートなど)などに加え、生理学的に許容される担体などを配合することができる。生理 学的に許容される担体などとしては、慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用い られ、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、防腐剤、抗酸化剤、増粘 剤、乳化剤などがあげられる。また食品添加物としては、着色剤、甘味剤、防腐剤、 抗酸化剤、着香剤などがあげられる。さらに、その他の材料、例えば、鉄などのミネラ ル類、ぺクチン、カラギーナン、マンナンなどの食物繊維などを含有していてもよい。
[0047] 賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、緩衝剤、増粘 剤、着色剤、甘味剤、防腐剤、抗酸化剤としては、それぞれ前記した本発明の製剤 に用いられるものと同様のものがあげられる。
[0048] ビタミン類としては、水溶性であっても脂溶性であってもよぐ例えばパルミチン酸レ チノール、トコフエロール、ビスベンチアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、シァノコ ノ ラミン、ァスコルビン酸ナトリウム、コレカルシフエロール、ニコチン酸アミド、パントテ ン酸カルシウム、葉酸、ピオチン、重酒石酸コリンなどがあげられる。
[0049] タブレット状、顆粒状、細粒状の食品組成物などに関しては、味のマスキング、光安 定性の向上、外観の向上あるいは腸溶性などの目的のため、コーティング基材を用 いて自体公知の方法でコーティングしてもよい。そのコーティング基材としては、前記 した本発明の製剤に用いられるものと同様のものがあげられ、同様にして実施するこ とがでさる。
[0050] 本発明の組成物は、医薬品の形態のものであって、 1またはそれ以上の医薬上許 容される担体とともに、 D-プシコースおよび/または D-タガトースを含むダルコキナー ゼ活性に関連する病状発症の予防ないし治療用組成物である。本発明の医薬組成 物は、ダルコキナーゼの核力ゝら細胞質への移行を促進し活性ィ匕するための、ヒトを含 む哺乳類への、経腸、たとえば経口もしくは経直腸、経皮および非経腸投与に適し、 そしてダルコキナーゼ活性に関連する病状の処置に適したものである。かかる病状と しては、上記の通り耐糖能異常、 2型糖尿病、高脂血症、代謝性症候群、メタボリック シンドローム、肥満症などが挙げられる。当該医薬組成物は、単独で、または 1もしく はそれ以上の医薬上許容される担体と組み合わせて、本発明の薬理学的活性ィ匕合 物の治療上有効量を含んでなる。
[0051] 本発明の薬理学的活性化合物は、経腸または非経腸投与に適した賦形剤または 担体と連係的または混合して治療上有効量を含んでなる医薬組成物の製造におい て有用である。希釈剤、たとえば、ラタトース、デキストロース、スクロース、マン-トー ル、ソルビトール、セルロースおよび Zまたはグリシン；滑沢剤、たとえば、シリカ、タル カム、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩および zまたはポリェチ レンダリコール;また、錠剤のために、結合剤、たとえば、ケィ酸アルミニウムマグネシ ゥム、スターチペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキ シメチルセルロースおよび zまたはポリビニルピロリドン;所望により、崩壊剤、たとえ ばスターチ、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩;または発泡性混合物；および
Zまたは吸収剤;着色剤;着香剤および甘味料とともに活性成分を含む錠剤および ゼラチンカプセルが好適である。
[0052] 注射用組成物は、好ましくは水性等張性溶液または懸濁液であり、そして坐剤は有 利には脂肪ェマルジヨンまたは懸濁液力 製造される。かかる組成物は、滅菌され、 そして Zまたはアジュバント、たとえば保存剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤、溶解 推進剤（solution promoter)、浸透圧調節用塩および Zまたは緩衝化剤を含有しても よい。さらに、それらは、また、他の治療上価値のある物質を含有し得る。当該組成物 は、それぞれ、慣用的混合、造粒またはコーティング法にしたがって製造され、そして 約 0.1〜75%、好ましくは約 1〜50%の活性成分を含有する。
[0053] 経皮適用に適した製剤は、担体とともに本発明の化合物の治療上有効量を含む。
有利な担体としては、宿主の皮膚の通過を助ける吸収可能な薬理学的に許容できる 溶媒が挙げられる。特徴的には、経皮デバイス (transdermal device)は、裏当て部分 (backing member)、所望により担体と共に化合物を含有するリザーバー、所望により 予め定められた制御速度で長期間にわたって化合物を宿主の皮膚へ送達する速度 制御ノリア一および当該デバイスを皮膚に固定する手段を含むバンデージ (bandage )の形態である。
[0054] 医薬製剤は、単独で、または別の治療剤と組み合わせて、たとえば当分野におい て報告されて 、るそれぞれの治療上有効量で、上で定義した本発明の化合物の治 療上有効量を含有する。カゝかる治療剤としては、インスリン、インスリン誘導体またはミ メテイクス;インスリン分泌促進剤;インスリン分泌増強スルホ -ルゥレアレセプターリガ ンド； PPARリガンド；インスリンセンシタイザ一；ビグアニド、ァノレファ ダルコシダー ゼインヒビター； GLP - 1、 GLP - 1アナログまたはミメテイクス； DPPIVインヒビター； HMG— CoAレダクターゼインヒビター；スクアレンシンターゼインヒビター； FXRまた は LXRリガンド；コレスチラミン；フイブラート；ニコチン酸またはアスピリンが挙げられる
[0055] したがって、追加的態様において、本発明は、 1またはそれ以上の医薬上許容され る担体と組み合わせて本発明の化合物の治療上有効量を含んでなる医薬組成物に 関する。
[0056] さらなる態様において、本発明は、好ましくは抗糖尿病剤、脂質低下剤、抗肥満剤 、抗高血圧剤または強心剤カゝら選択される、最も好ましくは上記の抗糖尿病剤または 脂質低下剤から選択される、別の治療剤の治療上有効量と組み合わせて本発明の 化合物の治療上有効量を含んでなる医薬組成物に関する。
[0057] ダルコキナーゼ活性に関連する病状、より具体的には耐糖能異常、 1型または 2型 糖尿病、高脂血症、代謝性症候群、メタボリックシンドロームおよび肥満症、好ましく は 2型糖尿病、耐糖能異常および肥満の処置用医薬の製造のための上記の医薬組 成物または組合せ剤の使用に関する。
[0058] ダルコキナーゼ活性に関連する病状、好ましくは耐糖能異常、 1型または 2型糖尿 病、高脂血症、代謝性症候群、メタボリックシンドロームおよび肥満症の処置のため の、上記の医薬組成物に関する。
[0059] 約 50〜70kgの哺乳類のための単位用量は、約 lmg〜20000mg、有利には約 5
〜5000mgの活性成分を含有し得る。当該化合物の治療上有効量は、温血動物（ 哺乳類)の種、体重、年齢、および個々の状態、投与の形態および関係する化合物 に依存する。
[0060] 本発明の化合物 D-プシコースおよび/または D-タガトースは、ダルコキナーゼの核 から細胞質への移行促進剤であり、したがって、本明細書において記載したようなグ ルコキナーゼ活性に関連する病状、たとえば、耐糖能異常、 2型糖尿病、高脂血症
、代謝性症候群、メタボリックシンドロームおよび肥満症の処置に使用され得る。
[0061] 前記にしたがって、本発明は、さらなる局面において、以下のものを提供する。たと えば、少なくとも 1つの他の治療剤 (好ましくは抗糖尿病剤、脂質低下剤、抗肥満剤、 抗高血圧剤または強心剤から選択される）を含んでなる少なくとも 1つの医薬組成物 と同時的または逐次的に使用するための、遊離の形態または医薬上許容される塩の 形態の式 Iの化合物を含んでなる、上記のいずれかの方法において使用するための 治療用組合せ剤、たとえばキット、パーツのキットなどである。当該キットは、その投与 のための指示書を含んで 、てもよ 、。 構成要素（i)と（ii)の 2つの個別のユニットの 形態の、（i)本発明の医薬組成物、（ii)抗糖尿病剤、抗肥満剤、抗高血圧剤、強心 剤もしくは脂質低下剤、または医薬上許容されるそれらの塩力 選択される化合物を 含んでなる医薬組成物を含んでなるパーツのキットである。
[0062] 好ましくは、本発明の化合物は、それを必要としている哺乳類に投与される。
[0063] 好ましくは、本発明の化合物は、ダルコキナーゼ活性の活性ィ匕に応答する疾患の 処置に使用される。
[0064] 好ましくは、ダルコキナーゼ活性に関連する病状は、耐糖能異常、 2型糖尿病、高 脂血症、メタボリックシンドロームおよび肥満症、最も好ましくは 2型糖尿病、耐糖能異 常および肥満症から選択される。
[0065] 抗糖尿病剤、抗肥満剤、抗高血圧剤、強心剤または脂質低下剤の治療上有効量 と組み合わせた前記化合物の投与を含んでなる本発明の方法または使用。
[0066] 本明細書において記載した医薬組成物の形態で前記化合物を投与することを含ん でなる本発明の方法または使用。
[0067] 本明細書を通して、および特許請求の範囲において使用されているように、「処置」 なる用語は、当業者既知のすべての種々の形態または様式の処置を包含し、そして 特に予防的、治癒的、進行遅延および緩和的処置を含む。
[0068] 上記の特性は、有利には哺乳類、たとえば、マウス、ラット、ィヌ、サルまたは摘出臓 器、組織およびそれらの調製物を用いるインビトロおよびインビボ試験にぉ 、て示さ れる。当該化合物は、溶液、たとえば、好ましくは水溶液の形態にてインビトロで、お よび経腸的、非経腸的に、有利には経静脈的に、たとえば、懸濁液または水溶液とし てインビボで適用され得る。インビトロの用量は、約 10_2モル濃度から 10_6モル濃度 の範囲であり得る。インビボの治療上有効量は、投与経路に依存して、約 0.1〜200 OOmgZkg、好まし <は約 l〜5000mgZkgの範囲であり得る。
[0069] 本発明の詳細を実施例で説明する。本発明はこれらの実施例によってなんら限定 されるものではない。
実施例 1
[0070] 肝臓は、血糖の恒常性の維持に重要な臓器である。肝糖代謝における解糖系の律 速酵素の一つであるダルコキナーゼ（EC 2.7.1.1)は、空腹時には細胞核内において ダルコキナーゼ活性調節タンパク質と結合して不活性型として存在し、細胞外の D- グルコース濃度の上昇、低濃度の D-フルクトースの存在により、ダルコキナーゼ調節 タンパク質カゝら解離して核力ゝら細胞質へ移行し、 D-グルコース代謝を促進する。ダル コキナーゼの核 I細胞質間の移行はホルモンによって調節されており、インスリンは ダルコキナーゼを核力 細胞質へ移行させ、グルカゴンは細胞質力 核へ移行させ る。
最近、ダルコキナーゼ活性を増加し、血糖降下作用を有するダルコキナーゼ活性 ィ匕剤が報告されている。また希少糖の大量生産方法が開発され、その機能に注目が 集まっている。
本研究では、肝ダルコキナーゼの核から細胞質への移行促進による糖尿病治療薬 の開発を目的にインスリンとグルカゴンによる肝ダルコキナーゼの核 I細胞質間移行 のシグナル伝達系について調べた。また、 D-フルクトースに代わる糖を探索する目 的で、ケトースによるダルコキナーゼの核 I細胞質間移行に及ぼす影響を調べた。
[0071] [実験方法]
1.ホルモンによる肝ダルコキナーゼの細胞内移行
Wistar系ラット (雄性、 5— 8週令）を用いた。ラット初代培養肝細胞をホルモン及び 各種化合物を添カ卩した 25mM D-グルコース含有 MEM培地中で一定時間インキュ ペートした。肝細胞を 4%パラホルムアルデヒドで固定し、抗ダルコキナーゼ抗体を用 いた蛍光抗体法で染色した。共焦点レーザー顕微鏡で取得した蛍光画像を NIH Ima geで解析して核と細胞質の蛍光強度を算出し、核と細胞質のダルコキナーゼ量とし た。
2.ケトースによる肝ダルコキナーゼの細胞内移行
ラット初代培養肝細胞をケトース添加 5mMあるいは 15mM D-グルコース含有 ME M培地中で一定時間インキュベートした。前述と同様の方法で、細胞内の核と細胞 質のダルコキナーゼ量を求めた。
[0072] [結果及び考察]
1.ホルモンによるラット肝ダルコキナーゼの細胞内移行の調節
インスリン存在下で LY-294002を作用させたところ、インスリンによる細胞質のダルコ キナーゼの増加は低下した。インスリン存在下で PD-98059あるいはラパマイシンを 作用させたところ、いずれの場合もそのような変化はみられな力つた。フオルスコリン、 Bt cAMP、 IBMXを作用させたところ、いずれの場合もグルカゴン添カ卩時と同様に細
2
胞質のダルコキナーゼは低下した。グルカゴン存在下で KT-5720を作用させると、グ ルカゴンによる細胞質のダルコキナーゼの低下はほとんどみられなくなった。インスリ ンによるダルコキナーゼの核力も細胞質への移行は、 PI3キナーゼを介し、グルカゴ ンによるダルコキナーゼの細胞質力 核への移行は、 cAMP依存性キナーゼを介して いるものと考えられる。 2.グルコースによるダルコキナーゼの核から細胞質への移行の促進
培養肝細胞をダルコキナーゼの核力も細胞質への移行促進作用のある 5mMある ヽ は 25mM D-グルコース含有 MEM培地でインキュベートすると、ダルコキナーゼの核 から細胞質への移行、グリコーゲン合成、および乳酸生成は増加した。グルコースに より、ダルコキナーゼの核力 細胞質への移行が起こり、細胞質のダルコキナーゼ活 性が上昇して肝糖代謝を促進するものと考えられる。（図 2,図 4,図 6のグルコース投 与の図）少量の D-フルクトースは、ダルコキナーゼの核から細胞質への移行を促進 することが判明した。（図 4,図 6,図 7,図 8)
3.ケトースによるダルコキナーゼの核力 細胞質への移行促進
D-フルクトース、 D-プシコース、あるいは D-タガトースをそれぞれ添カ卩すると、 5m Mあるいは 15mMの D-グルコース存在下において、ダルコキナーゼは核から細胞質 へ移行した。 D-タガトースを 10mM以上添カ卩した場合はダルコキナーゼの移行に変 ィ匕はみられなかった。 D-ソルボースは、いずれの濃度においてもダルコキナーゼの 移行に影響を与えな力つた。 D-プシコースは、高濃度においてもダルコキナーゼの 核から細胞質への移行促進作用を示した。 （図 11)
[0073] [結論]
1.インスリンによるダルコキナーゼの核力も細胞質の移行は、 PI3キナーゼを介して 起こり、グルカゴンによるダルコキナーゼの細胞質から核への移行は、 cAMP-Aキナ ーゼを介して起こる。
2.ダルコキナーゼと初代培養肝細胞をインキュベートすると、ダルコキナーゼの核 力 細胞質への移行が起こり、グリコーゲン量と乳酸生成が増加する。
3.プシコースと低濃度のタガトースにより、ダルコキナーゼの核から細胞質への移 行が起こる。
実施例 2
[0074] 培養細胞で見られた、ダルコキナーゼの核力 細胞質への移行力 動物実験にお いても起こるかどうかを確認するために実験を行った。
[0075] [実験方法]
図 14はそのプロトコールを示している。ー晚絶食した Wistar系雄性ラットに、 2g/kg の D-グノレコース、 D-プシコース、 D-フノレクトース、 D-プシコースと D-フノレクトースの 1 : 3の混合物を経口投与した。 30分後に麻酔下に、 4%パラフオルムアルデヒドによ りかん流固定後、すぐ肝臓を摘出し、凍結切片を作製した。抗ダルコキナーゼ抗体を 用いて蛍光抗体法でダルコキナーゼの核と細胞質の分布を解析した。同時に尾静 脈と門脈力 血液を採血し血糖値の測定を行った。
[0076] [結果及び考察]
図 15にその結果を示す。
対象（一晩絶食)ではほとんどのダルコキナーゼが肝細胞の核内に存在している。 D-プシコースを投与すると図の右側の肝臓細胞においてはダルコキナーゼの核から 細胞質への移行が見られている。 D-フルクトースにおいては、 D-プシコースより強い 移行が認められた。 D-フルクトースと D-プシコースの混合物でも十分なダルコキナ ーゼの核力 細胞質への移行が観察された。
[0077] [結論]
1.培養細胞で認められた、ダルコキナーゼの核力も細胞質への移行現象力 動物 への投与実験にても確認された。
2.ラットを用いた実験で、 D-フルクトースによりダルコキナーゼの核力 細胞質へ の移行が起こることが判った。
3. D-プシコースにおいても、また D-フルクトースと D-プシコースの混合物でも移 行が認められた。
実施例 3
[0078] 次に、一般の食事をする状態を反映する目的で、一定量の D-グルコースを経口投 与したラットに、同時に 1/10量の D-プシコースあるいは D-フルクトースあるいは D- プシコースと D-フルクトースの混合物を与え、ダルコキナーゼの核から細胞質への移 行が起こるかどうかを確認するために実験を行った。
[0079] [実験方法]
図 16はそのプロトコールを示している。ー晚絶食した Wistar系雄性ラットに、 2g/kg の D-グルコースを経口投与する。同時に 0. 2g/kgの D-プシコース、 D-フルクトース 、 D-プシコースと D-フルクトースの 1 : 3の混合物を経口投与した。 30分後に麻酔下 に、 4%バラフオルムアルデヒドによりかん流固定後、すぐ肝臓を摘出し、凍結切片を 作製した。抗ダルコキナーゼ抗体を用いて蛍光抗体法でダルコキナーゼの核と細胞 質の分布を解析した。同時に尾静脈と門脈カゝら血液を採血し血糖値の測定を行った
[0080] [結果及び考察]
図 17にその結果を示す。
対象（最下段 Fasted)ではほとんどのダルコキナーゼが肝細胞の核内に存在してい た。
2g/kgの D-グルコースの経口投与（最上段）ではダルコキナーゼの核から細胞質へ の移行が少し起こって 、た (特に右側の細胞群に多く認められる)。
これに 0. 2g/kgの D-フルクトースを同時経口投与したものでは（上から 2段目）、ほ とんどのダルコキナーゼが細胞質へ移行していた。 0. 2g/kgの D-プシコースを同時 経口投与したものでは（上から 3段目）、 D-フルクトースよりは弱いが、明瞭にダルコ キナーゼが細胞質へ移行して 、た (特に右側の細胞群に多く認められる）。 D-フルク トースと D-プシコースの混合物では（上から 4段目 )、 D-フルクトース単独のものよりも 強ぐダルコキナーゼの核力 細胞質への移行が起こっていた。今後は細胞実験で 認められた、 D-タガトースによる細胞質への移行が起こるかどうかを解析する。
[0081] [結論]
1.ラットを用いた実験で、 D-グルコースとともに D-フルクトースゃ D-プシコースを 同時に投与することによりダルコキナーゼの核力 細胞質への移行が促進されること が判った。
2. D-フルクトースと D-プシコースの混合物が最も強ぐ次いで D-フルクトース、 D- プシコースの順に強かった。 D-プシコースのみでも明瞭な移行が認められた。
3. D-フルクトースと D-プシコースの混合物、あるいは D-プシコースのみを食事と 一緒に摂取することにより、ダルコキナーゼの核から細胞質への移行を促進し、図 1, 図 5に述べた機構により、グリコーゲンの合成を促進することにより、血中の D-ダルコ ースが細胞内に移行し、血糖値が下がることが期待できる結果となった。
実施例 4 [0082] D-プシコースが 2型糖尿病患者、 IGT (Impaired Glucose Tolerance,耐糖能異常者 、糖尿病予備群）患者、およびメタボリックシンドローム患者の病態改善作用を有する かどうかを調べるために、 D-プシコースを 2型糖尿病モデル動物の Goto-Kakizakiラ ットに経口投与し、肝ダルコキナーゼの核力 細胞質への移行、尾静脈と門脈内の 血糖値とインスリン濃度の測定を行った。
[実験方法]
図 18は、そのプロトコールを示している。ー晚絶食した Goto-Kakizaki雄性ラットに、 2g/kgの D-グルコースを経口投与する。同時に 0. 2g/kgの D-プシコースを経口投 与した。 30分と 60分後に麻酔下に、 4%パラフオルムアルデヒドにより肝臓をかん流 固定し、肝臓を摘出して凍結切片を作製した。抗ダルコキナーゼ抗体を用いて蛍光 抗体法で肝ダルコキナーゼの核と細胞質の分布を解析した。同時に尾静脈と門脈か ら血液を採血し、血糖値とインスリン濃度の測定を行った。尚、肝臓は門脈領域と中 心静脈領域とに分かれ、ダルコキナーゼは中心静脈領域の方が門脈領域より 1. 3倍 力も 1. 5倍活性が高いことが知られているので、中心静脈領域と門脈領域のダルコ キナーゼの核と細胞質の分布を解析した。
[0083] [結果及び考察]
1. 図 19に、 D-グルコース単独あるいは D-グルコースと D-プシコースを同時に経 口投与し、投与 30分と 60分後の肝臓を、蛍光抗体法でダルコキナーゼの分布を調 ベた結果を示す。
24時間絶食した Goto-Kakizakiラットでは、ダルコキナーゼに特異的な蛍光は主に 核内に見られた。 D-グルコースの経口投与により、いずれ時間においても核内の蛍 光は低下し、逆に細胞質の蛍光は増加した。 D-プシコースの同時投与により、 D-グ ルコース単独投与時と比べて、有意に核内の蛍光は低下し、細胞質の蛍光は増加し た。この変化は門脈領域と中心静脈領域の両領域で認められた。
2. 図 20に、図 19の画像の核と細胞質の蛍光強度を解析した結果を示す。
中心静脈領域と門脈領域において、 D-グルコースの経口投与により、細胞質のグ ルコキナーゼ量は 24時間絶食時より有意に増加した。 D-プシコースの同時投与に よって細胞質のダルコキナーゼ量はさらに増加した。本実験条件下において、核と細 胞質を合わせたダルコキナーゼ量に変化は認められな力つた。これらの結果は、 in vi voにおいて D-プシコースによってダルコキナーゼの核から細胞質への移行が起こり 、活性型のダルコキナーゼが増加し、肝糖利用の促進が起こっていることを示してい る。
3. 図 21に、尾静脈と門脈内の血糖値の変化の結果を示す。
D-プシコースと D-グルコースの同時投与 30分後と 60分後における尾静脈と門脈 内のグルコース濃度は、 D-グルコース単独投与群の場合より有意な低値を示した。 この結果は、 D-プシコースによるダルコキナーゼの核力 細胞質への移行により活 性型のダルコキナーゼが増加し、肝糖利用が促進され、血糖値の上昇の抑制が起こ つたことを示している。
4. 図 22に、糖負荷による尾静脈と門脈内のインスリン濃度の変化の結果を示す。 D-プシコースと D-グルコースの同時投与 30分後と 60分後における尾静脈と門脈 内のインスリン濃度は、 D-グルコース単独投与群の場合より有意な低値を示した。 この結果は、 D-プシコースによるダルコキナーゼの核から細胞質への移行により、 肝糖利用が促進して血糖値の上昇が抑制され、脾臓 B細胞力ゝらのインスリン分泌の 抑制が起こったことを示している。インスリン分泌の抑制は、脾 B細胞の温存をもたら すものと考えられる。
以上の結果より、 D-プシコースは、血糖値の上昇抑制とインスリン濃度の上昇の抑 制により 2型糖尿病患者、 IGT (Impaired Glucose Tolerance耐糖能異常者、糖尿病 予備群）患者、あるいはメタボリックシンドローム患者の病態の改善作用を有するもの と考えられる。 D-タガトースも D-プシコースと同様な作用を有するものと考えられる。
[0084] [結論]
2型糖尿病モデル動物の Goto- Kakizakiラットに D-グルコース投与時に D-プシコ一 スを同時に経口投与すると、 D-グルコース単独の場合より肝ダルコキナーゼの核か ら細胞質へ移行し、肝糖利用を促進して血糖値の上昇とインスリン濃度の上昇が低 下する。
産業上の利用可能性
[0085] ダルコキナーゼはインスリン分泌のみならず、高脂肪食下でのインスリン抵抗性に 対する代償性脾 ι8細胞過形成にも重要であることより、インスリン分泌低下の遺伝素 因がもともとあるところに高脂肪食による肥満'インスリン抵抗性が加わつた病態では 、ダルコキナーゼ又はダルコキナーゼ活性剤は、脾 細胞からのインスリン分泌を促 進させるとともに、脾 |8細胞量をも増加させることによって、インスリン分泌能を改善さ せるので、 2型糖尿病の有効な治療方法である。特に D-プシコースや D-タガトース は自然界に存在する単糖であり、副作用も少ないと想定される。また D-フルクトース には核から細胞質への移行促進作用があるとされて 、るが、 D-フルクトースにはェ ネルギ一があり、 D-フルクトースの取り過ぎは却って問題となる。これに比べて D-プ シコースや D-タガトースは D-フルクトースと同様のダルコキナーゼの核から細胞質 への移行促進作用がある上に、エネルギーとしてはゼロであり、糖尿病や高脂血症 などを悪ィ匕させる可能性が低 、ので、有用性が高 、と考えられる。

Claims

請求の範囲
[1] D-プシコースおよび/または D-タガトースを有効成分とするダルコキナーゼの核か ら細胞質への移行の促進剤。
[2] D-プシコースおよび/または D-タガトースを有効成分とするダルコキナーゼ活性に 関連する病状発症の予防な!/ヽし治療用組成物。
[3] 上記組成物が、 D-プシコースおよび/または D-タガトースを有効成分として配合し た、ダルコキナーゼ活性に関連する病状発症の予防ないし治療に用いることができ る食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品および飼料からなる群から 選ばれる形態のものである請求項 2に記載のダルコキナーゼ活性に関連する病状発 症の予防な!/、し治療用組成物。
[4] ダルコキナーゼ活性に関連する病状が、耐糖能異常、 2型糖尿病、高脂血症、メタ ボリックシンドロームおよび肥満症力 選択される、請求項 2または 3に記載のダルコ キナーゼ活性に関連する病状発症の予防ないし治療用組成物。
[5] 医薬品の形態のものであって、 1またはそれ以上の医薬上許容される担体とともに
、 D-プシコースおよび/または D-タガトースを含む請求項 3または 4に記載のダルコ キナーゼ活性に関連する病状発症の予防ないし治療用組成物。
[6] 有効量が、 D-プシコースおよび/または D-タガトースの量が 1日当たり 0. 5〜50g である、請求項 2な 、し 5の 、ずれかに記載のダルコキナーゼ活性に関連する病状 発症の予防な!/、し治療用組成物。
[7] D-プシコースおよび/または D-タガトースを有効成分として配合した、ダルコキナー ゼ活性に関連する病状発症の予防ないし治療に用いられるものである旨の表示を付 し/こズ ロロ。
[8] 耐糖能異常、 2型糖尿病、高脂血症、メタボリックシンドロームおよび肥満症力 選 択されるダルコキナーゼ活性に関連する病状発症の予防ないし治療に用いられる請 求項 7に記載の飲食品。
[9] サプリメント、機能性食品、健康食品、特定保健用食品
、栄養補助飲食品または病者用食品である請求項 7または 8に記載の飲食品。
[10] タブレット状、丸状、カプセル状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状または液状 である請求項 7、 8または 9に記載の飲食品。
[11] 有効量が、 D-プシコースおよび/または D-タガトースの量が 1日当たり 0. 5〜50gで ある、請求項 7ないし 10のいずれかに記載の飲食品。
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