WO2008032134A1 - Proceso para la obtencion de glucan de levadura por autolisis de celulas de levadura saccharomyces cerevisiae de panaderia - Google Patents

Proceso para la obtencion de glucan de levadura por autolisis de celulas de levadura saccharomyces cerevisiae de panaderia Download PDF

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WO2008032134A1
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yeast
glucan
cell debris
treatment
autolysis
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Gloria Mabel Zapata B
Hector Adolfo Meza Mendoza
Gloria Mabel Zapata
Mendoza Hector Adolfo Meza
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Compana Nacional De Levaduras Levapan S.A.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • TITLE PROCESS FOR THE OBTAINING OF GLUCAN OF YEAST BY AUTOLISIS OF CELLS OF YEAST Saccharomyces cerevisiae OF BAKERY.
  • AWARDED COMPA ⁇ A NACIONAL DE LEVADURAS LEVAPAN S.A. TULU ⁇ , CAUCA VALLEY.
  • Beta Glucan yeast by autolysis of Saccharomyces cerevisia yeast cells, which comprises a stage of growth and recovery of yeast cells followed by an autolysis stage under strictly controlled process conditions and recovery of cell debris to be subjected to hot alkali extraction, being able to obtain Beta Glucan of yeast with color and characteristic functional properties with a content of ⁇ -glucan expressed as glucose in a concentration that is around 60.0 to 90.0% dry product base with a particle size of the material solid about 0.2-10 microns.
  • Yeast Extract which is obtained by a strictly controlled process of autolysis of yeast biomass;
  • the insoluble residual fraction called cell wall or yeast husks, is discarded as a waste product, which contains an approximate remainder of 40% carbohydrate-bound protein, with mann and glucan being the main and considered by many authors as of high molecular weight and complex nature.
  • mann and glucan being the main and considered by many authors as of high molecular weight and complex nature.
  • the glucan component of the yeast cell wall cannot be extracted from intact yeast cells by 3% w / v sodium hydroxide at 75 ° C, but less than one third of the glucan of The cell wall dissolves under these conditions and can dissolve further after an ultrasound treatment.
  • Polysaccharides are the biopolymers in quantity and variety mostly used and many have industrial, medicinal and food applications (WHEATCROFT, eta al, US Patent, 6,444,448, 2002.). The role they play in biological systems and in nature; evidence that polysaccharides possess unique physical-chemical properties that allow a wide variety of functions (SPIROS, J., et al., biotench. And Bioeng., 1986). The specific functional properties of the polysaccharides are the result of their physical properties, which are mainly controlled by the molecular structure, this structure being used to be used as a thickening agent in aqueous food systems producing a Tasty fatty sensation. (KOLLAR, R., et al., Food Biotech. 1992; MEYER, M., T., and PHAFF H., J., J. Of Food Sd., 1987).
  • ⁇ -glucans are a class of natural polysaccharides with important health and nutrition implications. These glucose polymers are considered to be fiber and are not digestible due to the absence in the human organism of the enzyme capable of hydrolyzing the ⁇ -glucosidic bonds. Insoluble fibers are not metabolized by the digestive tract. However, they do not contribute to giving property caloric value that can be exploited in low-calorie diets or in the control of obesity (JEZEQUEL, V., Cereal Foods World, 1998; ROBERTSEN, B., et al., J., of fish Diseases, 1990; DRITZ, S., S., et al., J. Anim., ScL, 1995; JAMAS et al., US Patent, 4,962,094, 1990; DONZIS, B., A., US Patent, 5,576,015, 1996).
  • Insoluble Glucan isolated from the yeast cell wall has been shown to have immunomodulatory properties, immunostimulatory activity has suggested that they are used as anti-cancer agents or the treatment of HIV infections (WHEATCROFT, eta al, U.S. Patent, 6,444,448, 2002.).
  • Glucan obtained from the yeast cell wall is recognized for its ability to activate the non-specific immune response, numerous studies have shown that the live administration of Glucan significantly modifies the host's resistance to a wide variety of infectious diseases induced by bacteria, fungi Viruses and parasitic organisms (JAMAS, et al., US Patent, 5,032,401 1991; DONZIS, BA, US Patent, 5,223,491, 1993; JAMAS, et al., US Patent, 5,322,841, 1994; JAMAS, et al., US Patent, 5,504,079, 1996; DONZIS, B., A., US Patent, 5,576,015, 1996; OSTROFF, G., R., US Paatent, 5,622,940, 1997; PATCHEN, et al., US Patent, 6,369,219, 2002; KLEIN, B ., K., US Pantent, 5,980,918, 1999).
  • Glucan can be added to skin creams, cosmetics and lotions, aftershave lotions, soaps, shampoos, conditioners, hair foams, lotions and oils for tanning, creams and medications for the treatment of Acne, deodorants and showers, toothpastes, mouthwashes and solutions that are in direct contact with the skin.
  • the alkaline treatment serves to extract the mannan from the wall, the acid treatment removes the stored glycogen and the highly insoluble residual material, known as yeast glucan (SENTANDREU, et al., J. of General Microbiology, 1975) retains the form of The original cell.
  • yeast glucan a highly insoluble residual material
  • the chemical analysis of these preparations by methylation, partial acid hydrolysis and oxidation with periodate established the predominance of ⁇ -1,3-D-glucose binding residues (MANNERS, D., j., Et al., Biochem.
  • ⁇ -1, 3-glucan insoluble alkali insoluble acetic acid plays a direct role in maintaining the stiffness and shape of the wall (FLEET, GH, The Yeast 1991; MCMURROUGH, J., and ROSE, A ..H., Biochem. J., 1967; KELLY, G., E., US Patent, 6,242,594, 2001; KAPTEYN 1 JC, et al., J. of Bacter. 1997).
  • the shape of the cells is retained after the wall wells and the alkali-soluble glucan has been extracted, in contrast the soluble alkali glucan has an amorphous appearance and can confer flexibility to the wall.
  • the glucose of the ⁇ -glucan polymer (JAMAS S., et al., Biotechn. And Bioeng. 1986), bound entirely by glucosidic bands ⁇ -1, 3 or ⁇ -1, 6, is the most abundant polysaccharide in the cell wall of yeast and comprises approximately 12-14% of the dry cell weight.
  • yeast species are also usually used as a source of ⁇ -glucan, including but not limited to other yeast strains of S. cerevisiae, K. fragilis and candida such as C. utilis. All of these yeast strains can be producing using food grade nutrient in batch or continuous fermentation. Many other species of microorganisms including bacteria, fungi and unicellular algae have been reported in the art as a source of ⁇ -glucan.
  • Vargas et al. Studied the effect of diets supplemented with D-glucan (Levapan), yeast extract (Levapan, Tulua, Colombia), Astaxanthin (Tesgofarm), Vitamins C and E (Tesgofarm, Holland), on the immune response of Litopenaeus Vannamei healthy.
  • the process for the production of BETA GLUCAN DE LEVADURA S. cerevis ⁇ ae de bakery includes:
  • PRECULTIVE STAGE Includes harvesting yeast cells S. Bakery cerevisiae, under controlled conditions of pH in the range of 2.5-5.0 and temperature in the range of 25-38 0 C for approximately 20 hours producing a dry yeast biomass equivalent to 5-15% of the source of carbon supplied .
  • GROWTH STAGE Includes the inoculation of the preculture stage to a fermenter that contains macro nutrients (nitrogen source, phosphorus, carbohydrates) and micro nutrients (salts and minerals), prepared at controlled pH conditions in the range of 2.5-5.0 and temperature in the range of 25-38 0 C for 20-30 hours, obtaining a biomass equivalent to 20-30% of the source of carbon fed.
  • FINAL GROWTH STAGE Consists of inoculating the production of the previous stage to a fermenter which has been previously prepared for this stage. The conditions at which the yeast biomass is obtained are carefully controlled by establishing pH ranges between 3.5 - 6.5, temperature between 28 - 38 0 C, adding to the fermentation medium micro nutrients that facilitate later the breakdown of yeast cells allowing to extract the protein content and leave the cell debris free for the treatment in the extraction of ⁇ -glucan.
  • BIOMASS TREATMENT AND AUTOLYSIS PROCESS The biomass finally harvested is collected by centrifugation and washed several times with water.
  • the clean biomass which we call "YEAST CREAM” is subjected to a process of autolysis of whole yeast cells under strictly controlled conditions of temperature, pH and sanitation in order to avoid contamination and loss of the product.
  • the process includes separation of the insoluble cell debris from the soluble fraction, which we call YEAST EXTRACT.
  • PROCESS OF OBTAINING BETA GLUCAN DE LEVADURA the recovered cellular remains are treated with hot alkali and with a bleach, to extract the insoluble glucan alkali. Once the extract is obtained, it is subjected to drying conditions in an NIRO dryer. The solids content, the temperature, the number of treatments, the pH and the time affect the increase in the extraction and the purity of the product finally obtained which we have called BETA GLUCAN DE LEADADURA DE PANADER ⁇ A DE S. cerevisiae.
  • the recovery of the protein material is carried out by centrifugation and washing. Cellular debris is recovered for further treatment.
  • the process flow chart is represented in the attached drawing No. 1 The process we have developed for the treatment of yeast husks or cell debris can be illustrated in the following examples.
  • the cellular remains obtained and recovered from the stage of the autolysis process with a solids content between 12-16% are subjected to heating at a temperature between 40-95 0 C, using a plate-type heat exchanger consisting of three bodies, feeding the product by the second body; if the equipment is not available, direct steam heating is done in the handling tank; the material already prepared is subjected to alkali treatment in a pH range between 5-14; that for our process the alkali used is SODIUM HYDROXIDE, in high purity scales, close to 98%, in a proportion in the range of 2.5-6% w / v, being added slowly and moderately and maintaining constant agitation between 30-85 RPM for 2-6 hours and the temperature between 40-95 ° C.
  • This example refers to the adjustment of the cellular debris obtained as in example 1.
  • the insoluble alkali material recovered after the last wash of the hot alkali treatment equivalent to twice the material initially treated and with a solids content between 5-11 % is added hot water at a temperature between 40-95 0 C and adjusted to pH between 1.0-5.0 with sulfuric acid with a concentration of 98% purity, adding the acid in a slow and gradual way while stirring constant between 30-85 RPM. After the adjustment, a separation stage is performed. Successive stages of washing with hot water which must be at 9O 0 C have been included.
  • the process flow diagram is represented in the attached drawing No. 2.
  • This example illustrates the sterilization and drying of the recovered material in obtaining GLUCAN DE LEVADURA DE S. cerevisiae DE PANADER ⁇ A.
  • the prepared material is pumped to through a gaulin bamba at a pressure of 75-80 psi and a temperature of 9O 0 C; to a NIRO dryer with a hot air inlet in the range of 190-225 0 C and a vacuum of 0.1-2.0 mm, a powder product is obtained that we have called BETA GLUCAN DE LEVADURA REFERENCE PCT 3111 whose protein content is in the range between 0.0-6.25 on the basis of dry matter, on ashes in the range between 0.0-5.0 on the basis of dry matter, on glucose in a range between 60-70% on the basis of dry matter and analyzed by HPLC under acid hydrolysis conditions strong by autoclave and fat in the range between 10-30% based on dry matter; and a powder product that we have called BETA GLUCAN DE LEVADURA REFERENCE GLUCAN PLUS whose protein content is in the range between 0.0-3.5% based on dry matter, in ashes in the range between 0.0-3.0% based on dry matter, in
  • a process of purification of the Treated Cell Wall is illustrated, an additional stage that may or may not be included in the manufacturing process of the GLUCAN DE LEVADURA BETA and developed according to the needs of the product.
  • the Treated Cell Wall product is subjected to an extraction of its lipid content, for which organic solvents have been used, the absolute ethanol of 95% purity being used in a 1: 1 ratio of treated cell wall product and / or a solvent mixture methanol: chloroform in a 2: 1: 1 mixture ratio of treated cell wall product.
  • the extraction stage is carried out under reflux conditions for a period of 4-16 hours, after this period the product is recovered by centrifugation which is subjected to a drying process in a vacuum oven in a period of time in the range from 4 to 10 hours and at a temperature in the range of 50-7O 0 C ,.
  • the finally purified product has a protein content of about 0.0 to 4.0% based on dry product, a glucose content of 85-90% determined on the basis of dry product, a fat content around 3 to 10% based of dry product and an ash content around 0.5-2.0% based on dry product.

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Abstract

Un proceso para producir Beta Glucan de levadura por autolisis de celulas de levadura Saccharomyces cerevisia, el cual comprende una etapa de crecimiento y recuperaciÌn de celulas de levadura seguido de una etapa de autolisis bajo condiciones de proceso estrictamente controladas y recuperaclÌn de los restos celulares para ser sornetidos a extracciÌn álcali caliente, lográndose obtener Beta Glucan de levadura con color y propiedades funcionales caracteristicas con un contenido de β-glucan expresado como glucosa en una concentraciÌn que esta alrededor del 60.0 al 90.0% base de producto seco con un tamano de particula del material sÌlido alrededor de 0.2-10 micrones.

Description

TITULO: PROCESO PARA LA OBTENCIÓN DE GLUCAN DE LEVADURA POR AUTOLISIS DE CÉLULAS DE LEVADURA Saccharomyces cerevisiae DE PANADERÍA.
ADJUDICADA: COMPAÑÍA NACIONAL DE LEVADURAS LEVAPAN S.A. TULUÁ, VALLE DEL CAUCA.
RESUMEN
Un proceso para producir Beta Glucan de levadura por autolisis de células de levadura Saccharomyces cerevisia, el cual comprende una etapa de crecimiento y recuperación de células de levadura seguido de una etapa de autolisis bajo condiciones de proceso estrictamente controladas y recuperación de los restos celulares para ser sometidos a extracción álcali caliente, lográndose obtener Beta Glucan de levadura con color y propiedades funcionales características con un contenido de β-glucan expresado como glucosa en una concentración que esta alrededor del 60.0 al 90.0% base de producto seco con un tamaño de partícula del material sólido alrededor de 0.2-10 micrones.
21 Reivindicaciones.
ANTECEDENTE
En Ia fabricación del Extracto de Levadura, el cual es obtenido por un proceso estrictamente controlado de autolisis de Ia biomasa de levadura; Ia fracción residual insoluble denominado pared celular o cascaras de levadura, se descarta como un producto de desecho, el cual contiene un remanente aproximado del 40% de proteína ligada a los carbohidratos, siendo el manan y el glucan los principales y considerados por muchos autores como de alto peso molecular y de naturaleza compleja. Se ha considerado estos restos celulares de relativa baja solubilidad atribuida a sus constituyentes carbohidratos, haciendo extremadamente difícil su purificación y análisis estructural por métodos convencionales (DUFFUS, J.A., et al., Adv. Microbiol. Physiol. 1982).
La estructura de los componentes polisacáridos de Ia pared celular de levadura ha sido sometida a numerosos estudios (DUFFUS, J.A., et al., Adv. Microbiol. Physiol. 1982; MANNERS, D., j., et al., Biochem. J., 1973; BACON J.S., et ai., Bichem. J., 1969; FLETE, G. H., The Yeast, 1991 ; KNORR, D., et al., Biotechnology and Bioengineering, 1979; KOLLAR R., et al., j. BioL, Chem., 1997; Dl LUZIO, N., U.S. Patertt 4,739,046, 1988; MANNERS, D., et al., Biochem. J., 1973.; KOLLAR, R., et al., J., of BIoI.., Chem. 1995; HASSiD, W.Z. et al., J. Of the American Che,. Soc. 1941 ; MANNERS, DJ. , et al., J. Of General Micrb. 1974.), en estos trabajos tempranos Ia pared celular de Ia levadura de panadería ha sido observada como un complejo que contiene glucan, manan, pequeñas cantidades de quitina, fosfatos, lípidos y proteínas. En ésta base algunas estructuras esquemáticas han sido propuestas para Ia pared celular de levadura . Según Bacon et al., el componente glucan de Ia pared celular de levadura no puede ser extraído de las células intactas de levadura por el 3% p/v de hidróxido de sodio a 75°C, pero menos de Ia tercera parte del glucan de Ia pared celular disuelve bajo éstas condiciones y puede disolverse más después de un tratamiento en ultrasonido.
Durante Ia preparación de pared celular los constituyentes de Ia membrana pueden romperse y seguidamente realizar Ia extracción de glucan a través de las perforaciones. El tratamiento con ultrasonido o condiciones acidas suaves puede incrementar Ia permeabilidad de Ia membrana ( BANCON, J.S., et al., Bichem., J., 1969; FLEET, G. H., The Yeast 1991). El descubrimiento de un β-1 ,6 glucan, en solución en dos situaciones en las cuales Ia extractabilidad del glucan es incrementado (tratamiento con ácido acético o β-1 ,3 glucanasa), indica que uno u otro es atrapado por alguna estructura que retiene Ia mayor parte del glucan o que hace parte de éstas estructuras retenidas. El efecto de purificar con β-1 ,6 glucanasa exhibe que cadenas de β-1 ,6, están por alguna razón involucradas en Ia insolubilidad del glucan pero ellas pueden estar presentes como un componente estructural menor en el β-1 ,3 glucan.
Los polisacárido son los biopolímeros en cantidad y variedad mayormente usados y muchos tienen aplicaciones industriales, medicinales y en alimentos ( WHEATCROFT, eta al, U.S. Patent, 6,444,448, 2002.). El papel que ellos juegan en los sistemas biológicos y en Ia naturaleza; evidencia que los polisacáridos poseen propiedades físicas-químicas únicas que permiten una amplia variedad de funciones ( SPIROS, J., et al., biotench. And Bioeng., 1986). Las propiedades funcionales específicas de los polisacáridos son el resultado de sus propiedades físicas, las cuales son principalmente controladas por Ia estructura molecular siendo esta estructura aprovechada para ser usados como agente espesante en sistemas alimenticios acuosos produciendo una sensación gustosa a grasa. ( KOLLAR, R., et al., Food Biotech. 1992; MEYER, M., T., and PHAFF H., J., J. Of Food Sd., 1987).
Los β-glucanos son una clase de polisacáridos naturales con importantes implicaciones en salud y nutrición. Estos polímeros de glucosa se consideran que son fibra y no son digeribles debido a Ia ausencia en el organismo humano de Ia enzima capaz de hidrolizar los enlaces β-glucosídicos. Las fibras insolubles no son metabolizadas por el tracto digestivo. Sin embargo ellas no contribuyen a dar valor calórico propiedad que puede ser aprovechada en dietas bajas en calorías o en el control de Ia obesidad (JEZEQUEL, V., Cereal Foods World,1998; ROBERTSEN, B., et al., J., of fish Diseases, 1990; DRITZ, S., S., et al., J. Anim., ScL, 1995; JAMAS et al., U.S. Patent, 4,962,094, 1990; DONZIS, B., A., U.S. Patent, 5,576,015, 1996).
El Glucan insoluble aislado de Ia pared celular de Ia levadura ha demostrado tener propiedades inmunomoduladoras, Ia actividad inmunoestimuladora ha sugerido que son usados como agentes anticancer o el tratamiento de infecciones de HIV (WHEATCROFT, eta al, U.S. Patent, 6,444,448, 2002.).
El Glucan obtenido de pared celular de levadura es reconocido por su habilidad para activar Ia respuesta inmune no específica, numerosos estudios han demostrado que Ia administración en vivo de Glucan significativamente modifica Ia resistencia del huésped a una amplia variedad de enfermedades infecciosas inducidas por bacterias, hongos virus y organismos parásitos ( JAMAS, et al., U.S. Patent, 5,032,401 1991 ; DONZIS, B.A., U.S. Patent, 5,223,491 , 1993; JAMAS, et al., U.S. Patent, 5,322,841 , 1994; JAMAS, et al., U.S. Patent, 5,504,079, 1996; DONZIS, B., A., U.S. Patent, 5,576,015, 1996; OSTROFF, G., R., U.S. Paatent, 5,622,940, 1997; PATCHEN, et al., U.S. Patent, 6,369,219, 2002; KLEIN, B., K., U.S. Pantent, 5,980,918, 1999). E igualmente indican que el Glucan puede ser adicionado a cremas para Ia piel, cosméticos y lociones, lociones para después de Ia afeitada, jabones, shampoos, acondicionadores, espumas para el cabello, lociones y aceites para bronceado, cremas y medicamentos para el tratamiento del acné, desodorantes y duchas, pastas dentífricas, enjuagues bucales y soluciones que están en contacto directo con Ia piel.
Estudios realizados en Salmón Atlántico (ROBERTSEN, B., et al., J., of fish Diseases,
1990; ENGSTAD, R., et al., Fish and Shellfish Immunology, 1992; ENGSTAD, R., and ROBERTSEN, B., Developm. And Comprar. Immunology, 1993; ENGSTAD, R., the Norwegian College of Fishery Science University of Tromso, 1994), demostraron que ramificaciones de enlace β-1 ,3- con cadenas laterales de enlace β-1 ,3- son immunoestimulantes muy efectivos contra enfermedades bacterianas y que partículas con poco número de ramificaciones mostraron poca afinidad para inducir Ia respuesta inmune, así como también demostraron que cadenas con enlaces β-1 ,6- fueron no necesarias para los efectos biológicos de β-glucan de levadura.
Igualmente (SÓDERHÁLL, K., and UNESTAM, T., Can., J., Microbiol., 1979; SÓDERHÁLL, K., and CERENIUS, L., Annual Rev. Of Fish diseases, 1992; SÓDERHÁLL, K., et al., Foundations for the Vertébrate Immune System , 1994; JOHANSSON, M., W., and SÓDERHÁLL, K., Parasitology today, 1989) han demostrado que algunas estructuras específicas de Glucan, especialmente estructura lineal de β-1 ,3- glucan actúa como inductor fuerte de fenoloxidacción activando Ia fenol oxidasa que es Ia enzima que actúa en Ia defensa contra hongos parasitarios en langostinos, de Ia misma manera Yen-Ling-Song et. al., ( YEN-LING-SONG et al., Department of Zoology , National Taiwán University; YEN LING-SONG, and YEUN -TING ASIEH, Developmental and Comparative Immunology, 1994), en sus estudios exhibieron que se incremento el crecimiento de camarón tratado con Glucan, demostrando claramente el papel de estimulación de respuesta protectiva contra infecciones experimentales; basados en estos resultados y seguidos de Ia duración en Ia protección indicaron que el Glucan puede ser utilizado profilácticamente como un ¡nmunoestimulante a corto plazo y sugieren que continuas administraciones orales como por inmersión pueden ser requeridas para mantener ésta respuesta protectiva.
Esfuerzos acumulativos de algunos años de investigación (MANNERS, D., j., et al., Biochem. J.,1973; FLEET, G.H., The Yeast 1991 ; SENTANDREU, et al., J. of General
Microbiology, 1975) sugieren que Ia pared celular de Ia levadura S. cerevisiae contiene posiblemente tres tipos de glucan que se diferencian en base a sus propiedades de solubilidad. Estos son: un glucan con enlace β-1 ,3 álcali insoluble-ácido acético insoluble; un glucan con enlace predominante β-1 ,6 y un glucan con enlace β-1 ,3 álcali soluble. Estudios tempranos consideraron Ia presencia de sólo el glucan álcali-insoluble- ácido acético-insoluble, el cual fue preparado por extracción con álcali caliente de células enteras de levadura y algunas veces seguido de extracción ácido caliente. El tratamiento alcalino sirve para extraer el manan de Ia pared, el tratamiento ácido remueve el glicógeno almacenado y el material residual altamente insoluble, conocido como glucan de levadura (SENTANDREU, et al., J. of General Microbiology, 1975) retiene Ia forma de Ia célula original. El análisis químico de éstas preparaciones por metilación, hidrólisis acida parcial y oxidación con peryodato establecieron Ia predominancia de residuos de enlace β-1,3-D-glucosa (MANNERS, D., j., et al., Biochem. J. ,1973); luego establecieron que se trataba de ramificaciones de enlaces β-1 ,6 y que contenían pequeños porciones de residuos de enlaces insustituibles de β-1 ,6, Manners et al., cuestionaron Ia pureza de éstas preparaciones de glucan y demostraron que preparaciones de residuos álcali- insoluble generalmente se encontraban contaminadas con pequeñas proporciones de glucan- β-1 ,6; su material altamente purificado fue exclusivamente cadenas de β-1 ,3- con una pequeña proporción (3%) de ramificaciones de β-1 ,6.
La asociación de enlaces β-1 ,6-glucan con pared celular de levadura S. cerevisiae fue primeramente reportado por Bacon, este glucan que no fue extraído por tratamientos iniciales con álcali-ácido acético pero curiosamente fue extraído con ácido acético solo después de que Ia pared fue expuesta a condiciones alcalinas sugiere que puede ser formas de degradación del producto.
Según Fleet 1991 , el β-1 ,3-glucan álcali insoluble ácido acético insoluble juega un papel directo en el mantenimiento de Ia rigidez y forma de Ia pared (FLEET, G. H., The Yeast 1991 ; MCMURROUGH, J., and ROSE, A..H., Biochem. J., 1967; KELLY, G., E., U.S. Patent, 6,242,594, 2001 ; KAPTEYN1 J.C., et al., J. of Bacter. 1997). La forma de Ia células se retiene después que el manan de Ia pared y el glucan álcali-soluble ha sido extraído, en contraste el glucan álcali soluble tiene una apariencia amorfa y puede conferir flexibilidad a Ia pared. La glucosa del polímero β-glucan ( JAMAS S., et el., Biotechn. And Bioeng. 1986) , enlazada enteramente por bandas glucosidicas β-1 ,3 o β- 1 ,6, es el polisacárido mas abundante en Ia pared celular de levadura y comprende aproximadamente el 12-14% del peso seco celular.
En adición otras especies de levadura son también usualmente usados como fuente de β-glucan, incluyendo pero no limitando a otras cepas de levadura de S. cerevisiae, K. fragilis y candida tales como C. utilis. Todas estas cepas de levadura pueden ser productoras usando nutriente grado alimenticio en fermentaciones tipo batch o continuo. Muchas otras especies de microorganismos incluyendo bacterias, hongos y algas unicelulares han sido reportadas en el arte como fuente de β-glucan. Vargas et al., estudiaron el efecto de dietas sυplementadas con D-glucan (Levapan), extracto de levadura (Levapan, Tulua, Colombia), Astaxanthin (Tesgofarm), Vitamins C y E (Tesgofarm, Holland), en Ia respuesta inmune de Litopenaeus. Vannamei sanos.
Animales alimentados con todas las dietas suplementadas tuvieron un incremento significativo en THC y actividad de Pro Po cuando se comparo con sus valores básales.
Animales que recibieron Ia dieta suplementada con Astaxanthin mostraron un incremento de Ia producción del anión súper oxido (O" 2). Al final del experimento Ia rata de supervivencia estuvo entre el 80-86% sin diferencias en la cantidad de tratamientos y el control. La ganancia en peso fue significativamente alta para los animales alimentados con Astaxanthin. Dietas suplementadas con inmunoestimulantes puede tener un efecto benéfico en Ia respuesta inmune in vito de L vannamei juveniles sanos.
RESUMEN
La purificación de β-glucanos de levadura y otros microorganismos ha sido extensamente investigado. Extracción alcalina a alta temperaturas, temperaturas superiores a 75°C y repeticiones del tratamiento alcalino, renovando cada vez con álcali, seguido de tratamiento ácido con ácido suave y precipitación con solventes orgánicos éter y/o alcohol (MANNERS, D. J., et al, Biochem. J. 135, 19-30(1973), JAMAS, S. et al., US Patent Nos. 4, 810,646; 5,028,703 y 5,250,436), requieren de múltiples etapas de extracción. Además muchos resultados analíticos reportados por los métodos de obtención de Glucan conocidos en el arte aplican solamente al Glucan de una muestra particular y las preparaciones del Glucan de diferentes batches de levadura difieren en Ia proporción relativa de los componentes, enfatizando que los resultados están influenciados con Ia especie y cepa de levadura, sus condiciones de crecimiento y el método usado para Ia preparación de Ia pared celular y su fraccionamiento (DUFFUS, J. H. Adv. Microbiol. Physiol. 23: 151-181 (1982)). Por otro lado Ia extracción con álcali caliente seguido por Ia extracción con ácido a altas temperaturas y extracción con tratamiento enzimático para modificar Ia pureza del Glucan cuando se usan las células intactas de levadura, hace que los procesos sean dispendiosos requiriendo tiempos prolongados de procesamiento con significante producción de residuos y alto costo. En nuestro proceso nosotros hemos aprovechado los restos celulares obtenidos del proceso de Autolisis, los cuales hemos tratado con álcali caliente introduciendo solo retenciones alcalinas sin Ia necesidad de suplementar el álcali, No realizamos tratamiento ácido para Ia extracción del Glucan; pero sí hemos introducido un proceso de blanqueamiento del material que nos ha permitido un BETA GLUCAN DE LEVADURA con características de color blanco y únicas, no obtenido en los procesos conocidos en el arte Este proceso nos ha permitido obtener un producto en polvo con un tamaño de partícula típica para ser aplicada en cualquier preparación donde se requiera su uso terapéutico, así como también hemos conservado Ia forma de Ia células de levadura de Ia cepa de Ia cual hemos partido presentando un tamaño de partícula entre 0.2 y 10 mícrones.
Conforme al primer aspecto el proceso para Ia producción de BETA GLUCAN DE LEVADURA S. cerevisíae de panadería comprende:
1. ETAPA DE PRECULTIVO: Comprende cosechar células de levadura S . cerevisiae de panadería, bajo condiciones controladas de pH en el rango de 2.5-5.0 y de temperatura en el rango de 25-380C durante aproximadamente 20 horas produciéndose una biomasa de levadura seca equivalente al 5-15% de Ia fuente de carbono suministrada. 2. ETAPA DE CRECIMIENTO: Comprende Ia inoculación de Ia etapa de precultivo a un fermentador que contiene macro nutrientes (fuente de nitrógeno, fósforo, carbohidratos) y micro nutrientes (sales y minerales), preparado a unas condiciones controladas de pH en el rango de 2.5-5.0 y de temperatura en el rango de 25-380C durante 20-30 horas lográndose obtener una biomasa equivalente al 20-30% de Ia fuente de carbono alimentada.
3. ETAPA DE CRECIMIENTO FINAL: Consistente en inocular Ia producción de Ia etapa anterior a un fermentador el cual ha sido previamente preparado para esta etapa. Las condiciones a las cuales se obtiene Ia biomasa de levadura son cuidadosamente controladas estableciéndose rangos de pH entre 3.5 - 6.5, de temperatura entre 28 - 380C, adicionando al medio de fermentación micro nutrientes que facilitan mas tarde el rompimiento de las células de levadura permitiendo extraer el contenido proteico y dejar los restos celulares libres para el tratamiento en Ia extracción de β -glucan.
4. TRATAMIENTO DE BIOMASA Y PROCESO DE AUTOLISIS: La biomasa finalmente cosechada es recolectada por centrifugación y lavada varias veces con agua. La biomasa limpia, Ia cual llamamos "CREMA DE LEVADURA" es sometida a un proceso de autolisis de células enteras de levadura bajo condiciones estrictamente controladas de temperatura, pH y sanitización con el objetivo de evitar contaminación y perdida del producto. El proceso incluye separación de los restos celulares insolubles de Ia fracción soluble, Ia cual llamamos EXTRACTO DE LEVADURA.
5. PROCESO DE OBTENCIÓN DE BETA GLUCAN DE LEVADURA : los restos celulares recuperados son tratados con álcali caliente y con un blanqueador, para extraer el glucan álcali insoluble. Una vez obtenido el extraído este es sometido a condiciones de secado en un secador NIRO. El contenido en sólidos, Ia temperatura, el número de tratamientos, el pH y el tiempo inciden sobre el incremento en Ia extracción y en Ia pureza del producto finalmente obtenido el cual hemos llamado BETA GLUCAN DE LEVADURA DE PANADERÍA DE S. cerevisiae.
DESCRIPCIÓN DETALLADA.
Para el rompimiento de células enteras de levadura nosotros hemos desarrollado un proceso de autolisis estrictamente controlado en el cual las enzimas endógenas de las células de levadura (proteasas, nucleasas, glucanasas) incrementan su actividad y Ia membrana celular adyacente a Ia pared celular gradualmente pierde su selectividad permitiendo Ia extracción de componentes solubles y Ia obtención de los restos celulares para su posterior tratamiento en obtención de GLUCAN DE LEVADURA. El grado de extracción depende de Ia temperatura, pH, agitación y concentración de inductor de autolisis.
En nuestro proceso las condiciones de autolisis que hemos desarrollado son las siguientes.
PRETRATAMIENTO Acetato de etilo: 0.1-2.0% v/v
SOLIDOS DE LA CREMA 5-15% pH 3.5-7.5
Calentamiento 5°C/hr hasta temperatura deseada con varios perfiles de temperatura
TEMPERATURA 47°C-60°C
TIEMPO 10-72 HORAS
AGITACIÓN 30-85 RPM.
La recuperación del material proteico se lleva a cabo por centrifugación y lavado. Los restos celulares son recuperados para su posterior tratamiento. El diagrama de flujo del proceso esta representado en el dibujo anexo No. 1 El proceso que hemos desarrollado para el tratamiento de las cascaras de levadura o restos celulares puede verse ilustrado en los siguientes ejemplos.
EJEMPLO 1.
En este ejemplo los restos celulares obtenidos y recuperados de Ia etapa del proceso de autolisis con un contenido de sólidos entre 12-16% son sometidos a calentamiento a una temperatura entre 40-950C, usando un intercambiador de calor tipo placas que consta de tres cuerpos, alimentando el producto por el segundo cuerpo; si no se cuenta con el equipo se hace el calentamiento con vapor directo en el tanque de manejo; el material ya preparado es sometido a tratamiento con álcali en un rango de pH entre 5-14; que para nuestro proceso el álcali usado es el HIDROXIDO DE SODIO, en escamas de alta pureza, cercana al 98%, en una proporción en el rango del 2.5- 6% p/v, adicionándose en forma lenta y moderada y manteniendo agitación constante entre 30-85 RPM durante 2-6 horas y Ia temperatura entre 40-95°C. Seguido a Ia finalización de éste tratamiento, incluimos sucesivas etapas de lavado con agua caliente entre 40-950C doblando el volumen inicial de los restos celulares y recuperación de restos celulares. La recuperación del material tratado se efectúa por centrifugación. En nuestro proceso hemos incluido etapas de retención alcalina por un tiempo de 1hora a una temperatura que está entre 40-950C, para cada etapa. En las etapas de retención alcalina hemos desarrollado un proceso de blanqueamiento del material tratado adicionando un agente blanqueador que para nuestro proceso el agente blanqueador usado es el HIPOCLORITO DE SODIO en una concentración que está entre el 0.5-12% v/v con respecto a Ia cantidad de restos celulares tratados, manteniendo agitación constante en el rango entre 30-85 RPM durante un período de tiempo en el rango entre 1-5 horas y a una temperatura en el rango entre 40-950C, seguido de etapas de recuperación del material tratado y sucesivos lavados usando agua caliente a una temperatura de 40-950C han sido introducidas. La recuperación del material tratado es efectuada por centrifugación.
Los tratamientos y Ia recuperaciones en cada etapa de proceso fueron monitoreados por un control en análisis de material obtenido en cuanto a su contenido en proteína, glucan como glucosa (HPLC), manan como mañosa (HPLC), lípidos y cenizas, llevando el material a producto seco, para Io cual el proceso que hemos establecido es un secado por secador NIRO con una rata de evaporación de agua de 11/hr. Los resultados obtenidos en ésta etapa del proceso son ilustrados en Ia tabla I y tabla Il MUESTRAS %S %PROTEINA % % % CARBOHIDRATOS
B. S. CENIZAS GRASA B.S.
B.S. B.S. GLUCOSA MAÑOSA
RESTOS 97.53 26.63 3.33 2.53 25.77 24.5
CELULARES
NO
TRATADOS fR LAVADO 95.53 19.75 33.98 15.42 35.8 14.2
ULTIMO 95.3 12 19.4 14.9 58.2 0
LAVADO
TABLA I: Resultados obtenidos en las diferentes etapas del tratamiento álcali en el proceso de obtención de PARED CELULAR TRATADA DE LEVADURA S. cerevisiae DE PANADERÍA.
CONTENIDO % DE EXTRACCIÓN TTO ALCALINO
PRIMER RETENCIÓN ULTIMA RETENCIÓN
PROTEINA 25.8 16.1
CENIZAS -920.4 20.8
GRASA -509.5 0.7
GLUCOSA -38.9 -34.7
MAÑOSA 42 100
TABLA II: Porcentaje de extracción en cada etapa del tratamiento álcali en el proceso de obtención de GLUCAN DE LEVADURA S. cerevisiae DE PANADERÍA.
EJEMPLO 2
Este ejemplo hace referencia al ajuste de los restos celulares obtenidos como en el ejemplo 1. El material álcali insoluble recuperado después del último lavado del tratamiento álcali caliente, equivalente al doble del material ¡nicialmente tratado y con un contenido de sólidos entre el 5-11 % es adicionado de agua caliente a temperatura entre 40-950C y ajustado a pH entre 1.0-5.0 con ácido sulfúrico con concentración del 98% de pureza, adicionando el ácido en una forma lenta y gradual manteniendo una agitación constante entre 30-85 RPM. Luego del ajuste se realiza una etapa de separación. Etapas sucesivas de lavado con agua caliente Ia cual debe estar a 9O0C han sido incluidas. El diagrama de flujo del proceso está representado en el dibujo anexo No. 2. Para cada una de las etapas se llevó un control de análisis para Io cual sometimos el material recuperado a un proceso de secado por secador NIRO a una rata de evaporación de agua de 11/hr, los análisis efectuados se basaron en su contenido en proteína, lípidos, carbohidratos glucosa y mañosa (HPLC). En Ia última etapa de proceso, llamada última etapa de lavado se verifica que el material tratado se encuentra en un rango de pH entre 5.5-7.0. Estos resultados pueden verse ilustrados en Ia tabla III.
MUESTRA %S % % % "/«CARBOHIDRATOS
PROTEINA CENIZA GRASA B.S.
B.S. B.S. B.S. GLUCOSA MAÑOSA
RESTOS 97.53 26.63 3.33 2.53 25.77 24.5
CELULARES
NO
TRATADOS.
-<RA 95.6 5.8 4.5 14.2 65.3 0
SEPARACIÓN
ULTIMA 95.2 5.4 4 12.8 67.5 0
SEPARACIÓN TABLA III: Resultados obtenidos en las diferentes etapas de lavado después del ajuste con acido sulfúrico del material álcali-insoluble, en el proceso de obtención de GLUCAN DE LEVADURA S. cerevisiae DE PANADERÍA
EJEMPLO 3
Con éste ejemplo se ilustra Ia esterilización y secado del material recuperado en Ia obtención de GLUCAN DE LEVADURA DE S. cerevisiae DE PANADERÍA. El material una vez ha sido completado en el proceso de lavado es separado por centrifugación hasta obtener una concentración de 10-15% en sólidos, lográndose ésta concentración, el material es esterilizado haciéndolo pasar por un intercambiador de calor de placas a una temperatura en el rango de 95-11O0C. Cuando todo el material ha pasado a ésta temperatura se prepara para el proceso de secado, en ésta etapa hemos desarrollado un proceso para adicionar un antioxidante, siendo el antioxidante usado el ácido ascórbico en una concentración entre el 0.01 %-1.2% p/v. El material preparado es bombeado a través de una bamba gaulin a una presión de 75-80 psi y una temperatura de 9O0C; a un secador NIRO con una entrada de aire caliente en el rango de 190-2250C y un vacío de 0.1-2.0 mm, se obtiene así producto en polvo que hemos llamado BETA GLUCAN DE LEVADURA REFERENCIA PCT 3111 cuyo contenido en proteína está en el rango entre 0.0-6.25 en base de materia seca, en cenizas en el rango entre 0.0-5.0 en base materia seca, en glucosa en un rango entre 60-70% en base de materia seca y analizados por HPLC bajo condiciones de hidrólisis acida fuerte por autoclave y en grasa en el rango entre 10-30% en base de materia seca; y un producto en polvo que hemos llamado BETA GLUCAN DE LEVADURA REFERENCIA GLUCAN PLUS cuyo contenido en proteína está en el rango entre 0.0-3.5% en base de materia seca, en cenizas en el rango entre 0.0-3.0% en base materia seca, en carbohidratos totales en el rango entre 71-85% en base de materia seca y analizados por HPLC bajo condiciones de hidrólisis acida fuerte por autoclave y en grasa en el rango entre 0.0-12% en base de materia seca.
EJEMPLO 4
En este ejemplo se ilustra un proceso de purificación de Ia Pared Celular Tratada etapa adicional que puede estar incluida o no dentro del proceso de fabricación del BETA GLUCAN DE LEVADURA y desarrollada de acuerdo a las necesidades del producto. El producto Pared Celular Tratada es sometido a una extracción de su contenido lipídico, para Io cual se ha usado solventes orgánicos, siendo usado el etanol absoluto del 95% de pureza en una proporción de 1 :1 de producto pared celular tratada y/o una mezcla de solventes metanol: cloroformo en una proporción de mezcla de 2:1 :1 de producto pared celular tratada . Ia etapa de extracción se realiza bajo condiciones de reflujo por un período de 4 -16 horas, transcurrido este período el producto es recuperado por centrifugación el cual es sometido a un proceso de secado en una estufa al vacío en un periodo de tiempo en el rango de 4 a 10 horas y a una temperatura en el rango de 50- 7O0C,. El producto finalmente purificado tiene un contenido de proteína alrededor del 0.0 al 4.0% en base de producto seco, un contenido de glucosa del 85-90% determinado en base de producto seco, un contenido en grasa al rededor del 3 al 10% en base de producto seco y un contenido de cenizas alrededor del 0.5-2.0% en base de producto seco.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para Ia obtención de BETA GLUCAN DE LEVADURA Saccharomyces cerevisiae DE PANADERÍA, el cual comprende:
a). Autolisis de células, vivas de levadura. b). Separación de los restos celulares del proceso a) de Ia fracción soluble por centrifugación y sucesivos lavados de los restos celulares c). Tratamiento de los restos celulares lavados con álcali en caliente, en orden a remover componentes álcali solubles. d). Tratamiento de los restos celulares del paso c). con un oxidante - blanqueador en caliente y sucesivos lavados, para retirar pigmentación de los restos celulares. e). Recuperación de los restos celulares del paso d). por centrifugación. f). Esterilización de los restos celulares del paso e) a través de un intercambiador de calor de placas. g). Adición a los restos celulares del paso f) de un antioxidante. h). Secado de los restos celulares en un secador NIRO y obtención de BETA GLUCAN DE LEVADURA.
2. El proceso de Ia reivindicación 1 en donde Ia levadura seleccionada es una levadura del grupo de levadura de panadería.
3. El proceso de Ia reivindicación 1 en donde se cosechan células de levadura de un medio de fermentación al cual se ha adicionado micro nutrientes que facilitan mas tarde el rompimiento de las células de levadura permitiendo extraer el contenido proteico y dejar los restos celulares libres para el tratamiento en Ia extracción de β - glucan.
4. El proceso de Ia reivindicación 1 en donde el proceso de autolisis es un proceso que se realiza entre 8-15% de sólidos, a un pH entre 3.5-6.0, a una temperatura entre 7-
600C por un tiempo entre 18-65 horas, con una agitación entre 30-85RPM, en presencia de acetato de etilo usado como inductor de autolisis.
5. El proceso de Ia reivindicación 2 en donde Ia levadura del grupo de levadura de panadería es una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
6. El proceso de Ia reivindicación 1 en donde el álcali caliente usado para el tratamiento de los restos celulares es el HIDRÓXIDO DE SODIO.
7. El proceso de Ia reivindicación 5 en donde el álcali caliente usado, HIDRÓXIDO DE SODIO, para el tratamiento de los restos celulares es en escamas con una pureza del 98%.
8. El proceso de Ia reivindicación 6 en donde el álcali para el tratamiento de los restos celulares se encuentra en una proporción del 2.5-6.0% p/v.
9. El proceso de Ia reivindicación 7 en donde el pH para el tratamiento álcali caliente se encuentra en el rango de 5-14.
10. El proceso de Ia reivindicación 1 en donde el tratamiento con álcali caliente se lleva a cabo a una temperatura entre 40-950C, durante 2-6 horas y con una agitación constante entre 30-85 rpm.
11. El proceso de Ia reivindicación 1 en donde el oxidante blanqueador usado para despigmentación de los restos celulares es el HIPOCLORITO DE SODIO.
12. El proceso de Ia reivindicación 11 en donde el HIPOCLORITO DE SODIO usado se encuentra en una concentración entre el 0.5-12% v/v.
13. El proceso de la reivindicación 12 en donde el tratamiento con el HIPOCLORITO DE SODIO se lleva a cabo a una temperatura entre 40-950C, durante un tiempo entre 1-5 horas y agitación constante entre 30-85 rpm.
14. El proceso de Ia reivindicación 1 en donde el ácido usado para el ajuste de pH ácido de los restos celulares es un ácido mineral fuerte siendo éste el ÁCIDO SULFÚRICO.
15. El proceso de Ia reivindicación 14 en donde el pH ácido está entre el 1.0-5.0.
16. El proceso de Ia reivindicación 1 en donde Ia recuperación de los restos celulares tratados en Ia reivindicación 15 se lleva a cabo a través de centrifugación incluyendo lavados sucesivos hasta lograr obtener un pH en el rango de 5.5-7.0.
17. El proceso de Ia reivindicación 1 en donde los restos celulares recuperados en Ia reivindicación 16 y con una concentración entre 10-15% en sólidos, son sometidos a un proceso de esterilización, siendo este proceso llevado a cabo mediante un intercambiador de calor de placas a una temperatura que se encuentra entre 95- 1100C.
18. El proceso de Ia reivindicación 1 en donde el material esterilizado es bombeado a una presión de 75-80 psi y una temperatura de 900C; a un secador con una entrada de aire caliente en el rango de 190-2250C y un vacío de 0.1-2.0 mm, lográndose obtener el BETA GLUCAN DE LEVADURA en polvo.
19. El proceso de Ia reivindicación 1 en donde los restos celulares recuperados en Ia reivindicación 18 y con una concentración de sólidos entre 10-15% son adicionados de un agente antioxidante.
20. Ei proceso de Ia reivindicación 19 en donde el agente antioxidante usado es el acido ascórbico.
21. Un proceso acorde con Ia reivindicación 1 , en donde el producto beta glucan de levadura puede ser sometido a un proceso de purificación, el cual comprende: a) Extracción con etanol absoluto del 95% de pureza en una proporción de 1 :1 de producto pared celular tratada y/o extracción con una mezcla de Metanol/Cloroformo en una proporción de 2:1 :1 de producto pared celular tratada. b) Calentamiento con reflujo por un período de tiempo alrededor de 4 a 16 horas. c) Recuperación del producto por centrifugación d) Secado del producto mediante estufa al vacío por un período de tiempo alrededor de 4 - 10 horas a una temperatura en el rango de 50-700C.
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