WO2008007711A1 - Peptide dérivé de sart3, utile dans une thérapie du cancer par vaccin pour patient présentant un cancer de la prostate, positif á l'allèle hla-supertype a3 - Google Patents
Peptide dérivé de sart3, utile dans une thérapie du cancer par vaccin pour patient présentant un cancer de la prostate, positif á l'allèle hla-supertype a3 Download PDFInfo
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- the present invention relates to a SART3-derived peptide useful for the treatment or prevention of HLA-A3 supertype allele positive prostate cancer patients.
- Prostate cancer is a cancer that is common in elderly men (Non-patent Document 1).
- Non-patent Document 1 the ability of androgon-removal therapy to be transiently successful S, effective treatment for relapse as hormone-resistant or bone-metastatic prostate cancer.
- Specific immunotherapy can be a promising option for such patients. This is because prostate cancer reactive cytotoxic ⁇ cells can specifically find metastases.
- Many cancer antigen peptides that can be used for specific immunotherapy for prostate cancer patients have been identified so far (Non-patent Document 2).
- Non-Patent Document 3 because of the high frequency of HLA-A2 and -A24 alleles worldwide, most of the conventional cancer antigen peptides were for patients positive for HLA-A2 or -A24 alleles (Non-Patent Document 3). ).
- HLA-A2, -A3, _B7 and -B44 supertype alleles have been proposed for HLA class I alleles based on structural homology and peptide binding motif analysis (Non-Patent Document 4).
- the HLA-A3 supertype allele is found in 38% of Caucasians, 53% of Chinese, 46% of Japanese, and 43% of North American African Americans and Hispanics (Non-patent Document 4). Nonetheless, cancer antigen peptides that can be used to treat HLA-A3 supertype allele positive prostate cancer patients are limited (Non-patent Documents 5-7)
- Non-patent Document 1 Greenlee RT, Murray T, Bolden S, Wingo PA. Cancer statistics, 2000. CA Cancer J Clin 2000; 50: 7-33.
- Non-patent literature 2 Renkvist N, Castelli C, Robbins PF, Policyani GA listing of human tu mor antigens recognized by T cells. Cancer Immunol Immunother 2001; 50: 3-15.
- Non-patent literature 3 Imanishi T, Akazawa Satoshi, Kimura A. Allele and haplotype frequencies fo r HLA and complement loci in various ethnic groups. In Tsuji, Aizawa M, Sasazuki T. editors. HLA 1991.Vol.
- Non-Patent Document 5 Wang RF, Johnston SL, Southwood S, Sette A, Rosenberg SA.Recognition of an antigenic peptide derived from tyrosinase-related protein-2 by CTL in t he context of HLA-A31 and A33. J Immunol 1998 ; 160: 890-897.
- Non-Patent Document 6 Takedatsu H, Shichijo S, atagiri, Sawamizu H, Sata M, Itoh. Identification of peptide vaccine candidates sharing among HLA-A3 +, -A11 +, -A31 +, and nd -A33 + cancer patients. Clin Cancer Res 2004 ; 10: 1112-1120.
- Non-Patent Document 7 Matsueda S, Takedatsu H, Yao A, Tanaka M, Noguchi M, Itoh, Harada M. identification of peptide vaccine candidates for prostate cancer patients with
- An object of the present invention is to provide a cancer antigen peptide useful for cancer vaccine therapy for HLA-A3 supertype allele positive prostate cancer patients.
- the present invention provides a SART3-derived peptide that can bind to an HLA-A3 supertype allele molecule and is recognized by cellular immunity.
- the present invention relates to a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 20, and substitution, deletion and / or addition of 1 or 2 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 20 And a derivative thereof having a property that is functionally equivalent to the peptide consisting of the amino acid sequence introduced with and having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 20.
- the present invention also provides a nucleic acid molecule encoding the peptide or derivative of the present invention and a vector comprising the nucleic acid molecule.
- the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating or preventing prostate cancer, particularly the pharmaceutical composition which is a cancer vaccine, comprising the peptide, derivative or vector of the present invention.
- the present invention relates to prostate cancer reactive cytotoxicity, which comprises contacting peripheral blood mononuclear cells collected from HLA-A3 supertype allele positive prostate cancer patients with the peptide or derivative of the present invention. Methods of inducing sex T cells are provided.
- the present invention also includes introducing a peptide or derivative of the present invention into a cell having an antigen-presenting ability derived from an HLA-A3 supertype allele-positive prostate cancer patient, or introducing the vector of the present invention. And a method for preparing an antigen-presenting cell that presents a complex of a SART3-derived peptide or a derivative thereof and a HLA-A3 supertype allele molecule on the cell surface.
- the present invention has expanded the options for peptide-based immunotherapy, particularly cancer vaccine therapy, for HLA-A3 supertype allele positive prostate cancer patients.
- the present invention is particularly useful for the treatment of prostate cancer patients who are negative for HLA-A2 or HLA-A24 molecules for which many cancer vaccine candidate peptides have been identified so far.
- FIG. 1 A: SART3 mRNA expression in esophageal cancer cell line KE4, normal PBMC, and three prostate cancer cell lines (PC3, PC93, and LNCaP). B: Expression of HLA-A11, _A31, and A33 molecules in three types of LNCaP transfectants established in the present invention. The dotted line shows the result of staining without the primary antibody.
- FIG. 2A Cytotoxic activity of peptide-stimulated PBMC from HLA-A3 supertype allele positive prostate cancer patients. * p ⁇ 0.05.
- FIG. 2B Cytotoxic activity of peptide-stimulated PBMC derived from HLA-A3 supertype allele positive prostate cancer patients. * p ⁇ 0.05.
- FIG. 3A Cytotoxic activity against prostate cancer cells depending on peptide-specific CD8-positive T cells. * ⁇ ⁇ 0 ⁇ 05.
- the peptide of the present invention is a peptide comprising a part of the amino acid sequence of SART3 identified as a cancer antigen.
- the amino acid sequence of SART3 is disclosed in Genebank at ⁇ 020880.
- HLA-A3 supertype allele molecule means that the peptide can form a complex with the HLA-A3 supertype allele molecule and be displayed on the cell surface.
- the amino acid sequence of a peptide that binds to an HLA molecule has regularity that depends on the type of HLA.
- the amino acid sequence according to the regularity is called a binding motif.
- HLA-A3 supertype allele molecules include HLA-A11, -A31, _A33, -A0301 and —A6801 molecules, which share the binding motif (Sette, A., and Sidney, J.
- the phrase “recognized by cellular immunity” means that the peptide has the ability to induce peptide-specific CTL.
- Peptide-specific CTL inducibility can be achieved, for example, by stimulating peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with a peptide and reacting with antigen-presenting cells in which the peptide-stimulated PB MC is pulsed with the corresponding peptide (eg, IFN- ⁇ ). ) Can be measured by ELISA or the like.
- the cytotoxic activity of the induced CTL can be confirmed by a 51 Cr release measurement method or the like.
- the number of amino acid residues of the peptide of the present invention should be in the range of 8-14. S is preferable, more preferably 8 to; 11, particularly preferably 9 or 10. is there.
- the phrase "recognized by humoral immunity” means that IgG specific to the peptide exists in the living body, that is, peptide-specific IgG is detected from plasma. Peptides recognized by both cellular immunity and humoral immunity are preferred as the peptides of the present invention because they are expected to have high immunogenicity and excellent CTL inducing ability. Specific IgG in plasma can be measured by a conventional ELISA method or the like.
- amino acid represented by SEQ ID NO: 16 or 20 is particularly preferred as the peptide of the present invention.
- substitution, deletion and / or addition of 1 or 2 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 20 It has the functionally equivalent properties of a peptide consisting of the introduced amino acid sequence and consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 20.
- “Has functionally equivalent properties to the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 20” means that it can bind to the HLA-A3 supertype allele molecule and is recognized by cellular immunity. To do. Whether or not they have functionally equivalent properties is determined by the ability S to investigate according to the method described above.
- Substitution of amino acids from the viewpoint of not changing the properties of peptides such as homologous amino acids (polar amino acids, nonpolar amino acids, hydrophobic amino acids, hydrophilic amino acids, positively charged amino acids, negatively charged amino acids, aromatic amino acids, etc.) ) Is preferable. Deletion and attachment of amino acids are preferably performed so that the derivative has 8 to 11 amino acid residues.
- amino acid substitutions, deletions and / or additions are preferably allowed on the HLA molecule-binding motif. That is, amino acid substitution, deletion and / or addition is preferably performed so that the peptide terminal amino acid force S-lysine or arginine of the peptide derivative is obtained.
- substitution, deletion and / or addition of other amino acids with the C-terminal amino acid of SEQ ID NO: 16 or 20 preserved in arginine substitution of its C-terminal amino acid with lysine, or its C-terminal
- substitution of its C-terminal amino acid with lysine, or its C-terminal substitution of its C-terminal amino acid with lysine, or its C-terminal
- the amino acid is replaced with lysine, and other amino acid substitutions, deletions and / or additions are performed.
- derivatives comprising an amino acid sequence in which the C-terminal amino acid of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 20 is substituted with lysine are particularly suitable for the
- the amino acids constituting the peptides and derivatives of the present invention may be natural amino acids or amino acid analogs.
- amino acid analogs include N-acylated, 0-acylated, esterified, and acid amino acids. Examples include amidated products and alkylated products.
- the peptides and derivatives of the present invention may be modified in their constituent amino acids or carboxyl groups as long as the functions are not significantly impaired. Modifications include binding of formyl, acetyl, and t-butoxycarbonyl groups to the N-terminus and free amino groups, and C-terminus and free amino groups. And those having a methyl group, an ethyl group, a t-butyl group, a benzyl group or the like bonded to the carboxyl group.
- the peptides and derivatives of the present invention can be produced by ordinary peptide synthesis.
- Peptide Synthesis Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol2, Academic Press Inc., New York, 1976; peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Experiment, Maruzen Co., Ltd., 1985; Development of pharmaceuticals, Vol. 14-Peptide synthesis, Hirokawa Shoten, 1991).
- the peptide and derivative of the present invention may be produced by fragmenting a polypeptide containing the amino acid sequence IJ of the peptide or derivative of the present invention in a cell and provided as a complex with an HLA molecule. . It is also within the scope of the present invention to utilize the peptides or derivatives of the present invention in such embodiments. As long as the peptide or derivative of the present invention can be provided, the number of amino acid residues and the amino acid sequence of the polypeptide are arbitrary.
- the peptides and derivatives of the present invention can efficiently induce and proliferate CTLs that damage HLA-A3 supertype allele-positive prostate cancer cells. That is, the peptides and derivatives of the present invention can be used for inducing prostate cancer-reactive CTLs and for producing pharmaceutical compositions for prostate cancer, etc., in the treatment or prevention of prostate cancer. Useful.
- the pharmaceutical composition of the present invention contains one or more of the peptides or derivatives of the present invention, and has a therapeutic effect by inducing prostate cancer reactive CTL specific for the peptides or derivatives. Demonstrate.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a cancer vaccine. Since CTL of cancer patients is a collection of cells that recognize different cancer antigen peptides, it is more effective to use a combination of multiple types of peptides and / or derivatives. You may combine with cancer antigen peptides other than the peptide of this invention.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be administered together with an adjuvant conventionally known to be used for vaccine administration so that an immune response is effectively established. Further, a liposomal preparation, a particulate preparation bound to beads having a diameter of several meters, or a preparation bound to lipid may be used.
- the administration method is, for example, intradermal administration or subcutaneous administration. Dosage, disease state
- the amount of the peptide or derivative of the present invention in the pharmaceutical composition is usually 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.0001 mg to 100 mg, more preferably 0.001 mg. ⁇ 10mg. It is preferable to administer this once every several days, weeks or months for 1 to 3 years.
- the nucleic acid molecule of the present invention can provide the peptide or derivative of the present invention.
- a vector containing the nucleic acid molecule of the present invention is introduced into an antigen-presenting cell and expressed, the peptide or derivative of the present invention is produced and forms a complex with the HLA molecule and presented on the cell surface.
- This antigen-presenting cell is capable of efficiently proliferating peptide-specific prostate cancer reactive CTL.
- the vector of the present invention can be used for administration to a patient to express the peptide or derivative of the present invention in the patient. Further, after the vector of the present invention is introduced into an appropriate cell outside the body, for example, a dendritic cell derived from a patient, the cell may be returned to the patient.
- a dendritic cell derived from a patient the cell may be returned to the patient.
- Examples of the vector of the present invention include various plasmids and viral vectors such as adenovirus, adeno-associated virus, retrovirus, vaccinia virus and the like (Liu M, Acres B, Balloul jM, Bizouarne N, Paul S, MOS). P, ⁇ quioan P. Gene-based vaccines and immunotherapeutics. Proc Natl Acad Sci USA 101 Suppl, 14567-71, 2004). Vector preparation methods are well known in the art (Molecular Cloning: A laboraroy manual, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory).
- the dosage varies depending on the disease state, individual patient age, weight, etc.
- the DNA content is 0.1 ⁇ g to 100 mg, preferably 1 ⁇ g to 50 mg.
- Examples of the administration method include intravenous injection, subcutaneous administration, intradermal administration and the like.
- the CTL induction method of the present invention provides a CTL that damages HLA-A3 supertype allele-positive prostate cancer cells.
- prostate cancer reactivity means that it has a property of recognizing a complex of a cancer antigen peptide on a prostate cancer cell and an HLA molecule and damaging the cell.
- Induction of CTL is, for example, HLA-A3 supertype array PBMC collected from a patient with le-positive prostate cancer is cultured in vitro in the presence of the peptide or derivative of the present invention.
- the CTL induced by the method of the present invention is useful for adoptive immunotherapy, that is, a cancer treatment method in which CTL induced in a patient's body from which PBMCs are collected and cancer cells are damaged. That is, CTL induced by the method of the present invention can be used as a medicament for treating or preventing prostate cancer.
- the CTL induction kit of the present invention is used for carrying out the CTL induction method.
- the kit of the present invention contains one or more of the peptides or derivatives of the present invention, and further includes an appropriate buffer or medium.
- the antigen-presenting cell preparation method of the present invention provides an antigen-presenting cell for inducing CTL that damages HLA-A3 supertype allele-positive prostate cancer cells.
- Antigen-presenting cells can be prepared, for example, by the ability of the peptide or derivative of the present invention to be incorporated into cells having antigen-presenting ability derived from HLA-A3 supertype allele-positive prostate cancer patients, or such This is carried out by introducing and expressing the vector of the present invention in cells by a well-known method.
- Cells with antigen-presenting ability are, for example, dendritic cells, and are prepared by separating cultured plate adherent cells from PBMC collected from patients and culturing them in the presence of IL-4 and GM-CSF for about 1 week. be able to.
- Antigen-presenting cells prepared by the method of the present invention can induce CTLs that specifically recognize complexes of peptides or derivatives presented on the cell surface and HLA molecules, and when administered to patients, It can promote the induction of prostate cancer reactive CTL in the body. That is, the antigen-presenting cells prepared by the method of the present invention can be used as a medicament for treating or preventing prostate cancer.
- the antigen-presenting cell preparation kit of the present invention is used for performing the antigen-presenting cell preparation method.
- the kit of the present invention contains one or more kinds of the peptide or derivative of the present invention, and can further contain an appropriate buffer or medium.
- PBMCs were collected with prior written consent from HLA-A3 supertype allele positive prostate cancer patients and healthy volunteers (HD). Patients included HLA-A11 positive, -A31 positive, and -A33 positive patients. HLA-A3 positive or -A68.1 positive patients are extremely infrequent in Japanese (1.6% and 0.5%) (Aizawa M. The Proceedings of the 3ra Asia-Oceania Histocompaatioility Workshop Conference, pp. 1090-1103 uxror d: Oxford University Press, 1986 ⁇ ), PBMCs derived from them were not available. None of the patients who collected PBM C were HIV-infected.
- HLA-A11, -A31 and -A33 molecules on PBMC was confirmed by flow cytometry using the following antibody: anti-HLA-A11 monoclonal antibody (mAb) (C at # 0284HA; One Lambda Inc., Canoga, CA, USA); anti-HLA-A31 mAb (Cat # 0273 HA; One Lambda); anti-HLA- A33 mAb (Cat # 0612HA; One Lambda); and FITC-conjugated anti-mouse immunoglobulin G (IgG) mAb .
- mAb monoclonal antibody
- IgG FITC-conjugated anti-mouse immunoglobulin G
- the level of SART3-derived peptide-specific IgG in plasma was measured by the Luminex (trademark) method as previously reported ( Komatsu N, Shichijo S, Nakagawa M, Itoh ⁇ , Scand J Clin Invest 2004; 64: 1-11 ⁇ ).
- diluted serum 100 L was added to SART3-derived peptide-coated color-coded beads (Luminex Corp (Austin, TX, USA) (5 ⁇ 1)) and 96-well filter plate (MABVN1250, Millipore Corp., Incubated for 2 hours at room temperature on a plate shaker in Bedford, MA, USA After 2 hours, the plate was washed with T-PBS and biotinylated anti-human IgG (BA-3080 (VECTOR LAB, (CA, USA) (100 1) for 1 hour at room temperature, wash the plate, add streptavidin-labeled PE (100) (S-866, Invitrogen Detection Technologies, Eugene, Oregon, USA), 30 The bound beads were washed 4 times, followed by addition of Tween-PBS dOO l) to each well 50 1 samples were used for measurements by the Luminex TM method SART3-derived peptides In order to confirm the specificity of IgG for Control The cells were cultured on
- C1R_A11, -A31, and -A33 are C1R subcell lines that stably express the HLA-A1101, -A3101, and -A3303 genes, respectively. Expression of HLA-A11, -A31 and -A33 molecules on these subcell lines has been reported previously (Takedatsu H, Shichijo S, Katagiri K, Saw amizu H, Sata M, Itoh ⁇ , Clin Cancer Res 2004; 10: 1112-1120 ⁇ ).
- PC3, PC-93, and LNCaP are prostate cancer cell lines, and KE4 is an esophageal cancer cell line.
- LNCaP subcell lines expressing HLA_A11, -A 31 and -A33 molecules were transformed into the eukaryotic expression vector pCR3.1 (Invitrogen, Carlsbad , CA, USA) and electoral positioning was performed using Gene Panoresa (Bio RAD, Richmond, CA, USA).
- LNCaP_All, -A31 and -A33 are subcell lines that stably express the HLA-A1101, -A3101 and -A3303 genes, respectively (Fig. 1). All these cell lines were cultured in RPMI 1640 (Invitrogen) containing 10% FCS.
- RNA of cancer cell lines was isolated using RNAzol TM B (Tel-Test Inc., Friendswood, TX, USA).
- cDNA was prepared using the Superscript TM Preamplification System for First-Strand cDNA Synthesis (Invitrogen) and amplified using the following primers: SART3: 5′-AAGTACGCCAACATGTGGC-3 ′ (sense, SEQ ID NO: 34) , 5,-CTCTG CTCATTGACACGAGC-3 '(antisense, SEQ ID NO: 35)); ⁇ -actin: 5, -CTTCG CGGGCGATGC-3' (sense, SEQ ID NO: 36), 5, -CGTACATGGCTGGGGTGTTG-3 '(antisense, sequence Number 37).
- PCR is 95 in a DNA thermorecycler (ICycler, Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA) using Taq DNA polymerase. C1 min, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 30 cycles. PCR products were separated by electrophoresis on a 2% agarose gel.
- All SART3-derived peptides shown in Table 1 were prepared based on the binding motif for the HLA-A3 supertype allele molecule (Parker C, Bednarek MA, Coligan JE., J Immu nol 1994; 152: 163-175.) 0 Influenza (Flu) virus-derived peptide, Epstein's virus (EBV) -derived peptide, tyrosinase-related protein 2 (TRP2) -derived peptide, and HIV-derived peptide, HLA- Used as a binding control for the A3 supertype allele. All peptides were purchased from Biologica Co. (Nagoya, Japan) and dissolved in dimethyl sulfoxide at a dose of 10 Hg / ml.
- T.P2 LLGPORPYR 9.0a The binding score was calculated based on the expected half-life of dissociation from the HLA class molecule.
- HIV-derived nucleotides are not calculated because they are composed of 11 amino acids.
- This culture is 45% RPMI 1640, 45% AIM-V medium (Gib co-BRL, Gaithersburg, MD), 10% FCS, 100 U / ml interleukin-2 (IL-2) and 0. ImM MEM not required It consisted of an amino acid solution (Gibco_BRL). Every 3 or 4 days, half of the culture was removed and replaced with a new culture containing the corresponding peptide (20 g / ml) and IL-2 (100 U / ml). On the 15th day of culture, the cultured cells were divided into 4 wells.
- the cytotoxic activity of peptide-stimulated PBM C against LNCaP, LNCaP_All, LNCaP_A31 or LNCaP_A33 was measured by standard 6 hour 51 Cr release assay.
- Phyto-Magnolechun (PHA) activated T cells were used as negative control cells.
- PHA Phyto-Magnolechun
- 2000 51 Cr-labeled cells were cultured with effector cells at the indicated effector cell / target cell ratio.
- CD8 positive T cells were isolated using a CD8 Positive Isolation Kit (Dynal, Oslo, Norway). Specifically, purified CD8 positive T cells (2 x 10 4 cells / well) were placed in a round bottom 96-well plate in the presence of cold target cells (4 x 10 4 cells) with 51 Cr labeled target cells ( 2 ⁇ 10 3 cells / well). Corresponding SART3 peptide or HIV peptide C1R_A11, -A31, and -A33 pre-pulsed with either of these were used as cold target cells.
- HLA-A3 and HLA-A68 molecules also belong to the HLA-A3 supertype allele (Sette A, Sidney J., Immunogenetics 1999; 50: 201-21 2.), but they are extremely rare in Japanese.
- the binding ability to HLA-A11, -A31, and -A33 molecules was preferentially examined. The purpose of this study is to identify peptides that have the ability to induce cancer-reactive CTL in HLA-A3 supertype positive prostate cancer patients.
- IgG response to chido was detected in plasma of 5, 7, 13, 5, and 5 of 20 prostate cancer patients, respectively (Table 2). IgG that reacts with these five SART3-derived peptides was also detected in plasma of 2, 2, 8, 1, and 4 of 20 HDs (data not shown). SART3-derived peptide-reactive IgG for these five types was detected more frequently in the plasma of prostate cancer patients than in HD. Against 24 other SART3-derived peptides 0064
- PBMCs were stimulated with each SART3-derived peptide or control peptide, and the stimulated cells responded to C1R_A11, C1R-A31, or C1R-A33 cells with the corresponding peptide nors in response to IFN- ⁇ . The production was examined.
- Table 3 shows representative results of 15 HLA-A3 supertype allele positive prostate cancer patients (5 per allele). Induction of peptide-specific CTL was considered successful when p ⁇ 0.05 and the difference from IFN- ⁇ production by the control HIV peptide was greater than 100 pg / ml.
- SART3 SEQ ID NO: 6
- SART3 SEQ ID NO: 16
- SART3 SEQ ID NO: 16
- SART3 SEQ ID NO: 20
- SART3 SEQ ID NO: 16
- SART3 SEQ ID NO: 20
- Prostate cancer cell lines PC3, PC93, and LNCaP also expressed SART3 mRNA. Furthermore, in order to clarify the ability of HLA-A3 supertype allele-restricted cytotoxic activity, LNCaP transfectants expressing each of the HLA-A11, -A31, and -A33 molecules were prepared (Fig. 1B).
- PBMC from HLA-A3 supertype allele-positive prostate cancer patients were stimulated with either SART3 or SART3 peptide and induced thereby
- HLA-A11 positive patients (Pt. 1, 2, 5) stimulated with each of SART3 (SEQ ID NO: 20)
- PBMCs derived from 17 showed higher levels of cytotoxic activity against LNCaP-All cells than against LNCaP cells and HLA-A11-positive immunized T cells.
- these peptides had the ability to induce LNCaP transfectant-reactive CTLs from PBMCs of HLA-A31 positive patients and HLA-A33 positive patients. That is, these peptide-reactive CTLs showed higher levels of cytotoxic activity against LNCaP_A31 cells and LNCaP_A33 cells than to LNCaP cells or immunized T cells.
- SART3 SEQ ID NO: 16
- SART3 SEQ ID NO: 16
- the SART3-derived peptide of the present invention can induce prostate cancer-reactive CTL in HLA-A3 supertype allele-positive prostate cancer patients and is useful for specific immunotherapy, particularly cancer vaccine therapy.
Landscapes
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Description
明 細 書
HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者に対する癌ワクチン療 法に有用な SART3由来ペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、 HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者の処置または予防に 有用な SART3由来ペプチドに関する。
背景技術
[0002] 前立腺癌は老年期男性に多い癌である(非特許文献 1)。前立腺癌にはアンドログ ン除去療法が一過性に奏功する力 S、ホルモン抵抗性または骨転移性前立腺癌として 再発した場合に有効な治療法はなレ、。このような患者にとって特異的免疫療法は有 望な選択肢となりうる。なぜなら前立腺癌反応性細胞傷害性 τ細胞は特異的に転移 を探し出すことができるからである。これまで、前立腺癌患者に対する特異的免疫療 法に利用可能な癌抗原ペプチドは多く同定されている(非特許文献 2)。しかしながら 、 HLA-A2および- A24アレルの頻度が世界的に高いことから、従来の癌抗原ぺプチ ドは HLA-A2または- A24アレルが陽性の患者に対するものがほとんどであった(非特 許文献 3)。
[0003] HLAクラス Iアレルには、その構造的相同性およびペプチド結合モチーフ解析に基 づき、 HLA-A2、 -A3、 _B7および- B44スーパータイプアレルが提唱されている (非特 許文献 4)。それらのうち HLA-A3スーパータイプアレルは、コーカサス人の 38%、中国 人の 53%、 日本人の 46%および北米アフリカ系アメリカ人およびヒスパニックの 43%に見 られる(非特許文献 4)。それにもかかわらず、 HLA-A3スーパータイプアレル陽性前 立腺癌患者の治療に使用できる癌抗原ペプチドは限られている(非特許文献 5— 7) 非特許文献 1 : Greenlee RT, Murray T, Bolden S, Wingo PA. Cancer statistics, 2000 . CA Cancer J Clin 2000;50:7-33.
非特許文献 2 : Renkvist N, Castelli C, Robbins PF, Parmiani G.A listing of human tu mor antigens recognized by T cells. Cancer Immunol Immunother 2001;50:3-15. 非特許文献 3: Imanishi T, Akazawa Τ, Kimura A. Allele and haplotype frequencies fo
r HLA and complement loci in various ethnic groups. In Tsuji , Aizawa M, Sasazuki T. editors. HLA 1991.Vol. l Oxford: Oxford Scientific Publications; 1992· 1065- 1220 P- 非特許文献 4: Sette A, Sidney J. Ninemajor HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA- A and B polymorphism. Immunogenetics 1999;50:201-2 12.
非特許文献 5 : Wang RF, Johnston SL, Southwood S, Sette A, Rosenberg SA. Recog nition of an antigenic peptide derived from tyrosinase-related protein-2 by CTL in t he context of HLA-A31 and A33. J Immunol 1998; 160:890-897.
非特許文献 6: Takedatsu H, Shichijo S, atagiri , Sawamizu H, Sata M, Itoh . Ide ntification of peptide vaccine candidates sharing among HLA-A3+, -A11+, -A31+, a nd -A33+ cancer patients. Clin Cancer Res 2004; 10: 1112-1120.
非特許文献 7: Matsueda S, Takedatsu H, Yao A, Tanaka M, Noguchi M, Itoh , Har ada M. identification of peptide vaccine candidates for prostate cancer patients with
HLA- A3 supertype alleles. Clin Cancer Res. 2005; 11 :6933- 6943.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、 HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者に対する癌ワクチン 療法に有用な癌抗原ペプチドを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明は、 SART3由来ペプチドであって、 HLA-A3スーパータイプアレル分子に結 合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドを提供する。具体的には、本発明は、 配列番号 16または 20に示すアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号 16また は 20に示すアミノ酸配列において 1または 2個のアミノ酸の置換、欠失および/また は付加が導入されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号 16または 20に示すアミノ酸 配列からなるペプチドと機能的に同等の性質を有するその誘導体を提供する。
[0006] 本発明はまた、本発明のペプチドまたは誘導体をコードする核酸分子および該核 酸分子を含むベクターを提供する。
[0007] 本発明はまた、本発明のペプチド、誘導体、またはベクターを含む、前立腺癌を処 置または予防するための医薬組成物、特に癌ワクチンである該医薬組成物、を提供 する。
[0008] さらに、本発明は、 HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者より採取され た末梢血単核細胞を本発明のペプチドまたは誘導体と接触させることを含む、前立 腺癌反応性細胞傷害性 T細胞を誘導する方法を提供する。
[0009] 本発明はまた、 HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者に由来する抗原 提示能を有する細胞に、本発明のペプチドまたは誘導体を取り込ませること、または 本発明のベクターを導入することを含む、 SART3由来ペプチドまたはその誘導体と H LA-A3スーパータイプアレル分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞 を調製する方法を提供する。
発明の効果
[0010] 本発明により、 HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者に対するペプチド 基盤免疫療法、特に癌ワクチン療法の選択肢が広がった。本発明は、これまでに癌 ワクチン候補ペプチドが多数同定されている HLA-A2または HLA-A24分子が陰性の 前立腺癌患者の治療に特に有用である。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]A:食道癌細胞株 KE4、正常 PBMC、及び 3種類の前立腺癌細胞株 (PC3、 PC93 、および LNCaP)における SART3 mRNAの発現。 B:本発明において樹立した 3種類 の LNCaPトランスフエクタントにおける HLA-A11、 _A31、および A33分子の発現。点線 は、一次抗体なしで染色した結果を示す。
[図 2A]HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者由来のペプチド刺激 PBMC の細胞傷害活性。 * p< 0.05。
[図 2B]HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者由来のペプチド刺激 PBMC の細胞傷害活性。 * p< 0.05。
[図 3A]ペプチド特異的 CD8陽性 T細胞に依存する前立腺癌細胞に対する細胞傷害 活性。 * ρ< 0·05。
[図 3Β]ペプチド特異的 CD8陽性 Τ細胞に依存する前立腺癌細胞に対する細胞傷害
活性。 * ρ< 0·05。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明のペプチドは、癌抗原として同定された SART3のアミノ酸配列の一部よりな るペプチドである。 SART3のアミノ酸配列は、 Genebankに ΑΒ020880にて開示されて いる。
[0013] 「HLA-A3スーパータイプアレル分子に結合できる」とは、ペプチドが HLA-A3スー パータイプアレル分子と複合体を形成し細胞表面に提示されうることを意味する。一 般に HLA分子に結合するペプチドのアミノ酸配列には HLAの型に依存する規則性が ある。その規則性にしたがうアミノ酸配列を結合モチーフと呼ぶ。 HLA-A3スーパータ ィプアレル分子には、 HLA-A11、 -A31、 _A33、 -A0301および—A6801分子が含まれ 、これら (ュ結合モテーフを共 する (Sette, A., and Sidney, J. Ninemajor, Immunogen etics, 50:201-212, 1999·)。 HLA-A3スーパータイプアレル分子に対する結合モチー フを有するペプチドは、 Bioinformatics and Molecular Analysis Section (NIH, Bethesd a, MD)等のコンピューター解析により決定することができる。
[0014] 本発明において、ペプチドが「細胞性免疫に認識される」とは、そのペプチドがぺプ チド特異的 CTLを誘導する能力を有することを意味する。ペプチド特異的 CTL誘導 能は、例えば、末梢血単核細胞(PBMC)をペプチドで刺激し、そのペプチド刺激 PB MCが対応ペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してサイト力イン (例えば IFN- γ )を産生するかを ELISA法等により測定して調べることができる。また、 51Cr放出測 定法等により、誘導された CTLの細胞傷害活性を確認することができる。 CTLによる 認識性を考慮すると、本発明のペプチドのアミノ酸残基数は 8〜 14個の範囲内であ ること力 S好ましく、より好ましくは 8〜; 11個、特に好ましくは 9または 10個である。
[0015] ペプチドが「液性免疫に認識される」とは、そのペプチドに特異的な IgGが生体内に 存在すること、つまりはペプチド特異的 IgGが血漿から検出されることを意味する。細 胞性免疫と液性免疫の両方に認識されるペプチドは、免疫原性が高く CTL誘導能に 優れると期待されるため、本発明のペプチドとして好ましい。血漿中の特異的 IgGは、 常套的な ELISA法等によって測定することができる。
[0016] 本発明のペプチドとして特に好ましいのは、配列番号 16または 20に示すアミノ酸
配列からなるペプチドである。
[0017] 本発明における配列番号 16または 20に示すアミノ酸配列からなるペプチドの誘導 体は、配列番号 16または 20に示すアミノ酸配列において 1または 2個のアミノ酸の置 換、欠失および/または付加が導入されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号 16ま たは 20に示すアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等の性質を有する。「配列 番号 16または 20に示すアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等の性質を有す る」とは、 HLA-A3スーパータイプアレル分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識さ れることを意味する。機能的に同等の性質を有するか否かは、前述の方法に従い調 ベること力 Sでさる。
[0018] アミノ酸の置換は、ペプチドの性質を変化させない観点から、同族アミノ酸 (極性ァ ミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷 電ァミノおよび芳香族アミノ酸等)の間で行うことが好ましい。アミノ酸の欠失および付 カロは、誘導体のアミノ酸残基数が 8〜; 11個となるように行うことが好ましい。
[0019] また、アミノ酸の置換、欠失および/または付加は、 HLA分子結合モチーフ上許容 されるものが好ましい。すなわち、アミノ酸の置換、欠失および/または付加は、ぺプ チド誘導体の C末端アミノ酸力 Sリシンまたはアルギニンとなるように行うことが好ましい 。例えば、配列番号 16または 20の C末端アミノ酸をアルギニンに保存したまま他のァ ミノ酸の置換、欠失および/または付加を行うか、その C末端アミノ酸をリシンに置換 するか、あるいはその C末端アミノ酸をリシンに置換しさらに他のアミノ酸の置換、欠失 および/または付加を行う。なかでも、配列番号 16または 20に示すアミノ酸配列の C 末端アミノ酸をリシンで置換したアミノ酸配列からなる誘導体が本発明に特に好適で ある。
[0020] 本発明のペプチドおよび誘導体を構成するアミノ酸は、天然のアミノ酸またはァミノ 酸アナログであってよく、アミノ酸アナログとしては、アミノ酸の N-ァシル化物、 0-ァシ ル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げられる。本発明のぺプ チドおよび誘導体は、機能を著しく損なわない限りにおいてその構成アミノ酸または カルボキシル基などが修飾されていてもよい。修飾は、 N末端や遊離のァミノ基にホ ルミル基、ァセチル基、 t-ブトキシカルボ二ル基等を結合するものや、 C末端や遊離
のカルボキシル基にメチル基、ェチル基、 t_ブチル基、ベンジル基等を結合するもの が挙げられる。
[0021] 本発明のペプチドおよび誘導体は、通常のペプチド合成により製造することができ る。そのよつな方法として、 列 ュ、 Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol2, Academic Press Inc.,New York, 1976 ;ペプチド合成、丸善(株) 、 1975 ;ペプチド合成の基礎と実験、丸善 (株)、 1985 ;医薬品の開発続第十四巻- ペプチド合成、広川書店、 1991)などに記載されている方法が挙げられる。
[0022] 本発明のペプチドおよび誘導体は、本発明のペプチドまたは誘導体のアミノ酸配 歹 IJを含むポリペプチドが細胞内で断片化されて生じ、 HLA分子との複合体として提 供される場合もある。そのような態様で本発明のペプチドまたは誘導体を利用するこ ともまた、本発明の範囲内である。本発明のペプチドまたは誘導体を提供できる限り 、ポリペプチドのアミノ酸残基数およびアミノ酸配列は任意である。
[0023] 本発明のペプチドおよび誘導体は、 HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌 細胞を傷害する CTLを効率的に誘導し増殖させることができる。即ち本発明のぺプ チドおよび誘導体は、前立腺癌反応性 CTLを誘導するため、および前立腺癌に対す る医薬組成物を製造するためなどに使用することができ、前立腺癌の処置または予 防において有用である。
[0024] 本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドまたは誘導体を 1または 2種類以上含 有し、その含有ペプチドまたは誘導体に特異的な前立腺癌反応性 CTLを誘導するこ とにより治療効果を発揮する。本発明の医薬組成物は、癌ワクチンとして使用するこ とができる。癌患者の CTLは相異なる癌抗原ペプチドを認識する細胞の集合なので 、複数種類のペプチドおよび/または誘導体を組み合わせて使用するとさらに効果 的である。本発明のペプチド以外の癌抗原ペプチドと組み合わせても良い。本発明 の医薬組成物は、免疫応答が効果的に成立するように、従来からワクチン投与に用 いられることが知られているアジュバントとともに投与することもできる。また、リポソ一 ム製剤、直径数 mのビーズに結合させた粒子状製剤、リピッドを結合させた製剤な どにしてもよい。
[0025] 投与方法は、例えば皮内投与または皮下投与などである。投与量は、疾患の状態
、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常医薬組成物中 の本発明のペプチドまたは誘導体の量として 0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.0001 mg〜100mg、より好ましくは 0.001mg〜10mgである。これを数日、数週または数ケ月 に 1回、 1〜3年間継続して投与することが好ましい。
[0026] 本発明の核酸分子は、本発明のペプチドまたは誘導体を提供できるものである。本 発明の核酸分子を含むベクターを抗原提示細胞に導入し発現させると、本発明のぺ プチドまたは誘導体が産生され、 HLA分子と複合体を形成して細胞表面に提示され る。この抗原提示細胞はペプチド特異的前立腺癌反応性 CTLを効率的に増殖させ ること力 Sでさる。
[0027] 本発明のベクターは、患者に投与して患者体内で本発明のペプチドまたは誘導体 を発現させるために使用できる。また、本発明のベクターを体外で適当な細胞、例え ば患者由来の樹状細胞に導入した後に、その細胞を患者体内に戻しても良い。これ らの方法は当業界において周知である(Hrouda D, Dalgleish AG. Gene therapy for prostate cancer. Gene Ther 3: 845-52, 1996)。
[0028] 本発明のベクターとしては、各種プラスミドおよびウィルスベクター、例えばアデノウ ィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウイルス、ワクシニアウィルス等が挙げられる(Liu M , Acres B, Balloul jM, Bizouarne N, Paul S, MOS P, ^quioan P. Gene-based vaccine s and immunotherapeutics . Proc Natl Acad Sci U S A 101 Suppl, 14567-71, 2004)。 ベクターの調製方法は当業界にて周知である(Molecular Cloning: A laboraroy manu al, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory)。
[0029] 本発明のベクターを前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物として患者 に投与する場合、その投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により変 化するが、 DNA含量として 0.1 μ g〜100mg、好ましくは 1 μ g〜50mgである。投与方法 には、静脈注射、皮下投与、皮内投与等が挙げられる。
[0030] 本発明の CTL誘導方法は、 HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌細胞を傷 害する CTLを提供するものである。本発明において「前立腺癌反応性」とは、前立腺 癌細胞上の癌抗原ペプチドと HLA分子との複合体を認識し、その細胞を傷害しうる 性質を有することを意味する。 CTLの誘導は、例えば、 HLA-A3スーパータイプァレ
ル陽性前立腺癌患者から採取された PBMCを、 in vitroで本発明のペプチドまたは誘 導体の存在下培養することにより行う。本発明の方法により誘導される CTLは、養子 免疫療法、すなわち PBMCを採取した患者体内に誘導した CTLを戻して癌細胞を傷 害する癌治療法に有用である。つまり本発明の方法により誘導される CTLは、前立腺 癌を処置または予防するための医薬として使用可能である。
[0031] 本発明の CTL誘導キットは、前記 CTL誘導方法を実施するために用いられる。本発 明のキットは、本発明のペプチドまたは誘導体を 1または 2種類以上含み、さらに適 当な緩衝液や培地などを含んでもょレ、。
[0032] 本発明の抗原提示細胞調製方法は、 HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌 細胞を傷害する CTLを誘導するための抗原提示細胞を提供するものである。抗原提 示細胞の調製は、例えば、 HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者由来の 抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチドまたは誘導体をノ ルスして取り込ませ る力、、あるいはそのような細胞に本発明のベクターを周知の方法により導入し発現さ せることにより行う。抗原提示能を有する細胞は例えば樹状細胞であり、患者より採 取された PBMCから培養プレート接着細胞を分離し、 IL-4および GM-CSFの存在下 で約 1週間培養することにより調製することができる。本発明の方法により調製された 抗原提示細胞は、その細胞表面に提示するペプチドまたは誘導体と HLA分子との複 合体を特異的に認識する CTLを誘導することができ、患者に投与されると患者体内 で前立腺癌反応性 CTLの誘導を促進することができる。つまり本発明の方法により調 製される抗原提示細胞は、前立腺癌を処置または予防するための医薬として使用可 能である。
[0033] 本発明の抗原提示細胞調製キットは、前記抗原提示細胞調製方法を行うために用 いられる。本発明のキットは、本発明のペプチドまたは誘導体を 1または 2種類以上 含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含むこともできる。
[0034] 本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する力 本発明はいかなる意味に おいてもこれら実施例により制限されるものではない。
実施例
[0035] 1.方法
1.1患者
HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者および健常人 (HD)より事前の文 書による承諾を得て PBMCを採取した。患者には、 HLA-A11陽性、 -A31陽性、およ び- A33陽性患者が含まれた。 HLA-A3陽性または- A68.1陽性患者は日本人におい ては極めて頻度が低いため(1.6%および 0.5%) (Aizawa M. The Proceedings of the 3ra Asia-Oceania Histocompaatioility Workshop Conference, pp. 1090—1103. uxror d: Oxford University Press, 1986·)、それら由来の PBMCは入手できなかった。 PBM Cを採取した患者はいずれも HIV非感染であった。末梢血 20mlを採取し、フイコール' コンレイ比重遠心法により PBMCを調製した。試料は全て実験で使用するまで低温に て保存した。 PBMC上の HLA-A11、 -A31および- A33分子の発現は、以下の抗体を 用いてフローサイトメトリーにより確認した:抗 HLA-A11モノクローナル抗体(mAb) (C at # 0284HA; One Lambda Inc., Canoga, CA, USA);抗 HLA- A31 mAb (Cat # 0273 HA; One Lambda) ;抗 HLA- A33 mAb (Cat # 0612HA; One Lambda);および FITC結 合抗マウスィムノグロブリン G (IgG) mAb。なお、本試験開始に当たっては、久留米大 学の医療に関する倫理委員会の承認を得て行った。
1.2ペプチド特異的 IgGの検出
血漿中の SART3由来ペプチド特異的 IgGのレベルは、 Luminex (商標)法により既報 のように測定した(Komatsu N, Shichijo S, Nakagawa M, Itoh Κ·, Scand J Clin Invest 2004;64: 1-11·)。詳細には、希釈血清(100 L)を、 SART3由来ペプチドをコートした カラーコードビーズ(Luminex Corp (Austin, TX, USA) (5 μ 1)と、 96ゥエルフィルター プレート(MABVN1250, Millipore Corp., Bedford, MA, USA)においてプレートシエ一 カー上にて室温で 2時間インキュベートした。 2時間後、プレートを T-PBSにて洗浄し、 ビォチン化ャギ抗ヒト IgG (BA-3080(VECTOR LAB, CA, USA) (100 1)と 1時間室温 で反応させた。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン標識 PE ( 100 し) (S-866,Invitrog en Detection Technologies, Eugene, Oregon, USA)を加え、 30分間室温で反応させ た。結合したビーズを 4回洗浄し、続いて Tween-PBS dOO l)を各ゥエルに添加した 。 50 1の試料を Luminex (商標)法による測定に用いた。 SART3由来ペプチドに対す る IgGの特異性を確認するため、試料血清を対応 SART3由来ペプチドまたは対照の
HIV由来ペプチドをコートしたプレートにおいて培養した。その後、得られた上清の対 応 SART3由来ペプチドに特異的な IgGのレベルを Luminex (商標)法により測定した。
[0037] 1.3細胞株およびフローサイトメトリー
C1R_A11、 -A31および -A33は、それぞれ HLA-A1101、 -A3101および -A3303遺伝 子を安定に発現する C1R亜細胞株である。これら亜細胞株上の HLA-A11、 -A31およ び- A33分子の発現は以前に報告している(Takedatsu H, Shichijo S, Katagiri K, Saw amizu H, Sata M, Itoh Κ·, Clin Cancer Res 2004;10: 1112-1120·)。 PC3、 PC- 93、お よび LNCaPは、前立腺癌細胞株であり、 KE4は食道癌細胞株である。 HLA_A11、 -A 31および- A33分子をそれぞれ発現する LNCaP亜細胞株を製造するため、 HLA-A11 01、 -A3101または- A3303プラスミド cDNAを真核細胞発現ベクターである pCR3.1 (Inv itrogen, Carlsbad, CA, USA)に揷入し、ジーン'パノレサ一(Bio RAD, Richmond, CA, USA)を用いてエレクト口ポレーシヨンを行った。 LNCaP_Al l、 -A31および -A33が、 それぞれ HLA-A1101、 -A3101および- A3303遺伝子を安定に発現する亜細胞株で ある(図 1)。これら細胞株は全て 10%FCS含有 RPMI 1640 (Invitrogen)で培養した。
[0038] 1.4 RT-PCR
癌細胞株の全 RNAは、 RNAzol (商標) B (Tel-Test Inc., Friendswood, TX, USA)を 用いて単離した。 cDNAを、 Superscript (商標) Preamplification System for First- Stra nd cDNA Synthesis (Invitrogen)を用いて調製し、以下のプライマーを用いて増幅した : SART3: 5 ' -AAGTACGCCAACATGTGGC-3 ' (センス、配列番号 34)、 5,- CTCTG CTCATTGACACGAGC-3 ' (アンチセンス、配列番号 35) ); βァクチン: 5, -CTTCG CGGGCGATGC-3' (センス、配列番号 36)、 5, -CGTACATGGCTGGGGTGTTG-3 ' (アンチセンス、配列番号 37)。 PCRは、 TaqDNAポリメラーゼを用いて、 DNAサーマ ノレサイクラ一(iCycler, Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA)において 95。C1分、 60°C1分、 72°C1分、 30サイクルにて行った。 PCR産物は、 2%ァガロースゲルにおける 電気泳動により分離した。
[0039] 1.5ペプチド
表 1に示す SART3由来ペプチドはすべて、 HLA-A3スーパータイプアレル分子に対 する結合モチーフに基づき調製した(Parker C, Bednarek MA, Coligan JE., J Immu
nol 1994;152:163-175. )0インフルエンザ (Flu)ウィルス由来ペプチド、ェプスタイン' バー.ウィルス(EBV)由来ペプチド、チロシナーゼ関連タンパク 2 (TRP2)由来ぺプチ ド、および HIV由来ペプチドを、 HLA-A3スーパータイプアレルに対する結合のコント ロールとして使用した。ペプチドは全て Biologica Co. (Nagoya, Japan)より購入し、ジメ チルスルホキシドを用いて 10 H g/mlの用量で溶解した。
[表 1]
??? f,.
33-41 TRR VLSR Q.O
-\n RLEGELTKV 2.7
127-135 ELTKVRMA 27.0
158-166 S AQDGLDR 15.0
G .ALWEAYR 9.0 LEKVHSL R 2
301-309 ALLQAEAPR 9.0
CLVPDLW! 9.0
364-273 VI,SVHNRAiR 9.0
396-405 HQV1SVTFF. Q.O
QVISVTi' K 0.0
455-463 YL QEVF.ER y.o
472- !VIMQNWA . Q.O
4,4-493 RLCNNM<) A 2.7
EL.WDSIMTR 27.0 WLEYY LEi 9.0 IU.ARVNEpR 2.7 AL K I 9.0 SMQEPDT LR 15.0
734-742 QiRPIPSNR 15.0
759-769 ALQALE DR 9.0
EMDRKSVEGR 45.0 RLVT RAOK 0.1)
872- SSI VAISNPPQR 45
KVPEKFET 4.5 M. QTYGAR 9.0
910-91 TQLSLLP Q.O
914-922 SLL AI.Q 9.0
M ADFA D.O
1VTDFSVIK 0.5
NVKNLYE V 0.5
T .P2 LLGPORPYR 9.0 a:結 スコアは、 HLAクラス】分子からの解離予測半減期に基づき計算した。
('ノ 31ブサイト; Bioinfomiaics and M !ecular Analysts Section, Cotwtttalsonal Bioscience m<5 Er
Division of Con¾>uti^ eseach & eehno!o vT NIH)
HIV由来べブチドは 11個のアミノ纖によ 構成されるため計算していない。
b:そのペプチドが免疫原性を することが ¾前に報告されている HLAクラス!アレルを示す u
1.6 PBMCからのペプチド特異的 CTLの誘導
ペプチド反応性 CTLは既報の方法に一部変更を加えて検出した(Hida N, Maeda Y, Katagiri Κ, TaKasu Η, Harada Μ, Itoh Κ·, Cancer Immunol Immunother 2002;51: 219-28 U底 96ウェルマイク口カルチャープレート(Nunc, Roskilde, Denmark)にお いて培養液 200 μΐ中で、 PBMC(1 X 105細胞/ゥエル)を各ペプチド(10 μ 1/ml)と 4ゥ
エルー組にてインキュベートした。本培養液は 45% RPMI 1640、 45% AIM-V培地(Gib co-BRL, Gaithersburg, MD)、 10% FCS、 100 U/mlインターロイキン- 2 (IL- 2)および 0 . ImM MEM非必須アミノ酸溶液(Gibco_BRL)より構成された。 3または 4日毎に培養 液の半分を除去して対応ペプチド(20 g/ml)および IL-2 (100 U/ml)を含む新しい 培養液と交換した。培養 15日目に、培養細胞を 4つのゥエルに分けた。 2つのウエノレ は対応ペプチドをパルスした C1R_A11、 -A31または- A33細胞について使用し、他の 2つのゥエルは HIVペプチドをパルスした C1R_A11、 -A31または- A33細胞と培養した 。 18時間インキュベートした後上清を回収し、 IFN- γのレベルを酵素結合免疫測定 法 (ELISA)により測定した。ペプチド反応性 CTLの誘導は、両側スチューデント t検定 により ρ< 0·05であり、かつ HIVペプチドをパルスした細胞と比較して対応ペプチドを パルスした細胞に応答して 100 pg/mlを超えるインターフェロン(IFN) - yが産生され た場合に陽性と判断した。
[0041] 1.7細胞傷害活性の測定
LNCaP、 LNCaP_Al l、 LNCaP_A31または LNCaP_A33に対するペプチド刺激 PBM Cの細胞傷害活性は、標準的 6時間51 Cr放出測定法により測定した。フイトへマグノレ チュン (PHA)活性化 T細胞を陰性対照細胞として使用した。丸底 96ゥエルプレートに お!/、て各ゥヱルにっき 2000個の51 Cr標識細胞を、示したエフェクター細胞/標的細 胞の比率でエフェクター細胞とともに培養した。特異的51 Cr放出は、以下の式により 計算した:特異的溶解 (%) = (被験試料の放出 自然放出) / (最大放出 自然放 出)。エフェクター細胞なしで51 Cr標識細胞をインキュベートした場合の上清中の51 Cr 量が自然放出であり、 51Cr標識細胞を 1% Triton X (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)とインキュベートした場合の上清中の51 Cr量が最大放出である。
[0042] 1.8コールド標的細胞阻害実験
ペプチド反応性 CTLの特異性は、コールド標的細胞による阻害実験により確認した 。実験直前に、 CD8陽性 T細胞を CD8 Positive Isolation Kit (Dynal, Oslo, Norway) により単離した。詳細には、精製した CD8陽性 T細胞(2 X 104細胞/ゥエル)を、丸底 96ゥエルプレートにおいて、コールド標的細胞(4 X 104細胞)の存在下、 51Cr標識標 的細胞(2 X 103細胞/ゥエル)とともに培養した。対応 SART3ペプチドまた HIVぺプチ
ドのいずれかで事前にパルスした C 1R_A11、 -A31および- A33をコールド標的細胞と して使用した。
[0043] 1.9統計
データの統計学的有意差は、両側スチューデント t検定により決定した。 0.05未満の P値を統計学的に有意であると判断した。
[0044] 2.結果
2. 1前立腺癌患者血漿中の SART3由来ペプチド反応性 IgGの測定
はじめに、 HLA-A3スーパータイプアレルに対する結合モチーフに基づき、 29個の SART-3由来ペプチドを調製した(表 1)。 HLA-A3および HLA-A68分子も HLA-A3ス 一パータイプアレルに属するが(Sette A, Sidney J. , Immunogenetics 1999;50:201-21 2.)、それらは日本人では極めて稀なことから、 HLA-A11、 -A31、および- A33分子に 対する結合能を優先的に検討した。本研究の目的は、 HLA-A3スーパータイプ陽性 前立腺癌患者において癌反応性 CTLを誘導する能力を有するペプチドを同定する ことである力 本発明者らは以前、 CTL誘導ペプチドに反応する IgGが各種の癌の患 者の血漿中から検出されることを観察している(Nakatsura T, Senju S, Ito M, Nishimu ra Y, Itoh Κ·, Eur J Immunol 2002;32:826-836. ; Ohkouchi S, Yamada A, Imai N, Mi ne t, Harada , Shichijo S, Maeda Y, Saijo Y, Nukiwa T, Itoh . , Tissue Antigens 2 002;59:259-272.) oさらに、前立腺癌患者から得られる PBMC数が限られることから、 その PBMCからペプチド特異的 CTLを誘導する能力について個々のペプチドを試験 するには、 29個のペプチドは数が多すぎた。したがってまず、これらペプチド候補を 前立腺癌患者の IgGに認識される能力に基づきスクリーニングした。
[0045] その結果、 SART3 (配列番号 6)、 SART3 (配列番号 16)、 SART3 (
243-252 511-519 734-742 配列番号 20)、 SART3 (配列番号 23) または SART3 (配列番号 27)ぺプ
831-839 、 910-918
チドに反応する IgG力 20人の前立腺癌患者のうちそれぞれ、 5、 7、 13、 5、および 5人 の血漿で検出された(表 2)。これら 5種類の SART3由来ペプチドに反応する IgGは、 2 0人の HDのうちそれぞれ、 2、 2、 8、 1、および 4人の血漿においても検出された(デー タ非提示)。これら 5種類に対する SART3由来ペプチド反応性 IgGは、 HDよりも前立腺 癌患者の血漿において検出頻度が高力、つた。他の 24個の SART3由来ペプチドに反
0064
きるかについて調べた。 In vitroにおいて、各 SART3由来ペプチドまたは対照ぺプチ ドにて PBMCを刺激し、刺激後の細胞が対応ペプチドをノルスした C1R_A11、 C1R-A 31、または C1R-A33細胞に応答して IFN- γを産生するかを調べた。
15人の HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者 (各アレルにつき 5人)の代 表的結果を表 3に示す。ペプチド特異的 CTLの誘導は、 p< 0.05で、かつ対照の HIV ペプチドによる IFN- γ産生との差が 100 pg/mlを超える場合に成功と判断した。その 結果、 SART3 (配列番号 6)、 SART3 (配列番号 16)、 SART3 (配列
243-252 511-519 734-742 番号 20)、 SART3 (配列番号 23) および SART3 (配列番号 27)ペプチド
831-839 、 910-918
により、 15人の HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者のうちそれぞれ、 0、 11、 6、 3、および 5人の PBMCから対応ペプチド反応性 CTLが誘導された。これら 5種 類の SART3由来ペプチドはまた、 15人の HLA-A3スーパータイプアレル陽性 HDのう ちそれぞれ、 1、 6、 3、 1、および 3人の PBMCからペプチド反応性 CTLを誘導した(デ ータ非提示)。
[表 3]
#i*¾ 16ffl b VHHffi c¾ lΘ 01 e Ί10-- ,
[0048] この結果は、これら 5種類の SART3由来ペプチドのうち SART3 (配列番号 16)
511-519
および SART3 (配列番号 20)ペプチドが特に、 HLA- A3スーパータイプアレル
734-742
陽性前立腺癌患者の PBMCにおいてペプチド特異的 CTLを誘導するためのぺプチ ドとして好適であることを示す。
[0049] 2.3 HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者の PBMCからの前立腺癌反応
性 CTLの誘導
次に、 SART3 (配列番号 16)および SART3 (配列番号 20)ペプチドによ
511-519 734-742
る in vitro刺激により誘導される CTLが前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を示す かについて調べた。細胞傷害活性試験に先立ち、前立腺癌細胞株における SART3 遺伝子の発現を RT-PCRに基づく方法により調べた(図 1A)。 SART3 mRNAの発現 は、 KE4食道癌細胞株(腫瘍浸潤 T細胞により SART3が同定された細胞 (Yang D, Na kao M, ^nicmjo Sasatomi Ί, Takasu H, Matsumoto H, Mori , Hayanshi A, Yama na H, Shirouzu K, Itoh Κ·, Cancer Res 1999;59:4056-4063.) )にお!/、てはっきりと検 出された。前立腺癌細胞株である PC3、 PC93、および LNCaPもまた SART3 mRNAを 発現していた。さらに、 HLA-A3スーパータイプアレル拘束性細胞傷害活性能を明ら かにするため、 HLA-A11、 -A31、および- A33分子のそれぞれを発現する LNCaPトラ ンスフエタタントを作成した(図 1B)。
[0050] In vitroにおいて HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者由来の PBMCを SART3 および SART3 ペプチドのいずれかにて刺激し、それにより誘導さ
511-519 734-742
れたペプチド反応性 CTLが LNCaPトランスフエクタントに対して細胞傷害活性を示す ことができるかを調べた(図 2A、図 2B)。 In vitroで SART3 (配列番号 16)および
511-519
SART3 (配列番号 20)のそれぞれにて刺激した HLA-A11陽性患者(Pt. 1、 2、 5
734-742
、および 17)由来の PBMCは、 LNCaP細胞および HLA-A11陽性幼弱化 T細胞に対し てよりも LNCaP-Al l細胞に対して高いレベルの細胞傷害活性を示した。同様に、こ れらペプチドは、 HLA-A31陽性患者および HLA-A33陽性患者の PBMCから LNCaPト ランスフエクタント反応性 CTLを誘導する能力を有していた。つまり、これらペプチド反 応性 CTLは、 LNCaP_A31細胞および LNCaP_A33細胞に対して LNCaP細胞または幼 弱化 T細胞に対してよりも高いレベルの細胞傷害活性を示した。
[0051] これらの結果は、 In vitroにおいて SART3 (配列番号 16)または SART3 (
511-519 734-742 配列番号 20)ペプチドにて刺激された PBMCは、前立腺癌細胞に対して HLA-A11、
-A31、または- A33拘束性に細胞傷害活性を発揮することを示す。
2.4ペプチド特異的 CD8陽性 T細胞に依存する前立腺癌細胞に対する細胞傷害活 性
さらに、ペプチド刺激 PBMCの細胞傷害活性に関与する細胞のタイプの同定を試 みた。精製した CD8陽性 T細胞を以下の実験に使用した。
[0053] 図 3Aおよび図 3Bに示すように、 SART3 (配列番号 16)および SART3 (
511-519 734-742 配列番号 20)ペプチドで刺激した HLA-A11、 HLA-A31、および HLA-A33陽性患者 由来の PBMCの、 LNCaP_Al l、 LNCaP_A31、および LNCaP_A33に対する細胞傷害 活性は、対応ペプチドをパルスした非標識の C1R_A11、 C1R_A31、および C1R-A33 細胞の添加によって有意に抑制された力 HIVペプチドをパルスした非標識の C1R- Al l、 C1R_A31、および C1R-A33細胞によっては抑制されなかった。
[0054] このコールド阻害実験の結果は、ペプチド刺激 PBMCの LNCaPトランスフエクタント に対する細胞傷害活性がペプチド特異的 CD8陽性 T細胞による可能性が高いこと示 す。
[0055] 3.まとめ
以上の結果は、本発明の SART3由来ペプチドが HLA-A3スーパータイプアレル陽 性前立腺癌患者において前立腺癌反応性 CTLを誘導でき、特異的免疫療法、特に 癌ワクチン療法に有用であることを示す。
Claims
[1] 配列番号 16または 20に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
[2] 配列番号 16または 20に示すアミノ酸配列からなるペプチドを含む医薬組成物。
[3] 医薬組成物が癌ワクチンである請求項 2記載の医薬組成物。
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