WO2007144985A1 - Ｒｐｎ２遺伝子発現抑制剤の用途 - Google Patents

Ｒｐｎ２遺伝子発現抑制剤の用途 Download PDF

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cancer
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Takahiro Ochiya
Kikuya Kato
Kimi Honma
Yasuji Ueda
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Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.
Koken Co., Ltd.
Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to the use of an RPN2 gene expression inhibitor, that is, a cancer cell proliferation inhibitor, an anticancer agent containing this cancer cell proliferation inhibitor, and a method of using the RPN2 gene expression inhibitor.
  • Taxanes are one of the anticancer drugs used for the treatment of breast cancer, lung cancer, stomach cancer, etc.
  • docetaxel is the most effective anticancer for the treatment of cancer, especially breast cancer.
  • Non-patent document 2 It is used as a neoadjuvant because administration of docetaxel before surgery can reduce tumor size and increase the success rate of surgery.
  • Taxanes such as docetaxel act by inhibiting microtubule dynamics, thereby arresting cells in the M phase of cell division and subsequently activating the apoptotic program Have been reported (Non-Patent Documents 2 to 5).
  • Non-Patent Document 1 Heys, S. D. et al., Clinical breast cancer, 2002, Suppl 2, p. S 69-74
  • Non-Patent Document 2 Jordan, M.A., et al., Current medicinal chemistry. Ant i-cancer agents, 2002, Vol. 2, p.1-17
  • Non-Patent Document 3 Rao, S. et al., Journal of the National Cancer Institute, 199
  • Non-Patent Document 4 Schiff, PB et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1980, Vol. 77, p.1561-1565
  • Non-Patent Document 5 Stein, CA, Seminars in oncology, 1999 26, p.3-7 Disclosure of the Invention [0004]
  • taxanes are very effective anticancer agents, it is known that about half of breast cancer patients do not respond to chemotherapy with taxanes and only cause side effects by administration. .
  • responsiveness samples genes derived from breast cancer
  • non-responsive samples samples derived from breast cancer
  • the present invention provides the following (1) to (1 3).
  • a cancer cell growth inhibitor comprising an RPN 2 gene expression inhibitor
  • a cancer cell growth inhibitor comprising an RPN 2 gene expression inhibitor and a drug exhibiting anticancer activity
  • cancer cell proliferation inhibitor according to (1) or (2), wherein the cancer cell proliferation inhibitor further comprises attestinal collagen;
  • the agent for inhibiting cancer cell proliferation according to (2) which exhibits an anticancer activity A cancer cell growth inhibitor, wherein the agent is at least one selected from platinum preparations;
  • An anticancer agent comprising the cancer cell proliferation inhibitor according to any one of (1) to (9);
  • RPN 2 gene expression inhibitor used as an anti-cancer agent in combination with an anti-cancer drug
  • FIG. 1 is a graph showing the cell growth inhibition rate of the corresponding gene by introduction of siRNA targeting each gene shown in Table 1 in non-drug-responsive cells.
  • FIG. 2 is a graph showing the apoptosis induction rate of the corresponding gene by introduction of si RNA targeting each gene shown in Table 1 in drug non-responsive cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the proportion of apoptotic cells induced by si RNA.
  • FIG. 4 is a view of apoptotic cells observed by Hoechst staining of cell nuclei.
  • FIG. 5 is a graph showing the expression level of RPN 2 gene suppressed by si RNA.
  • FIG. 6 shows a protocol for tumor growth test in nude mice.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of the test performed in FIG.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of an RPN 2 gene expression suppression test in nude mice.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of an RPN2 gene expression suppression test in nude mice.
  • FIG. 10 shows the results of an apoptosis induction test in nude mice.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of an RPN2 gene expression suppression test in the absence of a drug.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of an RPN2 gene expression suppression test in cancer cells that are non-responsive to other drugs.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of a RP N 2 gene expression suppression test in human liver cancer cells. Five tests were conducted and the average was taken.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of a RP N 2 gene expression suppression test in human colon cancer cells using dsRNA having various sequences.
  • the drug When the present inventors act on at least one drug selected from taxanes such as docetaxel and paclitaxel on cancerous cells collected from cancer patients, the drug responds to the drug. It has been confirmed that it is divided into cancerous cells that show sex and cancerous cells that do not show sex. In addition, when gene expression changes were examined in cancerous cells that did not respond to this drug, an increase in the expression level of various genes including the RPN2 gene was observed.
  • taxanes such as docetaxel and paclitaxel
  • the present invention includes an RPN 2 gene expression inhibitor, or an RPN 2 gene expression inhibitor and a cancer cell proliferation inhibitor comprising an agent having an anticancer activity as described above. Is to provide.
  • drugs showing anti-cancer activity include not only microtubule-acting drugs such as taxanes, but also antimetabolites, DNA alkylating agents, DNA binding agents (platinum preparations), anti-cancer antibiotics.
  • examples include substances. Specifically, amrubicin hydrochloride, irinocan hydrochloride, ifosfamide, etoposide, gefitinib, cyclophosphamide, cisplatin, trastuzumab, 5_fluoracil, mitomycin C, imatinib mesylate, methotrexate, rituximab, ad Etc.
  • these anticancer agents may be used alone or in combination of two or more.
  • examples of applicable cancer cells include a wide variety of cancer cells such as breast cancer cells, gastric cancer cells, colon cancer cells, lung cancer cells, prostate cancer cells, and blood cell cancer cells.
  • RPN 2 ribophorin II
  • STTT 3 the subunit consisting of STTT 3 is essential for the activity of this enzyme, but the function of RPN 2 has not been clarified.
  • the RPN 2 gene is a gene encoding this RPN 2 subunit and has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the RPN 2 gene expression inhibitor is an agent that suppresses the expression of the RPN 2 gene, and is a low molecular compound, for example, a low molecular compound that suppresses the expression of the RPN 2 gene due to RNA interference.
  • RNA interference refers to a phenomenon in which gene expression is suppressed in a sequence-specific manner by a small non-coding double-stranded (ds) RNA molecule.
  • ds double-stranded
  • si small i Interfering
  • Target mRNA cleavage by RNA gene silencing via heterochromatinization of target 0A region by si, translational suppression by mi (micro) RNA, transcriptional suppression, mRNA degradation, etc.
  • siRNA is preferably used in the embodiment of the present invention from the viewpoint that the sequence can be designed based on the sequence of the target gene RPN2 gene and can be artificially synthesized.
  • a low molecular weight compound used as an RPN 2 gene expression inhibitor is an siRNA having a sequence corresponding to a predetermined sequence of the RPN 2 gene, that is, a sequence corresponding to a part of the target mRNA. Preferably there is.
  • the sequence number 1 to the sense strand is compared to the sequence from 1 94th to 1 21 2nd in the RPN 2 gene sequence shown in SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 2).
  • Examples include dsRNA consisting of 3 RNA and the RNA of SEQ ID NO: 4 serving as an antisense strand. In this d sRNA, there is a 2-base overhang at the 3 'end of each strand, so the double-stranded portion is 19 bases long.
  • Such siRNA is chemically synthesized, and is subjected to a condensation reaction one by one from the 3 ′ end to the 5 ′ end by the phosphoramidite method used in, for example, DNA chemical synthesis. Is obtained. However, in order to prevent degradation by RNase during the synthesis process, the hydroxyl group at the 2 ′ end of each liponucleotide is protected.
  • This protecting group includes 2'-0-t-butyldimethylsi lyl (2 '-tBD MS) group, 2' -0-tr ii sopropy I si I y I oxymethy I (2, -TOM) group, 5 '- si lyl-2'-acet oxyethoxy (2, -ACE) group.
  • the cleavage of the target mRNA by siRNA may proceed by the following reaction mechanism.
  • siRNA duplex is taken up by and bound to the intracellular protein complex RISC (RNA-induced Silencing Complex), and the sense strand is released. Subsequently, the target mRNA is incorporated into RISC, and the antisense strand force bound to RISC recognizes and binds to the complementary sequence of the mRNA. In addition, antisense MRNA force bound to the strand is cleaved specifically.
  • RISC RNA-induced Silencing Complex
  • an antisense method in which a complementary antisense strand is bound to mRNA to inhibit translation into protein.
  • Nucleic acids have a problem that their activity is weak because they may not be able to bind effectively to the target site due to the influence of the higher-order structure of mRNA.
  • mi RNA is a low molecular RNA that does not encode a protein, and it is known that hundreds of types exist on the genome. mi RNA is transcribed as nucleotides of hundreds to thousands of bases and then processed, and finally becomes dimer nucleotides of 19 to 24 bases, and mRNA having a base sequence complementary to this mi RNA Suppresses gene expression by suppressing translation of mRNA, degradation of mRNA, and regulation of transcription. Since it is known that the expression of RPN 2 is also controlled by multiple miRNAs, it is possible to suppress RPN2 gene expression by artificially synthesizing and using such miRNAs. .
  • RNA sequences that may suppress the expression of the RPN2 gene can be searched by public databases (eg, TargetScan ReI ease 3.1).
  • the present invention provides a drug delivery system for a cancer cell growth inhibitor. That is, the aforementioned cancer cell proliferation inhibitor further includes atelocollagen.
  • atelocollagen refers to enzyme-solubilized collagen and modified products thereof.
  • the modified product a side chain amino group, a chemical modification of a carboxyl group, or a chemical ⁇ physical cross-linked product can be used.
  • any collagen derived from mammals such as horsetail, pigs, horses, humans, birds, and fish can be used, but the thermal stability does not change with the temperature of the environment in which it is used. It is desirable to have.
  • collagen derived from mammals, birds, or production from cultured cells, or their genetic recombination can be used. There are no particular restrictions on the type of collagen. Forces I, II, III, etc. can be used because of their availability.
  • the cancer cell growth inhibitor can be efficiently delivered to the target cells, and can be efficiently taken up by the cells.
  • the present invention provides the use of the aforementioned RPN2 gene expression inhibitor.
  • the RPN2 gene expression inhibitor can be administered to cancer patients together with atelocollagen as needed, and used as an anticancer agent that promotes apoptosis of cancerous cells.
  • it can be administered to cancer patients together with a drug exhibiting an anticancer action and, if necessary, with atelocollagen, and can be used as an anticancer agent that promotes apoptosis of cancerous cells.
  • the effect of RPN 2 gene expression inhibitor on cells is not limited to the promotion of apoptosis. If it can ultimately induce cell death or suppress cell proliferation, it can be used as a cancer cell growth inhibitor. Useful.
  • the present invention provides a method for using an RPN 2 gene expression inhibitor as an anticancer agent, and a method for using an RPN 2 gene expression inhibitor as an anticancer agent in combination with a drug exhibiting an anticancer activity. To do. From a further viewpoint, the present invention provides an anticancer agent comprising the aforementioned cancer cell proliferation inhibitor.
  • the amount of RPN 2 gene expression inhibitor, drug, and atherocollagen used varies depending on the administration method, tumor type, and size.
  • RPN 2 gene expression inhibitor For administration, 1 nmo I kg or more and 10 nmo I kg or less is desirable.
  • For systemic administration 2 nmo I / kg or more and 50 nmo I kg or less are desirable.
  • drugs it is desirable to determine the amount of drug used based on the amount used when each drug is used alone.
  • the concentration of atelocollagen is, for example, local ImgZm l (wZv o I) or more is 5 OmgZm I (wZv ol) or less for systemic administration, and 0. I mgZm l (wZ vo I) or more and 30 mg I (w / vol) or less is recommended for systemic administration.
  • 5 m I or more and 100 m I or less is recommended for local administration, and 10 m I or more and 50 Om I or less is recommended for systemic administration.
  • RPN 2 gene expression inhibitor is used in combination with a drug exhibiting an anti-cancer action as necessary to promote cell death by a mechanism such as promoting apoptosis of cancerous cells. Inducing or inhibiting cell growth can result in cancer treatment.
  • a 96-well microplate was coated with a mixture of atelocollagen (manufactured by Koken Co., Ltd.) and siRNA corresponding to each gene based on the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2OO6-6262.
  • a atelocollagen cell transfection array capable of reverse transfection of siRNA was prepared.
  • the cell line MCF 7-ADR-LUC was obtained by introducing the luciferase gene (GL 3) into MCF7-ADR, which is a multidrug resistant breast cancer cell line having the breast cancer cell MC F 7 as a parent strain, and stably expressing it.
  • MCF7-ADR-LUC cells obtained in (2) were seeded in 4 ⁇ 10 3 cell wells and cultured for 3 days in the presence of 1 nM docetaxel (DOC). Luciferin was added to live cells, and the cell growth inhibition rate and luciferase siRNA introduction efficiency were measured from the luminescence value.
  • the cell growth inhibition rate was calculated with control siRNA (dsRNA consisting of the sense strand of SEQ ID NO: 5 and the antisense strand of SEQ ID NO: 6) as 100%.
  • the results are shown in Figure 1.
  • the horizontal axis corresponds to the gene number (No.) shown in Table 1.
  • FIG. 1 2 in addition to the RP N 2 gene (No. 1 2), cell amplification was suppressed by introduction of siRNA corresponding to each gene.
  • siRNA introduction efficiency is different from siRNA corresponding to each gene by luciferase siRNA (GL 3 siRNA: ds RN A comprising a sense strand of SEQ ID NO: 7 and an antisense strand of SEQ ID NO: 8 ) was evaluated based on the inhibition rate of luciferase activity.
  • Luciferase activity was measured with a luminescence plate reader (ARVO: Perkin Elma) immediately after luciferin (final concentration 0.5 mM: Promega) was added to the medium.
  • ARVO Perkin Elma
  • a reagent for measuring apoptosis was added to the plate after measuring the luciferase activity in Test Example 1, and the caspase activity was measured. That is, according to the protocol recommended by Promega (Apo-ONE Homogeneous Caspase-3 / 7 Assay), the reagent was added, and 90 minutes after the addition of the reagent, measurement was performed with a fluorescence plate reader (AR VO: Perkin Elma). The Caspase activation rate was calculated with the control siRNA as 0%.
  • Figure 4 shows the observation results of nuclear morphology by Hoechst staining.
  • Fig. 4 (a) shows the results of the system with RPN 2 si RN A
  • Fig. 4 (b) shows the results of the system with control si RN A that does not suppress the expression of any gene. Show.
  • changes in its nuclear morphology (condensation and fragmentation) suggested that apoptosis was induced when RPN 2 si RNA was introduced.
  • Test Example 5 except that MCF7-ADR-LUG cells were transplanted into the fat pad of nude mice (4 weeks old, female) and RP N 2 siRNA and DOC were administered 6 weeks later The expression level of RPN2 gene was measured in the same manner as in Test Example 5.
  • RP N 2 si RN A is administered to RP N for cisplatin-resistant PC-9 / CDDP cells, an anticancer drug.
  • the cells were cultured for 3 days in the presence or absence of cisbratin (0.3 M). Thereafter, caspase activity was measured as described in Test Example 2. For comparison, the same test was performed in a system into which a control siRNA that does not suppress the expression of any gene was introduced. The results are shown in Figure 12. According to Fig.
  • human lung cancer cell lines such as PC-14 cells, SBC-3 cells, and H69 cells, K562 cells (human leukemia cell lines) or p388 cells (mouse lymphocyte-like cell lines)
  • anti-cancer drug resistant strains such as PC-14 / CDDP, SBC-3 / CDDP, SBC-3 / ADM, H69 / CDDP, K562 / ADM, P388 / MMC are also known (here CDDP means cisbratin resistance, ADM means adriamycin resistance, and MMC means mitomycin C resistance).
  • CDDP means cisbratin resistance
  • ADM means adriamycin resistance
  • MMC means mitomycin C resistance
  • RPN2 siRNA alone showed a cancer cell proliferation inhibitory effect in HepG2 cells sensitive to D0C, and also enhanced D0C's cancer cell proliferation inhibitory effect.
  • control siRNA (a dsRNA comprising a sense strand of SEQ ID NO: 5 and an antisense strand of SEQ ID NO: 6) was introduced.
  • 10 L of living cell quantification reagent Tetrakara Ichiwan: Seikagaku Corporation
  • sequences A to L are dsRNAs consisting of the sense strand and the antisense strand shown in Table 2.
  • Sequence A (dsRN A consisting of the sense strand of SEQ ID NO: 3 and the antisense strand of SEQ ID NO: 4);
  • Sequence B (dsRNA consisting of the sense strand of SEQ ID NO: 9 and the antisense strand of SEQ ID NO: 10);
  • Sequence E dsRNA consisting of the sense strand of SEQ ID NO: 15 and the antisense strand of SEQ ID NO: 16;
  • Sequence F dsRNA consisting of the sense strand of SEQ ID NO: 17 and the antisense strand of SEQ ID NO: 18;
  • Sequence G (dsRNA consisting of the sense strand of SEQ ID NO: 19 and the antisense strand of SEQ ID NO: 20);
  • Sequence H dsRNA consisting of the sense strand of SEQ ID NO: 21 and the antisense strand of SEQ ID NO: 22;
  • Sequence I dsRNA consisting of the sense strand of SEQ ID NO: 23 and the antisense strand of SEQ ID NO: 24;
  • Sequence J (dsRNA consisting of the sense strand of SEQ ID NO: 25 and the antisense strand of SEQ ID NO: 26);
  • Sequence K (dsRNA consisting of a sense strand of SEQ ID NO: 27 and an antisense strand of SEQ ID NO: 28);

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Abstract

　本発明は、ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤を、必要に応じて抗ガン作用を示す薬剤を含み、必要に応じてアテロコラーゲンとともに投与されるガン細胞増殖抑制剤として使用する。また、このようなガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤である。

Description

明 細 書
RPN 2遺伝子発現抑制剤の用途
技術分野
[0001] 本発明は、 RP N 2遺伝子発現抑制剤の用途、 すなわちガン細胞増殖抑制 剤、 このガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤、 および RP N 2遺伝子発現抑 制剤の使用方法に関する。
背景技術
[0002] タキサン類 （ドセタキセル、 パクリタキセル） は乳ガン、 肺ガン、 胃ガン などの治療に用いられる抗ガン剤の一つであり、 例えばドセタキセルはガン 、 特に乳ガンの治療のために最も有効な抗ガン剤の一つである （非特許文献
1、 非特許文献 2) 。 外科手術前にドセタキセルを投与することで、 腫瘍サ ィズを縮小させ、 手術の成功率を高めることができることから、 ネオアジュ バント （neoadjuvant) として使用されている。
[0003] ドセタキセル等のタキサン類 （タキサン系化合物） は微小管の動態を阻害 することによって作用し、 それによつて細胞を細胞***の M期に停止させ、 続いてアポトーシスのプログラムを活性化することが報告されている （非特 許文献 2〜 5) 。
非特許文献 1 ： Heys, S. D.ら， Cl inical breast cancer, 2002， Suppl 2， p. S 69-74
非特許文献 2 : Jordan, M.A.ら， Current medicinal chemistry. Ant i -cancer agents, 2002， 第 2巻， p.1-17
非特許文献 3： Rao, S.ら， Journal of the National Cancer Institute, 199
2, 第 84巻， p.785- 788
非特許文献 4： Schiff, P. B.ら， Proceedings of the National Academy of S ciences of the United States of America, 1980， 第 77卷， p.1561-1565 非特許文献 5 : Stein, C. A.， Seminars in oncology, 1999， 第 26卷， p.3-7 発明の開示 [0004] ところで、 タキサン類は非常に有効な抗ガン剤でありながら、 乳ガン患者 の約半分はタキサン類による化学療法に応答せず、 投与による副作用を生じ るのみであることが知られている。
[0005] そこで、 本発明者等は、 治療に対する応答性を示す （タキサン類による化 学的治療が有効である） 乳ガン由来のサンプル （以下、 「応答性サンプル」 という） および応答性を示さない （タキサン類による化学的治療が無効であ る） 乳ガン由来のサンプル （以下、 「非応答性サンプル」 という） にて、 遺 伝子発現プロファイル解析を行い、 特定の遺伝子の発現が非応答性サンプル にて共通して高いことを見出し、 およびこの知見に基づき当該特定の遺伝子 の発現と化学的治療の有効性との関係について鋭意研究した結果、 本発明を 完成させるに至った。
[0006] すなわち、 本発明は、 以下の （1 ) 〜 （1 3) を提供する。
(1 ) RPN 2遺伝子発現抑制剤を含むガン細胞増殖抑制剤；
(2) RPN 2遺伝子発現抑制剤および抗ガン作用を示す薬剤を含むガン細 胞増殖抑制剤；
(3) (1 ) 項または （2) 項に記載のガン細胞増殖抑制剤において、 ァテ 口コラーゲンをさらに含むことを特徴とするガン細胞増殖抑制剤；
(4) (1 ) 項または （2) 項に記載のガン細胞増殖抑制剤において、 RP N 2遺伝子発現抑制剤が、 低分子化合物であるガン細胞増殖抑制剤；
(5) (4) 項に記載のガン細胞増殖抑制剤において、 RPN 2遺伝子発現 抑制剤が、 R N A干渉により R P N 2遺伝子の発現を抑制する低分子化合物 であるガン細胞増殖抑制剤；
(6) (5) 項に記載のガン細胞増殖抑制剤において、 低分子化合物が、 R P N 2遺伝子の所定の配列に対応する配列を有する s i RN Aであるガン細 胞增殖抑制剤；
(7) (2) 項に記載のガン細胞増殖抑制剤において、 抗ガン作用を示す薬 剤が、 タキサン類から選ばれる少なくとも一つであるガン細胞増殖抑制剤；
(8) (2) 項に記載のガン細胞増殖抑制剤において、 抗ガン作用を示す薬 剤が、 白金製剤から選ばれる少なくとも一つであるガン細胞増殖抑制剤；
(9) (1 ) 項から （8) 項のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤に おいて、 ガン細胞増殖抑制剤は、 ガン化した細胞のアポトーシスを促進する ことを特徴とするガン細胞増殖抑制剤；
(1 0) (1 ) 項から （9) 項のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤 を含む抗ガン剤；
(1 1 ) RPN 2遺伝子発現抑制剤の抗ガン剤としての使用方法；
(1 2) RPN 2遺伝子発現抑制剤の抗ガン作用を示す薬剤を併用した抗ガ ン剤としての使用方法；
(1 3) (1 1 ) 項または （1 2) 項に記載の使用方法において、 ァ亍ロコ ラーゲンをさらに併用することを特徴とする RPN 2遺伝子発現抑制剤の使 用方法。
[0007] 本発明によれば、 R P N 2遺伝子発現抑制剤の新規用途が提供される。
図面の簡単な説明
[0008] 上述した目的、 およびその他の目的、 特徴および利点は、 以下に述べる好 適な実施の形態、 およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかに なる。
[0009] [図 1]薬剤非応答性細胞における表 1に示す各遺伝子を標的とする s i RNA の導入による対応遺伝子の細胞増殖抑制率を示すグラフである。
[図 2]薬剤非応答性細胞における表 1に示す各遺伝子を標的とする s i RNA 導入による対応遺伝子のアポトーシス誘導率を示すグラフである。
[図 3] s i RNAにより誘導されたアポトーシス細胞の割合を示すグラフであ る。
[図 4]細胞核へキスト染色により、 アポトーシス細胞を観察した図である。
[図 5] s i RNAにより抑制された RPN 2遺伝子の発現量を示すグラフであ る。
[図 6]ヌードマウスにおける腫瘍増殖試験のプロトコールを示す図である。
[図 7]図 6にて行った試験の結果を示すグラフである。 [図 8]ヌードマウスにおける R P N 2遺伝子発現抑制試験の結果を示すグラフ である。
[図 9]ヌードマウスにおける R P N 2遺伝子発現抑制試験の結果を示すグラフ である。
[図 10]ヌードマウスにおけるアポトーシス誘導試験の結果を示す図である。
[図 1 1 ]薬剤の非存在下における R P N 2遺伝子発現抑制試験の結果を示すグ ラフである。
[図 1 2]他の薬剤に対して非応答性を示すガン細胞における R P N 2遺伝子発 現抑制試験の結果を示すグラフである。
[図 13]ヒト肝臓ガン細胞における R P N 2遺伝子発現抑制試験の結果を示す グラフである。 5回試験を行って、 平均をとつた。
[図 14]様々な配列の d s R N Aを用いたヒト大腸ガン細胞における R P N 2 遺伝子発現抑制試験の結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 以下、 本発明の実施形態について説明する。
本発明者らにより、 ガン患者から採取したガン化された細胞に抗ガン作用 を示す薬剤、 例えばタキサン類から選ばれる少なくとも一つ、 例えばドセタ キセル、 パクリタキセルなどを作用させると、 薬剤に対して応答性を示すガ ン化細胞と、 示さないガン化細胞とに分かれることが、 確認されている。 ま た、 この薬剤に対して応答性を示さないガン化細胞において、 遺伝子発現変 動を調べたところ、 R P N 2遺伝子をはじめとする種々の遺伝子発現レベル の上昇が見られた。
[001 1 ] そこで、 発現レベルの上昇が見られた遺伝子のサイレンシング実験を行う ことによリガン化細胞の薬剤応答性についてスクリーニングしたところ、 薬 剤応答性を示さないガン化細胞において R P N 2遺伝子発現を抑制したとき に、 これらガン化細胞において薬剤応答性が観察される、 すなわちガン化細 胞に抗ガン作用を示す薬剤によるアポトーシスが促進されるという知見を得 た。 [0012] —方、 ガン化細胞に抗ガン作用を示す薬剤を併用しなくても、 RPN 2遺 伝子発現を抑制させるだけで、 このガン化細胞のアポトーシスが促進される という知見も得られた。
[0013] そこで一つの側面から見ると、 本発明は、 RPN 2遺伝子発現抑制剤を含 み、 あるいは RPN 2遺伝子発現抑制剤および前述したような抗ガン作用を 示す薬剤を含むガン細胞増殖抑制剤を提供するものである。
[0014] ここで、 抗ガン作用を示す薬剤としては、 タキサン類等の微小管作用薬だ けでなく、 代謝拮抗剤、 DN Aアルキル化剤、 DNA結合剤 （白金製剤） 、 抗ガン性抗生物質などが挙げられる。 具体的には、 塩酸アムルビシン、 塩酸 イリノ亍カン、 ィホスフアミ ド、 エトポシド、 ゲフィ二チブ、 シクロフォス フアミ ド、 シスブラチン、 トラスッズマブ、 5_フルォロウラシル、 マイ ト マイシン C、 メシル酸ィマチニブ、 メソトレキサート、 リツキシマブ、 アド リアマイシンなどが挙げられる。 また、 これら抗ガン性を示す薬剤を、 単独 で用いてもよいし、 2種以上併用して用いてもよい。
[0015] また、 適用可能なガン細胞としては、 乳ガン細胞、 胃ガン細胞、 大腸ガン 細胞、 肺ガン細胞、 前立腺ガン細胞、 血球系ガン細胞などの多種多様なガン 細胞が挙げられる。
[0016] ここで、 RPN 2 (ribophorin II) は、 細胞内小胞に存在し、 たんぱく質 の糖鎖付加に関与する糖転移化酵素複合体の構成分子 （サブユニット） の一 つである。 この酵素の活性には、 S T T 3からなるサブユニットが必須であ ることが知られているが、 RP N 2に関しては機能が明らかにされていない 。 また、 RPN 2遺伝子とは、 この RP N 2サブユニットをコードする遺伝 子であり、 配列番号 1に示した塩基配列を有するものである。
[0017] また、 RPN 2遺伝子発現抑制剤とは、 RPN 2遺伝子の発現を抑制する 薬剤であって、 低分子化合物、 例えば R N A干渉により R P N 2遺伝子の発 現を抑制する低分子化合物である。
[0018] ここで、 RNA干渉とは、 低分子の non- coding二重鎖 （d s) RNA分子 により配列特異的に遺伝子発現を抑制する現象をいい、 例えば s i (small i interfering) R N Aによる標的 m R N Aの切断、 s i にょる標的0 A領域のへテロクロマチン化を介した遺伝子サイレンシング、 m i (micro) RNAによる翻訳抑制、 転写抑制、 mRNAの分解等を指す。
[0019] s i R N Aは、 対象遺伝子である R P N 2遺伝子の配列に基づいて配列設 計をすることができ、 人工合成可能であるという観点から、 本発明の実施形 態において好ましく用いられる。
[0020] すなわち、 R P N 2遺伝子発現抑制剤として用いられる低分子化合物が、 R P N 2遺伝子の所定の配列に対応する配列、 すなわち標的となる mRNA の一部の配列に対応する配列を有する s i RNAであることが好ましい。 こ の配列の一具体例としては、 配列番号 1に示した R P N 2遺伝子配列の中の 1 1 94番目から 1 21 2番目までの配列 （配列番号 2) に対して、 センス 鎖となる配列番号 3の RN Aおよびアンチセンス鎖となる配列番号 4の RN Aからなる d s RNAが挙げられる。 この d s RNAにおいて、 各鎖の 3 '末 端には、 2塩基のオーバーハングが存在するため、 二重鎖部分は 1 9塩基長 となる。
[0021] このような s i RNAは、 化学的に合成され、 例えば DN A化学合成でも 使用されるホスホアミダイ ト法により、 3'末端から 5'末端に向かって一塩 基ずつ順番に縮合反応させることにより得られる。 ただし、 合成過程で RN a s eによる分解を防ぐために、 個々のリポヌクレオチドの 2'末端の水酸基 を保護して行う。 この保護基としては、 2'-0-t-butyldimethylsi lyl (2' -tBD MS) 基、 2' -0-tr i i sopropy I s i I y I oxymethy I (2， -TOM) 基、 5' -si lyl-2'-acet oxyethoxy (2， -ACE) 基などが挙げられる。
[0022] ここで、 s i RNAによる標的 mRNAの切断は、 以下の反応機構で進む ことが考えられる。
s i RNA二本鎖が、 細胞内のたんぱく質複合体 R I S C (RNA- induced S i lencing Complex) に取り込まれて結合し、 センス鎖が脱離する。 続いて、 標的 mRNAが R I S Cに取り込まれ、 R I S Cに結合したアンチセンス鎖 力 当該 mRNAの相補的配列を認識して結合する。 さらに、 アンチセンス 鎖と結合した mRNA力 特異的に切断される。
[0023] 例えば、 mRNAに作用し、 遺伝子発現を抑制する方法として、 mRNA に相補的なアンチセンス鎖を結合させ、 タンパク質への翻訳を阻害するアン チセンス法が知られているが、 人工アンチセンス核酸は、 mRNAの高次構 造の影響により標的部位に有効に結合できない場合があるため活性が弱いと いう問題点があった。
[0024] —方、 s i RN Aを用いた RN A干渉の場合には、 mRNAの高次構造に 無関係に作用することで、 m R N Aの局所的な構造に依存して活性が弱くな るという問題が低減される。
[0025] また、 m i RNAは、 タンパク質をコードしない低分子 R N Aであり、 ゲ ノム上に数百種類存在することが知られている。 m i RNAは、 数百から数 千塩基のヌクレオチドとして転写された後にプロセシングを受け、 最終的に は 1 9~ 24塩基の 2量体ヌクレオチドとなり、 この m i RNAと相補的な 塩基配列を持つ m RNAの翻訳抑制や、 mRNAの分解、 転写の制御等によ り遺伝子発現を抑制する。 RPN 2も複数の m i RNAによって発現が制御 されることが知られていることから、 このような m i RNAを人工的に合成 し、 使用することにより RPN 2遺伝子発現を抑制することが可能となる。
RP N 2遺伝子の発現を抑制する可能性のある既知の m i R N Aの配列は公 開データベース （T a r g e t S c a n Re I e a s e 3. 1など） によ り検索することができる。
[0026] また、 もう一つの観点から、 本発明は、 ガン細胞増殖抑制剤のドラッグデ リバリーシステムを提供する。 すなわち、 前述したガン細胞増殖抑制剤にお いて、 ァテロコラーゲンをさらに含む。
[0027] ここで、 ァテロコラーゲンとは、 酵素可溶化コラーゲンおよびその修飾物 のことをいう。 修飾物としては、 側鎖アミノ基、 カルボキシル基の化学修飾 、 あるいは化学的■物理的架橋物を用いることができる。 また、 ゥシ、 ブタ 、 ゥマ、 ヒトなどの哺乳動物、 鳥、 魚類を由来とするいずれのコラーゲンも 用いることが可能であるが、 使用される環境の温度で変化しない熱安定性を 持つことが望ましい。 具体的には、 哺乳動物、 鳥由来のコラーゲン、 もしく は培養細胞からの産生、 またはそれらの遺伝子組み換えにより得られたコラ 一ゲンを用いることができる。 コラーゲンの型については、 特に制限はない 力 入手の容易さより I、 I I、 I I I型などを使用することができる。
[0028] このようなァテロコラーゲンの併用により、 標的となる細胞にガン細胞增 殖抑制剤を効率よく送達し、 当該細胞に効率よく取り込ませることができる
[0029] 別の観点から、 本発明は、 前述した R P N 2遺伝子発現抑制剤の用途を提 供する。
例えば、 R P N 2遺伝子発現抑制剤は、 必要に応じてァテロコラーゲンと ともに、 ガン患者に投与され、 ガン化された細胞のアポトーシスを促進させ る抗ガン剤として用いることができる。 あるいは、 ガン患者に抗ガン作用を 示す薬剤および必要に応じてァテロコラーゲンとともに投与され、 ガン化さ れた細胞のアポトーシスを促進する抗ガン剤として用いることができる。 な お、 R P N 2遺伝子発現抑制剤の細胞への作用はアポトーシスの促進に限ら れるものではなく、 最終的に細胞死を誘発したり、 細胞増殖を抑制すること ができれば、 ガン細胞増殖抑制剤として有用である。
[0030] すなわち、 本発明は、 R P N 2遺伝子発現抑制剤の抗ガン剤としての使用 方法、 および R P N 2遺伝子発現抑制剤の抗ガン作用を示す薬剤を併用した 抗ガン剤としての使用方法を提供する。 また、 さらなる観点から、 本発明は 、 前述したガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤を提供する。
[0031 ] このような用途において、 R P N 2遺伝子発現抑制剤、 薬剤、 ァテロコラ 一ゲンの使用量は、 投与方法、 腫瘍の種類、 大きさによって異なるが、 例え ば R P N 2遺伝子発現抑制剤については局所投与では 1 n m o I k g以上 1 0 n m o I k g以下、 全身投与では 2 n m o I / k g以上 5 0 n m o I k g以下が望ましい。 また、 薬剤を用いる場合には、 薬剤の使用量はそれ ぞれ薬剤単独で用いた場合の使用量を前提に定めることが望ましい。 ァテロ コラーゲンと併用する場合には、 このァテロコラーゲンの濃度は例えば局所 投与では I mgZm l (wZv o I ) 以上 5 OmgZm I (wZv o l ) 以 下、 全身投与では 0. I mgZm l ( wZ v o I ) 以上 30 m g I (w /v o l ) 以下が望ましく、 その使用量は R P N 2遺伝子発現抑制剤との混 合後、 局所投与で 5 m I以上 1 00 m I以下、 全身投与で 1 0 m I以上 50 Om I以下が望ましい。
[0032] このような用途によれば、 R P N 2遺伝子発現抑制剤を、 必要に応じて抗 ガン作用を示す薬剤と併用して、 ガン化細胞のアポトーシスを促進させる等 の機序で細胞死を誘発させ、 又は細胞増殖を抑制させることにより、 結果と してガンの治療を行うことが可能になる。
[0033] 以下に、 本発明を試験例に基づいて説明するが、 本発明はこれら試験例に 限定されることはない。
[0034] (試験例 1 ) 細胞増殖抑制試験
( 1 ) ァテロコラーゲンセルトランスフエクシヨンアレイの作製
抗ガン作用を示す薬剤としてドセタキセルを作用させて薬剤非応答性を示 した患者のガン組織において、 A T AC— PC R解析 （国際公開第 2005 003352号パンフレット） を行った結果、 発現上昇が認められた以下 の 36遺伝子について s i RN Aを合成した。
[0035]
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[0036] 続いて、 特開 2 O O 6— 6262号公報に記載の方法に基づいて、 ァテロ コラーゲン （ （株） 高研製） および各遺伝子に対応する s i RNAの混合物 を、 96穴マイクロプレートにコーティングし、 s i RNAをリバーストラ ンスフエクションできるァテロコラーゲンセルトランスフエクションアレイ を作製した。
[0037] (2) 細胞の樹立
乳ガン細胞 MC F 7を親株とする多剤耐性乳ガン細胞株である MCF7-ADRに 、 ルシフェラーゼ遺伝子 （G L 3) を導入し、 安定形質発現させた細胞株 MCF 7-ADR-LUCを得た。
[0038] (3) 細胞増殖抑制率および s i RNAの導入効率の測定
( 1 ) で作製したアレイに、 （2) で得た MCF7-ADR-LUC細胞を、 4 x 1 03 細胞数 ウエルにて播種し、 1 nMドセタキセル （DOC) 存在下で 3日間 培養した。 生細胞にルシフェリンを添加しその発光値から、 細胞の増殖抑制 率およびルシフェラーゼ s i RNAの導入効率を測定した。 [0039] 細胞の増殖抑制率は、 コントロール s i RNA (配列番号 5のセンス鎖お よび配列番号 6のアンチセンス鎖からなる d s RN A) を 1 00%として算 出した。 結果を図 1に示す。 なお、 図 1において横軸は、 表 1に示した遺伝 子番号 （N o. ) に対応する。 図 1によれば、 RP N 2遺伝子 （N o. 1 2 ) のほかにもいくつかの遺伝子において、 各遺伝子に対応する s i RNAの 導入により細胞増幅が抑制された。
[0040] また、 s i RNA導入効率は、 各遺伝子に対応する s i RNAとは別にル シフェラーゼ s i RNA (G L 3 s i RNA :配列番号 7のセンス鎖および 配列番号 8のアンチセンス鎖からなる d s RN A) の導入によるルシフェラ ーゼ活性の抑制率で評価した。 なお、 ルシフェラーゼ活性は、 ルシフェリン (最終濃度 0. 5mM : プロメガ社） を培地に添加して、 その直後に発光プ レートリーダ （ARVO ：パーキンエルマ一社） により測定した。 G L 3 s i RNAの導入により、 ルシフヱラーゼ活性は、 前記コントロール s i RN Aと比較して、 80 %抑制されていた。
[0041] (試験例 2) アポトーシス誘導試験
試験例 1にてルシフエラーゼ活性を測定した後のプレー卜に対して、 アポ トーシス測定用の試薬を添加して、 Caspase活性を測定した。 すなわち、 プロ メガ社推奨のプロトコール （Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay) にし たがってアツセィし、 試薬を添加して 90分後に蛍光プレートリーダ （AR VO ：パーキンエルマ一社） により測定した。 Caspase活性化率は、 前記コン トロール s i R N Aを 0%として算出した。
[0042] また、 Caspase活性のほかに、 へキスト染色による観察 （細胞を PBS (-)で洗 浄後、 4% PFA - 0.1% Triton X- 100 - 1 mg/ml Hoechst 33342 / in PBS (-) を添加し、 室温で 20分間固定、 染色。 PBS (-)で洗浄後、 蛍光顕微鏡下で観 察。 ） によりアポトーシス誘導を調べた。
[0043] 結果を図 2に示す。 図 2によれば、 RP N 2遺伝子に対する s i RNA ( R P N 2 s i RNA) の導入により Caspase活性が強く誘導された。 また、 へ キスト染色により、 RP N 2 s i RNAを導入した細胞とコントロール s i RN Aを導入した細胞におけるアポ! ^一シス細胞の割合 （Apoptotic eel ls(% )) を比較したところ、 図 3に示したように、 有意な差異が見られた。 すなわ ち、 RPN 2 s i RN Aの導入により、 アポ! ^一シスが誘導されることが示 唆された。
図 4には、 へキスト染色による核形態の観察結果を示す。 図 4 (a) には RPN 2 s i RN Aを導入した系での結果を示し、 図 4 (b) にはどの遺伝 子の発現をも抑制しないコントロール s i RN Aを導入した系での結果を示 す。 図 4によれば、 その核形態の変化 （凝縮、 断片化） から、 RPN 2 s i RNAを導入したときにアポトーシスが誘導されることが示唆された。
[0044] (試験例 3 ) RPN 2遺伝子発現抑制試験
試験例 1 (1 ) にて作製したァテロコラーゲンセルトランスフヱクシヨン アレイに、 MCF7-ADR-LUG細胞を播種して 3日後に、 細胞溶解物から直接 c D N Aを合成し、 リアルタイム PC Rを行って、 RP N 2遺伝子発現量を調べ た (Superscript III Platinum Cel IsDi rect Two - Step qRT-PCR: invitrogen
)o
結果を図 5に示す。 図 5によれば、 RPN 2 s i RNA (配列番号 3のセ ンス鎖および配列番号 4のアンチセンス鎖からなる d s RN A) の導入によ り、 R P N 2遺伝子の発現が約 25 %に抑制されたことが認められた。
[0045] (試験例 4) ヌードマウスにおける腫瘍増殖試験
図 6に示したプロトコールにしたがって、 ヌードマウス （4週齢、 メス） の乳腺脂肪体 （fat pad) に 1 OO Iの PBS (-)にけん濁した 1 x 1 07個の MC F7-ADR-LUG細胞を移植した。 腫瘍径が約 5mmに達した 7曰後に、 s i RN Aおよび DOCを投与した。 ここで、 ァテロコラーゲンは最終濃度 5mgZ m I (wZv o I ) 、 s i RNAは腫瘍あたり 1 n mo I として混合後、 ァ テロコラーゲン （ （株） 高研製） Zs i RNAの 200 I を腫瘍内投与し た。 同時にドセタキセル 2 OmgZk gを腹腔内投与した。 7日後に腫瘍径 を測定し、 腫瘍体積を比較した。
[0046] 結果を図 7に示す。 図 7によれば、 RPN 2 s i RNAおよび DOCを投 与した結果、 コントロール s i RNAに比べ有意に腫瘍の縮小が認められた 。 DOCに対して非応答性を示した細胞においても、 RP N 2 s i RNAの 投与により、 D O Cへの応答性が獲得されたと考察される。
[0047] (試験例 5) ヌードマウスにおける R P N 2遺伝子発現抑制試験
ヌードマウス （4週齢、 メス） の乳腺脂肪体 （fat pad) に 1 O OjU Iの PB S (-)にけん濁した 1 X 1 07個の MCF7-ADR-LUC細胞を移植し、 7日後に RP N 2 s i RNAおよび DOCを投与した。 ここで、 ァテロコラーゲンは最終濃 度 5mgZm I (wZv o I ) 、 RP N 2 s i RNAは腫瘍あたり 1 nmo I として混合後、 ァテロコラーゲン/ s i RNAの 200 I を腫瘍内投与し た。 同時にドセタキセル 2 OmgZk gを腹腔内投与した。 1 日後に腫瘍を 採取して I ^一タル RNAを単離し、 real-time RT-PCR (SYBR ExScr i pt RT-PC R Kit: TaKaRa, Li htCycler Real-Time PCR System: Roche社） で RP N 2 遺伝子の発現量を測定した。
[0048] 結果を図 8に示す。 図 8によれば、 RP N 2 s i RNA投与群は、 コント ロール s i R N A投与群と比べ、 R P N 2遺伝子の発現が約 20%抑制され ていた。 なお、 標準偏差は非常に小さいため、 グラフ上に表現されていない
[0049] (試験例 6) ヌードマウスにおける R P N 2遺伝子発現抑制試験
試験例 5において、 ヌードマウス （4週齢、 メス） の乳腺脂肪体 （fat pad ) に MCF7-ADR-LUG細胞を移植して、 6週間後に RP N 2 s i RNAおよび D OCを投与した以外は、 試験例 5と同様の方法で、 RP N 2遺伝子の発現量 を測定した。
[0050] 結果を図 9に示す。 図 9によれば、 RP N 2 s i RNA投与群は、 コント ロール s i R N A投与群と比べ、 R P N 2遺伝子の発現が約 40%抑制され ていた。
[0051] (試験例 7) ヌードマウスにおけるアポトーシス誘導試験
ヌードマウス （4週齢、 メス） の乳腺脂肪体 （fat pad) に 1 O OjU Iの PB S (-)にけん濁した 1 X 1 07個の MCF7-ADR-LUC細胞を移植し、 6週間後に s i RNAおよび DOC、 あるいは s i RNAのみを投与した。 ァテロコラーゲ ンは最終濃度 5mgZm l (wZv o l ) 、 s i R N Aは腫瘍あたり 1 n m o I として混合後、 ァテロコラーゲン Zs i RN Aの 20 O I を腫瘍内投 与した。 同時にドセタキセル 2 OmgZk gを腹腔内投与した。 4日後に腫 瘍を採取し、 TUN E L染色 （In Situ Cell Death Detection Kit: Roche社 ) した。 核を DAP I (4'， 6- di amid i no- 2- phenyl indole) で対比染色した。
[0052] 結果を図 1 0に示す。 図 1 0によれば、 DOCおよび RP N 2 s i RN A の両方を投与した群については、 多くのアポトーシス細胞が認められた。
[0053] (試験例 8 )
試験例 1 (1 ) にて作製したァテロコラーゲンセルトランスフヱクシヨン ァレイに、 抗ガン性を示す薬剤の存在下あるいは非存在下で MCF7-ADR-LUG細 胞を播種して 3日後に、 試験例 2に記載の要領で Caspase活性を測定した。 結果を図 1 1に示す。 図 1 1によれば、 DOCの非存在下であっても、 R P N 2 s i RNAを投与した群について、 アポ! ^一シスが誘導されること力《 示唆された。
[0054] (試験例 9 )
ヒト肺ガン （小細胞ガン、 分化型腺ガン） の細胞株であり、 抗ガン性を示 す薬剤であるシスブラチン耐性の PC-9/CDDP細胞について、 RPN 2 s i RN Aを投与して RP N 2遺伝子発現を抑制した後、 シスブラチン （0. 3 M ) の存在下あるいは非存在下で 3日間培養した。 その後、 試験例 2に記載の 要領で Caspase活性を測定した。 なお、 比較するために、 どの遺伝子の発現を も抑制しないコントロール s i RNAを導入した系でも同様の試験をした。 結果を図 1 2に示す。 図 1 2によれば、 コントロールの系では、 シスブラ チン （Cis) の非投与 （Cis_) 、 投与 （Cis + ) の両方で Caspase活性に差異 は見られなかったが、 RPN 2 s i RNAを導入した系では、 シスブラチン の投与、 非投与にかかわらず、 アポトーシスが誘導されることが示唆された 。 RPN 2 s i RNAを導入した系ではシスブラチンの投与群において有意 にアポトーシスが誘導され、 細胞死が確認された。 シスブラチン非投与群に おいてもアポ I ^一シスの上昇は認められたが、 シスプラチン投与群に比して 軽微であった。 また、 白金製剤としてシスブラチンを用いた例を示したが、 シスブラチンよりも毒性を低減させた他の白金製剤、 例えばカルポプラチン などにおいても同じような傾向を示すと考えられる。
[0055] なお、 各試験例においては、 乳ガン細胞の MCF7-ADRの RP N 2遺伝子をサ ィレンシングしてガン化された細胞のアポトーシスの誘導が見られた例を挙 げたが、 他の RPN 2遺伝子が高発現している細胞、 例えば大腸ガン、 食道 ガン、 卵巣ガン、 乳ガン、 肺ガンの細胞および組織においても、 RPN 2遺 伝子をサイレンシングすることにより、 抗ガン剤 （ドセタキセルなどに） 耐 性となったガン化された細胞のアポトーシス誘導が見られる可能性がある。
[0056] また、 抗ガン剤耐性を示す細胞株として、 シスブラチン耐性を示すヒト肺 ガン細胞の PC-9/CDDP細胞の RP N 2遺伝子をサイレンシングしてガン化され た細胞のアポトーシスの誘導が見られた例を挙げたが、 その他には PC-14細胞 、 SBC-3細胞、 H69細胞などのヒト肺ガン細胞株、 K562細胞 （ヒト白血病細胞 株） または p388細胞 （マウスリンパ球様細胞株） などを親株とする抗ガン剤 耐性株、 例えば PC-14/CDDP、 SBC-3/CDDP, SBC-3/ADM, H69/CDDP, K562/ADM, P388/MMCなども知られている （ここで、 CDDPはシスブラチン耐性、 ADMはアド リアマイシン耐性、 MMCはマイ トマイシン C耐性を意味する） 。 これら抗ガン 剤耐性細胞においても、 RPN 2遺伝子をサイレンシングすることによリア ポトーシスが誘導される可能性がある。
[0057] 以下に、 s i RN Aによるヒト肝臓ガン、 ヒト大腸ガンにおいて、 RPN 2遺伝子発現抑制の例を示す。
(試験例 1 0 )
ヒト肝臓ガンの細胞株である HepG2を 5000個/ we Iし 96ゥヱルプレートに 播種した翌日、 遺伝子導入試薬 (Lipofectamine 2000： Invitrogen) を用い て、 Invitrogen社推奨のプロトコールに従って RPN2 si RNA (配列番号 3のセ ンス鎖及び配列番号 4のアンチセンス鎖からなる dsRNA) を導入し、 RPN2遺伝 子発現を抑制した。 陰性対照としてコントロール siRNA (配列番号 5のセンス 鎖及び配列番号 6のアンチセンス鎖からなる dsRNA) を導入した。 上記 siRNAと 同時に D0Cを最終濃度 1 nMで添加した。 3日間培養後、 各 wel lの細胞の生存 率を確認するために、 生細胞の定量試薬 (Cel ITiter-Glo substrate: Promeg a) を添加して、 2分間撹拌し、 10分静置後、 発光プレートリーダー （ARVO: P erkinElmer) により発光を測定した。
結果は、 無細胞ゥエルの発光強度を除いた発光強度 (RLU)として図 1 3に示 す。 図 1 3によれば、 D0Cに感受性を示す HepG2細胞において RPN2 siRNAは単 独でガン細胞の増殖抑制効果を示すとともに、 D0Cのガン細胞増殖抑制効果を 増強する作用を示した。
[0058] (試験例 1 1 )
ヒト大腸ガンの細胞株である HT29を 500個/ we Iし 96ゥヱルプレートに播 種した翌日、 遺伝子導人言式薬 (Dermafect： Dermacon) を用しゝて、 Dermacon社 推奨のプロトコールに従って複数の配列の RPN2 siRNAを導入し、 RPN2遺伝子 発現を抑制した。 陰性対照としてコントロール siRNA (配列番号 5のセンス鎖 及び配列番号 6のアンチセンス鎖からなる dsRNA) を導入した。 3日間培養後 、 各 wel Iの細胞の生存率を確認するために、 生細胞の定量試薬 （テトラカラ 一ワン：生化学工業） を 10 Lずつ添加して、 更に 2~3時間培養し、 490nm における各ゥエルの吸光度を測定した。
結果は、 無細胞ゥエルの吸光度を除いた、 A0D490として図 1 4に示す。 試験 で使用された複数の RPN2 siRNA (配列 A~L) はそれぞれ以下で示す配列を有 する。 なお、 配列 A~Lは、 表 2に示したセンス鎖およびアンチセンス鎖か らなる d s R N Aである。
[0059] 配列 A (配列番号 3のセンス鎖及び配列番号 4のアンチセンス鎖からなる dsRN A) ；
配列 B (配列番号 9のセンス鎖及び配列番号 1 0のアンチセンス鎖からなる ds RNA) ；
配列 C (配列番号 1 1のセンス鎖及び配列番号 1 2のアンチセンス鎖からなる dsRNA) ； 配列 D (配列番号 1 3のセンス鎖及び配列番号 1 4のアンチセンス鎖からなる dsRNA) ；
配列 E (配列番号 1 5のセンス鎖及び配列番号 1 6のアンチセンス鎖からなる dsRNA) ；
配列 F (配列番号 1 7のセンス鎖及び配列番号 1 8のアンチセンス鎖からなる dsRNA) ；
配列 G (配列番号 1 9のセンス鎖及び配列番号 2 0のアンチセンス鎖からなる dsRNA) ；
配列 H (配列番号 2 1のセンス鎖及び配列番号 2 2のアンチセンス鎖からなる dsRNA) ；
配列 I (配列番号 2 3のセンス鎖及び配列番号 2 4のアンチセンス鎖からなる dsRNA) ；
配列 J (配列番号 2 5のセンス鎖及び配列番号 2 6のアンチセンス鎖からなる dsRNA) ；
配列 K (配列番号 2 7のセンス鎖及び配列番号 2 8のアンチセンス鎖からなる dsRNA) ；
配列し （配列番号 2 9のセンス鎖及び配列番号 3 0のアンチセンス鎖からなる dsRNA)
いずれの配列も単独で HT29細胞の増殖を抑制する作用を示した。
/v:/ O /9000/-0sfcl£/-00iAV
Figure imgf000019_0001

Claims

請求の範囲
[I ] R P N 2遺伝子発現抑制剤を含むガン細胞増殖抑制剤。
[2] R P N 2遺伝子発現抑制剤および抗ガン作用を示す薬剤を含むガン細胞增 殖抑制剤。
[3] 請求項 1または 2に記載のガン細胞増殖抑制剤において、
ァテロコラーゲンをさらに含むことを特徴とするガン細胞増殖抑制剤。
[4] 請求項 1または 2に記載のガン細胞増殖抑制剤において、
前記 R P N 2遺伝子発現抑制剤が、 低分子化合物であるガン細胞増殖抑制 剤。
[5] 請求項 4に記載のガン細胞増殖抑制剤において、
前記 R P N 2遺伝子発現抑制剤が、 R N A干渉により R P N 2遺伝子の発 現を抑制する低分子化合物であるガン細胞増殖抑制剤。
[6] 請求項 5に記載のガン細胞増殖抑制剤において、
前記低分子化合物が、 R P N 2遺伝子の所定の配列に対応する配列を有す る s i R N Aであるガン細胞増殖抑制剤。
[7] 請求項 2に記載のガン細胞増殖抑制剤において、
前記抗ガン作用を示す薬剤が、 タキサン類から選ばれる少なくとも一つで あるガン細胞増殖抑制剤。
[8] 請求項 2に記載のガン細胞増殖抑制剤において、
前記抗ガン作用を示す薬剤が、 白金製剤から選ばれる少なくとも一つであ るガン細胞増殖抑制剤。
[9] 請求項 1から 8のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤において、 当該ガン細胞増殖抑制剤は、 ガン化した細胞のアポトーシスを促進するこ とを特徴とするガン細胞増殖抑制剤。
[10] 請求項 1から 9のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン 剤。
[I I ] R P N 2遺伝子発現抑制剤の抗ガン剤としての使用方法。
[12] R P N 2遺伝子発現抑制剤の抗ガン作用を示す薬剤を併用した抗ガン剤と しての使用方法。
請求項 1 1または 1 2に記載の使用方法において、
ァテロコラーゲンをさらに併用することを特徴とする R P N 2遺伝子発現 抑制剤の使用方法。
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