WO2007126099A1

WO2007126099A1 - 家族性複合型高脂血症の検出方法

Info

Publication number: WO2007126099A1
Application number: PCT/JP2007/059291
Authority: WO
Inventors: Yasuki Itoh
Original assignee: Denka Seiken Co., Ltd.
Priority date: 2006-05-01
Filing date: 2007-05-01
Publication date: 2007-11-08
Also published as: JP5081814B2; US8088625B2; ES2397942T3; EP2015077B1; EP2015077A1; EP2015077A4; JPWO2007126099A1; US20090317846A1

Abstract

　本発明は、家族性複合型高脂血症の優れた検出・診断方法の提供を目的とする、被験者から採取した被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール濃度を測定することを含む、家族性複合型高脂血症を検出する方法である。

Description

明細書

家族性複合型高脂血症の検出方法

技術分野

[0001] 本発明は、家族性複合型高脂血症の検出'診断方法に関する。

背景技術

[0002] 低密度リポ蛋白（LDL)は血液中におけるコレステロール運搬の主役であり、動脈硬化性疾患の危険因子である。 LDLの中でも特に粒子サイズが小さく平均的な LDLより高比重な、小粒子低比重リポ蛋白（以下、「small,dense LDL」という）は動脈硬化惹起性が通常の LDLより高くなることが知られて、る。

[0003] 家族性複合型高脂血症（Familial combined hyperlipidemia ,以下「FCHLと!ヽう」）は WHOの型別高脂血症では lib型の表現型を基盤とするが、食事等の影響により Ila 、 IV型にも変動し、家族の高脂血症も一定の型を示さず、 Ila, lib, IV型の種々の表現型を呈する遺伝性高脂血症として定義されたものである。 FCHLは動脈硬化性疾患を起こしやすい原発性高脂血症のひとつであり、頻度は約 100人に 1例程度と極めて高ぐ FCHLの 30%以上が冠動脈疾患を起こすと言われている。

[0004] 電気泳動を用いた解析より、 FCHLの患者検体の血液中では small,dense LDL力 S存在することが指摘されている（非特許文献 1、 2および 3を参照）。 small.dense LDLの存在は血液検体の電気泳動像をデンシトメ一ターを用いて解析すると LDLのメインピークが 25.5nm以下となることにより示される。このことは、 LDLの質が小粒子化していることを示している。また、 FCHLでは超低比重リポ蛋白（VLDL)が合成過剰となること力 LDLコレステロールに比しアポ蛋白 Bが相対的過剰となり、アポ蛋白 BZLDLコレステロール比が上昇することが指摘されて、る（非特許文献 3を参照)。 small,dense LDLでは LDL粒子中のコレステロール含量比率が低下する一方、アポ蛋白 Bは LDL 1粒子分子に必ず 1分子存在するため、アポ蛋白 BZLDLコレステロール比の上昇は small,dense LDLの存在を間接的に表しているとも言える。

[0005] しかしながら、上記のような LDLの質を求める方法では、 small,dense LDL以外の通常サイズの LDL力 mall,dense LDLと共に上昇した場合、 small,dense LDLの存在を精度良く特異的に検出することができず、家族性複合型高脂血症であるか否力の診断を見誤る可能性がある。また、アポ蛋白 Bの測定値のみを用いた場合では高レムナント血症なども含めて評価されてしまうため検出の精度が低くなる。

非特許文献 1 : Journal of Lipid Research 2002;43:598-603

非特許文献 2： Circulation 2004;109:2980-2985

非特許文献 3：厚生労働省特定疾患原発性高脂血症調査研究班平成 12年度研究報告書 2000 : 37-41

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明は、家族性複合型高脂血症の優れた検出'診断方法の提供を目的とする。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明者等は鋭意検討した結果、 small,dense LDL中のコレステロール値が FCHL 患者検体中では非常に高くなることを見いだした。また、従来の電気泳動による LDL サイズ測定や、アポ蛋白 BZLDLコレステロール 2項目測定値の比の計算では時間、費用の面力もも負担が大きいが、本発明の方法によれば、 FCHLの検出を簡便に行うことができる。

[0008] すなわち、本発明は FCHLの患者検体中の small,dense LDLコレステロールを測定することにより、家族性複合型高脂血症を検出'診断する方法を提供するものである

[0009] さらに、本発明は FCHLにおける動脈硬化症等のイベントが起こる危険性を評価' 判定する方法および FCHLにおける動脈硬化が重症力否かを評価 ·判定する方法を提供するものである。

[0010] 本発明は具体的には以下の方法およびキットを提供する。

[0011] [1] 被験者力も採取した被検体試料中の small,dense LDLコレステロール濃度を測定することを含む、家族性複合型高脂血症を検出する方法。

[0012] [2] 被検体試料中の TGまたは LDL-Cのレベルが正常レベルである患者力採取した被検体試料中の small,dense LDLコレステロール濃度を測定することを含む、 [1]の家族性複合型高脂血症を検出する方法。 [0013] [3] small.dense LDLコレステロール濃度の測定が、被検体試料中の small,dense LD Lをそれ以外の LDLと分離する、またはそれ以外の LDLを反応させコレステロールを消去する第 1工程、および small, dense LDL以外の LDLを分離または消去した後で sm all, dense LDL中のコレステロールを測定する第 2工程力もなる [1]または [2]の家族性複合型高脂血症を検出する方法。

[0014] [4] 被検体試料が血清または血漿であり、血清または血漿中の small,dense LDLコレステロール定量値が 40mg/dLを超えた場合に家族性複合型高脂血症に羅患していると判断する、 [1]〜[3]のいずれかの方法。

[0015] [5] 被験者力も採取した被検体試料中の small,dense LDLコレステロール濃度を測定することを含む、家族性複合型高脂血症患者にぉヽて動脈硬化性疾患を起こす危険性を判定する方法。

[0016] [6] 被験者力も採取した被検体試料中の small,dense LDLコレステロール濃度の増カロが、前記被験者の動脈硬化性疾患を起こす危険性の増加を示す、 [5]の家族性複合型高脂血症において動脈硬化性疾患を起こす危険性を判定する方法。

[0017] [7] small.dense LDLコレステロール濃度の測定が、被検体試料中の small,dense LD Lをそれ以外の LDLと分離する、またはそれ以外の LDLを反応させコレステロールを消去する第 1工程、および small, dense LDL以外の LDLを分離または消去した後で sm all, dense LDL中のコレステロールを測定する第 2工程からなる [5]または [6]の家族性複合型高脂血症にいて動脈硬化性疾患を起こす危険性を判定する方法。

[0018] [8] 被検体試料が血清または血漿であり、血清または血漿中の small,dense LDLコレステロール定量値が 40mg/dLを超えた場合に家族性複合型高脂血症患者において動脈硬化性疾患を起こす危険性があると判定する、 [5]〜[7]のヽずれかの方法。

[0019] [9] small.dense LDLコレステロールの測定用試薬を含む、家族性複合型高脂血症検出用キット。

発明の効果

[0020] 実施例 1に示すように、 FCHLの患者群では健常群に比べて明らかに small,dense L DLコレステロール値が高値となる。さらに実施例 2に示すように、 FCHL患者検体の脂質項目を測定した場合、 TGが高値の場合や LDL-Cが高値の場合など、個々人により高脂血症の型が異なる。しかしながら、 small, dense LDLコレステロール値はいずれの場合でも高値となり、 small, dense LDLコレステロール値の測定により FCHLの検出が的確に行えることがわかる。

[0021] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2006- 127591号の明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。

図面の簡単な説明

[0022] [図 1]健常群および FCHL群の small,dense LDLコレステロール平均値を示す図である。

[図 2]FCHL群および非 FCHL群に対する、 small,dense LDLコレステロール値をカットオフ値とした場合の ROC曲線を示す図である。

[図 3]本発明の方法による sd LDL-C値をカットオフ値として用いて FCHLを検出する方法（図 3A)と、 LDLサイズによる方法（図 3B)、アポ蛋白 Bと LDLコレステロールの比による方法（図 3C)または LDLサイズもしくはアポ蛋白 Bと LDLコレステロールの比による方法（図 3D)と比較した結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0023] 本発明では血清または血漿を被検試料として用いる。

[0024] また本発明では、 FCHLに羅患しているかどうかを検出'診断するために small,dens e LDLコレステロール測定値を用いる。

[0025] small, dense LDLとは一般的には LDL画分のうち直径が約 22.0〜約 25.5nmの亜分画、比重 1.040〜1.063の亜分画を指す。 LDLを大きさにより亜分画に分けているのは、 LDLのうち粒子径が小さいものが冠動脈硬化等の動脈硬化惹起性が高ぐ LDLの中でもより悪性度が高いので、 LDLの中でも小さいものを分別測定する必要があった力もである。 LDL内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものが特に悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重 1.040〜1.063という値も small,dense LDLの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえる LDLの比重範囲 1.019〜1.063を中央点で分けたものである。例えば、別の報告では 1.044〜1.060に分画される（Atherosclerosis: 106 241-253 1994)。 small.dense LDLの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合の small,dense LDLの存在が臨床的な悪性度と関連して、る。

[0026] small, dense LDLの測定法として古くから用いられてきた方法として電気泳動法がある。これはポリアクリルアミドゲルを用いて LDLの移動度や粒子直径を測る方法であり、 small, dense LDLの存在は確認できる力特定成分の定量を行うものではない（JAM A, 260, p.1917-21, 1988 動脈硬化， 25, p.67-70, 1997)。また、 NMRを用いて LDL 粒子数を測定する方法がある（Handbook of lipoprotein Testing, 2nd ed, Rifai N, Wa rnick GR, Dominiczak MH, eds p.609-623, AACC Press .Washington, DC, 2000.)。これは LDL総重量が同じでも LDLが小型化していれば粒子数が増加するとの考えのもと間接的に small,dense LDLを行うものである力 small,dense LDLの一成分を直接測定するものではない。

[0027] small, dense LDLコレステロールの測定方法としては、超遠心法（Atherosclerosis, 4 8 p.33-49, 1993: Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994等）、電気泳動後デンシトメ一ターを用いてピーク面積を定量する方法 (Atherosclerosis, 125, p.231-42 1996)、 HPLCを用いて LDLを細分化し、 small,dense LDL分画のコレステロールを定量する方法 (Handbook of lipoprotein Testing, 2nd ed, Rifai N, Warnick uR, Dominiczak M H, eds p.647-669, AACC Press .Washington, DC, 2000.)がある。さらに、ァガロース電気泳動において泳動後のゲルを脂質染色し、その染色パターンをコンピューター解析しリポ蛋白を定量する方法がある（特開 2000-356641号公報)。上記測定法でも s mall, dense LDLコレステロールを定量することにより FCHLの診断を行うことが可能であるが簡便性、汎用性に劣り日常検査の場で用いるのは難しい。また、測定値をコンピューター解析にて用いる場合には測定値は計算により求める概算値であり、正確 '性に問題がある。

[0028] 本発明者らはポリア-オンと二価陽イオン力もなる分離剤を用いて LDLを通常サイズの LDLと small,dense LDLに分離し、その後 LDLコレステロール測定用試薬を用いて small,dense LDLコレステロールを定量する方法（臨床病理， 25, p.406-413, 2004) を提供している。本発明では上記 small,dense LDLコレステロールの測定法を好適に用!/、ることができる。 [0029] 例えば、臨床病理， 25, p.406-413, 2004の記載に従って、以下のようにして sd LDL 中コレステロールの測定を行うことができる。血清または血漿を試料とし、ポリア-オンと二価陽イオンカゝらなる分離剤と混合した場合、通常サイズの LDLの他、 VLDL、カイ口ミクロンなどは凝集物を形成し、遠心分離やフィルタ一等により反応系から除去される。反応液中には凝集物を形成しない sd LDLおよび HDLが残る。この反応液に LDL コレステロール直接測定法の原理を利用した 2試薬系の自動分析装置対応の試薬を作用させる。第 1反応では LDL以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤の存在下でコレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼを作用させ、生じた過酸ィ匕水素を消去することにより、反応液中の HDLコレステロールのみが消去される。続く第 2反応では試料中の sd LDL中コレステロールの測定を行う。これは、例えば、少なくとも LDLに作用する界面活性剤をカ卩え、第 1工程でカ卩えたコレステロ一ルエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼの作用により生じた過酸ィ匕水素を定量すること〖こより行うことができる。

[0030] 本発明の方法は、 FCHLを検出 ·診断する方法である力該方法は、 FCHLをスクリ一二ングする方法でもある。また該方法は、 FCHLが原因となる動脈硬化症等の心血管イベントの発生確率、すなわち心血管イベントが起こる危険性を判定'評価する方法でもある。例えば、検体試料中の small,dense LDLコレステロールの濃度に応じて、心血管イベントの発生の確率が低い、中程度、または高いと判断できる。また、測定値とイベントが発生する頻度を関連付けることにより、確率を数値で示すことも可能である。

[0031] また、本発明の方法により、 FCHLにおける動脈硬化症等のイベントが起こる危険性を評価 ·判定することができ、さらに FCHLにおける動脈硬化が重症力否かを評価 · 半 U定することができる。

[0032] small, dense LDLコレステロールの定量値力 FCHLに罹患していない健常人よりも増加している場合、例えば、健常人の small,dense LDLコレステロールの平均値は 20mg /dLであるが、血清中の small,dense LDLコレステロールの定量値が 30〜50mg/dL、好ましくは 40mg/dLを超える場合、 FCHLに羅患していると判断され、さらに動脈硬化性疾患の危険性が高くなるものと判断される。ただし、 FCHL診断の基準値については民族等により異なることが考えられるためこの限りではない。また、 FCHLと診断されたヒトの中でも small,dense LDLコレステロール測定値が 45mg/dL、 50mg/dLと高くなるに従い、動脈硬化が重症化していると考えられ、心筋梗塞等の動脈硬化性疾患を発症する危険性が高!ヽと判定し得る。

[0033] 本発明の small,dense LDLコレステロールをマーカーとして FCHLを検出し、または動脈硬化性疾患の危険性を評価'判定する方法によれば、従来の脂質マーカーでは測定できない FCHLを検出することができ、また従来の脂質マーカーでは評価 '判定できない動脈硬化性疾患の危険性を評価 ·判定することができる。すなわち、 FCH L患者において、 TG、 LDL- Cおよび HDL- Cのいずれか 1つ、 2つ、またはすベて、好ましくは、 TGおよび LDL-Cの一方または両方が正常レベルであっても、 small,dense LDLコレステロールが正常レベルより高い場合がある。すなわち、本発明は、 TG、 LD L-C、 HDL-C等の従来の脂質マーカーでは検出できな、FCHLを検出することができる、 FCHLの検出方法である。ここで、正常レベルとは、臨床的に正常と判定された被験者力も採取した検体試料中のサンプル濃度と統計的に有意な差がないレベルをいう。

実施例

[0034] 以下、本発明の詳細について実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではな、。

[0035] [実施例 1]

動脈硬化性疾患を発症していない男性および女性健常人 360名、および本人、家族歴から FCHLに羅患して!/、ることが確認されて!、る 9例を用いて small,dense LDLコレステロールの測定を行った。 _Small,dense LDLコレステロールの測定は sd LDL- C「生研」（デン力生研社製)を使用した。

[0036] その結果を図 1に示す。図 1に示すように、健常群に比べて FCHL群では明らかに s mall, dense LDLコレステロール値が上昇している。本結果は small,dense LDLコレステロール定量により FCHL疾患を良好に検出することができることを示すものである。

[0037] [実施例 2]

実施例 1で用、た FCHL患者群にお、て検体中の各種脂質パラメーターの比較を行った。 small,dense LDLコレステロールの測定は実施例 1と同様の試薬を使用した。中性脂肪、 LDL-コレステロール、 HDL-コレステロールの測定は酵素法を使用した。

[0038] その結果を表 1に示す。表 1に示すように、 FCHL患者検体以外では一般に高値をもって動脈硬化性疾患と診断する脂質マーカー TGまたは LDL-Cが、 FCHL患者検体では低値となる場合がある力いずれの症例も small,dense LDLコレステロール値は高値となる。このことは small,dense LDLコレステロールが従来の脂質マーカーに比ベて特異性に優れた FCHL診断のための測定マーカーとなることを示すものである。

[表 1] 性別年齢 TG し DL - C HDL-C sd LDL-C

1 M 38 250 250 33 1 17.4

2 M 40 645 103 31 70.9

3 M 46 657 105 43 55.5

4 M . 54 135 175 50 46.8

5 M 55 1334 85 54 49.8

6 M 63 1156 81 39 45.2

7 M 65 77 266 50 95.1

8 F 59 130 132 53 76.8

9 F 65 212 158 34 59.2

単 δ： mg/dに

TG:中性脂肪、 LDL-C : LDLコレステロ一ル、 HDL-C : HDLコレステロール

sd LDL-C： small,dense LDLコレステロール

[0039] [実施例 3]

糖尿病、冠動脈疾患のない健常人 1345例の sd LDL- Cを small,dense LDLコレステロールの測定は sd LDL- C「生研」（デン力生研社製）を用いて測定した。

[0040] FCHLの疾患定義である家族歴、本人の高脂血症を用いて FCHL、非 FCHLを特定

•群分けし、 sd LDL-Cのカットオフ値を変動させたときの感度および特異性を測定して ROC曲線を描いた（図 2)。

[0041] その結果、 ROC曲線上左上（点 A)の sd LDL- Cが 40mg/dLのとき、感度 92.3%、特異性 88.3%となった。感度と特異性が共に優れて高、この値をカットオフ値として仮に定めた。

[0042] [実施例 4]

実施例 3で求めたように sd LDL-C値 40mg/dLをカットオフ値として用いて FCHLを検出する方法と、既存の FCHLを検出する方法である LDLサイズによる方法、アポ蛋白 Bと LDLコレステロールの比による方法と比較した。 LDLサイズによる方法とは粒子径 25.5nm未満 LDLの存在すれば陽性とする方法であり、アポ蛋白 Bと LDLコレステロールの比による方法とは ApoB/LDL-C > 1.0を陽性とする方法 (動脈硬化性疾患診療ガイドライン 2002年版、日本動脈硬化学会編)である。

[0043] その結果を図 3に示す。図 3A〜図 3Dにおいて、確定診断の欄は、 FCHLの疾患定義である家族歴、本人の高脂血症を用いて FCHL、非 FCHLを特定'群分けした場合の検体数を示し、 +が FCHLと診断された検体の数であり、—が非 FCHLと診断された検体の数である。図 3Aの本発明 sdLDL〉40mg/dLの欄は本発明の方法により sd LDL-C値をカットオフ値 (40mg · dL)として用、て FCHL、非 FCHLを特定 ·群分けした場合の検体数、図 3Bの LDLサイズの欄は LDLサイズによる方法により FCHL、非 FCH Lを特定'群分けした場合の検体数、図 3Cの ApoB/LDL〉10の欄はアポ蛋白 Bと LDL コレステロールの比をカットオフ値 (10)として用いて FCHL、非 FCHLを特定'群分けした場合の検体数、図 3Dは、 LDLサイズもしくはアポ蛋白 Bと LDLコレステロールの比をカットオフ値 (10)として用いて FCHL、非 FCHLを特定'群分けした場合の検体数を示す。 +はそれぞれの方法により FCHLと診断された検体の数、一は FCHLと診断されなかった検体の数を示す。図 3A〜図 3Dに示すように、本発明の方法、 LDLサイズによる方法、アポ蛋白 Bと LDLコレステロールの比を用いる方法、 LDLサイズもしくはアポ蛋白 Bと LDLコレステロールの比をカットオフ値 (10)として用いる方法の感度 '特異性は、それぞれ 92.3% ·88.3%、 30.8% -91.5%, 7.7% ·97.5%および 30.8% ·90.6 %であった。本発明法である sd LDL-C値を用いた診断の方が既存の方法に比べて感度，特異性の点力良好な結果が得られた。

[0044] 実施例 3および 4の結果より、 sd LDL-Cが 40mg/dLのとき FCHLに羅患していると判断され、さらに動脈硬化性疾患の危険性が高くなるものと判断することができると言える。

[0045] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

[1] 被験者カゝら採取した被検体試料中の small,dense LDLコレステロール濃度を測定することを含む、家族性複合型高脂血症を検出する方法。

[2] 被検体試料中の TGまたは LDL-Cのレベルが正常レベルである患者力採取した被検体試料中の _small,d_ense LDLコレステロール濃度を測定することを含む、請求項 1 記載の家族性複合型高脂血症を検出する方法。

[3] small.dense LDLコレステロール濃度の測定が、被検体試料中の small,dense LDLをそれ以外の LDLと分離する、またはそれ以外の LDLを反応させコレステロールを消去する第 1工程、ならびに small,dense LDL以外の LDLを分離または消去した後で small, dense LDL中のコレステロールを測定する第 2工程力なる請求項 1または 2に記載の家族性複合型高脂血症を検出する方法。

[4] 被検体試料が血清または血漿であり、血清または血漿中の small,dense LDLコレステロール定量値が 40mg/dLを超えた場合に家族性複合型高脂血症に羅患していると判断する、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の方法。

[5] 被験者カゝら採取した被検体試料中の small,dense LDLコレステロール濃度を測定することを含む、家族性複合型高脂血症患者にぉヽて動脈硬化性疾患を起こす危険性を判定する方法。

[6] 被験者力採取した被検体試料中の small,dense LDLコレステロール濃度の増カロが、前記被験者の動脈硬化性疾患を起こす危険性の増加を示す、請求項 5記載の家族性複合型高脂血症において動脈硬化性疾患を起こす危険性を判定する方法。

[7] small.dense LDLコレステロール濃度の測定が、被検体試料中の small,dense LDLをそれ以外の LDLと分離する、またはそれ以外の LDLを反応させコレステロールを消去する第 1工程、ならびに small,dense LDL以外の LDLを分離または消去した後で small, dense LDL中のコレステロールを測定する第 2工程からなる請求項 5または 6に記載の家族性複合型高脂血症において動脈硬化性疾患を起こす危険性を判定する方法。

[8] 被検体試料が血清または血漿であり、血清または血漿中の small,dense LDLコレステロール定量値が 40mg/dLを超えた場合に家族性複合型高脂血症患者において動脈硬化性疾患を起こす危険性があると判定する、請求項 5〜7のヽずれか 1項に記載の方法。

[9] small.dense LDLコレステロールの測定用試薬を含む、家族性複合型高脂血症検出用キット。