WO2007121864A1 - Laser-scanning microscope with main beam splitter for spatial separation of illumination and detection radiation - Google Patents

Laser-scanning microscope with main beam splitter for spatial separation of illumination and detection radiation Download PDF

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WO2007121864A1
WO2007121864A1 PCT/EP2007/003241 EP2007003241W WO2007121864A1 WO 2007121864 A1 WO2007121864 A1 WO 2007121864A1 EP 2007003241 W EP2007003241 W EP 2007003241W WO 2007121864 A1 WO2007121864 A1 WO 2007121864A1
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Ralf Wolleschensky
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Carl Zeiss Mikrolmaging Gmbh
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Definitions

  • the invention relates to a laser scanning microscope with an illumination beam source and a detection beam path, the radiation in a sample and / or backscattered radiation along an optical axis to a detector device and in which a beam splitter is provided on the output from the illumination beam source Illumination radiation is directed in an illumination beam path to the sample, wherein the beam splitter does not pass to the sample specularly reflected illumination radiation to the detector device and arranged for this purpose in a pupil of the illumination beam path and partially mirrored
  • the object of a laser scanning microscope is that the illumination radiation, which is excitation radiation in the mentioned case of fluorescence microscopy, must be separated from the radiation to be detected, since in most cases the illumination radiation and the detection radiation are guided via a common objective, ie the illumination radiation is incident on the objective, with which the detection radiation is also conducted to the detector. It is therefore customary to couple the illumination radiation via a beam splitter which ensures that back-reflected illumination radiation does not pass to the sample or to the smallest possible proportion to the detector.
  • fluorescence microscopy one makes use of the Stokes-induced wavelength shift between detection and excitation radiation and uses suitable dichroic elements for the beam splitter, which is why the term "color splitter" or main color splitter has become established for the beam splitter. Are different lighting and
  • Excitation radiation remains or that the detection radiation is unnecessarily attenuated when passing through the beam splitter.
  • DE 10257237A1 A spectrally independent approach is DE 10257237A1.
  • the laser scanning microscope of the type mentioned therein uses the fact that radiation coming from the sample is usually incoherent, i. is non-directionally emitted at the sample, whereas specularly reflected excitation or illumination radiation couples directionally into the detection beam path.
  • DE 10257237A1 therefore proposes to insert a beam splitter into a pupil of the illumination beam path, which is transparent at the point of penetration of the optical axis and otherwise mirrored. At the same time, the illumination radiation is focused precisely on this transparent spot.
  • laser scanning microscopy is particularly suitable for examining biological samples.
  • the amount of time it takes to take an image is naturally a significant factor in biological samples, especially when examining living samples or analyzing fast-paced processes. It is therefore constant efforts in laser scanning microscopy to increase the image acquisition speed.
  • Microscope systems have recently been described that sample a specimen not with a dot-like spot (ie, not with a confocal dot scanner), but use a cell-shaped illumination and scan (ie, a confocal slit).
  • DE 10257237A1 provides a suitable beam splitter ready, in which then a line-shaped area in the form of a narrow rectangle is mirrored on the beam splitter.
  • the invention is therefore the object of a laser scanning microscope of the type mentioned in such a way that a fast image recording is possible without the associated with a slit depth resolution restriction.
  • This object is achieved according to the invention with a laser scanning microscope with an illumination beam source and a detection beam path, the radiation in a sample and / or backscattered radiation along an optical axis to a detector device and in which a beam splitter is provided on the output from the illumination beam source Illumination radiation is directed in an illumination beam path to the sample, wherein the beam splitter on the sample does not allow mirroring reflected illumination radiation to pass to the detector device and arranged in a pupil of the illumination beam path and partially mirrored, dissolved, wherein the beam splitter has a lying in the detection beam path beam splitter surface, the is mirrored at three points which lie on the beam splitter surface on a circle around the piercing point of the optical axis, and in which the illumination beam source has a number a corresponding to the number of points a n generates partial beams and focuses them on the points of the beam splitter in such a way that an interference pattern in the form of illumination spots distributed periodically over the sample is formed in the sample.
  • the solution according to the invention can also be inverted by the beam splitter reflecting the detection radiation and allowing it to pass specularly reflected illumination radiation.
  • a laser scanning microscope is provided with an illumination beam source and a detection beam path which guides radiation excited and / or backscattered in a sample along an optical axis to a detector device and in which a beam splitter is provided via the illumination radiation emitted by the illumination beam source is directed to the sample in an illumination beam path, wherein the beam splitter on the sample does not pass mirroring reflected illumination radiation to the detector device and arranged in a pupil of the illumination beam path and partially mirrored, wherein the beam splitter has a lying in the detection beam path reflecting beam splitter surface which at least three Points for the Illumination radiation is not mirrored, which lie on the beam splitter surface on a circle around the piercing point of the optical axis, and the illumination beam source generates a number of points corresponding to the number of partial beams and these focused on the three points of the beam splitter such
  • the invention achieves highly efficient dot group generation by means of a simple construction.
  • the beam splitter is formed so that the sample is illuminated with a point group in the form of a pattern generated by interference.
  • This allows parallel illumination of multiple points and also parallel scanning of these simultaneously illuminated points when the detector device performs multi-point detection on the illuminated spots.
  • a sampling rate multiplied by the number of dots is obtained without affecting the depth resolution.
  • the illumination (in fluorescence microscopy, excitation) of the sample with the regular dot group pattern is made according to the present invention utilizing an interference effect, so that the number of illumination rays provided by the illumination source is much smaller than the numbers of illumination spots in the regular pattern.
  • the interference effect only requires at least three reflective dots / transmitting holes on the beam splitter, onto which the illumination radiation is focused, so that at least three illumination beams are coupled in at the beam splitter.
  • This number of illumination beams (in this specification the term "beam” is used synonymously for a corresponding beam) can be easily generated.
  • the illumination beam source comprises a laser emitting a laser beam and a divider which divides the laser beam into the at least three sub-beams and focuses on the points / holes by means of an optical device.
  • the number of reflective or transmissive points is not limited to three. It is also possible to use more points which should be distributed as equidistantly as possible or equidistant on the circle or along the circumference, but which must be disjoint. At four points, these may be e.g. lie at the corners of a square, in the center of which the puncture point is located.
  • the microscope according to the invention with the beam splitter which effects the illumination by utilizing the interference achieves, as already mentioned, a high scanning speed by parallelization of the illumination and possibly detection.
  • the requirements for the scanning mechanism required for scanning are drastically reduced, since it is only necessary to perform a shift within a period of the periodic dot group pattern for scanning the image area.
  • the scanning device if it is designed, for example, as an optical scanner acting in the beam path, then only has to achieve a comparatively small deflection angle. This matches the scanning speed as well as simplifications of apparatus.
  • the interference-related generation of the illumination point group pattern makes it possible to easily adjust the brightness of the light spots with respect to the dark areas surrounding the light spots, namely by varying the intensity of respectively diagonally opposite partial beams.
  • suitable means for variation which are arranged upstream of the beam splitter in the illumination direction, and are formed for example in the form of adjustable attenuation elements.
  • the number of bright spots in the dot group pattern depends exclusively on the illuminated area on the sample, if in the illumination beam path substantially an image of the pupil, in which the beam splitter is arranged, is made on the sample.
  • the illuminated area of the sample and thus the number of sample points can then be effected simply by means for the focal length variation of the image between the beam splitter and the sample.
  • means for changing the image field size detected by the optical image automatically also vary the number of illumination spots that are formed on the sample by the interference.
  • Parallel detection of the simultaneously illuminated spots on the sample increases the image acquisition speed.
  • Such a parallel scan can be achieved in a particularly simple manner if the detection beam path ends in a matrix detector, which can optionally be preceded by a pinhole mask tuned to the illumination pattern.
  • the spatially resolving elements of the matrix detector can also assume the function of the pinhole mask.
  • the reflective elements of the beam splitter must only reflect for illumination radiation, not for detection radiation. The beam splitter can therefore also be formed dichroic.
  • the dot pitch in the dot group pattern can be adjusted via the distance of the foci to the beam splitter, ie over the circle radius.
  • FIG. 1 shows a schematic view of a laser scanning microscope
  • FIG. 2 shows an alternative embodiment of an illumination source for the microscope of FIG. 1,
  • FIG. 3 shows a plan view of a beam splitter of the microscope of FIG. 1 and FIG. 4 shows an illumination pattern on the sample caused by the microscope of FIG.
  • Figure 1 shows a laser scanning microscope 1 in a schematic representation.
  • the solid lines represent the illumination beam path B; the dashed lines represent the detection beam path 2.
  • the laser scanning microscope images a sample 3 onto a detector 4 in a scanning manner, the sample being illuminated by means of an illumination source 5.
  • the detection beam path 2 has from the sample 3 to the detector 4 along an optical axis OA an objective 6 and a tube lens 7, which is followed by a scanning objective 8a, after which a scanner 9 is provided.
  • a relay optics 8b, 10 and a Pinholeoptik 11 the radiation passes through a beam splitter 13 and passes to a detector 4, which is designed here as a matrix detector, and a filter 12 is arranged upstream for blocking last portions of the illumination.
  • the detection beam path 2 can also be configured differently, for example, one can do without the filter 12 as well as the intermediate image provided in the construction of FIG. 2 between the elements 8a and 7, which is symbolized by a dashed line.
  • the pupil planes in which the scanner 9 and the beam splitter 13 to be explained are located are conjugate to each other and to the rear focal plane of the objective 6, which is drawn between the elements 6 and 7 as a solid line.
  • the illumination source 5 has a laser 14, which generates four partial beams Sa, Sb, Sc, Sd by means of a divider device 16, which will be explained in more detail, wherein in FIG Center rays are drawn.
  • the divider 16 focuses these four sub-beams Sa-d, of which only two can be seen in the schematic representation of FIG. 1 (the other two are one above the other perpendicular to the plane of the drawing) onto the beam splitter 13.
  • the divider 16 has two dividers 17 and 18 and a deflecting mirror 19, which generate four parallel partial beams Sa, Sb and Sc and Sd from the one beam S emitted by the laser 14.
  • the partial beams Sa and Sb are superimposed, as are the partial beams Sc and Sd.
  • Lenses 20 and 21 in the divider 16 cause the focusing such that the partial beams Sa-c are focused on four points on the surface of the beam splitter 13.
  • the generation of the four partial beams Sa-c can, of course, also be carried out by a differently designed divider device 16 or, in principle, differently, for example in which four lasers 14 are used.
  • a possible further embodiment for the divider device 16 is shown in FIG. 2, in which the divider 18 and the mirror 19 are interchanged with the divider 17.
  • FIG. 3 shows the beam splitter 13 in plan view of its beam splitter surface 22.
  • Arranged on the beam splitter surface 22 are four reflecting mirror surface elements 23a, 23b, 23c and 23d which lie at the vertices of an imaginary square 24 whose center forms the piercing point 25 of the optical axis OA , Only there is the beam splitter surface 25 reflective, in the remaining region it is transmissive at least for detection radiation.
  • the illumination source 5 focuses the four partial beams Sa-d onto the four mirror surface elements 23a-d.
  • the partial beams focused and reflected in the pupil reach the interference, whereby the multispot pattern shown in FIG
  • the multi-spot pattern 28 arises in the sample.
  • the multi-spot pattern 28 is a regular array of
  • Light spots 26 which are surrounded by a dark area 27.
  • the intensity difference between the light spots 26 and the dark area 27, that is to say the depth of the zeros, can be determined by changing the intensities of the respectively opposite partial beams Sa, Sd and Sb.
  • the spatial extent of the pattern 28 can be adjusted by varying the magnification scale of the microscope (eg, variation of the focal length at 10 and 8b) by using the Image field in the sample that covers the pattern 28 is changed.
  • the focal length of the lenses 10, 21 can be adjusted.
  • the effect of the beam splitter 13 is as follows:
  • the dot pattern 28 with regularly arranged light spots 26 is formed on the sample 3.
  • fluorescence is thus excited at the light spots 26.
  • This arises spatially incoherent and thus fills homogeneously the rear focal plane of the microscope 6 (drawn between the elements 6 and 7 as a solid line).
  • diffuse reflection which can also be used for image acquisition.
  • the incoherent radiation to be detected also fills the entire pupil, in which the beam splitter 13 is arranged, and thus illuminates the entire beam splitter surface 22.
  • specularly reflected illumination radiation is focused onto the mirror surface elements 23a-d and thus reflected back to the illumination source 5.
  • the beam splitter 13 passes only the radiation to be detected, the spatially incoherent, d. H. undirected in sample 3.
  • the beam splitter 13 thus causes a separation of detection radiation and specularly reflected illumination radiation without a chromatic adjustment would have to be made.
  • This has the advantage that not only a higher yield is achieved, also the beam splitter 13 can be used for a variety of illumination wavelengths and detection wavelengths. The usually provided with color dividers exchange mechanisms or change gears are not necessary.
  • the detection takes place, for example, with the detector 4, which is designed as a matrix detector and may optionally be preceded by a pinhole mask.
  • the illuminated spots are displayed confocally.
  • This mask can lie in an intermediate image plane of the observation beam path in front of the detector or alternatively in the relay optics (between 10 and 8b). The latter also improves the beam profile on the lighting side.
  • the scanning of the sample 3 is effected by the action of the scanner 9.
  • a much smaller displacement of the illuminating light spots on the sample 3 is required than is required for a single-point scanner.
  • the individual light spots 26 are shifted by the scanner 9 simultaneously, as they are caused by interference in the sample. It is sufficient therefore one Movement by means of the scanner 9, which scans the dark area 27 between adjacent light spots 26.
  • the scanning displacement of the light spots therefore preferably takes place within only one period length of the periodic regular pattern 28.
  • the construction shown in FIG. 1 can also be inverted to interchange the detection beam path from the beam splitter 13 and the illumination source 5.
  • the beam splitter 13 is then negative with respect to the mirroring to the construction shown in Figure 3, i. the mirror surface elements 23a-d are holes in a mirror surface.

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Abstract

A laser-scanning microscope is provided with an illumination beam source (5) and a detection beam path (2), which guides radiation excited in a sample (3) and/or back-scattered along an optical axis (OA) to a detector device (4), and in which a beam splitter (13) is provided by means of which light radiation emitted from the illumination beam source (5) is aimed in an illumination radiation path (B) towards the sample (3), wherein the beam splitter (13) does not let illumination radiation reflecting specularly on the sample (3) pass to the detector device (4), and, to this end, is located in an aperture diaphragm of the illumination beam path (B) and is partially reflected. The beam splitter (13) comprises a beam splitter surface (22) in the detection beam path (2) that is reflected for the illumination radiation at at least three points (23a-d) that lie on the beam splitter surface (22) on a circle around the penetration point (25) of the optical axis (OA), and the illumination beam source creates a number of partial beams (Sa-d) corresponding to the number of points and focuses these on the three points (23a-d) such that an interference pattern (28) arises in the sample (3) in the form of illumination spots (26) periodically distributed over the sample (113).

Description

Laser-Scanning-Mikroskop mit Hauptstrahlteiler zur räumlichen Trennung von Beleuchtunqs- und Detektionsstrahlung Laser scanning microscope with main beam splitter for the spatial separation of illumination and detection radiation
Die Erfindung bezieht sich auf ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle und einem Detektionsstrahlengang, der in einer Probe angeregte und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse zu einer Detektoreinrichtung leitet und in dem ein Strahlteiler vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang auf die Probe gerichtet ist, wobei der Strahlteiler an der Probe spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges angeordnet sowie teilverspiegelt istThe invention relates to a laser scanning microscope with an illumination beam source and a detection beam path, the radiation in a sample and / or backscattered radiation along an optical axis to a detector device and in which a beam splitter is provided on the output from the illumination beam source Illumination radiation is directed in an illumination beam path to the sample, wherein the beam splitter does not pass to the sample specularly reflected illumination radiation to the detector device and arranged for this purpose in a pupil of the illumination beam path and partially mirrored
Für Laser-Scanning-Mikroskope, die, wie beispielsweise in der DE 19702753A1 beschrieben ist, eine Probe durch Abrastern einer konfokalen Abbildung erfassen, ist die Untersuchung biologischer Präparate mittels Fluoreszenzmikroskopie eine verbreitete Anwendung. Dabei wird in einer Probe Fluoreszenz angeregt, wodurch gegenüber der Anregungsstrahlung spektral Stokes-verschobene Fluoreszenzstrahlung entsteht, die dann mit dem Laser-Scanning- Mikroskop konfokal detektiert wird. Anstelle einer konfokalen Detektion kann auch eine Weitfelddetektion erfolgen, beispielsweise im Falle einer Multi-Photonen-Anregung.For laser scanning microscopes, which, as described, for example, in DE 197 02 753 A1, detect a sample by scanning a confocal image, the investigation of biological preparations by means of fluorescence microscopy is a widespread application. In this case, fluorescence is excited in a sample, whereby compared to the excitation radiation spectrally Stokes-shifted fluorescence radiation is produced, which is then detected confocally with the laser scanning microscope. Instead of confocal detection, far-field detection can also be performed, for example in the case of multi-photon excitation.
Grundsätzlich stellt sich bei einem Laser-Scanning-Mikroskop die Aufgabe, daß die Beleuchtungsstrahlung, die im erwähnten Fall der Fluoreszenzmikroskopie Anregungsstrahlung ist, von der zu detektierenden Strahlung getrennt werden muß, da zumeist die Beleuchtungsstrahlung und die Detektionsstrahlung über ein gemeinsames Objektiv geführt werden, d.h. die Beleuchtungsstrahlung fällt über das Objektiv ein, mit dem auch die Detektionsstrahlung zum Detektor geleitet wird. Es ist deshalb üblich, die Beleuchtungsstrahlung über einen Strahlteiler einzukoppeln, der dafür sorgt, daß an der Probe rückreflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht oder zu einem möglichst geringen Anteil zum Detektor passiert. In der Fluoreszenzmikroskopie macht man sich die Stokes-bedingte Wellenlängenverschiebung zwischen Detektions- und Anregungsstrahlung zunutze und verwendet für den Strahlteiler geeignete dichroitische Elemente, weshalb sich für den Strahlteiler auch der Begriff Farbteiler oder Hauptfarbteiler eingebürgert hat. Unterscheiden sich Beleuchtungs- undIn principle, the object of a laser scanning microscope is that the illumination radiation, which is excitation radiation in the mentioned case of fluorescence microscopy, must be separated from the radiation to be detected, since in most cases the illumination radiation and the detection radiation are guided via a common objective, ie the illumination radiation is incident on the objective, with which the detection radiation is also conducted to the detector. It is therefore customary to couple the illumination radiation via a beam splitter which ensures that back-reflected illumination radiation does not pass to the sample or to the smallest possible proportion to the detector. In fluorescence microscopy, one makes use of the Stokes-induced wavelength shift between detection and excitation radiation and uses suitable dichroic elements for the beam splitter, which is why the term "color splitter" or main color splitter has become established for the beam splitter. Are different lighting and
Detektionsstrahlung jedoch spektral nicht, hilft dieser Ansatz nicht weiter. Auch ist dieSpectral detection radiation but not spectrally, this approach does not help. Also is the
Trennschärfe eines dichroitischen Strahlteilers begrenzt, was entweder dazu führt, daß imSelective power of a dichroic beam splitter limited, which either leads to that in the
Detektionsstrahlengang nach dem Strahlteiler immer noch an der Probe rückreflektierteDetection beam path after the beam splitter still reflected back to the sample
Anregungsstrahlung verbleibt oder daß die Detektionsstrahlung beim Durchgang durch den Strahlteiler unnötig abgeschwächt wird.Excitation radiation remains or that the detection radiation is unnecessarily attenuated when passing through the beam splitter.
Einen spektral unabhängigen Ansatz stellt die DE 10257237A1 vor. Das dort beschriebene Laser-Scanning-Mikroskop der eingangs genannten Art verwendet die Tatsache, daß von der Probe kommende Strahlung in der Regel inkohärent, d.h. nicht gerichtet an der Probe emittiert wird, wohingegen spiegelnd reflektierte Anregungs- oder Beleuchtungsstrahlung gerichtet in den Detektionsstrahlengang einkoppelt. Die DE 10257237A1 schlägt deshalb vor, in eine Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs einen Strahlteiler einzufügen, der am Durchstoßpunkt der optischen Achse transparent und ansonsten verspiegelt ist. Zugleich wird die Beleuchtungsstrahlung genau auf diesen transparenten Fleck fokussiert. Im Ergebnis erhält man damit eine flächige Beleuchtung der Probe und zugleich gelangt an der Probe spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung wieder auf die Spiegelfläche des Strahlteilers und wird dadurch aus dem nachfolgenden Teil des Detektionsstrahlengangs aufgespiegelt. Die diffus in der Probe erzeugte Detektionsstrahlung hingegen wird nicht fokussiert, füllt die ganze Pupille und wird fast vollständig transmittiert. Der als Auskoppelgrad der Beleuchtungsstrahlung zu verstehende Wirkungsgrad dieses Strahlteilers ist also nur durch das Flächenverhältnis von Pupille zu transparentem Fleck gegeben. Er kann bei geeigneter Fokussierung der Beleuchtungsstrahlung weit über 90% liegen. Der derart durch die DE 10257237A1 erreichte Strahlteiler ist spektral unempfindlich und erlaubt eine hohe Ausbeute der Detektionsstrahlung.A spectrally independent approach is DE 10257237A1. The laser scanning microscope of the type mentioned therein uses the fact that radiation coming from the sample is usually incoherent, i. is non-directionally emitted at the sample, whereas specularly reflected excitation or illumination radiation couples directionally into the detection beam path. DE 10257237A1 therefore proposes to insert a beam splitter into a pupil of the illumination beam path, which is transparent at the point of penetration of the optical axis and otherwise mirrored. At the same time, the illumination radiation is focused precisely on this transparent spot. As a result, this results in a surface illumination of the sample and at the same time specularly reflected illumination radiation arrives on the specimen again on the mirror surface of the beam splitter and is thus reflected from the subsequent part of the detection beam path. In contrast, the detection radiation generated diffusely in the sample is not focused, fills the entire pupil and is almost completely transmitted. The efficiency of this beam splitter to be understood as the coupling-out degree of the illumination radiation is therefore given only by the area ratio of the pupil to the transparent spot. It can be well over 90% with a suitable focusing of the illumination radiation. The beam splitter thus achieved by DE 10257237A1 is spectrally insensitive and allows a high yield of the detection radiation.
Die Laser-Scanning-Mikroskopie eignet sich, wie bereits erwähnt, besonders zur Untersuchung biologischer Proben. Die Zeitdauer, die für die Aufnahme eines Bildes benötigt wird, ist bei biologischen Proben naturgemäß ein bedeutender Faktor, insbesondere wenn man lebende Proben untersuchen oder schnell ablaufende Vorgänge analysieren möchte. Es ist deshalb stetes Bestreben in der Laser-Scanning-Mikroskopie, die Bildaufnahmegeschwindigkeit zu steigern. Hierzu sind in letzter Zeit vermehrt Mikroskopsysteme beschrieben worden, die eine Probe nicht mit einem punkt-artigen Lichtfleck (d.h. mit nicht einem konfokalen Punkt-Scanner) abtasten, sondern mit einer zellenförmigen Beleuchtung und Abtastung (d.h. eine konfokale Schlitzblende) verwenden. Auch hierfür stellt die DE 10257237A1 einen geeigneten Strahlteiler bereit, bei dem dann ein zeilenförmiger Bereich in Form eines schmalen Rechteckes auf dem Strahlteiler verspiegelt ist.As already mentioned, laser scanning microscopy is particularly suitable for examining biological samples. The amount of time it takes to take an image is naturally a significant factor in biological samples, especially when examining living samples or analyzing fast-paced processes. It is therefore constant efforts in laser scanning microscopy to increase the image acquisition speed. Microscope systems have recently been described that sample a specimen not with a dot-like spot (ie, not with a confocal dot scanner), but use a cell-shaped illumination and scan (ie, a confocal slit). For this purpose too, DE 10257237A1 provides a suitable beam splitter ready, in which then a line-shaped area in the form of a narrow rectangle is mirrored on the beam splitter.
Zwar erreichen zeilen-scannende Systeme eine hohe Bildaufnahmegeschwindigkeit, jedoch ist die Tiefenschärfeauflösung gegenüber einem punkt-scannenden System vermindert, da es in der konfokalen Abbildung mit der Schlitzblende prinzipbedingt zu einem gewissen Übersprechen längs der Schlitzblendenrichtung kommt.Although line-scanning systems achieve a high image recording speed, the depth of focus resolution is reduced in comparison with a point-scanning system, since in the confocal imaging with the slit diaphragm there is a certain degree of crosstalk along the slit-direction.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde ein Laser-Scanning-Mikroskop der eingangs genannten Art so weiterzubilden, daß eine schnelle Bildaufnahme möglich ist, ohne die mit einer Schlitzblende einhergehende Tiefenauflösungseinschränkung.The invention is therefore the object of a laser scanning microscope of the type mentioned in such a way that a fast image recording is possible without the associated with a slit depth resolution restriction.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle und einem Detektionsstrahlengang, der in einer Probe angeregte und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse zu einer Detektoreinrichtung leitet und in dem ein Strahlteiler vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang auf die Probe gerichtet ist, wobei der Strahlteiler an der Probe spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges angeordnet sowie teilverspiegelt ist, gelöst, bei dem der Strahlteiler eine im Detektionsstrahlengang liegende Strahlteilerfläche aufweist, die an drei Punkten verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche auf einen Kreis um den Durchstoßpunkt der optischen Achse liegen, und bei dem die Beleuchtungsstrahlquelle eine der Punktzahl entsprechende Anzahl an Teilstrahlen erzeugt und diese auf die Punkte des Strahlteilers derart fokussiert, daß in der Probe ein Interferenzmuster in Form periodisch über die Probe verteilter Beleuchtungsflecke entsteht.This object is achieved according to the invention with a laser scanning microscope with an illumination beam source and a detection beam path, the radiation in a sample and / or backscattered radiation along an optical axis to a detector device and in which a beam splitter is provided on the output from the illumination beam source Illumination radiation is directed in an illumination beam path to the sample, wherein the beam splitter on the sample does not allow mirroring reflected illumination radiation to pass to the detector device and arranged in a pupil of the illumination beam path and partially mirrored, dissolved, wherein the beam splitter has a lying in the detection beam path beam splitter surface, the is mirrored at three points which lie on the beam splitter surface on a circle around the piercing point of the optical axis, and in which the illumination beam source has a number a corresponding to the number of points a n generates partial beams and focuses them on the points of the beam splitter in such a way that an interference pattern in the form of illumination spots distributed periodically over the sample is formed in the sample.
Die erfindungsgemäße Lösung läßt sich natürlich auch invertieren, indem der Strahlteiler die Detektionsstrahlung ausspiegelt und spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung passieren läßt. Dazu ist vorgesehen, ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle und einem Detektionsstrahlengang, der in einer Probe angeregte und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse zu einer Detektoreinrichtung leitet und in dem ein Strahlteiler vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang auf die Probe gerichtet ist, wobei der Strahlteiler an der Probe spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges angeordnet sowie teilverspiegelt ist, wobei der Strahlteiler eine im Detektionsstrahlengang liegende reflektierende Strahlteilerfläche aufweist, die zumindest an drei Punkten für die Beleuchtungsstrahlung nicht verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche auf einem Kreis um den Durchstoßpunkt der optischen Achse liegen, und die Beleuchtungsstrahlquelle eine der Punktzahl entsprechende Anzahl von Teilstrahlen erzeugt und diese auf die drei Punkte des Strahlteilers derart fokussiert, daß in der Probe ein Interferenzmuster in Form periodisch über die Probe verteilter Beleuchtungsflecke entsteht.Of course, the solution according to the invention can also be inverted by the beam splitter reflecting the detection radiation and allowing it to pass specularly reflected illumination radiation. For this purpose, a laser scanning microscope is provided with an illumination beam source and a detection beam path which guides radiation excited and / or backscattered in a sample along an optical axis to a detector device and in which a beam splitter is provided via the illumination radiation emitted by the illumination beam source is directed to the sample in an illumination beam path, wherein the beam splitter on the sample does not pass mirroring reflected illumination radiation to the detector device and arranged in a pupil of the illumination beam path and partially mirrored, wherein the beam splitter has a lying in the detection beam path reflecting beam splitter surface which at least three Points for the Illumination radiation is not mirrored, which lie on the beam splitter surface on a circle around the piercing point of the optical axis, and the illumination beam source generates a number of points corresponding to the number of partial beams and these focused on the three points of the beam splitter such that in the sample an interference pattern in shape periodically over the sample distributed illumination spots arises.
Die Erfindung erzielt eine hocheffiziente Punktgruppenerzeugung mittels eines einfachen Aufbaus.The invention achieves highly efficient dot group generation by means of a simple construction.
Erfindungsgemäß wird der Strahlteiler so ausgebildet, daß die Probe mit einer Punktgruppe in Form eines durch Interferenz erzeugten Musters beleuchtet wird. Dies erlaubt eine parallele Beleuchtung mehrerer Punkte und auch ein paralleles Abtasten dieser gleichzeitig beleuchteten Punkte, wenn die Detektoreinrichtung eine Multipunktdetektion an den beleuchteten Flecken vornimmt. Im Ergebnis erhält man gegenüber einer Einzelpunktbeleuchtung eine um die Punktanzahl vervielfachte Abtastgeschwindigkeit, ohne daß die Tiefenauflösung beeinträchtigt wäre. Die Beleuchtung (in der Fluoreszenzmikroskopie, Anregung) der Probe mit dem regelmäßigen Punktgruppenmuster erfolgt erfindungsgemäß unter Ausnutzung eines Interferenzeffektes, so daß die Anzahl an Beleuchtungsstrahlen, welche die Beleuchtungsquelle bereitstellt, sehr viel geringer ist, als die Anzahlen an Beleuchtungsflecken im regelmäßigen Muster. Der Interferenzeffekt benötigt lediglich mindestens drei reflektierende Punkte / transmittierende Löcher am Strahlteiler, auf die die Beleuchtungsstrahlung fokussiert wird, so daß man mindestens drei Beleuchtungsstrahlen am Strahlteiler einkoppelt. Diese Anzahl an Beleuchtungsstrahlen (in dieser Beschreibung wird der Begriff "Strahl" synonym für ein entsprechendes Strahlbündel verwendet) läßt sich einfach erzeugen. Z.B. werden bei einem Ausgangsstrahl lediglich zwei Teilerelemente benötigt. Es ist deshalb bevorzugt, daß die Beleuchtungsstrahlquelle einen Laser, der einen Laserstrahl abgibt, und eine Teilereinrichtung, die den Laserstrahl in die mindestens drei Teilstrahlen aufteilt und mittels einer Optikeinrichtung auf die Punkte / Löcher fokussiert, aufweist.According to the invention, the beam splitter is formed so that the sample is illuminated with a point group in the form of a pattern generated by interference. This allows parallel illumination of multiple points and also parallel scanning of these simultaneously illuminated points when the detector device performs multi-point detection on the illuminated spots. As a result, compared with a single-point illumination, a sampling rate multiplied by the number of dots is obtained without affecting the depth resolution. The illumination (in fluorescence microscopy, excitation) of the sample with the regular dot group pattern is made according to the present invention utilizing an interference effect, so that the number of illumination rays provided by the illumination source is much smaller than the numbers of illumination spots in the regular pattern. The interference effect only requires at least three reflective dots / transmitting holes on the beam splitter, onto which the illumination radiation is focused, so that at least three illumination beams are coupled in at the beam splitter. This number of illumination beams (in this specification the term "beam" is used synonymously for a corresponding beam) can be easily generated. For example, For a single output beam, only two divider elements are needed. It is therefore preferred that the illumination beam source comprises a laser emitting a laser beam and a divider which divides the laser beam into the at least three sub-beams and focuses on the points / holes by means of an optical device.
Die Anzahl an reflektierenden bzw. transmittierenden Punkten ist nicht auf drei begrenzt. Es können auch mehr Punkte verwendet werden, die auf dem Kreis symmetrisch bzw. entlang der Kreislinie möglichst gleich verteilt oder äquidistant liegen sollten, aber disjunkt sein müssen. Bei vier Punkten können diese z.B. an den Ecken eines Quadrates liegen, in dessen Zentrum sich der Durchstoßpunkt befindet.The number of reflective or transmissive points is not limited to three. It is also possible to use more points which should be distributed as equidistantly as possible or equidistant on the circle or along the circumference, but which must be disjoint. At four points, these may be e.g. lie at the corners of a square, in the center of which the puncture point is located.
Das erfindungsgemäße Mikroskop mit dem die Beleuchtung unter Ausnutzung der Interferenz bewirkenden Strahlteiler erzielt, wie bereits erwähnt, eine hohe Scangeschwindigkeit durch Parallelisierung der Beleuchtung und gegebenenfalls Detektion. Zugleich können in einer vorteilhaften Ausgestaltung die Anforderungen an den zum Scannen erforderlichen Scanmechanismus drastisch reduziert werden, da es zum Abrastern der Bildfläche nur noch erforderlich ist, eine Verschiebung innerhalb einer Periode des periodischen Punktgruppenmusters auszuführen. Die Scaneinrichtung muß also, wenn sie beispielsweise als optischer im Strahlengang wirkender Scanner ausgebildet ist, nur noch einen vergleichsweise geringen Ablenkwinkel erreichen. Dies kommt der Scangeschwindigkeit wie apparativen Vereinfachungen gleichermaßen entgegen. Es ist deshalb in einer Weiterbildung zu bevorzugen, daß in Beleuchtungsrichtung dem Strahlteiler nachgeordnet eine Scaneinrichtung vorgesehen ist, die eine Verschiebung des Punkgruppenmusters über der Probe innerhalb einer Periode des Punktgruppenmusters bewirkt. Neben einer strahlablenkend arbeitenden Scaneinrichtung kann dabei natürlich auch eine Bewegung der Probe, z. B. durch einen sogenannten Tischscanner, verwendet werden.The microscope according to the invention with the beam splitter which effects the illumination by utilizing the interference achieves, as already mentioned, a high scanning speed by parallelization of the illumination and possibly detection. At the same time in one Advantageous configuration, the requirements for the scanning mechanism required for scanning are drastically reduced, since it is only necessary to perform a shift within a period of the periodic dot group pattern for scanning the image area. The scanning device, if it is designed, for example, as an optical scanner acting in the beam path, then only has to achieve a comparatively small deflection angle. This matches the scanning speed as well as simplifications of apparatus. It is therefore preferable in a development that in the illumination direction of the beam splitter downstream of a scanning device is provided which causes a shift of the punk group pattern on the sample within a period of the dot group pattern. In addition to a beam deflecting scanning device can of course also a movement of the sample, z. B. by a so-called table scanner.
Die interferenzbedingte Erzeugung des Beleuchtungs-Punktgruppenmusters erlaubt es, die Helligkeit der Lichtflecke gegenüber den die Lichtflecke umgebenden Dunkelbereichen einfach zu verstellen, indem nämlich die Intensität jeweils diagonal gegenüberliegend fokussierter Teilstrahlen variiert wird. Es sind deshalb in einer Weiterbildung der Erfindung geeignete Mittel zur Variation vorgesehen, die dem Strahlteiler in Beleuchtungsrichtung vorgeordnet sind, und beispielsweise in Form einstellbarer Abschwächelemente ausgebildet sind.The interference-related generation of the illumination point group pattern makes it possible to easily adjust the brightness of the light spots with respect to the dark areas surrounding the light spots, namely by varying the intensity of respectively diagonally opposite partial beams. There are therefore provided in a development of the invention suitable means for variation, which are arranged upstream of the beam splitter in the illumination direction, and are formed for example in the form of adjustable attenuation elements.
Die Anzahl an hellen Flecken im Punktgruppenmuster hängt ausschließlich von dem ausgeleuchteten Bereich auf der Probe ab, wenn im Beleuchtungsstrahlengang im wesentlichen eine Abbildung der Pupille, in welcher der Strahlteiler angeordnet ist, auf die Probe erfolgt. Der beleuchtete Bereich der Probe und damit die Anzahl an Probenpunkten läßt sich dann einfach durch Mittel zur Brennweitenvariation der Abbildung zwischen Strahlteiler und Probe bewirken. Mit anderen Worten, Mittel zur Veränderung der von der optischen Abbildung erfaßten Bildfeldgröße variieren automatisch auch die Anzahl an Beleuchtungspunkten, die auf der Probe durch die Interferenz entstehen.The number of bright spots in the dot group pattern depends exclusively on the illuminated area on the sample, if in the illumination beam path substantially an image of the pupil, in which the beam splitter is arranged, is made on the sample. The illuminated area of the sample and thus the number of sample points can then be effected simply by means for the focal length variation of the image between the beam splitter and the sample. In other words, means for changing the image field size detected by the optical image automatically also vary the number of illumination spots that are formed on the sample by the interference.
Eine parallele Detektion der gleichzeitig beleuchteten Flecken auf der Probe erhöht, wie bereits erwähnt, die Bildaufnahmegeschwindigkeit. Besonders einfach kann eine solche parallele Abtastung erreicht werden, wenn der Detektionsstrahlengang in einem Matrixdetektor endet, dem optional noch eine auf das Beleuchtungsmuster abgestimmte Pinholemaske vorgeordnet werden kann. Natürlich können aber auch die ortsauflösenden Elemente des Matrixdetektors die Funktion der Pinholemaske übernehmen. Die reflektierenden Elemente des Strahlteilers müssen nur für Beleuchtungsstrahlung reflektieren, nicht für Detektionsstrahlung. Der Strahlteiler kann also auch dichroitisch ausgebildet werden.Parallel detection of the simultaneously illuminated spots on the sample, as already mentioned, increases the image acquisition speed. Such a parallel scan can be achieved in a particularly simple manner if the detection beam path ends in a matrix detector, which can optionally be preceded by a pinhole mask tuned to the illumination pattern. Of course, however, the spatially resolving elements of the matrix detector can also assume the function of the pinhole mask. The reflective elements of the beam splitter must only reflect for illumination radiation, not for detection radiation. The beam splitter can therefore also be formed dichroic.
Der Punktabstand im Punktgruppenmuster kann über den Abstand der Foki auf den Strahlteiler, also über den Kreisradius, verstellt werden.The dot pitch in the dot group pattern can be adjusted via the distance of the foci to the beam splitter, ie over the circle radius.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielshalber noch näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:The invention will be explained in more detail by way of example with reference to the drawings. In the drawings shows:
Figur 1 eine Schemadarstellung eines Laser-Scanning-Mikroskops,FIG. 1 shows a schematic view of a laser scanning microscope;
Figur 2 eine alternative Ausgestaltung einer Beleuchtungsquelle für das Mikroskop der Figur 1 ,FIG. 2 shows an alternative embodiment of an illumination source for the microscope of FIG. 1,
Figur 3 eine Draufsicht auf einen Strahlteiler des Mikroskops der Figur 1 und Figur 4 ein vom Mikroskop der Figur 1 bewirktes Beleuchtungsmuster auf der Probe.3 shows a plan view of a beam splitter of the microscope of FIG. 1 and FIG. 4 shows an illumination pattern on the sample caused by the microscope of FIG.
Figur 1 zeigt ein Laser-Scanning-Mikroskop 1 in schematischer Darstellung. Die durchgezogenen Linien stellen den Beleuchtungsstrahlengang B dar; die gestrichelten Linien den Detektionsstrahlengang 2. Das Laser-Scanning-Mikroskop bildet eine Probe 3 rasternd auf einen Detektor 4 ab, wobei die Probe mittels einer Beleuchtungsquelle 5 beleuchtet wird.Figure 1 shows a laser scanning microscope 1 in a schematic representation. The solid lines represent the illumination beam path B; the dashed lines represent the detection beam path 2. The laser scanning microscope images a sample 3 onto a detector 4 in a scanning manner, the sample being illuminated by means of an illumination source 5.
Der Detektionsstrahlengang 2 weist von der Probe 3 zum Detektor 4 längs einer optischen Achse OA ein Objektiv 6 sowie eine Tubuslinse 7 auf, der ein Scanobjektiv 8a folgt, nach der ein Scanner 9 vorgesehen ist. Nach einer Relaisoptik 8b, 10 sowie einer Pinholeoptik 11 passiert die Strahlung einen Strahlteiler 13 und gelangt zu einem Detektor 4, der hier als Matrixdetektor ausgebildet ist, und dem ein Filter 12 zum Abblocken letzter Anteile der Beleuchtungsstrahlung vorgeordnet ist. Natürlich kann der Detektionsstrahlengang 2 auch anders ausgestaltet sein, beispielsweise kann man auf den Filter 12 sowie auf das in der Bauweise der Figur 2 zwischen den Elementen 8a und 7 vorgesehene Zwischenbild, das durch eine gestrichelte Linie symbolisiert ist, verzichten.The detection beam path 2 has from the sample 3 to the detector 4 along an optical axis OA an objective 6 and a tube lens 7, which is followed by a scanning objective 8a, after which a scanner 9 is provided. After a relay optics 8b, 10 and a Pinholeoptik 11 the radiation passes through a beam splitter 13 and passes to a detector 4, which is designed here as a matrix detector, and a filter 12 is arranged upstream for blocking last portions of the illumination. Of course, the detection beam path 2 can also be configured differently, for example, one can do without the filter 12 as well as the intermediate image provided in the construction of FIG. 2 between the elements 8a and 7, which is symbolized by a dashed line.
Im in Figur 1 gezeigten Mikroskop 1 sind die Pupillenebenen, in denen der Scanner 9 sowie der noch zu erläuternde Strahlteiler 13 liegen, zueinander und zur rückwärtigen Brennebene des Objektives 6, die zwischen den Elementen 6 und 7 als durchgezogene Linie eingezeichnet ist, konjugiert.In the microscope 1 shown in FIG. 1, the pupil planes in which the scanner 9 and the beam splitter 13 to be explained are located are conjugate to each other and to the rear focal plane of the objective 6, which is drawn between the elements 6 and 7 as a solid line.
Die Beleuchtungsquelle 5 weist einen Laser 14 auf, der durch eine Teilereinrichtung 16, die noch näher erläutert wird, vier Teilstrahlen Sa, Sb, Sc, Sd erzeugt, wobei in Figur 1 nur die Mittelstrahlen eingezeichnet sind. Die Teilereinrichtung 16 fokussiert diese vier Teilstrahlen Sa-d, von denen in der schematischen Darstellung der Figur 1 nur zwei zu sehen sind (die anderen zwei liegen senkrecht zur Zeichenebene übereinander) auf den Strahlteiler 13.The illumination source 5 has a laser 14, which generates four partial beams Sa, Sb, Sc, Sd by means of a divider device 16, which will be explained in more detail, wherein in FIG Center rays are drawn. The divider 16 focuses these four sub-beams Sa-d, of which only two can be seen in the schematic representation of FIG. 1 (the other two are one above the other perpendicular to the plane of the drawing) onto the beam splitter 13.
Im einzelnen weist die Teilereinrichtung 16 zwei Teiler 17 und 18 und einen Umlenkspiegel 19 auf, die aus dem einen vom Laser 14 abgegebenen Strahl S vier parallele Teilstrahlen Sa, Sb sowie Sc und Sd erzeugen. In der Darstellung der Figur 1 liegen die Teilstrahlen Sa und Sb übereinander, wie auch die Teilstrahlen Sc und Sd. Linsen 20 und 21 in der Teilereinrichtung 16 bewirken die Fokussierung derart, daß die Teilstrahlen Sa-c auf vier Punkte auf der Fläche des Strahlteilers 13 fokussiert werden.In detail, the divider 16 has two dividers 17 and 18 and a deflecting mirror 19, which generate four parallel partial beams Sa, Sb and Sc and Sd from the one beam S emitted by the laser 14. In the illustration of Figure 1, the partial beams Sa and Sb are superimposed, as are the partial beams Sc and Sd. Lenses 20 and 21 in the divider 16 cause the focusing such that the partial beams Sa-c are focused on four points on the surface of the beam splitter 13.
Die Erzeugung der vier Teilstrahlen Sa-c kann natürlich auch durch eine andersartig ausgebildete Teilereinrichtung 16 oder grundsätzlich anders erfolgen, beispielsweise in dem vier Laser 14 verwendet werden. Eine mögliche weitere Ausgestaltung für die Teilereinrichtung 16 ist in Figur 2 gezeigt, in der der Teiler 18 und der Spiegel 19 mit dem Teiler 17 vertauscht sind.The generation of the four partial beams Sa-c can, of course, also be carried out by a differently designed divider device 16 or, in principle, differently, for example in which four lasers 14 are used. A possible further embodiment for the divider device 16 is shown in FIG. 2, in which the divider 18 and the mirror 19 are interchanged with the divider 17.
Figur 3 zeigt den Strahlteiler 13 in Draufsicht auf dessen Strahlteilerfläche 22. Auf der Strahlteilerfläche 22 sind vier reflektierende Spiegelflächenelemente 23a, 23b, 23c und 23d angeordnet, die an den Eckpunkten eines gedachten Quadrates 24 liegen, dessen Zentrum der Durchstoßpunkt 25 der optischen Achse OA bildet. Nur dort ist die Strahlteilerfläche 25 reflektierend, im übrigen Bereich ist sie transmittierend zumindest für Detektionsstrahlung.FIG. 3 shows the beam splitter 13 in plan view of its beam splitter surface 22. Arranged on the beam splitter surface 22 are four reflecting mirror surface elements 23a, 23b, 23c and 23d which lie at the vertices of an imaginary square 24 whose center forms the piercing point 25 of the optical axis OA , Only there is the beam splitter surface 25 reflective, in the remaining region it is transmissive at least for detection radiation.
Die Beleuchtungsquelle 5 fokussiert die vier Teilstrahlen Sa-d auf die vier Spiegelflächenelemente 23a-d. In der Probe 3 gelangen die derart in die Pupille fokussiert und reflektierten Teilstrahlen zur Interferenz, wodurch das in Figur 4 dargestellte Multispot-MusterThe illumination source 5 focuses the four partial beams Sa-d onto the four mirror surface elements 23a-d. In the sample 3, the partial beams focused and reflected in the pupil reach the interference, whereby the multispot pattern shown in FIG
28 in der Probe entsteht. Das Multispot-Muster 28 ist eine regelmäßige Anordnung von28 arises in the sample. The multi-spot pattern 28 is a regular array of
Lichtflecken 26, die von einem Dunkelbereich 27 umgeben sind. Die Intensitätsdifferenz zwischen den Lichtflecken 26 und dem Dunkelbereich 27, also die Tiefe der Nullstellen, kann durch Änderung der Intensitäten der jeweils gegenüberliegenden Teilstrahlen Sa, Sd und Sb,Light spots 26, which are surrounded by a dark area 27. The intensity difference between the light spots 26 and the dark area 27, that is to say the depth of the zeros, can be determined by changing the intensities of the respectively opposite partial beams Sa, Sd and Sb.
Sc variiert werden. Dabei werden diagonal (bezogen auf die optische Achse) gegenüberliegende Teilstrahlen oder jeweils durch einen dazwischenliegenden Teilstrahl getrennte Teilstrahlen vorzugsweise gleichsinnig eingestellt. Bei drei Teilstrahlen wird einer gegenüber zwei verstellt (oder umgekehrt).Sc be varied. In this case, diagonal (with respect to the optical axis) opposite partial beams or in each case separated by a partial beam between them partial beams are preferably adjusted in the same direction. With three partial beams one is adjusted opposite two (or vice versa).
Die räumliche Ausdehnung des Musters 28 kann durch Variation des Vergrößerungsmaßstabes des Mikroskops (z.B. Variation der Brennweite bei 10 und 8b) angepaßt werden, indem das Bildfeld in der Probe, das das Muster 28 überdeckt, verändert wird. Alternativ kann die Brennweite der Linsen 10, 21 dazu eingestellt werden.The spatial extent of the pattern 28 can be adjusted by varying the magnification scale of the microscope (eg, variation of the focal length at 10 and 8b) by using the Image field in the sample that covers the pattern 28 is changed. Alternatively, the focal length of the lenses 10, 21 can be adjusted.
Die Wirkung des Strahlteilers 13 ist wie folgt:The effect of the beam splitter 13 is as follows:
Durch die geometrische Anordnung der Spiegelflächenelemente 23a-d und die darauf fokussierten Teilstrahlen Sa-d entsteht das Punkt-Muster 28 mit regelmäßig angeordneten Lichtflecken 26 auf der Probe 3. Bei einer Anwendung in der Fluoreszenzmikroskopie wird somit an den Lichtflecken 26 Fluoreszenz angeregt. Diese entsteht räumlich inkohärent und füllt somit homogen die rückwärtige Brennebene des Mikroskops 6 (zwischen den Elementen 6 und 7 als durchgezogene Linie eingezeichnet). Analoges gilt für diffuse Reflektion, die ebenfalls zur Bildgewinnung herangezogen werden kann.Due to the geometrical arrangement of the mirror surface elements 23a-d and the partial beams Sa-d focused thereon, the dot pattern 28 with regularly arranged light spots 26 is formed on the sample 3. When used in fluorescence microscopy, fluorescence is thus excited at the light spots 26. This arises spatially incoherent and thus fills homogeneously the rear focal plane of the microscope 6 (drawn between the elements 6 and 7 as a solid line). The same applies to diffuse reflection, which can also be used for image acquisition.
Da die rückwärtige Brennebene mit der Pupille, in welcher der Strahlteiler 13 angeordnet ist, konjugiert ist, füllt die zu detektierende inkohärente Strahlung auch die gesamte Pupille, in der der Strahlteiler 13 angeordnet ist und leuchtet somit die gesamte Strahlteilerfläche 22 aus. Spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung wird dagegen auf die Spiegelflächenelemente 23a-d fokussiert und somit zur Beleuchtungsquelle 5 zurückgeworfen.Since the rear focal plane is conjugate with the pupil, in which the beam splitter 13 is arranged, the incoherent radiation to be detected also fills the entire pupil, in which the beam splitter 13 is arranged, and thus illuminates the entire beam splitter surface 22. By contrast, specularly reflected illumination radiation is focused onto the mirror surface elements 23a-d and thus reflected back to the illumination source 5.
Im Ergebnis passiert den Strahlteiler 13 nur die zu detektierende Strahlung, die räumlich inkohärent, d. h. ungerichtet in der Probe 3 entstand. Der Strahlteiler 13 bewirkt damit eine Trennung von Detektionsstrahlung und spiegelnd reflektierter Beleuchtungsstrahlung ohne daß eine chromatische Einstellung vorgenommen werden müßte. Dies hatte den Vorteil, daß nicht nur eine höhere Ausbeute erreicht wird, auch kann der Strahlteiler 13 für verschiedenste Beleuchtungswellenlängen und Detektionswellenlängen verwendet werden. Die üblicherweise bei Farbteilern vorgesehenen Austauschmechanismen bzw. Wechselräder sind nicht nötig.As a result, the beam splitter 13 passes only the radiation to be detected, the spatially incoherent, d. H. undirected in sample 3. The beam splitter 13 thus causes a separation of detection radiation and specularly reflected illumination radiation without a chromatic adjustment would have to be made. This has the advantage that not only a higher yield is achieved, also the beam splitter 13 can be used for a variety of illumination wavelengths and detection wavelengths. The usually provided with color dividers exchange mechanisms or change gears are not necessary.
Die Detektion (in Figur 1 ist der Pupillenstrahlengang gestrichelt gezeichnet) erfolgt beispielshalber mit dem als Matrixdetektor ausgebildeten Detektor 4, dem optional eine Pinholemaske vorgeordnet sein kann. Dabei werden die beleuchteten Spots konfokal abgebildet. Diese Maske kann in einer Zwischenbildebene des Beobachtungsstrahlenganges vor dem Detektor liegen oder alternativ in die Relaisoptik (zwischen 10 und 8b) gestellt werden. Letzteres verbessert das Strahlprofil auch beleuchtungsseitig.The detection (in FIG. 1, the pupil beam path is shown by dashed lines) takes place, for example, with the detector 4, which is designed as a matrix detector and may optionally be preceded by a pinhole mask. The illuminated spots are displayed confocally. This mask can lie in an intermediate image plane of the observation beam path in front of the detector or alternatively in the relay optics (between 10 and 8b). The latter also improves the beam profile on the lighting side.
Das Abtasten der Probe 3 erfolgt durch Wirkung des Scanners 9. Dabei ist eine sehr viel geringere Verschiebung der beleuchtenden Lichtflecke auf der Probe 3 nötig, als dies bei einem Einzelpunktscanner erforderlich ist. Die einzelnen Lichtflecke 26 werden vom Scanner 9 simultan verschoben, da sie durch Interferenz in der Probe entstehen. Es genügt deshalb eine Bewegung mittels des Scanners 9, die den Dunkelbereich 27 zwischen benachbarten Lichtflecken 26 abtastet. Die scannende Verschiebung der Lichtflecke erfolgt also vorzugsweise nur innerhalb einer Periodenlänge des periodischen regelmäßigen Musters 28.The scanning of the sample 3 is effected by the action of the scanner 9. In this case, a much smaller displacement of the illuminating light spots on the sample 3 is required than is required for a single-point scanner. The individual light spots 26 are shifted by the scanner 9 simultaneously, as they are caused by interference in the sample. It is sufficient therefore one Movement by means of the scanner 9, which scans the dark area 27 between adjacent light spots 26. The scanning displacement of the light spots therefore preferably takes place within only one period length of the periodic regular pattern 28.
Der in Figur 1 gezeigte Aufbau kann auch dahingehend invertiert werden, daß der Detektionsstrahlengang ab dem Strahlteiler 13 und die Beleuchtungsquelle 5 vertauscht werden. Der Strahlteiler 13 ist dann bezüglich der Verspiegelung negativ zu der in Figur 3 gezeigten Bauweise, d.h. die Spiegelflächenelemente 23a-d sind Löcher in einer Spiegelfläche. The construction shown in FIG. 1 can also be inverted to interchange the detection beam path from the beam splitter 13 and the illumination source 5. The beam splitter 13 is then negative with respect to the mirroring to the construction shown in Figure 3, i. the mirror surface elements 23a-d are holes in a mirror surface.

Claims

Patentansprüche claims
1. Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle (5) und einem Detektionsstrahlengang (2), der in einer Probe angeregte (3) und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse (OA) zu einer Detektoreinrichtung (4) leitet und in dem ein Strahlteiler (13) vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle (5) abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang (B) auf die Probe (3) gerichtet ist, wobei der Strahlteiler (13) an der Probe (3) spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung (4) passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges (B) angeordnet sowie teilverspiegelt ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlteiler (13) eine im Detektionsstrahlengang (2) liegende Strahlteilerfläche (22) aufweist, die zumindest an drei Punkten (23a-d) für die Beleuchtungsstrahlung verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche (22) auf einem Kreis um den Durchstoßpunkt (25) der optischen Achse (OA) liegen, und die Beleuchtungsstrahlquelle (5) eine der Punktzahl entsprechende Anzahl von Teilstrahlen (Sa-d) erzeugt und diese auf die drei Punkte (23a-d) des Strahlteilers (13) derart fokussiert, daß in der Probe (3) ein Interferenzmuster (28) in Form periodisch über die Probe (13) verteilter Beleuchtungsflecke (26) entsteht.1. A laser scanning microscope with an illumination beam source (5) and a detection beam path (2) in a sample excited (3) and / or backscattered radiation along an optical axis (OA) to a detector device (4) passes and in the a beam splitter (13) is provided over which illuminating radiation emitted by the illumination beam source (5) is directed onto the sample (3) in an illumination beam path (B), wherein the beam splitter (13) does not reflect specularly reflected illumination radiation on the specimen (3) Detector device (4) pass and arranged in a pupil of the illumination beam path (B) and partially mirrored, characterized in that the beam splitter (13) in the detection beam path (2) lying beam splitter surface (22) which at least at three points (23a -d) is mirrored for the illumination radiation, which on the beam splitter surface (22) on a circle around the puncture point (25) of the optical Axis (OA) are located, and the illumination beam source (5) generates a number of sub-beams (Sa-d) corresponding to the number of points and focuses them on the three points (23a-d) of the beam splitter (13) such that in the sample (3 ) an interference pattern (28) in the form of periodically over the sample (13) distributed illumination spots (26) is formed.
2. Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle (5) und einem Detektionsstrahlengang (2), der in einer Probe angeregte (3) und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse (OA) zu einer Detektoreinrichtung (4) leitet und in dem ein Strahlteiler (13) vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle (5) abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang (B) auf die Probe (3) gerichtet ist, wobei der Strahlteiler (13) an der Probe (3) spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung (4) passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges (B) angeordnet sowie teilverspiegelt ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlteiler (13) eine im Detektionsstrahlengang (2) liegende reflektierende Strahlteilerfläche (22) aufweist, die zumindest an drei Punkten (23a-d) für die Beleuchtungsstrahlung nicht verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche (22) auf einem Kreis um den Durchstoßpunkt (25) der optischen Achse (OA) liegen, und die Beleuchtungsstrahlquelle (5) eine der Punktzahl entsprechende Anzahl von Teilstrahlen (Sa-d) erzeugt und diese auf die drei Punkte (23a-d) des Strahlteilers (13) derart fokussiert, daß in der Probe (3) ein Interferenzmuster (28) in Form periodisch über die Probe (13) verteilter Beleuchtungsflecke (26) entsteht.2. Laser scanning microscope with an illumination beam source (5) and a detection beam path (2) in a sample excited (3) and / or backscattered radiation along an optical axis (OA) to a detector device (4) passes and in the a beam splitter (13) is provided over which illuminating radiation emitted by the illumination beam source (5) is directed onto the sample (3) in an illumination beam path (B), wherein the beam splitter (13) does not reflect specularly reflected illumination radiation on the specimen (3) Detector device (4) and arranged in a pupil of the illumination beam path (B) and partially mirrored, characterized in that the beam splitter (13) in the detection beam (2) lying reflective beam splitter surface (22), at least at three points ( 23a-d) for the Illumination radiation is not mirrored, which lie on the beam splitter surface (22) on a circle around the piercing point (25) of the optical axis (OA), and the illumination beam source (5) generates a number of points corresponding to the number of partial beams (Sa-d) focused on the three points (23a-d) of the beam splitter (13) such that in the sample (3) an interference pattern (28) in the form of periodically over the sample (13) distributed illumination spots (26) arises.
3. Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungsstrahlquelle (5) einen Laser (14), der einen Laserstrahl (S) abgibt, und eine Teilereinrichtung (16), die den Laserstrahl (S) in die Teilstrahlen (Sa-d) aufteilt und mittels einer Optikeinrichtung (20, 21 ) auf die Punkte (23a-d) fokussiert, aufweist.3. A microscope according to claim 1 or 2, characterized in that the illumination beam source (5) comprises a laser (14) emitting a laser beam (S), and a divider (16), the laser beam (S) in the partial beams (Sa -d) and by means of an optical device (20, 21) focused on the points (23a-d) has.
4. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Scanneinrichtung (8), die in Beleuchtungsrichtung dem Strahlteiler (13) nachgeordnet ist und ein Abscannen durch Verschieben des Interferenzmusters (28) auf die Probe (3) bewirkt, wobei die Verschiebung innerhalb einer Periode der periodisch verteilten Beleuchtungsflecke (26) erfolgt.4. Microscope according to one of the above claims, characterized by a scanning device (8) which is downstream of the beam splitter (13) in the illumination direction and a scanning by moving the interference pattern (28) on the sample (3) causes, wherein the displacement within a Period of periodically distributed illumination spots (26) takes place.
5. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch Mittel zur Variation der Intensität jeweils diagonal gegenüberliegend fokussierter Teilstrahlen (Sa, Sc; Sb, Sd).5. Microscope according to one of the above claims, characterized by means for varying the intensity of each diagonally opposite focused partial beams (Sa, Sc, Sb, Sd).
6. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektionsstrahlengang in einem Matrixdetektor (4) endet.6. Microscope according to one of the above claims, characterized in that the detection beam path ends in a matrix detector (4).
7. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch Mittel zur Brennweitenvariation (10, 8a, 8b) zwischen Strahlteiler (13) und Probe (3). 7. Microscope according to one of the above claims, characterized by means for focal length variation (10, 8a, 8b) between the beam splitter (13) and sample (3).
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