WO2007119692A1 - METHOD OF INHIBITING CANCER CELL PROLIFERATION BY REGULATING eIF4H EXPRESSION - Google Patents

Abstract

It is intended to enable more effective and sure detection, diagnosis and treatment against cancers, in particular, digestive cancers such as colon cancer, and provide various biomolecules which are usable in developing systems for gene diagnosis and clinical studies on gene therapy for the cancers as described above. Namely, a method of inhibiting the proliferation of cancer cells which comprises regulating the expression of eIF-4H; a medicinal composition which contains an siRNA specific to eIF-4H as the active ingredient; a method of screening a substance having an activity of inhibiting the proliferation of cancer cells based on the expression amount of eIF-4H; and so on.

Description

明 細 書  Specification

eIF4H発現抑制による癌細胞の増殖阻害方法  Inhibition of cancer cell growth by suppressing eIF4H expression

技術分野  Technical field

[0001] 本発明は、真核生物翻訳開始因子（eucaryotic Initiation Factor 4H: elF- 4H)、特 にヒトの eIF-4H (以降、本明細書において、特に断わりのない限り、「eIF-4H」はヒト由 来の eIF-4Hを意味する）の発現を抑制することから成る、癌細胞の増殖阻害方法、 el F4Hに特異的な siRNAのような eIF4Hの発現を抑制し得る物質を活性成分として含 有する癌細胞増殖阻害剤、及び、 eIF-4Hの発現量に基ぐ癌細胞増殖阻害活性を 有する物質のスクリーニング方法等に関する。  [0001] The present invention relates to a eukaryotic translation initiation factor (eucaryotic Initiation Factor 4H: elF-4H), particularly human eIF-4H (hereinafter referred to as “eIF-4H” unless otherwise specified). Suppresses the expression of human-derived eIF-4H), a method for inhibiting the growth of cancer cells, and a substance capable of suppressing the expression of eIF4H, such as siRNA specific for el F4H, as an active ingredient The present invention relates to a cancer cell growth inhibitor and a screening method for a substance having cancer cell growth inhibitory activity based on the expression level of eIF-4H.

背景技術  Background art

[0002] 今までに、二次元電気泳動（2— DE)及び質量分析等の種々のプロテオミクス技術 によって、癌の診断'治療に有用な癌特異的な蛋白質が同定されている。このような 癌特異的な蛋白質に関する研究の多くは、疾患特異的な様式で増加調節又は減少 調節されるものに焦点が当てられてきた。し力しながら、蛋白質の選択的スプライシン グ変異体及び蛋白質の翻訳後修飾に関する報告は余りない。  Until now, cancer-specific proteins useful for cancer diagnosis and treatment have been identified by various proteomic techniques such as two-dimensional electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry. Much of the research on such cancer-specific proteins has focused on those that are up- or down-regulated in a disease-specific manner. However, there are few reports on alternative splicing variants of proteins and post-translational modifications of proteins.

[0003] ヒト遺伝子の 60%が少なくとも一つの選択的スプライシング変異体 (バリアント）を有 しているといわれており (Black, D丄.（2003). Mechanisms of alternative pre— messeng er RNA splicing. Annu Rev Biochem 72, 291-336)、このような変異体が癌等のヒトの 疾患において重要な役割を担っていることも報告されている（Brinkman, B.M. (2004). Splice variants as cancer biomar ers.し lin Biochem 37, 584-594)。従って、このよつ な選択的スプライシング変異体は有力な診断ツール又は薬剤ターゲットに成る可能 '性があると考えられる。  [0003] It is said that 60% of human genes have at least one alternatively spliced variant (variant) (Black, D 丄. (2003). Mechanisms of alternative pre—messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem 72, 291-336), it has also been reported that such mutants play an important role in human diseases such as cancer (Brinkman, BM (2004). Splice variants as cancer biomar ers. Lin Biochem 37, 584-594). Therefore, such alternative splicing variants may be potential diagnostic tools or drug targets.

[0004] 真核生物翻訳開始因子 4H (eucaryotic Initiation Factor 4H: eIF-4H)は最初にゥ サギ赤血球における翻訳を刺激する物質として同定された (Rogers, G.W., Jr., Richt er, N.J., ana Merrick, W.C. (1999). Biochemical and kinetic characterization of the RNA helicase activity of eukaryotic initiation factor 4A. J Biol Chem 274, 12236—12 244) o eIF_4Hは真核生物における翻訳開始因子ファミリーの一員として、 eIF_4F複 合体のサブユニットである eIF_4Aのへリカーゼ活性を促進することによって蛋白質合 成を刺激することが知られている（Richter-Cook, N.J., Dever, T.E., Hensold, J.O., a nd Merrick, W.し. (1998). Purincation and characterization of a new eukaryotic prot ein translation factor. Eukaryotic initiation factor 4H. J Biol Chem 273, 7579—7587; ) o更に、 eIF-4Hは他の幾つかの開始因子の活性を促進して、 4E-BP1による阻害等 の負調節を打ち消している可能性も指摘されている（Lin, T.A., Kong, X., Haystead, T.A., Pause, A., Belsham, G., bonenberg, N., ana Lawrence, J.し., Jr. (1994). PHA S— I as a link between mitogen— activated protein kinase and translation initiation. Sci ence 266, 653-656)。従って、 eIF-4Hは、 eIF-4E又は- 4Gの活性化を通じて直接的 又は間接的に様々な悪性腫瘍 (癌）関連 mRNAの翻訳を変化させることによって、 細胞増殖及び腫瘍形成に関与している可能性がある。 [0004] Eucaryotic Initiation Factor 4H (eIF-4H) was first identified as a substance that stimulates translation in rabbit erythrocytes (Rogers, GW, Jr., Richter, NJ, ana Merrick, WC (1999) .Biochemical and kinetic characterization of the RNA helicase activity of eukaryotic initiation factor 4A.J Biol Chem 274, 12236-12 244) o eIF_4H is a member of the eukaryotic translation initiation factor family. It is known to stimulate protein synthesis by promoting the helicase activity of the subunit eIF_4A (Richter-Cook, NJ, Dever, TE, Hensold, JO, nd Merrick, W. (1998). Purincation and characterization of a new eukaryotic prot ein translation factor. Eukaryotic initiation factor 4H. J Biol Chem 273, 7579—7587;) o Furthermore, eIF-4H promotes the activity of several other initiation factors. It is also pointed out that the negative regulation such as inhibition by 4E-BP1 may be canceled (Lin, TA, Kong, X., Haystead, TA, Pause, A., Belsham, G., bonenberg, N , ana Lawrence, J. and Jr. (1994). PHA S—I as a link between mitogen—activated protein kinase and translation initiation. Science 266, 653-656). Thus, eIF-4H is involved in cell proliferation and tumorigenesis by altering the translation of various malignant (cancer) -related mRNAs directly or indirectly through activation of eIF-4E or -4G there is a possibility.

[0005] eIF_4H遺伝子は、 7ql l.23における隣接遺伝子群の欠損が原因である多重人格を 発生する疾患であるウイリアムズ症候群で欠損していることが知られている力 これが 該症候群の発生とどのような関係があるかにっ 、ては未だ解明されて 、な 、。該遺 伝子の選択的スプライシングによって 2つ変異体、即ち、ァイソフォーム 1及びァイソ フォーム 2 (ェクソン 5が欠失したもの）が生じ、これらは夫々、分子量 27kDa及び 25k Daを有する。これら 2つのアイソフォームの特異的な機能は未だ判っていないが、分 子量の小さ!/、ァイソフォーム 2はヒト細胞にお!、てはより多く存在して 、ることが知られ ている（Martindale, D.W., Wilson, M.D., Wang, D., Burke, R.D., Chen, X., Duronio , V., and Koop, B.F. (2000). Comparative genomic sequence analysis of the Williams syndrome region (LIMK1-RFC2) of human chromosome 7ql l.23. Mamm Genome 1 1, 890- 898 :非特許文献 1)。  [0005] The eIF_4H gene is known to be deficient in Williams syndrome, a disease that develops multiple personalities caused by the loss of adjacent genes in 7ql l.23. The relationship has not yet been elucidated. Alternative splicing of the gene results in two variants, namely isoform 1 and isoform 2 (deleting exon 5), which have molecular weights of 27 kDa and 25 kDa, respectively. Although the specific functions of these two isoforms are not yet known, it is known that the molecular weight is small! /, And isoform 2 is present more in human cells! (Martindale, DW, Wilson, MD, Wang, D., Burke, RD, Chen, X., Duronio, V., and Koop, BF (2000). Comparative genomic sequence analysis of the Williams syndrome region (LIMK1-RFC2 ) of human chromosome 7ql l.23. Mamm Genome 1 1, 890-898: Non-patent document 1).

[0006] 本発明者等は既に、原発大腸癌における蛋白質の発現をァガロース 2— DEを用 いて分析し、腫瘍組織とそれに隣接する正常組織の間で、幾つ力の蛋白質に関する pi及び分子量が異なることを見出し、その一つとして、 eIF_4Hの選択的スプライシン グ変異体であるアイソフォーム 1の発現が殆どの腫瘍組織にぉ 、て増加して 、ること 見出した (Tomonaga, T., Matsushita, K., Yamagucni, Oh- Ishi, M., Kodera, Y., Maeda, T., Shimada, H., Ochiai, T., and Nomura, F. (2004). Identification of altere d protein expression and post— translational modifications in primary colorectal cance r by using agarose two-dimensional gel electrophoresis. Clin Cancer Res 10, 2007—2 014 :非特許文献 2)。 [0006] The present inventors have already analyzed protein expression in primary colorectal cancer using agarose 2-DE, and the pi and molecular weight of proteins with different strengths differ between tumor tissue and normal tissue adjacent thereto. One of them was that the expression of isoform 1, an alternative splicing variant of eIF_4H, was found to increase in most tumor tissues (Tomonaga, T., Matsushita, K ., Yamagucni, Oh- Ishi, M., Kodera, Y., Maeda, T., Shimada, H., Ochiai, T., and Nomura, F. (2004). Identification of altere d protein expression and post— translational modifications in primary colorectal cancer by using agarose two-dimensional gel electrophoresis. Clin Cancer Res 10, 2007—2 014: Non-patent document 2).

非特許文献 l : Martindale, D.W., Wilson, M.D., Wang, D.， Burke, R.D., Chen, X., Duronio, V., and Koop, B.F. (2000). Comparative genomic sequence analysis of the Williams syndrome region (LIMK1-RFC2) of human chromosome 7ql l.23. Mamm Ge nome 11, 890-898  Non-patent literature l: Martindale, DW, Wilson, MD, Wang, D., Burke, RD, Chen, X., Duronio, V., and Koop, BF (2000). Comparative genomic sequence analysis of the Williams syndrome region ( LIMK1-RFC2) of human chromosome 7ql l.23.Mamm Ge nome 11, 890-898

非特許文献 2 : Tomonaga, T.， Matsushita, K., Yamaguchi, S.， Oh-Ishi, M., Kodera, Y., Maeda, T., bhimada, H., Ochiai, T., and Nomura, F. (2004). Identification of alt ered protein expression and post— translational modifications in primary colorectal ca ncer by using agarose two-dimensional gel electrophoresis. Clin Cancer Res 10, 200 7-2014  Non-Patent Document 2: Tomonaga, T., Matsushita, K., Yamaguchi, S., Oh-Ishi, M., Kodera, Y., Maeda, T., bhimada, H., Ochiai, T., and Nomura, F. (2004). Identification of alt ered protein expression and post— translational modifications in primary colorectal cancer by using agarose two-dimensional gel electrophoresis. Clin Cancer Res 10, 200 7-2014

発明の開示  Disclosure of the invention

発明が解決しょうとする課題  Problems to be solved by the invention

[0007] 従って、本発明は、癌、特に大腸癌に代表される消化器癌等のより有効で確実な検 出 '診断'治療を提供すること、及び、このような癌の遺伝子診断システムと遺伝子治 療臨床研究システムの開発に利用される各種の生体分子を提供すること等を目的と する。 [0007] Therefore, the present invention provides a more effective and reliable detection 'diagnosis' treatment for cancer, particularly digestive organ cancer represented by colorectal cancer, and a genetic diagnosis system for such cancer. The purpose is to provide various biomolecules used in the development of clinical research systems for gene therapy.

課題を解決するための手段  Means for solving the problem

[0008] 本発明者は上記課題を解決すベぐ大腸癌における上記の eIF4Hァイソフォーム 1の 過剰発現が細胞増殖及び腫瘍形成に与える影響を研究した。その結果、 eIF4H発現 を抑制することによって、大腸癌等の癌細胞の増殖が特異的に阻害され、アポトーシ スが誘導されることを見出し、本発明を完成した。  [0008] The present inventor has studied the effect of overexpression of the above-mentioned eIF4H isoform 1 on cell proliferation and tumor formation in colorectal cancer to solve the above-mentioned problems. As a result, it was found that by suppressing the expression of eIF4H, proliferation of cancer cells such as colorectal cancer was specifically inhibited and apoptosis was induced, and the present invention was completed.

[0009] 即ち、本発明は、以下の各態様を含むものである。  That is, the present invention includes the following aspects.

[l] eIF-4Hの発現を抑制することから成る、癌細胞の増殖阻害方法  [l] A method for inhibiting the growth of cancer cells, comprising suppressing the expression of eIF-4H

[2] eIF-4Hの発現を有意に抑制できる物質を活性成分として含有する医薬組成物。  [2] A pharmaceutical composition comprising a substance capable of significantly suppressing the expression of eIF-4H as an active ingredient.

[3] eIF-4Hの発現量に基ぐ癌細胞増殖阻害活性を有する物質のスクリーニング方 法。 発明の効果 [3] A screening method for substances having cancer cell growth inhibitory activity based on the expression level of eIF-4H. The invention's effect

[0010] 本発明によって、 eIF-4H、特に、 eIF4Hァイソフォーム 1の発現を抑制することによつ て、癌細胞の増殖を阻害する方法、更に、 eIF-4Hに特異的な siRNAのような eIF-4H 発現を抑制する物質を有効成分として含有する癌細胞に対する特異性が高い優れ た癌細胞増殖阻害剤 (抗癌剤)等が提供される。  [0010] According to the present invention, a method for inhibiting the growth of cancer cells by suppressing the expression of eIF-4H, in particular, eIF4H isoform 1, and further, siRNA specific to eIF-4H An excellent cancer cell growth inhibitor (anticancer agent) and the like having high specificity for cancer cells containing a substance that suppresses eIF-4H expression as an active ingredient is provided.

図面の簡単な説明  Brief Description of Drawings

[0011] [図 1]転写レベルにおける eIF-4Hァイソフォーム 1の過剰発現を示すグラフである。  FIG. 1 is a graph showing the overexpression of eIF-4H isoform 1 at the transcription level.

[図 2]siRNAを用いた eIF-4Hの抑制による大腸癌細胞の増殖阻害を示す、ウェスタン プロット分析の結果 (ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真)等である。  FIG. 2 shows the results of Western plot analysis (photograph of polyacrylamide gel electrophoresis) showing inhibition of colon cancer cell growth by suppression of eIF-4H using siRNA.

[図 3]siRNA用いた eIF-4Hの抑制によっては肺繊維芽細胞株 MRC5の増殖は阻害さ れな 、ことを示す、ウェスタンブロット分析の結果 (ポリアクリルアミドゲル電気泳動の 写真)等である。  FIG. 3 shows the results of Western blot analysis (photo of polyacrylamide gel electrophoresis) showing that the growth of lung fibroblast cell line MRC5 is not inhibited by suppression of eIF-4H using siRNA.

[図 4]eIF-4Hァイソフォーム 1の発現抑制によりアポトーシスが誘導されることを示す、 細胞フローサイトメトリー分析である。  FIG. 4 is a cell flow cytometry analysis showing that apoptosis is induced by suppression of eIF-4H isoform 1 expression.

発明を実施するための最良の形態  BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

[0012] 本発明において、癌細胞における eIF-4Hの発現の抑制は、当業者に公知の任意の レベル、即ち、例えば、 eIF-4H遺伝子の転写レベル若しくは eIF-4H蛋白質の産生、 又は eIF_4H蛋白質の活性発現レベルで実施することが可能である。尚、対象となる 癌の種類に特に制限はないが、特に、大腸癌等に代表される消ィ匕器癌が好適である [0012] In the present invention, suppression of eIF-4H expression in cancer cells is performed at any level known to those skilled in the art, for example, the transcription level of eIF-4H gene or production of eIF-4H protein, or eIF_4H protein. It is possible to carry out at the activity expression level. There are no particular restrictions on the type of cancer to be treated, but in particular, extinguisher cancer typified by colorectal cancer is preferred.

[0013] 例えば、転写レベルでの抑制には、 eIF-4H遺伝子（DNA又は mRNA)を標的とす る siRNA等の RNA干渉 (RNAi)を誘導する核酸配列（eIF-4H遺伝子の部分塩基配 列に特異的な配列を有する一本鎖 RNA又は二本鎖 RNA)〖こよる遺伝子ノックダウ ン、アンチセンス RNA、又は各種のリボザィム等を用いる方法を挙げることが出来る 。又、 eIF_4H蛋白質の活性発現レベルでは、例えば、抗 eIF_4H抗体を用いる方法を 挙げることが出来る。 [0013] For example, for suppression at the transcription level, a nucleic acid sequence that induces RNA interference (RNAi) such as siRNA targeting the eIF-4H gene (DNA or mRNA) (partial base sequence of the eIF-4H gene) (Single-stranded RNA or double-stranded RNA having a specific sequence), a method using a gene knockdown, antisense RNA, various ribozymes, or the like. In addition, with respect to the activity expression level of the eIF_4H protein, for example, a method using an anti-eIF_4H antibody can be mentioned.

[0014] RNA干渉 (RNAi)を誘導する核酸は、 elF- 4Hの塩基配列（NM— 022170 (isoform 1 ), NM 031992 (isoform2)：データベース参照）に基き、当業者であれば、適宜設計 して調製することが出来る。その代表的な例としては、以下に示すいずれかの塩基配 列又はその一部の連続する塩基配列（例えば、 18〜20個の連続する塩基配列）を 含む 15〜30個の塩基力も成るオリゴヌクレオチド及びその相補的オリゴヌクレオチド から成る核酸配列、特に、 21〜23個の塩基力も成る siRNA (二本鎖 RNA)を挙げる ことが出来る。尚、かかる siRNAには、細胞内で上記核酸配列が Dicerにより消化さ れて生成されるものも含まれる。 [0014] Nucleic acids that induce RNA interference (RNAi) are appropriately designed by those skilled in the art based on the nucleotide sequence of elF-4H (see NM— 022170 (isoform 1), NM 031992 (isoform2): database)). Can be prepared. A typical example is an oligo having 15 to 30 bases including one of the following base sequences or a part of the base sequence (for example, 18 to 20 base sequences). Mention may be made, for example, of nucleic acid sequences consisting of nucleotides and their complementary oligonucleotides, in particular siRNAs (double-stranded RNAs) with a base strength of 21-23. Such siRNA includes those produced by digesting the nucleic acid sequence with Dicer in cells.

[0015] (R102) 0 -aacccacagaagaggaaagag-3 ； [0015] (R102) 0 -aacccacagaagaggaaagag-3;

(R103) 0 -aatgggtagctctcgagaatc-3 ；  (R103) 0 -aatgggtagctctcgagaatc-3;

(R104) 0 - aatctagaggtggatgggatt- 3 ' ₀ (R104) 0-aatctagaggtggatgggatt- 3 ' ₀

[0016] 特に、癌細胞で過剰発現している eIF4Hァイソフォーム 1に対して特異的に反応する 塩基配列である（103)又は（104)を含むオリゴヌクレオチドが好ましい。 [0016] In particular, an oligonucleotide containing (103) or (104) which is a base sequence that specifically reacts with eIF4H isoform 1 overexpressed in cancer cells is preferable.

[0017] 従って、本発明の医薬組成物、例えば、癌細胞増殖阻害剤は、上記に示したような el[0017] Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention, for example, a cancer cell growth inhibitor, is prepared as described above.

F-4Hの発現を有意に抑制できる物質を活性成分として含有するものである。 A substance that can significantly suppress the expression of F-4H is contained as an active ingredient.

[0018] 更に、上記の活性成分中で、 RNA又は DNAのような核酸分子は適当な発現べク ター等の当業者に公知の任意の各種の運搬ビークル内に組み込まれた状態で使用 することも可會である。 [0018] Further, among the above active ingredients, a nucleic acid molecule such as RNA or DNA should be used in a state where it is incorporated in any of various transport vehicles known to those skilled in the art, such as an appropriate expression vector. Is also pretty.

[0019] このような活性成分は当業者に公知の任意の方法、例えば、活性成分力 RNAの ような核酸分子である場合には、形質得転換法に使用される方法、例えば、リン酸力 ルシゥム法又は DOSPA (リポフエクタミン）等により構成される人工リボソームで DNA を包み込むリポフ クシヨン法等に基き対象細胞に取り込まれるようにすることが出来 る。  [0019] When such an active ingredient is any method known to those skilled in the art, for example, a nucleic acid molecule such as active ingredient strength RNA, the method used in the transformation method, for example, phosphate strength It can be incorporated into target cells based on the lipofusion method, which wraps DNA with an artificial ribosome constructed by the lucium method or DOSPA (lipofectamine).

[0020] 又、上記の医薬組成物には、各種の有効成分と組合せて、薬学上許容できる、当 業者に公知の任意の医薬キャリア一又は希釈剤等のその他の成分を含むことが出 来る。  [0020] In addition, the above pharmaceutical composition may contain other components such as any pharmaceutical carrier or diluent known to those skilled in the art in combination with various active ingredients. .

[0021] 本発明の有効成分の薬学的な有効量及び投与方法又は投与手段は、有効成分 の種類、病状の重さ、治療方針、患者の年齢、体重、性別、全般的な健康状態、及 び患者の (遺伝的)人種的背景に応じて、当業者が適宜選択することができる。例え ば、該有効成分の投与量は 0.1〜100mgZ日 Z成人、より一般的には l〜10mgZ日 z成人である。 [0021] The pharmaceutically effective amount and administration method or administration means of the active ingredient of the present invention include the type of active ingredient, the severity of the disease state, the treatment policy, the patient's age, weight, sex, general health condition, and Depending on the (genetic) racial background of the patient, those skilled in the art can select as appropriate. For example, the dosage of the active ingredient is 0.1-100 mg Z-day Z adults, more usually 1-10 mg Z-day. z Adults.

[0022] 本発明の医薬組成物は投与方法'投与経路等に応じて当業者に公知の任意の形 状とすることが出来る。それらは適当な方法で投与することが出来る。例えば、形状と しては、液体状、粉末状、及びコロイド状等があり、上記のキャリアー又は希釈剤を伴 つた形で、静脈内、腹腔内、皮下に注射するか、又は、経口投与等が挙げられる。  [0022] The pharmaceutical composition of the present invention can be in any form known to those skilled in the art depending on the administration method and route of administration. They can be administered by any suitable method. For example, liquids, powders, colloids, etc., can be injected into the above carrier or diluent, injected intravenously, intraperitoneally, subcutaneously, or orally. Is mentioned.

[0023] 本発明のスクリーニング方法は、例えば、以下の工程で実施することが出来る。  [0023] The screening method of the present invention can be carried out, for example, in the following steps.

(a)被検物質の存在下に細胞を培養する工程、  (a) culturing cells in the presence of a test substance,

(b)該細胞における eIF-4H遺伝子の発現量を測定する工程、及び  (b) measuring the expression level of the eIF-4H gene in the cell, and

(c)発現量を抑制させる物質を選択する工程。  (c) A step of selecting a substance that suppresses the expression level.

[0024] ここで、工程 (b)における eIF_4H遺伝子の発現量は、当業者に公知の任意のレベル 、即ち、例えば、 eIF-4H遺伝子の転写レベル若しくは eIF-4H蛋白質の産生、又は el F-4H蛋白質の活性発現レベルで測定することが可能である。  Here, the expression level of the eIF_4H gene in the step (b) is any level known to those skilled in the art, for example, the transcription level of the eIF-4H gene or the production of eIF-4H protein, or el F- It can be measured by the activity expression level of 4H protein.

[0025] eIF-4H遺伝子の発現量を測定は、測定方法 ·原理に応じて、定量的、半定量的、又 は定性的であり得る。特に、 eIF_4Hァイソフォームは癌細胞で過剰発現しているので 、その発現の抑制は定性的な判定で有意に検出することが可能となる。尚、発現量 を抑制させる物質の選択は、例えば、被検物質の非存在下での eIF_4H遺伝子の発 現量との比較をすることにより実施することが出来る。  [0025] The measurement of the expression level of the eIF-4H gene can be quantitative, semi-quantitative, or qualitative depending on the measurement method and principle. In particular, since eIF_4H isoform is overexpressed in cancer cells, suppression of the expression can be detected significantly by qualitative determination. The selection of the substance that suppresses the expression level can be performed by, for example, comparing with the expression level of the eIF_4H gene in the absence of the test substance.

[0026] eIF_4H蛋白質の産生量は、当業者に公知の任意の方法で測定することが可能で ある。例えば、適当な抗体を用いたウェスタンプロット等の免疫染色及び EIA等の各 種の免疫学的特異反応を利用する方法、エドマン法を用いた気相シークェンサ一等 ペプチドのアミノ酸配列分析法、更には、 MALDI— TOFZMS及び ESI Q— TO FZMS法等に代表される質量分析によって検出することが出来る。  [0026] The production amount of the eIF_4H protein can be measured by any method known to those skilled in the art. For example, a method using immunostaining such as Western plot using an appropriate antibody and various immunological specific reactions such as EIA, a gas phase sequencer using Edman's method, etc. It can be detected by mass spectrometry represented by MALDI-TOFZMS and ESI Q-TO FZMS methods.

[0027] 上記の方法の中でも、 eIF_4Hに特異的な抗体との抗原抗体反応によって該白質の 発現量を測定する検査方法が好適である。尚、ウェスタンプロット法においては、分 子量の違いに基き、ァイソフォーム 1及びアイソフォーム 2の夫々の発現量の変化を 測定することが可能となる。  [0027] Among the above methods, a test method is preferred in which the expression level of the white matter is measured by an antigen-antibody reaction with an antibody specific for eIF_4H. In the Western plot method, it is possible to measure changes in the expression levels of isoform 1 and isoform 2 based on the difference in molecular weight.

[0028] 従って、上記抗体は、 eIF_4H又はその適当な部分ポリペプチド (ペプチド断片）又は それらの各種誘導体又は複合体等を抗原物質又は免疫原として用いて、当業者に 公知の適当な方法で調製することが可能である。例えば、ポリクローナル抗体の場合 には、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、 -ヮトリ等の適当な動物に投与し、その抗血清か ら調製することが可能である。或いは、モノクローナル抗体作成法（「単クローン抗体」[0028] Therefore, the above antibody can be used by those skilled in the art using eIF_4H or an appropriate partial polypeptide (peptide fragment) or various derivatives or complexes thereof as an antigenic substance or immunogen. It can be prepared by a known appropriate method. For example, in the case of a polyclonal antibody, it can be administered to an appropriate animal such as mouse, rat, rabbit, goat, or chicken and prepared from the antiserum. Alternatively, monoclonal antibody production method ("monoclonal antibody"

、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、 1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Go ding, third edition, Academic Press, 1996)等に記載の公知の細胞融合を用いる方 法でモノクローナル抗体として調製することも可能である。 , Nagamune Kamei, Terada Hiroko, Yodogawa Shoten, 1990; "Monoclonal Antibody", prepared as a monoclonal antibody by a method using known cell fusion described in James W. Godding, third edition, Academic Press, 1996) It is also possible to do.

[0029] 尚、このような抗体は、その元来の抗体活性を失わない限り、遺伝子工学 (DNA組 換え技術）により、例えば、 Fab, F(ab')、 Fv断片等の完全な抗体由来の各種誘導体 [0029] It should be noted that such an antibody can be derived from a complete antibody such as Fab, F (ab '), Fv fragment, etc. by genetic engineering (DNA recombination technology) as long as the original antibody activity is not lost. Various derivatives of

2  2

を含む、当業者に公知の様々な形態に改変された誘導体、組換え体又はフラグメン トであっても良い。  It may be a derivative, a recombinant or a fragment modified into various forms known to those skilled in the art.

[0030] 更に、 eIF_4Hァイソフォーム 1のみ特異的に反応する抗体を使用して、例えば、 EIA 等の酵素免疫測定法により測定することが可能である。このような抗体には、酵素、 放射性同位体蛍光色素、及び金属原子等の当業者に公知の各種の標識物質で標 識されて!/ヽるちのち含まれる。  [0030] Furthermore, it is possible to measure by an enzyme immunoassay method such as EIA using an antibody that specifically reacts only with eIF_4H isoform 1. Such antibodies include those labeled with various labeling substances known to those skilled in the art, such as enzymes, radioisotope fluorescent dyes, and metal atoms.

[0031] eIF_4Hをコードする cDNA又はそれに対応する mRNAを含む核酸分子又はそれら の一部力 なるオリゴヌクレオチド、又は、 eIF_4Hの各ァイソフォームに特異的な塩基 配列から成る DNAは、例えば、 eIF_4H遺伝子の塩基配列に基づき適宜設計したプ ライマー又はプローブを使用した RT— PCR法、リアルタイム PCR等の各種定量的 P CR法、並びに各種のマイクロアレイ (DNAチップ)法等の当業者に公知の方法で増 幅 ·検出することが出来る。 PCR法で増幅された核酸分子の検出 ·同定は、その塩基 配列を直接決定する方法 (シークェンス法）、又は電気泳動との組み合わせ等、適当 な方法で行うことが出来る。  [0031] Nucleic acid molecules comprising cDNA encoding eIF_4H or its corresponding mRNA, or a partial oligonucleotide thereof, or DNA comprising a base sequence specific to each isoform of eIF_4H is, for example, the eIF_4H gene Increased by methods known to those skilled in the art, such as RT-PCR using primers or probes appropriately designed based on the base sequence of DNA, various quantitative PCR methods such as real-time PCR, and various microarray (DNA chip) methods. Width · Can be detected. Detection and identification of nucleic acid molecules amplified by the PCR method can be performed by an appropriate method such as a method for directly determining the nucleotide sequence (sequence method) or a combination with electrophoresis.

[0032] 上記のプライマー又はプローブの塩基配列は、铸型との特異的な結合が可能となる ような塩基数、例えば、 15— 40塩基、より具体的には、 15— 25塩基程度を有するこ と力 子ましく、更には、プライマー内でヘアピン構造をとつたり、センス鎖とアンチセン ス鎖とが互いにアニーリングしないような塩基配列とすることも重要である。例えば、 0 ligoTM(National Bioscience Inc.製)のような市販のプライマー設計用のソフトウェアを 使用することも可能である。 [0033] 本発明のスクリーニング方法に使用されるキットは、測定対象又は測定原理等に応じ て、適当な構成をとることが出来る。該キットは、その構成要素として、例えば、抗 elF- 4H抗体、各種の二次抗体 (標識抗体）、上記の mRNA (cDNA)の増幅用プライマ 一及び DNAチップ等で使用するハイブリダィゼーシヨン用のプローブ（例えば、 10 〜 100個程度の連続した塩基配列から成る）を含むことが出来る。更に、上記キット には、その構成 ·使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例え ば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート (容器)等が含まれる。 [0032] The base sequence of the above-mentioned primer or probe has a number of bases capable of specific binding to the cage type, for example, 15-40 bases, more specifically, about 15-25 bases. Furthermore, it is also important to have a base sequence that does not have a hairpin structure in the primer or that the sense strand and the antisense strand do not anneal to each other. For example, commercially available primer design software such as 0 ligo ™ (National Bioscience Inc.) can be used. [0033] The kit used in the screening method of the present invention can have an appropriate configuration depending on the measurement object or measurement principle. The kit includes, for example, an anti-elF-4H antibody, various secondary antibodies (labeled antibodies), a primer for amplification of the above mRNA (cDNA), and a hybridization chip used in a DNA chip and the like. Probes (for example, consisting of about 10 to 100 consecutive base sequences). Furthermore, the kit includes other elements or components known to those skilled in the art, such as various reagents, enzymes, buffers, reaction plates (containers), and the like, depending on the configuration and purpose of use.

実施例  Example

[0034] 以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の 実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない 場合には、以下の実施例は、例えば、 Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausu bel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New Y ork, N.Y, 1995等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分 子生物学的技術に従い、実施することが出来る。又、本明細書中に引用された文献 の記載内容は本明細書の開示、及び、内容の一部を構成するものである。  Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the technical scope of the present invention is not construed as being limited by the description of the following examples. Also, unless otherwise stated, the following examples are for example Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausu bel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1995, etc. can be performed according to standard genetic engineering and molecular biological techniques known to those skilled in the art. In addition, the contents of the references cited in the present specification constitute the disclosure and a part of the contents of the present specification.

[0035] ヒト組織試料の接取  [0035] Interception of human tissue samples

原発性大腸癌患者（ 10名）から術前に文書による同意を得て、術後 1時間以内に癌 部及び癌部から 5〜 10cm以内に位置する非癌組織を採取し、直ちに 80°Cの液 体窒素中で保存した。  Written informed consent was obtained from primary colorectal cancer patients (10 patients) before surgery, and cancerous tissues and non-cancerous tissues located within 5-10 cm from the cancerous part were collected within 1 hour after surgery, and immediately 80 ° C Stored in liquid nitrogen.

[0036] 細朐焙着  [0036] Roasting

2つの大腸癌細胞である LOVO及び RKO、並びに肺繊維芽細胞株 MRC5は RIKEN Cell Bank (日本茨城県つくば巿)から購入した。腫瘍細胞である LOVO及び RKO、並 びに、正常細胞である MRC5は、夫々、 10%牛胎児血清、 lOOU/mlペニシリン及び 1 00 g/mlストレプトマイシン（これらは全て、 Invitrogen, Carlsbad, CA力 購入）添カロ の RPMI- 1640及び IMDMを用いて、 5%CO条件下、 37°C培養した。  Two colon cancer cells, LOVO and RKO, and lung fibroblast cell line MRC5 were purchased from RIKEN Cell Bank (Tsukuba, Ibaraki, Japan). Tumor cells LOVO and RKO, and normal cells MRC5 are 10% fetal bovine serum, lOOU / ml penicillin and 100 g / ml streptomycin, respectively (all purchased from Invitrogen, Carlsbad, CA) Cultivation was carried out at 37 ° C under 5% CO conditions using RPMI-1640 and IMDM.

2  2

[0037] リアルタイム定量的 RT -PCR  [0037] Real-time quantitative RT-PCR

Total RNAは癌部、非癌部から RNeasy™ Mini Kit (Qiagen)を用いて抽出した。 cDNA は total RNAから 1^st strand cDNA Synthesis Kitを用いて合成した（Roche, Mannhei m, Germany)。 LightCycler (Roche, Mannheim, Germany)を用いた elF- 4H cDNA の Realtime quantitative PCRは、 LightCyclerキヤピラリー中の LightCyclere DNA Master ¾ BR reen I (rastStart faqDNA polymerase, deoxynucleotide tnpnosphate , buffer, SYBR Green 1)、 3.0 mM MgC12、及び 0.5 μ Mの各プライマー配列（forward primer:5 '一 TTCCTCTCGGAGCGGAGACG— 3 ' , Total RNA was extracted from cancerous and non-cancerous parts using RNeasy ™ Mini Kit (Qiagen). cDNA Was synthesized from total RNA using the 1 ^st strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Mannheim, Germany). Realtime quantitative PCR of elF-4H cDNA using LightCycler (Roche, Mannheim, Germany) was performed using LightCycler DNA Master ¾ BR reen I (rastStart faqDNA polymerase, deoxynucleotide tnpnosphate, buffer, SYBR Green 1), 3.0 mM MgC12 , And 0.5 μM of each primer sequence (forward primer: 5 '1 TTCCTCTCGGAGCGGAGACG— 3',

reverse primer： 5 ' - GGAATCCCATCCACCTCTAG- 3 ' )を含有する反応液（20 μ 1) で行った。铸型 cDNAの段階的希釈により PCR産物を直線領域で最適化した。定量 的 PCRの分析は LightCyclerソフトウェア 3.3版を用いて行った。  Reverse primer: It was performed in a reaction solution (20 μ 1) containing 5′-GGAATCCCATCCACCTCTAG-3 ′). PCR products were optimized in the linear region by serial dilution of vertical cDNA. Quantitative PCR analysis was performed using LightCycler software version 3.3.

[0038] siRNAによる遣伝子ノックダウン [0038] Gene knockdown by siRNA

eIF-4HRNAを標的とする siRNAを用いて eIF_4Hの発現を抑制した。 siRNAは 化学合成のより作製した (Japan Bio Services 日本、埼玉県）その塩基配列は以下の 通りである（図 2)。尚、カツコ内の数字は eIF_4H遺伝子における塩基配列番号を示 す。  The expression of eIF_4H was suppressed using siRNA targeting eIF-4HRNA. siRNA was prepared by chemical synthesis (Japan Bio Services, Japan, Saitama Prefecture). Its base sequence is as follows (Figure 2). The numbers in Katsuko indicate the nucleotide sequence numbers in the eIF_4H gene.

(R102) 5 -aacccacagaagaggaaagag- '； (59b- 616)  (R102) 5 -aacccacagaagaggaaagag- '; (59b-616)

(R103) 0 - aatgggtagctctcgagaatc- 3 ； (411-4^1)  (R103) 0-aatgggtagctctcgagaatc- 3; (411-4 ^ 1)

(R104) 5，- aatctagaggtggatgggatt- 3，（428-448)。  (R104) 5,-aatctagaggtggatgggatt-3, (428-448).

ここで、 siRNA-102塩基配列は 2つの選択的スプライシング変異体であるアイソフォ ーム 1及びアイソフォーム 2に共通するものであり、一方、 siRNA-103及び siRNA-104 はァイソフォーム 1のみに特異的なものである。 Blast分析（http：〃 www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/)によると該標的配列と他のヒト遺伝子との間に共通する領域は見出せ なかった。各細胞を 6ゥエルプレートで培養し、リポフエクタミン 2000 (Invitrogen, Carls bad, CA)を用いて上記の siRNAをトランスフエクシヨンした。 48時間後に大腸癌及び 正常繊維芽細胞を採取し、以下のウェスタンプロット分析、細胞増殖アツセィ (MTS アツセィ）、及び細胞周期分析に供した。  Here, the siRNA-102 nucleotide sequence is common to two alternatively spliced variants, isoform 1 and isoform 2, while siRNA-103 and siRNA-104 are specific only to isoform 1. Is something. According to Blast analysis (http: 〃 www.ncbi.nlm.nih. Gov / BLAST /), no common region was found between the target sequence and other human genes. Each cell was cultured on a 6-well plate, and the above siRNA was transfected using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carls bad, Calif.). After 48 hours, colon cancer and normal fibroblasts were collected and subjected to the following Western plot analysis, cell proliferation assay (MTS assay), and cell cycle analysis.

[0039] ウェスタンブロット分析 [0039] Western blot analysis

各細胞溶解物からの蛋白質 (総 30 μ g)を 10-20%勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳 動（Bio- Rad, Hercules, CA)にかけて分離した。 Tank- transfer装置（Bio- Rad)を用い て蛋白質をポリビ-リデンフルオライド膜 (Milipore, Bedford, MA)に移し、この膜を 5 %スキムミルク含有 PBSでブロックした。ゥサギ抗 elF- 4H抗体 (Japan Bio Services調 製）及びャギ抗 j8 -ァクチン抗体（Cappel, West Chester, PA)を上記ブロッキング緩 衝液中で 1:500に希釈したものを一次抗体として使用した。更に、夫々、ブロッキング 緩衝液中で 3000倍希釈のャギ抗ゥサギ IgG西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識抗体（ Bio-Rad)、及び、ブロッキング緩衝液中で 500倍希釈のゥサギ抗ャギ IgG西洋ヮサビ ペルォキシダーゼ標識抗体（Cappel, West Chester, PA)を二次抗体として使用した 。 |¼上の抗原 白質は ECL detection reagents (Amersham Pharmacia Biothech)で 検出した。 Proteins from each cell lysate (total 30 μg) were separated by 10-20% gradient polyacrylamide gel electrophoresis (Bio-Rad, Hercules, CA). Using a tank-transfer device (Bio-Rad) The protein was transferred to a polyvinylidene fluoride membrane (Milipore, Bedford, Mass.), And the membrane was blocked with PBS containing 5% skim milk. Usagi anti-elF-4H antibody (produced by Japan Bio Services) and goat anti-j8-actin antibody (Cappel, West Chester, PA) diluted 1: 500 in the blocking buffer were used as primary antibodies. In addition, 3000-fold diluted goat anti-rabbit IgG horseradish peroxidase-labeled antibody (Bio-Rad) in blocking buffer and 500-fold diluted rabbit anti-rabbit IgG horseradish IgG horseradish in blocking buffer, respectively. Peroxidase-labeled antibody (Cappel, West Chester, PA) was used as the secondary antibody. | ¼ Antigen white matter was detected with ECL detection reagents (Amersham Pharmacia Biothech).

[0040] 細朐増殖アツセィ [0040] Atssey

翌日に 50%集密（コンフルェント）状態になるように細胞を 96穴ゥエルに播き、 Lipof ectamine 2000試薬を用いて上記の siRNAをトランスフエクシヨンした。細胞を 37°C、 5 %CO条件下で 48時間培養した。試薬製造者の指示に従い、 3 - (4, 5 ジメチル On the next day, cells were seeded in a 96-well well so as to be 50% confluent, and the above siRNA was transfected using Lipofectamine 2000 reagent. The cells were cultured for 48 hours at 37 ° C, 5% CO. 3-(4,5 dimethyl

2 2

チアゾール—2—ィル）—5— (3—カルボキシメトキシフエ-ル）—2— (4—スルホフ ヱニル） 2H—テトラゾリゥム（MTS)染料の吸収を測定することにより、細胞の増殖 を評価した。吸収は、 Wallac 1420 ARVOsx Multilabel Counter (Perkin- Elmer, Toky o, Japan)を用いて行った。実験は 2回の独立系で、夫々、平行して 8回繰り返した。  Cell growth was assessed by measuring the absorption of thiazole-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) 2H-tetrazolium (MTS) dye. Absorption was performed using a Wallac 1420 ARVOsx Multilabel Counter (Perkin-Elmer, Tokyo, Japan). The experiment was repeated twice in parallel with two independent systems.

[0041] 細胞周期分析 [0041] Cell cycle analysis

LOVO、 RKO及び MRC5細胞を 6穴ゥエルに播き、翌日、上記のように siRNAをト ランスフエクシヨンし、 48時間培養した。その後、 70%エタノールで固定し、 200 μ g/m 1 Rnase存在下 50 g/mほゥ化プロビジゥム（和光純薬、 日本)含有 PBS溶液で処理 した。次 ヽで、 FAし S し aliber cytometer (Beccton Dickinson, banjose, し A, USA)を用 いて細胞を細胞周期分析した。各試料につき少なくとも 10,000個の細胞を計測し、得 られたデータは Cell Questプログラム（Beccton Dickinson, Sanjose, CA, USA)により 分析した。  LOVO, RKO and MRC5 cells were seeded in a 6-well well, and the next day, siRNA was transferred as described above and cultured for 48 hours. Thereafter, the mixture was fixed with 70% ethanol and treated with a PBS solution containing 50 g / m fluoride (Wako Pure Chemicals, Japan) in the presence of 200 μg / m 1 Rnase. Next, the cells were subjected to cell cycle analysis using an FA and S aliber cytometer (Beccton Dickinson, Banjose, A, USA). At least 10,000 cells were counted for each sample and the resulting data was analyzed by the Cell Quest program (Beccton Dickinson, Sanjose, CA, USA).

[0042] 結果（1)：転写レベルにおける eIF-4Hァイソフォーム 1の渦剰発現  [0042] Results (1): Eruption of eIF-4H isoform 1 at the transcriptional level

既に記載したように、本発明者が以前に、 eIF-4Hの選択的スプライシング変異体で あるアイソフォーム 1が原発性大腸癌の殆どの腫瘍組織にぉ 、て過剰発現して!/、るこ とを報告して 、る。この eIF-4Hァイソフォーム 1の過剰発現を転写レベルで確認すベ く、上記のようにリアルタイム定量的 RT-PCRを行った。その結果、 elF- 4Hアイソフォ ーム lmRNAレベルは腫瘍組織において有意（P〈0.01)に増加していることが示され、 過剰発現が転写レベルで起こって 、ることが確認された（図 1)。 As already described, the inventor previously reported that isoform 1, an alternative splicing variant of eIF-4H, was overexpressed in most tumor tissues of primary colorectal cancer! / And report. In order to confirm the overexpression of eIF-4H isoform 1 at the transcription level, real-time quantitative RT-PCR was performed as described above. The results showed that elF-4H isoform lmRNA levels increased significantly (P <0.01) in tumor tissues, confirming that overexpression occurred at the transcriptional level (Fig. 1). .

[0043] 結 (2)： eIF-4Hの抑制による大腸癌細胞の增 阳.害  [0043] Conclusion (2): Increased colorectal cancer cells due to suppression of eIF-4H.

eIF_4Hァイソフォーム 1が細胞増殖及び腫瘍形成に関与しているカゝ否かを検討すベ く、 RNAi法を用いて eIF-4H発現を抑制した。これに用いた 3種類の siRNAは eIF-4H 読取枠の夫々異なる領域を標的をすべく設計された（図 2A,B)。 2つの大腸癌細胞 である LOVO及び RKOの siRNA処理後 48時間後に、 （R102)は elF- 4Hの 2つのアイソ ファームの両方を抑制した。一方、（R103)及び (R104)は eIF-4Hァイソフォーム 1のみ を抑制した（図 2B, C)。従って、これら 3種類の siRNAを更なる分析に使用した。  To investigate whether eIF_4H isoform 1 is involved in cell growth and tumorigenesis, RNAi method was used to suppress eIF-4H expression. The three siRNAs used were designed to target different regions of the eIF-4H reading frame (Figures 2A and B). 48 hours after siRNA treatment of two colorectal cancer cells, LOVO and RKO, (R102) suppressed both elF-4H isoforms. On the other hand, (R103) and (R104) inhibited only eIF-4H isoform 1 (FIGS. 2B and C). Therefore, these three siRNAs were used for further analysis.

[0044] 即ち、 siRNA処理後 48時間後に実施した MTSアツセィの結果によれば、 eIF-4Hの 2 種類のァイソフォームの発現が (R102)により抑制されると、細胞増殖が 50%も顕著に 阻害された。驚くべきことに、（R103)及び (R104)を用いて eIF-4Hァイソフォーム 1のみ を抑制した場合にも、細胞増殖が同様の程度阻害された（図 2D, E)。 尚、（R104)と 比べて、（R103)の方が増殖阻害効果が高ぐこれは eIF_4Hァイソフォーム 1のノックダ ゥンレベルの結果（図 2B, C)とも一致した。これらの結果から、 eIF-4Hァイソフォーム 1が大腸癌細胞の増殖において重要な役割を担っていることが示された。  [0044] That is, according to the results of MTS assay 48 hours after siRNA treatment, when the expression of two isoforms of eIF-4H was suppressed by (R102), cell proliferation was markedly 50%. Was hindered. Surprisingly, cell growth was similarly inhibited when (R103) and (R104) were used to suppress only eIF-4H isoform 1 (FIG. 2D, E). Note that the growth inhibition effect of (R103) was higher than that of (R104), which was consistent with the knockdown level result of eIF_4H isoform 1 (Fig. 2B, C). These results indicate that eIF-4H isoform 1 plays an important role in the proliferation of colon cancer cells.

[0045] 結 (3)： eTF-4Hの ¾制による肺繊維莽細胞株の谐 阳害  [0045] Conclusion (3): Efficacy of pulmonary fibroblast cell line by eTF-4H

eIF_4Hアイソフォーム 1による細胞増殖効果が癌細胞に特異的力、又はより一般的 な特徴力どうかという問題を解決すベぐ正常ヒト肺繊維芽細胞株 MRC5の増殖に対 する eIF-4H抑制による効果を検討した。 siRNA処理 48時間後のウェスタンブロット分 祈の結果によれば、 MRC5における eIF-4Hァイソフォーム 1の発現レベルは大腸癌細 胞株のそれよりも低いにも拘らず、その発現レベルは検出不可能なレベルまで減少 した（図 3A)。し力しながら、大腸癌細胞株の場合と対照的に、 MRC5の細胞増殖に 対する RNAiによる阻害効果は得られな力 た（図 3B)。別の正常ヒト肺繊維芽細胞 株 WI38を用いた実験でも同様な結果が得られた。以上の結果から、 eIF-4Hアイソフ オーム 1の発現抑制により癌細胞の増殖が阻害されるが、正常ヒト肺繊維芽細胞株の 増殖は阻害されないことが判明し、 eIF-4Hアイソフォーム 1は大腸癌の治療剤の標的 として適当である可能性があることが示された。 The effect of eIF-4H suppression on the growth of normal human lung fibroblast cell line MRC5 should solve the problem of whether the cell proliferation effect of eIF_4H isoform 1 is specific to cancer cells or more general characteristics It was investigated. According to the results of Western blot analysis 48 hours after siRNA treatment, the expression level of eIF-4H isoform 1 in MRC5 was lower than that of the colon cancer cell line, but the expression level was not detected. Reduced to a possible level (Figure 3A). However, in contrast to the colorectal cancer cell line, the inhibitory effect of RNAi on the cell growth of MRC5 was not obtained (Fig. 3B). Similar results were obtained in experiments with another normal human lung fibroblast cell line WI38. From the above results, the suppression of eIF-4H isoform 1 expression inhibited the growth of cancer cells, but the normal human lung fibroblast cell line Growth was found not to be inhibited, indicating that eIF-4H isoform 1 may be suitable as a target for colorectal cancer therapeutics.

[0046] 結果 (4)： elF- 4H 1の抑制によるアポトーシスの誘導 [0046] Results (4): Induction of apoptosis by suppression of elF-4H 1

eIF_4Hアイソフォーム 1の発現抑制による細胞増殖の阻害効果が細胞周期の停止 によるものである力否かを検討するために、フローサイトメトリー分析を実施した。 siRN A処理した大腸癌細胞の細胞周期分布をコントロールのそれと比較した（図 4)。その 結果、（R103)で処理した細胞はコントロールと比較して、 sub- G1期細胞数が 3倍に増 加し、 S期細胞が減少した。このことは、 RNAiによる細胞増殖阻害がアポトーシスの誘 導に依るものであること示唆している。これについては、 eIF-4Hが低いレベルになつ た為に、 mRNAに対する eIF-4Aの親和性が減少し抗アポトーシス因子の翻訳効率が 低下した為である、という説明が可能である。従って、以上の結果から、 eIF_4Hァイソ フォーム 1はアポトーシス力 癌細胞を保護することによって増殖を刺激していること が示唆された。  In order to investigate whether the inhibition of cell proliferation by suppressing the expression of eIF_4H isoform 1 was due to cell cycle arrest, flow cytometry analysis was performed. The cell cycle distribution of siRNA-treated colorectal cancer cells was compared with that of the control (FIG. 4). As a result, cells treated with (R103) increased the number of cells in the sub-G1 phase three-fold and decreased the cells in the S phase compared to the control. This suggests that inhibition of cell proliferation by RNAi depends on induction of apoptosis. This can be explained by the fact that eIF-4H is at a low level, so the affinity of eIF-4A for mRNA is reduced and the translation efficiency of anti-apoptotic factors is reduced. Therefore, the above results suggested that eIF_4H isoform 1 stimulated proliferation by protecting apoptotic cancer cells.

産業上の利用可能性  Industrial applicability

[0047] 本発明によって、癌、特に大腸癌に代表される消ィ匕器癌等のより有効で確実な検出 •診断 '治療を提供すること、及び、このような癌の遺伝子診断システムと遺伝子治療 臨床研究システムの開発に利用される各種の生体分子を提供される。特に、 eIF-4H ァイソフォーム 1は大腸癌等の癌治療において、正常細胞に損傷をあたえず癌細胞 のみに特異的に作用する「magic bulletsj (Khosla, S. (2005). Magic bullets to kill na sty osteoclasts, Endocrinology 146, 3233- 3234)開発のための、有望な標的分子とな る可能性がある。 [0047] According to the present invention, more effective and reliable detection of cancer, in particular cancer gastric cancer represented by colorectal cancer, etc. • Providing a treatment, and genetic diagnosis system and gene for such cancer Treatment Various biomolecules used in the development of clinical research systems are provided. In particular, eIF-4H isoform 1 acts specifically only on cancer cells without damaging normal cells in the treatment of colorectal cancer, etc. “magic bulletsj (Khosla, S. (2005). Magic bullets to kill na sty osteoclasts, Endocrinology 146, 3233-3234) It may be a promising target molecule for development.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims

[I] eIF-4Hの発現を抑制することから成る、癌細胞の増殖阻害方法。  [I] A method for inhibiting the growth of cancer cells, comprising suppressing the expression of eIF-4H.

[2] elF- 4Hが eIF4Hァイソフォーム 1である、請求項 1記載の方法。 [2] The method according to claim 1, wherein elF-4H is eIF4H isoform 1.

[3] 発現の抑制が転写レベルで行われる、請求項 1又は 2記載の方法。  [3] The method according to claim 1 or 2, wherein the suppression of expression is performed at the transcription level.

[4] eIF-4Hに特異的な siRNAによる遺伝子ノックダウンを用いる、請求項 1〜3のいずれ か一項に記載の方法。 [4] The method according to any one of claims 1 to 3, wherein gene knockdown by siRNA specific to eIF-4H is used.

[5] siRNAが以下に示す 、ずれかの塩基配列又はその一部の連続する塩基配列を含む [5] The siRNA includes any one of the following base sequences or a part of the continuous base sequence as shown below.

21〜23個の塩基力も成るオリゴヌクレオチド及びその相補的オリゴヌクレオチドから 成る二本鎖 RNAである、請求項 4記載の方法： The method according to claim 4, which is a double-stranded RNA consisting of an oligonucleotide having 21 to 23 nucleotides and its complementary oligonucleotide:

(R102) 0 -aacccacagaagaggaaagag-3 ；  (R102) 0 -aacccacagaagaggaaagag-3;

(R103) 0 -aatgggtagctctcgagaatc-3 ；  (R103) 0 -aatgggtagctctcgagaatc-3;

(R104) 5 - aatctagaggtggatgggatt- 3 ₀ (R104) 5-aatctagaggtggatgggatt- 3 ₀

[6] 癌が消ィヒ器癌である、請求項 1〜5のいずれか一項記載の方法。 [6] The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the cancer is a cancer of the extinct organ.

[7] 癌が大腸癌である、請求項 6記載の方法。 7. The method according to claim 6, wherein the cancer is colorectal cancer.

[8] アポトーシスが誘導されることにより癌細胞の増殖が阻害される、請求項 1〜7のいず れか一項記載の方法。  8. The method according to any one of claims 1 to 7, wherein proliferation of cancer cells is inhibited by inducing apoptosis.

[9] eIF-4Hに特異的な siRNAを活性成分として含有する医薬組成物。 [9] A pharmaceutical composition comprising siRNA specific for eIF-4H as an active ingredient.

[10] 癌細胞増殖阻害剤である、請求項 9記載の医薬組成物。 10. The pharmaceutical composition according to claim 9, which is a cancer cell growth inhibitor.

[I I] eIF-4Hが eIF-4Hァイソフォーム 1である、請求項 10記載の癌細胞増殖阻害剤。  11. The cancer cell proliferation inhibitor according to claim 10, wherein [I I] eIF-4H is eIF-4H isoform 1.

[12] siRNAが以下に示す 、ずれかの塩基配列又はその一部の連続する塩基配列を含む[12] The siRNA includes any of the following nucleotide sequences or a part of the consecutive nucleotide sequences:

21〜23個の塩基力も成るオリゴヌクレオチド及びその相補的オリゴヌクレオチドから 成る二本鎖 RNAである、請求項 10又は 11記載の癌細胞増殖阻害剤： The cancer cell growth inhibitor according to claim 10 or 11, which is a double-stranded RNA comprising an oligonucleotide having 21 to 23 basic forces and a complementary oligonucleotide thereof:

(R102) 0 -aacccacagaagaggaaagag-3 ；  (R102) 0 -aacccacagaagaggaaagag-3;

(R103) 0 -aatgggtagctctcgagaatc-3 ；  (R103) 0 -aatgggtagctctcgagaatc-3;

(R104) 5 -aatctagaggtggatgggatt- 3 ₀ (R104) 5 -aatctagaggtggatgggatt- 3 ₀

[13] 癌が消ィ匕器癌である、請求項 10〜 12のいずれか一項記載の癌細胞増殖阻害剤。 [13] The cancer cell proliferation inhibitor according to any one of claims 10 to 12, wherein the cancer is a gastrointestinal cancer.

[14] eIF-4Hの発現量に基ぐ癌細胞増殖阻害活性を有する物質のスクリーニング方法。 [14] A screening method for a substance having cancer cell growth inhibitory activity based on the expression level of eIF-4H.

[15] 請求 14に記載のスクリーニング方法であって、 (a)被検物質の存在下に細胞を培養する工程、 [15] The screening method according to claim 14, (a) culturing cells in the presence of a test substance,

(b)該細胞における eIF-4H遺伝子の発現量を測定する工程、及び  (b) measuring the expression level of the eIF-4H gene in the cell, and

(c)発現量を抑制させる物質を選択する工程、を含む方法。  (c) a step of selecting a substance that suppresses the expression level.

[16] 工程 (b)における eIF_4H遺伝子の発現量の測定を、 eIF_4Hに対する抗体を使用して eIF_4H蛋白質の産生量の測定にて実施する、請求項 15記載のスクリーニング方法  [16] The screening method according to claim 15, wherein the measurement of the expression level of the eIF_4H gene in the step (b) is performed by measuring the production amount of the eIF_4H protein using an antibody against eIF_4H.

[17] 工程 (b)における eIF-4H遺伝子の発現量の測定を、 eIF-4Hをコードする mRNA量の 測定にて実施する、請求項 15記載のスクリーニング方法。 [17] The screening method according to claim 15, wherein the expression level of the eIF-4H gene in the step (b) is measured by measuring the amount of mRNA encoding eIF-4H.

[18] 請求項 14〜17のいずれか一項に記載のスクリーニング方法に用いるスクリーニング やット。 [18] A screening kit used in the screening method according to any one of claims 14 to 17.