WO2007105418A1

WO2007105418A1 - 細胞培養容器およびその製造方法

Info

Publication number: WO2007105418A1
Application number: PCT/JP2007/052972
Authority: WO
Inventors: Taiji Nishi; Go Tazaki; Motohiro Fukuda; Michio Yazawa; Masayuki Takahashi
Original assignee: Kuraray Co., Ltd.
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2007-02-19
Publication date: 2007-09-20
Also published as: TWI424058B; US8435782B2; US20090170190A1; EP1988153A1; EP1988153B1; JP5421588B2; TW200738872A; EP1988153A4; JPWO2007105418A1

Abstract

　培養する細胞の生存率を高めることができる細胞培養容器およびその製造方法を提供することを目的とする。本発明にかかる細胞培養容器は、細胞が培養される面に複数の微細な突起１からなる突起群を備える細胞培養容器であって、微細な突起１の幅または直径が２０ｎｍ～３μｍであり、微細な突起のアスペクト比が０．２～３．０のものである。これにより、培養細胞が接着、分化・増殖するのに最適な細胞培養容器を提供することができる。

Description

明細書

細胞培養容器およびその製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、細胞培養容器およびその製造方法に関する。

背景技術

[0002] 細胞死は、アポトーシス (apoptosis)と、ネクローシス (necrosis)に大別される。アポト一シスとは、多細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種で、個体をより良い状態に保っために積極的に引き起こされる、管理 *調節された細胞の自殺のことをいう。他方、ネクローシスとは、血行不良、外傷などによる細胞内外の環境の悪ィ匕によつて起こる細胞死、すなわち壊死（えし)をいう。

[0003] 壊死は、生物の組織の一部分が死ぬことである。壊死は通常の死とは違い、体の一部分を構成する細胞だけが死滅する。感染、物理的破壊、化学的損傷、血流の減少などが原因となる。血流減少によるものを特に梗塞と呼ぶ。細胞の死ではあっても、血球、皮膚、消化管の粘膜上皮のように正常な細胞、組織が次々に補充され機能的な障害、組織学的な異常を残さないものは壊死と呼ばない。壊死した組織は、生体の免疫系によって最終的には取り除かれ、欠損部分は元の糸且織が再生したり線維化したりすることで補われる。

[0004] このような細胞についての試験 ·研究には、組織から単離した細胞を培養する必要がある。近年、この細胞培養は、創薬開発、薬剤の産生、再生医療での基礎試験、薬物の効果判定等、多様な目的で実施され、バイオテクノロジー関連分野において欠かせない方法となっている。細胞培養器で培養される細胞の接着能は、細胞の分ィ匕 '増殖能にとって極めて重要な因子であるため、研究開発のスピードを左右する。また、培養試験に用いられる細胞培養株は極めて高額であるため、試験コストにも直接影響する。

[0005] プラスチック製シャーレ、ガラス製シャーレ、容器内に固定されたガラスプレート、ゥエルプレート等の細胞培養容器で細胞を培養する場合、培養細胞カゝら排出される炭酸ガスなどによる pH変化は、培養細胞の活性に大きく影響することが知られている。このため、従来の長期間培養においては、研究者が定期的に培養液を交換することで、培養細胞の活性を保っている。

[0006] また、特許文献 1には、細胞培養容器の表面に、相当直径が lOnm〜： Lmmである突起群が形成されてヽることを特徴とする細胞培養容器が提案されてヽる。これは、突起群の形成により、培養液を細胞の下部に行き渡らせ、細胞の必要とする栄養物の供給と細胞の放出する老廃物の排出を促進するとともに、細胞と容器の接触を点接触にすることにより細胞の剥離時に生じる細胞の損傷を防ぐものである。

特許文献 1 :特開 2005— 168494号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] し力しながら、神経細胞や心筋、骨格筋のように再生しな、組織の壊死や、神経細胞ゃ心筋、肝臓細胞と、つた培養が難、とされる組織の細胞死を抑制するためには、新鮮な培養液の交換だけでは、細胞死の抑制が実現できていないのが現状である。特に、培養が難しいとされる培養種では、新鮮な培養液の交換を行っても、最初に配置した細胞数に対する生存率は 20〜40%程度である。

[0008] また、特許文献 1に示す方法によれば、突起群の形成により、培養液を細胞の下部に行き渡らせ、細胞の必要とする栄養物の供給と細胞の放出する老廃物の排出を促進することはできる。し力しながら、細胞と容器の接触が点接触になるため、細胞の接着斑となる擬似足場が基板表面に形成できなくなり、細胞が十分な分化 ·増殖を行うことができな、という問題があった。

[0009] 本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであり、培養する細胞の生存率を高めることができる細胞培養容器およびその製造方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明にかかる細胞培養容器は、細胞が培養される面に複数の微細な突起からなる突起群を備える細胞培養容器であって、前記微細な突起の幅または直径が 20nm 〜3 mであり、前記微細な突起のアスペクト比が 0. 2〜3. 0であるものである。

[0011] 本発明にかかる細胞培養容器の製造方法は、基板上にパターンを形成するステツプと、前記基板上に形成されたパターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して細胞培養容器を形成するステップと、前記細胞容器の細胞が培養される面に複数の微細な突起力もなる突起群を形成するステップとを備えたものである。

発明の効果

[0012] 本発明によれば、培養する細胞の生存率を高めることができる細胞培養容器およびその製造方法を提供することができる。

図面の簡単な説明

[0013] [図 1A]本発明の実施の形態 1にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。

[図 1B]本発明の実施の形態 1にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。

[図 2A]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。

[図 2B]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。

[図 2C]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。

[図 3A]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。

[図 3B]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。

[図 3C]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。

[図 3D]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。

[図 3E]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。 [図 3F]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。

[図 3G]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。

[図 3H]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。

[図 4]本発明の実施例 5にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。符号の説明

[0014] 1 微細な突起

2 凹部

3 第 1の凸部

4 第 2の凸部

5 2段の凸部

6 第 1の凸部の側壁

7 第 2の凸部の側壁

11 基板

12 第 1レジスト層

13 マスク A

14 第 2レジスト層

15 マスク B

16 レジストパターン

17 導電性膜

18 金属構造体

19 樹脂製成型品

発明を実施するための最良の形態

[0015] 本発明者らは、鋭意研究した結果、プレート、シャーレ等の細胞培養容器にぉ、て細胞が培養される面に形成される微細な突起の寸法およびアスペクト比を所望の範囲とすることで、培養細胞が接着、分化'増殖するのに最適な細胞培養容器を提供できることを見出した。以下に、本発明の実施の形態について図を用いて説明する。

[0016] 発明の実施の形態 1

図 1Aは、実施の形態 1にかかる細胞培養容器の構成を示した平面図であり、図 1B は図 1Aの IB-IB'断面図である。実施の形態 1にかかる細胞培養容器は、細胞を培養する面に微細な突起 1を備えている。なお、図 1Aおよび図 1Bに示す微細な突起 1 は四角柱状である力円柱状または多角柱状であってもよい。

[0017] 細胞が培養される面の微細な突起 1の幅または直径は 20nm〜3 mが好ましぐ 1 OOnm〜l. がより好ましい。微細な突起 1の幅または直径が 20nmよりも小さいと、約 3 μ m〜20 μ mの直径を有する細胞が微細な突起 1を認識することが困難となる。そのため、擬似足場となる接着斑を形成することが困難となり、細胞の分化'増殖速度は低下する。逆に微細な突起 1の幅または直径が 3 mよりも大きいと、細胞の直径に近くなるため、擬似足場を形成することが困難となり、細胞の接着能は低下する。微細な突起 1のアスペクト比は、細胞の擬似足場となる接着斑が到達し、かつ再現しやすい工業技術の観点から、 0. 2〜3. 0力子ましく、 0. 5〜2. 0がより好ましい

[0018] アスペクト比とは、細胞が培養される面の微細な突起 1の幅または直径と高さとの比を示す。例えば、微細な突起 1の直径が 3 m、高さが 9 mの場合、アスペクト比は 3. 0となる。

[0019] 微細な突起 1の形成法について述べる。以下にあげる方法は代表的な例であり、これに限定されるものではな、。真空装置を用いたアルゴンプラズマ等によるエツチングは、幅または直径が 30nm前後の微細な突起 1を形成することができる。真空蒸着法では、真空度、原材料と基板距離を調整することで、幅または直径が 30ηπ！〜 400 nm付近の微細な突起 1を有する無機材料を形成することができる。幅または直径が 40011111〜3 111の微細な突起1を形成する方法には、サンドブラスト法、ドライアイス洗浄、レーザーアブレーシヨン、有機'無機粒子コーティング、電機メツキ、無電解メッキ、力-ゼンメツキによる無機材料堆積等がある。

[0020] 微細な突起 1はナノオーダーのパターンすなわちナノパターンにより形成することもできる。このナノパターンの形成法では、まず、電子線描画、 X線露光、縮小露光等により、感光性榭脂またはシリコン基板上にナノパターンを形成する。次に、電気メッキにより金属製原盤を作製し、ナノインプリント成形法によりナノパターンプレートを作製する。これらの製造法では、微細な突起 1のアスペクト比が 3. 0を超える場合、精密寸法を有する金属製原盤が必要となる。しかし、設備およびナノパターンを形成するための露光用マスクが高額となるため、作製するナノパターンプレートが高コストとなる問題を有していた。本発明者らは、鋭意研究した結果、細胞の接着、分化'増殖に適した微細な突起 1のアスペクト比が 0. 2〜3. 0であることを見出した。このため、低コストィ匕を実現することができる。

[0021] 培養細胞の観察では、倒立顕微鏡を用いた透過光観察が主流である。このため、細胞が培養される面に形成される微細な突起 1の寸法およびアスペクト比には、波長 450ηπ！〜 600nmの可視光を散乱させないこと、すなわち透明性が要求される。細胞の接着能、分化'増殖性能と透明性の両立する範囲として、微細な突起 1の幅または直径が 20nm〜400nm、アスペクト比が 0. 2〜1. 0が好ましぐ微細な突起 1の幅または直径が 100nm〜300nm、アスペクト比が 0. 5〜1. 0がより好ましい。

[0022] 透過光観察を可能にするため、榭脂プレートをガラスプレートと同等の光透過率とするには、紫外線領域を含む波長 300nm〜800nmの光透過率を 80%以上、ヘイズ値を 10%以内とすることが好ましい。上記要求を満たすため、細胞培養容器には

、紫外線吸収剤が含まれないアクリル榭脂を用いるカゝ、 PC (ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有さない材料を選択する必要がある。また、酸ィ匕防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物には、紫外線吸収剤が含まれていない必要がある。

[0023] 蛍光観察法では、蛍光色素を光らせるための光 (励起光）は、細胞培養容器を透過しなければ、それにより発生した蛍光 (蛍光放射光)を識別できない。したがって、細胞培養容器には高、光透過性が要求される。蛍光 (蛍光放射光)を識別するために必要な透明性は、可視光の全光線透過率 80%以上、ヘイズ値 10%以内とする必要がある。上記要求を満たすため、細胞培養容器には、例えば、ポリメチルメタクリレート等の光学特性に優れる材料を用いることが好ましぐ結晶性榭脂であるポリオレフィン系榭脂を用いる場合は、非結晶状態で用いることが好まし、。 [0024] 自家蛍光とは、ポリマー分子が紫外 ·可視光を吸収した後、光を放出して自ら蛍光を発することをいう。ガラスプレートは自家蛍光を発しないのに対し、榭脂プレートの多くは自家蛍光するため、サンプルカゝら発生した蛍光 (蛍光放射光)を識別できなくなり、蛍光分析の特徴である微量分析が困難となる。

[0025] 自家蛍光の影響を受けないためには、波長 230ηπ！〜 800nmの光を照射することで自家蛍光しないことが要求される。そのため、細胞培養容器には、 PC (ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有しない榭脂材料を選択する必要がある。また、自家蛍光の可能性を極力排除するため、酸化防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物は、できる限り少量とするか、添加しないことが好ましい。

[0026] 微分干渉観察法のコントラストを低下させずに、偏光顕微鏡や微分干渉顕微鏡により観察するために、光学ひずみの小さい材料が要求される。そのため、細胞培養容器には、 PC (ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有しない榭脂材料を選択する必要がある。

[0027] 細胞培養容器に有機膜または無機膜を被覆することで、親水化または疎水化することができる。これにより、微細な突起への気泡の付着防止や細胞の接着度合いを制御することができる。例えば、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射等を用いる方法、細胞の接着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法がある。また、細胞培養容器の一部分をマスクすることにより、他の部分のみを有機膜または無機膜により被覆することもできる。これにより、培養試験条件の幅をさらに広くすることがでさる。

[0028] 発明の実施の形態 2

上記の細胞が培養される面に、複数のマイクロ空間構造を有する榭脂製の細胞培養容器を用いることもできる。実施の形態 2にかかる細胞培養容器の構成について図 2A、図 2Bおよび図 2Cを用いて説明する。図 2Aは、実施の形態 2にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。図 2Bは、図 2Aに示された点線内の構成を拡大して示す平面図である。図 2Cは、図 2Bの IIC IIC'断面図である。

[0029] 細胞培養容器には、図 2Aに示すように、複数のマイクロ空間構造を構成する凹凸パターンが形成されている。凹凸パターンは、図 2Cに示すように、 2段の階段状に形成されている。すなわち、細胞培養容器の細胞を培養する面に、格子状に形成された第 1の凸部 3と、その上に形成された直方体状の第 2の凸部 4からなる 2段の凸部 5 が形成されている。この 2段の凸部 5により形成される空間が凹部 2となる。すなわち、凹部 2は、第 1の凸部 3により完全に囲まれた凹部と第 2の凸部 4により形成される凹部とからなる。第 1の凸部 3の側壁 6および第 2の凸部 4の側壁 7は底面に対して略垂直に形成されている。さらに凹部 2の底面に微細な突起 1が形成されている。なお、微細な突起 1は、細胞を培養する面の全体に形成されていてもよぐまた、一部に形成されていてもよい。

[0030] 第 1の凸部 3は、図 2Aに示すように矩形状の凹部 2の四辺を囲むよう格子状に配置されている。第 2の凸部 4は、隣接する凹部 2の間の第 1の凸部 3の上に島状に配置されている。第 2の凸部 4は、矩形状の凹部 2の四辺のそれぞれに設けられている。そのため、凹部 2は完全には仕切られておらず、矩形状の凹部 2の 4つの頂点部分において、隣接する凹部 2と連通している。なお、凹凸パターンを 2段以上の階段状に形成することが好ましいが、 1段でもよい。

[0031] 上記の複数のマイクロ空間構造を有する榭脂製の細胞培養容器に、所望の幅または直径およびアスペクト比を満足する微細な突起 1を形成することで、細胞の接着能、分化'増殖機能に加え、細胞の伸展方向や形態の制御試験等、幅広い用途に提供することができる。また、この細胞培養容器は、従来のパターン付きガラス製プレートと対比しても充分に高い精度を発揮することができる。さらに、細胞培養容器を安価に形成することができるため、その利点を発揮できるような産業上大量に使用される用途に、特に適している。

[0032] 上記の細胞が培養される面に、複数のマイクロ空間構造を有する榭脂製の細胞培養容器の製造方法について説明する。この製造方法は、基板上にマイクロ空間構造を形成するステップと、基板上に形成されたマイクロ空間構造パターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記榭脂プレートの構造パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して榭脂プレートを形成するステップとを備える。 [0033] 詳細には以下の通りである。

(i)基板上への第 1レジスト層の形成

(ii)基板とマスク Aとの位置合わせ

(iii)マスク Aを用 V、た第 1レジスト層の露光

(iv)第 1レジスト層の熱処理

(V)第 1レジスト層上への第 2レジスト層の形成

(vi)基板とマスク Bとの位置合わせ

(vii)マスク Bを用いた第 2レジスト層の露光

(viii)第 2レジスト層の熱処理

(ix)レジスト層の現像

を行い、所望のレジストパターンを形成する。

(X)さらに、形成されたレジストパターンを導電化処理した後、形成されたレジストパターンにしたがって、基板上に金属構造体をメツキにより堆積させる。

(xi)この金属構造体を型として、榭脂成形品を形成する

こと〖こよって、細胞培養容器が製造される。

(V)〜 (viii)の工程は任意であり、省略できる。一方、（V)〜 (viii)の工程を複数回繰り返すことちでさる。

[0034] レジストパターン形成処理についてさらに詳細に説明する。

基板上に、例えば、深さ 30 mと深さ 100 mの構造体を得ようとした場合、第 1レジスト層（厚さ 70 m)、第 2レジスト層（厚さ 30 m)順に形成し、各層に露光、または露光、熱処理を行う。現像工程では、最初に第 2レジスト層である深さ 30 /z mのパターンが得られ、次に第 1レジスト層と第 2レジスト層を合わせた深さ 100 μ mのパターンが得られる。深さ 100 mのパターンが得られた時点で、第 2レジスト層である深さ 30 mのパターンを現像液に溶解、または変形させないためには、各層の現像液への溶解性を制御させることが要求される。

[0035] 光分解型のポジ型レジストを用いて、耐アルカリ性を発現させる方法の一つとして、ベータ時間 (溶剤の乾燥時間）を長くし、レジストを硬化させることがあげられる。通常、レジストは膜厚、シンナー等の溶剤濃度および感度に応じてベータ時間を設定している。この時間を長くすることによって耐アルカリ性を持たせることができる。また、第 1 レジスト層のベータが進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像において光が照射された部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、ベータ時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。ベータに用いる装置は、溶剤を乾燥できれば特に限定されるものではなぐオーブン、ホットプレート、熱風乾燥機等があげられる。光分解型のポジ型レジストは光架橋型のネガ型レジストと比較して、耐ァルカリ性の発現幅は制限されるため、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて 5〜2 00 μ mの範囲内が好ましぐ 10〜： LOO μ mの範囲内であることがより好ましい。

[0036] 光架橋型のネガ型レジストを用いて耐アルカリ性を発現させる方法として、ベータ時間の最適化の他に、架橋密度の最適化があげられる。通常、ネガ型レジストの架橋密度は、露光量によって設定することができる。化学増幅系ネガ型レジストの場合、露光量および熱処理時間によって架橋密度を設定することができる。この露光量、または熱処理時間を長くすることによって、耐アルカリ性を発現させることができる。光架橋型のネガ型レジストの場合、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて 5〜500 μ mの範囲内が好ましく、 10〜300 μ mの範囲内であることがより好まし!/、。

[0037] (i)基板 11上への第 1レジスト層 12の形成について説明する。

図 3Aに基板 11上に第 1レジスト層 12が形成された状態を示す。成形品形成ステツプで得られる榭脂製細胞容器の平面度は、基板 11上へ第 1レジスト層 12を形成する工程で決定づけられる。すなわち、基板 11上に第 1レジスト層 12を形成した時点の平面度が金属構造体、ひいては細胞培養容器の平面度に反映される。

[0038] 基板 11上に第 1レジスト層 12を形成する方法は何ら限定されないが、一般的にスピンコート方式、デイツビング方式、ロール方式、ドライフィルムレジストの貼り合わせ等を挙げることができる。なかでも、スピンコート方式は、回転しているガラス基板上にレジストを塗布する方法で、直径 300mmを超えるガラス基板にレジストを高、平面度で塗布する利点がある。従って、高い平面度を実現できる観点から、スピンコート方式が好ましい。

[0039] 第 1レジスト層 12として用いられるレジストは、ポジ型レジスト、ネガ型レジストのいずれもでもよい。いずれの場合も、レジストの感度、露光条件により、レジストの焦点深度が変わる。そのため、例えば、 UV露光装置を用いた場合、露光時間、 UV出力値をレジスト厚さ、感度に応じて種類を選択するのが好まし、。

[0040] 第 1レジスト層 12として用いるレジストがウエットレジストの場合、例えば、スピンコート方式で所定のレジスト厚さを得る方法としては、スピンコート回転数の変更や粘度調整による方法がある。スピンコート回転数の変更による方法は、スピンコーターの回転数を適宜設定することによって所望のレジスト厚さを得るものである。粘度調整による方法は、レジスト厚さが厚い場合や塗布面積が大きい場合に、平面度が低下することが懸念されるため、実際使用上で要求される平面度に応じて粘度を調整するものである。

[0041] 例えばスピンコート方式の場合、 1回で塗布するレジスト層の厚さは、高い平面度を保持することを考慮し、好ましくは 10〜50 μ m、さらに好ましくは、 20-50 μ mの範囲内であることが好ましい。高い平面度を保持したうえで、所望のレジスト層の厚さを得るためには、レジスト層を複数回に分けて形成することができる。

[0042] 第 1レジスト層 12にポジ型レジストを用いた場合、ベータ時間（溶剤の乾燥）が過度に進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像においてパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが 100 m以上でない場合、ベータ時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。

[0043] (ii)基板 11とマスク A 13との位置合わせにっ、て説明する。

第 1レジスト層 12のパターンと、第 2レジスト層 14のパターンにおける位置関係を所望の設計通りにするためには、マスク A13を用いた露光時に、正確な位置合わせを行うことが必要となる。位置合わせには、基板 11とマスク A13の同位置に切削加工を施しピン固定する方法、レーザー干渉計を用い位置だしする方法、基板 11とマスク A13の同位置に位置マークを作製、光学顕微鏡で位置合わせをする方法等があげられる。光学顕微鏡で位置合わせをする方法は、例えば、フォトリソグラフ法にて基板 11に位置マークを作製し、マスク A13にはレーザー描画装置で位置マークを描画する。光学顕微鏡を用いた手動操作においても、 5 m以内の精度が簡単に得られる点で有効である。

[0044] (iii)マスク A13を用いた第 1レジスト層 12の露光につ!、て説明する。図 3Bに示される工程で使用するマスク A13は何ら限定されなヽが、ェマルジョンマスク、クロムマスク等を挙げることが出来る。レジストパターン形成ステップでは、使用するマスク A13によって寸法、および精度が左右される。そして、その寸法、および精度は、榭脂製細胞培養容器にも反映される。したがって、榭脂製細胞培養容器の各寸法、および精度を所定のものとするためには、マスク A13の寸法、および精度を規定する必要がある。マスク A13の精度を高める方法は何ら限定されないが、例えば、マスク A13のパターン形成に使用するレーザー光源をより波長の短いものに変えることを挙げることができるが、設備費用が高額であり、マスク A13製作費が高額となるため、榭脂製細胞培養容器が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが好ましい。

[0045] マスク A13の材質は温度膨張係数、 UV透過吸収性能の面力も石英ガラスが好ましいが比較的高価であるため、榭脂成形品が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが好ましい。設計通りの所望の深さまたは高さが異なる構造体、あるいは、第 1レジストパターンと第 2レジストパターンが異なる構造体を得るには、第 1レジスト層 12および第 2レジスト層 14の露光に用いるマスクのパターン設計 (透過 Z遮光部）が確実であることが必要であり、 CAE解析ソフトを用いたシミュレーションもその解決策の一つである。

[0046] 露光に用いられる光源は設備費用が安価である紫外線またはレーザー光であることが好ましい。シンクロトロン放射光は、設備費用が高額であり、実質的に榭脂プレートの価格が高額となるものの、露光深度が深いものを得たい場合などに用いることができる。

[0047] 露光時間や露光強度等の露光条件は第 1レジスト層 12の材質、厚み等により変化するため、得られるパターンに応じて適宜調節することが好ましい。特に空間構造パターンの寸法、および精度に影響を与えるため、露光条件の調節は重要である。また、レジストの種類により焦点深度が変わるため、例えば UV露光装置を用いた場合、露光時間、 UV出力値をレジストの厚さ、感度に応じて選択するのが好ましい。

[0048] (iv)第 1レジスト層 12の熱処理について説明する。

露光後の熱処理は、レジストパターンの形状を補正するためにァニールと!、われる熱処理が知られている。ここでは、化学架橋を目的とし、化学増幅系ネガ型レジストを用いた場合のみに熱処理を行う。化学増幅系ネガ型レジストとは、主に、 2成分系または 3成分系からなり、露光時の光によって、例えば、化学構造の末端のエポキシ基が開環し、熱処理によって架橋反応させるものである。熱処理時間は、例えば膜厚 1 00 mの場合、設定温度 100°Cの条件下においては数分で架橋反応は進行する。

[0049] 第 1レジスト層 12の熱処理が進行しすぎると、後の現像において未架橋部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが 100 m以上でない場合、熱処理時間を短くする、または後の第 2レジスト層 14の熱処理のみとする等、適宜選択することが好ましい。

[0050] (V)第 1レジスト層 12上への第 2レジスト層 14の形成につ!、て説明する。

図 3Cに第 2レジスト層 14が形成された状態を示す。この第 2レジスト層 14の形成は、上記 (i)において説明した第 1レジスト層 12の形成と同様の方法による。また、スピンコート方式にて、ポジ型レジストを使用してレジスト層を形成する場合、ベータ時間を通常の 1. 5〜2. 0倍程度とすることで、耐アルカリ性を発現させることができる。これにより、第 1レジスト層 12と第 2レジスト層 14の現像終了時、第 2レジスト層 14のレジストパターンの溶解、または変形を防止することができる。

[0051] (vi)基板 11とマスク B 15との位置合わせについて説明する。

基板 11とマスク B15との位置合わせは、上記）について説明した、基板 11とマスク A13との位置合わせと同様の方法による。

[0052] (vii)マスク B 15を用いた第 2レジスト層 14の露光につ!、て説明する。

マスク B15を用いた第 2レジスト層 14の露光は、上記（iii)において説明したマスク A 13を用いた第 1レジスト層 12の露光と同様の方法による。図 3Dに第 2レジスト層 14 の露光の様子を示す。

[0053] (viii)第 2レジスト層 14の熱処理につ!、て説明する。

第 2レジスト層 14の熱処理は、上記 (iv)において説明した第 1レジスト層 12の熱処理と同様の方法による。また、第 2レジスト層 14の熱処理は、後の現像において第 1 レジスト層 12のパターンが得られた時点で、第 2レジスト層 14のパターンが溶解、または変形させないために行う。熱処理によって化学架橋が進行し、架橋密度を高めることで耐アルカリ性が発現する。耐アルカリ性を発現させるための熱処理時間は、通常の 1. 1〜2. 0倍の範囲からレジストの厚さに応じて適宜選択することが好ましい

[0054] (ix)レジスト層 12および 14の現像について説明する。

図 3Eに示す現像工程では、用、たレジストに対応する所定の現像液を用いることが好ましい。現像時間、現像温度、現像液濃度等の現像条件はレジスト厚みやバターン形状に応じて適宜調節することが好ましい。例えば、必要な深さを得るために現像時間を長くしすぎると、所定の寸法よりも大きくなつてしまうため、適宜条件を設定することが好ましい。この現像工程により、レジストパターン 16が形成される。

[0055] 細胞培養容器の上面、または微細パターン底部の平面精度を高める方法としては、例えば、レジスト塗布で使用するレジスト種類 (ネガ型、ポジ型）を変更する方法、金属構造体の表面を研磨する方法などがあげられる。

[0056] なお、所望の造型深さを得るために複数のレジスト層を形成する場合、それら複数のレジスト層を同時に露光'現像処理する、あるいは、一つのレジスト層を形成および露光処理した後、さらにレジスト層の形成および露光処理を行い、 2つのレジスト層を同時に現像処理することができる。

[0057] (X)金属構造体形成ステップについてさらに詳細に説明する。

金属構造体形成ステップとはレジストパターン形成ステップで得られたレジストパターン 16に沿って金属を堆積させ、金属構造体 18のマイクロ空間構造面をレジストパターン 16に沿って形成することにより、金属構造体 18を得る工程である。

[0058] 図 3Fに示すように、この工程では予めレジストパターン 16に沿って導電性膜 17を形成する。導電性膜 17の形成方法は、特には限定されないが、好ましくは、真空蒸着法、スパッタリング法等による。導電性膜 17に用いられる導電性材料としては金、銀、白金、銅、アルミニウムなどを挙げることができる。

[0059] 図 3Gに示すように、導電性膜 17を形成した後、レジストパターン 16に沿って金属をメツキにより堆積させ、金属構造体 18を形成する。メツキ方法は特に限定されない力例えば電解メツキ、無電解メツキ等を挙げることができる。用いられる金属は特に限定されないが、ニッケル、ニッケルコバルト合金、銅、金を挙げることができ、経済性 '耐久性の観点力ニッケルが好ましく用いられる。

[0060] 金属構造体 18はその表面状態に応じて研磨しても構わない。ただし、汚れが造形物に付着することが懸念されるため、研磨後、超音波洗浄を実施することが好ましい。また、金属構造体 18はその表面状態を改善するために、離型剤等で表面処理しても構わない。なお、金属構造体 18の深さ方向の傾斜角度は、榭脂成形品の形状から 50° 〜90° であることが望ましぐより望ましくは 60° 〜87° である。メツキにより堆積した金属構造体 18はレジストパターン 16から分離される。

[0061] (xi)成形品形成ステップにつ!/、て詳細に説明する。

成形品形成ステップは、図 3Hに示すように、前記金属構造体 18を型として、榭脂成形品 19を形成する工程である。榭脂成形品 19の形成方法は特に限定されないが、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることができ、生産性、型転写性の観点から射出成形が好ましく用いられる。所定の寸法を選択した金属構造体 18を型として射出成形で榭脂成形品 19を形成する場合、金属構造体 18の形状を高い転写率で榭脂成形品 19に再現することができる。転写率を確認する方法としては、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡 (SEM)、透過電子顕微鏡 (TEM)等を用いる方法がある。

[0062] 榭脂成形品 19の平面度の最小値は、工業的に再現し易い観点から 1 μ m以上であることが好ましい。榭脂成形品 19の平面度の最大値は、例えば、該成形品に反り等が発生して光学系ユニットと接触しない等、支障とならない観点から 200 m以下であることが好ましい。榭脂成形品の造形部に対する寸法精度は、工業的に再現し易い観点から ±0. 5〜 10%の範囲内であることが好ましい。

[0063] 以下に、本発明にカゝかる実施例および比較例を示す。これらの実施例および比較例は、微細な突起の寸法およびアスペクト比を変量し、培養細胞の接着能および分ィ匕 '増殖能を解析したものである。微細な突起の寸法およびアスペクト比は、株式会社アルバック製の表面形状測定器 (DEKTAK3030)による触針法にて測定した。光学物性値である全光透過率およびヘイズ値は、株式会社スガ試験機製の可視光線透過率計 (型式: HA— TR)を用いて測定した。具体的には、全光線透過率を JIS K6714に準拠した方法で 2回測定し、その平均値を求めた。また、細胞の接着能は、比色分析法である Crystal Violet法で解析した。細胞の分化'増殖能は、比色分析法である MTT法で解析し、比較例 1を 100%とした。

[0064] Crystal Violet法は、 Crystal Violetが生細胞に取り込まれることを利用した比色分析法である。具体的には、 5. 0 X 10⁵個の HeLa細胞をインキュベーター内で 2時間かけて培養した後、生理食塩水で洗浄し、基板に接着している細胞と、浮遊 (死んでいる）細胞とを区分した。次に、 Crystal Violetで染色した後、 SDS (sodium dodecyl s ulfate)溶液を用いて基板に付着してヽる細胞を溶解し、波長 540nmの吸光度を測定し、比較例 1と比較した。

[0065] MTT法は、 MTT (テトラゾリゥム塩の一種）が細胞内の脱水素酵素による反応によつて、ホルマザンに変化することを利用した染色法である。細胞が元気な場合は酵素活性が高ぐホルマザンへの還元が高ぐホルマザン濃度が高くなる。この濃度差を吸光度として細胞数計測に利用したものである。具体的には、 5. 0 X 10⁵個の HeLa 細胞をインキュベーター内で 3時間かけて培養した後、生理食塩水で洗浄し、基板に接着している細胞と、浮遊 (死んでいる）細胞とを区分した。インキュベーター内で 48 時間かけて培養した後、 MTTを含む培養液と交換しさらに 3時間培養を続けた。そして、イソプロパノールを加えてホルマザンを溶解、波長 570nmの吸光度を測定し、比較例 1と比較した。

[0066] [比較例 1]

市販の滅菌済みのポリスチレン製シャーレ（ Φ 90mm—深さ 20mm)を用いた。培養される面の突起形状は、幅 10nm、アスペクト比 0. 05であった。光学物性値は、全光線透過率 87%、ヘイズ値 2. 0%であった。

[0067] [比較例 2]

株式会社クラレ製のアクリル榭脂 (パラペット GH - S)を使用し、射出成形法により、幅 24mm、長さ 74mm、厚さ 1. Ommの榭脂プレートを作製した後、滅菌を行った。榭脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、光メディアにも対応可能な鏡面仕上げを施した。培養される面の突起形状は、幅 7nm、アスペクト比 0. 1であった。光学物性値は、全光線透過率 91%、ヘイズ値 2. 1%であった。

[0068] [比較例 3] 株式会社クラレ製のアクリル榭脂 (パラペット GH - S)を使用し、射出成形法により、幅 24mm、長さ 74mm、厚さ 1. Ommの榭脂プレートを作製した後、滅菌を行った。榭脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、汎用の榭脂用を用いた。培養される面の突起形状は、幅 15nm、アスペクト比 0. 1であった。光学物性値は、全光線透過率 9 0%、ヘイズ値 2. 8%であった。

[0069] [比較例 4]

株式会社クラレ製のアクリル榭脂 (パラペット GH - S)を使用し、射出成形法により、幅 24mm、長さ 74mm、厚さ 1. Ommの榭脂プレートを作製した後、滅菌を行った。榭脂プレートの表面にあたる金型には、幅 5. 5 /ζ πι、アスペクト比 5を有するスタンパ一を固定して成形した。培養される面の突起形状は、幅 5 /ζ πι、アスペクト比 4. 5であつた。光学物性値は、全光線透過率 72%、ヘイズ値 25. 6%であった。

[0070] [実施例 1]

株式会社クラレ製のアクリル榭脂 (パラペット GH - S)を使用し、射出成形法により、幅 24mm、長さ 74mm、厚さ 1. Ommの榭脂プレートを作製した後、滅菌を行った。榭脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、汎用の榭脂用を用いた。次に、榭脂プレート上にサンドブラスト処理を行い、培養される面に微細な突起を形成した。培養される面の突起形状は、幅 2. 5 /ζ πι、アスペクト比 2. 0であった。光学物性値は、全光線透過率 76%、ヘイズ値 17. 3%であった。

[0071] [実施例 2]

株式会社クラレ製のアクリル榭脂 (パラペット GH - S)を使用し、射出成形法により、幅 24mm、長さ 74mm、厚さ 1. Ommの榭脂プレートを作製した後、滅菌を行った。榭脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、汎用の榭脂用を用いた。次に、榭脂プレート上にサンドブラスト処理を行い、培養される面に微細な突起を形成した。そして、株式会社アルバック (型式: UEP)の蒸着装置を用い、真空蒸着法により微細な突起上に無機膜を堆積させた。蒸着に用いたターゲット材料は、 SiOとし、膜厚は 0. 5 μ

2

mとした。培養される面の突起形状は、幅 800nm、アスペクト比 1. 0であった。光学物性値は、全光線透過率 78%、ヘイズ値 13. 8%であった。

[0072] [実施例 3] 株式会社クラレ製のアクリル榭脂 (パラペット GH - S)を使用し、射出成形法により、幅 24mm、長さ 74mm、厚さ 1. Ommの榭脂プレートを作製した後、滅菌を行った。榭脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、汎用の榭脂用を用いた。次に、株式会社アルバック製の蒸着装置 (型式: UEP)を用い、真空蒸着法により微細な突起を形成した。蒸着に用いたターゲット材料は、 SiOとし、膜厚は 0. 2 mとした。培養される

2

面の突起形状は、幅 280nm、アスペクト比 1. 0であった。光学物性値は、全光線透過率 88%、ヘイズ値 3. 0%であった。

[0073] [実施例 4]

株式会社クラレ製のアクリル榭脂 (パラペット GH - S)を使用し、射出成形法により、幅 24mm、長さ 74mm、厚さ 1. Ommの榭脂プレートを作製した後、滅菌を行った。榭脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、汎用の榭脂用を用いた。次に、株式会社アルバック製の蒸着装置 (型式: UEP)を用い、真空蒸着法により微細な突起を形成した。蒸着に用いたターゲット材料は、 SiOとし、膜厚は 0. 1 μ mとした。培養される

2

面の突起形状は、幅 150nm、アスペクト比 0. 8であった。光学物性値は、全光線透過率 90%、ヘイズ値 2. 5%であった。

[0074] [実施例 5]

株式会社クラレ製のアクリル榭脂 (パラペット GH— S)を使用し、スタンパーを使用した射出成形法により、幅 24mm、長さ 74mm、厚さ 1. Ommの榭脂プレート上に、高さ 20 μ mの複数の側壁によって形成されたマイクロ空間構造を有するプレートを作製した。図 4は、実施例 5にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。これは、図 2に示す第 1の突起 3が無ぐ第 2の突起 4のみを有する構成である。この第 2の突起 4の寸法が、幅 m、長さ m、高さ 20 mであり、配列ピッチは縦 '横ともに 100 /z mである。榭脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、汎用の榭脂用を用いた。この榭脂プレートを、滅菌した後、株式会社アルバック製の蒸着装置 (型式: UE P)を用い、真空蒸着法により微細な突起を形成した。蒸着に用いたターゲット材料は、 SiOとし、膜厚は 0. 3 μ mとした。培養される面の突起形状は、幅 180nm、ァスぺ

2

タト比 0. 6であった。光学物性値は、全光線透過率 89%、ヘイズ値 6. 6%であった。

[0075] 以上の比較例および実施例の結果を表 1にまとめて示す。 [0076] [表 1]

[0077] 比較例 1と比較し、細胞が培養される面の突起幅が 20nmよりも小さいまたは 3 μ m よりも大きいと細胞接着能は低下するまたは向上効果は認められなくなる。アスペクト比が 0. 2よりも小さいまたは 3. 0よりも大きいと、同様に、細胞接着能は低下するまたは向上効果は認められなくなる。突起幅、アスペクト比が大きくなると、透明性も損なわれる。

[0078] 実施例では、突起幅を 20nm〜3 μ m、アスペクト比を 0. 2〜3. 0の範囲とすることで、比較例 1よりも飛躍的に高い接着能を示す。本試験で用いた HeLa細胞では、突起幅が 800nmで最も高い接着能を示した。細胞に応じてそのサイズ、活性が異なるため、細胞種別の最適値は変動することが予測されるが、所望の範囲内を満足すれば、接着性能に優れることが期待される。

[0079] 実施例 3〜5においては、突起幅を 400nm以下とすることにより、高い透明性と細胞接着性の両方の性能を満足しており、透過光で観察を行う細胞観察用途において、その適用性の高いことが示されている。

[0080] 比較例 1と比較し、細胞が培養される面の突起幅が 20nmよりも小さいまたは 3 μ m よりも大きいと細胞の分化 ·増殖能は低下するまたは向上効果は認められなくなる。アスペクト比が 0. 2よりも小さいまたは 3. 0よりも大きいと、同様に、細胞の分化'増殖能は低下するまたは向上効果は認められなくなる。突起幅、アスペクト比が大きくなると、透明性も損なわれる。

[0081] 実施例では、突起幅を 20nm〜3 μ m、アスペクト比を 0. 2〜3. 0の範囲とすることで、比較例 1よりも飛躍的に高い細胞の分化 ·増殖能を示す。本試験で用いた HeLa 細胞では、突起幅が 800nmで最も高い細胞の分化 ·増殖能を示した。細胞に応じてそのサイズ、活性が異なるため、細胞種別の最適値は変動することが予測されるが、所望の範囲内を満足すれば、細胞の分化'増殖能に優れることが期待される。

[0082] 実施例 3〜5においては、突起幅を 400nm以下とすることにより、高い透明性と細胞の分化'増殖能の両方の性能を満足しており、透過光で観察を行う細胞観察用途において、その適用性の高いことが示されている。特に実施例 5では、褐色細胞腫（ PC 12)の培養試験の結果、培養細胞相互にネットワークの形成が認められた。産業上の利用可能性

[0083] 本発明は、例えば、組織から単離した細胞を培養し、試験、検査に用いるための細胞培養容器に利用される。

Claims

請求の範囲

[1] 細胞が培養される面に複数の微細な突起からなる突起群を備える細胞培養容器であって、前記微細な突起の幅または直径が 20ηπι〜3 /ζ πιであり、前記微細な突起のアスペクト比が 0. 2〜3. 0である細胞培養容器。

[2] 前記微細な突起の幅または直径が 20ηπ！〜 400nmであり、前記微細な突起のァスぺクト比が 0. 2〜1. 0であり、透明性を有することを特徴とする請求項 1に記載の細胞培養容器。

[3] 細胞培養容器の全体または一部に、有機膜または無機膜が被覆されていることを特徴とする請求項 1または 2に記載の細胞培養容器。

[4] 前記細胞が培養される面に、複数のマイクロ空間構造を有することを特徴とする請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の細胞培養容器。

[5] 基板上にパターンを形成するステップと、

前記基板上に形成されたパターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、金属構造体を形成するステップと、

前記金属構造体のパターンを転写して細胞培養容器を形成するステップと、前記細胞容器の細胞が培養される面に複数の微細な突起からなる突起群を形成するステップとを備えた細胞培養容器の製造方法。

[6] 前記細胞容器の細胞が培養される面に複数の微細な突起からなる突起群を形成するステップが真空蒸着法であることを特徴とする請求項 5に記載の細胞培養容器の製造方法。

[7] 前記細胞容器の細胞が培養される面に複数の微細な突起からなる突起群を形成するステップがサンドブラスト法であることを特徴とする請求項 5に記載の細胞培養容器の製造方法。

[8] 前記基板上にパターンを形成するステップにおいて、レジストパターンを形成するステップが、レジスト層が所望の高さまたは深さを有する構造体に形成されるまで、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップを含むことを特徴とする請求項 5〜7 のいずれか 1項に記載の細胞培養容器の製造方法。

[9] 前記複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップにおいて、パターンの位置を合わせるためにマスク位置を合わせるステップを備えることを特徴とする請求項 8に記載の細胞培養容器の製造方法。

前記複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップにおいて、異なるパターンのマスクを用いることを特徴とする請求項 8または 9に記載の細胞培養容器の製造方法。