WO2007085621A1

WO2007085621A1 - Verfahren und vorrichtung zur beaufschlagung von zellen

Info

Publication number: WO2007085621A1
Application number: PCT/EP2007/050699
Authority: WO
Inventors: Ulrich Mohr; Josef Vogel; Ulrich Deschl
Original assignee: Boehringer Ingelheim International Gmbh; Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2007-01-24
Publication date: 2007-08-02

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Untersuchung der biologischen Wirkung einer Prüfsubstanz, dadurch gekennzeichnet dass (a) ein Aerosol Generator und gegebenenfalls ein Befeuchter mit Reinluft versorgt werden, (b) die zu prüfende Substanz durch den Aerosol Generator in einen fein verteilten Partikelstrom überführt wird, (c) die Ströme aus dem Aerosol Generator und gegebenenfalls dem Befeuchter in geeigneter Weise zu einem Aerosol durchmischt und einem Verteiler zugeleitet werden, und (d) aus dem Verteiler definierte Volumenströme des Aerosols abgezogen und in unmittelbaren Kontakt mit prokaryotischen oder eukaryotischen In vitro-Kulturen in einer Kultur/Expositionsvorrichtung gebracht werden.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Beaufschlagung von Zellen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der biologischen Wirkung einer hhalierbaren Substanz oder Zusammensetzung auf lebende Zellen und eine Vorrichtung zur Durchführung solcher Untersuchungen.

In der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung verwendete in vitro Prüfsysteme untersuchen potentielle Wirksubstanzen unter konventionellen Kulturbedingungen. Dies gilt auch für Substanzen, die am besten inhalativ appliziert werden. In diesen Prüfsystemen werden Zellen submers, d.h. mit Mediumüberschichtung kultiviert und eine potentielle Wirksubstanz dem Medium zugegeben beziehungsweise gelöst. Eine Untersuchung der biologischen Wirkung von Substanzen und Substanzkombinationen, die inhaliert werden müssten, können auf diesem Wege in vitro nicht in der Form untersucht werden, wie sie für den Patienten entwickelt werden (z.B. als Aerosol), sondern nur in Inhalationsversuchen am lebenden Tier.

DE 10014057 A1 und DE 1021 1324 beschreiben Kulturvorrichtungen, die es gestatten, die darin kultivierten Zellen den schädigenden oder therapeutischen Bedingungen gasförmiger Medien, Aerosole oder Partikelströme auszusetzen. Se können kommerziell unter der Bezeichnung CULTEX® erworben werden.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Idee derartige Kulturvorrichtungen in einem standardisiertes Prüfsystem zu nutzen, mit dem die biologische Wirkung inhalierbarer Substanzen oder Substanzmischungen auf lebende Zellen systematisch untersucht wird, wobei die zu untersuchenden Substanzen als Aerosole mit den prokaryotischen oder eukaryotischen biologischen Testkulturen in unmittelbaren Kontakt gebracht und anschließend die Auswirkungen dieses Kontaktes auf die biologischen Systeme untersucht werden. Durch ein solches System lassen sich aus einer Vielzahl von Substanzen jene aufspüren, deren biologische Wirkung eine Aussage über den therapeutischen Nutzen und/oder seine Toxizität zulässt, während gleichzeitig die Zahl der Tierversuche als auch die benötigten Substanzmengen verringert werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein in vitro Verfahren zur Untersuchung der biologischen Wirkung einer Prüfsubstanz, dadurch gekennzeichnet dass

(a) ein Aerosol Generator und gegebenenfalls ein Befeuchter mit Reinluft versorgt werden,

(b) die Prüfsubstanz durch den Aerosol Generator in einen fein verteilten Partikelstrom überführt wird,

(c) die Ströme aus dem Aerosol Generator und gegebenenfalls dem Befeuchter in geeigneter Weise zu einem Aerosol durchmischt und einem Verteiler zugeleitet werden, und

(d) aus dem Verteiler definierte Volumenströme des Aerosols abgezogen und in unmittelbaren Kontakt mit prokaryotischen oder eukaryoti sehen In-vitro- Testkulturen in einer Kultur/Expositionsvorrichtung gebracht werden.

Als besonders vorteilhaft für die Durchführung des Verfahrens hat sich erwiesen, durch eine Wärmekonditionierung über den gesamten Prozess hinweg das Auftreten von Kondensationseffekten zu reduzieren bzw. zu minimieren. Besonders geeignet ist eine Konditionierung auf einen festen Temperaturwert zwischen 20 °C und 45 °C und bevorzugt zwischen 37°C und 42 °C.

Durch eine Befeuchtung kann die Luft auf einem Wert von wenigstens 60% relativer Feuchte gehalten werden. Bevorzugt ist eine Sättigung der Reinluft mit Wasserdampf, die dann im resultierenden Aerosol eine Trägermatrix für die Prüfsubstanz darstellt.

Als Aerosole zu verstehen sind Gase, welche flüssige oder feste Stoffe i n feinst verteilter Form enthalten. Typische Partikelgrößen für Inhalationszwecke sind von 0,1 μm bis 10μm, bevorzugt von 1 μm bis 5μm aerodynamischer Durchmesser. Verschiedene Möglichkeiten der Aerosolerzeugung werden in „Theorie und Praxis der Inhalationstherapie" von Dieter Köhler und Wolfgang Fleischer, Arcis Verlag, München, 2000, ISBN 3-89075-140-7 beschrieben und in Abbildung 22, Seite 33 des Buches zusammengefasst. So können Aerosole mit flüssigen Partikeln (Tröpfchen) durch Venturi- Düsenvernebler (Pressluft- oder Wasserdampf-getheben), durch Einstoffdüsen (z.B. Respimat®), durch Ultraschall (Pressen der Flüssigkeit durch vibrierende, perforierte Membran; Ablösen von Tröpfchen durch Oberflächenwellen) oder Verdampfen und anschließende Kondensation hergestellt werden.

Durch Versprühen mit Treibgasen (FCKW, HFKW) können feste oder flüssige Partikel entstehen, je nachdem, ob es sich um eine Suspension von festen Partikeln im Treibgas oder um eine Lösung des Wirkstoffes und eventueller Hilfsstoffe im Treibgas handelt. Aerosole mit festen Partikeln können durch dispergieren des Pulvers mit einem geeigneten Gas, insbesondere Luft, erzeugt werden. Dabei kann das Pulver dosiert entsprechend einer Inhalation mit Einzelhüben (z.B. HandiHaler®) oder als Haufwerk in größerer Menge vorliegen. Aerosole mit festen Partikeln können ferner durch eine oder mehrere scharfe Kanten von einem Presskörper aus Wirkstoff und Hilfsstoffen abgetragen werden. Durch Verdampfen und anschließende Kondensation können auch Aerosole mit festen Partikeln entstehen.

Die Technologie der Aerosol Generierung, d.h. die Auswahl des Aerosol Generators erfolgt in Abhängigkeit vom zu charakterisierenden Agens (Flüssigaerosol, Feststoff/Pulveraerosol) ist aber für das beanspruchte Verfahren von untergeordneter Bedeutung. Typische Bespiele von Aerosol Generatoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden könne n, sind unter der Bezeichnung Respimat® für die Erzeugung von Tröpfchen und Handihaler® für die Erzeugung von festen Partikeln bekannt. Bevorzugte Aerosol Generatoren können eine definiert Aerosolkonzentration der Substanz im Bereich von 1 μg/l bis 20mg/l erzeugen. Die Grosse der erzeugten Partikel sollte sich im Bereich von 0,1 μm bis 10μm, vorzugsweise 1 μm bis 5μm bewegen.

Die durch Durchmischung der Ströme aus dem Aerosol Generator und gegebenenfalls dem Befeuchter im Verteiler erzeugte Prüfatmosphäre sollte konstant temperiert sein. Je nach beaufschlagtem Zelltyp sollte die Temperatur zwischen 20 °C und 45 °C und bevorzugt zwischen 37°C und 42 °C gehalten werden. - A -

Um aus dem Verteiler unterschiedliche Proben reproduzierbar abziehen zu können sollte der abgezogene Volumenstrom im Bereich von 1 ml/Min bis 200ml/Min, vorzugsweise von 5ml/Min bis 10Oml/Min variiert werden können.

Besonders geeignet zur Beaufschlagung von Zellen mit der im Verteiler durch Durchmischung der Ströme aus dem Aerosol Generator und gegebenenfalls dem Befeuchter erzeugten Prüfatmosphäre sind Zellkulturen, die in sogenannten CULTEXΘ-Modulen kultiviert werden. Ein Teil der Prüfatmosphäre im Verteiler wird bevorzugt über eine Strömungsführung mit einem Eingang zum Einleiten der

Prüfatmosphäre i n die Strömungsführung und eine oberhalb der Zellkultur mündende Ausgangsöffnung in der Kutur/Expositionsvorrichtung zwangsgeführt und kommt in unmittelbaren Kontakt mit den Zellen, um eine allenfalls biologische Wirkung entfalten zu können. In einer besonderen Ausführungsform zeichnet sich die Strömungsführung dadurch aus, dass die Ausgangsmündung der Strömungsführung sich in Strömungsrichtung entsprechend dem Schalltrichter einer Trompete (im folgenden „trompetenförmig") öffnet. Dadurch wird eine intensive Beaufschlagung der Zellen mit den Prüfatmosphären gewährleistet. Der Vorteil dieser trompetenförmig sich öffnenden Ausgangsmündung gegenüber einem kreiszylindrischem Einleitungsrohr liegt darin, dass insbesondere schwer zu kontrollierende

Ablösezonen an deren Mündungskante vermieden werden, die beispielsweise zu in sich geschlossenen Wirbeln und damit Totzonen ohne oder mit Undefinierter Beaufschlagung oberhalb der Kulturoberfläche führen. Mit dieser speziell geformten Ausgangsmündung wird sichergestellt, dass die Strömung der Prüfatmosphäre glatt und ablösefrei über die Zellen geführt wird und die in der Strömung enthaltenen

Stoffe, insbesondere Partikeln etc., möglichst gleichmäßig über die Kulturoberfläche verteilt werden. Die Strömungsführung kann derart gestaltet sein, dass der Strömungsfluss der Prüfatmosphäre über die Oberfläche der Zellkultur und durch einen zwischen der Strömungsführung und der Kultur-innenwand bestehenden Ringspalt hindurch erzeugt wird, beispielsweise durch eine Vakuumpumpe, die in Strömungsrichtung hinter dem genannten Ringspalt angeordnet ist. Sie verlässt den Beaufschlagungsraum z.B. über Bohrungen, die in einem Kreis um den Einlassstutzen der Strömungsführung angeordnet sind und die ausgangsseitig in einem Ausgangstutzen gebündelt werden. Die Strömungsführung kann eingangsseitig mit einem Ansaugstutzen verbunden sein, der mit der Generationsquelle der Prüfatmosphäre verbunden ist. Der Expositionsaufsatz beinhaltet ein oder mehrere, beispielsweise drei separate Strömungsführungen, die eine separate Beaufschlagung der Zellen in separaten Zellkulturgefäße der Expositionsvorrichtung ermöglichen.

Für die Strömungsführung können verschiedene Materialien zum Einsatz kommen, die sich nach den Eigenschaften der Prüfatmosphäre richten, z.B. Teflon, metallische Werkstoffe, polierter Edelstahl und speziell antihaft- oder Glasbeschichtete trompetenförmige Strömungsführungen, die eine Beaufschlagung von kultivierten Zellen, beispielsweise Zellen des Respirationstraktes, mit ultrafeinen Partikeln gestatten.

Prokaryotische Testsysteme werden in der Regel auf Medien kultiviert, die mit Agar oder Chelatine verfestigt sind, während eukaryotische Zellen zur Direktbeaufschlagung bevorzugt auf Membranen kultiviert werden. Diese werden basal mit Kulturmedium über die Membran versorgt, sodass die Zellen ohne Mediumüberschichtung (apikal) wachsen.

Beispiele für eukaryotische Zellen sind Zellen des tierischen oder menschlichen Respirationstraktes; Makrophagen; Endothelzellen; oder Fibroblasten. Als Zellen des Respirationstraktes kommen zum Beispiel Nasen-, Bronchial- oder Alveolarepithelzellen für die Untersuchungen in Frage. Die Zellen wachsen apikal und treten an der Luft/Flüssigkeitsgrenzschicht direkt mit der Prüftatmosphäre in Kontakt. Sie können auf mikroporösen Membranen kultiviert werden (vgl DE 198 01 763 A1). Beispiele für geeignete mikroporöse Membranen sind beschichtete Membranen z.B. der Firmen Becton Dickinson (FALCON) und Corning (Costar), die aufgrund ihrer Membraneigenschaften ein entsprechendes Zellwachstum gewährleisten. Eine spezielle Kulturführung gestattet nicht nur die Untersuchung der Wirkstoffe mit den oben genannten Zelltypen, sondern erlaubt auch deren Kombination mit weiteren Zellen, wie zum Beispiel Makrophagen, Endothelzellen und Fibroblasten, die bei der Entfaltung der Wirkung des jeweiligen Stoffes eine Rolle spielen können. Dies erfolgt in sogenannten Kokulturen, wobei die Zellen beidseitig auf einer Membran angezüchtet werden. Eine solche Kulturvorrichtung in Kombination mit dem Verfahren erlaubt nach Direktbeaufschlagung des apikal befindlichen Zelltyps mit der Testatmosphäre eine Analyse der Interaktionen zwischen den auf der Membran befindlichen verschiedenen Zelltypen, um weitergehende Aufschlüsse über die Wirkung der Prüfsubstanz zu ermitteln.

Gefäße, welche auf mikroporösen Membranen angezüchtete und kultivierte Zellen zur Beaufschlagung mit der Prüfatmosphäre aufnehmen (z.B. in sogenannten Transwell-Inserts), befinden sich bevorzugt in einem separaten Untersatz, wobei jedes Gefäß individuell mit Nährstoffen versorgt wird. Die Nährstoffversorgung erfolgt über eine Zuleitung, die über eine entsprechende Verbindung wie z.B. eine Schlauchverbindung mit dem Nährstoffreservoir verbunden ist, und die über einen Eingangsstutzen eine Nährstoffzufuhr in das betreffende Gefäß des Untersatzes ermöglicht. Das Gefäß kann bis zu einer bestimmten Höhe mit Medium zur Versorgung der Zellen über die Zeit der Beaufschlagung gefüllt werden. Ein weiterer Stutzen eröffnet die Möglichkeit eines ständigen Mediumflusses, in dem das einströmende Volumen in analoger Weise über den Ausgangsstutzen abfließt bzw. entfernt wird. Der Mediumstrom kann z.B. durch eine Schlauchpumpe kontrolliert reguliert werden. Durch diese Maßnahmen wird eine kontinuierliche Mediumversorgung über lange Beaufschlagungszeiten erreicht.

Mit dem beschriebenen Prüfverfahren ist es möglich z.B. unterschiedliche Zielzellen des Respirationstraktes oder geeignete bakterielle Prüfsysteme mit potentiell therapeutisch wirksamen Substanzen zu beaufschlagen, die speziell inhalativ aufgenommen werden und direkt wirken. Dies beschränkt sich nicht nur auf gasförmige und Flüssigaerosole, sondern umfasst auch Wirkstoffe, die als feste Aerosolpartikel verabreicht werden. Das Verfahren gewährleistet eine unmittelbare Beaufschlagung der kultivierten Zellen oder Bakterien mit einer Prüfatmosphäre und erlaubt eine genaue Analyse des resultierenden zellulären Reaktionsmusters zur Beschreibung der zu erwartenden therapeutischen und allenfalls unerwünschten toxischen Wirkung. Die Bioverfügbarkeit und Wirksamkeit von Substanzen, die in fester partikulärer Form appliziert werden, kann in Abhängigkeit von der Partikelgröße und dem Trägermaterial untersucht werden, ein Aspekt, der unter konventionellen Bedingungen nicht realisiert werden kann.

Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht in der Möglichkeit nicht nur Einzelsubstanzen, sondern auch Kombinationen derselben in unterschiedlichen Mischungsverhältnissen an Zellen zu testen, um therapeutisch relevante Wirkstoffe oder deren Kombinationen zu selektieren.

Die Behandlung kultivierter Zellen mit therapeutischen Aerosolen durch Direktbeaufschlagung beinhaltet keine Limitierung hinsichtlich der bestimmbaren biologischen Endpunkte bzw. Wirkungen. Typischerweise bestimmte Parameter sind z.B. Lebendzellzahl, metabolische Aktivität, Membranintegrität, Energiestatus oder oxidativer Stress. Eine umfassende Charakterisierung der behandelten Zellen zum Beispiel in Bezug auf die zyto- und genotoxische Aktivität der Prüfatmosphäre, deren inflammatorisches Potential oder molekularbiologische Aspekte (Genomics, Metabono mics) ist uneingeschränkt möglich, ebenso wie Rezeptoruntersuchungen, die Bestimmung von Mediatoren oder anderen Biomarkern, die Analyse von Signaltransduktionswegen und Bestimmungen zur Bioverfügbarkeit der Prüfatmosphäre.

Die im Rahmen des Verfahrens bevorzugt durchgeführten Untersuchungen betreffen die biologische Wirkung von Aerosole n/Prüfatmosphäre auf in vitro kultivierte Zellen. Sie sind typischerweise gerichtet auf

• die Wirksamkeit von Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen partikulärer Aerosole in Abhängigkeit von ihrer Partikelgröße und gegebenenfalls dem verwendeten Trägermaterial; • die Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen partikulärer Aerosole in Abhängigkeit von ihrer Partikelgröße und gegebenenfalls dem verwendeten Trägermaterial;

• die zyto- und genotoxische Wirkung der Gase, Aerosole oder Mischungen auf die Zellkulturen;

• das inflammatorisches Potential der Gase, Aerosole oder Mischungen für die Zellkulturen;

• das zelluläre Reaktionsmuster der Zellkulturen auf den unmittelbaren Kontakt mit den Gasen, Aerosolen oder deren Mischungen; und • molekularbiologsiche Aspekte des unmittelbaren Kontaktes der Zellen mit den Gasen, Aerosolen oder deren Mischungen.

Beispiele für Untersuchungen molekularbiologischer Aspekte sind Rezeptorstudien, die Bestimmung von Mediatoren oder anderer Biomarker oder die Analyse von Signaltransduktionswegen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Vorrichtung basierend auf dem soeben beschriebenen Verfahren. Eine solche Vorrichtung dient der Untersuchung der biologischen Wirkung einer inhalierten Substanz, umfasst

• einen Luftbefeuchter;

• einen Aerosol Generator für feste oder flüssige Substanzen, der befeuchtete Reinluft des Luftbefeuchters als Trägergas nutzt;

• einen Verteiler, der mit dem erzeugten Aerosol beschickt wird; und • ein oder mehrere Zellkultureinheiten, die mit dem Verteiler über ein oder mehrere

Probenahmepunkte in Verbindung stehen; und ist dadurch gekennzeichnet dass der erzeugte Aerosolstrom von einem Probenahmepunkt zur verbundenen Zellkultureinheit geführt und dort mit den kultivierten Zellen in unmittelbaren Kontakt gebracht wird. In einer besonderen Ausführungsform umfasst die beschriebene Vorrichtung zusätzlich Online Analysegeräte zur Messung von Aerosolparametern, die über Probenahmepunkte mit dem Verteiler verbunden sind und ebenso wie die Zellkultureinheiten mit Proben aus dem Verteiler beschickt werden.

Als Probenahmevorrichtungen angeschlossen sein können beispielsweise Kühlfallen oder Aktivkohlefilter für gasförmige Bestandteile, Partikelfilter für Aerosolpartikel oder Impaktoren für definierte Partikelgrößen.

Als Online Analysegeräte angeschlossen sein können beispielsweise Vorrichtungen zur Bestimmung der Partikelkonzentration, Vorrichtungen zur Bestimmung der Partikel Größenverteilung oder Vorrichtungen zur Bestimmung der Konzentration bestimmter gasförmiger Bestandteile.

Typische Bespiele von Aerosol Generatoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden könne n sind unter der Bezeichnung Respimat® und Handihaler® bekannt. Eine geeignete Kultur- und Expositionseinheit sind die als CULTEXΘ-Module erhältlichen Vorrichtungen.

Als vorteilhaft erweist sich eine Wäremkonditionierung der gesamten Vorrichtung um das Auftreten von Kondensationseffekten zu reduzieren bzw. zu minimieren. Besonders geeignet ist eine Konditionierung auf einen festen Temperaturwert zwischen 20 °C und 45 °C und bevorzugt zwischen 37°C und 42°C.

Die wesentlichen Verfahrensschritte bzw. Elemente der vorliegenden Erfindung werden in den beispielhaften Fließschemata der Figuren 1 und 6 näher erläutert. Sie zeigt den Aerosol-Expositionsaufbau. Der komplette Aufbau besteht aus mindestens zwei derartigen Aufbauten, die zur gleichzeitigen Exposition von A549-Kulturen auf mikroporösen Membranen gegen eine Kontrollsubstanz (aerosoliertes PBS) und eine Prüfsubstanz (z.B. aerosolisiertes tert.-Butylhydroperoxid) genutzt wird. Beispiele:

Beispiel 1 : Vorrichtung für die Generierung und Exposition von Tröpfchen- Aerosolen im Zellkulturmaßstab Eine modulare Bauweise in paralleler Anordnung gestattet den gleichzeitigen Betrieb von mehreren Nebulizern. Damit ist die zeitgleiche, parallele Exposition von Zellen auf mikroporösen Membranen z.B. gegenüber einem Prüfaerosol und einem Kontrollaerosol (z.B. PBS als Träger bzw. Lösungsmittel der Prüfsubstanz) in einem Experiment möglich. Zur Herstellung des Tröpfchen-Aerosols aus Flüssigkeiten werden kommerziell erhältliche Nebulizer der Marke „Miniheart Low Flow Nebulizer" (Westmed Inc., Tucson, USA) verwendet. Mittels einer Perfusorpumpe werden die Testflüssigkeiten kontinuierlich in das Vorratsgefäß des Nebulizers transportiert und so konstante Füllstände im Nebulizer über den gesamten Expositionszeitraum gewährleistet. Die durch ein Wasserbad auf 37°C äußerlich permanent erwärmten Nebulizer werden mit einem Reinluft-Strom (Ca. 37°C , 2 l/min) betrieben. Die Probeentnahme der Aerosole für die Zellexpositionen erfolgt unmittelbar oberhalb des Austritts des Aerosols aus dem Nebulizer an zwei einander gegenüberliegenden Entnahmepunkten. Im weiteren Strömungsweg des Prüfaerosols liegt die Probenahme-Position für eine Online-Aerosolanalyse bevor das Prüfaerosol durch eine Kühlfalle und einen kombinierten Aktivkohle -/Partikelfilter geleitet wird. Bei Bedarf kann die parallel betriebene Position des Kontrollaerosols um eine derartige Reinigungseinheit und Online-Aerosolanalyse erweitert werden. Der gesamte Strömungsweg der Aerosole oberhalb der Nebulizer wird durch eine elektrische Wickelheizung auf Ca. 37°C konstant thermostatisiert.

Beispiel 2: Zellkultur

Aus einer kontinuierlich passagierten A549-Kultur (DSMZ, Braunschweig) werden im Verlauf des routinemäßigen Kultursplits Zellen geerntet und auf Membranen (BD Falcon) ausgesät. Nach einer 72h Anheftungs- und Wachstumsphase unter Standardkulturbedingungen werden die Zellen auf den Membranen mikroskopisch kontrolliert und mit frischem Medium versehen. 18 Stunden vor der eigentlichen Exposition werden die adhärent wachsenden Zellen aus der submersen Kultivierung in eine air/lifted Kulturführung verbracht. Die derart konditionierten Zellen werden für die Exposition gegen das Testaerosol oder das Kontrollaerosol bzw. als Inkubator- Kontrolle verwendet. Im Anschluss an den Expositionszeitraum werden die Zellen aufgearbeitet oder unter submersen Bedingungen im Inkubator nachkultiviert, um dann weiter analysiert zu werden.

Beispiel 3: Analyse zellulärer Wirkungen

Direkt nach der Exposition werden die Membranen den Expositionseinrichtungen entnommen, mit frischem Medium versehen und zunächst der Analyse des Tetrazoliu msalz- Umsatzes mittels WST- 1 Assay zugeführt. WST-1 Assay

WST-1 Farbstoff-Reagenz (Boehringer, Mannheim) wird zum Kulturmediumüberstand gegeben. Die Zellen werden unter zelltypspezifischen Bedingungen im Brutschrank für 30min reinkubiert. Aus dem Medium wird anschließend die Messung der Absorption im Mikrotiter-Platten Reader bei den Wellenlängen 450 nm/ 630 nm durchgeführt.

Messung der Lebendzellzahl

Nach Entfernung des Mediums aus den Inserts wird eine Trypsin/EDTA-Lösung zugegeben und die Zellen bei 37°C für 5min im Brutschrank reinkubiert. Anschließend wird die Trypsinwirkung durch Zugabe von Trypsin-Inhibitor gestoppt und die Zellen werden vorsichtig suspendiert. Zur Bestimmung der Lebendzellzahl mittels eines elektronischen Zellanalysegerätes (CASY, Fa. Schärfe) wird ein Aliquot des Zelltrypsinats in einem schwachen Elektrolyt suspendiert und mit konstanter Strömungsgeschwindigkeit durch eine Kapillare definierter Geometrie gesaugt. Von jeder Zellsuspension wird eine Dreifachmessung durchgeführt.

Beispiel 4: Exposition Experimentelle Gruppen

Inkubator-Kontrollen werden für den Zeitraum der Exposition unter air-liquid Kulturbedingungen im Brutschrank inkubiert.

Als Expositionskontrollen werden Kulturen eingesetzt, die parallel und zeitgleich zur Aerosolexposition unter denselben Bedingungen exponiert werden wie die Zellen in der Aerosolexposition. Der einzige Unterschied zur Aerosolexposition besteht darin, dass diese Exposition ausschließlich gegen aerosolisiertes PBS stattfindet. In der Aerosolexposition werden die Kulturen über einen Zeitraum von 30 Minuten gegen verschiedene Konzentrationen eines frisch generierten Tröpfchen-Aerosols einer Modellsubstanz exponiert.

Expositionsdosen

Es werden verschiedene Konzentrationen einer Modellsubstanz verwendet. Die Zellen werden den hieraus generierten Aerosolen bei einem Expositionsfluss von 5ml/min/cm² für jeweils 30min ausgesetzt. Zur Ermittlung der tatsächlichen Expositionsdosis wird für jede Testsubstanz in zellfreien Experimenten die Deposition des Aerosols mittels Na-Fluorescein (10 μg/ml in der Nebulizer-Füllung) auf den mikroporösen Membranen quantifiziert. Unter den Bedingungen der Zellexposition werden diese mit Expositionsflüssen von 5 ml/min über Zeiträume von 10 bis 30 Minuten überströmt. Danach werden die Membranen entnommen, aus den Halterungen ausgeschnitten, mit Reinstwasser extrahiert und die Fluoreszenz des Extraktes bei den Wellenlängen 435 nm (ex.) 510 nm (em.) gegen Vergleichslösungen von Na-Fluorescein in Reinstwasser quantifiziert. Durch das Ausschneiden der Membranen werden ausschließlich die Wachstumsflächen in der Messung berücksichtigt, auf der sich im weiteren die adhärenten Zellkulturen befinden werden.

Die Volumina an PBS z.B., die während der Expositionszeit deponiert werden, können mittels Anfärbung der Nebulizer-Füllung mit Natrium -Fluoreszin und Nachweis in zellfreien Experimenten derart bestimmt werden. Das maximal deponierte Volumen liegt innerhalb von 30 Minuten bei 1 μl/cm².

Expositionssituation

Zusätzlich zur Modulation üblicher Expositionsparameter wie z.B. Zeit, Konzentration oder Temperatur kann bei der Verwendung mikroporöser Membranen auch der Mediumfüllstand („Mediumlevel") unterhalb der Membrane eine Einflussgröße auf die Expositionssituation der apikal adhärent kultivierten Zellen darstellen. Daher werden zellbewachsene Membranen für die Dauer der Exposition in Abhängigkeit vom Mediumlevel in bis zu drei unterschiedlichen Variationen gegen die aerosolisierten Modellsubstanzen bzw. die korrespondierende PBS-Kontrolle exponiert: (1 ) unter den Bedingungen eines „hohen" Mediumlevels, und eines daraus resultierenden maximalen hydrostatischen Druckes auf die mikroporöse Membran (2) einem minimalen „Kontakt" zwische n Membran und basal herangeführtem Medium und (3) keinem Kontakt von Membrane und Medium, einem sog. "niedrigen" Mediumlevel (Abbildung 2-2).

Expositionskontrollen

Die Expositionskontrollen werden gleichzeitig zu jeder Aerosolexposition im Parallelaufbau verwendet und stellen die Bezugsgröße für die Ergebnisse der Aerosolexposition dar, da sie - mit Ausnahme der Wirkung der Testsubstanz - allen Einflüssen der Exposition unterliegen. Die aus den jeweiligen Kontrollsituationen stammenden zellbewachsenen

Membranen werden parallel mit den aus den Aerosolexpositionen stammenden Membranen aufgearbeitet. Im Folgenden sind getrennt nach Endpunkten die Ergebnisse für die Inkubatorkontrollen und die Expositionskontrollen in Abhängigkeit vom jeweiligen Expositionstag dargestellt. Die Ergebnisse des Tetrazoliumsalz-Umsatzes (WST-1 ) nach Exposition der A549- Zellen gegen ein PBS Tröpfchen-Aerosol als Kontrollsituation zu den durchgeführten Aerosolexpositionen mit Modellsubstanzen sind in Figur 2 für zwei Expositionstage (Di und Mi) in Abhängigkeit von der Expositionssituation (Mittelwerte mit Standardabweichung für Medium hoch, Medium Kontakt und Medium tief) aufgetragen. Die Daten sind auf die jeweils expositionstäglich aktuell mitgeführten Inkubatorkontrollen bezogen.

Die Werte liegen im Schwankungsbereich der Inkubator-Kontrollen und dokumentieren, dass die Expositionssituation auf den Tetrazoliumsalz- Umsatz der Zellen keinen Einfluss hat. Die Ergebnisse der Lebendzellzahlbestimmung, die als weiterer Vitalitätsparameter im Anschluss an die Exposition erfasst wurde, sind in Figur 3 zusammengestellt. Auch hier decken sich die Werte an beiden Expositionstagen im Mittel der Expositionskontrollen in allen Expositionssituationen mit den Inkubatorkontrollenwerten.

In Bezug auf die untersuchten Vitalitätsparameter können damit für die A549-Zellen in den beschriebenen Expositionskontrollsituationen auch unter Variation der Mediumlevel keinerlei Effekte beobachtet werden. Die Vitalitätsmessungen an kontrollexponierten Zellen führen sogar zu annähernd deckungsgleichen Ergebnissen wie sie für Zellen unter air/liquid Bedingungen im Inkubator ermittelt wurden.

Expositionen

Zur Erstellung von Dosis-Wirkungsbeziehungen wird als Beispiel tert. Butyl-hydroper- oxid (tBuOOH) in verschiedenen Konzentrationen von 0.02M bis 1 M im Aufbau vernebelt und dessen Wirkung auf die Zellen über die Bestimmung der metabolischen Aktivität (WST-1 Assay) und Lebendzellzahl untersucht. Dabei wird der Mediumlevel „Kontakt" verwendet.

Beispiel 5: Auswertung

In Figur 4 sind die Ergebnisse dieser Versuchsserie dargestellt. Dabei sind die Ergebnisse aus der Untersuchung des Tetrazoliumsalz- Umsatzes bei Mediiumlevel „Kontakt" gegen die per Depositionsuntersuchung ermittelte Dosis dargestellt. Für die Regression berücksichtigte Messpunkte sind mit „x" gekennzeichnet, nicht berücksichtigte mit „o". Die eingezeichneten Kurven entsprechen der Regressionsgeraden mit den dazugehörigen Konfidenzgrenzen (95%). Es wird eine Dosis-Wirkungsbeziehung berechnet, die innerhalb der untersuchten Dosierungen den kompletten Vitalitätsbereich von 100 % bis 0 % im Vergleich zur PBS- exponierten Kontrolle beschreibt.

Die entsprechende Darstellung der Ergebnisse zur Ermittlung der Zellzahl ist in Figur 5 aufgetragen. Aus diesen Dosis-Wirkungskurven können Kennwerte z.B. ED₅₀ Werte (Wert, bei dem das gemessene Signal eines Endpunktes, z.B. metabolische Aktivität im WST-1 Assay, um 50% gegenüber der Kontrollkultur erniedrigt ist) berechnet werden, die einen unmittelbaren Vergleich von Wirkungen unterschiedlicher Stoffe erlauben. Für tBuOOH beträgt dieser Wert bezogen auf die Messung der metabolischen Aktivität (WST-1 Assay) unter den genannten Bedingungen 0.05 μMole/cm² beziehungsweise 0.08 μMole/cm² für die Zellzahl.

Claims

Ansprüche:

1 . In vitro Verfahren zur Untersuchung der biologischen Wirkung einer Prüfsubstanz, dadurch gekennzeichnet dass (a) ein Aerosol Generator und gegebenenfalls ein Befeuchter mit Reinluft versorgt werden,

(d) aus dem Verteiler definierte Volumenströme des Aerosols abgezogen und in unmittelbaren Kontakt mit prokaryotischen oder eukaryotischen In vitro- Kulturen in einer Kultur/Expositionsvorrichtung gebracht werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturen in einem CULTEX® Modul kultiviert und mit dem Aerosol in Kontakt gebracht werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet dass durch den Aerosol Generator definierte Aerosolkonzentrationen der Substanz erzeugt werden können.

4. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass die durch den Aerosol Generator fein verteilten Substanzen fest oder flüssig sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet dass als Aerosol Generator ein Respimat® oder Handihaler® verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet dass der Volumenstrom für die Probennahme variiert werden kann.

7. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet dass die Untersuchungen gerichtet sind auf

• die Wirksamkeit von Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen partikulärer Aerosole in Abhängigkeit von ihrer Partikelgröße und gegebenenfalls dem verwendeten Trägermaterial;

• die Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen partikulärer Aerosole in Abhängigkeit von ihrer Partikelgröße und gegebenenfalls dem verwendeten Trägermaterial;

• das zelluläre Reaktionsmuster der Zellkulturen nach dem unmittelbaren Kontakt mit den Gasen, Aerosolen oder deren Mischungen; • molekularbiologsiche Aspekte des unmittelbaren Kontaktes der Zellen mit den

Gasen, Aerosolen oder deren Mischungen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet dass die molekularbiologischen Aspekte durch Rezeptorstudien, die Bestimmung von Mediatoren oder anderer Biomarker oder durch Analyse von

Signaltransduktionswegen untersucht werden.

9. Anordnung zur Untersuchung der biologischen Wirkung einer inhalierten Substanz umfassend (a) einen Luftbefeuchter;

(b) einen Aerosol Generator für feste oder flüssige Substanzen, der befeuchtete Reinluft des Luftbefeuchters als Trägergas nutzt;

(c) einen Verteiler, der mit dem erzeugten Aerosol beschickt wird; und

(d) ein oder mehrere Zellkultureinheiten, die mit dem Verteiler über einen oder mehrere Probenahmepunkte in Verbindung stehen; dadurch gekennzeichnet dass der erzeugte Aerosolstrom von einem Probenahmepunkt zur verbundenen Zellkultureinheit geführt und dort mit den kultivierten Zellen in unmittelbaren Kontakt gebracht wird.

10. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet dass zusätzlich ein oder mehrere Online Analysegeräte zur Messung von Aerosolparametern über Probenahmepunkte mit dem Verteiler verbunden sind und ebenso wie die Zellkultureinheiten mit Proben aus dem Verteiler beschickt werden

1 1 . Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet dass zur Vermeidung von Kondensationseffekten eine Wärmekonditionierung aller Komponenten verwirklicht ist.