WO2007082712A1 - Formulation colloïdale d'insuline longue action et sa préparation - Google Patents

Formulation colloïdale d'insuline longue action et sa préparation Download PDF

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WO2007082712A1
WO2007082712A1 PCT/EP2007/000335 EP2007000335W WO2007082712A1 WO 2007082712 A1 WO2007082712 A1 WO 2007082712A1 EP 2007000335 W EP2007000335 W EP 2007000335W WO 2007082712 A1 WO2007082712 A1 WO 2007082712A1
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insulin
formulation
poly
glu
leu
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PCT/EP2007/000335
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Alain Constancis
David Duracher
Olivier Soula
Nathan Bryson
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Flamel Technologies
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Definitions

  • the field of the present invention is that of insulin-based drugs, particularly injectable insulin formulations, for the treatment of type I and type II diabetes in humans and animals.
  • the present invention relates to injectable insulin formulations formed by colloidal insulin suspensions for daily parenteral administration and capable of maintaining throughout the nycthemeron in the diabetic patient or animal an insulin concentration. plasma concentration close to the basal concentration observed in a non-diabetic subject.
  • the invention also relates to methods for preparing said colloidal insulin suspensions.
  • Diabetics are subjected to a very restrictive and imperfect treatment, forcing them to inject insulin several times a day.
  • Injectable insulin formulations must be stable, ie the insulin they contain must not degrade on storage. This insulin must for example always be fully effective after storage for 2 years at 5 ° C. Injectable insulin formulations must have a rheology adapted to the injection systems commonly used for insulin. There is therefore an acute need for a formulation of insulin long action for injection through very fine needles and stable. The problem of developing such a formulation has been known for a long time and has been the subject of much work.
  • insulin refers to both human insulin or animal insulin or an insulin analogue.
  • a "long-acting insulin formulation” is a formulation that makes it possible, on the one hand, to avoid, after administration, any peak of hypoglycaemia that is harmful to the patient and, on the other hand, to maintain a hypoglycemic action over at least 24 hours.
  • long-acting human insulin NPH is known.
  • These are partially microcrystalline suspensions of human insulin / zinc / protamine complexes (as described, for example, in US Pat. No. 5,834,422), which make it possible to slow down the in vivo release of the protein.
  • the insulin is complexed with protamine and zinc to form a partially crystallized precipitate.
  • the rate of insulin release is controlled by the in vivo dissolution kinetics of this precipitate and insulin decomplexation kinetics.
  • the duration of action of this type of insulin although prolonged compared to that of a fast insulin, does not exceed 16 hours and does not really cover the nycthemeron.
  • hypoglycemia after administration of this long-acting human insulin NPH. The latter is not a true long-acting insulin as defined above.
  • US-B-5,656,722 discloses a novel insulin-like protein structure termed GLARGINE® included in a formulation.
  • Example 14 of US Pat. No. 5,904,936 human insulin spontaneously associates with nanoparticles of poly (Leu-block-Glu) up to a specific level. maximum of 0.65 mg of human insulin per 10 mg of poly (Leu-block-Glu), ie 6.5% by weight.
  • This long-acting injectable insulin formulation according to Example 14 of US Pat. No. 5,904,936 can be improved on the following points - The formulation could be easier to inject, especially with fine needle syringes 29G, 30G or 3GI, which clearly improve the comfort of the patient knowing that it is subject to daily injection over several decades
  • the formulation could gain stability to further delay insulin degradation -
  • Subcutaneous injection of this formulation into pigs can sometimes lead to the formation of marked erythema and edema, reflecting a local tolerance likely to to be improved, making this formulation difficult to reconcile with a daily pharmaceutical application over a very long period of time.
  • the formulation is difficult to sterilize by filtration
  • the application WO-A-01/37809 describes an insulin long-acting injectable formulation, whose pH is 7.4 and which comprises a suspension of poly (Leu-block-Glu) polymer nanoparticles.
  • suspension comprises (per ml of preparation) 80 IU of insulin and 56 mg of polymer, ie an insulin / poly (Leu-block-Glu) mass ratio of 5% administered in the Beagle dog at the rate of 2 IU / kg, this
  • this formulation has a perfectible stability as demonstrated in Example 5 below of the present application.
  • the formulation would benefit from being more easily injectable through a small diameter needle (eg 29G, 30G or 31G), in order to improve the comfort of the patient, and thus the observance of the treatment
  • the insulin formulation is perfectible in terms of its stability especially at 4 ° C and at room temperature, so as not to cause changes in the properties of the formulation or degradation of human insulin
  • the formulation would be greatly improved if it had an excellent local tolerance, to be compatible with a daily injection over a period of several decades 4.
  • the bioavailability of insulin provided by such a formulation would benefit from being as high as possible.
  • the effectiveness of the formulation measured for example by its hypoglycemic effect, would be to be as high as possible for at least 24 hours after the injection.
  • the formulation would benefit from having a rheology allowing an easy filling of the syringe by the patient.
  • French Patent Application No. 04 51578 of July 19, 2004 discloses a colloidal injectable suspension of insulin long action.
  • This suspension aims at satisfying the aforementioned specifications. It comprises nanoparticles of at least one poly (Leu-block-Glu), loaded with insulin.
  • Its pH is between 5.8 and 7.0 (eg 6.3-6.5).
  • Its osmolarity O is such that: 270 ⁇ O ⁇ 800 (eg circa 300).
  • This osmolarity is adjusted by addition of at least one salt, for example NaCl or MgCl 2 -Sa viscosity v (in mPa.s) is such that v ⁇ 40 (eg ⁇ 25).
  • the nanoparticles of poly (Leu-block-Glu) have a mean hydrodynamic diameter Dh such that: ⁇ Dh ⁇ 40.
  • the concentration of poly (Leu-block-Glu) is between 30-55 g / l (eg 42) .
  • the Insulin / poly (Leu-block-Glu) ratio is between 5 and 11.
  • the maximum loading rate Ta of the nanoparticles with insulin expressed in% of the mass of insulin associated with the mass of poly (Leu -bloc-Glu) and measured according to a procedure Ma, is such that: 12 ⁇ Ta ⁇ 25.
  • This colloidal injectable long acting insulin suspension has very good pharmacokinetic and pharmacodynamic performance.
  • this suspension is perfectible in terms of viscosity. Indeed for administration at least once a day for life, it is highly desirable to ensure that this suspension is as fluid as possible, ideally as water. This requirement applies as well to the ease of filling the syringe equipped with a fine needle (pumping / suction), as compared to the ease of injection (expulsion of the suspension).
  • the expected viscosity decrease should not be to the detriment of the pharmacokinetic and pharmacodynamic performance of the suspension.
  • the inventors have demonstrated that the simple solution which consists in reducing the concentration of poly (Leu-block-Glu) to reduce the viscosity of the suspension is detrimental to the pharmacokinetic and pharmacodynamic performances.
  • Another essential object of the invention is to provide long-acting insulin formulations in the form of a colloidal suspension which: allows easy filling of a syringe through a small diameter needle (for example 29G gauge, 3OG or 3 IG)
  • a small diameter needle for example 29G gauge, 3OG or 3 IG
  • Another essential objective of the present invention is to provide a long-acting insulin formulation in the form of a colloidal suspension comprising poly (Leu-block-Glu) nanoparticles and which can be filtered on 0.2 ⁇ m filters for sterilization.
  • Another essential objective of the invention is to improve the suspension disclosed in French Patent Application No. 04 51578 of July 19, 2004.
  • Another essential objective of the invention is to fully meet the specifications described above.
  • Another essential object of the invention is to provide a long-acting insulin formulation in the form of a colloidal suspension, which maintains a significant hypoglycemic effect extending over at least 24 hours, after a single administration, for example by subcutaneous administration. skin.
  • Another essential objective is to provide a long acting insulin formulation in the form of a colloidal suspension, which is stable and which does not induce a change in the structure and bioactivity of the insulin.
  • Another essential objective of the invention is to provide long-acting insulin formulations in the form of injectable colloidal suspensions with a low injection volume and a high concentration of human insulin, typically 100 IU / ml, without harming the therapeutic efficacy and in particular to the duration of the hypoglycemic effect.
  • Another essential objective of the present invention is to provide a long-acting insulin formulation in the form of a colloidal suspension, having good local tolerance and job security consistent with chronic treatment of diabetics.
  • Another essential object of the invention is to provide a long-acting insulin formulation in the form of a colloidal suspension, wherein the insulin is an unmodified human insulin.
  • Another essential objective of the present invention is to provide a long-acting insulin formulation in the form of a colloidal suspension comprising poly (Leu-block-Glu) nanoparticles on which the proteins are reversibly adsorbed, non-covalently and without denaturation.
  • Another essential objective of the invention is to propose a process for the preparation of these long-acting insulin colloidal suspensions, said process being easy to carry out, non-denaturing for the protein and also having to always ensure reliably the reproducibility of the characteristics of the formulation.
  • a long-acting insulin injectable formulation comprising a colloidal, aqueous and stable suspension of nanoparticles based on at least one polymer sequence of L-Leucine and sodium L-Glutamate, or poly (L-leucine-bL-sodium glutamate) hereinafter referred to as poly (Leu-block-Glu) -, these nanoparticles being loaded with insulin, the pH of this suspension being such that: 6.0 ⁇ pH ⁇ 7.0; characterized in that it comprises at least one magnesium salt in an amount such that:
  • Osmolarity Osm (in mOsmol) is such that: 270 ⁇ Osm ⁇ 600,
  • the viscosity v (in mPa.s), measured according to a procedure Mv, is such that: v ⁇ 15.
  • the concentration (in mg / ml) of poly (Leu-block-Glu) is between 30 and 70, preferably between 38 and 65.
  • the viscosity ⁇ (in mPa.s), measured according to a procedure Mv, is such that: v ⁇ 10, and even more preferably v ⁇ 5.
  • the inventive basis of this new colloidal suspension suitable for constituting an injectable long-acting injectable insulin formulation lies, in particular, in the combination of the following selections: osmolarity window ensuring in particular a good local tolerance for the formulation; - Viscosity window with a ceiling at 15 mPa.s, preferably at 10 mPa.s, and more preferably still at 5 mPa.s, which participates in the introduction into the formulation of rheological properties such that it is possible to fill easily a syringe by aspirating the formulation through a small diameter needle (for example gauge 29G, 30G or 31G) and easily inject through these same needles;
  • a small diameter needle for example gauge 29G, 30G or 31G
  • the concentration (in mg / ml) of poly (Leu-block-Glu) of the formulation is between 30 and 70, preferably 38 and 65.
  • This concentration window in poly (Leu-block-Glu) allows maintain the pharmacokinetic and pharmacodynamic performance of the suspension;
  • the counteranion of Mg 2+ is selected from the group consisting of Cl “ , SO 4 "" and mixtures thereof.
  • the formulation according to the invention preferably has at least one (ideally all) of the following characteristics: the particles of the poly (Leu-block-Glu) retained have a mean hydrodynamic diameter Dh expressed in nanometers (nm) and measured according to a procedure Md, such that:
  • the insulin / poly (Leu-block-Glu) mass ratio is such that:
  • the injectable long-acting insulin formulation according to the invention has the following essential properties:
  • This suspension also has the property of having a low weight ratio polymer / insulin leading to limited additional cost of polymer.
  • the stable colloidal suspension forming the formulation comprises submicron structured nanoparticles, constituted by self assembly of a poly (Leu-block-Glu) copolymer. These nanoparticles are capable of: o spontaneously associating (adsorbing) with insulin, non-covalently, in a colloidal suspension, in the undissolved state and without denaturation, to form a nanoparticle / insulin complex, o and to release the insulin, in particular in vivo, in a prolonged and / or delayed manner
  • nanoparticles are stable in the aqueous phase even in the absence of surfactant (s)
  • the term "order" associated with a numerical value means that this value is given with a tolerance that can reach, for example, 20%
  • the ability to easily fill the syringe by aspiration of the formulation through small diameter needles is also a targeted characteristic through the lowering of the viscosity
  • This operation must, for example, be typically performed in a time ⁇ 120 s, preferably ⁇ 60 s and more preferably still ⁇ 30 s, for a volume of 500 ⁇ l
  • the viscosity is measured according to the procedure Mv described below:
  • the determination of the important parameter that the viscosity v can be carried out, for example, at 20 ° C. using an AR1000 rheometer (TA Instruments ) equipped with a cone-plane geometry (4 cm, 2 °). Viscosity v is measured for a shear rate of 10 s -1
  • the colloidal suspension of nanoparticles according to the invention results from a particular selection from those described generally in WO-A-01/37809. has been found after numerous attempts to optimize the conflicting requirements of the specifications mentioned above.
  • optimization of the stability of the suspension is effected by adjusting the pH of the suspension between 5.8 and 7.0, preferably between 6.0 and 7.0, and more preferably still at a value of the order of 6.5.
  • the stability in question is, on the one hand, a physicochemical stability of the colloidal suspension of poly (Leu-Bloc-Glu) nanoparticles and, on the other hand, a stability of the insulin active in terms of effectiveness therapeutic (glycemic control).
  • the formulation remains stable after storage for 2 years at 5 0 C, for example.
  • the nanoparticles have a small size and more precisely have a hydrodynamic diameter Dh, measured according to the procedure Md, such that (in nm) in increasing order of preference: 10 ⁇ Dh ⁇ 50 and 15 ⁇ Dh ⁇ 40.
  • Dh hydrodynamic diameter measured according to the procedure Md
  • poly (Leu-block-Glu) particle size is that the formulation according to the invention is easily filterable on a 0.2 ⁇ m sterilizing filter. pore size, which makes it easy and inexpensive to obtain a sterile injectable formulation.
  • the local tolerance of these particles is better than that of larger size, as demonstrated hereafter in the examples.
  • This suspension is stirred for 1 hour, then introduced into the diffusion cell of a Brookhaven type light scattering apparatus, operating with a laser beam of wavelength 488 nm and vertically polarized.
  • the hydrodynamic diameter is calculated from the autocorrelation function of the electric field by the cumulant method, as described in "Surfactant Science Series" volume 22, Surfactant Solutions, Ed. R. Zana, chap. 3, M. Dekker, 1984.
  • the poly (Leu-block-Glu) s selected in accordance with the invention have the following characteristic: the maximum loading rate Ta of the nanoparticles with insulin, expressed in% of associated insulin mass relative to the poly (Leu-block-Glu) mass and measured according to a procedure Ma, is such that:
  • aqueous insulin solutions Lyophilized human recombinant insulin is poured into a volume V of 0.01 N hydrochloric acid solution for a maximum of 15 minutes. This solution is then poured into the same volume V of 0.01 N NaOH solution. The pH is adjusted between 7.2 and 7.4 with a 1N sodium hydroxide solution. The solution is stirred gently for 30 min. The insulin mass and volume V are calculated according to the desired volume V of final solution in order to obtain insulin concentrations of 100 IU / ml, 120 IU / ml and 140 IU / ml. (b) Preparation of the insulin formulation.
  • the concentrated solution (concentration of approximately 75 g / l) of poly (Leu-block-Glu) is added to the insulin solutions at a rate of 11 mg / ml. These mixtures are degassed then placed in a tilting stirrer at 25 ° C. for 2 hours and then degassed again. The pH is adjusted between 7.2 and 7.4 with 1N HCl solution and the mixtures are stirred (tilting stirrer) overnight at room temperature.
  • the insulin associated with the nanoparticles in the suspension constituting the formulation of the invention is an unmodified insulin.
  • an unmodified insulin is a recombinant insulin or not, having undergone no transformation of its primary structure, nor any modification of the side groups of amino acids.
  • the suspension constituting the formulation of the invention comprises at least one preservative, preferably selected from the group comprising: phenols, cresols (eg meta-cresol), methyl parahydroxybenzoate, propyl, butyl, or any other preservative known to those skilled in the art (see, for example, the article by A. Gatlin, et al., Injectable Drug Development, PKGupta eds Interpharm Press, Denver Colorado, 1999), and their mixtures.
  • preservative preferably selected from the group comprising: phenols, cresols (eg meta-cresol), methyl parahydroxybenzoate, propyl, butyl, or any other preservative known to those skilled in the art (see, for example, the article by A. Gatlin, et al., Injectable Drug Development, PKGupta eds Interpharm Press, Denver Colorado, 1999), and their mixtures.
  • the process for the synthesis of poly (Leu-block-Glu) as well as the process for obtaining poly (Leu-block-Glu) nanoparticles in aqueous suspension is preferably carried out in accordance with the methods and recommendations described in FIG. WO-A-01/37809.
  • the present invention also relates to a solid - preferably powder -, characterized in that it comprises nanoparticles based on poly (Leu-block-Glu) loaded insulin and in that it is obtained from the liquid suspension which is defined above and which constitutes at least a part of the formulation of the invention. This obtaining is carried out by any known and appropriate means such as lyophilization, atomization or drying.
  • the process for preparing the long-acting liquid insulin injectable formulation involves poly (Leu-block-Glu) not loaded with insulin and consists essentially of
  • the viscosity ⁇ (in mPa s), measured according to a procedure Mv, is such that v ⁇ 15, preferably v ⁇ 10, and more preferably still v ⁇ 5,
  • the concentration (in mg / ml) of poly (Leu-block-Glu) is between 30 and 70, preferably between 38 and 65,
  • the Osm osmolarity adjustment (in mOsmol) of the formulation with at least one magnesium salt is carried out so that the concentration of CM g 2+ (in moles / L) is the next one
  • a first method consists essentially of bringing into contact an aqueous phase containing the insulin with the colloidal suspension of poly (Leu-block-Glu) nanoparticles,
  • a second method consists essentially in bringing together (by mixing) the poly (Leu-block-Glu) in the powdery state with an aqueous phase containing the insulin e g at a concentration between 100 and 200 IU / ml,
  • a third method consists essentially of mixing the insulin in powder form with an aqueous phase containing poly (Leu-block-Glu).
  • a suspension of nanoparticles at neutral pH and isotonic is reconstituted at a concentration of 60 mg / ml or more (depending on the desired concentration in the final suspension)
  • a concentrated insulin solution is reconstituted at a concentration of 60 mg / ml or more (depending on the desired concentration in the final suspension).
  • excipients may especially be at least one preservative, preferably selected from the group comprising: phenols, cresols (eg meta-cresol), methyl, propyl or butyl parahydroxybenzoates, or any other preservative known from the group consisting of: those skilled in the art (see, for example, the article by LA Gatlin et al., Injectable Drug Development, PKGupta eds Interpharm Press, Denver Colorado, 1999), and their mixtures.
  • preservative preferably selected from the group comprising: phenols, cresols (eg meta-cresol), methyl, propyl or butyl parahydroxybenzoates, or any other preservative known from the group consisting of: those skilled in the art (see, for example, the article by LA Gatlin et al., Injectable Drug Development, PKGupta eds Interpharm Press, Denver Colorado, 1999), and their mixtures.
  • liquid suspension can be converted into a powdery solid by any conventional method known to those skilled in the art, such as, for example, lyophilization, atomization or drying.
  • the invention also relates to a method for preparing an injectable formulation of protein (s) characterized in that it consists essentially - - on the one hand, in mixing at least one protein with an aqueous liquid medium optionally adding excipients, if necessary adjusting the pH to a value between 6.0 and 7.0; and on the other hand, adjusting the osmolarity of the formulation with at least one magnesium salt, such that: • 270 ⁇ Osm ⁇ 600,
  • the viscosity ⁇ (in mPa.s), measured according to a procedure Mv, such that: v ⁇ 15, preferably v ⁇ 10, and even more preferably v ⁇ 5;
  • the concentration (in mg / ml) of poly (Leu-block-Glu) is between 30 and 70, preferably between 38 and 65;
  • protein any polyamino acid, for example oligopeptide, polypeptide [e.g poly (Leu-block-Glu)], protein stricto sensu [e.g. insulin].
  • the invention relates to the pharmaceutical and veterinary applications of the poly (Leu-block-Glu) -insulin suspension.
  • the essential application is the treatment of diabetes, and more specifically of type I and II diabetes.
  • the subject of the invention is also a medicinal product characterized in that it comprises a formulation comprising a colloidal poly (Leu-block-Glu) -insulin suspension, this formulation being as defined above and / or formulation obtained by the process also described supra and / or pulverulent solid as defined above.
  • the medicinal product it concerns is comparable to a long-acting liquid injectable human insulin formulation capable of assuring the diabetic patient, after a subcutaneous injection, a basal concentration of insulin, during at least 24 hours, repeated injections.
  • the basal concentration of insulin should be understood in this paper as a typical blood concentration observed in the healthy individual, ie 30 picomoles / l.
  • the invention also relates to a method of treating diabetes, in particular type I and II diabetes, characterized in that it consists essentially in administering to the patient the aforementioned drug based on a formulation comprising a suspension stable aqueous colloidal poly (Leu-block-Glu) nanoparticles loaded with insulin, preferably unmodified.
  • It is preferably a daily administration by injection, preferably subcutaneous.
  • the medicament according to the invention may also be in the form of a pulverulent solid described above and, optionally, aqueous liquid for the preparation of the suspension.
  • the invention also covers a pharmaceutical presentation comprising, on the one hand, a powdery solid as defined above and, on the other hand, separately, aqueous liquid for the reconstitution, prior to administration, of the suspension constituting the formulation according to the invention.
  • the preparation of the suspension is made under laminar flow hood or sterile room. 159 g of poly (Leu-block-Glu) polymer in solution in water at 73.9 mg / g are successively introduced into a glass flask. Then 1.9 g of 30% NaCl and 0.1 g of 1 N NaOH are added successively to the solution in order to adjust the pH to 7.4 and the osmolarity to 300 mOsm / kg and to adjust the polymer concentration to 60. , 5 mg / ml. 1.2- preparation of an intermediate insulin solution at 590 IU / ml:
  • the solution is stirred for at least half an hour until a clear solution is obtained and then filtered through a 0.2 ⁇ m PVDF (polyfluorovinylidene) or PTFE (polytetrafluoroethylene) membrane.
  • PVDF polyfluorovinylidene
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • CompA formulation 1.4- preparation of a negative control comparative formulation (CompA formulation) comprising the colloidal suspension of long-acting insulin P of 1.1 supra:
  • Example 2 Preparation of a Negative Control Comparison Formulation (CompB Formulation) Comprising a Colloidal Suspension of Long-acting Insulin P of Example 1.1:
  • Formulation B is prepared in a manner similar to Example 1, the polymer concentration being adjusted to 60 mg / ml and Osm Posmolality to 507 mOsm / kg in Step 1.
  • Example 3 Preparation of a Formulation According to the Invention (Formulation C) Comprising a Colloidal Suspension of Long-acting Insulin P of Example 1.1
  • Formulation C is prepared in a manner similar to Example 1, the osmolality Osm being adjusted to 507 mOsm / kg in step 1 1, by adding a 32% MgCl 2 solution.
  • the preparation of the suspension is made under a laminar flow hood or in a sterile room In a glass flask 65.6 g of poly (Leu-block-Glu) polymer are introduced successively.
  • Formulation E is prepared in a manner similar to Example 1, the polymer concentration being adjusted to 64.7 mg / ml and Osm osmolality to 535 mOsm / kg in Step 1.
  • Example 6 Characteristics of compA, compB, C, compD, E long-acting insulin formulations according to the invention (see Table 1).
  • the viscosity measurements are carried out at 20 ° C. on an AR100O (TA Instruments) rheometer equipped with a cone-plane geometry (4 cm, 2 °). The viscosity is measured for a shear rate of 10 s -1 .
  • the magnesium chloride used according to the invention (formulations C, E) is particularly advantageous, because at similar osmolality, it allows a greater reduction in viscosity: 4 and 5 mPa.s respectively for the formulations C and E versus 10 and 15 mPa.s respectively for the compB and compD formulations.
  • Example 7 Filling time of the formulations compA, compB and C:
  • the filling time of an insulin syringe through a 30 gauge needle and 8 mm length is measured for the different formulations described in the previous examples.
  • the filling volume is 0.5 ml corresponding to 50 IU / ml.
  • Example 8 Injection time of the formulations compA, compB and C:
  • Insulin products are injected subcutaneously by means of insulin syringes, evening by means of insulin pen
  • the injection time of a dose of 50 IU for different formulations is measured for a constant force of 20 newtons
  • the pen used is a NOVOPEN in, using 3 ml cartridges and 31 G "thin wall" Becton Dickinson brand needles
  • the model used is an in vivo pig skin model, whose high sensitivity compared to human skin has been shown for the type of product studied. The local tolerances of the CompD and E formulations were compared in this model.
  • Formulation E according to the invention comprises:
  • a formulation of NaCl / MgCl 2 450 mosm is used as a negative reference in the study.
  • the different products were injected subcutaneously under calibrated conditions, under a volume of 0.50 ml, on the belly skin of 9 domestic pigs (Seghers hybrid: Landrace x Largewhite weighing 50 to 60 kg).
  • the clinical signs - erythema and edema and induration - were then evaluated during the three days following the injection.
  • the negative reference NaCl / MgCl 2 450 mosm
  • the CompD formulation caused a weak and transient local reaction. The reaction disappears in about 3 days.
  • Formulation E caused a local reaction of the same type and intensity as that observed for the CompD formulation.
  • the adjusted E formulation in magnesium chloride has a local tolerance equivalent to that of the CompD formulation adjusted sodium chloride. This local tolerance is perfectly adapted to the daily administration of the drug.
  • the CompA formulation includes:
  • Formulation C according to the invention comprises
  • CompA and C formulations were administered subcutaneously at a dose of 1 IU / kg in 12 and 16 beagle dogs respectively, fasting for 16 hours. Plasma glucose concentrations were then evaluated (Advia 1650, Bayer Diagnostics) over a 32-hour period after administration to determine the pharmacodynamic parameters Cmin, AUC0 -32 h and T50% A uc, presented in Table 4. Standard deviations are shown in parentheses in Table 4
  • AUC - 32h expressed as percentages of basal plasma glucose level, represents the area between the plasma glucose profile as a function of time and basal plasma glucose level, from 0 to 32 hours This parameter is calculated by the trapezoidal method
  • CompA and C formulations according to the invention make it possible to obtain similar pharmacodynamic parameters.
  • the formulation C according to the invention therefore has an efficiency identical to the CompA formulation, while having significantly improved filling and injection times. compared to CompA

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Abstract

L'invention concerne des formulations d'insuline longue action injectables, pour le traitement des diabètes de type I et II chez l'homme et l'animal. L'objectif essentiel de l'invention est de fournir une formulation d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale: qui permette un remplissage aisé d'une seringue au travers d'une aiguille de faible diamètre (par exemple de gauge 29G, 30G ou 31G) et/ou qui soit aisément injectable au travers d'une aiguille de faible diamètre (par exemple de gauge 29G, 30G ou 31G), sans nuire à l'efficacité thérapeutique de l'insuline. Pour atteindre cet objectif, l'invention a pour objet une formulation colloïdale, aqueuse et stable de nanoparticules d'au moins un poly(Leu-bloc-Glu), chargées en insuline, dans laquelle le pH est tel que : 6,0 = pH = 7,0 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un sel de magnésium en quantité telle que : l'osmolarité Osm (en mOsmol) est telle que: 270 = Osm = 600, la viscosité v (en mPa.s ), mesurée selon un mode opératoire Mv, est telle que: v = 15, de préférence v = 10, et plus préférentiellement encore v = 5; la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) est comprise entre 30 et 70, de préférence entre 38 et 65.

Description

FORMULATION COLLOÏDALE D'INSULINE LONGUE ACTION ET SA
PRÉPARATION
Le domaine de la présente invention est celui des médicaments à base d'insuline, en particulier des formulations injectables d'insuline, pour le traitement des diabètes de type I et II chez l'homme et l'animal.
La présente invention concerne, plus précisément, des formulations injectables d'insuline formées par des suspensions colloïdales d'insuline destinées à une administration parentérale journalière et capables de maintenir durant tout le nycthémère chez le patient ou l'animal diabétique, une concentration d'insuline plasmatique voisine de la concentration basale observée chez un sujet non diabétique. L'invention concerne, également, des procédés de préparation desdites suspensions colloïdales d'insuline.
Les diabétiques sont assujettis à un traitement très contraignant et imparfait, les obligeant à s'injecter de l'insuline plusieurs fois par jour. Outre les injections d'insuline à absorption rapide, destinées à corriger la montée de glycémie après ou au cours d'un repas, il est également nécessaire de maintenir l'insuline sérique au niveau basai jour et nuit afin d'éviter des effets secondaires très néfastes. Cette dernière correction est particulièrement délicate car la nuit, les patients n'ont pas l'opportunité de se traiter et ainsi de rétablir le niveau souhaitable d'insuline.
Les formulations injectables d'insuline doivent être stables, à savoir que l'insuline qu'elles contiennent ne doit pas se dégrader au stockage. Cette insuline se doit par exemple d'être toujours pleinement efficace au terme d'un stockage de 2 ans à 5°C. Les formulations injectables d'insuline doivent avoir une rhéologie adaptée aux systèmes d'injection couramment utilisés pour l'insuline. Il existe donc un besoin aigu d'une formulation d'insuline longue action injectable au travers de très fines aiguilles et stable. Le problème de la mise au point d'une telle formulation est connu depuis longtemps et a fait l'objet de nombreux travaux. Au sens du présent exposé, "insuline" désigne aussi bien l'insuline humaine ou une insuline animale ou encore un analogue de l'insuline.
Au sens du présent exposé, une « formulation d'insuline longue action » est une formulation permettant, d'une part, d'éviter, après administration, tout pic d'hypoglycémie néfaste pour le patient et, d'autre part, de maintenir une action hypoglycémiante sur 24 heures au moins. ART ANTERIEUR
II est fait ci-après état d'un certain nombre de propositions techniques antérieures pour des formulations d'insuline longue action.
Ainsi, on connaît par exemple l'insuline humaine longue action NPH. Il s'agit de suspensions partiellement micro-cristallisées de complexes insuline humaine / zinc / protamine (comme décrites par exemple dans US-B-5, 834,422), qui permettent de ralentir la libération in vivo de la protéine. Dans ces suspensions, l'insuline est complexée à la protamine et au zinc pour former un précipité partiellement cristallisé. Après injection sous-cutanée, la vitesse de libération de l'insuline est contrôlée par la cinétique de dissolution in vivo de ce précipité et la cinétique de décomplexation de l'insuline. La durée d'action de ce type d'insuline, bien que prolongée par rapport à celle d'une insuline rapide, ne dépasse pas 16 heures et ne couvre donc pas réellement le nycthémère. Par ailleurs, on observe un pic d'hypoglycémie, après administration de cette insuline humaine longue action NPH. Cette dernière n'est donc pas une véritable insuline longue action telle que définie ci-dessus.
Récemment, le brevet US-B-5, 656,722 décrit une nouvelle structure de protéine analogue à l'insuline dénommée GLARGINE® incluse dans une formulation.
Une voie totalement différente pour obtenir une forme à libération prolongée de protéine est divulguée dans le brevet US-B- 5 904 936 (EP-B-O 734 720). La technique proposée ne consiste ni à modifier chimiquement l'insuline, ni encore à complexer l'insuline avec la protamine et le zinc. Il s'agit plutôt d'adsorber l'insuline humaine sur des nanoparticules biocompatibles formées spontanément, par auto- assemblage dans l'eau de polyaminoacides amphiphiles tels que le poly(L-leucine-b- glutamate de sodium) -ci-après dénommé poly(Leu-bloc-Glu). Cet auto-assemblage conduit à une suspension colloïdale de nanoparticules. L'insuline humaine, lorsqu'elle est mise en présence d'une telle suspension colloïdale, s'adsorbe spontanément sur les particules pour former un complexe non covalent insuline/particule. Après injection sous-cutanée, l'insuline humaine se dissocie progressivement du complexe ce qui permet de maintenir sa concentration plasmatique à une valeur voisine de sa valeur basale pendant une durée prolongée. L'avantage de cette approche est de mettre en œuvre dans un procédé non dénaturant, de l'insuline humaine non modifiée et un polymère biocompatible, sans faire appel à des tensioactifs potentiellement dénaturants. II est précisé dans l'exemple 14 du brevet US-B- 5 904 936 que l'insuline humaine s'associe spontanément à des nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu) jusqu'à un taux maximal de 0,65 mg d'insuline humaine pour 10 mg de poly(Leu-bloc-Glu) soit 6,5 % massique Cette formulation d'insuline longue action injectable selon l'exemple 14 du brevet US-B- 5 904 936 est perfectible s'agissant des points suivants - La formulation pourrait gagner en facilité d'injection, en particulier avec des seringues à aiguilles fines 29G, 30G ou 3 IG, qui améliorent nettement le confort du patient sachant que celui-ci est soumis à une injection quotidienne sur plusieurs dizaines d'années
La formulation pourrait gagner en stabilité pour retarder encore la dégradation de l'insuline - L'injection sous-cutanée de cette formulation chez le porc peut parfois conduire à la formation d'érythèmes et d'oedèmes marqués, traduisant une tolérance locale susceptible d'être améliorée, ce qui rend cette formulation difficilement compatible avec une application pharmaceutique journalière sur une très longue durée
La formulation est difficilement stérilisable par filtration
Dans son exemple 9, la demande WO-A-01/37809 décrit une formulation d'insuline longue action injectable, dont le pH est de 7,4 et qui comprend une suspension de nanoparticules de polymère poly(Leu-bloc-Glu) Cette suspension comprend (par ml de préparation) 80 UI d'insuline et 56 mg de polymère, soit un rapport massique insuline/poly(Leu-bloc-Glu) de 5% Administrée chez le chien Beagle à raison de 2 Ul/kg, cette suspension donne lieu à une libération prolongée sur 24 heures environ Cependant, cette formulation présente une stabilité perfectible comme démontrée dans l'exemple 5 infra de la présente demande
Forte de cette expérience, la demanderesse a redéfini un cahier des charges pour une formulation d'insuline humaine longue action injectable
1 La formulation gagnerait à être plus aisément injectable au travers d'une aiguille de petit diamètre (e g 29G, 30G ou 31G), afin d'améliorer le confort du patient, et ainsi l'observance du traitement
2 La formulation d'insuline est perfectible s'agissant de sa stabilité notamment à 4°C et à température ambiante, pour ne pas provoquer des modifications des propriétés de la formulation ni des dégradations de l'insuline humaine
3 la formulation serait grandement améliorée si elle était dotée d'une excellente tolérance locale, afin d'être compatible avec une injection journalière sur une durée de plusieurs dizaines d'années 4. La biodisponibilité de l'insuline fournie par une telle formulation gagnerait à être aussi élevée que possible.
5. L'efficacité de la formulation, mesurée, par exemple, par son effet hypoglycémiant, gagnerait à être la plus élevée possible pendant au moins 24 heures, après l'injection.
6. La formulation gagnerait à avoir une rhéologie permettant un remplissage aisé de la seringue par le patient.
7. L'aptitude à la stérilisation par filtration serait un atout déterminant pour la formulation.
La demande de brevet français N° 04 51578 du 19.07.2004 décrit une suspension colloïdale injectable d'insuline longue action. Cette suspension vise à satisfaire le cahier des charges susvisé. Elle comprend des nanoparticules d'au moins un poly(Leu- bloc-Glu), chargées en insuline. Son pH est compris entre 5,8 et 7,0 (e.g. 6,3-6,5). Son osmolarité O (en mOsmol) est telle que: 270 < O < 800 (e.g. circa 300). Cette osmolarité est ajustée par ajout d'au moins un sel, par exemple de NaCl ou de MgCl2-Sa viscosité v (en mPa.s) est telle que v < 40 (e.g. ≈ 25). Les nanoparticules du poly(Leu- bloc-Glu) ont un diamètre hydrodynamique moyen Dh tel que : 15 < Dh < 40. La concentration en poly(Leu-bloc-Glu) est comprise entre 30-55 g/1 (e.g. 42). Le rapport Insuline/ poly(Leu-bloc-Glu) est compris entre 5 et 11. Le taux maximal de chargement Ta des nanoparticules avec l'insuline, exprimé en % de masse d'insuline associée par rapport à la masse de poly(Leu-bloc-Glu) et mesuré selon un mode opératoire Ma, est tel que : 12 < Ta < 25.
Cette suspension colloïdale injectable d'insuline longue action est dotée de très bonnes performances pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. Cependant, il est apparu que cette suspension est perfectible en termes de viscosité. En effet pour une administration au moins une fois par jour la vie durant, il est hautement souhaitable de faire en sorte que cette suspension soit la plus fluide possible, idéalement comme l'eau. Cette exigence vaut aussi bien au regard de la facilité de remplissage de la seringue équipée d'une fine aiguille (pompage/aspiration), qu'au regard de la facilité d'injection (expulsion de la suspension).
La diminution de viscosité escomptée ne doit pas se faire au détriment des performances pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de la suspension. Or, les inventeurs ont mis en évidence que la solution simple qui consisterait à réduire la concentration en poly(Leu-bloc-Glu) pour diminuer la viscosité de la suspension est nuisible aux performances pharmacocinétiques et pharmacodynamiques.
EXPOSE SUCCINCT DE L'INVENTION
Confrontés à ce problème technique, les inventeurs se sont donc fixés pour objectif essentiel d'y apporter une solution convenable.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir des formulations d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale: • qui permette un remplissage aisé d'une seringue au travers d'une aiguille de faible diamètre (par exemple de gauge 29G, 3OG ou 3 IG)
• et/ou qui soit aisément injectable au travers d'une aiguille de faible diamètre (par exemple de gauge 29G, 3OG ou 3 IG), sans nuire à l'efficacité thérapeutique de l'insuline. Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir une formulation d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale comprenant des nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu) et qui soit filtrable sur des filtres de 0,2 μm à des fins de stérilisation.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de perfectionner la suspension divulguée dans la demande de brevet français N° 04 51578 du 19.07.2004.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de satisfaire pleinement le cahier des charges sus-décrit.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une formulation d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale, qui maintienne un effet hypoglycémiant important s'étendant sur 24 heures au moins, après une seule administration, par exemple par voie sous-cutanée.
Un autre objectif essentiel est de fournir une formulation d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale, qui soit stable et qui n'induise pas de modification de la structure et de la bioactivité de l'insuline. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir des formulations d'insuline longue action sous forme de suspensions colloïdales injectables à faible volume d'injection et concentration élevée en insuline humaine, typiquement 100 IU/ml, et ce sans nuire à l'efficacité thérapeutique et en particulier à la durée de l'effet hypoglycémiant. Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir une formulation d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale, présentant une bonne tolérance locale et une sécurité d'emploi compatibles avec le traitement chronique des diabétiques.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une formulation d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale, dans laquelle l'insuline est une insuline humaine non modifiée.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir une formulation d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale comprenant des nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu) sur lesquelles les protéines sont adsorbées de façon réversible, non covalente et sans dénaturation. Un autre objectif essentiel de l'invention est de proposer un procédé de préparation de ces suspensions colloïdales d'insuline longue action, ledit procédé se devant d'être, simple à mettre en œuvre, non dénaturant pour la protéine et devant en outre toujours assurer de façon fiable la reproductibilité des caractéristiques de la formulation.
Les objectifs ci-dessus, parmi d'autres, sont atteints par la présente invention qui concerne, tout d'abord, une formulation injectable d'insuline longue action comprenant une suspension colloïdale, aqueuse et stable de nanoparticules à base d'au moins un polymère séquence de L-Leucine et de L-Glutamate de sodium, ou poly(L-leucine-b-L- glutamate de sodium) -ci-après dénommé poly(Leu-bloc-Glu)-, ces nanoparticules étant chargées en insuline, le pH de cette suspension étant tel que: 6,0 < pH < 7,0; caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un sel de magnésium en quantité telle que :
• l'osmolarité Osm (en mOsmol) est telle que: 270 < Osm < 600,
• la viscosité v (en mPa.s ), mesurée selon un mode opératoire Mv, est telle que: v < 15.
• la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) est comprise entre 30 et 70, de préférence entre 38 et 65.
De préférence, la viscosité v (en mPa.s), mesurée selon un mode opératoire Mv, est telle que: v < 10, et plus préférentiellement encore v < 5.
Le fondement inventif de cette nouvelle suspension colloïdale apte à constituer une formulation galénique injectable d'insuline longue action, réside, notamment, dans la combinaison des sélections suivantes: - fenêtre d'osmolarité assurant notamment une bonne tolérance locale pour la formulation; - fenêtre de viscosité avec un plafond à 15 mPa.s, de préférence à 10 mPa.s, et plus préférentiellement encore à 5 mPa.s, qui participe à l'instauration dans la formulation de propriétés rhéologiques telles qu'il est possible de remplir aisément une seringue en aspirant la formulation au travers d'une aiguille de faible diamètre (par exemple de gauge 29G, 30G ou 31G) et d'injecter aisément au travers de ces mêmes aiguilles;
- nature (Mg2+) et quantité de l'électrolyte utilisé pour ajuster l'osmolarité.
Ces avancées sont obtenues sans grever le coût de revient de cette nouvelle formulation.
Avantageusement, la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) de la formulation, est comprise entre 30 et 70, de préférence 38 et 65. Cette fenêtre de concentration en poly(Leu-bloc-Glu) permet de préserver les performances pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de la suspension;
De préférence, le contre-anion du Mg2+ est choisi dans le groupe comprenant Cl", SO4 " " et leurs mélanges.
Par ailleurs, la formulation selon l'invention possède de préférence au moins l'une (idéalement toutes) des caractéristiques suivantes : les particules du poly(Leu-bloc-Glu) retenu ont un diamètre hydrodynamique moyen Dh exprimé en nanomètres (nm) et mesuré selon un mode opératoire Md, tel que :
10 < Dh < 50 de préférence, 15 < Dh < 40 ; - le rapport massique insuline/poly(Leu-bloc-Glu), exprimé en %, est tel que :
6 < insuline/poly(Leu-bloc-Glu) < 10, de préférence 3 < insuline/poly(Leu-bloc-Glu) < 5; la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) est comprise entre 30 et 70, de préférence 38 et 65; - le taux maximal de chargement Ta des nanoparticules avec l'insuline, exprimé en % de masse d'insuline associée par rapport à la masse de poly(Leu-bloc-Glu) et mesuré selon un mode opératoire Ma, est tel que :
10 < Ta de préférence, 10 < Ta < 40 et, plus préférentiellement encore, 12 < Ta < 25 l'insuline est une insuline humaine non modifiée Finalement, la formulation injectable d'insuline longue action selon l'invention est dotée des propriétés essentielles suivantes:
* une viscosité suffisamment faible pour avoir une bonne aptitude au remplissage d'une seringue par aspiration au travers d'une aiguille de faible diamètre et une
"injectabilité" aisée au travers d'une aiguille de faible diamètre, ce qui améliore considérablement le confort du patient et accroît donc l'observance du traitement; et ce en combinaison avec de bonnes performances pharmacocinétiques et pharmacodynamiques, en particulier une activité hypoglycémiante étendue sur
24 heures après administration chez l'homme d'une dose standard de 0,6 UI/kg;
* une excellente stabilité;
4 une bonne tolérance locale;
Φ une aptitude à la fïltration par stérilisation sur un filtre de 0,2 micron, grâce à la petite taille des particules.
Cette suspension présente en outre la propriété de présenter un faible rapport massique polymère/insuline conduisant à un surcoût limité en polymère.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La sélection des paramètres sus définis pour obtenir une suspension colloïdale d'insuline adaptée en tant que formulation médicamenteuse injectable d'insuline longue action, est le fruit d'importantes et longues recherches sur la mesure et la comparaison des activités pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de ces formulations d'insuline sur divers modèles animaux ainsi que de nombreux travaux sur la viscosité (caractère injectable et aptitude à être aspirée au travers d'une aiguille), la stabilité, la tolérance et la bio compatibilité de cette suspension particulière.
La suspension colloïdale stable formant la formulation comporte des nanoparticules structurées submicroniques, constituées par auto assemblage d'un copolymère poly(Leu-bloc-Glu). Ces nanoparticules sont aptes : o à s'associer (adsorber) spontanément à l'insuline, de façon non covalente, en suspension colloïdale, à l'état non dissous et sans dénaturation, pour former un complexe nanoparticule/insuline, o et à libérer l'insuline, notamment in vivo, de manière prolongée et/ou retardée
Enfin, ces nanoparticules sont stables en phase aqueuse même en l'absence de tensioactif(s)
II est du mérite de la Demanderesse d'avoir montré que l'on peut réduire la viscosité de la suspension et donc la force nécessaire pour injecter la suspension colloïdale au travers d'une aiguille de faible diamètre, en jouant notamment sur le choix du cation qui permet d'ajuster l'osmolarité Osm et sur la concentration CMg2+ de ce cation Un autre mérite des inventeurs est d'avoir abaissé la viscosité en ajustant l'osmolarité Osm (en mOsm) de la suspension à une valeur supérieure à 270 et inférieure ou égale à 600, par ajout d'au moins un sel, et plus spécialement d'un ou plusieurs sels monovalents et/ou multivalents (e g divalents ou trivalents) de magnésium Ainsi, compris entre 0,06 et 0,125 mole/L (de préférence de l'ordre de 0,08 +/- 0,01 mole/L) permet d'optimiser le compromis entre la durée d'action et le caractère injectable de la suspension
Au sens du présent exposé, le terme "de l'ordre" associée à une valeur numérique signifie que cette valeur est donnée avec une tolérance qui peut atteindre, par exemple, 20 %
Cette viscosité réduite et donc cette aptitude remarquable de la formulation de l'invention à être facilement injectable au travers d'une aiguille de petit diamètre (par exemple gauge 29G, 30G et 3 IG ou diamètre 0,15 à 0,4 mm, longueur 8 à 20 mm) est appréciée notamment au travers de la force à exercer sur le piston de la seringue II est par exemple souhaitable que cette force n'excède pas une valeur raisonnable, e g de l'ordre de 40 newtons, de préférence de l'ordre de 30 Newtons, et que le débit ne soit pas inférieur ou égal à 1 ml/min
La possibilité de remplir aisément la seringue par aspiration de la formulation au travers d'aiguilles de petit diamètre (par exemple gauge 29G, 30G et 3 IG ou diamètre 0,15 à 0,4 mm, longueur 8 à 20 mm) est également une caractéristique visée au travers de l'abaissement de la viscosité Cette opération doit, par exemple, être typiquement réalisée dans un temps < 120 s, de préférence < 60 s et plus préférentiellement encore < 30 s, pour un volume de 500 μl La viscosité est mesurée selon le mode opératoire Mv décrit ci-après :
Mode Opératoire Mv
Conformément à la présente invention, la détermination du paramètre important qu'est la viscosité v (en mPa.s à 2O0C) peut être réalisée, par exemple, à 2O0C à l'aide d'un rhéomètre AR1000 (TA Instruments) équipé d'une géométrie cône-plan (4 cm, 2°). La viscosité v est mesurée pour un gradient de cisaillement de 10 s"1. La suspension colloïdale de nanoparticules selon l'invention résulte d'une sélection particulière parmi celles décrites de manière générale dans le WO-A-01/37809. Cette sélection particulière a été trouvée après de nombreux essais visant à optimiser les exigences contradictoires du cahier des charges mentionné supra.
L'optimisation de la stabilité de la suspension passe par un ajustement du pH de la suspension entre 5,8 et 7,0, de préférence entre 6,0 et 7,0 et, plus préférentiellement encore à une valeur de l'ordre de 6,5. La stabilité dont il est question est, d'une part, une stabilité physicochimique de la suspension colloïdale de nanoparticules de poly(Leu- Bloc-Glu) et, d'autre part, une stabilité de l'actif insulinique en termes d'efficacité thérapeutique (contrôle de la glycémie). Avantageusement, la formulation reste stable après un stockage de 2 ans à 5 0C, par exemple.
Conformément à l'invention, les nanoparticules ont une petite taille et présentent plus précisément un diamètre hydrodynamique Dh, mesuré selon le mode opératoire Md, tel que (en nm) dans l'ordre croissant de préférence : 10 < Dh < 50 et 15 < Dh < 40. L'une des incidences parmi d'autres de ces choix de taille de particules de poly(Leu- bloc-Glu) est que la formulation selon l'invention est aisément filtrable sur un filtre stérilisant de 0,2 μm de taille de pores, ce qui permet d'obtenir, aisément et à moindre coût, une formulation injectable stérile. Par ailleurs, il apparaît que de façon surprenante, la tolérance locale de ces particules est meilleure que celle de plus grande taille, comme démontré ci-après dans les exemples.
Mode opératoire Md :
La solution de poly(Leu-bloc-Glu), d'une concentration d'environ 75 g/L, est diluée à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,15 M, de façon à obtenir au final une concentration en poly(Leu-bloc-Glu) comprise entre 0,5 et 4 g/L et, de préférence, égale à 2 g/L. Cette suspension est agitée 1 heure, puis introduite dans la cellule de diffusion d'un appareil de diffusion de la lumière, de type Brookhaven, fonctionnant avec un faisceau laser de longueur d'onde 488 nm et polarisé verticalement. Le diamètre hydrodynamique est calculé à partir de la fonction d'autocorrélation du champ électrique par le méthode des cumulants, comme décrit dans l'ouvrage « Surfactant Science Séries » volume 22, Surfactant Solutions, Ed. R. Zana, chap. 3, M. Dekker, 1984.
Suivant une autre caractéristique préférée, les poly(Leu-bloc-Glu)s sélectionnés conformément à l'invention, présentent la caractéristique suivante : le taux maximal de chargement Ta des nanoparticules avec l'insuline, exprimé en % de masse d'insuline associée par rapport à la masse poly(Leu-bloc-Glu) et mesuré selon un mode opératoire Ma, est tel que :
10 < Ta de préférence, 10 < Ta < 40 et, plus préférentiellement encore, 12 < Ta < 25.
Mode opératoire Ma :
(a) Préparation de solutions aqueuses d'insuline: de l'insuline recombinante humaine lyophilisée est versée dans un volume V de solution d'acide chlorhydrique 0,01 N durant au maximum 15 min. Cette solution est ensuite versée dans un même volume V de solution NaOH 0.01 N. Le pH est ajusté entre 7,2 et 7,4 avec une solution de soude 1 N. La solution est agitée doucement pendant 30 min. La masse d'insuline et le volume V sont calculés en fonction du volume V souhaité de solution finale afin d'obtenir des concentrations en insuline de 100 Ul/ml, 120 Ul/ml et 140 Ul/ml. (b) Préparation de la formulation d'insuline. La solution concentrée (concentration d'environ 75 g/1 ) de poly(Leu-bloc-Glu) est ajoutée aux solutions d'insuline à raison de 1 1 mg/ml. Ces mélanges sont dégazés puis placés dans un agitateur à basculement à 250C pendant 2 heures puis dégazés de nouveau. Le pH est ajusté entre 7,2 et 7,4 avec une solution HCl IN et les mélanges sont agités (agitateur à basculement) pendant une nuit à température ambiante.
(c) Dosage de l'insuline libre : les formulations sont injectées sur une colonne de chromatographie liquide d'exclusion stérique dans des conditions non dissociantes et l'insuline libre est dosée par fiuorimétrie.
Suivant une variante avantageuse, l'insuline associée aux nanoparticules dans la suspension constituant la formulation de l'invention est une insuline non modifiée. Au sens de l'invention, une insuline non modifiée est une insuline recombinante ou non, n'ayant subi aucune transformation de sa structure primaire, ni aucune modification des groupements latéraux des acides aminés.
Avantageusement, la suspension constituant la formulation de l'invention comprend au moins un conservateur, de préférence sélectionné dans le groupe comprenant : les phénols, les crésols (e.g méta-crésol), le parahydroxybenzoate de méthyle, de propyle, de butyle, ou tout autre conservateur connu de l'homme de l'art (consulter par exemple l'article de L A. Gatlin et al. in Injectable Drug Development, P.K.Gupta eds Interpharm Press, Denver Colorado, 1999), et leurs mélanges.
Le procédé de synthèse du poly(Leu-bloc-Glu) ainsi que le procédé d'obtention des nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu) en suspension aqueuse s'effectuent, de préférence, selon les modalités et les recommandations décrites dans le WO-A- 01/37809.
Au lieu d'être en suspension stable en milieu liquide aqueux, les nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu) chargées en insuline pourraient également exister dans un état solide stable, de préférence sous forme pulvérulente. Ainsi, la présente invention concerne également un solide -de préférence pulvérulent-, caractérisé en ce qu'il comprend des nanoparticules à base de poly(Leu-bloc-Glu) chargées en insuline et en ce qu'il est obtenu à partir de la suspension liquide qui est définie ci-dessus et qui constitue au moins une partie de la formulation de l'invention. Cette obtention est effectuée par tout moyen connu et approprié tel que la lyophilisation, l'atomisation ou le séchage.
Le procédé de préparation de la formulation liquide injectable d'insuline longue action fait intervenir du poly(Leu-bloc-Glu) non chargé en insuline et consiste essentiellement
- d'une part, i. à mélanger, en milieu liquide aqueux, au moins un poly(Leu-bloc-Glu) et de l'insuline, de préférence sous agitation, ii. et à ajouter éventuellement des excipients, au besoin à ajuster le pH à une valeur comprise entre 6,0 et 7,0;
- d'autre part, à ajuster l'osmolarité Osm (en mOsmol) de la formulation à l'aide d'au moins un sel de magnésium, de telle sorte que:
• 270 < Osm < 600; • la viscosité v (en mPa s ), mesurée selon un mode opératoire Mv, soit telle que v < 15, de préférence v < 10, et plus préférentiellement encore v <5,
• la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) soit comprise entre 30 et 70, de préférence entre 38 et 65,
- et, éventuellement à filtrer la suspension ainsi obtenue
De préférence, l'ajustement de l'osmolarité Osm (en mOsmol) de la formulation à l'aide d'au moins un sel de magnésium est effectué de telle sorte que la concentration en CMg2+ (en mole/L) soit la suivante
0,06 < CMg2+ ≤ 0, 125, de préférence de l'ordre de 0,08 +/- 0,01
Avantageusement, l'association de l'insuline aux nanoparticules lors de l'étape (i) est effectuée par mise en œuvre d'au moins l'une des méthodes suivantes - Une première méthode consiste essentiellement à mettre en présence une phase aqueuse contenant l'insuline avec la suspension colloïdale de nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu),
- Une deuxième méthode consiste essentiellement à mettre en présence (en les mélangeant) le poly(Leu-bloc-Glu) à l'état pulvérulent avec une phase aqueuse contenant l'insuline e g à une concentration entre 100 et 200 Ul/ml,
Une troisième méthode consiste essentiellement à mélanger l'insuline à l'état pulvérulent avec une phase aqueuse contenant le poly(Leu-bloc-Glu)
Plus précisément, dans la première méthode, une suspension de nanoparticules à pH neutre et isotonique est reconstituée à une concentration de 60 mg/ml ou plus (selon la concentration voulue dans la suspension finale) Une solution d'insuline concentrée
(typiquement entre 500 et 600 Ul/ml - pH compris entre 7 et 8 - isotonique) est alors préparée extemporanément à partir de poudre d'insuline (dissolution en milieu acide puis neutralisation) Les deux solutions sont mélangées par agitation pendant quelques minutes et cette phase est éventuellement suivie d'une phase de « maturation » de quelques heures Le pH est ensuite ajusté à une valeur comprise entre 6,0 et 7,0
II importe de veiller au respect d'au moins l'une des caractéristiques essentielles de l'invention, à savoir l'établissement d'un pH compris entre 6,0 et 7,0 Ce facteur participe de façon importante à la stabilité de la suspension de nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu). L'ajustement du pH peut s'effectuer par tout moyen connu et approprié, à savoir notamment par acidification, par exemple, de la façon suivante : -1- ajout d'acide chlorhydrique 0, IN dans la suspension chargée d'insuline (il se produit alors une précipitation intermédiaire qui disparaît au bout d'une heure d'agitation environ)
-2- ajout d'acide acétique 0,1N dans la suspension chargée d'insuline (pas de précipitation intermédiaire) L'ajout -2- d'acide acétique est préféré.
Lors de la préparation de la formulation selon l'invention, on peut éventuellement ajouter des excipients, et au besoin réajuster le pH à une valeur comprise entre 5,8 et 7,0, et, éventuellement stériliser la suspension ainsi obtenue par filtration sur des pores de 0,2 microns.
Ces autres excipients peuvent être notamment au moins un conservateur, de préférence sélectionné dans le groupe comprenant : les phénols, les crésols (e.g méta-crésol), les parahydroxybenzoates de méthyle, de propyle, ou de butyle, ou tout autre conservateur connu de l'homme de l'art (consulter par exemple l'article de L. A. Gatlin et al. in Injectable Drug Development, P.K.Gupta eds Interpharm Press, Denver Colorado, 1999), et leurs mélanges.
Les conditions de mélange aussi bien pour la régulation du pH que pour l'addition d'excipients, sont classiques et à la portée de l'homme du métier notamment en termes de température, pression et agitation.
Finalement, la suspension liquide peut être transformée en un solide pulvérulent par toute méthode classique connue de l'homme de l'art, telle que par exemple la lyophilisation, l'atomisation ou le séchage.
De manière plus générale, l'invention vise également un procédé de préparation d'une formulation injectable de protéine(s) caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement - - d'une part, à mélanger au moins une protéine à un milieu liquide aqueux, à ajouter éventuellement des excipients, au besoin à ajuster le pH à une valeur comprise entre 6,0 et 7,0; - - et d'autre part, à ajuster l'osmolarité de la formulation à l'aide d'au moins un sel de magnésium, de telle sorte que: • 270 < Osm < 600,
• la viscosité v (en mPa.s ), mesurée selon un mode opératoire Mv, soit telle que: v < 15, de préférence v < 10, et plus préférentiellement encore v < 5;
• la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) soit comprise entre 30 et 70, de préférence entre 38 et 65;
- - et, éventuellement à filtrer le mélange ainsi obtenu.
Par "protéine", on désigne tout polyamino-acide, par exemple oligopeptide, polypeptide [e.g poly(Leu-bloc-Glu)], protéine stricto sensu [e.g. insuline].
Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne les applications pharmaceutiques et vétérinaires de la suspension poly(Leu-bloc-Glu)-insuline. L'application essentielle est le traitement du diabète, et plus précisément du diabète de type I et II.
Ainsi, l'invention a également pour objet un médicament caractérisé en ce qu'il comprend de la formulation comprenant une suspension colloïdale poly(Leu-bloc-Glu)- insuline, cette formulation étant telle que définie ci-dessus et/ou de la formulation obtenue par le procédé lui aussi décrit supra et/ou du solide pulvérulent tel défini ci- dessus.
Il s'agit de préférence d'un médicament destiné au traitement du diabète et plus précisément du diabète de type I et II. Suivant une disposition avantageuse de l'invention, le médicament qu'elle concerne est assimilable à une formulation liquide injectable d'insuline humaine longue action susceptible d'assurer au patient diabétique, après une injection sous-cutanée, une concentration basale en insuline, pendant au moins 24 heures, en régime d'injections répétées.
La concentration basale d'insuline doit s'entendre dans le présent exposé comme une concentration typique dans le sang observée chez l'individu sain, soit 30 picomoles/1.
L'invention concerne en outre une méthode de traitement du diabète, en particulier du diabète de type I et II, caractérisée en ce qu'elle consiste essentiellement à administrer au patient le médicament susvisé à base d'une formulation comprenant une suspension colloïdale aqueuse stable de nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu) chargées en insuline, de préférence non modifiée.
Il s'agit préférentiellement d'une administration journalière par injection, de préférence sous-cutanée.
Le médicament selon l'invention peut également se présenter sous la forme d'un solide pulvérulent décrit ci-avant et, éventuellement du liquide aqueux pour la préparation de la suspension. II en résulte que l'invention couvre également une présentation galénique comprenant, d'une part, du solide pulvérulent tel que défini supra et, d'autre part, de manière séparée, du liquide aqueux pour la reconstitution, avant l'administration, de la suspension constituant la formulation selon l'invention.
Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention dans ses différents aspects produit/procédé/application. Ces exemples illustrent la préparation de la formulation selon l'invention à base de suspension de nanoparticules de poly(Leu- bloc-Glu) chargées en insuline, de même qu'ils présentent les caractéristiques de structure et les propriétés de cette formulation, en la comparant avec des formulations poly(Leu-bloc-Glu)-insuline selon l'art antérieur.
EXEMPLES
Exemple 1 - Préparation d'une suspension d'insuline longue action :
1.1- préparation d'une suspension colloïdale de nanoparticules de poly(L leucine bloc L glutamate de sodium) (P) intermédiaire concentrée à 60 mg/g :
La préparation de la suspension est faite sous hotte à flux laminaire ou en pièce stérile. Dans un flacon de verre on introduit successivement 159 g de polymère poly(Leu-bloc- Glu) en solution dans l'eau à 73,9 mg/g. On ajoute ensuite successivement 1,9 g de NaCl 30% et 0, 1 g de NaOH IN sont ajoutés à la solution pour ajuster le pH à 7,4 et l'osmolarité à 300 mOsm/kg et régler la concentration en polymère à 60,5 mg/ml. 1.2- préparation d'une solution d'insuline intermédiaire à 590 Ul/ml :
7 g d'insuline humaine recombinante (poudre) d'activité 27,5 Ul/g et contenant 3,8% d'humidité sont introduits dans un flacon en verre, 149,5 g d'eau pour injection sont rajoutés et l'insuline est dispersée sous agitation magnétique lente. 51,20 g d'HCl 0, 1N sont ajoutés jusqu'à obtention d'une solution limpide d'insuline acide. 7,7 g de soude O,1N sont alors ajoutés de façon à obtenir une solution finale ayant un pH compris entre
7.2 et 7,6. 9,4 g de NaCl 30% sont ajoutés pour ajuster l'osmolarité. La solution est alors diluée par ajout de NaCl 0.9% (15,1g) afin d'atteindre une concentration finale en Insuline de 590 Ul/ml La solution est filtrée sur membrane polyéthersulfone 0,2μm avant mélange avec la suspension de nanoparticules.
1.3 - préparation d'une solution d'excipients (phénol 140 m M ; m-crésol 140 m M, acide acétique 0,1N) : Dans un flacon de 1 1 on rajoute successivement :
- 13,2 g de phénol (M=94 g/mol)
- 100 g d'eau
15,1 g de m-crésol (M=I 08 g/mol)
100 g d'acide acétique IN - 771,7 g d'eau.
La solution est agitée au moins une demi-heure jusqu'à obtention d'une solution limpide puis filtrée sur membrane 0,2 μm PVDF (polyfluorovinylidène)ou PTFE (polytétrafluoroéthylène) .
1.4- préparation d'une formulation comparative témoin négatif (Formulation compA) comprenant la suspension colloïdale d'insuline longue action P de 1.1 supra:
(Osmolarité Osm = 300 mOsm; pH=6,5; Concentration en poly(Leu-bloc-Glu) Cpol = 42 mg/ml; Concentration en insuline C insuline = 3,5 mg/ml) 800 g de suspension P sont introduits dans un flacon de 1 litre.
Sous agitation magnétique lente, 196 g de solution à 590 Ul/ml d'insuline sont rajoutés. L'agitation est maintenue pendant 15 heures à 25°C. 171 g de solution d'excipients sont alors rajoutés au mélange et la solution est laissée à agiter pendant 1 heure. La formulation ainsi obtenue est filtrée sur membrane polyéthersulfone 0,2 μm. Exemple 2 - Préparation d'une formulation comparative témoin négatif (Formulation compB) comprenant une suspension colloïdale d'insuline longue action P de l'exemple 1.1 :
(Osmolarité Osm = 450 mOsm, pH = 6,5, Concentration en poly(Leu-bloc-Glu) Cpol = 42 mg/ml, Concentration en insuline C insuline = 3,5 mg/ml)
La formulation B est préparée de manière similaire à l'exemple 1, la concentration en polymère étant ajustée à 60 mg/ml et Posmolalité Osm à 507 mOsm/kg à l'étape 1 1
Exemple 3 - Préparation d'une formulation selon l'invention (Formulation C) comprenant une suspension colloïdale d'insuline longue action P de l'exemple 1.1:
(Osmolarité Osm = 450 mOsm, pH=6,5, Concentration en poly(Leu-bloc-Glu) Cpol = 42 mg/ml, Concentration en insuline C insuline = 3,5 mg/ml)
La formulation C est préparée de manière similaire à l'exemple 1, l'osmolalité Osm étant ajustée à 507 mOsm/kg à l'étape 1 1, par ajout d'une solution de MgCl2 à 32%
Exemple 4 — Préparation d'une formulation comparative témoin négatif (Formulation compD) comprenant une suspension colloïdale sans insuline: (Osmolarité Osm = 450 mOsm, pH=7,4, Concentration en poly(Leu-bloc-Glu) Cpol = 45 mg/ml, Concentration en insuline C insulin = 0 mg/ml) La préparation de la suspension est faite sous hotte à flux laminaire ou en pièce stérile Dans un flacon de verre on introduit successivement 65,6 g de polymère poly(Leu- bloc-Glu) en solution dans l'eau à 73,5 mg/g On ajoute ensuite successivement 2,21 g de NaCl 30% et 0,53 g de NaOH IN sont ajoutés à la solution pour ajuster le pH à 7,4 et l'osmolarité à 450 mOsm/kg On ajoute ensuite 2,3 g NaCl 30% et 37,88 g d'eau injectable afin de régler la concentration en polymère à 45 mg/ml tout en maintenant l'osmolalité à 450 mOsm/kg
Exemple 5 - Préparation d'une formulation selon l'invention (Formulation E) comprenant une suspension colloïdale d'insuline longue action P de l'exemple 1.1: (Osmolarité Osm = 450 mOsm, pH = 6,5, Concentration en poly(Leu-bloc-Glu) Cpol = 45 mg/ml, Concentration en insuline C insuline = 3,5 mg/ml)
La formulation E est préparée de manière similaire à l'exemple 1, la concentration en polymère étant ajustée à 64,7 mg/ml et l'osmolalité Osm à 535 mOsm/kg à l'étape 1 1 Exemple 6 — Caractéristiques des formulations compA, compB, C, compD, E d'insuline longue action selon l'invention (cf. Tableau 1).
Les mesures de viscosité sont réalisées à 20°C sur un rhéomètre ARlOOO (TA Instruments) équipé d'une géométrie cône-plan (4cm, 2°). La viscosité est mesurée pour un gradient de cisaillement de 10 s"1.
Tableau 1
Figure imgf000020_0001
Le chlorure de magnésium utilisé conformément à l'invention (formulations C, E) est particulièrement avantageux, car à osmolalité semblable, il permet une réduction plus importante de la viscosité : 4 et 5 mPa.s respectivement pour les formulations C et E versus 10 et 15 mPa.s respectivement pour les formulations compB et compD.
Exemple 7 - Temps de remplissage des formulations compA, compB et C:
Le temps de remplissage d'une seringue à insuline au travers d'une aiguille de gauge 30 et de longueur 8 mm est mesuré pour les différentes formulations décrites dans les exemples précédents. Le volume de remplissage est de 0,5 ml correspondant à 50UI/ml.
On obtient les résultats suivants présentés dans le Tableau 2 ci-dessous: Tableau 2
Figure imgf000021_0001
L'utilisation d'une solution hyperosmotique ajustée en chlorure de magnésium (formulation C) permet de diminuer considérablement le temps de remplissage d'une seringue pour permettre aisément un usage quotidien par les patients
Exemple 8 - Temps d'injection des formulations compA, compB et C :
Les produits à base d'insuline sont injectés en sous cutané soit au moyen de seringues à insulines, soir au moyen de stylo à insuline Le temps d'injection d'une dose de 50UI pour différentes formulations est mesuré pour une force constante de 20 newtons Le stylo utilisé est un NOVOPEN in, utilisant des cartouches de 3 ml et des aiguilles de 31 G « thin wall » de marque Becton Dickinson
Tableau 3
Figure imgf000021_0002
L'utilisation d'une solution hyperosmotique ajustée en chlorure de magnésium (formulation C) permet de ramener le temps d'injection d'une seringue à un temps suffisamment court pour permettre aisément un usage quotidien par les patients
Exemple 9 -Tolérance locale — Formulations CompD et E
Le modèle utilisé est un modèle m vivo de peau de porc, dont la grande sensibilité par rapport à une peau humaine a été montrée pour le type de produit étudié Les tolérances locales des formulations CompD et E ont été comparées dans ce modèle La formulation CompD comprend
• 45 mg/ml du polymère poly(Leu-bloc-Glu)
• une osmolalité de 450 mosm ajustée par du chlorure de sodium et est préparée selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 4 ci-dessus. La formulation E selon l'invention comprend :
• 100 Ul/ml d'insuline recombinante humaine
• 45 mg/ml du polymère poly(Leu-bloc-Glu) » 21 mM de phénol et de métacrésol
• une osmolalité de 450 mosm ajustée par du chlorure de magnésium et est préparée selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 5 ci- dessus.
Une formulation de NaCl/MgCL2 450 mosm est utilisé en tant que référence négative dans l'étude. Les différents produits ont été injectés en sous-cutané dans des conditions calibrées, sous un volume de 0,50 ml, sur la peau du ventre de 9 porcs domestiques (Seghers hybrid: Landrace x Largewhite pesant de 50 à 60 kg). Les signes cliniques - érythème et œdème et induration- ont ensuite été évalués durant les trois jours qui suivent l'injection. La référence négative (NaCl/MgCL2 450 mosm) n'a pas provoqué de réaction clinique.
La formulation CompD a provoqué une réaction locale faible et transitoire. La réaction disparaît en 3 jours environ.
La formulation E a provoqué une réaction locale du même type et de même intensité que celle observé pour la formulation CompD. Ainsi, dans ce modèle très sensible, la formulation E ajustée en chlorure de magnésium présente une tolérance locale équivalente à celle de la formulation CompD ajustée en chlorure de sodium. Cette tolérance locale est parfaitement adaptée à l'administration quotidienne du médicament.
Exemple 10 — Essai in vivo — Formulations CompA et C :
Une étude a été réalisée de manière à comparer la pharmacodynamie (i.e. la glycémie) de la formulation CompA, correspondant à l'exemple 1 ci-dessus et d'une formulation de poly(Leu-bloc-Glu) (formulation C selon l'invention) contenant du chlorure de magnésium décrite dans l'exemple 3.
La formulation CompA comprend :
• 100 Ul/ml d'insuline recombinante humaine
• 42 mg/ml du polymère poly(Leu-bloc-Glu)
• 21 mM de phénol et de métacrésol et est préparée selon l'exemple 1 ci-dessus. La formulation C selon l'invention comprend
• 100 Ul/ml d'insuline recombinante humaine
• 42 mg/ml du polymère poly(Leu-bloc-Glu)
• 21 mM de phénol et de métacrésol et est préparée selon l'exemple 3 ci-dessus
Les formulations CompA et C ont été administrées par la voie sous-cutanée à la dose 1 Ul/kg chez 12 et 16 chiens Beagle, respectivement, à jeun depuis 16 heures Les concentrations plasmatiques en glucose ont ensuite été évaluées (automate Advia 1650, Bayer Diagnostics) sur une période de 32 heures après administration afin de déterminer les paramètres pharmacodynamiques Cmin, AUCo-32h et T50%Auc, présentés dans le Tableau 4 Les écarts types sont indiqués entre parenthèses dans le Tableau 4
• AUCo-32h, exprimé en pourcentages du niveau basai de glucose dans le plasma, représente la surface entre le profil de glucose plasmatique en fonction du temps et le niveau basai de glucose plasmatique, de 0 à 32 heures Ce paramètre est calculé par la méthode dite des trapèzes
• Cmin, exprimé en pourcentages du niveau basai de glucose dans le plasma, représente la concentration minimale observée de glucose dans le plasma • T50%AUC, exprimé en heures, représente le temps nécessaire pour obtenir 50%
Figure imgf000023_0001
Tableau 4
Figure imgf000023_0002
On constate que les formulations CompA et C selon l'invention permettent l'obtention de paramètres pharmacodynamiques similaires La formulation C selon l'invention présente donc une efficacité identique à la formulation CompA, tout en ayant des temps de remplissage et d'injection significativement améliorés par rapport à CompA

Claims

REVENDICATIONS
1. Formulation injectable d'insuline longue action comprenant une suspension colloïdale, aqueuse et stable de nanoparticules à base d'au moins un poly(Leu-bloc-Glu) et chargées en insuline, le pH de cette suspension étant tel que : 6,0 < pH < 7,0; caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un sel de magnésium en quantité telle que :
' l'osmolarité Osm (en mOsmol) est telle que: 270 < Osm < 600, 1 la viscosité v (en mPa.s ), mesurée selon un mode opératoire Mv, est telle que: v < 15.
• la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) est comprise entre 30 et 70, de préférence entre 38 et 65.
2. Formulation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la viscosité v (en mPa.s), mesurée selon un mode opératoire Mv, est telle que: v < 10, et de préférence v
< 5.
3. Formulation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le contre-anion du Mg2+ est choisi dans le groupe comprenant Cl", SO4" " et leurs mélanges.
4. Formulation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les particules du poly(Leu-bloc-Glu) retenu ont un diamètre hydrodynamique moyen Dh exprimé en nanomètres (nm) et mesuré selon un mode opératoire Md, tel que :
10 < Dh < 50 de préférence, 15 < Dh < 40.
5. Formulation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le rapport massique insuline/poly(Leu-bloc-Glu), exprimé en %, est tel que :
6 < insuline/poly(Leu-bloc-Glu) < 10.
6. Formulation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le taux maximal de chargement Ta des nanoparticules avec l'insuline, exprimé en % de masse d'insuline associée par rapport à la masse de poly(Leu-bloc-Glu) et mesuré selon un mode opératoire Ma, est tel que : lO ≤ Ta de préférence, 10 < Ta < 40 et, plus préférentiellement encore, 12 < Ta < 25.
7. Formulation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'insuline est une insuline humaine non modifiée.
8. Formulation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un conservateur, de préférence sélectionné dans le groupe comprenant : les phénols, les crésols, les parahydroxybenzoates de méthyle, de propyle, ou de butyle et leurs mélanges.
9. Solide pulvérulent caractérisé en ce qu'il comprend des nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu) chargées en insuline et en ce qu'il est obtenu à partir de la formulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
10. Procédé de préparation d'une formulation injectable d'insuline longue action, en particulier selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, cette formulation comprenant une suspension colloïdale, aqueuse et stable de nanoparticules d'au moins un poly(L-leucine-b-L glutamate de sodium) ci-après dénommé poly(Leu-bloc-Glu), chargées en insuline, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement
- d'une part, i. à mélanger, en milieu liquide aqueux, au moins un poly(Leu-bloc-Glu) et de l'insuline, de préférence sous agitation, ii. et à ajouter éventuellement des excipients, au besoin à ajuster le pH à une valeur comprise entre 6,0 et 7,0;
- d'autre part, à ajuster l'osmolarité Osm (en mOsmol) de la formulation à l'aide d'au moins un sel de magnésium, de telle sorte que: • 270 < Osm < 600,
• la viscosité v (en mPa.s ), mesurée selon un mode opératoire Mv, soit telle que: v < 15, et de préférence v < 10, et encore plus préférentiellement v < 5;
• la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) soit comprise entre 30 et 70, de préférence entre 38 et 65; et, éventuellement à filtrer la suspension ainsi obtenue.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'ajustement, à l'aide d'au moins un sel de magnésium, de l'osmolarité Osm (en mOsmol) de la formulation est effectuée de telle sorte que la concentration en CMg2+ (en mole/L) soit la suivante: 0,06 < CMg2+ < 0, 125; de préférence de l'ordre de 0,08 +/- 0,01.
12. Procédé de préparation d'une formulation injectable de protéine(s) caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement :
- d'une part, à mélanger au moins une protéine à un milieu liquide aqueux, à ajouter éventuellement des excipients, au besoin à ajuster le pH à une valeur comprise entre 6,0 et 7,0;
- et d'autre part, à ajuster l'osmolarité de la formulation à l'aide d'au moins un sel de magnésium, de telle sorte que: « 270 < Osm < 600, • la viscosité v (en mPa.s ), mesurée selon un mode opératoire Mv, soit telle que: v < 15, et de préférence v < 10, et encore plus préférentiellement v < 5,; • la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) soit comprise entre 30 et
70, de préférence entre 38 et 65;
- et, éventuellement à filtrer le mélange ainsi obtenu.
13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'association de l'insuline aux nanoparticules lors de l'étape (i) est effectuée par mise en œuvre d'au moins l'une des méthodes suivantes : une première méthode consiste essentiellement à mettre en présence une phase aqueuse contenant l'insuline avec la suspension colloïdale de nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu);
- une deuxième méthode consiste essentiellement à mettre en présence (en les mélangeant) le poly(Leu-bloc-Glu) à l'état pulvérulent avec une phase aqueuse contenant l'insuline ; - une troisième méthode consiste essentiellement à mélanger l'insuline à l'état pulvérulent avec une phase aqueuse contenant le poly(Leu-bloc-Glu).
14. Médicament caractérisé en ce qu'il comprend de la formulation injectable d'insuline longue action selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et/ou de la formulation obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 13 et/ou du solide pulvérulent selon la revendication 9.
15. Médicament selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est destiné au traitement du diabète.
16. Médicament selon l'une quelconque des revendications 14 à 15, caractérisé en ce qu'il est constitué par une présentation galénique comprenant, d'une part, du solide pulvérulent selon la revendication 9 et, d'autre part, de manière séparée, du liquide aqueux pour la reconstitution, avant l'administration, de la formulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et/ou de la formulation obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 13.
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