WO2007074832A1 - 小細胞肺がんの診断のための方法、システムおよび組成物ならびに関連するスクリーニング方法 - Google Patents

小細胞肺がんの診断のための方法、システムおよび組成物ならびに関連するスクリーニング方法 Download PDF

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WO2007074832A1
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Yoshinori Murakami
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to methods, systems and compositions for cancer diagnosis and related screening methods. More particularly, it relates to methods, systems and compositions and associated screening methods for the diagnosis of small cell lung cancer.
  • Cancer treatment and prevention is a problem that has not yet been completely solved, and has been analyzed from various perspectives, and there is still a strong demand for its solution.
  • Diagnosis of cancer is a process necessary for appropriate diagnosis and prevention, and various methods and markers are used for the diagnosis.
  • SCLC Small cell lung cancer
  • a type of cancer is an invasive cancer with characteristic initial metastasis.
  • SCLC patients have an overall survival rate of 12% for early stage disease and only 2% for metastatic disease.
  • Metastatic disease is usually seen in about two-thirds of SCL C patients.
  • Non-patent document 2 Chute, JP et al. (1997) Mayo Clin. Proc. 72: 901-12;
  • Non-patent literature 3 Salgia, R. (1996) Adv. Oncol. 12: 8-15). Understanding the mechanism of SCLC metastasis to lymph nodes and various organs is important when designing additional therapies.
  • SCLC is characterized by overexpression of several receptor tyrosine kinases (RTK).
  • RTK receptor tyrosine kinases
  • the 145 kDa proto-oncogene product, the c Kit receptor is a class ⁇ RTK similar to c-Fms, Flt3, and platelet-derived growth factor receptor (PDGFR).
  • Non-patent document 1 Chute, JP et al. (1999) J. Clin. Oncol. 17: 1794—801
  • Non-patent document 2 Chute, JP et al. (1997) Mayo Clin. Proc. 72: 901—12
  • Patent Document 3 Salgia, R. (1996) Adv. Oncol. 12: 8— 15
  • Non-Patent Document 4 Gibbs, J. B. and Oliff, A. (1994) Cell 79: 193— 8
  • Non-Patent Document 5 Levitzki, A. and Gazit, A. (1995) Science 267: 1782-8
  • Non-Patent Document 6 Hibi, K. et al. (1991) Oncogene 6: 2291— 6
  • Non-Patent Document 7 Yamanishi, Y. et al. (1996) jpn. J. Cancer Res. 87: 534—4
  • an object of the present invention is to provide a completely new technique for diagnosis of cancer (particularly, small cell lung cancer).
  • the present invention includes the following.
  • a step of observing an increase in TSLC1 expression or a change in sugar chain in a subject, and the presence of the increased expression or changed sugar chain as compared to a normal individual is the expression of cancer in the subject. Showing the process,
  • the change in the sugar chain is that the sugar chain pattern of the protein is different from the normal pattern, and that an increase in O-type or N-type sugar chain modification is observed.
  • the increase in the activity is due to the fact that the Rac protein activity level, which can be measured as the ratio of Rac protein that can bind to the Rac binding domain of p21 kinase, to the total intracellular Rac protein, is more than twice the normal value. 10. The method according to item 9 above.
  • the detection is performed using a reagent including a probe designed to be a sequence complementary to all or part of the nucleic acid molecule having the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5. 15. The method according to 15.
  • a diagnostic agent for cancer comprising a means for measuring the level of TSLC1 or Racl.
  • the specific factor is an antibody against the polypeptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6.
  • a method of screening for a diagnostic agent for cancer comprising: A) observing differences in TSLC1 or Racl levels between normal subjects and cancer patients and selecting normal subjects and cancer patients in which differences are found; and
  • a system for screening for diagnostic agents for cancer comprising:
  • a system comprising means for identifying factors that correlate with TSLC1 or Racl levels in selected normal subjects and cancer patients.
  • a technique for diagnosis of cancer is provided.
  • FIG. 1 TSLC1 overexpression in small cell lung cancer.
  • TSLC1 which is highly expressed in small cell lung cancer, is a specific splicing variant.
  • A Differences between TSLC1 gene organs, disease state-specific splicing and O-glycan modification.
  • B Splicing 'variant found in small cell lung cancer.
  • FIG. 3 Glycosylation of TSLC1 protein.
  • A Western 'blot analysis of TSLC1 protein. The molecular weight of TSLC1 protein is different in small cell lung cancer, ATK cells, and epithelium.
  • B. The molecular weight of TSLC1 protein in small cell lung cancer is decreased by digestion specific to N-type and O-type glycans.
  • FIG. 4 shows the induction of cancer cell invasive traits by TSLC1. Cancer cells lacking TSLC1 expression were layered on NIH3T3 monolayer cells and TSL C1 expression was induced by doxycycline. TSLC1 was stained with anti-TSLC1 antibody and secondary antibody (blue), and actin molecules were stained with faroidin (red). As shown, TSLC 1 overexpression resulted in cancer cells infiltrating.
  • FIG. 5 shows in vitro binding between TSLC1 protein and Tiaml protein.
  • TSLC1 intracellular fragment GST fusion protein in E. coli and a fragment lacking 9 amino acids at its C-terminus Binding above and detecting the eluted fragment.
  • GST-C TSLC1 intracellular fragment
  • FIG. 6 and FIG. 7 show in vitro binding between TSLC1 protein and Tiaml protein. Introduced and expressed Tiaml protein with V5 tag sequence in cultured cancer cells, immunoprecipitated with anti-V5 antibody or mouse IgG ( Figure 6), or anti-TSLC1 antibody or mouse IgG ( Figure 6), and sedimented Were separated by polyacrylamide gel electrophoresis and detected with anti-TSLC 1 antibody (FIG. 6) and anti-Tiaml antibody (FIG. 7) (Western blotting). As controls, cell lysates were detected with anti-TSLC 1 antibody and anti-V5 antibody ( Figure 6), or cell lysates and immunoprecipitates were detected with anti-V5 antibody ( Figure 7).
  • FIGS. 6 and 7 show in vitro binding of TSLC1 protein and Tiaml protein. Introduced and expressed Tiaml protein with V5 tag sequence in cultured cancer cells, immunoprecipitated with anti-V5 antibody or mouse IgG ( Figure 6), or anti-TSLC1 antibody or mouse IgG ( Figure 6), and sedimented Were separated by polyacrylamide gel electrophoresis and detected with anti-TSLC 1 antibody (FIG. 6) and anti-Tiaml antibody (FIG. 7) (Western blotting). As a control, cell lysates were detected with anti-TSLC 1 antibody as well as anti-V5 antibody ( Figure 6), Alternatively, cell lysates and immunoprecipitates were detected with anti-V5 antibody (FIG. 7).
  • FIG. 8 shows the colocalization of TSLC1 protein and Tiaml protein.
  • Expression of TSLC1 protein was induced in cultured cancer cells with doxycycline, and localization of TSLC1 protein and TIM protein was detected with anti-TSLC1 antibody and anti-Tiaml antibody, respectively.
  • the right end is an image that combines both signals.
  • FIG. 9 shows that TSLC1 suppresses epithelial-mesenchymal transition, migration, invasiveness, and Racl activity of MDCK cells by HGF.
  • TSLC1 is a gene reported as a tumor suppressor gene in non-small cell lung cancer (Kuramochi M, Fukuhara H, Nobukuni T, et a 1.
  • TSLCl is a tumor -suppressor gene in human non-small-cell lung cancer. Nat Med. 2001; 27: 427-430).
  • the TSLCl gene is a chromosomal partial force-isolated gene that is commonly deleted in many lung cancers, and is recently considered to be involved in the epithelial cell adhesion function. (Masuda M, Yageta M, Fukuhara H, et al. The tumor suppressor protein TSLCl ⁇ s involved in cell-cell adhesion.
  • Morphological transformation is the basic phenotype that distinguishes cancer cells from normal epithelial cells.
  • TSLC1 is a tumor suppressor gene on chromosome fragment 11 q23.2, which was identified by functional complementation (Kuramochi, M., Fukuhara, H., Nobukuni, ⁇ ., Kanbe, ⁇ . , Maruyama, ⁇ ., Ghosh, ⁇ . ⁇ ., Pletcher, ⁇ ., Isomura, ⁇ ., Onizuka, ⁇ ., Kitamura, ⁇ ., Sekiya, ⁇ ., Reeves, R. ⁇ ., And Murakami, ⁇ . (2001) Nat Genet 27, 427-430 .;).
  • Promoter monomethylation and loss of TSLC1 expression are frequently observed in advanced stages of primary lung cancer, primary esophageal cancer, primary spleen cancer, and various other cancers (Kuramo chi, M. , Fukuhara, ⁇ ., Nobukuni, ⁇ ., Kanoe, ⁇ ., Maruyama, ⁇ ., O sh, ⁇ . P., Pletcher, ⁇ ., Isomura, ⁇ ., Onizuka, ⁇ ., Kitamura,,., Se Kiya, ⁇ ., Reeves, R. ⁇ ., and Murakami, .. (2001) Nat Genet 27, 427-430 .; Murakami, Y. (2002).
  • TSLC1 encodes an immunoglobulin superfamily molecule that mediates cell-cell adhesion (Masud a, M., Yageta, ⁇ ., Fukuhara, ⁇ ., Kuramochi, ⁇ ., Maruyama, ⁇ ., No moto, ⁇ . & Murakami, Y. (2002). J Bio Chem, 277, 31014—31019.).
  • TSLC1 protein The loss of TSLC1 protein was found mainly at the invasive tip of primary lung adenocarcinoma (Ito, A., Okada, M., Uchino, K., Wakayama, T., Koma, Y., Iseki, S., Tsubota, N., Okita, Y. & Kitamura, Y. (2003a) .Lab Invest, 83, 1175-1183.) 0 Therefore, TSLC1 seems to be mainly involved in epithelial cell adhesion. On the other hand, loss of TSLC1 function can lead to cancer cells invasion and Z or metastasis.
  • TSLC1 was found to have a role not only in epithelial cell adhesion, but also in spermatogenic cell adhesion to Sertoli cells, mast cell adhesion to fibroblasts, and neuronal synapse formation.
  • TSLC1 / IGSF4 / N ecl-2 / Sg IGSF / RA175 / SynCAM (Biederer, T., Sara, Y., Mozhayev a, M., Atasoy, D., Liu, X., Kavalali, ET & Sudhof , TC (2002).
  • the cytoplasmic domain of TSLC1 carries a binding motif for molecules of the protein 4. family.
  • DAL-1 / 4.1B via the TSLC1 force protein 4.1 binding motif (Yageta, M., Kuramochi, M., ⁇ asuda, ⁇ ., Fukami, ⁇ ., Fukuhara, ⁇ ., Maruyama, ⁇ ., Shibuya, ⁇ . & Murakami, ⁇ . (2002). Cancer Res, 62, 5129-5133 .;).
  • DAL-1 is a candidate tumor suppressor in N SCLC, meningioma, and breast cancer and belongs to the protein 4.1 family of molecules.
  • TSLC1 is a class II PSD95 / D lg / ZO-1 (which is located at the carboxyl terminus of TSLC1 with respect to MPP3 (a member of the membrane-bound guanylate kinase homolog (MAGuK)).
  • PDZ domain-binding motif
  • MPP1, MPP2, and MPP3 are thought to be human counterparts of Drosophilastardust (Sdt) and are involved in cell polarization (Bachmann, A., Schneider, M., Theilenberg, E., Grawe, F. & Knust , E. (2001). Nature, 414, 638— 643.
  • TSLC1ZIGSF4A is a single transmembrane saccharide belonging to the family of immunoglobulin superfamily cells (IgCAM) (Masuda, M., 3 ⁇ 4 (2002) J Biol Chem 277, 31014- 31019).
  • IgCAM immunoglobulin superfamily cells
  • N SCLC Non-small cell lung cancer
  • encoding proteins Gomyo, H., et al. (1999) Geno mics 62, 139-146; and Kuramoc hi, M., et al. (2001) Nat Genet 27, 427-430
  • It is a tumor suppressor gene. Due to its diverse functions in various tissues, TSLC1 has been characterized by several different research groups.
  • RA175 Flujita, E., et al. (2003) Exp Cell Res 287, 57-66
  • SgIGSF Ito, A., et al. (2003) Blood 101, 2601— 2608
  • NecI2 Shifai , T., et al. (2003) J Biol Chem 278, 35421- 3542
  • SynCAMl Maher, T., et al. (2002) Science 29 7, 1525-1531.
  • TSLC1 protein 4.1BZDAL-1 (a member of the protein 4.1 family) force TLSC1 is connected to the actin skeleton, and that this interaction force is involved in the reconstruction of actin.
  • TSLC1 also interacts with membrane-associated guanylate kinase homolog (MAGuK) through its class II PDZ domain (Shingai, T., et al. (2003). ) J Biol Chem 278, 35421- 35427; Bie derer, T., et al.
  • MAGuK membrane-associated guanylate kinase homolog
  • TSLC1 was first identified in nude mice based on its tumorigenic potential of A549 cells, human lung gland cancer (Kuramochi, M., et al. (2001) Nat Genet 27, 427-430). Restoration of TSLC1 expression in A549 cells inhibited splenic force metastasis to the liver (Yageta, M., 3 ⁇ 4 (2002) Cancer Res 62, 5129-5133).
  • TLSC1 deletion has been frequently observed in advanced lung cancer and many other human cancers (Kuramochi, M., et al. (2001) Nat Genet 27, 427-430, 11). These observations strongly suggest that TSLC1-terminal motifs play an important role in tumor invasion and Z or metastasis, yet the exact role of these motifs in tumor suppression remains unclear. is there.
  • a representative nucleotide sequence of TSLC 1 is:
  • amino acids In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition, and deletion, and have a biological activity.
  • amino acids In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition, and deletion, and have a biological activity.
  • polypeptide having an amino acid sequence that is at least 70% identical to any one of the polypeptides of (a) to (d) and having biological activity
  • TSLC1 is known not only to humans but also to other animals (for example, mammals) and homologs thereof (referred to herein as "corresponding" genes). Therefore, in the present specification, TSLC1 usually means TSLC1 which exists not only in human but also in living organisms unless otherwise specified.
  • the "molecular pathway of TSLC1" refers to a signal transduction pathway mediated by TSLC1, and in the present invention, Tiaml and low molecular weight G-coupled protein Racl are involved and are clearly the factors. Became. Therefore, in the present specification, when referring to the molecular pathway of TSLC1, it is understood that the forces of TSLC1, Tiaml (for example, SEQ ID NOs: 3 and 4) and R acl (for example, SEQ ID NOs: 5 and 6) exist as factors.
  • Tiaml for example, SEQ ID NOs: 3 and 4
  • R acl for example, SEQ ID NOs: 5 and 6
  • Ras is one of the Ras subfamily of oncogenes, and the Ras subfamily consists of Rho, Racl and Cdc4.
  • Ras belongs to the GTPase-per family that regulates various signal transduction pathways. Ras is involved in the regulation of cell proliferation and differentiation (Boguski. MS and McCormick, F. (1993) Nature 366, 643—654).
  • One of these subfamilies is involved in the control of cell proliferation, in particular the control of cell transformation, as well as the regulation of cell adhesion formation and the change of actin cell skeleton upon growth factor stimulation (Coso).
  • OA Chiariello. M., Yu. J. —C., Teramoto. H., Crespo.
  • Ras family proteins are commonly inactive (GDP binding) and active
  • GTPases act as molecular switches to process and transmit information to regulate specific pathways.
  • proteins that control the nucleotide state of Ras and Ras-related GT Pase have been identified and purified (Bogus ki. MS and McCormick, F. ( 1993) Nature366, 643—654).
  • GAP GTPase activation protein
  • GEF guanine nucleotide exchange factor
  • GEF plays an important role by promoting the dissociation of GDP and subsequent GTP binding.
  • Ras-specific GEF Sos is transferred by growth factor stimulation, Ras is converted to a GTP-binding form (Buday. L. and Downward. J. (1993) Cell 73, 611 — 620).
  • GEFs that specifically activate Racl family proteins the signal transduction pathways involved in those GT Pases are elucidated, and therefore the molecular mechanism of cell proliferation is better understood. Let ’s go.
  • drugs that prevent and treat diseases caused by uncontrolled cell growth can be found. Since Racl plays a central role in signal transduction and cell proliferation, the identification and analysis of Racl—GEF is currently attracting considerable scientific attention.
  • Rhol is known as one of the GEFs (Michiels, F., Habets, GG, Stam, JC, van der Kammen, RA, and Collard, JG (1995) Nature 375, 338—340. See also Eva. A. and Aaronson. SA (1985) Nature 316, 273—275: Toksoz. D. and Williams. D. A. (1994) Oncogene 9, 621—628).
  • GEF GDPZGTP exchange factors
  • Tiaml, 2 e.g., Cell, 77, 537-549, 1994, Nature, 375, See 338-340, 1995.
  • Vavl see, for example, Nature, 385, 169—172, 1997) that regulates T cell receptor signaling, as well as Vav2, Vav3, and Trio (see, for example, J. Cell Science, 113, 729-739, 2000);
  • STEF see, for example, J. Biol. Chem., 277, 2860-2868, 2002;
  • P-Rexl see, for example, Non-Patent Document 21
  • These five types all have a common domain and have the function of adding GTP to Racl.
  • a representative nucleotide sequence of Racl is:
  • polypeptide having an amino acid sequence with at least 70% identity to any one of the polypeptides of (a) to (d) and having biological activity
  • Tiaml refers to a molecule identified as a molecule that functions as a Racl-specific GDPZGTP exchange factor (GEF) (Michiels, F., Habets, GG, Stam, JC, van der Kammen, RA, and CoUard, JG (1995) Nature 3 75, 338-340.See also. Eva.A. and Aaronson.SA (1985) Nature 3 16, 273-275: Toksoz.D. And Williams.DA ( 1994) Oncogene 9, 621 — 628).
  • GEF Racl-specific GDPZGTP exchange factor
  • a typical nucleotide sequence of Tiaml is:
  • variant polypeptide having one mutation selected from the group consisting of one or more amino acid force substitutions, additions and deletions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or a fragment thereof, A polynucleotide that encodes a variant polypeptide having biological activity;
  • one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition, and deletion ability, and have a biological activity.
  • polypeptide having an amino acid sequence with at least 70% identity to any one of the polypeptides of (a) to (d) and having biological activity
  • an "agent” is any substance or other element (eg, energy such as light, radioactivity, heat, electricity, etc.) as long as the intended purpose can be achieved. There may be.
  • examples of such substances include proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA, genomic DNA, and RNA such as mRNA), Polysaccharides, oligosaccharides, lipids, small organic molecules (eg hormones, ligands, signaling substances, Examples include, but are not limited to, small organic molecules, molecules synthesized by combinatorial chemistry, small molecules that can be used as pharmaceuticals (such as small molecule ligands), and complex molecules thereof.
  • a specific factor for a polynucleotide is typically a polynucleotide having a certain sequence homology to the sequence of the polynucleotide (e.g., 70% or more sequence identity) and complementarity. Examples thereof include, but are not limited to, a polypeptide such as a transcription factor that binds to the promoter region.
  • Factors specific for a polypeptide typically include an antibody specifically directed against the polypeptide or a derivative or analog thereof (eg, a single chain antibody), a polypeptide thereof. Examples include, but are not limited to, a specific ligand or receptor when the peptide is a receptor or a ligand, and a substrate when the polypeptide is an enzyme.
  • a “factor that specifically interacts” with a biological agent such as a polynucleotide or a polypeptide means an affinity for the biological agent such as the polynucleotide or the polypeptide.
  • the affinity for other unrelated (especially less than 30% identity) polynucleotides or polypeptides is typically the same or higher, preferably significantly (eg, statistically Includes significantly higher).
  • affinity can be measured by, for example, hybridization assay, binding assay, or the like.
  • the first substance or factor “specifically interacts” with the second substance or factor means that the first substance or factor has a second substance or factor with respect to the second substance or factor.
  • Specific interactions for substances or factors include both nucleic acids and proteins, such as hybridization in nucleic acids, antigen-antibody reactions in proteins, ligand-receptor reactions, enzyme-substrate reactions, etc. Examples include, but are not limited to, protein-lipid interaction, nucleic acid-lipid interaction, and the like, such as a reaction between a transcription factor and a binding site of the transcription factor.
  • nucleic acids and proteins such as hybridization in nucleic acids, antigen-antibody reactions in proteins, ligand-receptor reactions, enzyme-substrate reactions, etc. Examples include, but are not limited to, protein-lipid interaction, nucleic acid-lipid interaction, and the like, such as a reaction between a transcription factor and a binding site of the transcription factor.
  • the first substance or factor is “specifically interacting” with the second substance or factor. Included is at least partially complementary to the force, second substance or factor.
  • the first substance or factor “specifically interacts” with the second substance or factor may be, for example, an interaction by an antigen antibody reaction, a receptor Examples include, but are not limited to, interaction by a single ligand reaction, enzyme-monomolecular interaction, and the like. If the two substances or factors include proteins and nucleic acids, the first substance or factor “specifically interacts” with the second substance or factor means that the transcription factor and the transcription factor The interaction between the binding region of the nucleic acid molecule is included.
  • antibodies refers to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, multispecific antibodies, chimeric antibodies, and anti-idiotype antibodies, and fragments thereof, such as F (ab ') and Fab fragments, As well as other recombinantly produced conjugates.
  • antibodies may be covalently linked or recombinantly fused to an enzyme, such as alkaline phosphatase, horse radish peroxidase, alpha galactosidase, etc.
  • an enzyme such as alkaline phosphatase, horse radish peroxidase, alpha galactosidase, etc.
  • antigen refers to any substrate that can be specifically bound by an antibody molecule.
  • immunogen refers to an antigen capable of initiating lymphocyte activity that produces an antigen-specific immune response.
  • the antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • compound means any distinguishable chemical or molecule, including small molecules, peptides, proteins, sugars, nucleotides, or nucleic acids. Without being limited thereto, and such compounds can be natural or synthetic.
  • the “small organic molecule” means an organic molecule having a relatively small molecular weight. Usually, a small organic molecule has a molecular weight of about 1000 or less, but it may be higher. Small organic molecules can be synthesized by using methods known in the art or a combination thereof. Such small organic molecules are produced in living organisms You may let them. Examples of small organic molecules include hormones, ligands, signal transmitters, organic small molecules, molecules synthesized by combinatorial chemistry, and small molecules that can be used as pharmaceuticals (for example, small molecule ligands). Not limited to.
  • ligand refers to a substance that specifically binds to a protein.
  • ligands For example, lectins, antigens, antibodies, hormones, neurotransmitters, etc. that specifically bind to various receptor protein molecules present on the cell membrane can be mentioned as ligands.
  • ligands When a factor in the molecular pathway of TS LC1 is a receptor, its partner is called a ligand.
  • protein protein
  • polypeptide oligopeptide
  • peptide refers to a polymer of amino acids of any length.
  • the polymer may be linear or branched or cyclic.
  • the amino acid may be a modified amino acid, whether natural or non-natural.
  • the term can also refer to a complex assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphate or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component) and the like. .
  • polypeptides containing one or more analogs of amino acids eg, including non-natural amino acids, etc.
  • peptidomimetic compounds eg, peptoids
  • polypeptide of the present invention may refer to any factor in the molecular pathway of TSLC1 (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.).
  • amino acid may be natural or non-natural.
  • “Derivative amino acid” or “amino acid analog” refers to an amino acid that is different from a naturally occurring amino acid but has the same function as the original amino acid. Such derivative amino acids and amino acid analogs are well known in the art.
  • natural amino acid means the L isomer of a natural amino acid. Natural amino acids are glycine, alanine, noline, leucine, isoleucine, serine, methionine, threonine, phenylalanin, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, hygiene. Stidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, gamma carboxy glutamic acid, arginine, orthine, and lysine. Unless otherwise indicated, in this specification, all amino acids are in the L form.
  • unnatural amino acid means an amino acid that is not normally found in proteins.
  • non-natural amino acids include the above-mentioned D-form amino acids, norleucine, normal nitrophenylalanine, homophenylalanine, parafluorophenylalanine, 3 amino-2 benzylpropionic acid, homoarginine D-form or L-form and D-phenol- Lualanin is mentioned.
  • amino acid analog refers to a molecule that is not an amino acid but is similar to the physical properties and function or function of an amino acid.
  • amino acid analogs include ethionine, canavanine, 2-methylglutamine and the like.
  • Amino acid mimetics refers to chemical compounds that have a structure that is different from the general chemical structure of an amino acid, but that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid.
  • Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbol power or by the one letter symbol recommended by the IUPAC — IUB Biochemica 1 Nomenclature Commission. Nucleotides can also be referred to by the generally accepted single letter code.
  • polynucleotide refers to a polymer of nucleotides of any length.
  • the term also includes “oligonucleotide derivatives” or “polynucleotide derivatives”.
  • Oligonucleotide derivatives refer to oligonucleotides or polynucleotides that include derivatives of nucleotides or that have unusual linkages between nucleotides, and are used interchangeably.
  • oligonucleotides include, for example, 2, 1 O-methyl-ribonucleotide, oligonucleotide derivatives in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphoroate bond, and oligonucleotides.
  • nucleic acid sequence may also contain conservatively modified variants (eg, degenerate codon substitutes) and complements, as well as explicitly indicated sequences. It is contemplated to encompass the sequence. Specifically, a degenerate codon substitute creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and a Z or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605—2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91— 98 (1994)).
  • degenerate codon substitute creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and a Z or deoxyinosine residue.
  • nucleotide may be natural or non-natural.
  • Nucleotide derivative or “nucleotide analog” refers to a substance that is different from a naturally occurring nucleotide but has the same function as the original nucleotide.
  • nucleotide derivatives and nucleotide analogs are well known in the art. Examples of such nucleotide derivatives and nucleotide analogs include phosphoroates, phosphoramidates, methylphosphonates, chiral methylphosphonates, 2,1-O-methylribonucleotides, and peptide-type nucleic acids (PNA). Not.
  • complex molecule refers to a molecule formed by linking a plurality of molecules such as polypeptides, polynucleotides, lipids, sugars, and small molecules.
  • complex molecules include, but are not limited to, glycolipids and glycopeptides.
  • a polypeptide having the amino acid of SEQ ID NO: 2, or a variant or fragment thereof, as long as it has biological activity involved in diagnosis encodes each variant or fragment.
  • Nucleic acid molecules can also be used.
  • nuclear Complex molecules including acid molecules can also be used.
  • nucleic acid is also used interchangeably with gene, cDNA, mRNA, oligonucleotide, and polynucleotide.
  • Particular nucleic acid sequences also include “splice variants”.
  • a particular protein encoded by a nucleic acid implicitly includes any protein encoded by a splice variant of that nucleic acid.
  • splice variants are the product of alternative splicing of genes. After transcription, the initial nucleic acid transcript can be spliced such that different (alternate) nucleic acid splice products encode different polypeptides. The mechanism of splice variant production varies, but includes exon alternative splicing.
  • polypeptides derived from the same nucleic acid by read-through transcription are also included in this definition.
  • Any product of a splicing reaction (including recombinant forms of the splice product) is included in this definition.
  • any factor in the molecular pathway of TSLC1 eg, TS LC, Tiaml, Racl, etc.
  • gene refers to a factor that defines a genetic trait. Usually arranged on a chromosome in a certain order. A gene that defines the primary structure of a protein is called a structural gene, and a gene that affects its expression is called a regulatory gene. As used herein, “gene” may refer to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” and Z or “protein” “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide”.
  • homology of a gene refers to the degree of identity between two or more gene sequences. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity.
  • the ability of two genes to have homology can be determined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions.
  • the DNA sequence power between the gene sequences is typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90%, If they are 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical, the genes have homology.
  • identity value in this specification usually refers to the value when aligned using the above BLAST and default conditions. However, if a higher value is obtained by changing the parameter, the highest value is the identity value. When identity is evaluated in multiple areas, the highest value is used as the identity value.
  • a "corresponding" amino acid or nucleic acid has the same action as a given amino acid or nucleotide in a polypeptide or polynucleotide as a reference for comparison in a polypeptide molecule or polynucleotide molecule.
  • an antisense molecule can be a similar part in an ortholog corresponding to a particular part of the antisense molecule.
  • the corresponding amino acid in any factor (for example, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.) in the molecular pathway of the active TSLC1 of the present invention, can be, for example, a phosphorylated site.
  • the corresponding amino acid in any factor in the molecular pathway of active TSLC1 of the present invention (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.), can be an amino acid responsible for dimerization.
  • Such “corresponding” amino acids or nucleic acids may be regions or domains spanning a range. Accordingly, such cases are referred to herein as “corresponding” regions or domains.
  • a "corresponding" gene eg, a polypeptide molecule or a polynucleotide molecule
  • a gene that is predicted to have for example, a polypeptide molecule or a polynucleotide molecule
  • the gene corresponding to a gene can be an ortholog of that gene.
  • any factor in the molecular route of mouse TSLC1 eg TSLC1, Tiaml, Rac, etc.
  • TSLC1 any factor in the molecular route of TSLC1
  • Corresponding genes can also be found in other animals (human, rat, pig, ushi, etc .. Such corresponding genes are identified using techniques well known in the art. be able to.
  • the corresponding gene in an animal is a gene that serves as a reference for the corresponding gene (eg, any factor in the molecular pathway of mouse TSLC1 (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.)
  • A, TSLC1 molecule can be found by searching the sequence database of the animal (eg, human, rat) using the sequence of any factor in the pathway (eg, genes such as TSLC1, Tiaml, Racl, etc. B) as a query sequence it can.
  • fragment refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n-1 relative to a full-length polypeptide or polynucleotide (length n).
  • length n the length of the fragment can be changed as appropriate according to its purpose.
  • the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 in the case of a polypeptide. , 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and the lengths represented by integers not specifically listed here (e.g., 11 is also suitable as a lower limit).
  • polynucleotides 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides may be mentioned.
  • the lengths expressed in! /, NA! /, Integers may also be appropriate as lower limits, where such fragments are, for example, full length If it functions as a marker, the fragment itself also functions as a marker. To the extent that it falls within the scope of the invention.
  • contacting refers to bringing a compound in physical proximity to the polypeptide or polynucleotide of the present invention, either directly or indirectly. Means that.
  • the polypeptide or polynucleotide can be present in many buffers, salts, solutions, and the like. Contact includes placing the compound in, for example, a beaker, microtiter plate, cell culture flask or microarray (eg, gene chip) containing a polypeptide encoding a nucleic acid molecule or fragment thereof.
  • polynucleotide that hybridizes under stringent conditions refers to well-known conditions commonly used in the art. Using a polynucleotide selected from the polynucleotides of the present invention as a probe, a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like is used. Thus, such a polynucleotide can be obtained. Specifically, using a filter on which colony or plaque-derived DNA is immobilized, 0.7 to 1.
  • the polypeptide used in the present invention includes a nucleic acid molecule encoding the polypeptide specifically described in the present invention.
  • a polypeptide encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions is also included.
  • a polynucleotide that can be hybridized refers to a polynucleotide that can hybridize to another polynucleotide under the above-mentioned hybridization conditions.
  • a polynucleotide capable of hybridizing is a polynucleotide having at least 60% homology with a DNA base sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, etc.
  • a polynucleotide having a homology of 80% or more is preferable, and a polynucleotide having a homology of 95% or more is more preferable.
  • the homology of the nucleic acid sequence is indicated by the score by using the search program BLAST using an algorithm developed by Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)).
  • highly stringent conditions allow for hybridization of DNA strands having a high degree of complementarity in nucleic acid sequences, and hybridization of DNA having significant mismatches.
  • a condition designed to exclude a session! The stringency of hybridization is mainly related to temperature, ionic strength, and formaldehyde. It is determined by the condition of a denaturing agent such as mid. Examples of “highly stringent conditions” for such hybridization and washing are: 0.0015M sodium chloride, 0.0015M sodium taenate !; um, 65-68 ° C. Or 0.005 M salt HJ um, 0.001 5 M sodium citrate, and 50% formamide, 42 ° C.
  • Examples of such other drugs include 0.1% cyserum albumin, 0.1% polybulurpyrrolidone, 0.1% sodium pyrophosphate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (NaDodSO or SDS), Ficoll Denhardt solution, sonicated
  • Salmon sperm DNA or another non-complementary DNA
  • force that is dextran sulfate Other suitable agents can also be used.
  • concentration and type of these additives can be varied without substantially affecting the stringency of the hybridization conditions. No, hybridization experiments are usually carried out at pH 6.8 to 7.4; however, at typical ion intensity conditions, the speed of hybridization is almost pH independent. See Anderson et al., Nucleic Acid Hybridization: A PR Actical Approach Brother 4, IRL Press Limited (Oxford, England).
  • Factors that affect the stability of DNA duplex include base composition, length, and degree of base pair mismatch. Hybridization conditions can be adjusted by those skilled in the art to apply these variables and allow different sequence related DNAs to form hybrids.
  • the melting temperature of a perfectly matched DNA duplex can be estimated by the following equation:
  • N is the length of the double chain formed
  • [Na +] is the molar concentration of sodium ions in the noble, hybridization solution or wash solution
  • % G + C is The percentage of (guanine + cytosine) bases in the.
  • the melting temperature decreases by about 1 ° C for each 1% mismatch.
  • moderately stringent conditions refers to the formation of DNA duplexes that have a higher degree of base pair mismatch than can occur under “highly stringent conditions”. The condition to obtain. Typical examples of “moderate stringent conditions” are: 0.005 M salt water, 0.0015 M sodium quenate, 50-65 ° C, or 0.005 M salt water. 0.0015 M sodium citrate, and 20% formamide, 37-50. C. As an example, “moderately stringent” conditions at 50 ° C. in 0.015 M sodium ion tolerate about 21% mismatch.
  • Tm (2 ° C per A—T base) + (4 ° C per G—C base pair).
  • SSC 6 X sodium citrate
  • an "isolated" biological agent refers to other biological cells within the cells of the organism in which the biological agent is naturally present.
  • Factor e.g., if it is a nucleic acid, a nucleic acid comprising a non-nucleic acid factor and a nucleic acid sequence other than the target nucleic acid; if it is a protein, the non-protein factor and the A protein substantially separated or purified from a protein containing an amino acid sequence other than a protein.
  • isolated nucleic acids and proteins include nucleic acids and proteins purified by standard purification methods. Thus, isolated nucleic acids and proteins include chemically synthesized nucleic acids and proteins.
  • a "purified" biological agent eg, nucleic acid or protein
  • a purified biological agent is one in which at least a portion of the factor that naturally accompanies the biological agent has been removed.
  • the purity of a biological agent in a purified biological agent is usually higher (ie, enriched) than the state in which the biological agent is normally present.
  • the terms "purified” and “isolated” are preferably at least 75% by weight, more preferably at least 85% by weight, even more preferably at least 95% by weight. % And most preferably at least 98% by weight of the same type of biological agent is present.
  • expression of a gene, polynucleotide, polypeptide or the like means that the gene or the like is subjected to a certain action in vivo to take another form.
  • it refers to force transcription and translation of genes, polynucleotides, and the like to form a polypeptide, but transcription and production of mRNA may also be an embodiment of expression.
  • polypeptide forms may be post-translationally processed.
  • such expressed polypeptides can be constitutively or transiently activated Racl.
  • detection or “quantification” of polypeptide expression can be accomplished using any suitable method, including, for example, mRNA measurement and immunoassay methods.
  • molecular biological measurement methods include Northern plot method, dot plot method, and PCR method.
  • immunological measurement method include an ELISA method using a microtiter plate, an RIA method, a fluorescent antibody method, a Western plot method, and an immunohistochemical staining method.
  • quantification methods include ELISA and RIA.
  • expression level refers to polypeptide or m in target cells and the like. The amount by which RNA is expressed. Such expression level is evaluated by any appropriate method including immunological measurement methods such as ELI SA method, RIA method, fluorescent antibody method, Western plot method, immunohistological staining method, etc. using the antibody of the present invention. Expressed in the protein level of the polypeptide of the present invention to be used, or used in the present invention to be evaluated by any suitable method including molecular biological measurement methods such as Northern blotting, dot blotting, and PCR. Expression level of the polypeptide at the mRNA level. “Change in expression level” means expression at the protein level or mRNA level of the polypeptide used in the present invention evaluated by any appropriate method including the above immunological measurement method or molecular biological measurement method. Means that the amount increases or decreases.
  • binding refers to a physical or chemical interaction between two proteins or compounds or related proteins or compounds, or a combination thereof. Means. Bonds include ionic bonds, non-ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals bonds, hydrophobic interactions, and the like.
  • a physical interaction (binding) can be direct or indirect, where indirect is due to or due to the effect of another protein or compound. Direct binding refers to an interaction that does not occur through or due to the effects of another protein or compound and is not accompanied by other substantial chemical intermediates.
  • module or “modify” refer to an increase or decrease or maintenance in a particular activity, quantity or quality or effect of a transcript or protein. means.
  • activity, expression product eg, protein, transcript (such as RNA)
  • “reduction” or “suppression” or synonyms are used to refer to the amount of a particular activity, transcript, or protein. , A decrease in quality or effect, or an activity that decreases.
  • enhanced or “activation” of an activity, expression product eg, protein, transcript (RNA, etc.)
  • synonym is used to refer to the amount of a particular activity, transcript or protein. Increase or increase activity in quality or effect.
  • the term "probe” refers to a substance used as a search means used in biological experiments such as screening in vitro and Z or in vivo. , Examples thereof include, but are not limited to, a nucleic acid molecule containing a specific base sequence or a peptide containing a specific amino acid sequence. In this specification, the probe is used as a marker detection means.
  • Nucleic acid sequences used as probes include nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, more preferably at least 90% homologous, at least 95% homologous to the sequences described above. Is included.
  • search refers to another nucleobase sequence having a specific function and Z or property using a nucleobase sequence electronically or biologically or by other methods.
  • Electronic searches include BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403—410 (1990)), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444- 2448 (1988)), Smith and Waterman method (Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147: 195—197 (1981)), and Needleman and Wunsch method (Needleman an Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443—453 (1970)), but not limited thereto.
  • Bio searches include stringent hybridization, macroarrays with genomic DNA attached to nylon membranes, or microarrays (microarray assembly) attached to glass plates, PCR and in situ hybridizers. Examples include, but are not limited to.
  • the molecular pathway of TSLC1 used in the present invention is described. It is intended that any factor (eg, TSLC1, Tiaml, Rac, etc.) should include the corresponding genes identified by such electronic and biological searches.
  • the percentages of “identity”, “homology” and “similarity” of sequences are determined by comparing two optimally aligned sequences in a comparison window.
  • the portion of the polynucleotide or polypeptide sequence within the comparison window contains a reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (and may contain gaps if other sequences contain additions).
  • the reference sequence herein may contain additions or deletions (ie, gaps) when compared to those with no additions or deletions. Find the number of match positions by determining the number of positions where the same nucleobase or amino acid residue is found in both sequences, and divide the number of match positions by the total number of positions in the comparison window.
  • the prior art [Basic Local Alignment Seul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2267-2268, Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 4 03-410, Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3: 266-272, Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402).
  • a comparison or search can be achieved by performing the following tasks using five dedicated BLAST programs. [0086] (1) Compare amino acid query sequence with protein sequence database in BLASTP and BLAST3;
  • the BLAST program is an analogy called a "high score segment pair" between an amino acid query sequence or a nucleic acid query sequence, and preferably a protein sequence database or nucleic acid sequence database capability.
  • the homologous sequence is identified by specifying the segment. High score segment pairs are preferred, many of which are identified (ie, aligned) by a scoring matrix well known in the art.
  • PAM or PAM250 matrices can also be used (eg Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Res earch See Foundation).
  • the BLAST program evaluates the statistical significance of all identified high score segment pairs, preferably user-defined significance thresholds such as user-specific homology. Select segments that meet the level, preferably using the Karlin equation for statistical significance to assess the statistical significance of high-scoring segment pairs (Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. S ci. USA 87: 2267-2268).
  • the "primer” in the present specification refers to a substance necessary for the start of the reaction of the polymer compound synthesized in the polymer synthase reaction.
  • synthesis Nucleic acid molecules eg, DNA or RNA
  • the primer can be used as a marker detection means.
  • nucleic acid molecules that are usually used as primers include those having a nucleic acid sequence of at least 8 consecutive nucleotides complementary to the nucleic acid sequence of the target gene. Such a nucleic acid sequence is preferably at least 12 contiguous nucleotides of at least 9 contiguous nucleotides, more preferably of at least 10 contiguous nucleotides, more preferably of at least 11 contiguous nucleotides.
  • Nucleic acid sequences used as probes are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, more preferably at least 90% homologous, at least 95% homologous to the sequences described above. Nucleic acid sequences are included.
  • a sequence suitable as a primer may vary depending on the nature of the sequence intended for synthesis (amplification), but those skilled in the art can appropriately design a primer according to the intended sequence. Such primer design is well known in the art, and may be performed manually or using a computer program (eg, LASERGENE, PrimerSelect, DNAStar).
  • contacting refers to bringing a compound in physical proximity, either directly or indirectly, to a polypeptide or polynucleotide of the present invention. Means that.
  • the polypeptide or polynucleotide can be present in many buffers, salts, solutions, and the like.
  • Contact includes placing the compound in, for example, a beaker, microtiter plate, cell culture flask, or microarray (eg, gene chip) containing a polypeptide encoding a nucleic acid molecule or fragment thereof.
  • biological activity refers to an activity that a certain factor (for example, a polypeptide or a protein) can have in a living body, and an activity that exhibits various functions. Is included.
  • a certain factor for example, a polypeptide or a protein
  • its biological activity includes the activity of that ligand binding to the corresponding receptor.
  • the biological activity is at least any factor in the molecular pathway of TSLC1 (eg, TSLC1, Includes at least one of the activities of Tiaml, Racl, etc.
  • biological activity includes activity as a transcription factor (eg, the ability of any factor in the molecular pathway of TSLC1 (eg, the ability to bind a consensus sequence of TSLC1, Tiaml, Racl, etc.)).
  • a transcription factor eg, the ability of any factor in the molecular pathway of TSLC1 (eg, the ability to bind a consensus sequence of TSLC1, Tiaml, Racl, etc.)).
  • TSLC1 eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.
  • examples include, but are not limited to. Specific examples include the following.
  • the method for detecting gene transcripts of any factor in the TSLC 1 molecular pathway (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.) in the collected cells is not particularly limited, but the following method is adopted. be able to.
  • heparinized peripheral blood is first collected from the patient to be diagnosed. This heparinian peripheral blood is subjected to specific gravity centrifugation to separate mononuclear cells. Separated mononuclear cells are used as patient specimens.
  • CD4 positive T lymphocytes from healthy individuals are used as control samples. Healthy human CD4-positive T lymphocytes can be isolated after heparinized peripheral blood collected from healthy humans is converted to CD8 and unnecessary cells are precipitated using an antibody mixture.
  • the patient sample and control sample were cell-solubilized using Trizol solution, and RN Separate into A and DNA 'protein' and other fractions.
  • RNA synthesize single-stranded cDNA with reverse transcriptase using oligo dT primer.
  • the synthesized cDNA is used as a saddle type, and DNA synthesis is performed by a thermorecycler using Taq DNA polymerase with a TSLC1-specific primer.
  • a TSLC1-specific primer a pair of oligonucleotides having the following sequences can be used.
  • the TSLC1-specific primer is not limited to the oligonucleotide having the above-mentioned sequence ability, and can be appropriately designed based on the base sequence of the TSLC1 gene.
  • a TSLC1-specific primer in the base sequence of the TSLC1 gene shown in SEQ ID NO: 2, it is preferable to design a TSLC1-specific primer so that the 445th to 721st regions can be amplified.
  • the amplification of the 445th to 721st regions is not limited to this, which is preferable because amplification of nonspecific nucleic acid fragments can be prevented.
  • other factors in the molecular pathway of TSLC1 eg, TSLCl, Tiaml, Racl, etc.
  • the conditions of the thermal cycler in the above-described DNA synthesis are not particularly limited. C5 min 1 cyclore, 94. C30 deficiency, 60. C30 deficiency and 72. C1 min 30 cycles, 72 ° C 5 min 1 cycle.
  • the synthesized DNA solution can be separated by, for example, agarose gel electrophoresis, visualized by DNA staining, and the expression level can be examined using a DNA imaging device.
  • the ratio of TSLC1 gene transcript in the patient sample to TSLC1 gene transcript in the control sample is 3 times or more, preferably 5 times or more, the patient has developed cancer! / Can be diagnosed.
  • RNA synthesis is performed using a real-time PCR device using fluorescently labeled specific synthetic oligonucleotides.
  • specific synthetic oligonucleotides include, but are not limited to, those consisting of the following sequences.
  • the specific synthetic oligonucleotide is not limited to those having the above-described sequence ability, and can be appropriately designed based on the base sequence of the TSLC1 gene.
  • the base sequence of the TSLC 1 gene shown in SEQ ID NO: 2 it is preferable to design a specific synthetic oligonucleotide so as to hybridize with the region 1159-1180. 1159-When hybridizing with the 1180th region, it is preferable because non-specific hybridization of specific synthetic oligonucleotide can be prevented.
  • any factor in the molecular pathway of TSLC1 eg TSLC1, Tiaml, Racl, etc.
  • the conditions for DNA synthesis in the real-time PCR apparatus are not particularly limited. For example, 94 ° C for 5 minutes per cycle, 94 ° C for 30 seconds, and 60 ° C for 1 minute for 40 cycles.
  • the amount of DNA corresponding to the number of synthesis is quantified by fluorescent color development using a spectrofluorometer provided in the real-time PCR device.
  • the actin gene and the like can be simultaneously measured as a control, and the amount of the TSLC1 gene transcript can be averaged and quantified based on the actin gene expression level.
  • the real-time PCR apparatus it is not necessary to first separate amplified DNA fragments by electrophoresis, so that analysis can be performed very easily and rapidly.
  • the real-time PCR apparatus can compare the amount of product in a region where amplification occurs exponentially, so that more accurate quantitative analysis can be performed.
  • Diagnosis force As a method for detecting TSLC1 gene transcripts in collected cells, collect the patient sample and control sample in the same manner as the above “RT-PCR”, isolate RNA in the same way, and then use the TSLC1 gene The TSLC1 gene transcript may be detected by using an oligonucleotide that specifically hybridizes to the mRNA. In addition, RNA was isolated by the same method as RT-PCRJ, and cDNA was synthesized. Use a specifically hybridizing probe to detect the TSLC1 gene transcript.
  • the probe is not particularly limited, but, for example, TSLC1 gene 411 ⁇
  • a nucleic acid fragment having a sequence complementary to position 1371 can be used.
  • the probe is not limited to the one having the above-mentioned sequence ability, and can be appropriately designed based on the base sequence of the TSLC1 gene.
  • the probe in the base sequence of the TSLC1 gene shown in SEQ ID NO: 2, it is preferable to design the probe so as to hybridize with the region 411 to 1371.
  • probes can be similarly designed for any factor in the molecular pathway of other TSLC1 (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.).
  • TSLC1 antibody When detecting TSLC 1 protein contained in cells or serum, an antibody that specifically recognizes TSLC 1 protein (hereinafter referred to as TSLC1 antibody) is prepared.
  • the TSLC1 antibody can be produced using a conventionally known method.
  • the TSLC1 antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • Antibodies can be produced in the same manner for any factor in the molecular pathway of other TSLC1 (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.).
  • TSLC1 monoclonal antibody is a clone that prepares an antibody that specifically inhibits TSLC1 activity from the resulting hyperidoma by preparing hyperpridoma by cell fusion between antibody-producing cells obtained from an animal immunized with an antigen and myeloma cells. It can be prepared by selecting.
  • Examples of the TSLC1 protein used as an antigen for animal immunization include all or a part of the amino acid sequence of the TSLC1 protein prepared by recombinant DN method or chemical synthesis.
  • a peptide having amino acid sequence from 431 to 442 in the amino acid sequence of TSLC protein shown in SEQ ID NO: 1 should be used as an antigen.
  • a TSLC1 monoclonal antibody for specifically detecting TSLC1 protein present on the cell surface a peptide having amino acid sequence from 232 to 247 in the amino acid sequence of TSLC1 protein shown in SEQ ID NO: 1 is used as an antigen. It is preferable to do this.
  • TSLC1 monoclonal antibody for specifically detecting solubilized TSLC1 protein present in blood
  • the amino acid sequence of TSLC1 protein shown in SEQ ID NO: 1 is located at positions 315 to 331 (the soluble specific region is A peptide comprising the amino acid sequence of (including) is preferably used as the antigen.
  • Antigens can be similarly designed for other factors in the molecular pathway of TSLC1 (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.).
  • TSLC1 for antigen is bound to a carrier protein (for example, thyroglobulin).
  • a carrier protein for example, thyroglobulin
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant and Freund's incomplete adjuvant, and any of these may be mixed.
  • the antigen obtained as described above is administered to mammals such as mammals such as mice, rats, horses, monkeys, rabbits, goats, and hidges.
  • Immunization can be performed by any existing method, but is mainly performed by intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, or the like.
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed at intervals of several days to several weeks, preferably 4 to 21 days.
  • Antibody-producing cells are collected 2-3 days after the last immunization.
  • Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood cells. Generally, spleen cells are used.
  • the immunization amount of the antigen is, for example, 100 / zg per mouse at a time.
  • the antibody titer in the blood of the immunized animal or the culture supernatant of the antibody-producing cell was selected.
  • the antibody titer is measured.
  • the antibody detection method include known techniques such as EIA (Enzym Immunoassay), RIA (Radio Immunase), ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), and the like.
  • myeloma (myeloma) cells to be fused with antibody-producing cells cell lines derived from various animals such as mice, rats, humans and generally available to those skilled in the art are used.
  • the cell line used is drug resistant and in a non-fused state a selective medium (for example HAT medium). ) That cannot survive and can only survive in a fused state.
  • An 8-azaguanine resistant strain is generally used, and this cell line lacks hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase and cannot grow in hypoxanthine / aminopterin / thymidine (HAT) medium! / It is.
  • HAT hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase and cannot grow in hypoxanthine / aminopterin / thymidine (HAT) medium! / It is.
  • Myeloma cells are known in various known cell lines such as P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123: 1548-1550), P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978). 81: 1— 7), NS— l (Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511— 519), MPC— 11 (M argulies, DH et al., Cell (1976) 8: 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276: 269-270), FO (de St.
  • P3 P3x63Ag8.653
  • P3x63Ag8U. 1 Current Topics in Microbiology and Immunology (1978). 81: 1— 7
  • Antibody-producing cells can be obtained from spleen cells, lymph node cells and the like. That is, the spleen, lymph nodes, etc. are removed or collected from the various animals, and these tissues are crushed. The obtained disrupted product is suspended in a medium or buffer such as PBS, DMEM, RPMI1640, etc., filtered through a stainless steel mesh, etc., and centrifuged to prepare the desired antibody-producing cells.
  • a medium or buffer such as PBS, DMEM, RPMI1640, etc.
  • cell fusion is performed between the myeloma cell and the antibody-producing cell.
  • Cell fusion is carried out by mixing myeloma cells and antibody-producing cells at a mixing ratio of 1: 1 to 1:10 in an animal cell culture medium such as MEM, DMEM, RPME-1640 medium, It is performed by contacting at 30-37 ° C for 1-15 minutes.
  • a fusion promoter such as polyethylene glycol, polyvinyl alcohol or Sendai virus having an average molecular weight of 1,000 to 6,000 or a fusion virus can be used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device using electric stimulation (for example, electoral position).
  • the target hyperidoma is selected from the cells after cell fusion treatment.
  • Examples of the method include a method utilizing selective growth of cells in a selective medium. That is, after diluting the cell suspension with an appropriate medium, it is plated on a microtiter plate Add a selective medium (HAT medium, etc.), and then replace the selective medium appropriately. As a result, growing cells can be obtained as hybridomas.
  • the screening of wild and ibridoma is performed by limiting dilution method, fluorescence excitation cell sorter method, etc., and finally monoclonal antibody-producing hyperidoma is obtained.
  • Examples of a method for collecting monoclonal antibodies with the acquired nodobridoma power include ordinary cell culture methods and ascites formation methods.
  • Hypridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10-20% urine fetal serum, MEM medium, or serum-free medium under normal culture conditions (for example, 37 ° C, Incubate for 2-14 days at 5% CO concentration)
  • Antibodies are obtained from the culture supernatant.
  • hypridoma is administered into the abdominal cavity of an animal of the same kind as a mammal derived from myeloma cells, and the hyperidoma is proliferated in large quantities.
  • Ascites or serum is collected after 1 to 4 weeks.
  • the term "antigen” refers to antibody production and immune responses such as Z or cell damage by binding to antibodies or binding to specific receptors such as B lymphocytes and T lymphocytes. Substances that cause it (for example, but not limited to proteins, lipids, sugars, etc.). The binding with an antibody or lymphocyte receptor is called “antigecity”. A characteristic that induces an immune response, such as antibody production, is called “immunogenicity”.
  • a substance used as an antigen includes, for example, at least one target substance (for example, protein). The contained substance is preferably full length, but may be a partial sequence as long as it contains at least one epitope capable of inducing immunity.
  • epitope or “antigenic determinant” refers to a site in an antigen molecule to which an antibody or lymphocyte receptor binds.
  • Methods for determining epitopes are well known in the art, and such epitopes can be determined by those skilled in the art using such well known techniques once the primary sequence of the nucleic acid or amino acid is provided.
  • Epitopes can be used as well, even if their exact positions and structures are not necessarily known. Thus, epitopes are involved in recognition by specific immunoglobulins. Or a set of amino acid residues required for recognition by T cell receptor proteins and Z or major histocompatibility complex (MHC) receptors. The term is also used interchangeably with “antigenic determinant” or “antigenic determinant site”. In the immune system field, in vivo or in vitro, epitopes are molecular features (e.g., primary peptide structure, secondary peptide structure or tertiary peptide structure and charge) and are recognized by immunoglobulins, T cell receptors or HLA molecules. Forming a site.
  • MHC major histocompatibility complex
  • Epitopes containing peptides may contain more than two amino acids in a spatial conformation unique to the epitopes.
  • epitopes consist of at least 5 such amino acids, typically consisting of at least 6, 7, 8, 9, or 10 such amino acids.
  • the length of the epitope is generally preferred because it is more similar to the antigenicity of the original peptide, but this may not always be the case considering the conformation.
  • Methods for determining the spatial conformation of amino acids are known in the art and include, for example, X-ray crystallography and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy.
  • identification of epitopes in a given protein is readily accomplished using techniques well known in the art. For example, Geysen et al. (1984) Proc. Natl.
  • a sequence of at least 3 amino acids in length is required, and preferably this sequence is at least 4 amino acids, more preferably at least 5 amino acids, at least 6 amino acids, at least 7 amino acids.
  • An acid, a sequence of at least 25 amino acids in length may be required.
  • Epitopes can be linear or conformational.
  • Macromolecular structures can be described in terms of various levels of organization. For a general discussion of this configuration, see, for example, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3rd edition, 1994), and Cantor and Schimmel, Biophysi cal Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980). See “Primary structure” refers to the amino acid sequence of a particular peptide. “Secondary structure” refers to a locally arranged three-dimensional structure within a polypeptide. These structures are generally known as domains. A domain is a portion of a polypeptide that forms a compact unit of the polypeptide and is typically 50-350 amino acids in length.
  • a typical domain is made from 13 sheets (such as 13 strands) and a stretch, such as a one-helix stretch.
  • “Tertiary structure” refers to the complete three-dimensional structure of a polypeptide monomer.
  • Quaternary structure refers to a three-dimensional structure formed by non-covalent association of independent tertiary units. Anisotropy terms are used in the same way as terms known in the energy field. Therefore, as long as the polypeptide used in the present invention has a higher-order structure having the same ability as any factor in the molecular pathway of active TSL C1 (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.) Polypeptides of various amino acid sequences can also be included.
  • TSLC1 monoclonal antibody prepared as described above, the presence or absence of the TSLC1 protein present on the surface of the cell to be diagnosed can be detected by FACS scanning.
  • a TSLC1 monoclonal antibody obtained by using a peptide consisting of amino acid sequences 232 to 247 in the amino acid sequence of TSLC1 protein shown in SEQ ID NO: 1 as an antigen is used.
  • Antigens can be similarly designed for any factor in the other TSLC1 molecular pathways (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.).
  • a mononuclear cell fraction is isolated from a patient's peripheral blood collected by patient force by specific gravity centrifugation.
  • the TSLC 1 monoclonal antibody obtained as described above is labeled with a fluorescent label.
  • the fluorescence intensity is measured with a FACS scan apparatus, and the number of cells is measured based on the measured fluorescence intensity.
  • TSLC 1 gene or other TSLC 1 molecular pathways in the separated cells eg TSLC1, Tiaml, Racl, etc.
  • TSLC 1-positive cells can be dyed and detailed infected cells can be counted. Furthermore, as will be described later, the onset of cancer can be predicted by measuring the amount of soluble TSLC1 protein contained in the blood. Furthermore, according to this method, HTLV-1 infected cells can be isolated, and abnormal gene expression in infected cells can be identified, so that onset prediction can be made more accurately.
  • TSLC1 protein present in the blood to be diagnosed can be detected using the TSLC1 monoclonal antibody prepared as described above.
  • a TSLC1 monoclonal antibody obtained by using a peptide consisting of amino acids 315 to 331 in the amino acid sequence of TSLC1 protein shown in SEQ ID NO: 1 as an antigen is used.
  • antigens can be similarly designed if there are soluble forms for any factor in the other molecular pathways of TSLC1 (eg TSLC1, Tiaml, Racl, etc.).
  • the TSLC1 monoclonal antibody is adsorbed to the solid phase plate, and then a protein such as BSA is allowed to act on the plate to block nonspecific binding.
  • a protein such as BSA
  • add the enzyme substrate solution for the enzyme and measure the expression level by coloring the enzyme reaction.
  • TSLC1 in cells eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.
  • arbitrary factor in the molecular pathway of TSL C1 in cells or serum eg, According to “detection of a protein of TSLC1, Tiaml, Racl, etc.”
  • expression of TSLC1 gene can be detected using cells or serum collected from a patient to be diagnosed.
  • TSL in cells Reagents containing TSLC1-specific primers, specific synthetic oligonucleotides or probes as described in “Detection of CI gene transcripts” can provide completely novel cancer diagnostic agents.
  • reagents that contain TSLC1 antibodies as described in “Detection of proteins of any factor (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.) in the molecular pathway of TSLC1 in cells or serum” can be used to develop completely new cancer diagnostic agents. Can be provided.
  • Certain amino acids can be replaced with other amino acids in protein structures such as, for example, force thionic regions or substrate molecule binding sites, without an apparent reduction or loss of interaction binding capacity. It is the ability and nature of the protein to define the biological function of a protein. Thus, specific amino acid substitutions can be made in the amino acid sequence or at the level of its DNA coding sequence, resulting in a protein that still retains its original properties after substitution. Thus, various modifications can be made to the peptide disclosed herein or the corresponding DNA encoding this peptide without any apparent loss of biological utility.
  • hydrophobicity index of amino acids can be considered.
  • the importance of the hydrophobic amino acid index in conferring interactive biological functions in proteins is generally recognized in the art (Kyte. J and Doolittle, RFJ Mol. Biol. 157 (1): 105-132, 1982).
  • the hydrophobic nature of amino acids contributes to the secondary structure of the protein produced, and then defines the interaction of the protein with other molecules (eg, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.).
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on their hydrophobicity and charge properties.
  • One amino acid can be replaced by another amino acid with a similar hydrophobicity index and still result in a protein with a similar biological function (eg, a protein equivalent in enzyme activity) are well known in the art.
  • the hydrophobicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5. It is understood in the art that such substitution of amino acids based on hydrophobicity is efficient.
  • hydrophilicity index is also useful for modifying the amino acid sequence of the present invention.
  • the following hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid (+ 3.0 ⁇ 1); glutamate (+ 3.0 ⁇ 1); serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0) Threonine (one 0.4); proline (one 0.5 ⁇ 1); alanine (one 0.5); histidine (-0.5); cysteine (one 1.0); methionine (one 1.3); Valine (one 1.5); leucine (one 1.8); isoleucine (one 1.8); tyrosine (one 2.3); ferulalanin (one 2.5); and tryptophan (one 3.
  • an amino acid can be substituted with another that has a similar hydrophilicity index and still can provide a biological equivalent.
  • the hydrophilicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • “conservative substitution” means that the amino acid substitution is similar to the hydrophilicity index or Z and hydrophobicity index with the amino acid substituted with the original amino acid as described above. This refers to substitution.
  • conservative substitutions are well known to those skilled in the art and include, for example, substitutions within the following groups: arginine and lysine; glutamic acid and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and asparagine; and palin, leucine, and isoleucine However, it is not limited to these.
  • variant refers to a substance in which a part of the original substance such as a polypeptide or polynucleotide has been changed. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. Alleles are genetic variants that belong to the same locus and are distinguished from each other. Therefore, an “allelic variant” , Refers to a variant in an allelic relationship.
  • a “species homologue or homolog” is a homology (preferably at least 60% homology, more preferably at least 80%, at a certain amino acid level or nucleotide level within a species. 85% or higher, 90% or higher, 95% or higher homology).
  • ortholog also called orthologous gene, refers to a gene derived from speciation from a common ancestor with two genes. For example, taking the hemoglobin gene family with multiple gene structures as an example, human and mouse ⁇ -hemoglobin genes are orthologs. Human ⁇ -hemoglobin genes and / 3 hemoglobin genes are paralogs (genes generated by gene duplication). It is. Since orthologs are useful for the estimation of molecular phylogenetic trees, orthologs of any factor in the molecular pathway of TSLC1 of the present invention (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.) may also be useful in the present invention.
  • “conservative (modified) variants” applies to both amino acid and nucleic acid sequences.
  • Conservatively modified with respect to a particular nucleic acid sequence refers to a nucleic acid that encodes the same or essentially the same amino acid sequence, and is essentially identical if the nucleic acid does not encode an amino acid sequence.
  • An array Because of the degeneracy of the genetic code, a large number of functionally identical nucleic acids encode any given protein. For example, the codons GCA, GCC, GCG, and GCU all encode the amino acid alanine. Thus, at every position where an alanine is specified by a codon, the codon can be altered to any of the corresponding codons described without altering the encoded polypeptide.
  • nucleic acid variations are “silent modifications (mutations),” which are one species of conservatively modified mutations. Every nucleic acid sequence herein which encodes a polypeptide also describes every possible silent variation of that nucleic acid. In the field, each codon in nuclear acid (except AUG, which is usually the only codon for methionine, and TGG, which is usually the only codon for tryptophan) 1S produces functionally identical molecules It is thus understood that this can be modified. Thus, each silent variation of a nucleic acid that encodes a polypeptide is implicit in each described sequence. Preferably, such modifications are amino acids that significantly affect the conformation of the polypeptide. In order to avoid in-substitution.
  • amino acid additions, deletions, or modifications can also be made in order to produce functionally equivalent polypeptides.
  • Amino acid substitution refers to substitution of the original peptide with one or more, for example, 1 to: LO, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids.
  • the addition of amino acids means that one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids are added to the original peptide chain.
  • Deletion of amino acids refers to deletion of one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids from the original peptide.
  • Amino acid modifications include, but are not limited to, amidation, carboxylation, sulfation, halogenation, alkylation, glycosylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), and the like.
  • the substituted or added amino acid may be a natural amino acid or a non-natural amino acid, or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.
  • peptide analog refers to a compound that is different from a peptide but is equivalent to at least one chemical or biological function of the peptide.
  • peptide analogs include those in which one or more amino acid analogs are added or substituted to the original peptide.
  • Peptide analogs have the functions of their original peptides (for example, similar pKa values, similar functional groups, similar binding modes with other molecules, Such additions or substitutions are made in such a way that they are practically similar to those of similar sex.
  • Such peptide analogs can be prepared using techniques well known in the art.
  • a peptide analog can be a polymer that includes an amino acid analog.
  • Chemically modified polypeptide compositions in which a polypeptide of the invention is attached to a polymer are included within the scope of the invention.
  • the polymer can be water soluble and can prevent precipitation of the protein in a water soluble environment (eg, a physiological environment).
  • Suitable aqueous polymers may be selected from the group consisting of, for example, the following forces: polyethylene glycol (PEG), monomethoxypolyethylene glycol, dextran, cellulose, or other carbohydrate-based polymers, poly (N-butylpyrrolidone) polyethylene Glycol, Polypropylene glycol Monore homopolymer, Polypropylene oxide / Ethylene oxide copolymer, Polyoxy Ethylated polyols (eg glycerol) and polybulualcohol.
  • This selected polymer is usually modified to have a single reactive group (eg, an active ester for acylation or an aldehyde for alkylation), so that the degree of polymerization is controlled. obtain.
  • the polymer can be of any molecular weight and the polymer can be branched or unbranched and mixtures of such polymers can also be used.
  • This chemically modified polymer of the present invention is selected for use by a pharmaceutically acceptable polymer when determined for therapeutic use.
  • the polymer should have a single reactive ester group.
  • the polymer should have a single reactive aldehyde group.
  • Preferred reactive aldehydes are polyethylene glycol, propionaldehyde (the propionaldehyde is water soluble) or mono-C1-C10 alkoxy derivatives or aryloxy derivatives (eg, US Pat. No. 5,252,52). 714, which is incorporated herein by reference in its entirety).
  • the PEGylation (Pegylation) of the polypeptide of the present invention can be carried out by any PEGylation reaction known in the art as described in the following references, for example: Focus on Growth Factors 3, 4-10 (1992); EP 0 154 316; and EP 0 40 1 384, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • this PEGylation is carried out via a reaction or an alkylation reaction with a reactive polyethylene glycol molecule (or an analogous reactive water-soluble polymer).
  • Preferred water-soluble polymers for PEGylation of the polypeptides of the present invention are Polyethylene glycol (PEG).
  • PEG Polyethylene glycol
  • polyethylene glycol is meant to encompass any form of PEG, where the PEG is another protein (eg, mono (C1-C10) alkoxypolyethylene. Used to derivatize glycol or mono (C1-C10) aryloxypolyethylene glycol).
  • a chemical derivative of the polypeptide of the present invention is converted to a biologically active substance. It can be performed under the appropriate conditions used to react with the limer molecule.
  • Methods for preparing PEGylated polypeptides of the invention generally include the following steps: (a) any factor in the molecular pathway of TSLC1 (eg TSLC1, Tiaml, Racl, etc.) or its activity Reacting the polypeptide with polyethylene glycol (eg, a reactive ester or aldehyde derivative of PEG) under conditions such that the type or active agent binds to one or more PEG groups; and (b) Obtaining this reaction product. Based on known parameters and the desired result, it is easy for a person skilled in the art to select the optimal reaction conditions or the acylation reaction.
  • PEGylated polypeptides of the invention can generally be used to treat conditions that can be alleviated or modulated by administering the polypeptides described herein, however,
  • the chemically derivatized polypeptide molecules of the invention disclosed herein may have additional activity, increased or decreased biological activity, or others compared to their non-derivative molecules. Characteristics (eg, increased or decreased half-life).
  • the polypeptides, fragments, variants and derivatives thereof of the invention can be used alone, in combination, or in combination with other pharmaceutical compositions.
  • Such a nucleic acid can be obtained by a well-known PCR method or can be chemically synthesized.
  • a site-specific displacement induction method, a hybridization method, or the like may be combined with these methods.
  • substitution, addition or deletion of a polypeptide or polynucleotide refers to an amino acid or its substitute, or nucleotide, respectively, with respect to the original polypeptide or polynucleotide. Or its substitute power is replaced, added or removed.
  • substitution, addition, or deletion techniques are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques. Any number of substitutions, additions or deletions may be used, as long as it is one or more. Such numbers may be used in the variants having the substitutions, additions or deletions (eg, cancer markers, nerves). As long as the disease marker, etc.) is retained, it can be increased. For example, such a number can be one or several, and preferably 20% of the total length Or less, 10% or less, or 100 or less, 50 or less, 25 or less, and the like.
  • the polypeptide used in the present invention may be derived from any organism.
  • the organism is a vertebrate (eg, mammal, reptile, amphibian, fish, bird, etc.), more preferably a mammal (eg, rodent (mouse, rat, etc.), primate ( Etc.).
  • the polypeptide used in the present invention may be a synthesized polypeptide as long as a desired effect is exhibited.
  • Such polypeptides can be synthesized by synthetic methods well known in the art. For example, the synthesis method using an automatic solid phase peptide synthesizer is described in Stewart, JM et al. (1984). Solid Phase Peptide Synthesis, Pierc Chemical Co .; Grant, GA (1992).
  • TSLC 1 used in the present invention
  • TSLC1 TS LC1, Tiaml, Racl, etc.
  • fragments and variants thereof can be produced using genetic techniques.
  • vector refers to a vector that can transfer a target polynucleotide sequence to a target cell.
  • Such vectors include forces capable of autonomous replication in host cells such as individual animals, or staining. Examples are those that can be threaded into the body and contain a promoter at a position suitable for transcription of the polynucleotide of the present invention.
  • a vector can be a plasmid.
  • virus vector refers to a vector derived from a virus.
  • virus refers to an infectious microstructure that has either DNA or RNA as a genome and that grows only in infected cells. Viruses include Retroviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Noramixowinoles, Orthomyxoviridae, Bujaviridae, Rhabdoviridae, Box Winores, Herpesviridae, Examples include viruses belonging to the family selected from the group consisting of the Baculovirus family and the Hepadnaviridae family.
  • retrovirus refers to a virus having genetic information in the form of RNA and synthesizing DNA from the RNA information by reverse transcriptase.
  • retroviral vector refers to a form in which a retrovirus is used as a gene carrier or hand (vector).
  • retroviral vector examples include retroviral expression vectors based on Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) and Murine Stem Cell Virus (MSCV). Is not limited to them.
  • retroviral vectors include, but are not limited to, pGen 1, pMSCV, and the like.
  • an "expression vector” refers to a structural gene and a promoter that regulates its expression, in which various regulatory elements are operably linked in a host cell.
  • the regulatory element may preferably include a terminator, a selectable marker such as a drug resistance gene, and an enhancer.
  • the type of expression vector of an organism eg, animal
  • the type of regulatory element used can vary depending on the host cell.
  • the expression vector used in the present invention may further contain pCAGGS (Niwa H et al, Gene; 108: 193-9 (1991)).
  • the term "recombinant vector” refers to a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence to a target cell.
  • Such vectors include individual animals Examples thereof include those that can autonomously replicate in a host cell such as those described above and can be integrated into a chromosome and contain a promoter at a position suitable for transcription of the polynucleotide of the present invention.
  • recombinant vectors for animal cells include pcDNAlZAmp, pcDNAI, pCDM8 (all available from Funakoshi), pAGE107 (JP-A-3-22979, Cytotechnology, 3, 133 (1990)). , PREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J. Bio chem., 101, 1307 (1987)), pAMo, pAMoA (j. Biol. Chem., 268, 22782-22787 (1993)), pCAGGS (Niwa H et al, Gene; 108: 193-9 (1991)).
  • terminal is located downstream of a gene-coding region of a gene, and is a sequence involved in termination of transcription when DNA is transcribed into mRNA and addition of a poly A sequence. It is. Terminators are known to be involved in mRNA stability and affect gene expression levels. Terminators include, but are not limited to, CaMV35S terminator, nopaline synthase gene terminator (Tnos), and tobacco PRla gene terminator in addition to mammalian terminators.
  • promoter refers to a region on DNA that determines a transcription start site of a gene and directly regulates its frequency, and a base sequence that initiates transcription by binding RNA polymerase. It is. Since the promoter region is usually within about 2 kbp upstream of the first exon of the putative protein coding region, the protein coding region in the genomic nucleotide sequence can be predicted by using DNA analysis software. The motor area can be estimated.
  • the putative promoter region varies for each structural gene, but is usually upstream of the structural gene, but is not limited to this and may be downstream of the structural gene. Preferably, the putative promoter region is present within about 2 kbp upstream from the first exon translation start point.
  • site specificity means that in a part of an organism (for example, an animal) (for example, in the case of an animal, heart, cardiomyocyte, etc.). Specificity of gene expression. “Time-specific” refers to living things (eg animals ) The specificity of expression of the gene according to a particular stage (eg, at the time of an attack). Such specificity can be introduced into the desired organism by selecting an appropriate promoter.
  • the expression of the promoter of the present invention is "constitutive" means that, in all yarns and tissues of an organism, the growth or early stage of the organism is shifted. Even so, it is a property that is expressed in an almost constant amount. Specifically, when Northern plot analysis is performed under the same conditions as in the examples of the present specification, for example, expression is substantially observed at any time point (for example, at two or more identical or corresponding sites). In the definition of the present invention, the expression is constitutive, and it is considered that the constitutive promoter plays a role in maintaining the homeostasis of an organism in a normal growth environment.
  • Stress responsiveness refers to the property that the expression level changes when an organism is given at least one stress (e.g., a stimulation of divergence). ,,,, And the property of decreasing the expression level are called “stress reduction”! The expression of “stress reduction” is based on the premise that expression is seen in normal conditions.
  • Ennossa can be used to increase the expression efficiency of a target gene.
  • En'no ⁇ capacitors 1 ⁇ human cytomegalovirus immediate- early enha ncer
  • Multiple enhancers can be used, but one may or may not be used.
  • operably linked means expression of a desired sequence (operation). It is arranged under the control of a transcriptional translational regulatory sequence (for example, promoter, henno, sensor, etc.) or a translational regulatory sequence.
  • a transcriptional translational regulatory sequence for example, promoter, henno, sensor, etc.
  • a translational regulatory sequence for example, promoter, henno, sensor, etc.
  • a promoter In order for a promoter to be operably linked to a gene, it is usually not necessary to place the promoter immediately adjacent to the gene.
  • the present invention may be utilized in any animal. Techniques for use in such animals are well known and commonly used in the art, such as Aus ubel FA et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York. NY; Sambrook J et al. (1987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Old Spring Harbor, NY Company, 1997, etc.
  • transformant refers to all or part of a living organism such as a cell produced by transformation. Examples of the transformant include animal cells. A transformant is also referred to as a transformed cell, transformed tissue, transformed host, etc., depending on the subject, and encompasses all of these forms herein, but in certain contexts. Can refer to a specific form.
  • animal is used in the broadest sense in the art, and includes vertebrates and invertebrates. Examples of animals include, but are not limited to, mammals, birds, reptiles, amphibians, fishes, worms and worms. Preferably, the animal includes a mammal.
  • polypeptides, nucleic acids, kits, systems, compositions and methods used in the present invention will function not only in mammals, but in whole animals, including other animals. It is. This is because ligands corresponding to arbitrary factors in the molecular pathway of TSLC1 (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.) are known to exist in organisms other than mammals.
  • TSLC1 eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.
  • cell is defined in the same way as the broadest meaning used in the field, and is a structural unit of a tissue of a multicellular organism and is enclosed in a membrane structure that isolates the outside world. Rare, self-regenerative ability inside, genetic information and its expression mechanism A life form.
  • tissue of an organism refers to a population of cells having a certain similar action in the population.
  • a tissue can be a part of an organ.
  • organ organ
  • cells there are many cells having the same function, but there are also cases where slightly different functions are mixed, so in this specification, as long as the tissue shares certain characteristics, You can have a mix of cells.
  • organ refers to a structure that has one independent form and that combines one or more tissues to perform a specific function.
  • animals include stomach, liver, intestine, spleen, lung, trachea, nose, heart, artery, vein, lymph node (lymphatic system), thymus, egg layer, eye, ear, tongue, skin, etc. It is not limited.
  • transgene refers to an organism (including an animal (such as a mouse) or a plant) that has been incorporated into an organism having a specific gene or has been incorporated therein.
  • a transgenic organism when used in the present invention, such a transgenic organism can be selected from a microinjection method (microinjection method), a viral vector method, an ES cell method (embryonic stem cell method), a sperm It can be produced using a transgenic animal production technique utilizing a vector method, a method for introducing a chromosome fragment (transzomic method), an episome method, or the like. Techniques for producing such transgenic animals are well known in the art.
  • screening refers to selecting a target such as a target organism or substance having a specific property from a large population using a specific operation Z evaluation method.
  • an agent eg, antibody
  • polypeptide or nucleic acid molecule of the invention can be used.
  • the screening may be performed using a library generated using an in silico (computer system) system that may use a system using a real substance such as in vitro or in vivo.
  • in silico computer system
  • compounds obtained by screening with the desired activity are also included within the scope of the present invention.
  • the present invention also contemplates providing a drug by computer modeling based on the disclosure of the present invention.
  • the present invention relates to a candidate combination that modulates the ability to bind to, or the activity of, the protein of the present invention or the polypeptide of the present invention, or a biologically active portion thereof.
  • Test compounds of the present invention can be obtained using any of a number of approaches in a combinatorial library methodology known in the art, including the following: biological libraries; spatial Accessible parallel solid phase or solution phase libraries; a synthetic library method that requires deconvolution; a “one-bead one-rich” library method; and a synthetic library that uses affinity chromatography selection One law.
  • the biological library approach is limited to peptide libraries, but the other four approaches are applicable to small libraries of peptides, non-peptide oligomers or compounds (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12 : 145).
  • the present invention provides an active ingredient of the present invention (eg, polypeptide or As a tool for screening factors that are as effective as nucleic acids), compounds obtained using computational structure activity relationship (QSAR) modeling technology are also available.
  • the computer technology includes creation of a substrate cage type, a pharmacophore, and a homology model of the active site of the present invention produced by several computers.
  • methods for modeling the normal characteristic groups of an interacting substance for a substance from in vitro data are described by the CATALYST TM pharmacophore method (Ekins et al., Pharmacogenetics, 9: 477-489, 1999). ; Ekins et al., J. Pharm acol. & Exp. Ther., 288: 21-29, 1999; Ekins et al., Pharmacol. &
  • Fitting a compound to the active site can be performed using any of a variety of computer modeling techniques known in the art. Visual inspection and manual manipulation of compounds to active sites are described in QUANTA (Molecular Simulations, Burlington, MA, 1992), SYBYL (Molecular Modeling Software, Tripos Associates, Inc., St. Louis, MO, 1992), AMBER (Weiner et a 1., J. Am. Chem. Soc., 106: 765—784, 1984), CHARMM (Brooks et a 1., J. Comp. Chem., 4: 187-217, 1983), etc. You can use a program like this. In addition, energy can be minimized by using a standard force field such as CHARMM, AMBER, etc.
  • composition prepared by the agent of the present invention can be provided in any pharmaceutical form as long as it is in a form suitable for transfer to an organism.
  • dosage forms include solutions, injections, and sustained release agents.
  • administration routes include oral administration, parenteral administration, and direct administration to the affected area.
  • Injections can be prepared by methods well known in the art. For example, after being dissolved in a suitable solvent (saline, buffer solution such as PBS, sterilized water, etc.), sterilized by filtration with a filter or the like, and then filled into a sterile container (for example, an ampule). Can be prepared. This injection may contain a conventional pharmaceutical carrier if necessary. Administration methods using non-invasive catheters can also be used.
  • a suitable solvent saline, buffer solution such as PBS, sterilized water, etc.
  • a sterile container for example, an ampule.
  • This injection may contain a conventional pharmaceutical carrier if necessary.
  • Administration methods using non-invasive catheters can also be used.
  • an agent of the present invention eg, any factor in the molecular pathway of active TSLC1 (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.) or a nuclear acid encoding the same
  • TSLC1 eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.
  • the sustained-release form can be any form known in the art as long as it can be used in the present invention.
  • Such a form may be, for example, a rod-like (pellet-like, cylinder-like, needle-like, etc.), tablet-like, disc-like, spherical or sheet-like preparation.
  • sustained release forms are known in the art and are described, for example, in the Japanese Pharmacopeia, the US Pharmacopeia and pharmacopoeia in other countries.
  • a sustained-release agent sustained administration agent
  • aqueous suspension injection oil injection or oil suspension injection
  • emulsion injection oZw type, wZo type emulsion injection, etc.
  • composition or kit of the present invention may further comprise a biocompatible material.
  • This biocompatible material is, for example, silicone, collagen, gelatin, glycolic acid'lactic acid copolymer, ethylene vinyl acetate copolymer, polyurethane, polyethylene, polytetrafluoroethylene, polypropylene, polyacrylate, polymetathali It may include at least one selected from the group consisting of rates. Silicone is preferred because it is easy to mold.
  • biodegradable polymers include collagen, gelatin, ahydroxycarboxylic acids (eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid), hydroxydicarboxylic acids (eg, malic acid) and hydroxytricarboxylic acids (eg, Polymers, copolymers or mixtures thereof synthesized from non-catalytic dehydration polycondensation from one or more selected from the group consisting of citrate and the like, poly ⁇ -cyanacrylates, polyamino acids (e.g. poly 1 ⁇ -benzyl-L glutamic acid, etc.), and maleic anhydride-based copolymers (eg, styrene maleic acid copolymer, etc.) polyanhydrides.
  • ahydroxycarboxylic acids eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid
  • hydroxydicarboxylic acids eg, malic acid
  • hydroxytricarboxylic acids eg, Polymers, copolymers or
  • the polymerization type may be random, block, or graft.
  • a-hydroxycarboxylic acids, hydroxydicarboxylic acids, and hydroxytricarboxylic acids have an optically active center in the molecule, D-form, L-form, DL Any body can be used.
  • a glycolic acid / lactic acid copolymer may be used.
  • the nucleic acid molecule can be administered in a non-viral vector form or in a viral vector form, or in a form of direct administration with naked DNA.
  • Such administration forms are well known in the art.
  • the separate experimental medicine "Basic technology of gene therapy” Yodosha, 1996; the separate experimental medicine “gene introduction & expression analysis experiment method” Yodosha, It is explained in detail in 1997.
  • a nucleic acid comprising a normal gene nucleic acid sequence of the invention, a sequence encoding an antibody or functional derivative thereof, is associated with aberrant expression and Z or activity of a polypeptide of the invention.
  • Gene therapy is expressed or can be expressed Active nucleic acid is administered to a subject.
  • the nucleic acids produce their encoded protein, which mediates a therapeutic effect.
  • the present invention encodes any factor (for example, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.) in the molecular pathway of TSLC1, or a variant or fragment thereof, using the diagnosis result of the diagnostic agent of the present invention.
  • Gene therapy using nucleic acid molecules can be useful.
  • nucleic acid molecules are introduced using ribosomes (liposome method, HVJ-ribosome method, catonic ribosome method, ribofectin method, lipofectamine method, etc.), microinjection method, gene
  • ribosomes liposome method, HVJ-ribosome method, catonic ribosome method, ribofectin method, lipofectamine method, etc.
  • microinjection method gene
  • a method of transferring a nucleic acid molecule into a cell together with a carrier (metal particle) with a gun (Gene Gun) can be used.
  • expression vectors include pCAGGS (Gene 108: 193-9, Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J (1991)), pBJ—CMV, pcDNA3.1, pZeoSV (Invitrogen, Strata gene, etc. are available) Etc.
  • HVJ-ribosome method a nucleic acid molecule is encapsulated in a ribosome produced by a lipid bilayer membrane, and this ribosome and inactivated Sendai virus (Hemagglutinating virus of Jap an, HVJ).
  • This HVJ-ribosome method is characterized by a much higher fusion activity with the cell membrane than the conventional liposome method.
  • the HVJ—ribosome preparation method is described in detail in the separate experimental medicine “Basic technology of gene therapy” Yodosha, 1996; separate experimental medicine “Genetic introduction and expression analysis experiment method” Yodosha, 1997. Any strain can be used as HVJ (for example, ATCC VR-907, ATCC VR-105, etc.), and Z strain is preferable.
  • a viral vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus
  • DNA such as detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, potas virus, poliovirus, Sindbis Vinores, Sendai virus, SV40, human immunodeficiency virus (HIV)
  • Any factor in the molecular pathway of active TSLC1 eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.
  • TSLC1 eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.
  • a gene can be introduced into a cell or tissue by introducing a nucleic acid that encodes and infecting the cell or tissue with this recombinant virus.
  • adenoviral infection efficiency is
  • the above-mentioned expression plasmid which is a non-viral vector, is dissolved in physiological saline and administered as it is.
  • physiological saline for example, by the method described in Tsurumi Y, Kearney M, Chen D, Silver M, Takeshita 3 ⁇ 4, Yang J, Symes JF, Isner JM., Circulation 98 (Suppl. 11), 382-388 (1997), It can be injected directly into organ tissues.
  • a polypeptide as an active ingredient contained in the yarn composition and kit of the present invention (eg, any factor in the molecular pathway of active TSLC1 (eg, TSLC1, Timl, Racl, etc.)) )
  • TSLC1 any factor in the molecular pathway of active TSLC1 (eg, TSLC1, Timl, Racl, etc.)
  • the lower limit of the amount range of this polypeptide is about 1 g, about 2 g, about 3 g, about 4 g, about 5 g, about 6 g, about 7 ⁇ g, about 8 g, about 9 g, about 10 g, about 15 g, about 20 g, etc., any between about 1 ⁇ g to about lmg It can be a numerical value.
  • the upper limit of the amount range of this polypeptide is, for example, about 1000 mg, about 9 OO mg, about 800 mg, about 700 mg, about 600 mg, about 500 mg, about 400 mg, about 300 mg, about 2 OO mg, about 100 mg, about 75 mg, about 50 mg. , About 25 mg, about 10 mg, about 5 mg, etc., and any number from about 1000 mg to about 1 mg.
  • the active ingredient of the present invention is a nucleic acid form (eg, a nucleic acid encoding any factor in the molecular pathway of active TSLC1 (eg, TSLC1, Tiaml, Racl, etc.) or any factor in the molecular pathway of TSLC1 (eg, , TSLC1, Tiaml, Racl, etc.) (for example, for adults (body weight about 60 kg)) about: L g to about 10 mg, preferably about 1 ⁇ g to about 1000 ⁇ g, more preferably It can be from about 5 ⁇ g to about 400 ⁇ g.
  • the lower limit of the amount range of this nucleic acid is about 1 g, about 2 g, about 3 g, about 4 g, about 5 g, about 6 g, about 7 g, about 8 g, about 9 g, It may be any number between about 1 ⁇ g and about 20 g, such as about 10 g, about 15 g, about 20 g.
  • the upper limit of the amount range of this nucleic acid is, for example, about 10 mg, about 9 mg, about 8 mg, about 7 mg, about 6 mg, about 5 mg, about 4 mg, about 3 mg, about 2 mg, about lmg, about 750 ⁇ g, about 500 ⁇ g.
  • g about 250 ⁇ g, about 100 ⁇ g, etc., and can be any number from about 10 mg to about 10 ⁇ g.
  • SCF cell bioactive substances
  • the above amounts are applied individually.
  • the administration frequency include daily administration once every several months (for example, once a week—once a month).
  • the "instruction” describes an explanation for a person who administers the method of administering the medicine of the present invention, such as a doctor or a patient.
  • This instruction describes a word for instructing administration of the medicine of the present invention.
  • the instruction sheet may include a word that instructs administration (for example, by injection) to skeletal muscle as an administration site.
  • These instructions are prepared according to the format prescribed by the national regulatory agency (for example, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan and the Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc.) in the country where the present invention is implemented and approved by the regulatory agency It is clearly stated that it has been received.
  • the instructions are so-called package inserts and are usually provided in paper media, but are not limited to such media, for example, electronic media (for example, home pages provided on the Internet, electronic mail). Can also be provided.
  • subject refers to an organism to which the treatment of the present invention is applied, and is also referred to as "patient”.
  • patient refers to an organism to which the treatment of the present invention is applied, and is also referred to as “patient”.
  • patient or subject may preferably be a human.
  • a "recipient” is also referred to as an individual receiving a substance! /, Or a "host”.
  • an individual who provides a substance is called a “donor”.
  • in vivo refers to the inside of a living body.
  • in vivo refers to the location where a target substance is to be placed.
  • in vitro refers to a state in which a part of a living body is removed or released “outside the living body” (for example, in a test tube) for various research purposes. It is a term that contrasts with in vivo.
  • ex vivo refers to a case where target cells for gene transfer are extracted from a subject, a therapeutic gene or factor is introduced in vitro, and then returned to the same subject again. A series of operations is called ex vivo.
  • Polypeptides, nucleic acids, pharmaceuticals and compositions prepared by such polypeptides or nucleic acids used in the present invention may be in any preparation form as long as they are in a form suitable for transfer to an organism.
  • examples of such a preparation form include liquids, injections and sustained-release agents.
  • Administration methods include oral administration and parenteral administration (e.g., intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, mucosal administration, rectal administration, intravaginal administration, topical administration to affected areas, skin administration, etc.) And direct administration to the affected area.
  • Formulations for such administration can be provided in any pharmaceutical form. Examples of such a preparation form include liquids, injections, and sustained release agents.
  • compositions and medicaments of the present invention may be in the form of orally acceptable aqueous solutions that do not contain pyrogens when administered systemically.
  • the preparation of such pharmaceutically acceptable protein solutions is within the skill of the artisan, provided that considerable attention is paid to pH, isotonicity, stability, and the like.
  • the solvent used for pharmaceutical formulation in the present invention may have either aqueous or non-aqueous properties.
  • the vehicle can be used to modify or maintain the formulation's pH, osmolality, viscosity, clarity, color, sterility, stability, isotonicity, disintegration rate, or odor. It may contain material.
  • the composition of the present invention comprises an active ingredient. Other formulation materials may be included to modify or maintain the rate of release of or to facilitate absorption or permeation of the active ingredient.
  • the present invention when formulated as a pharmaceutical or pharmaceutical composition, is optionally physiologically acceptable carriers, excipients or stabilizers (Remington's Pharmaceutical sciences, 18th Edition, AR Gennaro, ed., MacK Publishing Company, 1990) and a selected composition having the desired degree of purity, prepared for storage in the form of a lyophilized cake or aqueous solution. Can be done.
  • Suitable pharmaceutically acceptable factors include, but are not limited to, antioxidants, preservatives, colorants, flavors, and diluents, emulsifiers, suspending. Agents, solvents, fillers, bulking agents, buffering agents, delivery vehicles, diluents, excipients and Z or agricultural or pharmaceutical adjuvants.
  • a medicament of the present invention comprises a composition of an active ingredient of the present invention (eg, a polypeptide or nucleic acid) together with one or more physiologically acceptable carriers, excipients or diluents. Can be administered.
  • a suitable vehicle can be water for injection, physiological solution, or artificial cerebrospinal fluid, which can be supplemented with other substances common in compositions for parenteral delivery. It is.
  • acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to the recipient and are preferably inert at the dosages and concentrations used, and include the following: Phosphate, citrate, or other organic acids; antioxidants (eg, ascorbic acid); low molecular weight polypeptides; proteins (eg, serum albumin, gelatin or immunoglobulin); hydrophilic polymers (eg, Amino acids (eg, glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine); monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including glucose, mannose, or dextrin); chelating agents (eg, EDTA) Sugar alcohols (eg, mantol or sorbitol); salt formation versus Io (Eg, sodium); and Z or non-ionic surfact
  • Injections can be prepared by methods well known in the art. For example, after being dissolved in a suitable solvent (saline, buffer solution such as PBS, sterilized water, etc.), sterilized by filtration with a filter or the like, and then filled into a sterile container (eg, ampoule) for injection.
  • a suitable solvent saline, buffer solution such as PBS, sterilized water, etc.
  • An agent can be prepared.
  • This injection may contain a conventional pharmaceutical carrier, if necessary.
  • Methods of administration using non-invasive catheters can also be used.
  • Exemplary suitable carriers include neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin.
  • the medicament of the present invention is formulated as a lyophilization agent using a suitable excipient (eg, sucrose).
  • compositions include Tris buffer at pH 7.0-8.5 or acetic acid buffer at pH 4.0-5.5, which are arabic, sorbitol or a suitable substitute thereof Can be included.
  • the pH of the solution should also be selected based on the relative solubility of the active ingredient of the present invention (such as a polypeptide or nucleic acid) at various pHs.
  • the compositions and medicaments of the present invention may be provided in sustained release form.
  • the active ingredient eg, nucleic acid or polypeptide
  • the sustained-release form can be any form known in the art as long as it can be used in the present invention.
  • Such a form may be, for example, a preparation in the form of a rod (pellet, cylinder, needle, etc.), tablet, disk, sphere, or sheet.
  • Methods for preparing sustained release forms are known in the art and are described, for example, in the Japanese Pharmacopeia, the US Pharmacopeia, and pharmacopoeias in other countries.
  • Examples of the method for producing a sustained-release agent include a method of utilizing dissociation of a drug from a complex, a method of using an aqueous suspension injection solution, and a method of using an oily injection solution or an oily suspension injection solution. And an emulsion injection solution (oZw type, wZo type emulsion injection solution, etc.).
  • the present invention also contemplates administration of additional agents.
  • Such an agent can be any drug known in the art, for example, such an agent can be any drug known in pharmacy (eg, antibiotics, etc.). This However, such a drug can be two or more other drugs. Examples of such drugs include those listed in the latest version of the Japanese Pharmacopeia, the latest version of the US Pharmacopeia, and the latest version of pharmacopoeia in other countries.
  • composition prepared by the methods of the present invention may comprise two or more types of cells.
  • drugs of similar nature or origin may be used, or drugs of different nature or origin may be used!
  • the amount of the polypeptide, nucleic acid, composition and medicament used in the method of the present invention is the purpose of use, the age, size, sex, medical history of the subject, polypeptide, nucleic acid, composition, medicament or drug. These can be easily determined by those skilled in the art in consideration of the cell morphology or type, the cell morphology or type, and the like.
  • the frequency with which the composition of the present invention is applied to an object is also easily determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, the age of the object, the size, sex, medical history, course of treatment, and the like. can do.
  • Examples of the frequency include administration once to several times a day, once every several months every day (for example, once a week and once a month). It is preferable to administer once a week to once a month while watching the course.
  • the disease targeted by the present invention is cancer.
  • cancer refers to a general malignant tumor.
  • examples of cancers particularly targeted by the present invention include solid cancers (particularly small cell lung cancer, colon cancer, ovarian cancer, osteosarcoma, soft tissue sarcoma, and other solid cancers). Therefore, the disease targeted by the present invention may be “small cell lung cancer”.
  • “Cancer” usually refers to the presence of a malignant tumor or the presence of such a malignant tumor that can invade destructively or metastasize into surrounding tissues where atypical growth is faster than normal cells. ⁇ .
  • cancer includes, but is not limited to, solid cancer and hematopoietic tumor.
  • solid cancer refers to cancer having a solid shape, and is a concept confronting hematopoietic tumors such as leukemia.
  • solid cancers include breast cancer, liver cancer, stomach cancer, lung cancer, head and neck cancer, cervical cancer, prostate cancer, retinoblastoma, malignant lymphoma, esophageal cancer, brain tumor, Examples include, but are not limited to, bone tumors.
  • lung cancer refers to lung cancer.
  • Lung cancer is a type of solid cancer. Lung cancer causes tracheal, bronchial, and alveolar cells to lose their normal function and increase randomly It occurs more. Cancer spreads to other organs as it grows by destroying surrounding tissues and organs, often forming a mass. The number of people with lung cancer is increasing worldwide. In 2015, the annual number of new cases of lung cancer in Japan is expected to be 110,000 for men and 37,000 for women. The male-female ratio more than 50 years old is about 3: 1. The annual number of deaths from lung cancer in 1999 was approximately 52,000 (approximately 290,000 people died of cancer, of which approximately 50,000 were stomach cancers). No. 1 for women and No. 2 for women after stomach cancer. The 5-year survival rate (the rate of survival for 5 years from the start of treatment) of lung cancer is 25-30%.
  • Lung cancer is broadly classified into two types: small cell cancer and non-small cell cancer.
  • Non-small cell lung cancer is further classified into tissue types such as adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell carcinoma, and adenosquamous cell carcinoma.
  • tissue types such as adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell carcinoma, and adenosquamous cell carcinoma.
  • the clinical features such as the location where lung cancer is likely to occur, the type and speed of progression, and symptoms are varied, but this is because there are many different tissue types.
  • Adenocarcinoma accounts for 40% of the most common male lung cancer in Japan and more than 70% of female lung cancer.
  • lung cancer has a variety of clinical features, ranging from fast progress to slow progress.
  • the second most common squamous cell carcinoma accounts for 40% of male lung cancer and 15% of female lung cancer.
  • the frequency of cancer called the hilar type that occurs near the bronchi in the lungs is higher than that
  • small cell carcinoma consists of relatively small cells resembling lymphocytes when viewed under a microscope, and appears to be small cells such as oats. It is also called soba cell carcinoma.
  • Small cell cancer accounts for about 15 to 20% of lung cancer and grows quickly. It is easy to metastasize to the brain 'lymph node' liver 'adrenal' bone, etc.!
  • anticancer drugs and radiation therapy are relatively effective, and because it is a type of cancer, it has the special property that knowledge in other cancers is not useful at all. In about 80% or more, cancer cells produce various hormones.
  • Diagnosis of lung cancer is usually performed by bronchoscopy, fine needle aspiration cytology, CT-guided lung needle biopsy, pleural biopsy, lymph node biopsy, and the like.
  • fetal protein CEA is examined, but in small cell cancer, NSE is a marker of neuroendocrine cells because cancer cells also have the characteristics of neuroendocrine cells.
  • the power of ProGRP inspections is the key.
  • stage 0 I, II, III, IV, etc. small cell lung cancer can also be classified into two types: localized type and advanced type.
  • 2-year, 3-year, and 5-year survival rates are said to be approximately 50, 30, and 25%, respectively.
  • advanced chemotherapy is used, the 3-year survival rate is said to be approximately 10% (National Cancer Center, website http: ZZwww. Ncc. Go. Jp / jp / n cc-cis / pub from /cancer/010202.html).
  • anticancer agent selectively suppresses the growth of cancer (tumor) cells, and includes both cancer drugs and radiotherapy.
  • anticancer agents are well known in the art.
  • the anticancer agent Mayual 2nd edition Tsukagoshi Shigeru et al. Chugai Medical Company; Ph armacoiogy; Lippmcott Williams & Wilkms, Inc. Has been.
  • RNAi is an abbreviation for RNA interference, and a homologous mRNA is specifically identified by introducing a factor that causes RNAi, such as double-stranded RNA (also referred to as ds RNA), into a cell. This refers to a phenomenon in which the synthesis of a gene product is inhibited and the synthesis of the gene product is suppressed, and the technology used for it. As used herein, RNAi may also be used interchangeably with factors that cause RNAi in some cases.
  • ds RNA double-stranded RNA
  • factor causing RNAi refers to any factor capable of causing RNAi.
  • factor causing RNAi with respect to “gene” means that an effect of causing RNAi related to the gene and causing RNAi force (for example, suppression of expression of the gene, etc.) is achieved.
  • factors include, for example, a double strand at least 10 nucleotides in length, including a sequence having at least about 70% homology to a part of the nucleic acid sequence of the target gene or a sequence that hybridizes under stringent conditions. Examples include, but are not limited to, RNA containing the portion or variants thereof.
  • the factor preferably comprises a 3 ′ overhang, more preferably the 3 ′ overhang can be 2 or more nucleotides long DNA (eg, 2 to 4 nucleotides long DNA).
  • RNAi is an abbreviation for short interfering RNA, which is artificially chemically synthesized or biochemically synthesized, or synthesized in an organism.
  • RNA-induced-silencing-complex is formed by binding specific protein to this siRNA. This complex recognizes and binds to mRNA having the same sequence as siRNA, and cleaves mRNA at the center of siRNA by RNaselll-like enzyme activity.
  • the relationship between the siRNA sequence and the mRNA sequence cleaved as a target is preferably 100%.
  • siRNA itself can be used as a factor that causes RNAi, and a factor that generates siRNA (for example, a dsRNA of typically about 40 bases or more) is used as such a factor.
  • siRNA acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) by binding the antisense strand of siRNA to mRNA separately from the above pathway. It is also contemplated that dsRNA is synthesized and that this dsRNA is once again a dicer's substrate, generating a new siRNA and amplifying the action. Thus, in the present invention, siRNA itself and factors that give rise to siRNA are also useful. In fact, in insects, for example, 35 molecules of dsRNA have a molecular force of 1,000 copies or more and almost completely degrade the mRNA in cells. Therefore, it is understood that siRNA itself and factors that produce siRNA are useful. The
  • siRNA double-stranded RNA having a length of about 20 bases (for example, typically about 21 to 23 bases in length) or less can be used.
  • siRNA can be used for treatment, prevention, prognosis, etc. of a disease because it suppresses gene expression by expressing in a cell and suppresses expression of a pathogenic gene targeted by the siRNA.
  • siRNA used in the present invention may take any form as long as it can cause RNAi.
  • the agent that causes RNAi of the present invention may be a short hairpin RNA (shRNA) having an overhang at the 3 'end.
  • shRNA short hairpin RNA
  • shRNA is a single-stranded RNA that includes a partially palindromic base sequence, and thus has a double-stranded structure in the molecule, resulting in a hairpin-like structure. A molecule that is more than base pairs.
  • shRNAs are artificially chemically synthesized.
  • such shRNA can be generated by synthesizing RNA in vitro using T7 RNA polymerase with hairpin structure DNA in which the DNA sequences of the sense strand and antisense strand are ligated in the opposite direction.
  • shRNAs are approximately 20 bases long (typically 21 bases, 22 bases, 23 bases) long after they have been introduced into the cell. It should be understood that it is degraded and causes RNAi as well as siRNA and has the therapeutic effects of the present invention. It should be understood that such an effect is exerted in a wide range of organisms such as insects, plants, animals (including mammals). Thus, sh RNA causes RNAi in the same way as siRNA, so it is used as an active ingredient in the present invention. Can.
  • the shRNA may also preferably have a 3 ′ overhang.
  • the length of the double-stranded portion is not particularly limited, but may preferably be about 10 nucleotides or more, more preferably about 20 nucleotides or more.
  • the three protruding ends may be preferably DNA, more preferably DNA having a length of at least 2 nucleotides or more, and further preferably DNA having a length of 2 to 4 nucleotides.
  • the factor that causes RNAi used in the present invention may be an artificially synthesized (for example, chemical or biochemical) or a naturally occurring factor. There is no essential difference in the effect. For chemically synthesized products, purification by liquid chromatography or the like is preferred.
  • RNAi used in the present invention can also be synthesized in vitro.
  • antisense and sense RNAs are synthesized from the truncated DNA using T7 RNA polymerase and T7 promoter. When these are annealed in vitro and then introduced into cells, RNAi is caused through the mechanism described above, and the effects of the present invention are achieved.
  • such RNA can be introduced into cells by the calcium phosphate method.
  • Factors that cause RNAi of the present invention also include factors such as single strands that can hybridize to mRNA, or all similar nucleic acid analogs thereof. Such factors are also useful in the treatment methods and compositions of the invention.
  • RNAi used in the present invention a double-stranded polynucleotide comprising DNA and RNA having substantially the same sequence as at least a part of the base sequence of the target gene is used as a cell or tissue.
  • a method for inhibiting the expression of a target gene characterized by being introduced into an individual can be used.
  • a double-stranded polynucleotide having a single strand having a self-complementarity can be used.
  • the double-stranded polynucleotide may be a hybrid of a DNA strand and an RNA strand.
  • the sense strand can be DNA and the antisense strand can be RNA.
  • the double-stranded polynucleotide used may be a DNA and RNA chimera.
  • the double-stranded polynucleotide force used is at least above the polynucleotide A part of the flow side may be RNA.
  • the upstream portion of the nucleotides used can be 9-13 nucleotide forces.
  • the double-stranded polynucleotide used consists of 19-25 nucleotides, of which at least about 1Z2 upstream can be RNA.
  • RNAi technology there may be multiple target genes! / ⁇ .
  • the effect can be confirmed by analyzing phenotypic changes that appear in the cells, tissues, or individuals.
  • RNAi technology Using RNAi technology, cells, tissues, and certain! / ⁇ can be given specific properties to individuals by inhibiting the expression of the target gene.
  • the functional site of RNA in the RNAi method can be identified by a method including the following steps: (i) a double strand having a sequence substantially identical to at least a part of the base sequence of the target gene (Ii) introducing the double-stranded polynucleotide into a cell, tissue, or individual; and (iii) a target in the cell, tissue, or individual. Measure the degree of gene expression inhibition, and (iv) identify the sequences that are required to be RNA for inhibition of target gene expression.
  • the double-stranded polynucleotide force used either one of the double strands may be the RNA strand.
  • target gene used in RNAi technology refers to a cell, tissue, or individual into which this gene is to be introduced (hereinafter sometimes referred to as “introduced body”). It can be anything that can be translated to produce mRNA, and optionally protein. Specifically, the target to be introduced may be endogenous or exogenous. Further, it may be a gene present on the chromosome or an extrachromosomal one. Examples of exogenous substances include those derived from pathogens such as viruses, bacteria, fungi, or protozoa that can infect the recipient. The function may be known or unknown, or the function may be known in the cells of other organisms, but the function may not be known in the recipient body.
  • a double-stranded polynucleotide consisting of DNA and RNA having substantially the same sequence as the base sequence of at least a part of these genes (hereinafter sometimes referred to as "double-stranded polynucleotide”) ) Is any part of the base sequence of the target gene. It consists of a sequence that is substantially identical to the sequence of thiode or higher.
  • substantially identical means having 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more homology with the target gene sequence.
  • the nucleotide chain length can be anything from 19 nucleotides to the full length of the target gene open reading frame (ORF)!
  • RNA having a chain length of 19 to 500 nucleotides are preferably used.
  • interferon reaction Mareus, PI, et al., Interferon, 5, 115—180 (1983)
  • nase Bass, BL, Nature, 411, 428— 429 (2001)).
  • 411, 428-429 (2001)) activation of RNaseL occurs, causing nonspecific degradation of RNA in the cell.
  • a double-stranded polynucleotide having 19 to 25, preferably 19 to 23, more preferably 19 to 21 nucleotides is used. It is done.
  • the double-stranded polynucleotide of the present invention does not have to be double-stranded as a whole, and includes those in which the 5 ′ or 3 ′ end partially protrudes, and the protruding end is 1 to 5 nucleotides, preferably 1 -3 nucleotides, more preferably 2 nucleotides.
  • the most preferred example is one having a structure in which the 3 ′ end of each polynucleotide chain protrudes by 2 nucleotides.
  • the double-stranded polynucleotide may be a polynucleotide obtained by self-annealing a single-stranded polynucleotide having a force self-phase correction that means a polynucleotide having a complementary portion in a double-stranded state.
  • Examples of the single-stranded polynucleotide having self-phase correction include those having an inverted repeat sequence.
  • a hybrid type of DNA strand and RNA strand, a chimeric type of DNA and RNA, or the like is used.
  • the hybrid of the DNA strand and the RNA strand may be any as long as it has an activity that inhibits the expression of the target gene when it is introduced into the recipient, but preferably the sense strand. Is DNA and antisense A strand whose RNA is RNA is used.
  • the chimeric form of DNA and RNA may be any as long as it has an activity that inhibits the expression of a target gene when introduced into a recipient. In order to increase the stability of the double-stranded polynucleotide, it is preferable to contain as much DNA as possible.
  • RNA is necessary for inhibition of target gene expression.
  • the sequence is preferably determined as appropriate within the range where expression inhibition occurs while analyzing the expression inhibition degree of the target gene described later. This makes it possible to identify the functional site of RNA in the RNAi method.
  • Preferable examples of the chimeric type thus determined include those in which a part of the upstream side of the double-stranded polynucleotide is RNA.
  • the upstream side means the 5 ′ side of the sense strand and the 3 ′ side of the antisense strand.
  • the portion on the upstream side is preferably a portion of 9 to 13 nucleotides from the upstream end of the double-stranded polynucleotide.
  • the polynucleotide chain length is 19 to 21 polynucleotides, and at least the upstream 1Z2 of the polynucleotide is RNA and the others are RNA.
  • a double-stranded polynucleotide that is DNA can be mentioned. Of such double-stranded polynucleotides, those whose antisense strands are all RNA have an even higher inhibitory effect on target gene expression.
  • the method for preparing the double-stranded polynucleotide is not particularly limited, but it is preferable to use a chemical synthesis method known per se.
  • chemical synthesis single-stranded polynucleotides having complementarity can be synthesized separately, and these can be combined into each other by an appropriate method to form a double-stranded chain.
  • Specific methods of association include, for example, a synthesized single-stranded polynucleotide, preferably in a molar ratio of at least about 3: 7, more preferably in a molar ratio of about 4: 6, and most preferably essentially.
  • Examples of the method include mixing in the same molar amount (that is, a molar ratio of about 5: 5), heating to a temperature at which the double strands dissociate, and then gradually cooling.
  • the associated double-stranded polynucleotide is purified, if necessary, by a commonly used method known per se.
  • a purification method for example, a method of confirming by using an agarose gel or the like and arbitrarily removing the remaining double-stranded polynucleotide by decomposing with an appropriate enzyme can be used.
  • the polynucleotide was prepared by a method such as chemical synthesis. Prepared by associating sequences with self-complementarity later in the same manner as described above (introduction of double-stranded polynucleotide into cells, tissues, or individuals, and inhibition of target gene expression)
  • the recipient to which the double-stranded polynucleotide thus prepared is introduced may be any one as long as the target gene can be transcribed into RNA or translated into protein in the cell.
  • the introducer used in the present invention means a cell, tissue, or individual.
  • cells used in the present invention include germline cells, somatic cells, differentiated totipotent cells, multipotent cells, dividing cells, non-dividing cells, parenchyma cells, epidermal cells, immortalized cells, transformed cells, etc. Any one may be used.
  • Specific examples include undifferentiated cells such as stem cells, cells derived from organs or tissues, or differentiated cells thereof. Tissues include single cell embryos or constitutive cells, multi-cell embryos, fetal tissues and the like.
  • Examples of the differentiation cells include adipocytes, fibroblasts, muscle cells, cardiomyocytes, endothelial cells, neurons, glia, blood cells, megakaryocytes, lymphocytes, macrophages, neutrophils, Examples include eosinophils, basophils, mast cells, leukocytes, granulocytes, keratinocytes, chondrocytes, osteoblasts, osteoclasts, hepatocytes and endocrine or exocrine gland cells. Specific examples of such cells include CHO-KI cells (RIKEN Cell bank), Drosophila S2 cells (Schneider, I., et al., J. Em bryol. Exp. Morph., 27, 353-365).
  • human HeLa cells ATCC: CCL-2
  • human HEK293 cells ATCC: CRL-1573
  • specific examples of the individual used as the recipient in the present invention include those belonging to plant, animal, protozoan, virus, bacteria, or fungal species.
  • An animal that may be a monocotyledonous, dicotyledonous or gymnosperm plant may be a vertebrate or an invertebrate.
  • Preferred microorganisms as recipients of the present invention are those used in agriculture or by industry and are pathogenic to plants or animals. Fungi include organisms in both mold and yeast forms.
  • vertebrates examples include mammals including fish, bushes, goats, pigs, hidges, hamsters, mice, rats, monkeys and humans, and invertebrates include nematodes and other reptiles
  • Drosophila Droso
  • Specific examples of the cultured cells include C HO-KI cells (RIKEN Cell bank), Drosophila S2 cells (Schneider, I., et al., J. Embryol. Exp. Morph., 27, 353). — 365 (1972)), human HeLa cells (AT CC: CCL-2), and for certain! / ⁇ , human HEK293 cells (ATCC: CRL-1573) are preferably used.
  • a method for introducing a double-stranded polynucleotide into a recipient when the recipient is a cell, or a tissue, a calcium phosphate method, an electoporet method, a lipofussion method, a viral infection, For example, immersion in a double-stranded polynucleotide solution or a transformation method is used. Examples of the method for introduction into the embryo include microinjection, electoral poling method, and virus infection.
  • a method by injection or perfusion into the body cavity or stromal cells of the plant or spraying is used.
  • systemic introduction is performed by oral, topical, parenteral (including subcutaneous, intramuscular and intravenous administration), transvaginal, rectal, nasal, ophthalmic, intraperitoneal administration, etc.
  • a method, an elect mouth position method, a virus infection, or the like is used.
  • double-stranded polynucleotides can be mixed directly with biological food.
  • it when introduced into an individual, it can be administered, for example, as an implanted long-term release preparation or by ingesting an introducer into which a double-stranded polynucleotide has been introduced.
  • the amount of the double-stranded polynucleotide to be introduced can be appropriately selected depending on the introduced body and the target gene, but it is preferable to introduce an amount sufficient to introduce at least one copy per cell. Specifically, for example, when the recipient is a cultured human cell and a double-stranded polynucleotide is introduced by the calcium phosphate method, 0.1 to: LOOOnM is preferable.
  • two or more types of double-stranded polynucleotides can be simultaneously introduced.
  • inhibition of expression of two or more types of target genes is expected in cells, tissues, or individuals that have been introduced with the polynucleotide (hereinafter sometimes referred to as “introducers”).
  • inhibition of expression of a target gene means inhibition of 20% or more as an expression level of mRNA or protein that is not only completely inhibited from the expression.
  • the degree of target gene expression inhibition is determined by the accumulation of target gene RNA,
  • the output of the protein encoded by the gene can be measured by comparing the double-stranded polynucleotide introduced into the non-introduced one.
  • the amount of mRNA can be measured by a commonly used method known per se. Specifically, for example, Northern hybridization, quantitative reverse transfer PCR, or in situ hybridization can be used.
  • the amount of protein produced can be measured by Western blotting using an antibody whose antigen is the protein encoded by the target gene, or by measuring the enzyme activity of the protein encoded by the target gene.
  • the target gene may have a known function or may have a function unknown in the recipient.
  • a double-stranded polynucleotide corresponding to the target gene is prepared as described above and introduced into the recipient in the same manner.
  • the phenotype for which changes are to be analyzed in the introducer is not particularly limited. For example, the form of the introducer, the amount of substance introduced into the introducer, the amount of substance secreted by the introducer, the dynamics of the substance in the introducer, the adhesion between the introducer, Movements, or life-form behavior such as the life of the introduced body. If the function of the target gene is already known in other recipients, it is preferable to analyze the function according to the phenotype associated with that function.
  • a microscope or a method of detecting it visually can be used as a means for analyzing the amount.
  • mRNA for example, as a substance in the introduced body, Northern hybridization, quantitative reverse transfer PCR, in situ hybridization, and the like can be used as a method for analyzing the amount.
  • methods for analyzing the amount include Western blotting using an antibody whose antigen is the protein encoded by the target gene, and methods for measuring the enzyme activity of the protein encoded by the target gene. It is possible.
  • the phenotypic changes that appear only in the transfectant analyzed in this way are the expression of the target gene. Since it is a result of the current inhibition, it can be identified as a function of the target gene.
  • the target gene used here may be a gene whose inhibition of expression gives the introduced body already known, or a function or a function unknown in the introduced body.
  • a desired property is imparted to the introduced body by selecting the desired phenotype of the introduced body. be able to.
  • target genes include enzymes related to fruit ripening, plant structural proteins, genes related to pathogenicity, and the like.
  • target gene expression inhibition has a resistance function against a specific disease, an increase in the expression of a specific protein causes a specific disease
  • the target gene is a gene encoding the above protein or And a gene encoding a protein having a function of controlling the expression of the protein.
  • the target gene is a gene necessary for maintaining a cancerous Z tumor ⁇ phenotype, and the recipient is a cancerous cell or a tumor tissue.
  • a double-stranded polynucleotide against the target gene inhibits the expression of the protein encoded by the target gene, it can be used as a therapeutic or prophylactic agent for a disease associated with the target gene.
  • the polynucleotide can be used alone, but it can also be used as a pharmaceutical composition by blending with a pharmaceutically acceptable carrier. it can. At this time, the ratio of the effective component to the carrier can be varied between 1 to 90% by weight.
  • the powerful drugs It can be administered in various forms, including oral administration via tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc., or injections, drops, liposomes, suppositories, etc. Parenteral administration.
  • the dose can be appropriately selected depending on the symptom, age, weight, and the like.
  • An introducer into which a double-stranded polynucleotide targeting such a gene has been introduced is selected based on the phenotype predicted to accompany the inhibition of gene expression.
  • the double-stranded nucleotide to be introduced is linked to a sequence encoding a specific genetic marker such as a fluorescent protein, the degree of inhibition of the expression of the fluorescent protein introduced into the recipient with the double-stranded polynucleotide. It is also possible to select based on Of these, for example, when a gene that functions for cancer suppression is used as a target gene, the characteristics of cells to be selected include increased proliferation ability, decreased cell adhesion ability, or increased motility (metastasis) ability. And traits of a malicious tumor.
  • the characteristic of a cell to be selected includes the disappearance of a cell-specific circadian rhythm.
  • the characteristics of cells to be selected include susceptibility to the mutagen.
  • the selected transductant can be established and obtained as a system by a known cloning technique suitable for each. Specifically, when the recipient is a cell, the transfectant is established as a cell line by a normal dilution method, a method using a drug-resistant marker, etc. Can be acquired.
  • the transductant with a specific function obtained in the present invention is a cell line with increased production or secretion efficiency of useful substances, or a cell line highly sensitive to environmental factors that cause damage to cells or DNA. It shows traits associated with diseases and can be used as a model for disease treatment.
  • target genes include genes whose expression is reduced or lacked.
  • Specific examples include genes for TSLC1 molecular pathway factors (TSLC1, Racl, Tiaml, etc.) in small cell lung cancer.
  • DNA having a sequence substantially the same as at least a part of the base sequence of these human genes and the like and a double-stranded polynucleotide having RNA power are introduced into, for example, a human-derived culture cell, whereby human Type of disease model cells can be obtained.
  • test substance is brought into contact with a cell, tissue, or individual to which this specific property is imparted to analyze whether or not a symptom of a disease related to the gene, or whether a change occurs in a trait. Therefore, it is possible to screen for therapeutic agents for the above diseases and Z or preventive agents
  • a substance selected by such screening is used as an active ingredient of the drug, it is possible to use the substance alone, but the pharmaceutical composition is formulated with a pharmaceutically acceptable carrier. It can also be used as a product. The ratio of the active ingredient to the carrier at this time can vary between 1 and 90% by weight.
  • such drugs can be administered in various forms such as tablets, capsules, granules, powders, or syrups, or injections, drops, ribosomes. Parenteral administration such as suppositories and suppositories. The dose can be appropriately selected depending on symptoms, age, body weight and the like.
  • the RNAi technique described above is a method of introducing a double-stranded polynucleotide having RNA power and DNA having substantially the same sequence as the base sequence of at least a part of the target gene into the recipient.
  • the method further comprises (a) an expression vector containing DNA encoding the indicator protein, and (b) at least a part of the base sequence encoding the indicator protein.
  • the recipient is a cultured cell derived from a vertebrate and the target protein is a fluorescent protein.
  • An expression vector containing DNA encoding a fluorescent protein is introduced into a cultured cell derived from a vertebrate and cultured, and a cell having a fluorescence intensity generated by the indicator protein is selected to have a specific intensity or more.
  • a double-stranded polynucleotide comprising DNA and RNA having substantially the same sequence as at least a part of the base sequence of the DNA encoding the indicator protein is further introduced into the cultured cells and cultured to express the indicator gene. The degree of inhibition is analyzed by the degree of attenuation of the amount of fluorescence that is also emitted by the indicator protein force.
  • the amount of protein encoded by the target gene can also be calculated based on the expression level of the indicator protein.
  • the kit for carrying out the RNAi technology described in this specification includes a double-stranded polynucleotide, a vector containing a DNA encoding a marker protein, and at least a part of the nucleotide sequence of the marker gene.
  • Examples include double-stranded polynucleotides consisting of DNA and RNA having the same sequence, reagents such as enzymes and buffers, reagents for introducing polynucleotides, and the like.
  • the kit of the present invention need not contain all these reagents and the like, and may be a combination of such reagents as long as it is a kit used in the above-described method of the present invention.
  • RNAi technology when RNAi technology is used, even if the expression of the RNAi effect is weak, cells that express a particularly high RNAi effect may be subjected to primary screening to use stronger ones.
  • polynucleotides comprising DNA and RNA as described above, specifically, hybrid polynucleotides comprising DNA strands and RNA strands, or polynucleotides introduced by using DNA-RNA chimeric polynucleotides It is possible to increase the stability as a substance and reduce the manufacturing cost. From this, the polynucleotide itself to be introduced can be developed as a preparation for cancer treatment using RNAi technology.
  • DNA is fluorescent labeling, piotin labeling, amination, phosphorylation, thiolation, etc. These modifications can be easily performed in a wide variety. Therefore, when used as a medicine or reagent, it is possible to add a function according to the purpose by performing such chemical modification.
  • the present invention provides a method for diagnosing cancer. Where this method is
  • the present invention relates to a method for diagnosing cancer, the step of observing the activity of Rac in a subject, comprising an increase in expression or activity compared to a normal individual. An increase is indicative of the development of cancer in the subject,
  • a method comprising:
  • a normal individual refers to an individual who does not have cancer and does not have a predisposition thereto. Where possible, refer to a standard individual or its average population recognized in the field.
  • increased or altered sugar chains compared to normal individuals refers to any expression or sugar chain that is altered compared to the values in the normal individuals. This is a numerical value. Such numerical changes are preferably not statistically significant as long as a force change is observed.
  • increased expression or altered sugar chain can be detected using any technique known in the art.
  • Such techniques can include other techniques detailed above in this specification, such as Western blot, Northern blot, dot blot, PCR, RT-PCR, ELISA etc. can be mentioned.
  • the cancer diagnosis method of the present invention the cancer is small cell lung cancer, some colorectal cancer, some liver cancer, some ovarian cancer, some osteosarcoma, some Or soft tissue sarcoma. These cancers, unlike leukemia, cannot be predicted from leukemia findings in terms of diagnosis.
  • TSLC1 overexpression or sugar chain change performed in the present invention is performed by direct observation of TSLC1 molecule and other molecules of TSLC1 molecular pathway (for example, TSLC1, Tiaml, Racl and low molecular weight G protein Racl, protein 4.1B, protein 4.1N, MPP3, protein Pals 2, protein CASK may be observed).
  • TSLC1 Tiaml, Racl and low molecular weight G protein Racl, protein 4.1B, protein 4.1N, MPP3, protein Pals 2, protein CASK may be observed.
  • TSLC1 was unexpectedly overexpressed and sugar chain changes in cancer
  • Racl was unexpectedly active.
  • cancer can be diagnosed by examining trends in these molecules.
  • the TSLC1 of interest in the present invention comprises the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the force encoded by a variant thereof, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a modified sequence thereof. You may have.
  • the variant of TSLC1 may be in the form of any variant as defined and exemplified herein, but when specifically mentioned, it is naturally occurring in vivo. Preferably there is. In the diagnosis of the present invention, since the subject of observation is a living body, it is understood that any variant that the living body can have falls within the scope of TSLC1 in the present invention.
  • Racl as a subject of the present invention is the force encoded by the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or a variant thereof, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, or a modified sequence thereof You may have.
  • the Racl variant may be in the form of any variant as defined and exemplified herein, but when specifically mentioned, it is naturally occurring in vivo. I prefer that.
  • the increase in the expression of TLSC1 occurs at the mRNA or protein level.
  • the increase in expression is the normal level of mRNA level force It is more likely to be more favorable if it is a statistically significant change, usually twice as much for agility, twice as much at a reasonable level, and more than 3 times as best.
  • the increase in expression is in the range where the protein level is above normal, and is more preferable if it is a statistically significant change, usually 2 times for the most sensitive, 2 times at a reasonable level, 2 times the best The range is more than tripled.
  • the sugar chain change when a sugar chain change is a diagnosis target, the sugar chain change is that the sugar chain pattern of the protein is different from the normal pattern.
  • Such glycosylation patterns include the following: Increase in N-type glycosylation in cancer and concomitant increase in molecular weight of TSLC1 protein in cancer, O-type glycosylation in cancer Increasing and accompanying increase in molecular weight of TSLC1 protein, response to monoclonal antibodies against cancer specific sugar chains. In such a case, cancer can be diagnosed in the present invention.
  • the increase in expression of Racl preferably occurs at the mRNA or protein level.
  • the increase in expression is in a range that is greater than the normal value of mRNA level force, and is more preferable if it is a statistically significant change, usually 2 times for the most sensitive, and 3 times at a reasonable level. The best range is more than 4 times.
  • the increase in expression is in the range where the protein level is higher than normal, and if it is a statistically significant change, it is more preferred, usually 2 times for the most sensitive, 3 times at a reasonable level, best This range is more than 4 times.
  • the activity of Racl is preferably the activity of the gene product.
  • Such activity can be measured by the ratio of Rac protein capable of binding to the Rac binding domain of p21 activity kinase to the total intracellular Rac protein.
  • cancer can be diagnosed by measuring the increase in activity as a percentage of total intracellular Rac protein that can bind to the Rac-binding domain of p21 kinase.
  • Racl protein activity level is higher than normal, and is more preferable if it is statistically significant. Furthermore, it is usually 2 times for the most sensitive, 3 times at a reasonable level, and 4 for the best range. This is the case when it becomes more than double. In such a case, cancer can be diagnosed in the present invention.
  • the increased expression is expressed as 8A + 8B type splicing. Including increased expression of mutated mutants.
  • the TSLC1 gene includes 8A + 8B splicing mutants, such as 8A and 8 (—). In particular, efficient diagnosis can be performed by observing this 8A + 8B splicing mutant. it can.
  • the 8A + 8B type splicing variant is identified by (attached to the sequence information).
  • the sugar chain change is performed by modifying a sugar chain in an O-type modified sugar chain, but is not limited thereto.
  • the change of the sugar chain is performed by modifying a sugar chain in an N-type modified sugar chain, but is not limited thereto.
  • the change of the sugar chain is performed by performing sugar chain modification on the O-type modified sugar chain and the type modified sugar chain, but is not limited thereto. !
  • TSLC1, Racl, and the like factors that specifically bind to these molecules (that is, specific factors) can be used. It is understood that any factor described in the present invention is used as the factor used.
  • the factor may be a nucleic acid molecule, a polypeptide, a lipid, a sugar chain, a small organic molecule, and a complex molecule thereof.
  • Such specific factors can be labeled or labeled.
  • label refers to an entity (for example, a substance, energy, electromagnetic wave, etc.) for identifying other molecules of interest.
  • labeling methods include RI (radioisotope) method, fluorescence method, piotin method, chemiluminescence method and the like.
  • the labeling is performed with fluorescent substances having different fluorescence emission maximum wavelengths. The difference in the maximum fluorescence emission wavelength is preferably lOnm or more. Any fluorescent substance can be used as long as it can bind to the base moiety of nucleic acid.
  • Cyanine dyes eg, CyDye TM series Cy3, Cy5, etc.
  • rhodamine 6G reagent N-acetoxy-N-a Uses cetylaminofluorene (AAF), AAIF (iodine derivative of AAF), etc.
  • a fluorescent substance with a difference in fluorescence maximum wavelength of lOnm or more examples thereof include a combination of Cy5 and rhodamine 6G reagent, a combination of Cy3 and fluorescein, a combination of rhodamine 6G reagent and fluorescein, and the like.
  • a label can be used to modify the target object so that it can be detected by the detection means used. Such modifications are known in the art, and those skilled in the art can appropriately carry out such methods depending on the label and the target object.
  • the factor that can be used is an oligonucleotide or polynucleotide primer or probe containing at least a part of a complementary sequence of a nucleic acid sequence encoding TSLC1, Racl, or the like, or a variant thereof, or A specific antibody.
  • the specific design method for such a primer or probe may be as detailed elsewhere herein. Detection of amplification by primers can be performed by confirming the expected product size. Detection with a probe can be performed by utilizing the size or label of interest.
  • Such antibodies can be prepared by any method described elsewhere herein.
  • the antibody used in the present invention does not need the ability to detect only the polypeptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody having any specificity can be used as long as the polypeptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 6 can be detected by any method and false positives are reduced. Therefore, the antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the factor that may be included may be an antibody against TSLC1, Racl, and the like.
  • expression can be indicated by the fluorescence intensity (FI) when using a directly labeled antibody, a primary antibody (eg, a piotinylated antibody) and a secondary antibody. Such an indication can be expressed in absolute or relative levels.
  • FI fluorescence intensity
  • the expression intensity at the mRNA level can be analyzed using RT-PCR or microarray. When RT-PCR is used, it can be quantified relatively using a densitometer, and when more detailed numerical values are used, it is less than that for the housekeeping gene HRPT in the microarray. Negative expression, equivalent weak positive and Stronger (statistically strong) levels can be expressed as strong positives.
  • level such as expression refers to a level at which a polypeptide or mRNA is expressed in a target cell or the like. Such expression level is evaluated by any appropriate method including immunological measurement methods such as ELISA method, RIA method, fluorescent antibody method, Western plot method, and immunohistological staining method using the antibody of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention evaluated by any suitable method including the expression level of the polypeptide of the present invention at the protein level or a molecular biological measurement method such as Northern blotting, dot blotting, or PCR. Expression level at the mRNA level.
  • “Change in expression level” means expression at the protein level or mRNA level of the polypeptide of the present invention evaluated by any appropriate method including the above-mentioned immunological measurement method or molecular biological measurement method. Means that the amount increases or decreases. Expression levels can be assessed at absolute or relative levels.
  • the diagnosis subject of the present invention is small cell lung cancer, some colon cancer, some liver cancer, some ovarian cancer, some osteosarcoma, some soft parts. Includes tissue sarcoma.
  • the specific agent of the present invention is a nucleic acid molecule having a sequence that hybridizes under stringent conditions to the nucleic acid molecule of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO :.
  • the specific agent of the present invention is an antibody against the polypeptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6.
  • the detection of the present invention is performed using a reagent comprising a primer designed to amplify all or part of the nucleic acid molecule of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5. obtain.
  • the detection of the present invention comprises a reagent comprising a probe designed to be a sequence complementary to all or part of the nucleic acid molecule of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5. Can be used.
  • the detection of the present invention can be performed using a reagent containing an antibody that specifically recognizes the polypeptide of the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6.
  • the detection of the present invention comprises detecting an antibody that specifically recognizes active ⁇ type Racl. This can be done with the reagent containing.
  • the present invention provides a method for diagnosing cancer, comprising the step of measuring the level of a TSLC1 molecular pathway factor.
  • TSLC1 molecular pathway factors of interest may be TSLC1, Tiaml and Racl.
  • the level of a factor can be measured by a specific factor for that factor.
  • the specific factor may be a nucleic acid molecule, a polypeptide, a lipid, a sugar chain, a small organic molecule and a complex molecule thereof.
  • the specific agent can be labeled or labeled. For example, when so labeled, the various conditions that can be measured by the factors of the present invention can be measured directly and Z or easily.
  • Such a label may be any label as long as it is discriminably labeled, for example, techniques such as fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, radioactivity, enzyme-substrate reaction and antigen-antibody reaction. It is not limited.
  • a system often used in an immune reaction such as piotin streptavidin may be used.
  • the present invention provides a diagnostic agent for cancer, comprising a means for measuring the level of TSLC1 or Racl.
  • the above means includes a factor of a molecular pathway of TSLC1 (for example, TSLC1,
  • the above means of the present invention comprises a nucleic acid molecule, polypeptide, lipid, sugar chain.
  • Organic small molecules and complex molecules thereof may also be used. Such specific factors can be labeled or labeled.
  • the above-mentioned means of the present invention comprises means for identifying TSLC1 expression or glycosylation (for example, a probe, primer, antibody, etc.) or means for identifying Racl activity (for example, , An antibody that specifically recognizes active ⁇ type Racl)
  • the above-described means of the present invention comprises TSLC1 or TS in cells or serum.
  • the means of the present invention is a nucleic acid molecule having a sequence that hybridizes under stringent conditions to the nucleic acid molecule of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5. It can be.
  • the above means of the present invention may be an antibody against the polypeptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6.
  • the means of the present invention may be a reagent comprising a primer designed to amplify all or part of the nucleic acid molecule of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5. .
  • the above means of the present invention includes a probe designed to be a sequence complementary to all or part of the nucleic acid molecule of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5. It can be a reagent.
  • the means of the present invention may be a reagent comprising an antibody that specifically recognizes the polypeptide of the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6.
  • the diagnostic target of the diagnostic agent of the present invention includes small cell lung cancer, some large intestine cancers, some liver cancers, some ovarian cancers, some osteosarcoma species, Includes some soft tissue sarcomas.
  • the present invention provides a method of screening for a diagnostic agent for cancer, the method comprising: A) observing a difference in TSLC1 or Racl levels between a normal subject and a cancer patient Selecting a normal subject and a cancer patient in which a difference is found; and B) identifying a factor that correlates with the level of TSLC1 or Racl in the selected normal subject and the cancer patient.
  • the identification of the TSLC1 or Racl level can be performed using any method described in the present specification and elsewhere. Understood.
  • the level of TSLC1 or Racl includes the level of gene expression (mRNA, protein level, etc.), as well as the level of post-translational modification (eg, glycosylation differences). .
  • the selected normal subject and cancer patient Identification of a factor that correlates with the level of TSLC1 or Racl can be performed using any method known in the art. Statistical analysis (eg, regression analysis) can be used for correlation analysis.
  • the present invention provides a diagnostic agent for cancer identified by the screening method of the present invention.
  • the present invention provides a system for screening a diagnostic agent for cancer, the system comprising: A) Differences in levels of TSLC1 or Racl between normal subjects and cancer patients. A means to select normal subjects and cancer patients to observe and find differences; and B) factors that correlate with TSLC1 or Racl levels in selected normal subjects and cancer patients. A system that provides a means for identification is provided.
  • means for identifying a factor that correlates with the level of TSLC1 or Racl in the selected normal subject and cancer patient is any method known in the art. possible.
  • Statistical analysis eg regression analysis
  • the present invention provides a method of screening factors for the treatment or prevention of cancer.
  • the target cancer may be a small cell lung cancer.
  • TSLC1 molecular pathway factors may be TSLC1, Tiaml and R acl.
  • the candidate substance used in the present invention may be any substance, such as a nucleic acid molecule, polypeptide, lipid, sugar chain, small organic molecule, and the like. It can be a complex molecule.
  • a factor that regulates the molecular pathway of TSLC1 observe the activity of the factor in the molecular pathway or inactivation, increase / decrease of expression level, increase / decrease of phosphorylation, increase / decrease of molecular weight, etc. Can be done.
  • a dominant deletion variant of a factor of the molecular pathway of TSLC 1 may be used.
  • the present invention provides a method of screening factors for treating or preventing cancer.
  • a step of providing; E) A step of selecting a factor for treating or preventing cancer among the candidates for the modulator may be included.
  • the present invention provides dominant deletion variants of TSLC 1 molecular pathway factors.
  • the variant of the present invention may be all or part of a genome, a cell, a tissue, an organ, or an individual. Preferably, it may be an individual, in which case it can be used for drug screening as a model animal for cancer treatment or prevention.
  • the present invention provides an agent for treating or preventing cancer identified by the screening method of the present invention.
  • regulatory molecules may be nucleic acid molecules, polypeptides, lipids, sugar chains, small organic molecules and complex molecules thereof.
  • Such molecules can be produced using well-known combinatorial chemistry techniques.
  • the present invention provides the use of an agent that modulates the molecular pathway of TSLC 1 in the manufacture of a composition for cancer diagnosis.
  • the target cancer may be a small cell lung cancer.
  • TSLC1 molecular pathway factors may be TSLC1, Tiaml and Racl.
  • TSLC1 molecular pathway factors may be TSLC1, Tiaml and Racl.
  • the present invention provides the use of an agent that modulates the molecular pathway of TSLC 1 in the manufacture of a composition for the treatment or prevention of cancer.
  • the target cancer may be a small cell lung cancer.
  • TSLC 1 molecular pathway factors may be TSLC1, Tiaml and Racl. It will be appreciated that in other preferred embodiments, any preferred form similar to that described herein in the compositions, methods, and systems may be taken.
  • References such as scientific literature, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety to the same extent as if each was specifically described. The
  • Polyclonal antibody CC2 against human TSLC1 protein was obtained by immunizing a rabbit with a fusion protein of KLH (keyhole limpet hemocyanin) and a polypeptide consisting of 18 amino acids at the end of the TSLC1 protein as an antigen.
  • the antiserum was prepared by purification with an antigen affinity column.
  • Human small cell lung cancer tissue was fixed in formalin, embedded in norafin, and cut out as 5 m thick continuous sections. The sections were deparaffinized and dehydrated, and then heated in ImM EDTA solution at 120 ° C for 5 minutes.
  • Nonspecific reaction was prevented by immersing the sections in a solution of TBS (Tris-NaCl, pH 7.5; final concentration 25 mM Tris, 150 mM NaCl) containing 5% normal donkey serum.
  • TBS Tris-NaCl, pH 7.5; final concentration 25 mM Tris, 150 mM NaCl
  • TBS containing a solution containing anti-TSLC1 antibody CC2 (1% NDS (normal donkey serum)) Solution diluted to 2,000: 1 with the solution
  • the sections were reacted with the labeled polymer and wasabi-derived peroxidase for 1 hour at room temperature, washed gently with TBS solution, covered with 3,3′-diaminoventine, and reacted for 3 minutes. This section was observed with an optical microscope.
  • Synthetic polypeptide N-INAEGGQNNSEEKKEYFI-C (SEQ ID NO: 10) of the carboxyl terminal of TSLC 1 fused to KLH was used as an immunogen to elicit CC2, a rabbit anti-TSLC1 polyclonal antibody.
  • Rabbit polyclonal antibody (pAb) against the C-terminus of TSLC1 (CC2) or the ectodomain (EC) of TSLC1 can be prepared by well-known means.
  • mAb Clone 12CA5 was purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) and Roche Applied Science (Indianapolis, IN), respectively.
  • Mouse mAbs against ⁇ -catenin, E-cadherin (clone 36), and fibronectin were obtained from BD Biosciences.
  • Other mouse mAbs used were ZO-1 (Zymed, South San Francisco, CA) and vimentin (clone V9, Sigma, St.
  • Poly (A) RNA was also extracted from cultured cell force using a commercially available kit such as Invitrogen's FastTrack 2.0. Poly (A) RNA derived from normal lung and normal brain was purchased from Clontech. 1 ⁇ g of poly (A) RNA was separated by electrophoresis on a 1% agarose “formaldehyde” gel and transferred to Amersham High Bond N +.
  • a 961 base pair fragment obtained by PCR amplification of a plasmid containing TSLC1 cDNA (corresponding to 411–1, 371 bases, counting the first base force of the translation start codon of TSLClcDNA)
  • the complementary base sequence of the fragment to be Radiolabeled with 32 P] dCTP using the Amersham Bioscince multiprime DNA labeling system.
  • Total cellular RNA was extracted with Qiagen's RNeasy Mini Kit.
  • a reverse transcriptase reaction was carried out using an enzyme such as SuperScriptn from Invitrogen in the presence of an RNase inhibitor using 1 g of whole cell RNA as a saddle.
  • a portion of the reaction solution was used as a saddle and PCR was performed using a DNA polymerase such as ExTaq DNA polymerase from TAKARA to amplify the exon 7-9 region of TSLC lcDNA.
  • Figure 1 shows TSLC1 overexpression in small cell lung cancer.
  • Figure 1A shows immunohistochemical staining using a TSLC1-specific antibody. Overexpression of TSLC1 protein is observed in small cell lung cancer.
  • Figure 1B shows a Northern 'plot analysis of TSLC1. TSLC 1 overexpression is frequently observed in small cell lung cancer.
  • Example 2 In small cell lung cancer, a mutant of TSLC1 is expressed and sugar chain modification is different.
  • RNA from which cancer cell strength is also extracted is used as a saddle type, and cDNA is prepared by reverse transcriptase reaction such as Super Script 2 using oligo dT primer.
  • PCR is performed with Taq DNA polymerase using the following primers corresponding to TSLC1 gene exons 7 and 9 as a saddle type.
  • the F-primer is labeled with the fluorescent dye Texas Red at the 5 and ends.
  • N-glycosidase F (Roche Diagnostics) was added to the lysed sample and reacted at 37 ° C. Finally, the sample was separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and the TSLC1 protein with GFP attached was detected by immunoplot method.
  • the cells were lysed and centrifuged at 17,000 XG for 20 minutes, and the supernatant was diluted with phosphate buffer containing 0-glycosydase (Roche Applied Science) ( PH 7.2) (final concentration 9.6 mM, containing Nonidet P-40 (final concentration 1%)) and reacted at 37 ° C for 24 hours. Finally, this sample was separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and TSLC1 protein attached with GFP was detected by immunoplot method.
  • phosphate buffer containing 0-glycosydase (Roche Applied Science) ( PH 7.2) (final concentration 9.6 mM, containing Nonidet P-40 (final concentration 1%)
  • Figure 2 shows the results showing that TSLC1, which is highly expressed in small cell lung cancer, is a specific splicing variant.
  • Figure 3 shows the results demonstrating glycosylation of TSLC1 protein.
  • Figure 2. TSLC1, which is highly expressed in small cell lung cancer, is a specific splicing variant.
  • A These results show the difference between TSLC1 gene organs, pathological condition-specific splicing and O-glycan modification.
  • B Splicing found in small cell lung cancer 'variant It is a result which shows.
  • Figure 3. TSLC1 protein glycosylation. A.
  • TSLC1 protein Western blot analysis of TSLC1 protein is shown.
  • the molecular weight of TSLC1 protein is different in small cell lung cancer, ATL cells, and epithelium.
  • B. The molecular weight of TSLC1 protein in small cell lung cancer is reduced by digestion specific to N-type and O-type glycans.
  • TSLC1 or Racl specific factors Use TSLC1 or Racl specific factors to determine whether they can be used to diagnose small cell lung cancer.
  • Small cell lung cancer can be diagnosed by detecting the TSLC 1 splice variant specific for small cell lung cancer using RT-PCR.
  • TSLC1 splice 'variant 8 A + 8B is specifically expressed in cultured small cell lung cancer, but not in normal lung tissue, non-small cell lung cancer, or other tissues except for testis and brain (very small amount) . Therefore, we created a model system that detects small cell lung cancer cells in sputum and peripheral blood using this method. In other words, after diluting small cell lung cancer cells with normal lymphocytes in a stepwise manner, total cell RNA is extracted, subjected to reverse transcriptase reaction, and then using splice 'variant 8A + 8B-specific primers.
  • Normal lung-derived total cell RNA was purchased from Clontech.
  • a commercially available kit such as Clontech was used.
  • cDNA was prepared by reverse transcriptase reaction using a commercially available kit with 1 ⁇ g of total cell RNA as a saddle type.
  • TSLC1 8A + 8B splice 'variant was detected by PCR using Advantage Klen Taq DNA polymerase.
  • a primer for example, an oligo having the following base sequence: Gogonucleotides are used: 5, one GTGATGGTAACTTGGGTGAGAGTC one 3, (Self sequence number 11); 5 'CCAGAATGATGAGCAAGCACAG-3, (SEQ ID NO: 12).
  • Amplified fragments were separated by 4% agarose gel electrophoresis, and amplification products were detected by ultraviolet irradiation after adding ethidium bromide. The amplification product was confirmed by the molecular weight marker migrated at the leftmost end of the lane.
  • a cell line with a Tet-Off control was constructed and maintained in Eagle's minimum essential medium (Sigma, St. Louis, MO). This minimal medium includes: 0. ImM non-essential amino acids (Invit rogen, Carlsbad, CA) ⁇ 1. OmM sodium pyruvate (Invitrogen), 10% Tet system approved FBS (BD Biosciences), 100 units / ml penicillin, and 1 00 ⁇ g Zml streptomycin (Invitrogen) was added. To suppress the expression of the related genes, 100 / z gZml of doxycycline (Dox) was added to this medium.
  • Dox doxycycline
  • Cell proliferation was examined by MTS assembly using Cell Titer 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, Wis.) According to the manufacturer's protocol.
  • Motility was determined by micropore chamber assembly. Cells (4 ⁇ 10 5 ) were seeded in the top chamber of a 6-well micropore polycarbonate membrane filter (Bee ton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) with 8 ⁇ m pores. The bottom chamber was then filled with RPMI 1640 and Ham's F12 mixed medium containing 2% urchin fetal serum as a chemoattractant. After 16 hours of incubation at 37 ° C, the membrane was fixed and stained with Diff Quik reagent (International Reagents, Inc, Kobe, Japan) and cells that migrated through the membrane All were counted with a light microscope. Each experiment was performed in triplicate wells and repeated three times. [0335] (In vitro invasiveness of cancer cells: cell invasiveness)
  • mice Male SCD mice (6-8 weeks old) were acquired by CLEA (Tokyo, Japan) and maintained throughout this study under certain pathogen free conditions.
  • FBS was purchased from M.A. Biopoducts (Walkersville, MD). Anti-asharo GM1 serum was obtained from Wako (Osaka, Japan).
  • TM- ⁇ 1 Ab (lmg / 0.3 ml PBSZ mouse) or anti-assialo GM1 serum (20 1 / 0.3 ml PBSZ mouse) was injected into the lateral vein of SCID 2 days before tumor inoculation.
  • Tumor cells were washed with PBS without Ca 2+ and Mg 2+ and suspended in the same solution at the desired cell concentration. Cell viability as determined by trypan blue exclusion was greater than 90%.
  • a volume of 0.3 ml tumor cell suspension was injected into the unanesthetized lateral tail vein. After the indicated period, the mice were sacrificed and the number of metastatic lymph nodes was counted. Nodules in their liver and kidney were counted using a dissecting microscope.
  • FIG. Figure 4 shows the induction of cancer cell invasive traits by TSLC1.
  • TSLC 1 is an anti-TSLC 1 antibody and a secondary antibody (blue)
  • the actin molecule was stained with faroidin (red). As shown, overexpression of TSLC1 caused cancer cells to show an infiltrating trait.
  • TSLC1 protein binds to Tiaml protein in cells (in epithelial tissues, cancer cells and adult T-cell leukemia cells (ATL))]
  • Synthetic polypeptide N—INAEGGQNNSEEKKEYFI—C (SEQ ID NO: 10) of the carboxyl terminal of TSLC 1 fused to KLH was used as an immunogen to elicit CC2, a rabbit anti-TSLC1 polyclonal antibody.
  • C-terminal of TSLC1 CC2
  • pAb rabbit antibody against the TSLC1 ectodomain
  • EC TSLC1 ectodomain
  • HA hemagglutinin
  • mAb mouse anti-HA monoclonal antibody
  • clone 12CA5 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) and Roche Applied Science (Indianapolis, IN)
  • Mouse mAbs against ⁇ -catenin, E-cadherin (clone 36), and fibronectin were obtained from BD Biosciences.
  • Other mouse mAbs used are specific for ZO-1 (Zymed, South San Francisco, Calif.) And vimentin (clone V9, Sigma, St. Louis, Mo.).
  • Secondary antibodies for immunoplotting and immunofluorescence staining were obtained from Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, England) and Jackson Immuno Research Lab (West urove, PA), respectively.
  • the antibodies used for the activity of Racl and Rho are the mouse anti-Racl mAb, clone 23A8 (Upstate, Lake Placid, NY), and the rabbit anti-Rho pAb (Upstate), respectively ( MMZ CR) G
  • MDCK cells can be prepared with pTSLCl-GFP using Lipofectamine Plus reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. Transfusion. Stable clones were selected in medium containing 500 mg / ml Geneticin (G418) (Invitrogen). Stably transfected clones were maintained in the presence of 300 mgZml G418. Cancer cells were transiently transfected with pTSLCl-GFP and Z or pTSLCl-HA as described above.
  • the GST-TSLC1 fusion protein expressed in E. coli was purified using glutathione sepharose 4B (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's protocol.
  • [ 35 S] methionine-labeled MPPs HA proteins were synthesized using the TNT T7 Quick Coupled transcription / translation system (Promega, Maaison, WI). It was. The binding of radiolabeled MPP to GST fusion proteins has been previously described (Yageta et al., 2002). The signal intensity of the binding protein and the amount of GST fusion protein were quantified using the software NIH Image versio 1.62, and the binding affinity was adjusted for the amount of GST fusion protein.
  • BIOCOAT collagen-coated 8-well culture slides (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) were plated and fixed 2 days later.
  • M DCK / TSLC 1 -GFP cells or Caco-2 cells were seeded at a density of 10 5 cells in Trans-well-COL collagen-coated filter inactivator (Costar, Cambridge, MA), The cells were grown for 3-4 days until confluence. These cells were washed twice with PBS (pH 7.2) and fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 20 minutes at room temperature.
  • FIG. 5 shows in vitro binding of TSLC1 protein and Tiaml protein.
  • TSLC1 intracellular fragment prepared as a GST fusion protein in E. coli, and a fragment lacking its 9 amino acids at its C-terminus Ligation was detected by binding on a GST column.
  • synthesized Tiaml and its partial fragments were detected by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Figures 6 and 7 show the in vitro binding of TSLC1 protein and Tiaml protein. Introduced and expressed Tiaml protein with V5 tag sequence in cultured cancer cells, immunoprecipitated with anti-V5 antibody or mouse IgG ( Figure 6), or anti-TSLC1 antibody or mouse IgG ( Figure 6), and sedimented Were separated by polyacrylamide gel electrophoresis and detected with anti-TSLC1 antibody (FIG. 6) and anti-Tiaml antibody (FIG. 7) (Western 'plot method). As controls, cell lysates were detected with anti-TSLC1 antibody and anti-V5 antibody (FIG. 6), or cell lysates and immunoprecipitates were detected with anti-V5 antibody (FIG. 7).
  • Figure 8 shows the co-localization of TSLC1 protein and Tiaml protein. Expression of TSLC1 protein was induced in cultured cancer cells with doxycycline, and localization of TSLC1 protein and Tiaml protein was detected with anti-TSLC1 antibody and anti-Tiaml antibody, respectively. The right end is an image that combines both signals.
  • TSLC1 protein binds intracellularly to Tiaml protein (in epithelial tissues, cancer cells and adult T-cell leukemia cells (ATL)).
  • TSLC1 cDNA was transferred to the pTRE2hygro vector (BD Biosciences).
  • the shortened TSLC1 fragment was generated by PCR using pTSLCl—HA or pcTSLCl as a template and cloned into the pTREhygro vector.
  • the amino acid (aa) residue located at 397-422 was removed and 396 residues were fused with the HA epitope tag .
  • Three-dimensional (3D) culture was performed according to the manufacturer's protocol (Nitta Gelatin, Osaka, Japan). Cells were added to the collagen I mixture, mixed gently, and plated on 12-well plates with 5 ⁇ 10 3 cell Z-wells. Five-day-old cysts were examined for general cyst structure and subcellular localization of TSLC1 and deletion mutants. For induction of tube formation, 4 day old cysts were stimulated with fresh medium containing 40 ng Zml of HGF (Sigma), incubated for an additional 4 days, and examined by phase contrast microscopy It was.
  • Cells were seeded with 1 ⁇ 10 4 cell Z wells in 6 well plates. The next day, the cells were fed with fresh medium in the presence or absence of 40 ng / ml HGF and incubated for an additional 17 hours. Cell dispersion was examined with a phase contrast microscope.
  • Activation of Racl and Rho was determined according to the manufacturer's protocol using the Racl activation kit and the Rho activation kit (Upstate), respectively. Decided by Unatsusei. Briefly, cells were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells per 100 mm culture plate and placed in serum starved overnight. The cells were then stimulated with 40 ng / ml HGF for various time periods and lysed in MLB lysis buffer. 13 ⁇ 4. 1-0? ⁇ cho 13 ⁇ 410—0?
  • FIG. Figure 9 shows that TSLC1 suppresses epithelial-mesenchymal transition, migration, invasiveness, and Racl activity of MDCK cells by HGF.
  • the GST-pull-down assay can be used as a means to identify inhibition of Racl activity.
  • Example 7 Activation of low molecular weight G protein Rac l by TSLC1 protein is mediated by Tiaml protein.
  • Example 6 it can be confirmed whether or not Racl activity is performed using TSLC 1 protein.
  • a substance that may activate a factor of the molecular pathway of TSLC1 is screened using a reporter gene assembly.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • Lysis solution 25 mM Tris (7.5), 2 mM dithiothreitol (DTT), 10% glycerol, 1% TritonX—100; Luciferin mix: 20 mM Tricine Zl. 07 mM (MgCO) Mg ( OH) — 5H 0/2. 67 mM MgSO / 0. ImM EDTA / 33
  • Small cell lung cancer cells primary
  • MDCK2 cells etc.
  • These cells are appropriately cultured in Dulbecco's modified Eagle medium using 10% urine fetal serum.
  • Luciferase is an enzyme that produces fluorescence (approximately 560 nm).
  • a plasmid containing a nucleic acid sequence encoding the protein to be assayed and a reporter plasmid (luciferase reporter) are simultaneously forcibly expressed in the cell and the reporter activity is measured.
  • Gene expression can be measured by measuring fluorescence due to expression of the luciferase gene product.
  • Example 9 Secondary screening
  • cells other than cancer cells cell lines or primary cultured cells.
  • cells other than cancer cells cells that do not have the effect of activating the factor of the molecular pathway of TSLC1 are selected as preferred U hits.
  • small cell lung cancer primary cells 3T3-Ll, 3T3-F442 or other primary cell cultures are used in the presence or absence (at various concentrations) of the candidate drug library. Under culture these cells.
  • a compound that activates the expression level can be measured at the mRNA level.
  • Example 9 Screening performed in L 1 or the like can be automated using a robot.
  • the Beckman Coulter Biomek series can be used to construct a system using a microphone port plate, or the Zymark Staccato Mini-System series can be used to construct a system.
  • the leady compound thus obtained can be used for animal experiments. Alternatively, other compounds can be designed based on such lead compounds.
  • a compound that was found to potentially activate a factor of the molecular pathway of TSLC 1 specifically for small cell lung cancer was administered to animals such as mice, rats or monkeys. And screening for compounds that reduce the expression level of mRNA or protein in the TSLC1 molecular pathway specifically for cancer tissues.
  • the present invention provides techniques for diagnosis, treatment and Z or prevention of cancer, particularly small cell lung cancer and related cancers or neoplasms, and suppression of Z or invasion 'metastasis.
  • the Such technology has industrial applicability in medicine and surrounding areas (pharmaceutical manufacturers, reagent manufacturers), etc.
  • SEQ ID NO: 1 is a nucleic acid sequence encoding TSLC1 (base sequence of TSLC1 8A + 8B type cDNA).
  • SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of TSLC1 (the amino acid sequence of TSLC1 8A + 8B).
  • SEQ ID NO: 3 is a nucleic acid sequence encoding Tiaml (base sequence of TIAM1 cDNA; accession number NM 003253).
  • SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of Tiaml (accession number NM_003253).
  • SEQ ID NO: 5 is a nucleic acid sequence encoding Racl (accession number NM_006908).
  • SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 are examples of the sense sequence and the antisense sequence of TSLC1 siRNA, respectively.
  • SEQ ID NO: 9 is a specific synthetic oligonucleotide sequence of TSLC1 (TTCGCCAT GCTGTGCTTGCTCA).
  • SEQ ID NO: 10 is a synthetic polypeptide of the carboxyl terminal 18 amino acids of TSLC 1 fused with KLH N-INAEGGQNNSEEKKEYFI-C
  • SEQ ID NO: 11 TSLC1 8A + 8B splice 'primer 5' for detection of variants-GTGATGGTAACTTGGGTGAGAGTC-3 '
  • SEQ ID NO: 12 TSLC1 8A + 8B splice 'primer 5' for detection of variants-CCAGAATGATGAGCAAGCACAG-3 '

Abstract

本発明は、全く新規な、がん（特に、小細胞肺がん）の診断のための技術を提供することを課題とする。上述した課題は、本発明者が鋭意検討した結果、ＴＳＬＣ１の分子経路において、特に、ＴＳＬＣ１およびＲａｃ１の発現レベル（過剰発現、糖鎖変化、活性化など）が、がん（特に、小細胞肺がん）の発症と密接に関連していることを見出したことによって、解決された。すなわち、Ａ）ＴＳＬＣ１の発現の増加または糖鎖の変化またはＲａｃ１の活性化を観察する工程、およびＢ）正常個体と比較して増大した該発現または変化した糖鎖、あるいは活性化の変化によりがんの発現を示す工程、を含む方法による。

Description

明 細 書
小細胞肺がんの診断のための方法、システムおよび組成物ならびに関連 するスクリーニング方法
技術分野
[0001] 本発明は、がんの診断のための方法、システムおよび組成物ならびに関連するスク リー-ング方法に関する。より詳細には、小細胞肺がんの診断のための方法、システ ムおよび組成物ならびに関連するスクリーニング方法に関する。
[0002] 本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願 2005— 380332号 優先権を請求する。
背景技術
[0003] がんの処置および予防は、未だに完全には解決していない問題であり、種々の局 面からの解析がなされており、その解決方法に対しては未だに強い需要が存在する
[0004] がんの診断は、適切な診断および予防をするために必要な工程であり、その診断 には種々の手法およびマーカーが使用されている。
[0005] がんの一種である小細胞肺がん（以下、 SCLCとも 、う）は、特徴的な初期転移を 伴う侵襲性のがんである。最も有効な治療法でさえ、 SCLC患者の全生存率は、初 期の疾病で 12%、そして転移性疾病で 2%のみである。転移性疾病は通常、 SCL C患者の約 3分の 2で認められる。通常の転移部位は、肝臓、副腎、脳、骨、および 骨髄を含む（非特許文献 1 = Chute, J. P. et al. (1999)J. Clin. Oncol. 17 : 17 94— 801 ;非特許文献 2 = Chute, J. P. et al. (1997) Mayo Clin. Proc. 72 : 901— 12 ;非特許文献 3 = Salgia , R. (1996) Adv. Oncol. 12 : 8— 15)。 SCLC でのリンパ節および様々な器官への転移機序を理解することは、さらなる治療法を 設計する際に重要である。
[0006] SCLCは、 、くつかの受容体チロシンキナーゼ (RTK)の過剰発現を特徴とする。
RTKのいくつかは、プロトオンコジーンであり、かつ細胞成長、分化、生存、および 運動の鍵となる制御因子である。最近の研究により、該 RTKを標的とする SCLCの 新規治療薬剤が同定され始めた（非特許文献 4 = Gibbs, J. B. and Oliff, A. (1 994) Cell 79:193— 8; 非特許文献 5=Levitzki, A. and Gazit, A. (1995) Science 267: 1782— 8)。 c— Metおよび c— Kit RTK力 SCLCにおいて重 要であると同定された。分子量 145kDaのプロトオンコジーン産物である c Kit受 容体は、 c-Fms、 Flt3、および血小板由来成長因子受容体 (PDGFR)に類似の クラス ΠΙ RTKである。 SCLC腫瘍標本の約 70%、および細胞株は、 c— Kitおよ びその天然のリガンドである幹細胞因子（SCF)を共に発現する。 SCF/c-Kit経 路は、 SCLCでのオートクラインまたはパラクラインの機能である（非特許文献 6 = Hi bi, K. et al. (1991) Oncogene 6:2291— 6; 非特許文献 7=Yamanishi, Y . et al. (1996)jpn. J. Cancer Res. 87: 534— 42など）。
[0007] SCLCなどのがんの診断の有効な技術は、未だに提供されておらず、あつたとして も、より良好な、効率のよい技術の提供が要求されている。そこで、 SCLCなどのが んの診断に関連する分子標的を同定する必要がある。
非特許文献 1: Chute, J. P. et al. (1999)J. Clin. Oncol. 17:1794— 801 非特許文献 2: Chute, J. P. et al. (1997) Mayo Clin. Proc. 72:901— 12 非特許文献 3:Salgia, R. (1996) Adv. Oncol. 12:8— 15
非特許文献 4: Gibbs, J. B. and Oliff, A. (1994) Cell 79:193— 8
非特許文献 5:Levitzki, A. and Gazit, A. (1995) Science 267:1782-8 非特許文献 6:Hibi, K. et al. (1991) Oncogene 6:2291— 6
非特許文献 7:Yamanishi, Y. et al. (1996)jpn. J. Cancer Res.87:534—4
2
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] そこで、本発明は、全く新規な、がん (特に、小細胞肺がん)の診断のための技術を 提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0009] 上述した課題は、本発明者が鋭意検討した結果、 TSLC1の分子経路において、 特に、 TSLC1および Raclの発現レベル (過剰発現、糖鎖変化、活性ィ匕など）力 が ん（特に、小細胞肺がん）の発症と密接に関連していることを見出したことによって、 解決された。
従って、本発明は以下を包含する。
(1)がんの診断方法であって、
A)被験体における TSLC1の発現の増加または糖鎖の変化を観察する工程であ つて、正常個体と比較して増大した該発現または変化した糖鎖の存在は、該被験体 におけるがんの発現を示す、工程、
を包含する、方法。
(2)前記発現の増加は、 mRNAまたはタンパク質レベルで生じることを特徴とする、 前項 1に記載の診断方法。
(3)前記発現の増加は、 mRNAレベル力 正常値の 2倍以上になることである、前 項 1に記載の方法。
(4)前記発現の増加は、タンパク質レベル力 正常値の 2倍以上になることである、前 項 1に記載の方法。
(5)前記糖鎖の変化は、タンパク質の糖鎖パターンが正常パターンとは異なることで あり、 O—型または N—型の糖鎖修飾の増加が認められることである、前項 1に記載 の方法。
(6)前記発現の増加は、 8A+8B型スプライシング変異体の発現の増加を含む、前 項 1に記載の方法。
(7)前記 8A+8B型スプライシング変異体は、配列番号 1 (塩基配列)または配列番 号 2 (アミノ酸配列）により同定される、前項 6に記載の方法。
(8)前記がんは、小細胞肺がんを含む、前項 1に記載の方法。
(9)がんの診断方法であって、
A)被験体における Racの活性ィ匕を観察する工程であって、正常個体と比較したと きの発現の増加または活性の増加は、該被験体におけるがんの発現を示す、工程、 を包含する、方法。
(10)前記発現の増加は、 mRNAまたはタンパク質レベルで生じることを特徴とする 、前項 9に記載の診断方法。 (11)前記発現の増加は、 mRNAレベル力 正常値の 2倍以上になることである、前 項 9に記載の方法。
(12)前記発現の増加は、タンパク質レベルが正常値の 2倍以上になることである、前 項 9に記載の方法。
(13)前記活性の増加は、 p21活性ィ匕キナーゼの Rac結合ドメインと結合可能な Rac タンパク質の、細胞内全 Racタンパク質に占める割合として測定できる Racタンパク 質の活性レベルが正常値の 2倍以上になることである、前項 9に記載の方法。
(14)前記がんは、小細胞肺がんを含む、前項 9に記載の方法。
(15)前記レベルは、前記因子の特異的因子によって測定される、前項 1または 9に 記載の方法。
(16)前記特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子および それらの複合分子からなる群より選択される、前項 15に記載の方法。
(17)前記特異的因子は、標識されまたは標識され得る、前項 15に記載の方法。
(18)前記特異的因子は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の核酸分子に対 してストリンジェントな条件下でハイブリダィズする配列を有する核酸分子である、前 項 15に記載の方法。
(19)前記特異的因子は、配列番号 2または配列番号 6に示す配列のポリペプチドに 対する抗体である、前項 15に記載の方法。
(20)前記検出は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の核酸分子の全部また は一部を増幅するように設計されたプライマーを含む試薬を用いて行われる、前項 1 5に記載の方法。
(21)前記検出は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の核酸分子の全部また は一部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含む試薬を用いて行われ る、前項 15に記載の方法。
(22)前記検出は、配列番号 2または配列番号 6に示す配列のポリペプチドを特異的 に認識する抗体を含む試薬を用いて行われる、前項 15に記載の方法。
(23)前記検出は、活性化型 Rac 1を特異的に認識する抗体を含む試薬を用 ヽて行 われる、前項 15に記載の方法。 (24)がんの診断薬であって、 TSLC1または Raclのレベルを測定する手段を備える 、診断薬。
(25)前記診断薬は、小細胞肺がんの診断薬である、前項 24に記載の診断薬。
(26)前記手段は、前記 TSLC1の分子経路の因子の特異的因子である、前項 24に 記載の診断薬。
(27)前記特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子および それらの複合分子からなる群より選択される、前項 24に記載の診断薬。
(28)前記特異的因子は、標識されまたは標識され得る、前項 24に記載の診断薬。
(29)前記特異的因子は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の核酸分子に対 してストリンジェントな条件下でハイブリダィズする配列を有する核酸分子である、前 項 24に記載の診断薬。
(30)前記特異的因子は、配列番号 2または配列番号 6に示す配列のポリペプチドに 対する抗体
である、前項 24に記載の診断薬。
(31)前記手段は、該 Raclの活性ィ匕を同定する手段である、前項 24に記載の診断 薬。
(32)前記手段は、細胞または血清において Racl遺伝子の転写産物または Raclタ ンパク質の有無を検出する手段である、前項 24に記載の診断薬。
(33)前記手段は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の核酸分子の全部ま たは一部を増幅するように設計されたプライマーを含む、前項 24に記載の診断薬。
(34)前記手段は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の核酸分子の全部ま たは一部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含む、前項 24に記載の 診断薬。
(35)前記手段は、配列番号 2または配列番号 6に示す配列のポリペプチドを特異 的に認識する抗体を含む、前項 24に記載の診断薬。
(36)前記手段は、活性化型 Raclを特異的に認識する抗体を含む、前項 24に記 載の診断薬。
(37)がんの診断薬をスクリーニングする方法であって、該方法は： A)正常被験体とがん患者とにおける TSLC1または Raclのレベルの相違を観察 し、相違が見出される正常被験体とがん患者とを選択する工程;および
B)選択された正常被験体とがん患者とにお 、て TSLC1または Raclのレベルと 相関する因子を同定する工程
を包含する、方法。
(38)前項 37に記載のスクリーニング方法で同定されたがんの診断薬。
(39)がんの診断薬をスクリーニングするシステムであって、該システムは：
A)正常被験体とがん患者とにおける TSLC1または Raclのレベルの相違を観察 し、相違が見出される正常被験体とがん患者とを選択する手段；および
B)選択された正常被験体とがん患者とにお 、て TSLC1または Raclのレベルと 相関する因子を同定する手段とをそなえる、システム。
[0011] 以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該 分野における周知慣用技術力もその実施形態などを適宜実施することができ、本発 明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
[0012] 従って、本発明のこれらおよび他の利点は、必要に応じて添付の図面等を参照し て、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解さ れる。
発明の効果
[0013] 本発明によれば、がん（特に、小細胞肺がんおよび関連するがんまたは新生物）の 診断のための技術が提供される。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]小細胞肺がんにおける TSLC1の過剰発現。 A. TSLC1特異抗体を用いた免 疫組織染色。小細胞肺がんにおける TSLC1タンパク質の過剰発現が認められる。 B . TSLC1のノーザン 'ブロット解析。小細胞肺がんで TSLC1の過剰発現が高頻度に 認められる。
[図 2]小細胞肺がんで高発現する TSLC1は特異的なスプライシング 'バリアントであ る。 A. TSLC1遺伝子の臓器、病態特異的なスプライシングと O—型糖鎖修飾の違 い。 B.小細胞肺がんで認められるスプライシング 'バリアント。 [図 3]TSLC1タンパク質の糖鎖修飾。 A. TSLC1タンパク質のウェスタン 'ブロット解 析。 TSLC1タンパク質の分子量は、小細胞肺がん、 ATK細胞、上皮でそれぞれ異 なる。 B. N—型糖鎖、 O—型糖鎖特異的な消化により、小細胞肺がんの TSLC1タ ンパク質は分子量が減少する。
[図 4]図 4は、 TSLC1によるがん細胞の浸潤性形質の誘導を示す。 TSLC1発現の 欠如したがん細胞を NIH3T3単層細胞上へ重層培養し、ドキシサイクリンにより TSL C1の発現を誘導した。 TSLC1は抗 TSLC1抗体と二次抗体 (青)で、ァクチン分子 はファロィジン (赤）で染色した。示されるように、 TSLC 1の過剰発現により、がん細 胞は浸潤形質を示した。
[図 5]図 5は、 TSLC1タンパク質と Tiamlタンパク質との in vitroでの結合を示す。 i n vitro転写 '翻訳して作成した Tiamlタンパク質、ならびに部分断片と、大腸菌に て GST融合タンパク質として作成した TSLC1細胞内断片（GST— C)ならびにその C端 9アミノ酸を欠失した断片とを GSTカラム上で結合させ、溶出断片を検出した。 右端は合成した Tiamlならびにその部分断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動にて 検出した。
[図 6]図 6および図 7は、 TSLC1タンパク質と Tiamlタンパク質との in vitroでの結 合を示す。培養がん細胞に V5タグ配列をつけた Tiamlタンパク質を導入、発現させ 、抗 V5抗体、またはマウス IgG (図 6)、あるいは抗 TSLC1抗体、またはマウス IgG ( 図 6)で免疫沈降し、沈降物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、抗 TSLC 1抗体（図 6)、ならびに抗 Tiaml抗体（図 7)にて検出した（ウェスタン.ブロット法)。 対照として、細胞溶解物を抗 TSLC 1抗体、ならびに抗 V5抗体で検出し（図 6)、ある いは細胞溶解物と免疫沈降物を抗 V5抗体で検出（図 7)した。
[図 7]図 6および図 7は、 TSLC1タンパク質と Tiamlタンパク質との in vitro での結 合を示す。培養がん細胞に V5タグ配列をつけた Tiamlタンパク質を導入、発現させ 、抗 V5抗体、またはマウス IgG (図 6)、あるいは抗 TSLC1抗体、またはマウス IgG ( 図 6)で免疫沈降し、沈降物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、抗 TSLC 1抗体（図 6)、ならびに抗 Tiaml抗体（図 7)にて検出した（ウェスタン.ブロット法)。 対照として、細胞溶解物を抗 TSLC 1抗体、ならびに抗 V5抗体で検出し（図 6)、ある いは細胞溶解物と免疫沈降物を抗 V5抗体で検出（図 7)した。
[図 8]図 8は、 TSLC1タンパク質と Tiamlタンパク質との共局在を示す。培養がん細 胞で TSLC1タンパク質の発現をドキシサイクリンにて誘導し、 TSLC1タンパク質と Ti amiタンパク質との局在を、それぞれ抗 TSLC1抗体、ならびに抗 Tiaml抗体にて 検出した。右端は両シグナルを合成した画像である。
[図 9]図 9は、 TSLC1は HGFによる MDCK細胞の上皮間葉転換、遊走性、浸潤性 、ならびに Raclの活性ィ匕を抑制することを示す。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下、本発明を詳細に説明する。以下には、本発明が、必要に応じて、添付の図 面を参照して例示の実施例により記載される。本明細書の全体にわたり、単数形の 表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきであ る。従って、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むこと が理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しな い限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。し たがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および 科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同 じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書 (定義を含めて)が優先する。
[0016] (定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
[0017] 本明細書において「TSLC1」とは、肺非小細胞がんにおいてがん抑制遺伝子とし て報告された遺伝子である（Kuramochi M, Fukuhara H, Nobukuni T, et a 1. TSLCl is a tumor-suppressor gene in human non-small-cell lung cancer. Nat Med. 2001 ; 27 :427— 430)。また、 TSLCl遺伝子は、多くの肺 がんにおいて共通して欠失している染色体部分力 単離された遺伝子であり、最近 の研究力 上皮細胞の接着機能に関与していると考えられている（Masuda M, Ya geta M, Fukuhara H, et al. The tumor suppressor protein TSLCl ι s involved in cell-cell adhesion. J Biol Chem. 2002 ; 277 : 31014- 31019)。肺がん等において、 TSLCl遺伝子を含む染色体が欠失し、細胞接着能 が低下することによって、がん細胞が他の臓器に転移しやすくなつて 、ると考えられ て
いる。
形態学的形質変換は、がん細胞を正常な上皮細胞と区別するための基本的表現 型である。 TSLC1は、染色体フラグメント 11 q23. 2上にある腫瘍サブレッサー遺伝 子であり、これは、機能的相補によって同定された (Kuramochi, M. , Fukuhara, H. , Nobukuni, Τ. , Kanbe, Τ. , Maruyama, Τ. , Ghosh, Η. Ρ. , Pletcher , Μ. , Isomura, Μ. , Onizuka, Μ. , Kitamura, Τ. , Sekiya, Τ. , Reeves, R . Η. , and Murakami, Υ. (2001) Nat Genet 27, 427—430.；)。プロモータ 一のメチル化および TSLC1発現の喪失が、原発性肺がん、原発性食道がん、原発 性脾臓がん、および種々の他のがんの進行期において頻繁に観察される (Kuramo chi, M. , Fukuhara, Η. , Nobukuni, Τ. , Kanoe, Τ. , Maruyama, Τ. , o sh, Η. P. , Pletcher, Μ. , Isomura, Μ. , Onizuka, Μ. , Kitamura, Τ. , Se kiya, Τ. , Reeves, R. Η. , and Murakami, Υ. (2001) Nat Genet 27, 427 -430. ； Murakami, Y. (2002) . Oncogene, 21, 6936— 6948.；)。 TSLC1は 、細胞間接着を媒介する免疫グロブリンスーパーファミリー分子をコードする（Masud a, M. , Yageta, Μ. , Fukuhara, Η. , Kuramochi, Μ. , Maruyama, Τ. , No moto, Α. & Murakami, Y. (2002) . J Bio Chem, 277, 31014— 31019. ) 。 TSLC1タンパク質の喪失は、原発性肺腺がんの浸潤性先端において主に見出さ れた（Ito, A. , Okada, M. , Uchino, K. , Wakayama, T. , Koma, Y. , Iseki , S. , Tsubota, N. , Okita, Y. & Kitamura, Y. (2003a) . Lab Invest, 83 , 1175 - 1183. )0従って、 TSLC1は、上皮細胞接着に主に関与しているようであ り、一方、 TSLC1機能の喪失は、がん細胞が浸潤および Zまたは転移するのをもた らし得る。最近、 TSLC1は、上皮細胞接着においてのみならず、セルトーリ細胞への ***形成細胞の接着、線維芽細胞への肥満細胞の接着、および神経細胞のシナプ ス形成においても役割を有することが見出され、 TSLC1/IGSF4/N ecl- 2/Sg IGSF/RA175/SynCAMと呼ばれる（Biederer, T. , Sara, Y. , Mozhayev a, M. , Atasoy, D. , Liu, X. , Kavalali, E. T. & Sudhof, T. C. (2002) . S cience, 297, 1525— 1531 ;Gomyo, H. , Ami, Y. , Tanigami, A. , Muraka mi, Y. , Hattori, M. , Hosoda, F. , Ami, K. , Aikawa, Y. , Tsuda, H. , Hi rohashi, S. , Asakawa, S. , Shimizu, N. , Soeda, E. , Sakaki, Y. & Ohki , M. (1999) . Genomics, 62, 139— 146. ； Kuramochi, M. , Fukuhara, H . , Nobukuni, T. , Kanbe, T . , Maruyama, T. , Ghosh, H. P. , Pletcher, M. , Iso mura, M. , Onizuka, M. , Kitamura, T. , Sekiya, T. , Reeves, R. H. , and Murakami, Y. (2001) Nat Genet 27, 427—430. ； Shingai, T . , Ikeda, W. , Kakunaga, S. , Morimoto, K. , Takekuni, K. , Itoh, S. , Sa toh, K. , Takeuchi, M. , Imai, T. , Monden, M. & Takai, Y. (2003) . J Biol Chem, 278, 35421— 35427. ； Urase, K. , Soyama, A. , Fujita, E. & Momoi, T. (2001) . Neuroreport, 12, 3217— 21. ； Wakayama, T. , Oh ashi, K. , Mizuno, K. & Iseki, S. (2001) . Mol Reprod Dev, 60, 158— 164.；)。
TSLC1の細胞質ドメインは、プロテイン 4. ファミリーの分子に対する結合モチーフ を保有する。本発明者らは、 TSLC1力 プロテイン 4. 1結合モチーフを介して DAL - 1/4. 1Bと結合することを以前に報告した（Yageta, M. , Kuramochi, M. , Μ asuda, Μ. , Fukami, Τ. , Fukuhara, Η. , Maruyama, Τ. , Shibuya, Μ. & Murakami, Υ. (2002) . Cancer Res, 62, 5129— 5133.；)。 DAL— 1は、 N SCLC、髄膜腫、および乳がんにおける腫瘍サブレッサーの候補であり、プロテイン 4 . 1ファミリー分子に属する。このプロテイン 4. 1アミリー分子は、膜貫通タンパク質を ァクチンおよびスぺクトリン力 なる細胞骨格に連結する（Sun, C. X. , Robb, V. A . & Gutmann, D. H. (2002) . J Cell Sci, 115, 3991—4000.；)。本発明者 らはまた、 TSLC1は、 MPP3 (膜結合型グァ -ル酸キナーゼホモログ（MAGuK)の メンバーである） に対して、 TSLC1のカルボキシル末端にあるクラス II PSD95/D lg/ZO- 1 (PDZ)ドメイン結合モチーフである EYFIを介して結合することを示した ( Fukunara, H. , Masuda, M. , Yageta, Μ. , Fukami, Τ. , Kuramochi, Μ. , Maruyama, Τ. , Kitamura, Τ. & Murakami, Υ. (2003) . Oncogene, 22 , 6160— 6165. )。 ΜΡΡ3のクラス Π PDZドメインは、 TSLC1との結合を担い、他 の 2つの MAGuKタンパク質（MPPlZp55および MPP2ZDLG2) において保 存されている（Mazoyer, S. , Gayther, S. A. , Nagai, M. A. , Smith, S. A. , Dunning, A. , van Rensburg, E. J. , Albertsen, H. , White, R. & Ponde r, B. A. (1995) . Genomics, 28, 25— 31. ； Ruff, P. , Speicher, D. W. & Husain-Chishti, A. (1991) . Proc Natl Acad Sci USA, 88, 6595— 65 99. )。 MPP1、 MPP2、および MPP3は、 Drosophilastardust (Sdt)のヒト対応 物であると考えられ、細胞分極に関与する（Bachmann, A. , Schneider, M. , Th eilenberg, E. , Grawe, F. & Knust, E. (2001) . Nature, 414, 638— 643.
) o
[0020] 本出願において、本発明者らは、 DLA- 1および MAGuK力 互いに直接結合す ること、そして TSLC1が、 DAL— 1および MAGuKメンバーと 3者結合タンパク質複 合体を形成することを示す。 siRNAによる TSLC1発現の抑制は、これらのタンパク 質複合体が、成熟細胞接着を伴う上皮細胞構造の形成にぉ ヽて重要な役割を果た すことを示す。
[0021] TSLC1ZIGSF4Aは、免疫グロブリンスーパーファミリーである細胞細胞接着分 子（IgCAM) (Masuda, M. , ¾ (2002) J Biol Chem 277, 31014— 31019) のファミリーに属する単一の膜貫通型糖タンパク質をコードする、非小細胞肺がん (N SCLC) (Gomyo, H. , ら（1999) Geno mics 62, 139— 146 ;および Kuramoc hi, M. , ら（2001) Nat Genet 27, 427-430) における腫瘍抑制遺伝子であ る。種々の組織におけるその多様な機能に起因して、 TSLC1は、いくつかの異なる 研究グループにより特徴付けられている。この遺伝子は、それゆえ、 RA175 (Fujita , E. ,ら（2003) Exp Cell Res 287, 57— 66)、 SgIGSF (Ito , A. ,ら（2003) Blood 101, 2601— 2608)、 NecI2 (Shingai, T. ,ら（2003)J Biol Chem 2 78, 35421— 35427)および SynCAMl (Biederer, T. , ら（2002) Science 29 7, 1525— 1531)としても知られている。原発性の NSCLCにおいて、本発明者らは 、 C末端の 19アミノ酸残基の置き換えを生じる TSLC1に 2bpの欠失を発見し、このこ とは、 TSLC1の細胞質ドメイン力 腫瘍の抑制に重要であることを示している (Kura mochi, M. ,ら（2001) Nat Genet 27, 427—430)。実際、細胞質ドメインは、 ヌードマウスにおいて、 TSLC1の腫瘍特性活性に必須であることが示された (Mao, X. ,ら（2003) Cancer Res 63, 7979— 7985)。 TSLC1の細胞質ティルは、。末 端に、プロテイン 4. 1 (protein 4. 1)と相互作用する傍膜配列 (juxtamembrane) (プロテイン 4. 1結合モチーフ：プロテイン 4. 1— BM)およびクラス II PDZ結合モチ ーフ（PDZ— BM)を含む。
[0022] 本発明者らは、プロテイン 4. 1BZDAL—1 (プロテイン 4. 1ファミリーのメンバー） 力 TLSC1をァクチン骨格に接続すること、そして、この相互作用力 ァクチンの再 構築に関与することを実証した (Yageta, M. ,ら（2002) Cancer Res 62, 5129 5133)。他の研究グループおよび本発明者らは、 TSLC1がまた、そのクラス II P DZドメインを通して膜関連グァ -ル酸キナーゼホモログ (MAGuK)と相互作用する ことを報告し（Shingai, T. ,ら（2003)J Biol Chem 278, 35421— 35427 ;Bie derer, T. ,ら（2002) Science 297, 1525— 1531；および Fukuhara, H. ,ら（2 003) Oncogene 22, 6160— 6165)、そして、 TSLC1、プロテイン 4. 1および M AGuKが、 3分子から構成される複合体を形成することを示唆した。 TSLC1は、最 初に、ヌードマウスにおいて、ヒト肺腺がんである A549細胞のその腫瘍形成能に基 づいて同定された（Kuramochi, M. ,ら（2001) Nat Genet 27, 427—430)。 A549細胞における TSLC1発現の回復は、脾臓力 肝臓への転移を阻害した (Yag eta, M. , ¾ (2002) Cancer Res 62, 5129— 5133)。 TLSC1の欠失は、進行 した肺がんおよび多くの他のヒトがんにおいて高頻度で観察されている（Kuramoc h i, M. , ら（2001) Nat Genet 27, 427—430, 11)。これらの観察は、 TSLC1 末端モチーフが、腫瘍の浸潤および Zまたは転移において重要な役割を演じ ることを強く示唆するが、なお、腫瘍抑制におけるこれらのモチーフの正確な役割は 、不明瞭なままである。
[0023] TSLC 1の代表的なヌクレオチド配列は、
(a)配列番号 1に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオ チド；
(b)配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントを コードするポリヌクレオチド； (c)配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸力 置換、付加お よび欠失力 なる群より選択される 1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそ のフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリ ヌクレ才チド；
(d)配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体ま たはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
(e)配列番号 2に記載のアミノ酸配列力 なるポリペプチドの種相同体またはそのフ ラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
(f) (a)〜（e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリ ダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;また は
(g) (a)〜（e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一 性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプ チドをコードするポリヌクレオチド
[0024] TSLC1のアミノ酸配列としては、
(a)配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
(b)配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加およ び欠失からなる群より選択される 1の変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリ ペプチド；
(c)配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体に よつ
てコードされる、ポリペプチド；
(d)配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
(e) (a)〜（d)のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 70 %で あるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。
[0025] TSLC1の代表的な配列は、配列番号 1 (核酸配列）および配列番号 2 (アミノ酸配 列）において示される。 [0026] TSLC1は、ヒトのほか、他の動物（例えば、哺乳動物）でもそのホモログ (本明細書 において、「対応する」遺伝子などという）が知られている。従って、本明細書におい て TSLC1は、通常、特に言及しない場合は、ヒトのほか、生物一般において存在す る TSLC1を旨す。
[0027] 本明細書において「TSLC1の分子経路」とは、 TSLC1が媒介するシグナル伝達 経路をいい、本発明において、 Tiamlおよび低分子量 G共役タンパク質 Raclが関 与し、その因子であることが明らかになった。従って、本明細書では、 TSLC1の分子 経路というときには、 TSLC1のほ力、 Tiaml (例えば、配列番号 3および 4)および R acl (例えば、配列番号 5および 6)が因子として存在することが理解される。
[0028] 本明細書において「Racl」とは、がん遺伝子の Rasサブファミリーの一つであり、 Ra sサブファミリ一は、 Rho, Raclおよび Cdc4からなる。 Rasは、様々なシグナル伝達 経路を制御する GTPase—パーファミリーに属する。 Rasは、細胞増殖および分化の 制御に関与している （Boguski. M. S. and McCormick, F. (1993) Nature 366, 643— 654)。これらのサブファミリ一は、細胞増殖の制御、特に細胞の形質転 換の制御、ならびに、細胞接着の形成の調節、および増殖因子刺激時のァクチン細 胞骨格変化の調節に関与している（Coso. O. A. , Chiariello. M. , Yu. J. —C . , Teramoto. H. , Crespo. P. , Xu. Nu. , Miki. T. and Gutkind. J. S. (19 95) Cell 81, 1137— 1146 : Hill. C. S. , Wy nne. J. and Treisman. R. (199 5) Cell 81, 1159 - 1170 :Kozma. R. , Ahmed. S. , Best. A. and Lim. L. ( 1995) Mol. Cell. Biol. 15, 1942— 1952 : Minden. A. , Lin. A. , Claret. F. —X. , Abo. A. and Karin. M. (1995) Cell 81, 1147— 1157 : Nobes. C. D. and Hall. A. (1995) Cell 81, 53— 62 : Olson. M. F. , Ashworth. A. an d Hall. A. (1995) Science 269, 12 70— 1272)。し力し、/ J、糸田胞月巿力 Sんなど力 S ん、新生物などに関しては関連が知られていな力つた。 Raclは、葉状突起と呼ばれ るァクチンに富んだ突起を形成することで細胞運動の際の駆動力を提供している。
[0029] Rasファミリーのタンパク質は、その全部に共通に、不活性 (GDP結合)状態と活性
(GTP結合)状態との間を転換する。従って、これらの GTPaseは、特定の経路を調 節するために、分子スィッチとして働き、情報を処理し、そして伝達する。 GTP状態と GDP状態との間を転換する性質に基づ 、て、 Rasおよび Ras近縁 GT Paseのヌクレオチド状態を制御するタンパク質が同定および精製されている（Bogus ki. M. S. and McCormick, F. (1993) Nature366, 643— 654)。 GTP力も G DPへの加水分解を検査することによって、多数の Rasファミリーのタンパク質にお!/ヽ て、その GTPaseの活性化タンパク質（GAP)が解析された（Boguski. M. S. and McCormick, F. ( 1993) Nature 366, 643— 654 : Barfod. E. T. , Zheng. Y . , Kuang. W. —J. , Hart. M. J. , Evans. T. , Ceri one. R. A. and Ashken az. A. (1993) Biol. Chem. 268, 26059 - 26062： Lamarche. N. and Hal 1. A. (1994) Trends Genet. 10, 436 -440 : Cerione. R. A. and Zheng. Y . (1996) Current Opinion in Cell Biology 8, 216— 222)。最後の参考文 献では、 Rasおよび Ras近縁 GTPaseのグァニンヌクレオチド状態に影響するタン パク質の特性にっ 、て良く考察されて 、る。 GDPの解離を抑制する性質に基づ 、て 、グァニンヌクレオチド解離抑制因子 (GDI)が同定された。これらは GTP状態にも結 合して、内因性及び GAP刺激性の GTP加水分解を抑制することが見出された (Bog uski. M. S. and McCormick, F. (1993) Nature 366, 643— 654)。一般に 、 GAPおよび効果器 (effector)は、 GTP結合状態に対して高い親和性を有する。 一方、 GDIタンパク質は、 GDP結合状態に最も強く結合する。この様な特性を利用 して、 Cdc42 (Bagrodia. S. , Taylor. S. J. , Creasy. C. L. Chernoff. J. and
Cerione. R. A. (1995) Biol. Chem. 270, 22731 - 22737 : Manser. E. , Leung. T. Salihuddin. H. , Zhao. Z. — s. and Lim. L. (1994) Nature 3 67, 40-46 : Martin. G. A. , Bollag. G. , McCormick. F. and Abo. A. (19 95) EMBO J. 14, 1970— 1978)、 Ras (Moodie. S. A. , Willumsen. B. M. , Weber. M. J. and Wolfman. A. (1993) Science 260, 1658— 1661 :Rod riguez― Viciana . P. , Warne. P. H. , Dhand. R. Vanhaesebroeck. B. , G out. I. , Fry. M. J. , Waterfield. M. D. and Downward. J. (1994) Nature
370, 527— 532)および Rho (Leung. T. , Manser. E. , Tan. L. and Lim. L. (1995) Biol. Chem. 270, 29051 - 29054 :Watanabe. G. , Saito. Y. , Madaule. P. , Ishizaki. T. , Fujisawa. K. , Morii. N. , Mukai. H. , Ono. Y. , Kakizuki. A. and Narumiya. S. (1996) Science 271, 645— 648)の 効果器を精製した。 Cdc42Hs-GTPを利用した親和的方法によって、 Cdc42によ つて誘導される細胞骨格変化の潜在的な仲介因子である IQGAPlが解析された (H art. M. J. , Callow. M. , Souza. B. and Polakis. P. (1996) EMBO J. 15, 2 997— 3005)。
[0031] この親和的方法の改法を用いて、グァニンヌクレオチド交換因子 (GEF)を同定お よび精製することもできる。ヌクレオチド欠失状態の G—タンパク質に優先的に相互 作用する性質に基づいて、他の制御タンパク質から、 GEFを識別することができる（ Hart. M. J. , Eva. A. , Zangrilli. D. , Aaronson. S. A . , Evans. T. , Ceri one. R. A. and Zheng. Y. (1994) Biol. Chem. 269, 62— 65 : Mosteller, R. D. , Han. J. and Broek. D. (1994) Mol. Cell. Biol. 14, 1104—1112)。 Ras類似タンパク質の活性化において、 GEFは、 GDPの解離とそれに続く GTPの 結合を促進することによって、重要な機能を果たす。例えば、増殖因子の刺激によつ て、 Ras特異的 GEFである Sosが転移することによって、 Rasは、 GTP結合型に転換 する（Buday. L. and Downward. J. (1993) Cell 73, 611— 620)。 Raclファ ミリ一のタンパク質を特異的に活性ィ匕する GEFを解析することによって、それらの GT Paseが関与するシグナル伝達経路が解明され、従って、、細胞増殖の分子機構が より良く理解されるだろう。更に、制御されない細胞増殖を原因とする疾患を予防およ び治療する薬を見出すことができる。 Raclは、シグナル伝達および細胞増殖におい て中心的な機能を果たすので、現在、 Racl— GEFの同定および解析は、科学上か なり注目されている。 Racl— GEFの 1つとして、 Tiamlが知られている（Michiels, F. , Habets, G. G. , Stam, J. C. , van der Kammen, R. A. , and Collard , J. G. (1995) Nature 375, 338— 340. See also. Eva. A. and Aaronson . S. A. (1985) Nature 316, 273— 275 :Toksoz. D. and Williams. D. A . (1994) Oncogene 9, 621— 628)。
[0032] GDPZGTP交換因子（GEF)としてこれまでに数 10種類のものが知られており、こ れら GEFの中でも、 Racl特異的な GEFとして機能する分子として、胸腺腫細胞株の 浸潤を規定する Tiaml, 2 (例えば、 Cell, 77, 537- 549, 1994、 Nature, 375, 338 - 340, 1995参照。）や、 T細胞受容体シグナルを制御する Vavl (例えば、 Na ture, 385, 169— 172, 1997参照。）の他 Vav2、 Vav3や、 Trio (例えば、 J. Cell Science, 113, 729— 739, 2000参照。；)や、 STEF (例えば、 J. Biol. Chem. , 277, 2860- 2868, 2002参照。；)や、 P— Rexl (例えば、非特許文献 21参照。 ) が知られており、これら 5種類はいずれも共通のドメインをもっており、 GTPを Racl に付与する機能を有して 、る。
[0033] Raclの代表的なヌクレオチド配列は、
(a)配列番号 5に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオ チド；
(b)配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントを コードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸力 置換、付加お よび欠失力 なる群より選択される 1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそ のフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリ ヌクレ才チド；
(d)配列番号 5に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体ま たはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
(e)配列番号 6に記載のアミノ酸配列力 なるポリペプチドの種相同体またはそのフ ラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
(f) (a)〜（e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリ ダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;また は
(g) (a)〜（e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一 性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプ チドをコードするポリヌクレオチド、
であり得る。
[0034] Raclのアミノ酸配列としては、
(a)配列番号 6に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド； (b)配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加およ び欠失力 なる群より選択される 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、 ポリペプチド；
(c)配列番号 5に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体に よってコードされる、ポリペプチド；
(d)配列番号 6に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e) (a)〜（d)のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 70%であ るアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。
[0035] Raclの代表的な配列は、配列番号 5 (核酸配列）および配列番号 6 (アミノ酸配列） において示される。
[0036] 本明細書において Tiamlとは、 Racl特異的な GDPZGTP交換因子（GEF)とし て機能する分子として同定された分子をいう（Michiels, F. , Habets, G. G. , Sta m, J. C. , van der Kammen, R. A. , and CoUard, J. G. (1995) Nature 3 75, 338 - 340. See also. Eva. A. and Aaronson. S. A. (1985) Nature 3 16, 273 - 275 :Toksoz. D. and Williams. D. A. (1994) Oncogene 9, 621 — 628)。
[0037] Tiamlの代表的なヌクレオチド配列は、
(a)配列番号 3に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオ チド；
(b)配列番号 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントを コードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸力 置換、付加お よび欠失力 なる群より選択される 1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそ のフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリ ヌクレ才チド；
(d)配列番号 3に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体ま たはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド； (e)配列番号 4に記載のアミノ酸配列力 なるポリペプチドの種相同体またはそのフ ラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
(f) (a)〜（e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリ ダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;また は
(g) (a)〜（e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一 性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプ チドをコードするポリヌクレオチド、
であり得る。
[0038] Tiamlのアミノ酸配列は、
(a)配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
(b)配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加およ び欠失力 なる群より選択される 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、 ポリペプチド；
(c)配列番号 3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体に よってコードされる、ポリペプチド；
(d)配列番号 4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
(e) (a)〜（d)のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 70%であ るアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。
[0039] Tiamlの代表的な配列は、配列番号 3 (核酸配列）および配列番号 4 (アミノ酸配列 )において示される。
[0040] 本明細書において「因子」（agent)としては、意図する目的を達成することができる 限りどのような物質または他の要素 (例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー )でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリ ゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸 (例え ば、 cDNA、ゲノム DNAのような DNA、 mRNAのような RNAを含む）、ポリサッカリド 、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子 (例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、 有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る 低分子 (例えば、低分子リガンドなど)など）、これらの複合分子が挙げられるがそれら に限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、その ポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を (例えば、 70%以上の配列同 一性)もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因 子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対 して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向さ れた抗体またはその誘導体あるいはその類似物 (例えば、単鎖抗体)、そのポリぺプ チドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そ のポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されな い。
したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的 因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポ リペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が 3 0%未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同 等またはより高いか、好ましくは有意に (例えば、統計学的に有意に）高いものを包含 する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダィゼーシヨンアツセィ、結合アツセィな どによって測定することができる。本明細書において第一の物質または因子が第二 の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二 の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子 (特に、 第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対する よりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互 作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダィゼーシヨン、タンパク質における抗 原抗体反応、リガンドーレセプター反応、酵素一基質反応など、核酸およびタンパク 質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タン パク質 脂質相互作用、核酸 脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定され ない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第 二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子 力、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含され る。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または 因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗 原抗体反応による相互作用、レセプタ一一リガンド反応による相互作用、酵素一基 質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。 2種類の物質または因子が タンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子 に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸 分子の結合領域との間の相互作用が包含される。
[0042] 本明細書にお!、て「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異 性抗体、キメラ抗体、および抗イディォタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えば F (ab' ) および Fab断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さ
2
らにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ヮサビペルォキシ ダーゼ、 αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい
[0043] 本明細書において「抗原」（antigen)とは、抗体分子によって特異的に結合され得 る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（immunogen)とは、抗原特異的 免疫応答を生じるリンパ球活性ィ匕を開始し得る抗原をいう。
[0044] 本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられるかぎり、どのような特異 性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いられる抗体 は、ポリクローナル抗体であってもよぐモノクローナル抗体であってもよい。
[0045] 本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を 意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が 挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物 であり得る。
[0046] 本明細書にぉ 、て「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さな ものをいう。通常有機低分子は、分子量が約 1000以下のものをいうが、それ以上の ものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるか それらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産 させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有 機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低 分子 (例えば、低分子リガンドなど)などが挙げられるがそれらに限定されな 、。
[0047] 本明細書において「リガンド」とは、あるタンパク質に特異的に結合する物質をいう。
例えば，細胞膜上に存在する種々のレセプタータンパク質分子と特異的に結合する レクチン、抗原、抗体、ホルモン、神経伝達物質などがリガンドとして挙げられる。 TS LC1の分子経路における因子がレセプターの場合は、その相手は、リガンドと称され る。
[0048] 本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ぺプチ ド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをい う。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよぐ環状であってもよい。アミノ酸 は、天然のものであっても非天然のものであってもよぐ改変されたアミノ酸であっても よい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされた複合体 をさし得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含 する。そのような改変としては、例えば、ジスルフイド結合形成、グリコシル化、脂質ィ匕 、ァセチル化、リン酸ィ匕または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との 結合体化)などが挙げられる。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1または 2以上 のアナログを含むポリペプチド (例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様 化合物（例えば、ぺプトイド）および当該分野にお!、て公知の他の改変が包含される 。特に言及する場合、本発明の「ポリペプチド」は、 TSLC1の分子経路における任意 の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）を指すこともある。
[0049] 本明細書にぉ 、て「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよ 、。「誘導体ァ ミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミ ノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナ口 グは、当該分野において周知である。
[0050] 本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸の L 異性体を意味する 。天然のアミノ酸は、グリシン、ァラニン、ノ リン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチォ ニン、トレオニン、フエ二ルァラニン、チロシン、トリプトファン、システィン、プロリン、ヒ スチジン、ァスパラギン酸、ァスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、 γ カルボキシ グルタミン酸、アルギニン、オル-チン、およびリジンである。特に示されない限り、本 明細書で 、う全てのアミノ酸は L体である。
[0051] 本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されな いアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、上述の D型アミノ酸、ノルロイシン、 ノ ラーニトロフエ二ルァラニン、ホモフエ二ルァラニン、パラーフルオロフェニルァラニ ン、 3 アミノー 2 ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンの D体または L体および D フエ-ルァラニンが挙げられる。
[0052] 本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性お よび Ζまたは機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、ェチォ ニン、カナバニン、 2—メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、ァミノ 酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様 な様式で機能する化合物を 、う。
[0053] アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号力、または IUPAC— IUB Biochemica 1 Nomenclature Commissionにより推奨される 1文字記号のいずれかにより、本 明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた 1文字コー ドにより言及され得る。
[0054] 本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明 細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この 用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「ォ リゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体 を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポ リヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体 的には、例えば、 2，一O—メチルーリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジ エステル結合がホスホロチォエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリ ゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N3，—P5，ホスホロアミデート結合に変換 されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル 結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチ ド中のゥラシルが C— 5プロピ-ルゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ォ リゴヌクレオチド中のゥラシルが C— 5チアゾールゥラシルで置換されたオリゴヌクレオ チド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンが C— 5プロピ-ルシトシンで置換された オリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキサジン修飾シト シン（phenoxazine— modified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体 、 DNA中のリボースが 2，一O—プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘 導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが 2，ーメトキシエトキシリボースで置換され たオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではな 、と示されなければ、 特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された 改変体 (例えば、縮重コドン置換体)および相補配列を包含することが企図される。具 体的には、縮重コドン置換体は、 1またはそれ以上の選択された (または、すべての） コドンの 3番目の位置が混合塩基および Zまたはデォキシイノシン残基で置換された 配列を作成することにより達成され得る（Batzerら、 Nucleic Acid Res. 19 : 5081 (1991) ; Ohtsukaら、 J. Biol. Chem. 260 : 2605— 2608 (1985) ;Rossoliniら、 Mol. Cell. Probes 8 : 91— 98 (1994) )。
[0055] 本明細書にぉ 、て「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよ 、。「ヌク レオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは 異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド 誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌク レオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチォエート、ホスホ ルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、 2，一 O—メチルリボヌク レオチド、ペプチド型核酸 (PNA)が含まれる力 これらに限定されない。
[0056] 本明細書にぉ 、て「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低 分子などの分子が複数種連結してできた分子を 、う。そのような複合分子としては、 例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書で は、配列番号 2のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメント であって、診断に関与する生物学的な活性性を有する限り、それぞれの改変体もしく はフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核 酸分子を含む複合分子も使用することができる。
[0057] 本明細書にぉ 、て「核酸」はまた、遺伝子、 cDNA、 mRNA、オリゴヌクレオチド、 およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライ ス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核 酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名 が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産 物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の)核酸スプライス産物が異なる ポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は 変化するが、ェキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同 じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反 応の任意の産物 (組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。本発 明において用いられる場合、 TSLC1の分子経路における任意の因子 (例えば、 TS LC、 Tiaml、 Raclなど）はまた、この核酸形態をとり得る。
[0058] 本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上 に一定の順序に配列して ヽる。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝 子といい、その発現を左右する遺伝子を調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子 」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに Zあるいは「タン パク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。
[0059] 本明細書において遺伝子の「相同性」とは、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する 同一性の程度をいう。従って、ある 2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列 の同一性または類似性は高い。 2種類の遺伝子が相同性を有する力否かは、配列の 直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダィゼーシヨン 法によって調べられ得る。 2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列 間で DNA配列力 代表的には少なくとも 50%同一である場合、好ましくは少なくとも 70%同一である場合、より好ましくは少なくとも 80%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98 %または 99%同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
[0060] 本明細書ではアミノ酸および塩基配列の類似性、相同性および同一性の比較は、 配列分析用ツールである BLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される 。同一性の検索は例えば、 NCBIの BLAST 2. 2. 9 (2004. 5. 12発行）を用い て行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記 BLASTを用い、デ フォルトの条件でァラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高 い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価さ れる場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
[0061] 本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子また はポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオ チドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有する力、または有す ることが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活 性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸を！ヽぅ。例え ば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するォ ルソログにおける同様の部分であり得る。また、本発明の活性型 TSLC1の分子経路 における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）では、対応するアミノ酸 は、例えば、リン酸化される部位であり得る。別の実施形態では、本発明の活性型 T SLC1の分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）では 、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」ァミノ 酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、その ような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。
[0062] 本明細書にぉ 、て「対応する」遺伝子 (例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレ ォチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同 様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子 (例えば、ポリペプチド分 子またはポリヌクレオチド分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在す る場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺 伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、マウスの TSLC1の分子経 路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Racなど） A、 TSLC1の分子経 路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど） Bなどの遺伝子に対 応する遺伝子は、他の動物（ヒト、ラット、ブタ、ゥシなどにおいても見出すことができ る。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定する ことができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺 伝子の基準となる遺伝子 (例えば、マウスの TSLC1の分子経路における任意の因子 (例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど） A、 TSLC1の分子経路における任意の因 子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど） Bなどの遺伝子）の配列をクエリ配列として 用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出 すことができる。
[0063] 本明細書にぉ 、て「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（ 長さが n)に対して、 l〜n— 1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオ チドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例え ば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 2 0、 25、 30、 40、 50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙して いない整数で表される長さ (例えば、 11などもまた、下限として適切であり得る。また 、ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20、 25、 30、 40、 50、 75、 100 およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙して!/、な!/、整数で表 される長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、 このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーとして機能する場合、そのフ ラグメント自体もまたマーカーとしての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ること が理解される。
[0064] 本明細書中で使用される「接触 (させる）」とは、化合物を、直接的または間接的の いずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接さ せることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液 などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリぺプ チドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマ イクロアレイ (例えば、遺伝子チップ)などに化合物を置くことが挙げられる。
[0065] 本明細書にぉ 、て「ストリンジェントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド」と は、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択 されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニ一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラー ク 'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法などを用 いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニー あるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. OMの Na C1存在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC (salin e- sodium citrate)溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM 塩化ナトリウ ム、 15mM クェン酸ナトリウムである）を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄する ことにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダィゼーシヨンは、 Molecu lar Cloning 2ηα ed. , Current Protocols m Molecular Biology, ¾uppl ement 1〜38、 DNA Cloning 1 : Core Techniq ues, A PRacltical Appr oach, Second Edition, Oxford University Press (1995)などの実験書に記 載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブ リダィズする配列からは、好ましくは、 A配列のみまたは T配列のみを含む配列が除 外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド (例えば、 TSLC1の分子 経路における任意の因子 (例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）には、本発明で特 に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下 でノ、イブリダィズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
[0066] 本明細書にぉ 、て「ノヽイブリダィズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダィ ズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドを いう。ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号 2、 4、 6など で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAの塩基配列と少なくと も 60%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは 80%以上の相同性を有 するポリヌクレオチド、さらに好ましくは 95%以上の相同性を有するポリヌクレオチドを 挙げることができる。核酸配列の相同性は、たとえば Altschulら (J. Mol. Biol. 215 , 403— 410 (1990) )が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラム BLASTを 用いることにより、 scoreで類似度が示される。
[0067] 本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相 補性を有する DNA鎖のハイブリダィゼーシヨンを可能にし、そしてミスマッチを有意 に有する DNAのハイブリダィゼーシヨンを除外するように設計された条件を!、う。ハイ ブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムァ ミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダィゼーシヨンおよ び洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、 0. 0015M塩ィ匕ナトリウム、 0. 0015Mタエン酸ナ卜!;ゥム、 65〜68°C、または 0. 015M塩ィ匕ナ HJゥム、 0. 001 5Mクェン酸ナトリウム、および 50%ホルムアミド、 42°Cである。このような高度にスト リンジェントな条件については、 Sambrooket al. , Molecular Cloning : A Labor atory Manual、弟 2版、 Cold Spring Harbor Laboratory (ColdSpring Har bor, N, Y. 1989)；ぉよび Anderson et al、 Nucleic Acid Hybridization : A PRac IticalApproa ch、 IV、 IRL Press Limited (Oxford, England) . Limite d, Oxford, Englandを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、 より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使 用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダィゼーシヨンおよび zまたはバック グラウンドのハイブリダィゼーシヨンを減少する目的で、ハイブリダィゼーシヨン緩衝液 および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、 0. 1%シ血清ァ ルブミン、 0. 1%ポリビュルピロリドン、 0. 1%ピロリン酸ナトリウム、 0. 1%ドデシル 硫酸ナトリウム（NaDodSOまたは SDS)、 Ficoll、 Denhardt溶液、超音波処理され
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たサケ*** DNA (または別の非相補的 DNA)および硫酸デキストランである力 他 の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダ ィゼーシヨン条件のストリンジエンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る 。ノ、イブリダィゼーシヨン実験は、通常、 pH6. 8〜7. 4で実施されるが；代表的なィ オン強度条件において、ハイブリダィゼーシヨンの速度は、ほとんど pH独立である。 Anderson et al.、 NucleicAcid Hybridization: A PRac ltical Approach弟 4章、 IRL Press Limited (Oxford, England)を参照のこと。
DNA二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基 対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダィゼーシヨン条件は、当業者によって調整 され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性の DNAがハイブリッドを 形成するのを可能にする。完全に一致した DNA二重鎖の融解温度は、以下の式に よって概算され得る。
Tm (°C) =81. 5 + 16. 6 (log[Na+]) +0. 41 (%G + C) -600/N-O. 72 (% ホノレムアミド）
ここで、 Nは、形成される二重鎖の長さであり、 [Na+]は、ノ、イブリダィゼーシヨン溶 液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％G + Cは、ノ、イブリツド 中の（グァニン +シトシン)塩基のパーセンテージである。不完全に一致したノヽイブリ ッドに関して、融解温度は、各 1%不一致 (ミスマッチ）に対して約 1°Cずつ減少する。
[0069] 本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェント な条件」下で生じ得るよりも高 、程度の塩基対不一致を有する DNA二重鎖が、形成 し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジヱントな条件」の例は、 0. 015M塩 ィ匕ナ卜リクム、 0. 0015Mクェン酸ナトリウム、 50〜65°C、または 0. 015M塩ィ匕ナ卜リ ゥム、 0. 0015Mクェン酸ナトリウム、および 20%ホルムアミド、 37〜50。Cである。例 として、 0. 015Mナトリウムイオン中、 50°Cの「中程度にストリンジェントな」条件は、 約 21%の不一致を許容する。
[0070] 本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条 件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される 。例えば、 0. 015Mナトリウムイオン (ホルムアミドなし）において、完全に一致した長 い DNAの融解温度は、約 71°Cである。 65°C (同じイオン強度）での洗浄において、 これは、約 6%不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当 業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
[0071] 約 20ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、 1M NaClにおける 融解温度の適切な概算は、
Tm= (1つの A— T塩基につき 2°C) + (1つの G— C塩基対につき 4°C) によって提供される。なお、 6 Xクェン酸ナトリウム塩 (SSC)におけるナトリウムイオン 濃度 fま、 1Mで to (Suggsら、 Developmental Biology Using Purified Genes、 683頁、 Brownおよび Fox (編）（1981)を参照のこと）。
[0072] 本明細書において「単離された」生物学的因子 (例えば、核酸またはタンパク質な ど）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因 子 (例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配 列を含む核酸;タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタン パク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など)から実質的に分離または精製され たものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって 精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタ ンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
[0073] 本明細書において「精製された」生物学的因子 (例えば、核酸またはタンパク質な ど）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたも のをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の 純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い (すなわち濃縮されてい る)。
[0074] 本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少な くとも 75重量％、より好ましくは少なくとも 85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも 95 重量％、そして最も好ましくは少なくとも 98重量％の、同型の生物学的因子が存在 することを意味する。
[0075] 本明細書にぉ 、て遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その 遺伝子など力 Sインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは 、遺伝子、ポリヌクレオチドなど力 転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態にな ることをいうが、転写されて mRNAが作製されることもまた発現の一態様であり得る。 より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたもので あり得る。好ましい実施形態では、そのような発現されたポリペプチドは、恒常的また は一過的に活性ィ匕された Raclであり得る。
[0076] 本明細書にぉ 、てポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、 mRNAの 測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物 学的測定方法としては、例えば、ノーザンプロット法、ドットプロット法または PCR法な どが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタ 一プレートを用いる ELISA法、 RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織 染色法などが例示される。また、定量方法としては、 ELISA法または RIA法などが例 示される。
[0077] 本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたは m RNAが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いて ELI SA法、 RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などの免疫学的 測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク 質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、 PCR法などの分子 生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用 されるポリペプチドの mRNAレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは 、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法 により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたは mRNAレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
[0078] 本明細書中で使用される用語「結合」は、 2つのタンパク質もしくは化合物または関 連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理 的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結 合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的 相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク 質または化合物の効果を介する力または起因する。直接的な結合とは、別のタンパク 質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な 化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
[0079] 本明細書中で使用される用語「調節する（modulate)」または「改変する（modify) 」は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または 減少あるいは維持を意味する。
[0080] 本明細書にぉ 、て、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物 (RNAなど) )の「 減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の 量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。
[0081] 本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物 (RNAなど)）の「 増カロ」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク 質の量、質または効果における増加または増加させる活性を 、う。
[0082] 本明細書にぉ 、て「プローブ」とは、インビトロおよび Zまたはインビボなどのスクリ 一ユングなどの生物学的実験にお!、て用いられる、検索の手段となる物質を!、 、、 例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド などが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー 検出手段としてもちいられる。
[0083] 通常プローブとして用いられる核酸分子としては、 目的とする遺伝子の核酸配列と 相同なまたは相補的な、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するも のが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも 9の連続するヌクレオ チド長の、より好ましくは少なくとも 10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは 少なくとも 11の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 12の連続するヌクレオチド長の 、少なくとも 13の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 14の連続するヌクレオチド長 の、少なくとも 15の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 20の連続するヌクレオチド 長の、少なくとも 25の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 30の連続するヌクレオチ ド長の、少なくとも 40の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 50の連続するヌクレオ チド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、 上述の配列に対して、少なくとも 70%相同な、より好ましくは、少なくとも 80%相同な 、さらに好ましくは、少なくとも 90%相同な、少なくとも 95%相同な核酸配列が含まれ る。
[0084] 本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により 、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および Zまたは性質を有する他の核酸 塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、 BLAST (Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215 :403— 410 (1990) )、 FASTA (Pearson & Lipman, Proc . Natl. Acad. Sci. , USA 85 : 2444- 2448 (1988) ) , Smith and Waterma n法（Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147 : 195— 197 (1981) )、および Needleman and Wunsch法 (Needleman an Wunsch, J. Mol. Biol. 48 : 443— 453 (1970 ) )などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索と しては、ストリンジェントハイブリダィゼーシヨン、ゲノム DNAをナイロンメンブレン等に 貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ (マイクロアレイアツ セィ）、 PCRおよび in situハイブリダィゼーシヨンなどが挙げられるがそれらに限定 されない。本明細書において、本発明において使用される TSLC1の分子経路にお ける任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Racなど）などには、このような電子的 検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意 図される。
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「 類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列 2つを 比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配 列の比較ウィンドウ内の部分には、 2つの配列の最適なァライメントについての基準 配列 (他の配列に付加が含まれて ヽればギャップが生じることもある力 ここでの基準 配列は付加も欠失もないものとする)と比較したときに、付加または欠失 (すなわちギヤ ップ)が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも 認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数 を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に 100を掛けて同一性のパーセ ンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術 にお 、て周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当な ものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、 TBLAST N、： BLAST、FASTA、TFASTAおよび CLUSTALW (Pearson and Lipma n, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (8) : 2444— 2448、 Altschul e al. , 1990, J. Mol. Biol. 215 (3 ) : 403—410、 Thompson et al. , 1994, Nuclei Acids Res. 22 (2) : 4673— 4680、 Higgins et al. , 1996, Methods Enzymol. 266 : 383—40、 Altschu 1 et al. , 1990, J. Mol. Biol. 215 (3)： 403— 410、 Altschul et al. , 1993, Nature Genetics 3 : 266— 272)力あ げられる力 何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来 技術【こお ヽて周知の Basic Local Alignment Seul, 1990, Proc. Natl. Acad . Sci. USA 87： 2267- 2268, Altschul et al. , 1990, J. Mol. Biol. 215 4 03— 410、 Altschul et al. , 1993, Nature Genetics 3 : 266— 272、 Altsch ul et al. , 1997, Nuc. Acids Res. 25 : 3389— 3402を参照のこと）を用!ヽてタ ンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、 5つの専用 BLASTプログラム を用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。 [0086] (1) BLASTPおよび BLAST3でアミノ酸のクエリ配列をタンパク質配列データべ一 スと比較；
(2) BLASTNでヌクレオチドのクエリ配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
(3) BLASTXでヌクレオチドのクエリ配列（両方の鎖）をつの読み枠で変換した概 念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
(4) TBLASTNでタンパク質のクエリ配列を 6つの読み枠（両方の鎖）すべてで変 換したヌクレオチド配列データベースと比較；
(5) TBLASTXでヌクレオチドのクエリ配列を 6つの読み枠で変換したものを、 6つ の読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
[0087] BLASTプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタ ンパク質配列データベースまたは核酸配列データベース力 得られた被検配列との 間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相 同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術にお V、て周知のスコアリングマトリックスによって同定 (すなわち整列化）されると好ま U、。
992, Science 256 : 1443— 1445、 Henikoff and Henikoff, 1993, Protei ns 17 :49— 61)を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、 PAMま たは PAM250マトリックスも使用できる（たとえば、 Schwartz and Dayhoff, eds . , 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships： Atlas of Pr otein Sequence and Structure, Washington： National Biomedical Res earch Foundationを参照のこと。 BLASTプログラムは、同定されたすベてのハ イスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率 などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する 。統計的な有意性を求める Karlinの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有 意性を評価すると好ましい（Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. S ci. USA 87 : 2267- 2268参照のこと）。
[0088] 本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される 高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成 されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子 (例えば、 DNAまたは RNAなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段とし て使用され得る。
[0089] 通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、 目的とする遺伝子の核酸配列 と相補的な、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げら れる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも 9の連続するヌクレオチド長の、よ り好ましくは少なくとも 10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも 11 の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 12の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 1 3の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 14の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 15の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 16の連続するヌクレオチド長の、少なくと も 17の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 18の連続するヌクレオチド長の、少なく とも 19の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 20の連続するヌクレオチド長の、少な くとも 25の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 3の連続するヌクレオチド長の、少な くとも 40の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 5の連続するヌクレオチド長の、核 酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、 少なくとも 70%相同な、より好ましくは、少なくとも 80%相同な、さらに好ましくは、少 なくとも 90%相同な、少なくとも 95%相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして 適切な配列は、合成 (増幅)が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者 は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなブラ イマ一の設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータ プログラム（例えば、 LASERGENE, PrimerSelect, DNAStar)を用いて行っても よい。
[0090] 本明細書中で使用される「接触 (させる）」とは、化合物を、直接的または間接的の いずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接さ せることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液 などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリぺプ チドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマ イクロアレイ (例えば、遺伝子チップ)などに化合物を置くことが挙げられる。 [0091] 本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子 (例えば、ポリペプチドまたはタ ンパク質）力 生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活 性が包含される。例えば、ある因子がリガンドである場合、その生物学的活性は、そ のリガンドが対応するレセプターに結合する活性を包含する。本発明の活性型 TSL C1の分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiam、 Raclなど）の場合 は、その生物学的活性は、少なくとも TSLC1の分子経路における任意の因子 (例え ば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）が有する活性の少なくとも 1つ（核内への移行能、 TSLC1の分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）コ ンセンサス配列への結合能など）を包含する。別の実施形態では、生物学的活性とし ては、転写因子としての活性 (例えば、 TSLC1の分子経路における任意の因子 (例 えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）のコンセンサス配列への結合能）が挙げられる。
[0092] 本明細書において生物学的活性をアツセィする方法としては、（例えば、 TSLC1の 分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）を判定するた めのアツセィ）を利用したアツセィが挙げられるがそれらに限定されない。具体的には 、以下が挙げられる。
[0093] (細胞における TSLC1の分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiam 1、 Raclなど）遺伝子転写産物の検出）
診断対象力 採取した細胞における TSLC 1の分子経路における任意の因子 (例 えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）の遺伝子転写産物を検出する手法としては、特 に限定されないが、以下の方法を採用することができる。
[0094] (RT-PCR)
本明細書において、 RT— PCRを適用する際には、例えば、先ず、診断対象の患 者よりへパリン化末梢血を採取する。このへパリンィ匕末梢血を比重遠心分離にかけ 単核球を分離する。分離した単核球を患者検体とする。一方、コントロール検体とし ては、健常人の CD4陽性 Tリンパ球を使用する。健常人の CD4陽性 Tリンパ球は、 健常人より採取したへパリンィ匕末梢血を CD8化、抗体混合物を用いて不要な細胞を 沈降させた後、分離することができる。
[0095] この患者検体、コントロール検体に対してトリゾール液を用いて細胞可溶ィ匕し、 RN Aと、 DNA'タンパク質 'その他分画とに分離する。分離した RNAを用いて、オリゴ d Tプライマーを用い、逆転写酵素により一本鎖 cDNAを合成する。次に、合成した cD NAを铸型として、 TSLC1特異的プライマーにより、 TaqDNAポリメラーゼを用い てサーマノレサイクラ一による DNA合成を行う。
[0096] 具体的に、 TSLC1特異的プライマーとしては以下の配列からなる一対のオリゴヌク レオチドを使用することができる。
プライマー 1； ATGATCGATATCCAGAAAGACACT (配列番号 7)
プライマー 2； GTACTTCTAGATACCGCTGGG (配列番号 8)
なお、 TSLC1特異的プライマーは、上述の配列力 なるオリゴヌクレオチドに限定 されず、 TSLC1遺伝子の塩基配列に基づいて適宜設計することができる。例えば、 配列番号 2に示した TSLC1遺伝子の塩基配列において、 445〜721番目の領域を 増幅できるように TSLC1特異的プライマーを設計することが好ましい。 445〜721番 目の領域を増幅する場合には、非特異的な核酸断片の増幅を防ぐことができるため に好ましいこれに限定されない。また、他の TSLC1の分子経路における任意の因子 (例えば、 TSLCl、Tiaml、Raclなど）もまた、同様にしてプライマーを設計するこ とがでさる。
[0097] また、上述した DNA合成に際してサーマルサイクラ一の条件としては、特に限定さ れな ヽカ ί列えば、、 94。C5分 1サイクノレ、 94。C30禾少、 60。C30禾少および 72。C1分 30 サイクル、 72°C5分 1サイクルとすることができる。
[0098] 次に、合成した DNA溶液を、例えばァガロースゲル電気泳動法により分離し、 DN A染色によって可視化し、 DNA撮影装置を用いて発現量を検討することができる。 このとき、患者検体における TSLC1遺伝子転写産物量と、コントロール検体におけ る TSLC1遺伝子転写産物量との比が 3倍以上、好ましくは 5倍以上である場合、患 者ががんを発症して！/、ると診断することができる。
[0099] (リアルタイム（Real— time) PCR)
上記「RT— PCR」と同様の方法により、患者検体、コントロール検体を採取し、同様 に RNAを分離、 cDNAを合成する。蛍光ラベルした特異的合成オリゴヌクレオチドに より、同様に Realtime PCR装置により DNA合成を行う。 [0100] 具体的に、特異的合成オリゴヌクレオチドとしては、限定されないが、以下の配列か らなるものを使用することができる。
[0101] 特異的合成オリゴヌクレオチド; TTCGCCATGCTGTGCTTGCTCA (配
列番号 9)
なお、特異的合成オリゴヌクレオチドは、上述の配列力 なるものに限定されず、 T SLC1遺伝子の塩基配列に基づいて適宜設計することができる。例えば、配列番号 2に示した TSLC 1遺伝子の塩基配列において、 1159— 1180番目の領域とハイブ リダィズするように特異的合成オリゴヌクレオチドを設計することが好ま 、。 1159— 1180番目の領域とハイブリダィズする場合には、特異的合成オリゴヌクレオチドの非 特異的なノ、イブリダィズを防ぐことができるために好まし 、。 TSLC1の分子経路にお ける任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）についてもまた、同様に任 意の設計することができることが理解される。
[0102] リアルタイム PCR装置における DNA合成の条件としては、特に限定されないが、例 えば 94°C5分 1サイクル、 94°C30秒および 60°C1分 40サイクルとすることができる。
[0103] そして、リアルタイム PCR装置に備わる分光蛍光光度計によって、合成の回数に応 じた DNA量が蛍光発色により定量する。このとき、コントロールとしてァクチン遺伝子 等を同時に測定し、ァクチン遺伝子発現量によって TSLC1遺伝子転写産物量を平 均化して定量することもできる。
[0104] リアルタイム PCR装置によれば、先ず電気泳動による増幅 DNA断片の分離が必 要でないため、非常に簡易に且つ迅速に解析を行うことができる。また、リアルタイム PCR装置によれば、増幅が指数関数的に起こる領域で産物量を比較できるため、よ り正確に定量的に解析することができる。
[0105] (ハイブリダィゼーシヨン法）
診断対象力 採取した細胞における TSLC1遺伝子転写産物を検出する手法とし ては、上記「RT— PCR」と同様の方法により、患者検体、コントロール検体を採取し、 同様に RNAを分離した後、 TSLC1遺伝子の mRNAに特異的にハイブリダィズする オリゴヌクレオチドを用いて、 TSLC1遺伝子転写産物を検出してもよい。また、上記「 RT-PCRJと同様の方法により RN Aを分離して cDN Aを合成し、合成した cDNAに 特異的にハイブリダィズするプローブを用いて、 TSLC1遺伝子転写産物を検出して ちょい。
[0106] ここで、プローブとしては、特に限定されないが、例えば、 TSLC1遺伝子の 411〜
1371番目と相補的な配列を有する核酸断片を使用することができる。なお、プロ一 ブは、上述の配列力 なるものに限定されず、 TSLC1遺伝子の塩基配列に基づい て適宜設計することができる。例えば、配列番号 2に示した TSLC1遺伝子の塩基配 列において、 411〜1371番目の領域とハイブリダィズするようにプローブを設計する ことが好ましい。 411〜1371番目の領域とハイブリダィズする場合には、プローブの 非特異的なノ、イブリダィズを防ぐことができるために好まし 、。他の TSLC1の分子経 路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）についても、同様に プローブを設計することができることが理解される。
[0107] (細胞または血清における TSLC1の分子経路における任意の因子（例えば、 TSL Cl、 Tiaml、 Raclなど）のタンパク質の検出）
細胞または血清に含まれる TSLC 1タンパク質を検出する際には、 TSLC 1タンパク 質を特異的に認識する抗体 (以下、 TSLC1抗体と呼ぶ)を作製する。 TSLC1抗体 は、従来公知の手法を用いて作製することができる。なお、 TSLC1抗体は、モノクロ ーナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であっても良い。他の TSLC1の分子経 路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）についても、同様に 抗体を作製することができる。
[0108] 一例として、 TSLC1モノクローナル抗体の調製方法を以下に記載する。 TSLC1モ ノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ 細胞との細胞融合によりハイプリドーマを調製し、得られるハイプリドーマから TSLC1 活性を特異的に阻害する抗体を産生するクローンを選択することにより調製すること ができる。
[0109] 動物の免疫に抗原として用いる TSLC1タンパク質としては、組換え DN法または 化学合成により調製した TSLC1タンパク質のアミノ酸配列の全部若しくは一部のぺ プチドが挙げられる。例えば、配列番号 1に示した TSLCタンパク質のアミノ酸配列 における、 431〜442番目のアミノ酸配列力もなるペプチドを抗原として使用すること ができる。また、細胞表面に存在する TSLC1タンパク質を特異的に検出するための TSLC1モノクローナル抗体としては、配列番号 1に示した TSLC1タンパク質のァミノ 酸配列における 232〜247番目のアミノ酸配列力もなるペプチドを抗原として使用す ることが好ましい。一方、血中に存在する可溶化 TSLC1タンパク質を特異的に検出 するための TSLC1モノクローナル抗体としては、配列番号 1に示した TSLC1タンパ ク質のアミノ酸配列における 315〜331番目（可溶型特異領域を含む）のアミノ酸配 列からなるペプチドを抗原として使用することが好ましい。他の TSLC1の分子経路 における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）についても同様に抗原 を設計することができる。
[0110] 得られた抗原用 TSLC1をキャリアータンパク質 (例えばサイログロブリン）に結合さ せた後、アジュバントを添加する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、 フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよ 、。
[0111] 上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウス、ラット、ゥマ、サル、ゥサ ギ、ャギ、ヒッジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方 法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより 行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは 4〜2 1日間隔で免疫する。
[0112] 最終の免疫日から 2〜3日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、 脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられ る。抗原の免疫量は 1回にマウス 1匹当たり、例えば 100 /z g用いられる。
[0113] 免疫した動物の免疫応答レベルを確認し、また、細胞融合処理後の細胞から目的 とするハイプリドーマを選択するため、免疫した動物の血中抗体価、または抗体産生 細胞の培養上清中の抗体価を測定する。抗体検出の方法としては、公知技術、例え ば EIA (ェンザィムィムノアツセィ）、 RIA (ラジオィムノアツセィ）、 ELISA (酵素連結 ィムノソルベントアツセィ)等が挙げられる。
[0114] 抗体産生細胞と融合させるミエローマ (骨髄腫)細胞として、マウス、ラット、ヒトなど 種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する 細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地 (例えば HAT培地 )で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一 般的に 8—ァザグァニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン グァ- ン ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン ·アミノプテリン ·チミジ ン（HAT)培地に生育できな!/、ものである。
[0115] ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、 P3 (P3x63Ag8. 653) (J . Immunol. (1979) 123 : 1548— 1550)、 P3x63Ag8U. 1 (Current Topics i n Microbiology and Immunology (1978) 81 : 1— 7)、 NS— l (Kohler, G. and Milstein, C. , Eur. J. Immunol. (1976) 6 : 511— 519)、 MPC— 11 (M argulies, D. H. et al. , Cell (1976) 8 :405-415) , SP2/0 (Shulman, M . et al. , Nature (1978) 276 : 269— 270)、 FO (de St. Groth, S. F. et al . , J. Immunol. Methods (1980) 35 : 1— 21)、 S194 (Trowbridge, I. S. , J . Exp. Med. (1978) 148 : 313— 323)、 R210 (Galfre, G. et al. , Nature ( 1979) 277 : 131 - 133)等が好適に使用される。
[0116] 抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節細胞など力 得られる。すなわち、前記各種 動物から脾臓、リンパ節等を摘出または採取し、これら組織を破砕する。得られる破 砕物を PBS、 DMEM、 RPMI1640等の培地または緩衝液に懸濁し、ステンレスメッ シュ等で濾過後、遠心分離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製する。
[0117] 次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、 ME M、 DMEM、 RPME— 1640培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細 胞と抗体産生細胞とを、混合比 1： 1〜1： 10で融合促進剤の存在下、 30〜37°Cで 1 〜15分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均 分子量 1, 000〜6, 000のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたはセン ダイウィルスなどの融合促進剤や融合ウィルスを使用することができる。また、電気刺 激 (例えばエレクト口ポレーシヨン)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産 生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
[0118] 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリドーマを選別する。その方法として 、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、 細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ゥエルに 選択培地 (HAT培地など)を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。そ の結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
[0119] ノ、イブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により 行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイプリドーマを取得する。取得したノ、イブリ ドーマ力もモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水 形成法等が挙げられる。細胞培養法においては、ハイプリドーマを 10〜20%ゥシ胎 児血清含有 RPMI— 1640培地、 MEM培地、または無血清培地等の動物細胞培養 培地中で、通常の培養条件 (例えば 37°C, 5%CO濃度)で 2〜14日間培養し、そ
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の培養上清から抗体を取得する。腹水形成法においては、ミエローマ細胞由来の哺 乳動物と同種の動物の腹腔内にハイプリドーマを投与し、ハイプリドーマを大量に増 殖させる。そして、 1〜4週間後に腹水または血清を採取する。
[0120] 上記抗体の採取方法にお!、て、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、 イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィーなどの公知の方法を 適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製する。
[0121] 本明細書において「抗原」とは、抗体と結合したり、 Bリンパ球、 Tリンパ球などの特 異的レセプターに結合して、抗体産生および Zまたは細胞障害などの免疫反応をひ きおこす物質 (例えば、タンパク質、脂質、糖などが挙げられるがそれらに限定されな い）をいう。抗体またはリンパ球レセプターとの結合性を、「抗原性」（antigecity)とい う。抗体産生などの免疫応答を誘導する特性を「免疫原性」（immunogenicity)とい う。抗原として使用される物質は、例えば、その目的とする物質 (例えば、タンパク質） を少なくとも 1つ含む。含まれる物質は、全長が好ましいが、免疫を惹起し得るェピト ープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。本明細書において「ェピト ープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子 中の部位をいう。ェピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、その ようなェピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのよ うな周知慣用技術を用いて決定することができる。
[0122] ェピトープは、必ずしもその正確な位置および構造が判明して 、な 、としても使用 することができる。従って、ェピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与す るアミノ酸残基のセット、または、 T細胞の場合は、 T細胞レセプタータンパク質および Zもしくは主要組織適合性複合体 (MHC)レセプターによる認識について必要であ るアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決 定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで 、ェピトープは、分子の特徴 (例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または 三次ペプチド構造および電荷)であり、免疫グロブリン、 T細胞レセプターまたは HL A分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むェピトープは、ェピトープ に独特な空間的コンフオメーシヨン中に 3つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、ェピ トープは、少なくとも 5つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも 6つ、 7つ 、 8つ、 9つ、または 10のこのようなアミノ酸からなる。ェピトープの長さは、より長いほ ど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフオメーシ ヨンを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフオメーシヨン を決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、 X線結晶学、および 2次元核磁 気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるェピトープの同定は、当該 分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、 Geysenら（1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 3998 (所定の抗原における免疫原性ェピトープの位 置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第 4, 708 , 871号 (抗原のェピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；および Geysenら（1986) Molecular Immunology 23 : 709 (所定の抗体に対して高い 親和性を有するペプチドを同定するための技術)を参照されたい。同じェピトープを 認識する抗体は、単純な免疫アツセィにおいて同定され得る。このように、ペプチドを 含むェピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなェピト ープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣 用技術を用いて決定することができる。
従って、ペプチドを含むェピトープとして使用するためには、少なくとも 3アミノ酸の 長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも 4アミノ酸、より好ましく は少なくとも 5アミノ酸、少なくとも 6アミノ酸、少なくとも 7アミノ酸、少なくとも 8アミノ酸、 少なくとも 9アミノ酸、少なくとも 10アミノ酸、少なくとも 15アミノ酸、少なくとも 20ァミノ 酸、少なくとも 25アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。ェピトープは線状であって もコンフオメーシヨン形態であってもよ 、。
[0124] 高分子構造 (例えば、ポリペプチド構造）は種々のレベルの構成に関して記述され 得る。この構成の一般的な議論については、例えば、 Albertsら、 Molecular Biolo gy of the Cell (第 3版、 1994)、ならびに、 Cantorおよび Schimmel、 Biophysi cal Chemistry Part I : The Conformation of Biological Macromolecul es (1980)を参照。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構 造」とは、ポリペプチド内の局所的に配置された三次元構造をいう。これらの構造はド メインとして一般に公知である。ドメインは、ポリペプチドの緻密単位を形成し、そして 代表的には 50〜350アミノ酸長であるそのポリペプチドの部分である。代表的なドメ インは、 13シート（ 13ストランドなど）および a 一へリックスのストレッチ（stretch)のよう な、部分から作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造 をいう。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有的会合により形成される三次元 構造をいう。異方性に関する用語は、エネルギー分野において知られる用語と同様 に使用される。したがって、本発明において使用されるポリペプチドは、活性型 TSL C1の分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）と同等 の能力を有するような高次構造を有する限り、どのようなアミノ酸配列のポリペプチド をも包含し得る。
[0125] (FACSスキャンを用いた白血病細胞表面抗原の同定）
以上のように調製した TSLC1モノクローナル抗体を用いて、診断対象の細胞の表 面に存在する TSLC1タンパク質の有無を FACSスキャンにより検出することができる 。この方法では、 TSLC1モノクローナル抗体としては、配列番号 1に示した TSLC1 タンパク質のアミノ酸配列における 232〜247番目のアミノ酸配列からなるペプチドを 抗原として使用して得られたものを使用する。他の TSLC 1の分子経路における任意 の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）についても、同様に抗原を設計する ことができる。
[0126] この場合、先ず、患者力 採取した患者末梢血より、比重遠心法により単核球分画 を単離する。次に、上述したように得られた TSLC 1モノクローナル抗体を蛍光ラベル した蛍光化 TSLCl抗体と単核球分画とを 30〜60分混合する。反応後に FACSスキ ヤン装置によって蛍光強度を測定して、測定した蛍光強度に基づいて細胞数を測定 する。また、ソーティング装置付 FACSを用いることで、蛍光標識された細胞を分離し 、分離した細胞における TSLC 1遺伝子または他の TSLC 1の分子経路における任 意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）の発現の解析を行ってもよい。
[0127] この方法によれば、 HTLV—1キャリアにおいて、 TSLC 1陽性細胞を染め分け、詳 細な感染細胞を数えることができる。さらに、後述するように、血中に含まれる可溶ィ匕 TSLC1タンパク質量を測定することにより、がんの発症予測が可能となる。さらに、こ の方法によれば、 HTLV— 1感染細胞を分離し、感染細胞における遺伝子発現異常 を同定できるようになるため、発症予測がより正確にできるようになる。
[0128] (可溶性 TSLC1タンパク質の血中濃度測定）
また、以上のように調製した TSLC1モノクローナル抗体を用いて、診断対象の血中 に存在する TSLC1タンパク質を検出することができる。この方法では、 TSLC1モノク ローナル抗体としては、配列番号 1に示した TSLC1タンパク質のアミノ酸配列におけ る 315〜331番目のアミノ酸配列カゝらなるペプチドを抗原として使用して得られたも のを使用する。他の TSLC1の分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tia ml、 Raclなど）についても可溶性形態がある場合は、同様に抗原を設計することが できることが理解される。
[0129] この場合、先ず、 TSLC1モノクローナル抗体を固相プレートに吸着させ、その後、 プレートに BSAなどのタンパク質を作用させ、非特異結合をブロックしておく。患者も しくは健常人血清を添加し、洗浄した後、異種由来 TSLC1抗体を添加、さらに酵素 標識抗種特異的免疫グロブリン抗体を添加する。加えてその酵素に対する酵素基質 溶液を加え酵素反応の発色により、発現量を測定する。
[0130] 以上、「細胞における TSLC1の分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど)遺伝子転写産物の検出」および「細胞または血清における TSL C1の分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）のタン ノ ク質の検出」に従えば、診断対象の患者力 採取した細胞あるいは血清を用いて 、 TSLC1遺伝子の発現を検出することができる。言い換えると、「細胞における TSL CI遺伝子転写産物の検出」に記載したような TSLC1特異的プライマー、特異的合 成オリゴヌクレオチドまたはプローブを含む試薬によって、全く新規ながん診断薬を 提供することができる。また、「細胞または血清における TSLC1の分子経路における 任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）のタンパク質の検出」に記載した ような TSLC1抗体を含む試薬によって、全く新規ながん診断薬を提供することがで きる。
[0131] (改変体）
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、力 チオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミ ノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の 相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列にお いて、またはその DNAコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの 性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なし に、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコー ドする対応する DNAにお 、て行われ得る。
[0132] 上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク 質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性 は、一般に当該分野で認められている（Kyte. Jおよび Doolittle, R. F. J. Mol. Bi ol. 157 (1) : 105- 132, 1982)。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の 二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子 (例えば、酵素、基質、レセプ ター、 DNA、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水 性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは:イソロイシン（ +4. 5)；バリン（+4. 2)；ロイシン（ + 3. 8)；フエ-ルァラニン（ + 2. 8)；システィン Zシスチン（ + 2. 5)；メチォニン（ + 1. 9)；ァラニン（ + 1. 8)；グリシン（一0. 4)；スレ ォニン（一 0. 7) ;セリン（一0. 8)；トリプトファン（一0. 9) ;チロシン（一1. 3) ;プロリン (— 1. 6) ;ヒスチジン（一3. 2)；グノレタミン酸（一 3. 5)；グノレタミン（一3. 5) ;ァスパラ ギン酸（一3. 5)；ァスパラギン（一3. 5) ;リジン（一3. 9)；およびアルギニン（一4. 5) )である。 [0133] あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依 然として同様の生物学的機能を有するタンパク質 (例えば、酵素活性において等価 なタンパク質)を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換に おいて、疎水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好まし ぐおよび ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなァミノ 酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
[0134] 親水性指数もまた、本発明のアミノ酸配列を改変するのに有用である。米国特許第 4, 554, 101号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てら れている：アルギニン（ + 3. 0)；リジン（ + 3. 0)；ァスパラギン酸（ + 3. 0± 1)；グルタ ミン酸（ + 3. 0± 1)；セリン（ + 0. 3)；ァスパラギン（ + 0. 2)；グルタミン（ + 0. 2)；グリ シン（0)；スレオニン（一0. 4)；プロリン（一0. 5 ± 1)；ァラニン（一0. 5)；ヒスチジン（ -0. 5)；システィン（一1. 0)；メチォニン（一1. 3)；バリン（一 1. 5)；ロイシン（一1. 8 ) ;イソロイシン（一 1. 8) ;チロシン（一2. 3)；フエ-ルァラニン（一2. 5) ;およびトリプ トフアン（一 3. 4)。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価 体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換にお いて、親水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好ましく 、および ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。
[0135] 本発明にお 、て、「保存的置換」とは、アミノ酸置換にぉ 、て、元のアミノ酸と置換さ れるアミノ酸との親水性指数または Zおよび疎水性指数が上記のように類似して 、る 置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内 での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびァスパラギン酸；セリンおよび スレオニン；グルタミンおよびァスパラギン；ならびにパリン、ロイシン、およびイソロイ シン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
[0136] 本明細書において「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの 物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改 変体、付加改変体、欠失改変体、短縮 (truncated)改変体、対立遺伝子変異体な どが挙げられる。対立遺伝子 (allele)とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される 遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して 、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ (homolog)」と は、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（ 好ましくは、 60%以上の相同性、より好ましくは、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95%以上の相同性)を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本 明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ortholog)」とは、オルソロガス遺伝子 (orthologous gene)ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来 する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを 例にとると、ヒトとマウスの αヘモグロビン遺伝子はオルソログである力 ヒトの αへモ グロビン遺伝子と /3ヘモグロビン遺伝子はパラログ (遺伝子重複で生じた遺伝子)で ある。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明の TSLC1の 分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）のオルソログ もまた、本発明において有用であり得る。
本明細書にぉ 、て「保存的（に改変された)改変体」は、アミノ酸配列および核酸配 列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは 、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がァミノ 酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のた め、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コ ドン GCA、 GCC、 GCG、および GCUはすべて、アミノ酸ァラニンをコードする。した がって、ァラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされた ポリペプチドを変更することなぐ記載された対応するコドンの任意のものに変更され 得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の 1つの種である「サイレン ト改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列は また、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核 酸中の各コドン（通常メチォニンのための唯一のコドンである AUG、および通常トリプ トフアンのための唯一のコドンである TGGを除く） 1S 機能的に同一な分子を産生す るため〖こ改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸 の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そ のような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステ インの置換を回避するようになされ得る。
[0138] 本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の 置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の 置換とは、もとのペプチドを 1つ以上、例えば、 1〜： LO個、好ましくは 1〜5個、より好ま しくは 1〜3個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖 に 1つ以上、例えば、 1〜10個、好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸 を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから 1つ以上、例えば、 1〜 10個、好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸を欠失させることをいう。ァ ミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシ ル化、リン酸化、水酸化、ァシル化 (例えば、ァセチル化)などを含むが、これらに限 定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよぐ非天 然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
[0139] 本明細書において「ペプチドアナログ」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、 ペプチドと少なくとも 1つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。 したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、 1つ以上のアミノ酸アナ ログが付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能力 もとのペプチドの機能 (例えば、 pKa値が類似していること、官能基が類似しているこ と、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実 質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなぺプチ ドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したが つて、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
[0140] 本発明のポリペプチドがポリマーに結合している、化学修飾されたポリペプチド組 成物は、本発明の範囲に包含される。このポリマーは、水溶性であり得、水溶性環境 (例えば、生理学的環境)でこのタンパク質の沈澱を防止し得る。適切な水性ポリマ 一は、例えば、以下力もなる群より選択され得る：ポリエチレングリコール (PEG)、モノ メトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基 づくポリマー、ポリ（N—ビュルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコ 一ノレホモポリマー、ポリプロピレンォキシド/エチレンォキシドコポリマー、ポリオキシ ェチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビュルアルコール。この選択さ れたポリマーは、通常は改変され、単一の反応性基 (例えば、ァシル化のための活性 エステルまたはアルキルィ匕のためのアルデヒド）を有し、その結果、重合度は制御さ れ得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、そして、このポリマーは分枝状でも分枝 状でなくてもよぐそしてこのようなポリマーの混合物はまた、使用され得る。この化学 修飾された本発明のポリマーは、治療用途に決定付けられる場合、薬学的に受容可 能なポリマーが使用するために選択される。
[0141] このポリマーがァシル化反応によって改変される場合、このポリマーは、単一の反 応性エステル基を有するべきである。あるいは、このポリマーが還元アルキル化によ つて改変される場合、このポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有するべきである 。好ましい反応性アルデヒドは、ポリエチレングリコール、プロピオンアルデヒド（このプ ロピオンアルデヒドは、水溶性である）または、そのモノ C1〜C10の、アルコキシ誘導 体もしくはァリールォキシ誘導体である（例えば、米国特許第 5, 252, 714号 (これは 、本明細書中で全体が参考として援用される）を参照のこと)。
[0142] 本発明のポリペプチドの PEG化（Pegylation)は、例えば、以下の参考文献に記 載されるような、当該分野で公知の、任意の PEG化反応によって実施され得る Focu s on Growth Factors 3, 4— 10 (1992) ;EP 0 154 316 ;および EP 0 40 1 384 (これらの各々は、本明細書中で、全体が参考として援用される）。好ましくは 、この PEG化は、反応性ポリエチレングリコール分子 (または、類似の反応性水溶性 ポリマー）とのァシルイ匕反応またはアルキルィ匕反応を介して実施される。本発明のポ リペプチド（例えば、 TSLC1の分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Ti aml、 Raclなど）またはその活性型あるいはその活性ィ匕因子など）の PEG化のため の好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール (PEG)である。本明細書中で 使用される場合、「ポリエチレングリコール」は、 PEGの任意の形態の包含することを 意味し、ここで、この PEGは、他のタンパク質（例えば、モノ（C1〜C10)アルコキシポ リエチレングリコールまたはモノ（C1〜C10)ァリールォキシポリエチレングリコール） を誘導体するために使用される。
[0143] 本発明のポリペプチドの化学誘導体ィ匕を、生物学的に活性な物質を活性化したポ リマー分子と反応させるのに使用される適切な条件下で、実施され得る。 PEG化した 本発明のポリペプチドを調製するための方法は、一般に以下の工程を包含する： (a) TSLC1の分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）ま たはその活性型あるいはその活性ィ匕因子が 1以上の PEG基に結合するような条件 下で、ポリエチレングリコール（例えば、 PEGの、反応性エステルまたはアルデヒド誘 導体)とこのポリペプチドを反応させる工程および (b)この反応生成物を得る工程。公 知のパラメータおよび所望の結果に基づ 、て、最適な反応条件またはァシル化反応 を選択することは当業者に容易である。
[0144] PEG化された本発明のポリペプチドは、一般に、本明細書中に記載のポリペプチド を投与することによって、緩和または調節され得る状態を処置するために使用され得 るが、しかし、本明細書中で開示された、化学誘導体化された本発明のポリペプチド 分子は、それらの非誘導体分子と比較して、さらなる活性、増大された生物活性もし くは減少した生物活性、または他の特徴 (例えば、増大された半減期または減少した 半減期）を有し得る。本発明のポリペプチド、それらのフラグメント、改変体および誘 導体は、単独で、併用して、または他の薬学的組成物を組み合わせて使用され得る
[0145] このような核酸は、周知の PCR法により得ることができ、化学的に合成することもで きる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダィゼーシヨン法な どを組み合わせてもよい。
[0146] 本明細書にぉ 、て、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」 とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはそ の代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物力 置き換わること、付け加わること または取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野 において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが 挙げられる。置換、付加または欠失は、 1つ以上であれば任意の数でよぐそのような 数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能 (例えば、 がんマーカー、神経疾患マーカーなど）が保持される限り、多くすることができる。例 えば、そのような数は、 1または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの 20% 以内、 10%以内、または 100個以下、 50個以下、 25個以下などであり得る。
[0147] 本発明において使用されるポリペプチドは、任意の生物由来であり得る。好ましくは 、その生物は、脊椎動物 (例えば、哺乳動物、爬虫類、両生類、魚類、鳥類など)であ り、より好ましくは、哺乳動物 (例えば、齧歯類 (マウス、ラットなど）、霊長類 (ヒトなど） など)であり得る。本発明において使用されるポリペプチドは、所望の効果を発揮する かぎり、合成されたものでもよい。そのようなポリペプチドは、当該分野において周知 の合成方法によって合成され得る。例えば、自動固相ペプチド合成機を用いた合成 方法は、 Stewart, J. M. et al. (1984) . Solid Phase Peptide Synthesis, P ierc Chemical Co. ； Grant , G. A. (1992) . Synthetic Peptides： A Us er' s Guide, W. H. Freeman ; Bodanszky, M. (1993) . Principles of Pept ide Synthesis, Springer—Verlag； Bodanszky, M. et al. (1994) . The PR acltice of Peptide Synthesis, Springer— Verlag ; Fields, G. B. (1997) . Phase Peptide Synthesis, Academic Press； Pennington, M. W. et al. ( 1994) . Peptide Synthesis Protocols, Humana Press ; Fields, G. B. (199 7) . Solid— Phase Peptide Synthesis, Academic Pressにおいて 己載されて いる。
[0148] (一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手 法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Sambrook J. e t al. (,1989) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその 3rd Ed. (2001)； Ausubel, F. M. (1987) . Current Prot ocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and "Wiley— Inte rscience ; Ausubel, F. M. (1989) . Short Protocols in Molecular Biolog y : A じ ompendium of Methods from Current Protocols in Molecular
Biology, Greene Pub. Associates and Wiley— Interscience ;Innis, M. A. (1990) . PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, A cademic Press ; Ausubel, F. M. (1992) . Short Protocols in Molecular Biology： A Compendium of Methods from Current Protocols in Mol ecular Biology, Greene Pub. Associates ;Ausubel, F. M. (1995) . Short Protocols in Molecular Biology： A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates ; Inn is, M. A. et al. (1995) . PCR Strategies, Academic Press ;Ausubel, F. M. (1999) . Short Protocols in Molecular Biology： A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates ; Sninsky, J. J. et al. (1999) . PCR Applications： Proto cols for Functional Genomics, Academic Press、別冊夹験医 「遺 ナ尊 入&発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載されており、これらは本明細書にお V、て関連する部分 (全部であり得る）が参考として援用される。
[0149] 人工的に合成した遺伝子を作製するための DNA合成技術および核酸ィ匕学にっ ヽ ては、例えば、 Gait, M. J. (1985) . Oligonucleotide Synthesis : A PRacltic al Approach, IRLPress ; Gait, M. J. (1990) . Oligonucleotide Synthesis： A PRacltical Approach, IRL Press ; Eckstein, F. (1991) . Oligonucleoti des and Analogues : A PRacltical Approach, IRL Press ; Adams, R. L. etal. (1992) . The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman&Hal l ; Shabarova, Z. et al. (1994) . Advanced Organic Chemistry of Nucle ic Acids, Weinheim； Blackburn, G. M. et al. (1996) . Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press； Hermanson, G. T. (1996) . Bioconjugate Techniques, Academic Pressなどに ci載されており、 これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
[0150] (遺伝子工学）
本発明において用いられる TSLC 1の分子経路における任意の因子（例えば、 TS LC1、 Tiaml、 Raclなど）などならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子ェ 学技術を用いて生産することができる。
[0151] 本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌク レオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクター としては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能である力、または染色 体中への糸且込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモ 一ターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドで あり得る。
[0152] 本明細書において「ウィルスベクター」とは、ベクターのうち、ウィルス由来のものを いう。本明細書において「ウィルス」とは、 DNAまたは RNAのいずれかをゲノムとして 有する、感染細胞内だけで増殖する感染性の微小構造体をいう。ウィルスとしては、 レトロウイルス科、トガウィルス科、コロナウィルス科、フラビウィルス科、ノ ラミクソウイ ノレス科、オルトミクソウィルス科、ブ-ャウィルス科、ラブドウィルス科、ボックスウイノレ ス科、ヘルぺスウィルス科、バキュロウィルス科およびへパドナウィルス科からなる群 より選択される科に属するウィルスが挙げられる。本明細書において「レトロウイルス」 とは、 RNAの形で遺伝情報を有し、逆転写酵素によって RNAの情報カゝら DNAを合 成するウィルスをいう。
[0153] 本明細書にぉ 、て「レトロウイルスベクター」とは、レトロウイルスを遺伝子の担 、手（ ベクター）として使用した形態を 、う。本発明にお 、て使用される「レトロウイルスべク ター」としては、例えば、 Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV)、 Murin e Stem Cell Virus (MSCV)にもとづいたレトロウイルス型発現ベクターなどが挙 げられるがそれらに限定されない。好ましくは、レトロウイルスベクターとしては、 pGen 一、 pMSCVなどが挙げられるがそれらに限定されない。
[0154] 本明細書にぉ 、て「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロ モーターにカ卩えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結さ れている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネータ一、薬剤耐性遺 伝子のような選択マーカーおよび、ェンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の 発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類力 S、宿主細胞に応じて 変わり得ることは、当業者に周知の事項である。ヒトの場合、本発明に用いる発現べク ターはさらに pCAGGS (Niwa H et al, Gene ; 108 : 193— 9 (1991) )を含み得 る。
[0155] 本明細書において「組換えベクター」とは、 目的のポリヌクレオチド配列を目的の細 胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、動物個体 などの宿主細胞にぉ 、て自律複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、 本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが 例示される。
[0156] 本明細書において、動物細胞に対する「組換えベクター」としては、 pcDNAlZAm p、 pcDNAI、 pCDM8 (いずれもフナコシより市販）、 pAGE107 (特開平 3— 22979 、 Cytotechnology, 3, 133 (1990) )、 pREP4 (Invitrogen)、 pAGE103 (J. Bio chem. , 101, 1307 (1987) )、 pAMo、 pAMoA (j. Biol. Chem. , 268, 22782 - 22787 (1993) ) , pCAGGS (Niwa H et al, Gene ; 108 : 193— 9 (1991) ) などが例示される。
[0157] 本明細書において「ターミネータ一」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下 流に位置し、 DNAが mRNAに転写される際の転写の終結、ポリ A配列の付加に関 与する配列である。ターミネータ一は、 mRNAの安定性に関与して遺伝子の発現量 に影響を及ぼすことが知られている。ターミネータ一としては、哺乳動物由来のターミ ネーターのほかに、 CaMV35Sターミネータ一、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネ 一ター（Tnos)、タバコ PRla遺伝子のターミネータ一が挙げられる力 これに限定さ れない。
[0158] 本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、また その頻度を直接的に調節する DNA上の領域を 、、 RNAポリメラーゼが結合して 転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード 領域の第 1ェキソンの上流約 2kbp以内の領域であることが多いので、 DNA解析用 ソフトウェアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロ モータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変 動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下 流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一ェキソン翻訳開始点から 上流約 2kbp以内に存在する。
[0159] 本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異 性」とは、生物（例えば、動物）の部位 (例えば、動物の場合、心臓、心筋細胞など）に おけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、生物（たとえば、動物 )の特定の段階 (例えば、発作時など）に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。 そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導 人することができる。
[0160] 本明細書において、本発明のプロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物の すべての糸且織にぉ 、て、その生物の生長の幼若期または成熟期の 、ずれにあって もほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、本明細書の実施例と同様の 条件でノーザンプロット分析したとき、例えば、任意の時点で (例えば、 2点以上の同 一または対応する部位のいずれにおいても実質的に発現がみられるとき、本発明の 定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある 生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発 現が「ストレス応答性」であるとは、少なくとも 1つのストレス (例えば、分ィ匕刺激など）が 生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加す る性質を「ストレス誘導性」と!、 、、発現量が減少する性質を「ストレス減少性」と!、う。 「ストレス減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としている ので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分 から RNAを抽出してノーザンプロット分析または RT—PCRで発現量を分析すること または発現されたタンパク質をウェスタンプロットにより定量することにより決定すること ができる。ストレス誘導性のプロモーターを本発明において使用されるポリペプチドを コードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された動物または動物の一 部（特定の細胞、組織など）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用い ることにより、ある条件 (例えば、分化刺激時）下での本発明において使用されるポリ ペプチドの発現を行うことができる。
[0161] 本明細書において「ェンノヽンサ一」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用 いられ得る。植物において使用する場合、ェンノヽンサ一としては、ヒトサイトメガロウイ ルス目 ijf刀期ェンノヽンサ1 ~~ (human cytomegalovirus immediate― early enha ncer)の上流側の配列を含むェンハンサー領域が好ましい。ェンハンサ一は複数個 用いられ得るが 1個用いられてもよいし、用いなくともよい。
[0162] 本明細書にぉ 、て「作動可能に連結された (る）」とは、所望の配列の発現 (作動） がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、ェンノ、ンサ一など)または翻訳調 節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結 されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置される力 必ず しも隣接して配置される必要はな 、。
[0163] 本発明は、任意の動物において利用され得る。そのような動物における利用のため の技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、 Aus ubel F. A.ら編（1988)、 Current Protocols in Molecular Biology, Wile y、 New York；、 NY; Sambrook Jら (1987) Molecular Cloning : A Laborato ry Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, じ old S pring Harbor, NY、別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 19 97などに記載される。
[0164] 本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生 命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、動物細胞などが例示される。形 質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主 などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすベて包含するが、特定の文脈 にお 、て特定の形態を指し得る。
[0165] 本明細書において「動物」は、当該分野において最も広義で用いられ、脊椎動物 および無脊椎動物を含む。動物としては、哺乳綱、鳥綱、爬虫綱、両生綱、魚綱、昆 虫綱、蠕虫綱などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、動物は、哺乳 動物を含む。
[0166] 本発明にお 、て使用されるポリペプチド、核酸、キット、システム、組成物および方 法は、哺乳動物だけでなく他の動物を含む動物全体にお 、て機能することが企図さ れる。なぜなら、 TSLC1の分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml 、 Raclなど）に対応するリガンドは、哺乳動物以外の生物においても存在することが 知られているからである。
[0167] 本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の 意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜 構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する 生命体をいう。
[0168] 本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において 一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、臓器 (器官）の一部であり得 る。臓器 (器官）内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる 働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の 特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有して ヽてもよ ヽ。
[0169] 本明細書において「器官 (臓器)」とは、 1つ独立した形態をもち、 1種以上の組織が 組み合わさって特定の機能を営む構造体を形成したものをいう。動物では、胃、肝臓 、腸、脾臓、肺、気管、鼻、心臓、動脈、静脈、リンパ節 (リンパ管系）、胸腺、卵層、眼 、耳、舌、皮膚等が挙げられるがそれらに限定されない。
[0170] 本明細書において「トランスジエニック」とは、特定の遺伝子がある生物に組み込む ことまたは組み込まれた生物（例えば、動物（マウスなど)または植物を含む）をいう。
[0171] 本発明においてトランスジエニック生物が利用される場合、そのようなトランスジェニ ック生物は、マイクロインジェクション法 (微量注入法）、ウィルスベクター法、 ES細胞 法 (胚性幹細胞法)、***ベクター法、染色体断片を導入する方法 (トランスゾミック 法）、ェピゾーム法などを利用したトランスジェニック動物の作製技術を使用して作製 することができる。そのようなトランスジエニック動物の作成技術は当該分野において 周知である。
[0172] (スクリーニング）
本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供され ることち企図される。
[0173] 本明細書において「スクリーニング」とは、 目的とするある特定の性質をもつ生物ま たは物質などの標的を、特定の操作 Z評価方法で多数を含む集団の中から選抜す ることをいう。スクリーニングのために、本発明の因子 (例えば、抗体）、ポリペプチドま たは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実 在物質を用いた系を使用してもよぐインシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用い て生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリー ユングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解され る。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提 供されることち企図される。
[0174] 1実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質または本発明のポリペプチド 、あるいはその生物学的に活性な部分に結合する力、またはこれらの活性を調節す る、候補ィ匕合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアツセィを提供する。 本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリ一法に おける多数のアプローチの任意のものを使用して得られ得、これには、以下が挙げら れる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブ ラリー;逆重畳を要する合成ライブラリ一法；「1ビーズ 1ィヒ合物」ライブラリ一法;およ びァフィユティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリ一法。生物学的ライ ブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の 4つのアプローチは 、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能で ある（Lam (1997) Anticancer Drug Des.12:145)。
[0175] 分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に 見出され得る： DeWittら（1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909;Erbら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann¾ ( 1994) J. M ed. Chem 37: 2678 ;Cho¾ (1993) Science 261:1303; Carrell¾ ( 1994) An gew Chem. Int. Ed. Engl.33:2059;Carrell (1994)Angew Chem. Int. Ed. Engl.33:2061;および Gallopら（1994) Med. Chem 37:1233。
[0176] 化合物のライブラリ一は、溶液中で（例えば、 Houghten(1992)BioTechniques
13:412〜421)、あるいはビーズ上（Lam(1991)Nature 354:82〜84)、チッ プ上（Fodor( 1993) Nature 364: 555〜556)、細菌（Ladner 米国特許第 5, 2 23, 409号）、胞子（Ladner、上記）、プラスミド（Cullら（1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865〜1869)またはファージ上（3。01 ぉょび3111辻11(1990)3(^ nce 249 :386〜390; Devlin (1990) Science 249:404〜406;Cwirlaら（199 0) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.87:6378〜6382;Felici(1991)J Mol B iol 222 : 301〜310 ; Ladner上記）にお!/、て示され得る。
[0177] 本発明は、他の実施形態において、本発明の活性成分 (例えば、ポリペプチドまた は核酸）と同等に有効な因子をスクリーニングするための道具として、コンピュータに よる疋直的構造活'性ネ目関 (quantitative structure activity relationship = Q SAR)モデルィ匕技術を使用して得られる化合物もまた、本発明に包含される。ここで 、コンピュータ技術は、いくつかのコンピュータによって作成した基質铸型、ファーマ コフォア、ならびに本発明の活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に 、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基 をモデル化することに対する方法は、 CATALYSTTM ファーマコフォア法（Ekins et al. , Pharmacogenetics, 9 :477〜489, 1999 ;Ekins et al. , J. Pharm acol. & Exp. Ther. , 288 : 21〜29, 1999 ;Ekins et al.、 Pharmacol. &
Exp. Ther. , 290 :429〜438, 1999 ;Ekins et al.、 Pharmacol. & Exp . Ther. , 291 :424〜433, 1999)および比較分子電界分析（comparative mol ecular field analysis ;し oMFAノ (Jones et al. 、 Drug Metabolism & Dis position, 24 : 1〜6, 1996)などを使用して示されている。本発明において、コンビ ユータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、 CATALYSTTMバージョ ン 4 (Molecular Simulations, Inc. , San Diego, CA)など）を使用して行われ 得る。
活性部位に対する化合物のフィッティングは、当該分野で公知の種々のコンビユー タモデリング技術のいずれかを使用してで行うことができる。視覚による検査および活 性部位に対する化合物のマニュアルによる操作は、 QUANTA (Molecular Simul ations, Burlington, MA, 1992)、 SYBYL (Molecular Modeling Software , Tripos Associates, Inc. , St. Louis, MO, 1992)、 AMBER (Weiner et a 1. , J. Am. Chem. Soc. , 106 : 765— 784, 1984)、 CHARMM (Brooks et a 1. 、J. Comp. Chem. , 4 : 187〜217, 1983)などのようなプログラムを使用して行 うことができる。これにカロえ、 CHARMM, AMBERなどのような標準的な力の場を使 用してエネルギーの最小化を行うこともできる。他のさらに特殊ィ匕されたコンピュータ モデリングは、 GRID (Goodford et al. 、J. Med. Chem. , 28 : 849〜857, 198 5) , MCSS (Miranker and Karplus, Function and Genetics, 11 : 29〜34 , 1991)、 AUTODOCK(Goodsell and Olsen, Proteins : S tructure, Func tion and Genetics, 8 : 195〜202, 1990)、 DOCK (Kuntz et al. , J. Mol. Biol. , 161 : 269-288, (1982) )などを含む。さらなる構造の化合物は、空白の活 性部位、既知の低分子化合物における活性部位などに、 LUDKBohm, J. Comp. Aid. Molec. Design, 6 : 61〜78, 1992)、 LEGEND (Nishibata and Itai, T etrahedron, 47 : 8985, 1991)、 Leap Frog (Tripos Associates, St. Louis, MO)などのようなコンピュータープログラムを使用して新規に構築することもできる。 このようなモデリングは、当該分野において周知慣用されており、当業者は、本明細 書の開示に従って、適宜本発明の範囲に入る化合物（例えば、活性型 TSLC1の分 子経路における任意の因子 (例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）の等価物）を設 計することができる。
[0179] (投与 '注入'医薬）
本発明の因子によって調製された組成物は、生物への移入に適した形態であれば 、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注 射剤、徐放剤が挙げられる。投与経路としては経口投与、非経口投与、患部への直 接投与などが挙げられる。
[0180] 注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切 な溶剤（生理食塩水、 PBSのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターな どで濾過滅菌し、次いで無菌容器 (例えば、アンプルなど）に充填することにより注射 剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを 含めてもょ ヽ。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。
[0181] 1つの実施形態において、本発明の因子 (例えば、活性型 TSLC1の分子経路に おける任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）またはそれをコードする核 酸など）は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使 用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、 例えば、ロッド状 (ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状 、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野におい て公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載 されている。徐放剤 (持続性投与剤)を製造する方法としては、例えば、複合体から 薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性 懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液 (oZw型、 wZo型の乳濁製注射液など）とす る方法などが挙げられる。
[0182] 本発明の組成物またはキットはまた、さらに生体親和性材料を含み得る。この生体 親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸'乳酸の共重 合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルォロ エチレン、ポリプロピレン、ポリアタリレート、ポリメタタリレートからなる群より選択される 少なくとも 1つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解 性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、 a ヒロドキシカルボン酸類 (例えば、 グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ 酸など）およびヒドロキシトリカルボン酸 (例えば、クェン酸など)からなる群より選択さ れる 1種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれ らの混合物、ポリ一 α—シァノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸 (例えば、ポリ一 γ— ベンジルー L グルタミン酸など）、無水マレイン酸系共重合体（例えば、スチレン マレイン酸共重合体など）のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダ ム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、 a—ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジ力 ルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、 D —体、 L 体、 DL 体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール 酸 ·乳酸の共重合体が使用され得る。
[0183] 核酸分子を含む本発明の組成物を投与する場合、核酸分子は、非ウィルスベクタ 一形態またはウィルスベクター形態による投与、または naked DNAでの直接投与 の形態などで投与され得る。このような投与形態は、当該分野において周知であり、 例えば、別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、 1996 ;別冊実験医学「遺 伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに詳説されている。
[0184] 特定の実施形態において、本発明の正常な遺伝子の核酸配列、抗体またはその 機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現 および Zまたは活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために 、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可 能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態に おいて、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効 果を媒介する。
[0185] 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用 され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。
[0186] 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、 Goldspielら， Clinical Pharma cy 12 :488— 505 (1993) ;Wuおよび Wu, Biotherapy 3 : 87— 95 (1991) ;Tol stoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 : 573- 596 (1993)； Mulligan, Science 260 : 926- 932 (1993)；ならびに Morganおよび Anderson, Ann. Re v. Biochem. 62 : 191— 217 (1993)； May, TIBTECH 11 (5) : 155— 215 (19 93)を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換え DNA技 術は、 Ausubelら (編) , Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons, NY (1993)；および Kriegler, Gene Transfer and Expressio n, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990)に記載さ
れる。
[0187] したがって、本発明では、本発明の診断薬による診断結果を利用して、 TSLC1の 分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）またはその改 変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子を用いた遺伝子治療が有用であり 得る。
[0188] 非ウィルスベクター形態の場合、リボソームを用いて核酸分子を導入する方法 (リポ ソーム法、 HVJ—リボソーム法、カチォニックリボソーム法、リボフヱクチン法、リポフエ クトァミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Gene Gun)でキャリア (金 属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などが利用され得る。発現ベクター としては、例えば、 pCAGGS (Gene 108 : 193— 9、 Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J (1991) )、 pBJ— CMV、 pcDNA3. 1、 pZeoSV (Invitrogen、 Strata geneなど力 入手可能である）などが挙げられる。
[0189] HVJ—リボソーム法は、脂質二重膜で作製されたリボソーム中に核酸分子を封入し 、このリボソームと不活化したセンダイウィルス（Hemagglutinating virus of Jap an、 HVJ)とを融合させることを包含する。この HVJ—リボソーム法は、従来のリポソ一 ム法よりも、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とする。 HVJ—リボソーム調 製法は、別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、 1996 ;別冊実験医学「遺 伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997に詳述されている。 HVJとしては、任意 の株が利用可能であり（例えば、 ATCC VR- 907、 ATCC VR- 105など）、 Z株 が好ましい。
[0190] 本発明の組成物は、ウィルスベクターの核酸形態で提供される場合、組換えアデノ ウィルス、レトロウイルスなどのウィルスベクターが利用される。無毒化したレトロウィル ス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ポッ タスウィルス、ポリオウイルス、シンドビスゥイノレス、センダイウィルス、 SV40、ヒト免疫 不全ウィルス (HIV)などの DNAウィルスまたは RNAウィルスに、活性型 TSLC1の 分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）をコードする 核酸または TSLC1の分子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Ra clなど）をコードする核酸を導入し、細胞または組織にこの組換えウィルスを感染さ せることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。これらウィルス ベクターでは、アデノウイルスの感染効率が他のウィルスベクターによる効率よりも遙 力に高 、こと力ら、アデノウイルスベクター系を用いることが好まし！/、。
[0191] Naked DNA法の場合、上述の非ウィルスベクターである発現プラスミドを生理食 塩水などに溶解し、そのまま投与する。例えば、 Tsurumi Y, Kearney M, Chen D, Silver M, Takeshita ¾, Yang J, Symes JF, Isner JM.、 Circulation 98 (Suppl. 11)、 382— 388 (1997)に記載される方法により、生物の器官の組織 などに直接注入することができる。
[0192] 従って、本発明の糸且成物およびキットにおいて含まれる活性成分としてのポリぺプ チド (例えば、活性型 TSLC1の分子経路における任意の因子 (例えば、 TSLC1、 Ti aml、 Raclなど）など）の量は、例えば、成人（体重約 60kg)の場合、約 1 μ g〜約 1 000mg、好ましくは約 5 μ g〜約 lOOmgであり得る。このポリペプチドの量の範囲の 下限は、 f列えば、約 1 g、約 2 g、約 3 g、約 4 g、約 5 g、約 6 g、約 7 μ g、 約 8 g、約 9 g、約 10 g、約 15 g、約 20 gなど、約 1 μ g〜約 lmgの間の任意 の数値であり得る。このポリペプチドの量の範囲の上限は、例えば、約 1000mg、約 9 OOmg、約 800mg、約 700mg、約 600mg、約 500mg、約 400mg、約 300mg、約 2 OOmg、約 100mg、約 75mg、約 50mg、約 25mg、約 10mg、約 5mgなど、約 1000 mg〜約 lmgの任意の数値であり得る。
[0193] 本発明の活性成分が核酸形態 (例えば、活性型 TSLC1の分子経路における任意 の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）をコードする核酸または TSLC1の分 子経路における任意の因子（例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclなど）をコードする核 酸など）の場合、成人（体重約 60kg)の場合、約: L g〜約 10mg、好ましくは約 1 μ g 〜約 1000 μ g、より好ましくは約 5 μ g〜約 400 μ gであり得る。この核酸の量の範囲 の下限は、 f列えば、約 1 g、約 2 g、約 3 g、約 4 g、約 5 g、約 6 g、約 7 g 、約 8 g、約 9 g、約 10 g、約 15 g、約 20 gなど、約 1 μ g〜約 20 gの間の 任意の数値であり得る。この核酸の量の範囲の上限は、例えば、約 10mg、約 9mg、 約 8mg、約 7mg、約 6mg、約 5mg、約 4mg、約 3mg、約 2mg、約 lmg、約 750 μ g、 約 500 μ g、約 250 μ g、約 100 μ gなど、約 10mg〜約 10 μ gの任意の数値であり得 る。 2種類以上の細胞生理活性物質 (SCFなど）が含まれる場合も、上記の量が個々 に適用される。ウィルスベクターまたは非ウィルスベクターとして投与される場合は、 通常、 0. 0001〜100mg、好まし <は 0. 001〜10mg、より好まし <は 0. 01〜： Lmg である。投与頻度としては、例えば、毎日—数ケ月に 1回（例えば、 1週間に 1回— 1ケ 月に 1回）の投与が挙げられる。
[0194] 本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法を医師、患者な ど投与を行う人に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の医薬な どを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位と して、骨格筋に投与 (例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されて いてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁 (例えば、 日本であれ ば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局 (FDA)など）が規定した様式に従って 作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添 付文書 (package insert)であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定され ず、例えば、電子媒体 (例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メー ル)のような形態でも提供され得る。
[0195] 本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」 ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。
[0196] 本明細書にぉ 、て「レシピエント」（受容者）とは、物質を受け取る個体と!/ 、、「宿 主」とも呼ばれる。これに対し、物質を提供する個体は、「ドナー」（供与者)という。
[0197] 本明細書において「生体内」または「インビボ」（in vivo)とは、生体の内部をいう。
特定の文脈において、「生体内」は、目的とする物質が配置されるべき位置をいう。
[0198] 本明細書にぉ 、て「インビトロ」とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生 体外に」（例えば、試験管内に)摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対 照をなす用語である。
[0199] 本明細書にぉ 、て「ェキソビボ」とは、遺伝子導入を行うための標的細胞を被験体 より抽出し、インビトロで治療遺伝子または因子を導入した後に、再び同一被験体に 戻す場合、一連の動作をェキソビボという。
[0200] 本発明において使用されるポリペプチド、核酸、医薬ならびにそのようなポリべプチ ドまたは核酸によって調製された組成物は、生物への移入に適した形態であれば、 任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射 剤、徐放剤が挙げられる。投与方法は、経口投与、非経口投与 (例えば、静脈内投 与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部へ の局所投与、皮膚投与など)、患部への直接投与などが挙げられる。そのような投与 のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、 例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。本発明の組成物および医薬は、全身 投与されるとき、発熱物質を含ない、経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。 そのような薬学的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、 pH、等張性、安定性など に相当な注意を払うことを条件として、当業者の技術範囲内である。
[0201] 本発明において医薬の処方のために使用される溶媒は、水性または非水性のいず れかの性質を有し得る。さらに、そのビヒクルは、処方物の、 pH、容量ォスモル濃度、 粘性、明澄性、色、滅菌性、安定性、等張性、崩壊速度、または臭いを改変または維 持するための他の処方物材料を含み得る。同様に、本発明の組成物は、有効成分 の放出速度を改変または維持するため、または有効成分の吸収もしくは透過を促進 するための他の処方物材料を含み得る。
[0202] 本発明は、医薬または医薬組成物として処方される場合、必要に応じて生理学的 に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（Remington' s Pharmaceutical sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed. , MacK Publishing Compan y, 1990)と、所望の程度の純度を有する選択された組成物とを混合することによつ て、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。
[0203] そのような適切な薬学的に受容可能な因子としては、以下が挙げられるがそれらに 限定されない:抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化 剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および Zまたは 農学的もしくは薬学的アジュバント。代表的には、本発明の医薬は、本発明の活性成 分 (例えば、ポリペプチドまたは核酸など）を、 1つ以上の生理的に受容可能なキヤリ ァ、賦形剤または希釈剤とともに組成物の形態で投与され得る。例えば、適切なビヒ クルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口 送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。そのような 受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、 そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下 が挙げられる：リン酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸;抗酸化剤（例えば、ァスコ ルビン酸）；低分子量ポリペプチド;タンパク質 (例えば、血清アルブミン、ゼラチンま たは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビュルピロリドン）；アミノ酸 (例え ば、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサ ッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キ レート剤（例えば、 EDTA)；糖アルコール（例えば、マン-トールまたはソルビトール） ；塩形成対イオン (例えば、ナトリウム）；ならびに Zあるいは非イオン性表面活性化剤 (例えば、 Tween、プル口ニック（pluronic)またはポリエチレングリコール（PEG) )。
[0204] 注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切 な溶剤（生理食塩水、 PBSのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターな どで濾過滅菌し、次いで無菌容器 (例えば、アンプルなど）に充填することにより注射 剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを 含めてもよい。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。例示の適 切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された 生理食塩水が挙げられる。好ましくは、本発明の医薬は、適切な賦形剤 (例えば、ス クロース)を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤およ び賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、 pH7. 0-8. 5の Tr is緩衝剤または pH4. 0- 5. 5の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さら〖こ、ソルビトール またはその適切な代替物を含み得る。その溶液の pHはまた、種々の pHにおいて、 本発明の活性成分 (例えば、ポリペプチドまたは核酸など)の相対的溶解度に基づ 、 て選択されるべきである。
[0205] 本発明の製剤の処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方 、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細 書の記載があれば、過度な実験を行うことなぐ投与すべきポリペプチド量および細 胞量を決定することができる。
[0206] 1つの実施形態において、本発明の組成物および医薬は、徐放性形態で提供され 得る。徐放性形態で投与される場合、活性成分 (例えば、核酸またはポリペプチド） は、徐々に放出されるので、長期にわたり薬効が期待される場合に有効である。徐放 性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形 態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状 (ペレット状、シリンダー状、 針状など)、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形 態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬 局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤 (持続性投与剤)を製造 する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射 液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液 (oZw 型、 wZo型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
[0207] 別の実施形態では、本発明では、さらに他の薬剤もまた投与することも企図される。
そのような薬剤は、当該分野において公知の任意の医薬であり得、例えば、そのよう な薬剤は、薬学において公知の任意の薬剤 (例えば、抗生物質など)であり得る。当 然、そのような薬剤は、 2種類以上の他の薬剤であり得る。そのような薬剤としては、 例えば、 日本薬局方最新版、米国薬局方最新版、他の国の薬局方の最新版におい て掲載されて 、るものなどが挙げられる。
[0208] 他の実施形態において、本発明の方法によって調製された組成物は 2種類以上の 細胞を含み得る。 2種類以上の医薬を使用する場合、類似の性質または由来の医薬 を使用してもよく、異なる性質または由来の医薬を使用してもよ!、。
[0209] 本発明の方法において使用されるポリペプチド、核酸、組成物および医薬の量は、 使用目的、対象物の齢、サイズ、性別、既往歴、ポリペプチド、核酸、組成物、医薬も しくは細胞の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容 易に決定することができる。
[0210] 本発明の組成物を対象物に対して与える頻度もまた、使用目的、対象物の齢、サイ ズ、性別、既往歴、および処置経過などを考慮して、当業者が容易に決定することが できる。頻度としては、例えば、一日に 1回〜数回、毎日 数ケ月に 1回（例えば、 1 週間に 1回 1ヶ月に 1回）の投与が挙げられる。 1週間ー1ヶ月に 1回の投与を、経 過を見ながら施すことが好ましい。
[0211] 本発明が対象とする疾患は、がんである。本明細書において「がん」とは、悪性腫瘍 一般をいう。本発明が特に対象とするがんは、固形がん (特に、小細胞肺がん、大腸 がん、卵巣がん、骨肉腫、軟部組織肉腫および他の固形がん)などを挙げることがで きる。従って、本発明が対象とする疾患は、「小細胞肺がん」であり得る。「がん」は、 通常、異型性が強ぐ増殖が正常細胞より速ぐ周囲組織に破壊性に浸潤し得あるい は転移をおこし得る悪性腫瘍またはそのような悪性腫瘍が存在する状態を ヽぅ。本発 明においては、がんは固形がんおよび造血器腫瘍を含むがそれらに限定されない。
[0212] 本明細書において「固形がん」は、固形の形状があるがんをいい、白血病などの造 血器腫瘍とは対畤する概念である。そのような固形がんとしては、例えば、乳がん、肝 がん、胃がん、肺がん、頭頸部がん、子宮頸部がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、 悪性リンパ腫、食道がん、脳腫瘍、骨腫瘍が挙げられるがそれらに限定されない。
[0213] 本明細書において「肺がん」とは、肺のがんをいう。肺がんは固形がんの一種である 。肺がんは気管、気管支、肺胞の細胞が正常の機能を失い、無秩序に増えることに より発生する。がんは周囲の組織や器官を破壊して増殖しながら他の臓器に拡がり、 多くの場合、腫瘤（しゅりゅう）を形成する。肺がんになる人は世界的に増加傾向にあ る。 2015年には、我が国での肺がんの 1年間の新患者数は男性 11万人、女性 3万 7 千人になると予想されている。 50歳以上に多ぐ男女比は約 3 : 1である。 1999年の 肺がんによる年間死亡者数は約 5万 2千人であり（がんで亡くなった方は約 29万人、 うち胃がん約 5万人）、 1993年からは肺がんは男性のがん死亡率の第 1位となり、女 性では胃がんに次いで第 2位となっている。肺がんの 5年生存率 (治療開始から 5年 間生存して 、る割合）は 25〜30%と 、われて 、る。
[0214] 肺がんは、小細胞がんと非小細胞がんの 2つの型に大きく分類される。非小細胞肺 がんは、さらに腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、腺扁平上皮がんなどの組織型 に分類される。肺がんの発生しやすい部位、進行形式と速度、症状などの臨床像は 多彩ですが、これも多くの異なる組織型があるためである。腺がんは、我が国で最も 発生頻度が高ぐ男性の肺がんの 40%、女性の肺がんの 70%以上を占めている。 肺がんの中でも他の組織型に比べ臨床像は多彩で、進行の速!、ものから進行の遅 いものまでいろいろある。次に多い扁平上皮がんは、男性の肺がんの 40%、女性 の肺がんの 15%を占めている。気管支が肺に入った近くに発生する肺門型と呼ば れるがんの頻度が、腺がんに比べて高くなる。大細胞がんは、一般に増殖が速ぐ肺 がんと診断された時には大きながんであることが多くみられる。
[0215] 本明細書において、「小細胞がん」は、顕微鏡で見るとリンパ球に似た比較的小さ な細胞からなっており、燕麦（えんばく）のような小型の細胞に見えることより、燕麦細 胞がんとも呼ばれている。小細胞がんは肺がんの約 15〜20%を占め、増殖が速ぐ 脳'リンパ節'肝臓 '副腎'骨などに転移しやす!/ヽ悪性度の高!ヽがんである。非小細胞 肺がんと異なり、抗がん剤や放射線治療が比較的効きやす 、タイプのがんであること から、他のがんにおける知見が何ら役に立たないという特殊な性質を有する。約 80 %以上では、がん細胞が種々のホルモンを産生している。そのため、まれに副腎皮 質刺激ホルモンによるクッシング症候群と呼ばれる身体の中心部を主体とした肥満、 満月のような丸い顔貌、全身の皮膚の色が黒くなる、血圧が高くなる、血糖値が高く なる、血液中のカリウム値が低くなるなどの症候があらわれることもある。その他、まれ に抗利尿ホルモンの産生による水利尿不全にともない、血液中のナトリウム値が低く なり、食欲不振などの消化器症状や神経症状'意識障害が出現することがある。大細 胞がんでは、細胞の増殖を増やす因子の産生による白血球増多症や発熱、肝腫大 などがあらわれることがあり、その形態ごとに、病態は全く異なるのが特徴である。
[0216] 肺がんの診断は、通常、気管支鏡検査、穿刺吸引細胞診、 CTガイド下肺針生検、 胸膜生検、リンパ節生検などによって行われている。一般的には、胎児性タンパクの CEAが検査されるが、小細胞がんでは、がん細胞が神経内分泌系細胞の特徴も有 して 、ることから、神経内分泌系細胞のマーカーである NSEまたは ProGRPの検査 も行われている力 その決め手にかいている。
[0217] 病期に分類すると、小細胞肺がんでは、潜伏がん、 0、 I、 II、 III、 IV期などの分類 以外に、限局型、進展型に大別する方法も使われている。限局型で放射線療法と化 学療法の合併療法を受けた場合、 2年、 3年、 5年生存率はそれぞれ約 50、 30、 25 %といわれている。進展型で化学療法を受けた場合、 3年生存率は約 10%といわれ ている（以上、国立がんセンター、ウェブサイト http : ZZwww. ncc. go. jp/jp/n cc-cis/pub/cancer/010202. htmlより）。
[0218] 本明細書において「抗がん剤」とは、がん (腫瘍)細胞の増殖を選択的に抑制し、が んの薬剤および放射線治療の両方を包含する。そのような抗がん剤は当該分野にお いて周知であり、例えば、抗がん剤マ-ユアル第 2版 塚越茂他編 中外医学社; Ph armacoiogy； Lippmcott Williams & Wilkms, Inc.に己載されている。
[0219] 本明細書において「RNAi」とは、 RNA interferenceの略称で、二本鎖 RNA(ds RNAともいう）のような RNAiを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同な mRNAが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用 いられる技術をいう。本明細書において RNAiはまた、場合によっては、 RNAiを引 き起こす因子と同義に用いられ得る。
[0220] 本明細書において「RNAiを引き起こす因子」とは、 RNAiを引き起こすことができる ような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「RNAiを引き起こす 因子」とは、その遺伝子に関する RNAiを引き起こし、 RNAi力もたらす効果 (例えば 、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのような RNAiを引き起こ す因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約 70% の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダィズする配列を含 む、少なくとも 10ヌクレオチド長の二本鎖部分を含む RNAまたはその改変体が挙げ られるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、 3'突出末端を含み、 より好ましくは、 3'突出末端は、 2ヌクレオチド長以上の DNA (例えば、 2〜4ヌクレオ チド長の DNA)であり得る。
理論に束縛されな 、が、 RNAiが働く機構として考えられるものの一つとして、 dsR NAのような RNAiを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、 4 0塩基対以上) RNAの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Dicer)と呼ばれる R Naselll様のヌクレアーゼが ATP存在下で、その分子を 3'末端から約 20塩基対ず つ切り出し、短鎖 dsRNA(siRNAとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「siRN A」とは、 short interfering RNAの略称であり、人工的に化学合成されるかまた は生化学的に合成されたものカゝ、あるいは生物体内で合成されたものカゝ、あるいは 約 40塩基以上の二本鎖 RNAが体内で分解されてできた 10塩基対以上の短鎖二本 鎖 RNAをいい、通常、 5'—リン酸、 3'—OHの構造を有しており、 3'末端は約 2塩 基突出している。この siRNAに特異的なタンパク質が結合して、 RISC (RNA—indu ced— silencing— complex)が形成される。この複合体は、 siRNAと同じ配列を有 する mRNAを認識して結合し、 RNaselll様の酵素活性によって siRNAの中央部で mRNAを切断する。 siRNAの配列と標的として切断する mRNAの配列の関係につ いては、 100%—致することが好ましい。し力し、 siRNAの中央から外れた位置につ いての塩基の変異については、完全に RNAiによる切断活性がなくなるのではなぐ 部分的な活性が残存する。他方、 siRNAの中央部の塩基の変異は影響が大きぐ R NAiによる mRNAの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異 をもつ mRNAについては、その変異を中央に配した siRNAを合成し、細胞内に導 入することで特異的に変異を含む mRNAだけを分解することができる。従って、本発 明では、 siRNAそのものを、 RNAiを引き起こす因子として用いることができるし、 siR NAを生成するような因子 (例えば、代表的に約 40塩基以上の dsRNA)をそのような 因子として用いることができる。 [0222] また、理論に束縛されることを希望しないが、 siRNAは、上記経路とは別に、 siRN Aのアンチセンス鎖が mRNAに結合して RNA依存性 RNAポリメラーゼ（RdRP)の プライマーとして作用し、 dsRNAが合成され、この dsRNAが再びダイサ一の基質と なり、新たな siRNAを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、 siRNA自体および siRNAが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫など では、例えば 35分子の dsRNA分子力 1, 000コピー以上ある細胞内の mRNAを ほぼ完全に分解することから、 siRNA自体および siRNAが生じるような因子が有用 であることが理解される。
[0223] 本発明において siRNAと呼ばれる、約 20塩基前後（例えば、代表的には約 21〜2 3塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖 RNAを用いることができる。このような siR NAは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、その siRNAの標的となる 病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することが できる。
[0224] 本発明において用いられる siRNAは、 RNAiを引き起こすことができる限り、ど のような形態を採って 、てもよ 、。
[0225] 別の実施形態において、本発明の RNAiを引き起こす因子は、 3'末端に突出部を 有する短いヘアピン構造（shRNA; short hairpin RNA)であり得る。本明細書に おいて「shRNA」とは、一本鎖 RNAで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより 、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約 20塩基対以上の分子を いう。そのような shRNAは、人工的に化学合成される。あるいは、そのような shRNA は、センス鎖およびアンチセンス鎖の DNA配列を逆向きに連結したヘアピン構造の DNAを T7 RNAポリメラーゼによりインビトロで RNAを合成することによって生成す ることができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのような shRNAは、細胞内 に導入された後、細胞内で約 20塩基 (代表的には例えば、 21塩基、 22塩基、 23塩 基)の長さに分解され、 siRNAと同様に RNAiを引き起こし、本発明の処置効果があ ることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含 む)など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、 sh RNAは、 siRNAと同様に RNAiを引き起こすことから、本発明の有効成分として用い ることができる。 shRNAはまた、好ましくは、 3'突出末端を有し得る。二本鎖部分の 長さは特に限定されないが、好ましくは約 10ヌクレオチド長以上、より好ましくは約 20 ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、 3突出末端は、好ましくは DNAであり得、より 好ましくは少なくとも 2ヌクレオチド長以上の DNAであり得、さらに好ましくは 2〜4ヌク レオチド長の DNAであり得る。
[0226] 本発明において用いられる RNAiを引き起こす因子は、人工的に合成した (例えば 、化学的または生化学的)ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この 両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、 液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
[0227] 本発明において用いられる RNAiを引き起こす因子は、インビトロで合成することも できる。この合成系において、 T7 RNAポリメラーゼおよび T7プロモーターを用いて 、铸型 DNAからアンチセンスおよびセンスの RNAを合成する。これらをインビトロで アニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じて RNAiが引き起こ され、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのよう な RNAを細胞内に導入することができる。
[0228] 本発明の RNAiを引き起こす因子としてはまた、 mRNAとハイブリダィズし得る一本 鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。その ような因子もまた、本発明の処置方法および組成物において有用である。
[0229] 以下により詳細な RNAiの設計方法の説明を記載する。
[0230] 本発明にお 、て用いられる RNAiとしては、標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配 列と実質的に同一の配列を有する DNAと RNAからなる 2本鎖ポリヌクレオチドを、細 胞、組織、あるいは個体に導入することを特徴とする標的遺伝子の発現阻害方法を 用いることができる。ここで、 2本鎖ポリヌクレオチド力 自己相補性を有する 1本鎖か らなるものを用いることができる。あるいは、この 2本鎖ポリヌクレオチドは、 DNA鎖と RNA鎖のハイブリッドであってもよい。好ましくは、使用される DNA鎖と RNA鎖のハ イブリツドは、センス鎖が DNAで、アンチセンス鎖が RNAであり得る。あるいは、使用 される 2本鎖ポリヌクレオチドは、 DNAと RNAのキメラであってもよい。 1つの実施形 態では、使用される 2本鎖ポリヌクレオチド力 該ポリヌクレオチドのうち、少なくとも上 流側の一部は RNAであってもよい。 1つの実施形態では、使用されるヌクレオチドの 上流側の一部は、 9〜13ヌクレオチド力 なり得る。
[0231] 1つの実施形態では、使用される 2本鎖ポリヌクレオチドは、 19〜25ヌクレオチドか らなり、該ポリヌクレオチドのうち、少なくとも上流約 1Z2が RNAであり得る。
[0232] RNAi技術では、標的遺伝子は、複数であってもよ!/ヽ。 RNAi技術による標的遺伝 子の発現阻害の結果、該細胞、組織、あるいは個体に現れる表現型の変化を解析 することにより効果確認を行うことができる。
[0233] RNAi技術を用いれば、標的遺伝子の発現の阻害により、細胞、組織、ある!/ヽは個 体に特定の性質を付与することができる。
[0234] RNAi法における RNAの機能部位は、以下の工程を包含する方法により同定する ことができる：（i)標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を 有する 2本鎖ポリヌクレオチドであって DNAと RNAのキメラ力もなるものを作製し、 (ii )該2本鎖ポリヌクレオチドを細胞、組織、あるいは個体に導入し、（iii)該細胞、組織 、あるいは個体中の標的遺伝子の発現阻害度を測定し、（iv)標的遺伝子の発現阻 害に RNAであることが必要とされる配列を特定すること。この方法では、使用される 2 本鎖ポリヌクレオチド力 その 2本鎖のどちらか一方が RN A鎖であってもよい。
[0235] 本明細書にぉ 、て RNAi技術で使用される「標的遺伝子」とは、これを導入する細 胞、組織、あるいは個体（以下これを「被導入体」と称することがある）に mRNA、お よび任意にタンパク質を産出するように翻訳され得るものであれば如何なるものであ つてもよい。具体的には、導入する対象物の内在性のものでも、また外来性のもので もよい。また、染色体上に存在する遺伝子でも、染色体外のものでもよい。外来性の ものとしては、例えば、被導入体に感染可能なウィルス、細菌、真菌または原生動物 のような病原体由来のもの等が挙げられる。その機能については、既知のものでも、 未知のものでもよぐまた、他生物の細胞内では機能が既知であるが、被導入体内で は機能が未知のもの等でもよ 、。
[0236] これらの遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有する DNA と RNAからなる二本鎖ポリヌクレオチド（以下、これを「二本鎖ポリヌクレオチド」と称 することがある）とは、標的遺伝子の塩基配列のうち、いずれの部分でもよい 20ヌクレ ォチド以上の配列と実質的に同一な配列からなるものである。ここで、実質的に同一 とは、標的遺伝子の配列と 50%以上、好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 80%以 上の相同性を有することを意味する。ヌクレオチドの鎖長は 19ヌクレオチドから標的 遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF)の全長までの如何なる長さでもよ！/ヽ 力 19〜500ヌクレオチドの鎖長を有するものが好ましく用いられる。ただし、哺乳類 動物由来の細胞においては、 30ヌクレオチド以上の鎖長を有する二本鎖 RNAに反 応して活性ィ匕するシグナル伝達系の存在が知られて 、る。これはインターフェロン反 応と呼ばれており（Mareus, P. I. , et al. , Interferon, 5, 115— 180 (1983) ) 、該ニ本鎖 RNAが細胞内に侵入すると、 PKR (dsRNA— responsive protein ki nase : Bass, B. L. , Nature, 411, 428— 429 (2001) )を介して多くの遺伝子の 翻訳開始が非特異的に阻害され、それと同時に 2'、 5 ' oligoadenylate syntheta se (Bass, B. L. , Nature, 411, 428— 429 (2001) )を介して RNaseLの活性化 が起こり、細胞内の RNAの非特異的な分解が惹起される。これらの非特異的な反応 のために、標的遺伝子の特異的反応が隠蔽されてしまう。従って哺乳類動物、または 該動物由来の細胞、あるいは組織を被導入体として用いる場合には 19〜25、好まし くは 19〜23、さらに好ましくは 19〜21ヌクレオチド力もなる二本鎖ポリヌクレオチドが 用いられる。本発明の二本鎖ポリヌクレオチドは、その全体が 2本鎖である必要はなく 、 5 '、または 3 '末端が一部突出したものも含み、その突出末端は 1〜5ヌクレオチド、 好ましくは 1〜3ヌクレオチド、さらに好ましくは 2ヌクレオチドである。また、最も好まし い例としては、各ポリヌクレオチド鎖の 3 '末端が 2ヌクレオチドずつ突出している構造 を有するものが挙げられる。二本鎖ポリヌクレオチドは、相補性を有する部分が二本 鎖となっているポリヌクレオチドを意味する力 自己相補正を有する 1本鎖ポリヌクレ ォチドが自己アニーリングしたものでもよい。 自己相補正を有する 1本鎖ポリヌクレオ チドとしては、例えば、逆方向反復配列を有するもの等が挙げられる。
さらに、 DNAと RNAの混合については、 DNA鎖と RNA鎖のハイブリッド型や、 D NAと RNAのキメラ型等が用いられる。 DNA鎖と RNA鎖のハイブリッドは、それを被 導入体に導入した際に、標的遺伝子の発現が阻害される活性を有するものである限 り如何なるものであってもよいが、好ましくは、センス鎖が DNAであり、アンチセンス 鎖が RNAであるものが用いられる。また、 DNAと RNAのキメラ型では、それを被導 入体に導入した際に、標的遺伝子の発現が阻害される活性を有するものである限り 如何なるものであってもよ 、。二本鎖ポリヌクレオチドの安定性を高めるためには DN Aをできるだけ多く含むことが好ましいが、本発明のキメラ型二本鎖ポリヌクレオチド のうち、 RNAであることが標的遺伝子の発現阻害に必要な配列については、後述す る標的遺伝子の発現阻害度の解析を行いながら発現阻害の起こる範囲で適宜決定 していくことが望ましい。これにより、 RNAi法における RNAの機能部位を同定するこ ともできる。このように決定されたキメラ型の好ましい例としては、例えば、二本鎖ポリ ヌクレオチドの上流側の一部が RNAであるものが挙げられる。ここで、上流側とは、 センス鎖の 5'側およびアンチセンス鎖の 3'側を意味する。上流側の一部とは、上記 二本鎖ポリヌクレオチドの上流の末端から 9〜 13ヌクレオチドの部分が好ましく挙げら れる。また、このようなキメラ型二本鎖ポリヌクレオチドとして好ましい例としては、ポリ ヌクレオチドの鎖長がそれぞれ 19〜21ポリヌクレオチド力 なり、該ポリヌクレオチド のうち、少なくとも上流側 1Z2が RNAで、それ以外が DNAである二本鎖ポリヌクレ ォチドが挙げられる。また、このような二本鎖ポリヌクレオチドのうち、アンチセンス鎖 が全て RNAのものは標的遺伝子の発現阻害効果がさらに高い。
二本鎖ポリヌクレオチドの調製方法としては、特に制限はな 、が、それ自体既知の 化学合成方法を用いることが好ましい。化学合成は、相補性を有する 1本鎖ポリヌク レオチドを別個に合成し、これを適当な方法で会合させることにより二本鎖とすること ができる。会合の方法として具体的には、例えば、合成した 1本鎖ポリヌクレオチドを 好ましくは少なくとも約 3 : 7のモル比で、より好ましくは約 4 : 6のモル比で、そして最も 好ましくは本質的に同モル量 (すなわち約 5： 5のモル比）で混合し、二本鎖が解離す る温度にまで加熱し、その後徐々に冷却する方法等が挙げられる。会合した二本鎖 ポリヌクレオチドは、必要に応じてそれ自体公知の通常用いられる方法により精製さ れる。精製方法としては、例えばァガロースゲル等を用いて確認し、任意に残存する 本鎖ポリヌクレオチドを適当な酵素により分解する等して除去する方法を用いることが できる。また、自己相補正を有する 1本鎖ポリヌクレオチドとして、逆方向反復配列を 有するものを調製する場合には、該ポリヌクレオチドをィ匕学合成等の方法で作製した 後に上記と同様の方法で自己相補性を有する配列を会合させることにより調製する (二本鎖ポリヌクレオチドの細胞、組織、ある 、は個体への導入、および標的遺伝子 の発現阻害）
このようにして調製した二本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的 遺伝子がその細胞内で RNAに転写、またはタンパク質に翻訳され得るものであれば 如何なるものであってもよい。具体的には、本発明で用いる被導入体は、細胞、組織 、あるいは個体を意味する。本発明に用いられる細胞としては、生殖系列細胞、体性 細胞、分化全能細胞、多分化能細胞、分割細胞、非分割細胞、実質組織細胞、上 皮細胞、不滅化細胞、または形質転換細胞等何れのものであってもよい。具体的に は、例えば、幹細胞のような未分化細胞、器官または組織由来の細胞あるいはその 分化細胞等が挙げられる。組織としては、単一細胞胚ま たは構成性細胞、または多 重細胞胚、胎児組織等を含む。また、上記分ィ匕細胞としては、例えば、脂肪細胞、繊 維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リ ンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、 ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌線または 外分泌腺の細胞等が挙げられる。このような細胞の具体例としては、 CHO— KI細胞 (RIKEN Cell bank)、ショウジヨウバエ S2細胞（Schneider, I. , et al. , J. Em bryol. Exp. Morph. , 27, 353— 365 (1972) )、ヒト HeLa細胞（ATCC : CCL— 2)、あるいはヒト HEK293細胞（ATCC : CRL— 1573)等が好ましく用いられる。さら に、本発明で被導入体として用いられる個体として、具体的には、植物、動物、原生 動物、ウィルス、細菌、または真菌種に属するもの等が挙げられる。植物は単子葉植 物、双子葉植物または裸子植物であってよぐ動物は、脊椎動物または無脊椎動物 であってよい。本発明の被導入体として好ましい微生物は、農業で、または工業によ つて使用されるものであり、そして植物または動物に対して病原性のものである。真 菌には、カビおよび酵母形態両方での生物体が含まれる。脊椎動物の例には、魚類 、ゥシ、ャギ、ブタ、ヒッジ、ハムスター、マウス、ラット、サルおよびヒトを含む哺乳動物 が含まれ、無脊椎動物には、線虫類および他の虫類、キイ口ショウジヨウバエ（Droso phila)、および他の昆虫が含まれる。上記培養細胞として、具体的には、例えば、 C HO—KI細胞（RIKEN Cell bank)、ショウジヨウバエ S2細胞（Schneider, I. , et al. , J. Embryol. Exp. Morph. , 27, 353— 365 (1972) )、ヒト HeLa細胞（AT CC： CCL- 2)、ある!/ヽはヒト HEK293細胞（ATCC： CRL— 1573)等が好ましく用 いられる。
[0240] 被導入体への二本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、被導入体が細胞、ある ヽ は組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクト口ポレーシヨン法、リポフエクシ ヨン法、ウィルス感染、二本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等 が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクト口 ポレーシヨン法、あるいはウイスル感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には 、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が 用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、（皮下、筋肉内および静脈内 投与を含む)非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に 導入する方法、あるいはエレクト口ポレーシヨン法またはウィルス感染等が用いられる 。経口導入のための方法には、二本鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合する ことができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等と して投与することや、二本鎖ポリヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより 行うことちでさる。
[0241] 導入する二本鎖ポリヌクレオチドの量は、導入体や、標的遺伝子によって適宜選択 することができるが、細胞あたり少なくとも 1コピー導入されるに充分量を導入するこ とが好ましい。具体的には、例えば、被導入体がヒト培養細胞で、カルシウムホスフエ ート法により二本鎖ポリヌクレオチドを導入する場合、 0. 1〜： LOOOnMが好ましい。
[0242] ここで、二本鎖ポリヌクレオチドは、 2種類以上のものを同時に導入することもできる 。この場合、該ポリヌクレオチドの導入を受けた細胞、組織、あるいは個体（以下これ を「導入体」と称することがある）においては、 2種類以上の標的遺伝子の発現阻害が 期待される。本発明において、標的遺伝子の発現阻害とは、その発現を完全に阻害 することだけでなぐ mRNA、もしくはタンパク質の発現量として 20%以上の阻害を 意味する。標的遺伝子の発現阻害度は、標的遺伝子の RNAの蓄積、または標的遺 伝子によってコードされるタンパク質の産出量を、二本鎖ポリヌクレオチドの導入体と 非導入体において比較することにより測定することができる。 mRNA量は、それ自体 既知の通常用いられる方法により測定することができる。具体的には、例えば、ノー ザンハイブリダィゼーシヨン、定量的リバーストランスフエレース PCR、あるいは In s itu hybridization等を用いて行うことができる。また、タンパク質の産生量は、標的 遺伝子がコードするタンパク質を抗原とする抗体によるウェスタンブロッテイング法や 、標的遺伝子がコードするタンパク質が有する酵素活性を測定すること等により測定 することができる。
[0243] (RNAi技術におけるポリヌクレオチドの導入）
(RNAi技術を用いた体内の遺伝子の発現阻害による遺伝子機能解析方法） 本発明の二本鎖ポリヌクレオチドによる導入体内の遺伝子の発現阻害の結果、該 導入体に現れる表現型の変化を解析することにより導入した二本鎖ポリヌクレオチド が標的とする遺伝子の機能を同定することができる。
[0244] ここで、標的遺伝子はその機能が既知であっても、被導入体内での機能が未知の ものであってもよい。該標的遺伝子に対応する二本鎖ポリヌクレオチドは上記上記の とおり調製され、被導入体に同様にして導入する。導入体でその変化を解析すべき 表現型は特に制限はされないが、例えば導入体の形態、導入体内物質量、導入体 が分泌する物質量、導入体内物質の動態、導入体間接着、導入体の運動、あるいは 導入体の寿命等の生命体行動が挙げられる。標的遺伝子の機能が、他の被導入体 にお 、て既知の場合には、その機能に連関する表現型にっ 、て解析することが好ま しい。表現型の変化を解析する手段としては、導入体の形態の変化を解析する場合 には、顕微鏡、あるいは肉眼的に検出する方法を用いることができる。また、導入体 内の物質として、例えば mRNAの場合には、その量の解析方法として、ノーザンハイ ブリダィゼーシヨン、定量的リバーストランスフエレース PCR、あるいは In situ hybri dization等が挙げられる。タンパク質の場合には、その量の解析方法として、標的遺 伝子がコードするタンパク質を抗原とする抗体によるウェスタンブロッテイング法や、 標的遺伝子がコードするタンパク質が有する酵素活性を測定する方法等が挙げられ る。このようにして解析した、導入体にのみ現れる表現型の変化は、標的遺伝子の発 現阻害の結果生じているものであるので、これを標的遺伝子の機能として同定するこ とがでさる。
[0245] (二本鎖ポリヌクレオチドを用いた標的遺伝子発現阻害により細胞、組織、あるいは 個体に特定の性質を付与する方法）
本発明の二本鎖ポリヌクレオチドを用いた標的遺伝子の発現阻害により、細胞、組 織、あるいは個体に特定の性質を付与することができる。特定の性質とは、標的遺伝 子の発現阻害の結果、該導入体に現れるものをさす。ここでの標的遺伝子としては、 その発現の阻害が導入体に与える性質がすでに判明しているものでもよいし、機能、 もしくは導入体内での機能が未知のものでもよい。機能が未知の標的遺伝子につい ては、これに対する二本鎖ポリヌクレオチドを導入した後に、該導入体が示す表現型 のうち所望のものを選択することにより、該導入体に所望の性質を付与することができ る。
[0246] 被導入体に付与するべき所望の性質として、具体的には、例えば、細胞内生産機 能、細胞外分泌を阻害する機能、細胞や DNAに対する障害の修復機能、特定の疾 患に対する耐性機能等が挙げられる。具体的には、被導入体が植物個体等の場合 、標的遺伝子としては、果実熟成に関連する酵素、植物構造タンパク質、若しくは病 原性に関連する遺伝子等が挙げられる。標的遺伝子の発現阻害が、特定の疾患に 対する耐性機能を有する場合としては、特定のタンパク質の発現の上昇が特定の疾 患の原因となる場合で、標的遺伝子は、上記タンパク質をコードする遺伝子や、上記 タンパク質の発現を制御する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子等が挙げら れる。具体的例としては、標的遺伝子ががん化 Z腫瘍ィ匕表現型の保持に必要である 遺伝子であり、被導入体ががん性細胞、または腫瘍組織等である。
[0247] このような標的遺伝子に対する二本鎖ポリヌクレオチドは、標的遺伝子がコードする タンパク質の発現を阻害することから、標的遺伝子が関連する疾患の治療または予 防薬として用いることができる。二本鎖ポリヌクレオチドを上記薬剤の有効成分として 用いる場合には、該ポリヌクレオチドを単独で用いることも可能であるが、薬学的に許 容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成 分の担体に対する割合は、 1〜90重量％の間で変動され得る。また、力かる薬剤は 種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、 顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソ ーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症 状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
[0248] このような遺伝子を標的とする二本鎖ポリヌクレオチドが導入された導入体は、その 遺伝子発現阻害に付随すると予測される表現型によって選択される。また、導入する 二本鎖ヌクレオチドにおいて、特定の遺伝標識、例えば蛍光タンパク質等をコードす る配列を連結しておけば、被導入体に該ニ本鎖ポリヌクレオチドと共に導入した蛍光 タンパク質の発現阻害度に基づいて選択することも可能である。このうち、例えばガ ン抑制に機能する遺伝子を標的遺伝子とした場合、選択されるべき細胞の形質とし ては、増殖能の亢進や、細胞接着能の低下、あるいは運動 (転移)能の亢進等、悪 性腫瘍の形質等が挙げられる。また、生体リズムを調製する遺伝子を標的遺伝子とし た場合、選択されるべき細胞の形質としては、細胞固有の慨日リズムの消失等が挙 げられる。さらには、環境変異原による DNA損傷の修復等に関与する遺伝子を標的 遺伝子とした場合、選択されるべき細胞の形質としては、変異原に対して感受性を示 すこと等が挙げられる。
[0249] 選択された導入体は、それぞれに適したそれ自体既知のクローン化技術により系と して榭立、取得することができる。具体的には、被導入体が細胞である場合には、導 入体は通常の培養細胞における細胞株榭立法である、限界希釈法、薬剤耐性マー カーによる方法等により細胞株として榭立、取得することができる。本発明で取得され た特定の機能を付与された導入体は、有用物質の産生あるいは分泌効率が上昇し た細胞株、細胞あるいは DNA等に対する障害を与える環境要因に対して高感受性 を示す細胞株、疾病に付随する形質を示し、疾病治療のモデルとして使用すること ができる。
[0250] このうち、疾病治療のモデルとなる細胞株の取得方法を、本発明のさらなる具体的 な適用例として説明する。標的遺伝子としては、その発現量の低下、または欠如が疾 病の原因となる遺伝子 が挙げられる。具体的には、小細胞肺がんにおける TSLC1 の分子経路の因子 (TSLC1、 Racl、 Tiamlなど）遺伝子等が挙げられる。 [0251] これらのヒト遺伝子等の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有する DNAと RNA力もなる二本鎖ポリヌクレオチドを、例えばヒト由来の培養細 胞に導入 することにより、ヒト型の疾病モデル細胞を取得することができる。さらにこの特定の性 質を付与された細胞、組織、あるいは個体に被検物質を接触させて、その遺伝子が 関与する疾病の症状、ある 、は形質に変化が現れるか否かを解析することによれば 、上記疾病の治療剤、および Zまたは予防剤のスクリーニングを行うことも可能である
[0252] このようなスクリーニングにより選択された物質を上記薬剤の有効成分として用いる 場合には、該物質を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と 配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する 割合は、 1〜90重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与 することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、ある いはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リボソーム剤、坐薬剤等 による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等に よって適宜選択することができる。
[0253] (指標遺伝子の発現阻害度を指標とした一次選択を用いる方法）
本明細書にぉ 、て上記した RNAi技術は、被導入体に標的遺伝子の少なくとも一 部の塩基配列と実質的に同一の配列を有する DNAと RNA力 なる二本鎖ポリヌク レオチドを導入する方法であるが、本発明の方法では、さらに (a)指標タンパク質をコ ードする DNAを含む発現ベクター、 (b)該指標タンパク質をコードする塩基配列の 少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有する DNAと RNAからなる二 本鎖ポリヌクレオチドを導入し、該指標タンパク質力も発せられる信号量を指標として 導入体を一次スクリーニングすることにより、導入体内での遺伝子の発現阻害がかか つた導入体のみを解析することができ、効率的な解析を行うことができる。
[0254] 本発明のさらに具体的な例として、被導入体を脊椎動物由来の培養細胞とし、指 標タンパク質を蛍光タンパク質とした場合を説明する。脊椎動物由来の培養細胞に 蛍光タンパク質をコードする DNAを含む発現ベクターを導入して培養し、該指標タ ンパク質力 発せられる蛍光量が、特定の強さ以上の細胞を選択する。ここで選択さ れた細胞に、さらに指標タンパク質をコードする DNAの少なくとも一部の塩基配列と 実質的に同一の配列を有する DNAと RNAからなる二本鎖ポリヌクレオチドを導入し て培養して、指標遺伝子の発現の阻害度を、該指標タンパク質力も発せられる蛍光 量の減弱度により解析する。
[0255] このような一次スクリーニングは、いずれも被導入体への二本鎖ポリヌクレオチドの 導入が行われたことや、該導入体内で標的遺伝子の発現阻害が起こって！/ヽることを 確認するものであるので、指標タンパク質は、そのタンパク質量とそれが発する信号 量とが相関するものである必要がある。このようなタンパク質の具体例としては、ルシ フェラーゼタンパク質が挙げられる。
[0256] さらには、標的遺伝子発現の阻害度を測定する場合に、指標タンパク質の発現量 を基準として、標的遺伝子がコードするタンパク質量を算出することもできる。
[0257] (RNAi技術に用いられるキット）
本明細書にぉ 、て記載した RNAi技術実施するためのキットとしては、二本鎖ポリ ヌクレオチド、指標タンパク質をコードする DNAを含むベクター、指標遺伝子の少な くとも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有する DNAと RNAからなる二本鎖 ポリヌクレオチド、酵素、バッファ一等の試薬類、ポリヌクレオチォド導入のための試 薬類等が含まれる。本発明のキットは、これら全ての試薬類等を含む必要はなぐ上 記した本発明の方法に用いられるキットであれば 、かなる試薬類等の組み合わせで あってもよい。
[0258] RNAi技術を用いた場合に、 RNAi効果の発現が弱 ヽ細胞であっても、特に RNAi 効果の高く発現している細胞を一次スクリーニングして、より強いものを利用すればよ い。
[0259] 上述のような例示の DNAと RNAからなるポリヌクレオチド、具体的には DNA鎖と R NA鎖からなるハイブリッドポリヌクレオチド、または DNA— RNAキメラポリヌクレオチ ドを用いることによって導入するポリヌクレオチドの物質としての安定性を高め、製造 費用を低減することが可能である。このことから、 RNAi技術を用いて、導入するポリ ヌクレオチド自体を、がん治療を目的とした製剤として開発することができる。また、 D NAは RNAと比較して蛍光標識、ピオチン標識、アミン化、リン酸化、チオール化等 の修飾をより多種にわたり容易に行うことができる。従って、医薬品あるいは試薬とし て使用する場合に、このような化学的修飾を行うことによって目的に応じた機能を付 カロすることがでさる。
[0260] (好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本 発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に 限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参 酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
[0261] 1つの局面において、本発明は、がんの診断方法を提供する。ここで、この方法は、
A)被験体における TSLC1の発現の増加または糖鎖の変化を観察する工程であつ て、正常個体と比較して増大した該発現または変化した糖鎖の存在は、該被験体に おけるがんの発現を示す、工程を包含する。
[0262] 別の局面において、本発明は、がんの診断方法であって、被験体における Racの 活性ィ匕を観察する工程であって、正常個体と比較したときの発現の増加または活性 の増加は、該被験体におけるがんの発現を示す、工程、
を包含する、方法を提供する。
[0263] 本明細書において、正常個体とは、がんを有しておらず、その素因も有していない 個体をいう。可能であれば、当該分野において広く認められた標準の個体またはそ の平均集団をさす。
[0264] 本明細書にぉ 、て、正常個体と比較して「増大した発現または変化した糖鎖」は、 上記正常個体における数値と比較して変化が認められる、発現または糖鎖に関する 任意の数値をいう。このような数値の変化は、統計学的に有意であることが好ましい 力 変化が観察される限りこれに限定されない。
[0265] 本明細書におけるこの診断方法において、増大した発現または変化した糖鎖は、 当該分野において公知の任意の手法を用いて検出することができる。そのような手 法としては、本明細書において上記において詳述されたもののほ力、他の手法を挙 げることができ、例えば、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、ドットブロット、 PCR、 R T—PCR、 ELISAなどを挙げることができる。 [0266] 本発明のがんの診断方法では、がんは、小細胞肺がん、一部の大腸がん、一部の 肝臓がん、一部の卵巣がん、一部の骨肉種、一部の軟部組織肉腫等であり得る。こ れらのがんは、白血病とは違い、診断について、白血病の知見からは予測不可能で ある。
[0267] 1つの実施形態では、本発明にお 、て実施される TSLC1の過剰発現または糖鎖 の変化は、 TSLC1分子の直接の観察の他、および TSLC1の分子経路の他の分子 (例えば、 TSLC1、 Tiaml、 Raclおよび低分子量 Gタンパク質 Racl、プロテイン 4. 1B,プロテイン 4. 1N、 MPP3、プロテイン Pals 2、プロテイン CASKを含み得る。 )の変化によって観察され得る。本発明では、がんにおいて TSLC1が予想外に過剰 発現および糖鎖の変化をしていることを見出し、 Raclが予想外に活性ィ匕していること を見出したことから、 Raclの活性ィ匕ががんの指標であることをみいだすしたことから、 これらの分子の動向を検査することによってがんの診断を行うことができることを見出 した。
[0268] 1つの実施形態では、本発明において対象となる TSLC1は、配列番号 1に示す核 酸配列またはその改変体によってコードされる力、配列番号 2に示すアミノ酸配列ま たはその改変配列を有していてもよい。ここで、 TSLC1の改変体とは、本明細書に おいて定義され、例示される任意の改変体の形態であってもよいが、特に言及する 場合は、生体内に天然に存在するものであることが好ましい。本発明の診断におい て、観察の対象となるのは生体であることから、生体が有し得る任意の改変体が本発 明における TSLC1の範囲に入ることが理解される。
[0269] 1つの実施形態では、本発明にお 、て対象となる Raclは、配列番号 5に示す核酸 配列またはその改変体によってコードされる力、配列番号 6に示すアミノ酸配列また はその改変配列を有していてもよい。ここで、 Raclの改変体とは、本明細書におい て定義され、例示される任意の改変体の形態であってもよいが、特に言及する場合 は、生体内に天然に存在するものであることが好ま 、。
[0270] 具体的な実施形態では、本発明の診断方法において、 TLSC1 (特に、 8A+8Bス プライシング変異体）の発現の増加は、 mRNAまたはタンパク質レベルで生じたもの であることが好ましい。この場合、詳細には発現の増加は、 mRNAレベル力 正常値 より多い範囲であり、統計学的に有意な変化であればより好ましぐさらに通常もっと も鋭敏にとって 2倍、妥当なレベルで 2倍、ベストな範囲は 3倍以上になることである。 あるいは、発現の増加は、タンパク質レベルが正常値より多い範囲であり、統計学的 に有意な変化であればより好ましぐさらに通常もっとも鋭敏にとって 2倍、妥当なレべ ルで 2倍、ベストな範囲も 3倍以上になることである。本発明において糖鎖の変化が 診断対象となる場合、糖鎖の変化は、タンパク質の糖鎖パターンが正常パターンとは 異なることである。そのような糖鎖パターンとしては、以下を挙げることができる： N— 型糖鎖修飾のがんにおける増加と、それに伴うがんでの TSLC1タンパク質の分子量 の増大、 O型糖鎖修飾のがんにおける増加と、それに伴うがんでの TSLC1タンパク 質の分子量の増大、がん特異的糖鎖に対する単クローン性抗体への反応。上記のよ うな場合において、本発明では、がんと診断され得る。
[0271] 別の具体的な実施形態では、本発明の診断方法において、 Raclの発現の増加は 、 mRNAまたはタンパク質レベルで生じたものであることが好ましい。この場合、詳細 には発現の増加は、 mRNAレベル力 正常値より多い範囲であり、統計学的に有意 な変化であればより好ましぐさらに通常もっとも鋭敏にとって 2倍、妥当なレベルで 3 倍、ベストな範囲も 4倍以上になることである。あるいは、発現の増加は、タンパク質レ ベルが正常値より多い範囲であり、統計学的に有意な変化であればより好ましぐさら に通常もっとも鋭敏にとって 2倍、妥当なレベルで 3倍、ベストな範囲も 4倍以上にな ることである。あるいは Raclの活性ィ匕は、遺伝子産物の活性ィ匕であることが好ましい 。そのような活性は、 p21活性ィ匕キナーゼの Rac結合ドメインと結合可能な Racタンパ ク質の細胞内全 Racタンパク質に占める割合により測定することができる。このような 場合、がんと診断され得るのは、活性の増加が、 p21活性ィ匕キナーゼの Rac結合ドメ インと結合可能な Racタンパク質の、細胞内全 Racタンパク質に占める割合として測 定することができる Raclタンパク質の活性レベルが正常値より多い範囲であり、統計 学的に有意な変化であればより好ましぐさらに通常もっとも鋭敏にとって 2倍、妥当 なレベルで 3倍、ベストな範囲も 4倍以上になる場合である。上記のような場合におい て、本発明では、がんと診断され得る。
[0272] 本明細書において、好ましい実施形態では、発現の増加は、 8A+8B型スプライシ ング変異体の発現の増加を含む。理論に束縛されることを所望しないが、 TSLC1遺 伝子のうち、 8A+Bスプライシング変異体の発現増力!]が、がん (特に、小細胞肺がん )と密接に関連していることが見出された力 である。 TSLC1遺伝子には、 8A+8B スプライシング変異体のほ力、 8A、 8 (—）などの変異体があるが、特にこの 8A+8B スプライシング変異体を観察することによって効率的な診断を行うことができる。 8A+ 8B型スプライシング変異体は、（配列情報別添致します） により同定される。
[0273] 本明細書において、 1つの実施形態では、糖鎖の変化は、 O—型修飾糖鎖におい て糖鎖修飾が行われて 、るがこれに限定されな 、。
[0274] 本明細書において、 1つの実施形態では、糖鎖の変化は、 N—型修飾糖鎖におい て糖鎖修飾が行われて 、るがこれに限定されな 、。
[0275] 本明細書において、 1つの実施形態では、糖鎖の変化は、 O—型修飾糖鎖および 型修飾糖鎖にぉ 、て糖鎖修飾が行われて 、るがこれに限定されな!、。
[0276] 本明細書において、 TSLC1、 Raclなどを観察するために、これらの分子に特異的 に結合する因子 (すなわち、特異的因子)を用いることができる。使用される因子は、 本発明において説明される任意の因子が使用されることが理解される。
[0277] 1つの実施形態では、上記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低 分子およびそれらの複合分子であってもよい。このような特異的因子は、標識されま たは標識され得る。
[0278] 本明細書にぉ 、て「標識」とは、目的となる分子または物質を他力も識別するため の存在 (たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法として は、 RI (ラジオアイソトープ)法、蛍光法、ピオチン法、化学発光法等を挙げることがで きる。上記の核酸断片および相補性を示すオリゴヌクレオチドを何れも蛍光法によつ て標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を 行う。蛍光発光極大波長の差は、 lOnm以上であることが好ましい。蛍光物質として は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができる力 シァニン 色素（例えば、 CyDye™シリーズの Cy3、 Cy5等）、ローダミン 6G試薬、 N—ァセトキ シ—N—ァセチルァミノフルオレン (AAF)、 AAIF (AAFのヨウ素誘導体）等を使用
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することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が lOnm以上である蛍光物質としては、 例えば、 Cy5とローダミン 6G試薬との組み合わせ、 Cy3とフルォレセインとの組み合 わせ、ローダミン 6G試薬とフルォレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本 発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目 的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知で あり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施する ことができる。
[0279] ここで、より具体的には、使用され得る因子は、 TSLC1、 Raclなどをコードする核 酸配列の相補配列を少なくとも一部含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの プライマーまたはプローブあるいはその改変体あるいは、特異的な抗体であり得る。 そのようなプライマーまたはプローブの具体的な設計方法は、本明細書において別 の場所において詳述されたとおりであり得る。プライマーによる増幅の検出は、予測さ れる産物のサイズを確認することによって行うことができる。プローブによる検出は、 対象のサイズまたは標識を利用することによって行うことができる。このような抗体は、 本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる 。ここで、本発明において使用される抗体は、配列番号 6に示す配列のポリペプチド のみを検出する能力を必要とするのではない。むしろ、何らかの方法で、配列番号 6 に示す配列のポリペプチドを検出することができ、擬陽性が減じられるかぎり、どのよ うな特異性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いら れる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよぐモノクローナル抗体であってもよい。
[0280] 別の具体的な実施形態では、含有され得る因子は、 TSLC1、 Raclなどに対する 抗体であり得る。
[0281] 本明細書にぉ 、て「発現」は、直接標識抗体、一次抗体 (例えば、ピオチン化抗体) および二次抗体を用いた際の蛍光強度 (FI)で示すことができる。このような表示は、 絶対レベルまたは相対レベルで表すことができる。
[0282] mRNAレベルの発現強度は、 RT—PCRまたはマイクロアレイを用いて解析するこ とができる。 RT— PCRを用いた場合は、相対的にデンシトメーターを用いて定量ィ匕 することができ、より詳細に数値ィ匕する場合は、マイクロアレイにおいてハウスキービ ング遺伝子である HRPTに対してそれより少な 、発現は陰性、同等を弱陽性および それより強い (統計学的に強い）レベルを強陽性であらわすことができる。
[0283] 本明細書において発現などの「レベル」とは、目的の細胞などにおいて、ポリべプチ ドまたは mRNAが発現されるレベルをいう。そのような発現レベルとしては、本発明 の抗体を用いて ELISA法、 RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染 色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリ ペプチドのタンパク質レベルでの発現レベル、またはノーザンブロット法、ドットブロッ ト法、 PCR法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価され る本発明のポリペプチドの mRNAレベルでの発現レベルが挙げられる。「発現レべ ルの変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意 の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたは mR NAレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。発現レベルは、絶対 レベルまたは相対レベルで評価され得る。
[0284] 好ましい実施形態では、本発明の診断対象は、小細胞肺がん、一部の大腸がん、 一部の肝臓がん、一部の卵巣がん、一部の骨肉種、一部の軟部組織肉腫を含む。
[0285] 具体的な実施形態では、本発明の特異的因子は、配列番号 1または配列番号に 示す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズする配列を 有する核酸分子である。
[0286] 別の実施形態では、本発明の特異的因子は、配列番号 2または配列番号 6に示す 配列のポリペプチドに対する抗体である。
[0287] 他の実施形態では、本発明の検出は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の 核酸分子の全部または一部を増幅するように設計されたプライマーを含む試薬を用 いて行われ得る。
[0288] 他の実施形態では、本発明の検出は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の 核酸分子の全部または一部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含む 試薬を用いて行われ得る。
[0289] 他の実施形態では、本発明の検出は、配列番号 2または配列番号 6に示す配列の ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む試薬を用いて行われ得る。
[0290] 他の実施形態では、本発明の検出は、活性ィ匕型 Raclを特異的に認識する抗体を 含む試薬を用いて行われ得る。
[0291] 1つの好ましい実施形態では、本発明は、がんの診断方法であって、 TSLC1の分 子経路の因子のレベルを測定する工程を包含する、方法を提供する。ここで、対象と なる TSLC1の分子経路の因子は、 TSLC1、 Tiamlおよび Raclであってもよい。こ こで、因子のレベルは、その因子に対する特異的因子によって測定され得る。ここで 、特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの 複合分子であってもよい。ここで、この特異的因子は、標識されまたは標識され得る。 例えば、そのように標識がされている場合、本発明の因子によって測定することがで きる種々の状態を直接および Zまたは容易に測定することができる。そのような標識 は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよぐ例えば、蛍光、リン光、化学 発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれら に限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用す る場合、ピオチン ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を 用いてもよい。
[0292] 別の局面において、本発明は、がんの診断薬であって、 TSLC1または Raclのレ ベルを測定する手段を備える、診断薬を提供する。
[0293] 本明細書において、上記手段は、 TSLC1の分子経路の因子（例えば、 TSLC1、
Raclなど)を観察するための、これらの分子に特異的に結合する因子 (すなわち、特 異的因子)であり得る。使用される因子は、本発明において説明される任意の因子が 使用されることが理解される。
[0294] 1つの実施形態では、本発明の上記手段は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖
、有機低分子およびそれらの複合分子であってもよい。このような特異的因子は、標 識されまたは標識され得る。
[0295] 1つの実施形態では、本発明の上記手段は、 TSLC1の発現または糖鎖修飾を同 定する手段 (例えば、プローブ、プライマー、抗体など）または Raclの活性ィ匕を同定 する手段 (例えば、活性ィ匕型 Raclを特異的に認識する抗体)を含む試薬であり得る
[0296] 他の実施形態では、本発明の上記手段は、細胞または血清にぉ 、て TSLC1また は Racl遺伝子の転写産物または Raclタンパク質の有無を検出する手段であり得る
[0297] 具体的な実施形態では、本発明の上記手段は、配列番号 1または配列番号 5に示 す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズする配列を有 する核酸分子であであり得る。あるいは、本発明の上記手段は、配列番号 2または配 列番号 6に示す配列のポリペプチドに対する抗体であり得る。
[0298] 他の実施形態では、本発明の上記手段は、配列番号 1または配列番号 5に示す配 列の核酸分子の全部または一部を増幅するように設計されたプライマーを含む試薬 であり得る。
[0299] 他の実施形態では、本発明の上記手段は、配列番号 1または配列番号 5に示す配 列の核酸分子の全部または一部に相補的な配列となるように設計されたプローブを 含む試薬であり得る。
[0300] 他の実施形態では、本発明の上記手段は、配列番号 2または配列番号 6に示す配 列のポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む試薬であり得る。
[0301] 好ましい実施形態では、本発明の診断薬の診断対象は、小細胞肺がん、一部の大 腸がん、一部の肝臓がん、一部の卵巣がん、一部の骨肉種、一部の軟部組織肉腫 を含む。
[0302] 別の局面において、本発明は、がんの診断薬をスクリーニングする方法であって、 該方法は： A)正常被験体とがん患者とにおける TSLC1または Raclのレベルの相 違を観察し、相違が見出される正常被験体とがん患者とを選択する工程;および B) 選択された正常被験体とがん患者とにおいて TSLC1または Raclのレベルと相関す る因子を同定する工程を包含する、方法を提供する。
[0303] ここで、このスクリーニング方法における、 TSLC1または Raclのレベルの同定は、 本明細書にぉ 、て別の場所にぉ 、て説明されて 、る任意の手法を用いて行うことが できることが理解される。ここで、 TSLC1または Raclのレベルには、遺伝子発現 (m RNA,タンパク質レベルなど）のレベルの他、翻訳後修飾のレベル（例えば、糖鎖修 飾の違 、）などを挙げることが理解される。
[0304] 本発明のスクリーニング方法にぉ 、て、選択された正常被験体とがん患者とにお!/ヽ て TSLC1または Raclのレベルと相関する因子を同定することは、当該分野におい て公知の任意の手法を用いて行うことができる。相関解析には、統計学的手法 (たと えば、回帰分析など)を用いることができる。
[0305] 別の局面において、本発明は、本発明のスクリーニング方法で同定されたがんの診 断薬を提供する。
[0306] 他の局面において、本発明は、がんの診断薬をスクリーニングするシステムであつ て、該システムは： A)正常被験体とがん患者とにおける TSLC1または Raclのレべ ルの相違を観察し、相違が見出される正常被験体とがん患者とを選択する手段;およ び B)選択された正常被験体とがん患者とにお 、て TSLC1または Raclのレベルと 相関する因子を同定する手段をとをそなえる、システムを提供する。
[0307] 本発明のスクリーニングシステムにおいて、選択された正常被験体とがん患者とに おいて TSLC1または Raclのレベルと相関する因子を同定する手段は、当該分野に おいて公知の任意の手法であり得る。相関解析には、統計学的手法 (たとえば、回帰 分析など)を用いることができる。
[0308] あるいは、別の局面において、本発明は、がんの処置または予防のための因子をス クリーニングする方法を提供する。この方法は、 A)候補物質を提供する工程、 B)該 候補物質を TSLC 1の分子経路のアツセィ系に供する工程； C)該候補物質の内、 T SLC1の分子経路を調節する因子を同定し、該調節する因子を、がんの処置または 予防のための因子であると決定する工程
を包含し得る。ここで、対象となるがんは、小細胞肺がんであり得る。 1つの実施形態 では、小細胞肺がんでは、 TSLC1の分子経路の因子は、 TSLC1、 Tiamlおよび R aclであってもよい。
[0309] 1つの実施形態では、本発明において使用される候補物質は、どのような物質であ つてもよいが、例えば、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれ らの複合分子であり得る。ここで、 TSLC1の分子経路を調節する因子の同定は、そ の分子経路中の因子の活性ィ匕または不活化、あるいは、発現量の増減、リン酸化量 の増減、分子量の増減などを観察することによって行うことができる。ここでは、例え ば、 TSLC 1の分子経路の因子の優性欠失改変体を用いてもよい。 [0310] 他の好ましい局面において、本発明は、がんの処置または予防ための因子をスクリ 一ユングする方法を提供する。この方法は、 A)候補物質を提供する工程、 B)該候補 物質を TSLC 1の分子経路のアツセィ系に供する工程； C)該候補物質の内、 TSLC 1の分子経路を調節する因子を同定し、該調節する因子を、がんの処置または予防 のための因子であると決定する工程; D)さらに、該調節因子の候補を、がんの処置ま たは予防のためのアツセィ系に供する工程; E)該調節因子の候補の内、がんの処置 または予防のための因子を選択する工程を包含し得る。
[0311] 別の局面において、本発明は、 TSLC 1の分子経路の因子の優性欠失改変体を提 供する。ここで、本発明の改変体は、ゲノム、細胞、組織、臓器または個体の全部ま たは一部であってもよい。好ましくは、個体であり得、この場合は、がんの処置または 予防ためのモデル動物として薬物のスクリーニングに使用することができる。
[0312] 別の局面では、本発明は、本発明のスクリーニング方法によって、同定されたがん の処置または予防ための因子を提供する。この調節分子は、核酸分子、ポリペプチド 、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子であってもよぐこのような分子は 、周知のコンビナトリアルケミストリー技術を用いて製造することができる。
[0313] (使用）
別の局面において、本発明は、 TSLC 1の分子経路を調節する因子の、がんの診 断のための組成物の製造における、使用を提供する。ここで、対象となるがんは、小 細胞肺がんであり得る。 1つの実施形態では、小細胞肺がんでは、 TSLC1の分子経 路の因子は、 TSLC1、 Tiamlおよび Raclであってもよい。他の好ましい実施形態 では、本明細書において上記組成物、方法、システムにおいて説明されるのと同様 の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。
[0314] 他の局面において、本発明は、 TSLC 1の分子経路を調節する因子の、がんの処 置または予防のための組成物の製造における、使用を提供する。ここで、対象となる がんは、小細胞肺がんであり得る。 1つの実施形態では、小細胞肺がんでは、 TSLC 1の分子経路の因子は、 TSLC1、 Tiamlおよび Raclであってもよい。他の好ましい 実施形態では、本明細書において上記組成物、方法、システムにおいて説明される のと同様の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。 [0315] 本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、そ の全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援 用される。
[0316] 以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以 下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は 、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従つ て、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限 定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
実施例
[0317] 以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限 定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬などは、例外を除き、 Sigma (St. Louis, USA)、和光純薬（大阪、 日本）、などから市販されるものを用い た。動物実験は、施設のガイドラインと政府が示す基準に則って行った。ヒト患者に対 する処置においては、厚生労働省などにおいて規定される規準を遵守して行い、必 要に応じて、インフォームド 'コンセントを行った後の患者に対して行う。
[0318] (実施例 1 :TSLC1の過剰発現は、小細胞肺がんの指標である）
本実施例では、小細胞肺がんにおける TSLC1の過剰発現を確認し、 TSLC1の過 剰発現は、小細胞肺がんの指標と成り得ることを確認した。
[0319] (免疫組織染色）
ヒト TSLC1タンパク質に対するポリクローン性抗体 CC2は、 TSLC1タンパク質の力 ルボキシル末端の 18アミノ酸からなるポリペプチドを KLH (キーホールリンペットへモ シニアン)と融合したタンパク質を抗原とし、ゥサギを免疫して得た抗血清から、抗原 の親和性カラムにより精製して作製した。ヒト小細胞肺がん組織をホルマリンで固定し 、 ノラフィンで包埋し、 5 m厚さの連続切片として切り出した。この切片を脱パラフィ ン、脱水した後、 ImM EDTA溶液中で 120°C、 5分間加熱した。非特異的反応は 、切片を 5% 正常ロバ血清を含む TBS (Tris— NaCl, pH7. 5 ;終濃度 25mM Tris、 150mM NaCl)溶液に浸すことで阻止した。これらの切片を抗 TSLC1抗体 CC2を含む溶液（ 1 %NDS (normal donkey serum；正常ロバ血清）を含む TBS 溶液で 2, 000 : 1に希釈した溶液）に浸し、 4°Cで一晩反応させた。次に、切片を標 識したポリマー、並びにわさび由来ペルォキシダーゼとともに室温で 1時間反応させ 、 TBS溶液で緩徐に洗い、 3, 3'ージァミノベントジンで覆って、 3分間反応させた。 この切片を光学顕微鏡により観察した。
[0320] (抗体）
KLHと融合した TSLC 1のカルボキシル末端の 18アミノ酸の合成ポリペプチド N— INAEGGQNNSEEKKEYFI— C (配列番号 10)を、免疫原として使用して、ゥサ ギ抗 TSLC1ポリクローナル抗体である、 CC2を惹起した。 TSLC1 (CC2)の C末端 または TSLC1のェクトドメイン (EC)に対するゥサギポリクローナル抗体 (pAb) は、 周知の手段により調製され得る。
[0321] ゥサギ抗血球凝集素（HA) pAb (sc— 805)およびマウス抗 HAモノクローナル抗体
(mAb)クローン 12CA5を、それぞれ、 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cr uz, CA)および Roche Applied Science (Indianapolis, IN)から購入した。 β— カテニンに対するマウス mAbである、 E—カドヘリン（クローン 36)、およびフイブロネ クチンを、 BD Biosciencesから取得した。使用した他のマウス mAbは、 ZO— 1 (Zy med, South San Francisco, CA)およびビメンチン（クローン V9, Sigma, St.
Louis, MO)に対して特異的である。免疫プロッティングおよび免疫蛍光染色のた めの二次饥体は、それ" 1rれ、 Amer sham Pharmacia Biotech (Buckinghamsh ire, England)および Jackson Immuno Research Lab (West Grove, PA) から得た。
[0322] (ノーザン.プロット解析）
ポリ（A)RNAは、 Invitrogen社の FastTrack2. 0のような市販のキットを用いて、 培養細胞力も抽出した。正常肺、並びに正常脳由来のポリ（A)RNAは、 Clontech 社から購入した。 1 μ gのポリ（A)RNAを 1%ァガロース 'ホルムアルデヒド 'ゲルによ る電気泳動により分離し、 Amersham社のハイボンド N+にトランスファーした。 TSL C1の検出には、 TSLC1 cDNAを含むプラスミドを铸型とし PCRにより増幅して得 た 961塩基対の断片 (TSLClcDNAの翻訳開始コドンの第 1塩基力も数えて 411— 1, 371塩基までに相当する断片の相補的塩基配列)をプローブとして用い、これを [ 32P]dCTPを用いて Amersham Bioscince 社のマルチプライム DNA ラベリン グシステムを用いて放射線標識した。
[0323] (逆転写酵素反応 ·ポリメラーゼ反応： RT-PCR)
全細胞 RNAは Qiagen社の RNeasy Mini Kitにて抽出した。 1 gの全細胞 RN Aを铸型として、 RNase阻害剤の存在下に Invitrogen社の SuperScriptnなどの酵 素により逆転写酵素反応を行った。その反応液の一部を铸型として、 TAKARA社 の ExTaq DNAポリメラーゼなどの DNAポリメラーゼを用いて PCRを行い、 TSLC lcDNAのェクソン 7— 9の領域を増幅した。 PCRのプライマーとしては、 5，一 GTG ATGGTAACTTGGGTGAGAGTC - 3 ' (配列番号 11) ; 5，一 CCAGAATGA TGAGCAAGCACAG - 3 ' (配列番号 12)を用い、前者の 5，末端をテキサスレッド で標識した。得られた断片をポリアクリルアミドゲル電気電子泳動にて分離し、蛍光 標識を検出した。
[0324] (結果）
図 1に小細胞肺がんにおける TSLC1の過剰発現を示す。図 1Aには. TSLC1 特異抗体を用いた免疫組織染色が示される。小細胞肺がんにおける TSLC1タンパ ク質の過剰発現が認められる。図 1Bには、 TSLC1のノーザン'プロット解析が示され る。小細胞肺がんで TSLC 1の過剰発現が高頻度に認められる。
[0325] (実施例 2 :小細胞肺がんでは、 TSLC1の変異体が発現され、糖鎖修飾が異なる。
)
本実施例では、小細胞肺がんでは、 TSLC1の変異体が発現され、糖鎖修飾が異 なることを実証する。
[0326] (スプライシングバリアントの検出）
がん細胞力も抽出した全細胞 RNAを铸型とし、オリゴ dTプライマーを用いて Supe r Script 2等の逆転写酵素反応により cDNAを作成する。次にこれを铸型として T SLC1遺伝子ェクソン 7, 9に相当する以下のプライマーを用いて、 Taq DNAポリメ ラーゼにより PCRを行う。この際、 F—プライマーの 5，末端を蛍光色素テキサスレッド で標識する。
F—プライマー： 5， - GTG ATGGTAACTTGGGTGAGAGTC - 3 ' (配列番号 1 1)
R—プライマー： 5， - CCAGAATGATGAGCAAGCACAG - 3 ' (配列番号 12) 増幅産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により自動塩基配列決定機を用いて 分離し、蛍光色素を検出、定量する。コントロールとして、 PCRにより合成した塩基配 列既知のスプライシングバリアントに相当する DNA断片を電気泳動した。
[0327] (N—糖鎖修飾の検出）
N—型糖鎖付加を阻害するためには、細胞培養液を 5 gZmlのツユ力マイシンを 含む新鮮な培養液に交換して 2日間培養した後、細胞を溶解し、 TSLC1— GFPを 検出するために抗 GFP抗体を加えて反応させた。一方、 N—型オリゴサッカライドを 分解するためには、細胞溶解物を抗 GFP抗体で免疫沈降し、沈降物を溶解液で 3 回洗い、 150mMクェン酸ナトリウム（pH5. 5)、 0. 6%SDS、 1. 5% j8—メルカプト タノールを含む溶液の中で 5分間煮沸した。続いて溶解したサンプルに 1. 5単位の N—グリコシダーゼ F (Roche Diagnostics)をカ卩え、 37°Cでー晚反応させた。最後 にこのサンプルを、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、 GFPを付カロ した TSLC1タンパク質を免疫プロット法にて検出した。
[0328] (O—糖鎖修飾の検出）
O—型糖鎖付加を分解するためには、細胞を溶解して 17, 000 X Gで 20分間遠心 分離し、上清を、 0—glycosydase (Roche Applied Science)をカ卩えたリン酸緩 衝液 (PH7. 2) (最終濃度 9. 6mM、Nonidet P— 40 (最終濃度 1%)を含む） に加 え、 37°Cで 24時間反応させた。最後にこのサンプルを、 SDS—ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動にて分離し、 GFPを付カ卩した TSLC1タンパク質を免疫プロット法にて検 出した。
[0329] (結果）
図 2に小細胞肺がんで高発現する TSLC1は特異的なスプライシング 'バリアントで あることを示す結果を示す。図 3に TSLC1タンパク質の糖鎖修飾を実証する結果を 示す。図 2.小細胞肺がんで高発現する TSLC1は特異的なスプライシング 'バリアン トである。 A. TSLC1遺伝子の臓器、病態特異的なスプライシングと O—型糖鎖修飾 の違いを示す結果である。 B.小細胞肺がんで認められるスプライシング 'バリアント を示す結果である。 B.小細胞肺がんで特異的に認められる 8A+ 8Bスプライシング 'バリアント (赤字)。青字は正常肺をはじめ大部分の上皮組織で発現する 8A型転写 物である。 図 3. TSLC1タンパク質の糖鎖修飾。 A. TSLC1タンパク質のウェスタン .ブロット解析を示す。 TSLC1タンパク質の分子量は、小細胞肺がん、 ATL細胞、 上皮でそれぞれ異なる。 B. N—型糖鎖、 O—型糖鎖特異的な消化により、小細胞肺 がんの TSLC1タンパク質は分子量が減少する。
[0330] (実施例 3 :診断薬としての効果確認実験）
TSLC1または Raclの特異的因子を用いて小細胞肺がんの診断に用いることがで きるかを確認する。
小細胞肺がんに特異的な TSLC 1スプライス 'バリアントの RT— PCR法を用いた検 出により、小細胞肺がんを診断することが可能である。 TSLC1スプライス 'バリアント 8 A+ 8Bは培養小細胞肺がんに特異的に発現するが、正常肺組織や非小細胞肺が ん、その他の組織には、精巣、脳 (ごく少量)を除いて認められない。そこで、喀痰や 末梢血液中に混在する小細胞肺がん細胞をこの方法で検出するモデル系を作成し た。すなわち、小細胞肺がん細胞を正常リンパ球細胞で段階的に希釈した後、全細 胞 RNAを抽出し、逆転写酵素反応を行った後、スプライス 'バリアント 8A+ 8Bに特 異的なプライマーを用いて PCR反応を行 ヽ、増幅産物をァガロースゲル電気泳動を 用いて分離した。この結果、 10_7まで希釈した場合でも、特異的スプライス 'バリアン トを検出することができた。この結果は、喀痰や抹消血に微量混在する小細胞肺がん 細胞を検出することが可能であることを示す。抹消血中に小細胞肺がん細胞が相当 量混入することは、がんの極く初期に考えにくいが、喀痰中への混入は初期からでも 想定され、診断に応用することが可能と考えられる。
[0331] (全細胞 RNAの抽出）
正常肺由来全細胞 RNAは Clontech社より購入した。培養細胞力らの全細胞 RN Aの抽出は、 Clontech社などの市販のキットを用いた。次に全細胞 RNA 1 μ gを 铸型として市販のキットを用いた逆転写酵素反応により、 cDNAを作成した。 TSLC1 8A + 8Bスプライス'バリアントの検出は、 Advantage Klen TaqDNAポリメラーゼ を用いた PCRにより行った。プライマーとしては、たとえば以下の塩基配列をもつオリ ゴヌクレオチドを用 、る： 5， 一 GTGATGGTAACTTGGGTGAGAGTC一 3，（酉己 列番号 11) ; 5 ' CCAGAATGATGAGCAAGCACAG— 3，（配列番号 12)。増 幅断片を 4%ァガロースゲル電気泳動により分離し、増幅産物をェチジゥム 'ブロミド を加えた後、紫外線照射により検出した。レーンの最左端に泳動した分子量マーカ 一により、増幅産物を確認した。
[0332] (実施例 4 : TSLC1の過剰発現により、がん細胞は浸潤形質を示す。 )
(TSLC1発現誘導がん細胞の榭立）
Tet— Offコントロールを有する細胞株を構築し、イーグル最小必須培地（Sigma, St. Louis, MO)中で維持した。この最小培地には、 0. ImM非必須アミノ酸（Invit rogen, Carlsbad, CA)ゝ 1. OmMピルビン酸ナトリウム（Invitrogen)、 10% Tet system approved FBS (BD Biosciences)、 100単位/ mlペニシリン、および 1 00 μ gZmlストレプトマイシン（Invitrogen)力 添カ卩されていた。その関連遺伝子の 発現を抑制するために、 100 /z gZmlのドキシサイクリン（Dox)を、この培地に添カロ した。
[0333] (がん細胞のインビトロ増殖アツセィ：細胞増殖アツセィ）
製造業者のプロトコールに従って、 Cell Titer 96 Aqueous Non— Radioacti ve Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI)を使用する MTS アツセィによって、細胞増殖を調べた。
[0334] (がん細胞の運動性のインビトロアツセィ：細胞運動性アツセィ）
運動性を、マイクロポアチャンバアツセィによって決定した。細胞 (4 X 105)を、 8 μ mポアを有する 6ゥエルサイズのマイクロポアポリカーボネートメンブレンフィルタ（Bee ton Dickinson Lab ware, Lincoln Park, NJ)の頂部チャンバに播いた。そして 、その底部チャンバは、化学誘引物質として 2%のゥシ胎仔血清を含む、 RPMI164 0および Ham' s F12の混合培地で満たした。 37°Cのインキュベーションの 16時間 後に、そのメンブレンを固定して、そして、 Diff Quik試薬（International Reagen ts, Inc, Kobe, Japan)で染色して、そして、そのメンブレンを通過して移動した細胞 の全てを、光学顕微鏡で計数した。各実験は、三連のゥエルで、実施し、 3回反復し [0335] (がん細胞の浸潤性インビトロアツセィ：細胞浸潤性アツセィ）
その浸潤能力を、浸潤チャンバアツセィによって決定した。細胞（3 X 104)を、 8 μ mポアを有する 14ゥエルサイズの Matrigel被覆マイクロポアメンブレンフィルタ（Bee ton Dickinson Labware)の底部チャンバに播き、そして、その底部チャンバを、 化学誘引物質として 2%のゥシ胎仔血清を含む、 RPMI1640および Ham' s F12 の混合培地で満たした。 37°Cのインキュベーションの 22時間後に、そのメンブレンを 固定して、そして、 Diff Quik試薬 (International Reagents, Inc, Kobe, Japan )で染色した。次いで、そのメンブレンを介して浸潤した細胞の全てを、光学顕微鏡の もとで計数した。実験の各々は、三連で実行し、そして、 3回反復した。
[0336] (SCID マウスを用いた転移抑制アツセィ）
(動物）
雄性 SCDマウス（6〜8週齢）を、 CLEA (Tokyo, Japan)力 得て、そして、この研 究を通して、特定の病原体を含まない条件下で維持した。
[0337] (試薬）
FBSを、 M. A. Biopoducts ( Walker sville, MD)から購入した。抗ァシァロ GM1 血清を、 Wako (Osaka, Japan)から取得した。
[0338] (試験的転移実験）
TM - β 1 Ab ( lmg/0. 3ml PBSZマウス）また抗ァシァロ GM1血清（20 1 /0. 3ml PBSZマウス）を、腫瘍接種の 2日前に SCIDの側尾静脈に注入した。腫 瘍細胞を、 Ca2+および Mg2+を含まない PBSで洗浄して、そして、所望の細胞濃度 でそれと同じ溶液中に懸濁した。トリパンブルー排除法によって決定される細胞の生 存率は、 90%を超えるものであった。体積にして 0. 3mlの腫瘍細胞懸濁液を、麻酔 をかけていない側尾静脈に注入した。示した期間の後に、そのマウスを屠殺し、そし て、転移性のリンパ節の数を、計数した。それらの肝臓および腎臓における小瘤を、 解剖顕微鏡を用いて計数した。
[0339] 結果を図 4に示す。図 4は、 TSLC1によるがん細胞の浸潤性形質の誘導を示す。
TSLC1発現の欠如したがん細胞を NIH3T3単層細胞上へ重層培養し、ドキシサイ クリンにより TSLC 1の発現を誘導した。 TSLC 1は抗 TSLC 1抗体と二次抗体 (青)で 、ァクチン分子はファロィジン (赤)で染色した。示されるように、 TSLC1の過剰発現 により、がん細胞は浸潤形質を示した。
[0340] (実施例 5 :TSLC1タンパク質は細胞内で Tiamlタンパク質と結合する。 （上皮組 織、がん細胞および成人 T細胞白血病細胞 (ATL)で)）
(免疫沈降、免疫プロット法：免疫沈降ウェスタンプロティング）
トランスフエクシヨンの 24時間、 60mmディッシュ中の細胞を洗浄し、そして、氷上で 10分間に亘つて、 500 1の溶解溶液（50mM Tris— HC1、 pH7 . 5、 150mM NaCl、 5mM EDTA、 1% Triton— X 100、 ImM NaFゝ ImM Na VO、プ
3 5 口テアーゼインヒビターカクテル（Calbiochem, San Diego, CA) )で処理した。上 清を、 4°Cでの 15分間に亘る遠心分離を行った後に単離し、そして、そのタンパク質 含量、タンパク質アツセィ試薬（Bio— Rad Labolatories, Hercules, CA)を使用 して決定した。次いで、 1 IX gの抗体を、 500 gの細胞溶解物に添加して、 4°Cにて ー晚にでインキュベートした。 30 1の、プロテイン A—セファロース 6MBの 50%懸 濁液 (Amersham Biosciences)を、添加して、そして、室温で、 1時間に亘つてィ ンキュペートした。インキュベーション後に、ビーズを、 5回、 500 1の溶解緩衝液で 洗浄し、そして、 NuP AGEサンプル緩衝液中に再懸濁した。サンプルを、 4〜12% NuPAGEminigels (Invitrogen)上で電気泳動して、そして、 XCell SureLock Mini -Cell Apparatus (Invitrogen)を使用して、ポリビ-レンジスルフイド（PVD F)メンブレン（Millipore, Bedford, MA)に移した。 30分間に亘つて、 l%Tween 20および 5%スキムミルクを含む TBSでブロッキングした後に、これらのフィルターを 、 1時間に亘つて一次抗体とともにインキュベートし、洗浄し、そして、適切な HRP標 識二次抗体 (Amersham Pharmacia)とともにインキュベートした。特異的なタンパ ク質を、増強化学発光システム（Lumi— LightPLUS； Roche)を用いて検出した
[0341] (抗体）
KLHと融合した TSLC 1のカルボキシル末端の 18アミノ酸の合成ポリペプチド N— INAEGGQNNSEEKKEYFI— C (配列番号 10)を、免疫原として使用して、ゥサ ギ抗 TSLC1ポリクローナル抗体である、 CC2を惹起した。 TSLC1 (CC2)の C末端 または TSLC1のェクトドメイン (EC)に対するゥサギポリクローナル抗体 (pAb)は、周 知の手段により調製され得る。
[0342] ゥサギ抗血球凝集素（HA) pAb (sc 805)およびマウス抗 HAモノクローナル抗 体（mAb)クローン 12CA5を、それぞれ、 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)および Roche Applied Science (Indianapolis, IN)から購入した。 β—カテニンに対するマウス mAbである、 E—カドヘリン（クローン 36)、およびフイブ ロネクチンを、 BD Biosciencesから取得した。使用した他のマウス mAbは、 ZO— 1 (Zymed, South San Francisco, CA)およびビメンチン（クローン V9, Sigma, St. Louis, MO)に対して特異的である。免疫プロッティングおよび免疫蛍光染色 のための二次抗体は、それぞれ、 Amersham Pharmacia Biotech (Buckingha mshire, England)および Jackson Immuno Research Lab (West urove, P A)から得た。
[0343] Raclおよび Rhoの活性アツセィのために使用される抗体は、それぞれ、マウス抗 R acl mAbである、クローン 23A8 (Upstate, Lake Placid, NY)、およびゥサギ抗 Rho pAb (Upstate)である（MMZ CR) G
[0344] (プラスミドの細胞への導入：トランスフエクシヨン）
安定に、 TSLC1 -GFP (MDCK/TSLC 1 - GFP)を発現する癌細胞を調製す る為に、 MDCK細胞を、製造業者のプロトコールに従って Lipofectamine Plus試 薬（Invitrogen)を用いて、 pTSLCl— GFPでトランスフエクシヨンした。安定なクロ ーンを、 500mg/mlの Geneticin (G418) (Invitrogen)を含む培地中で選択した 。安定にトランスフエクシヨンされたクローンを、 300mgZmlの G418の存在下で維 持した。癌細胞を、上述のように、 pTSLCl— GFPおよび Zまたは pTSLCl—HA を用いて、一過的にトランスフエタトした。
[0345] (GST結合タンパク質とのインビトロ結合アツセィ： GSTプルダウン）
E. coli中で発現される GST— TSLC1融合タンパク質を、製造者のプロトコルに従 つてグルタチオンセファロース 4B (Amersham Biosciences)を使用して精製した。
[35S]メチォニン標識 MPPs— HAタンパク質を、 TNT T7 Quick Coupled tra nscription/ translation system (Promega, Maaison, WI) 使用し飞合成し た。 GST融合タンパク質に対する放射性標識した MPPの結合は、以前に記載され ている（Yageta et al. , 2002)。結合タンパク質のシグナル強度および GST融合 タンパク質の量を、ソフトウェア NIH Image versio 1. 62を使用して定量化し、 そして、その結合親和性を、 GST融合タンパク質の量に関して調節した。
[0346] (免疫染色、共焦点顕微鏡解析）
それらの 2次元極性実験について、細胞を、 24mm Trans— well— COLコラーゲ ン被覆フィルター不活性体（Costar, Cambridge, MA)にっき 105細胞の密度で播 いた。そして、 5〜6日間に亘つてコンフルエンスになるまで増殖させた。これらの細 胞を、固定し、免疫染色し、そして、上述のように、共焦点顕微鏡によって調べた。核 DNAを染色する際に、 TOTO— 3 iodide (Invitrogen)™ (これ全体で商品名）、 二次抗体を含む溶液に添加した。コラーゲン I型ゲル中のシストの免疫蛍光染色を、 前掲したよう実施した。
[0347] (免疫染色および共焦顕微鏡）
BIOCOATコラーゲン被覆した 8ゥエルの培養スライド（Becton Dickinson Lab ware, Bedford, MA)上に播いて、その 2日後に固定した。極性実験のために、 M DCK/TSLC 1 - GFP細胞または Caco - 2細胞を、 Trans—well - COLコラーゲ ン被覆フィルター不活性体（Costar, Cambridge, MA)にっき 105細胞の密度で播 いて、そして、コンフルエンスになるまで 3〜4日間に亘つて増殖させた。これらの細 胞を、 PBS (pH7. 2)で 2回洗浄して、 PBS中の 4%パラホルムアルデヒドを用いて 2 0分間に亘つて、室温で固定した。
[0348] HEK293細胞または Caco— 2細胞の反射型蛍光顕微鏡検査のために、細胞を、 上述のように播いて、そして、固定した。次いで、固定した細胞を、 5分間に亘つて PB S中の 0. l%Tritonで透過性にして、 PBSで 3回洗浄し、 PBS中の 5%正常ロバ血 清（Chemicon International, Inc. , Temecula, CA)で 30分間に亘つてブロッ クし、そして、室温で一晚に亘つて、 1%正常ロバ血清中に上述の一次抗体で染色し た。 PBSで、 3回洗浄した後に、発蛍光団を結合体ィ匕させた二次抗体を、室温にお いて 1時間に亘つて適用して、 PBSで洗浄した。これらのスライドを、 Vectashield a ntifade reagent (Vactor Laboratories, Burlmgame, CAノ 用 ヽてマウントし て、そして、ガラスカバースリップで覆って、そして、 488/514nmアルゴンレーザー および 543nmヘリウムネオンレーザーを備えた共焦点走査システムである、 Zeiss LSM510または Bio— Rad Radiance 2000で調べた。その X— Z垂直方向切片 を、 0. 2— mmモーターステップで作製した。各イメージは、単一の平均化した（16ラ インスキャン）のイメージの代表例である。
[0349] 結果を図 5〜8に示す。図 5は、 TSLC1タンパク質と Tiamlタンパク質との in vitr oでの結合を示す。 in vitro転写 '翻訳して作成した Tiamlタンパク質、ならびに部 分断片と、大腸菌にて GST融合タンパク質として作成した TSLC1細胞内断片 (GS T—C)ならびにその C端 9アミノ酸を欠失した断片とを GSTカラム上で結合させ、溶 出断片を検出した。右端は合成した Tiamlならびにその部分断片をポリアクリルアミ ドゲル電気泳動にて検出した。
[0350] 図 6および図 7は、 TSLC1タンパク質と Tiamlタンパク質との in vitroでの結合を 示す。培養がん細胞に V5タグ配列をつけた Tiamlタンパク質を導入、発現させ、抗 V5抗体、またはマウス IgG (図 6)、あるいは抗 TSLC1抗体、またはマウス IgG (図 6) で免疫沈降し、沈降物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、抗 TSLC1抗体 (図 6)、ならびに抗 Tiaml抗体（図 7)にて検出した (ウェスタン'プロット法)。対照とし て、細胞溶解物を抗 TSLC1抗体、ならびに抗 V5抗体で検出し（図 6)、あるいは細 胞溶解物と免疫沈降物を抗 V5抗体で検出（図 7)した。
[0351] 図 8は、 TSLC1タンパク質と Tiamlタンパク質との共局在を示す。培養がん細胞で TSLC1タンパク質の発現をドキシサイクリンにて誘導し、 TSLC1タンパク質と Tiaml タンパク質との局在を、それぞれ抗 TSLC1抗体、ならびに抗 Tiaml抗体にて検出し た。右端は両シグナルを合成した画像である。
[0352] 従って、 TSLC1タンパク質は細胞内で Tiamlタンパク質と結合する（上皮組織、が ん細胞および成人 T細胞白血病細胞 (ATL)で)ことが示された。
[0353] (実施例 6 :TSLC1タンパク質は低分子量 Gタンパク質 Raclを活性ィ匕する。） （測 定法）
(発現ベクターおよびトランスフエクシヨン）
PTRE2/TSLC1を得るために、 TSLC1 cDNAを、 pTRE2hygroベクター（BD Biosciences)にクローユングした。短縮化した TSLC1フラグメントを、テンプレート として pTSLCl— HAまたは pcTSLClを使用して、 PCRによって作製して、 pTREh ygroベクターにクローユングした。 TSLC1 ( Δ C—HA)の細胞質性ティルを欠く変 異体を作製するために、 397〜422に位置するアミノ酸 (aa)残基を取り除き、そして 、 396の残基を、 HAェピトープタグと融合させた。この短縮化変異体である、プロテ イン 4. 1 BMおよびプロテイン PDZ— BMを、それぞれ、タンパク質である 4. 1 B Mを含む 11アミノ酸（400〜410)、ならびに PDZ— BM (439〜422)を含む 4ァミノ 酸を取り除くように設計した。これらの構築物を、製造者のプロトコルに従って、 Fuge ne 6 reagent (Roche Applied Science)で、上述の細胞に卜ランスフエク卜した 。安定なクローンを、 300 /z gZmlのハイグロマイシン（Invitrogen)を含む培地中で 選択した。
[0354] (コラーゲンゲル中での 3次元培養および管腔構造形成 (Tubulogenesis)アツセィ )
3次元（3D)培養を、製造者（Nitta Gelatin, Osaka, Japan)のプロトコールに従 つて実施した。細胞を、コラーゲン I混合物に添加して、穏かに混合し、そして、 5 X 1 03細胞 Zゥエルで 12ゥエルプレートにプレーティングした。 5日齢シストを、一般的な シスト構造および TSLC1の細胞内局在ならびに欠失変異体にっ 、て調べた。管腔 形成の誘導のために、 4日齢のシストを、 40ngZmlの HGF (Sigma)を含む新鮮な 培地で刺激して、さらに 4日間に亘つてインキュベートし、そして、位相差顕微鏡によ つて調べた。
[0355] (細胞分散アツセィ）
細胞を、 6ゥエルプレート中に 1 X 104細胞 Zゥエルで播いた。次の日に、それらの 細胞に、 40ng/ml HGFの存在下または非存在下の、新鮮な培地を供給して、そ して、さらに 17時間に亘つてインキュベートした。細胞分散を、位相差顕微鏡で調べ た。
[0356] (Racl活性ィ匕アツセィおよび Rho活性ィ匕アツセィ）
Raclおよび Rhoの活性化を、それぞれ、 Racl活性化アツセィキットおよび Rho活 性化キット（Upstate)を使用して、その製造者のプロトコルに従って、 GST ブルダ ゥンアツセィによって決定した。簡潔には、細胞を、 100mm培養プレートあたり 1 X 1 05細胞で播き、血清飢餓状態にして一晩置いた。次いで、それらの細胞を、種々の 時間期間に亘つて、 40ng/ml HGFで刺激して、そして、 MLB溶解緩衝液中で溶 解した。 1¾。1ー0丁？ぉょび1¾10— 0丁？を、それぞれ、グルタチオンーァガロースビ ーズ上に固定された、ダルタチオン Sトランスフェラーゼ (GST)タグ化 p21活性ィ匕キ ナーゼ（PAR)—Racl結合ドメイン（RBD)および GSTタグ化 Rhotekin—Rho結合 ドメイン (RBD)を用いて、それらの溶解物力も沈降させた。総溶解物および総沈降 物を、免疫ブロッテイングによって分析した。濃度計分析を、 NIHイメージソフトゥェ ァを用いて実施した。
[0357] 結果を図 9に示す。図 9は、 TSLC1は HGFによる MDCK細胞の上皮間葉転換、 遊走性、浸潤性、ならびに Raclの活性ィ匕を抑制することを示す。 GST—プルダウン アツセィは、 Raclの活性ィ匕の抑制を同定する手段として使用され得る。
[0358] (実施例 7 : TSLC1タンパク質による低分子量 G タンパク質 Rac l の活性化は Tiamlタンパク質を介する。 )
実施例 6に準じて、 TSLC 1タンパク質を用いて Raclの活性ィ匕が行われるかどうか を確認することができる。
[0359] (実施例 8 :スクリーニング）
まず、 TSLC1の分子経路の因子を活性ィ匕する可能性のある物質を、レポーター ジーンアツセィを用 、てスクリ一二ングする。
[0360] (レポータージーンアツセィ）
(方法）
リン酸緩衝化生理食塩水（PBS ; 10 mM リン酸塩； 150mM 塩化ナトリウム， pH7. 2 - 7. 3)
ルシフェラーゼレポーターアツセィキット：
溶解溶液： 25mM Tris (7. 5)、 2mM ジチオスレィトール（DTT) , 10%グリセ口 ール、 1 % TritonX— 100 ;ルシフェリンミックス： 20mMトリシン（Tricine) Zl . 07 mM (MgCO ) Mg (OH) — 5H 0/2. 67mMMgSO /0. ImM EDTA/33
3 4 2 2 4
. 3mM DTT/270 μ M コェンザィム（Coenzyme) AZ470 μ Mルシフェリン Z 530 ΜΑΤΡ (-ツボンジーンのピツカジーン（Code No. PGK— L100)を使用す ることができる）。
[0361] (使用する細胞）
小細胞肺がん細胞（初代）、 MDCK2細胞など。
[0362] (培地）
これらの細胞は、適宜 Dulbecco改変 Eagle培地に 10%ゥシ胎仔血清などを用い て培養する。
[0363] (ルシフェラーゼ）
ルシフェラーゼは、蛍光（約 560nm)作る酵素である。細胞内に、アツセィするタン パク質をコードした核酸配列を含むプラスミドとレポータープラスミド (ルシフェラーゼ レポーター）を同時に細胞に強制発現し、レポーター活性を測定する。ルシフェラー ゼ遺伝子産物の発現による蛍光を測定することにより、遺伝子発現を測定することが できる。
[0364] (方法）
(1)上記プラスミドを用いて上記各々の細胞のトランスフエクシヨンを行う。
(2) 48〜72時間、上記細胞を培養する。
(3)培養上清を除去する。
(4)培養に使用されて 、るゥエルまたはディッシュを洗浄する。
(5)細胞の溶解（24穴プレートの場合、溶解溶液 200 μ 1Ζゥエル)。
(6)ライゼートを Eppendorfチューブへうつす。
(7)脱核 (遠心分離 15Krpm、 3分、 4°C)する。
(8)上清を別の Eppendorfチューブへうつす
(9)液体シンチレーシヨンカウンターにサンプルを挿入する。
(10)ルシフェリンミックスにサンプル上清を 0. 5 μ 1加える。
(11)蛍光に起因するカウントを測定する。
[0365] このようにして得られた蛍光から、 TSLC1の分子経路の因子の機能の抑制または 亢進を測定することができる。
[0366] (実施例 9： 2次スクリーニング） 実施例 8にお 、て、がん細胞以外の細胞を用いて (株化細胞または初代培養細胞 ) ,同様の実験を行う。ここで、がん細胞以外の細胞では、 TSLC1の分子経路の因 子の活性化効果がな 、か低 、ものを、好ま U、ヒットとして選択する。
[0367] (実施例 10 :mRNAの発現低下）
次に、別のスクリーニングの系として、小細胞肺がん初代細胞、 3T3— Ll、 3T3- F442または他の初代培養細胞を用いて、候補薬物ライブラリーの（種々の濃度での )存在下または非存在下で、これらの細胞を培養する。
[0368] mRNAの発現は、上記実施例に記載される技術に準じて測定する。
[0369] これにより、 mRNAレベルで、発現量を活性ィ匕させる化合物を測定することができ る。
[0370] (実施例 11 :自動化）
実施例 9〜： L 1などで実施するスクリーニングは、ロボットを用いて自動化することが できる。この場合、例えば、ベックマンコールターの Biomekシリーズを用いて、マイク 口プレートを用いたシステムを構築する力、または Zymarkの Staccato Mini— Sys temシリーズを用いてシステムを構築することができる。
[0371] このようにして得られたリードィ匕合物は、動物実験に用いることができる。あるいは、 このようなリード化合物をもとに、他の化合物を設計することができる。
[0372] (実施例 17 :動物実験）
実施例 13〜 16などで、小細胞肺がん特異的に TSLC 1の分子経路の因子を活性 化する可能性があることが判明したィ匕合物について、マウス、ラットまたはサルなどの 動物に投与してがん組織特異的に TSLC1の分子経路の因子 mRNA発現量または タンパク質量を低下させる化合物をスクリーニングする。
[0373] このようなスクリーニングにより、動物において実際にがんに作用する物質をスクリー ニングすることができる。
[0374] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきた力 本発 明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解され る。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体 的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として 援用されるべきであることが理解される。
産業上の利用可能性
[0375] 本発明によれば、がん（特に、小細胞肺がんおよび関連するがんまたは新生物）の 診断、処置および Zまたは予防、および Zまたは浸潤 '転移の抑制のための技術が 提供される。このような技術は、医療およびその周辺 (製薬メーカー、試薬メーカー） などにおいて産業上の利用可能性がある。
配列表フリーテキスト
[0376] (配列表の説明）
配列番号 1は、 TSLC1をコードする核酸配列（TSLC1 8A+8B型 cDNAの塩基 配列）である。
配列番号 2は、 TSLC1のアミノ酸配列（TSLC1 8A+8Bのアミノ酸配列）である。 配列番号 3は、 Tiamlをコードする核酸配列（TIAM1 cDNAの塩基配列；ァクセッ シヨン番号 NM 003253)である。
配列番号 4は、 Tiamlのアミノ酸配列（ァクセッション番号 NM_003253)である。
配列番号 5は、 Raclをコードする核酸配列（ァクセッション番号 NM_006908)である。 配列番号 7および配列番号 8は、 TSLC1の siRNAの、それぞれセンス配列およびァ ンチセンス配列の例である。
配列番号 9は、 TSLC1の特異的合成オリゴヌクレオチド配列である（TTCGCCAT GCTGTGCTTGCTCA)。
配列番号 10は、 KLHと融合した TSLC 1のカルボキシル末端の 18アミノ酸の合成ポ リペプチド N - INAEGGQNNSEEKKEYFI - C
配列番号 11 :TSLC1 8A+8B スプライス 'バリアントの検出のためのプライマー 5 ' - GTGATGGTAACTTGGGTGAGAGTC - 3 '
配列番号 12 :TSLC1 8A+8B スプライス 'バリアントの検出のためのプライマー 5 ' - CCAGAATGATGAGCAAGCACAG - 3 '

Claims

請求の範囲
[I] がんの診断方法であって、
A)被験体における TSLC1の発現の増加または糖鎖の変化を観察する工程であ つて、正常個体と比較して増大した該発現または変化した糖鎖の存在は、該被験体 におけるがんの発現を示す、工程、
を包含する、方法。
[2] 前記発現の増加は、 mRNAまたはタンパク質レベルで生じることを特徴とする、請求 項 1に記載の診断方法。
[3] 前記発現の増加は、 mRNAレベル力 正常値の 2倍以上になることである、請求項 1 に記載の方法。
[4] 前記発現の増加は、タンパク質レベル力 正常値の 2倍以上になることである、請求 項 1に記載の方法。
[5] 前記糖鎖の変化は、タンパク質の糖鎖パターンが正常パターンとは異なることであり 、 O—型または N—型の糖鎖修飾の増加が認められることである、請求項 1に記載の 方法。
[6] 前記発現の増加は、 8A+8B型スプライシング変異体の発現の増加を含む、請求項 1に記載の方法。
[7] 前記 8A+8B型スプライシング変異体は、配列番号 1 (塩基配列)または配列番号 2 ( アミノ酸配列）により同定される、請求項 6に記載の方法。
[8] 前記がんは、小細胞肺がんを含む、請求項 1に記載の方法。
[9] がんの診断方法であって、
A)被験体における Racの活性ィ匕を観察する工程であって、正常個体と比較したと きの発現の増加または活性の増加は、該被験体におけるがんの発現を示す、工程、 を包含する、方法。
[10] 前記発現の増加は、 mRNAまたはタンパク質レベルで生じることを特徴とする、請求 項 9に記載の診断方法。
[II] 前記発現の増加は、 mRNAレベル力 正常値の 2倍以上になることである、請求項 9 に記載の方法。
[12] 前記発現の増加は、タンパク質レベルが正常値の 2倍以上になることである、請求項 9に記載の方法。
[13] 前記活性の増加は、 p21活性ィ匕キナーゼの Rac結合ドメインと結合可能な Racタン パク質の、細胞内全 Racタンパク質に占める割合として測定できる Racタンパク質の 活性レベルが正常値の 2倍以上になることである、請求項 9に記載の方法。
[14] 前記がんは、小細胞肺がんを含む、請求項 9に記載の方法。
[15] 前記レベルは、前記因子の特異的因子によって測定される、請求項 1または 9に記 載の方法。
[16] 前記特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれら の複合分子からなる群より選択される、請求項 15に記載の方法。
[17] 前記特異的因子は、標識されまたは標識され得る、請求項 15に記載の方法。
[18] 前記特異的因子は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の核酸分子に対してス トリンジェントな条件下でハイブリダィズする配列を有する核酸分子である、請求項 15 に記載の方法。
[19] 前記特異的因子は、配列番号 2または配列番号 6に示す配列のポリペプチドに対す る抗体である、請求項 15に記載の方法。
[20] 前記検出は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の核酸分子の全部または一 部を増幅するように設計されたプライマーを含む試薬を用いて行われる、請求項 15 に記載の方法。
[21] 前記検出は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の核酸分子の全部または一 部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含む試薬を用いて行われる、請 求項 15に記載の方法。
[22] 前記検出は、配列番号 2または配列番号 6に示す配列のポリペプチドを特異的に認 識する抗体を含む試薬を用 ヽて行われる、請求項 15に記載の方法。
[23] 前記検出は、活性化型 Rac 1を特異的に認識する抗体を含む試薬を用いて行われる 、請求項 15に記載の方法。
[24] がんの診断薬であって、 TSLC1または Raclのレベルを測定する手段を備える、診 断薬。
[25] 前記診断薬は、小細胞肺がんの診断薬である、請求項 24に記載の診断薬。
[26] 前記手段は、前記 TSLC1の分子経路の因子の特異的因子である、請求項 24に記 載の診断薬。
[27] 前記特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれら の複合分子からなる群より選択される、請求項 24に記載の診断薬。
[28] 前記特異的因子は、標識されまたは標識され得る、請求項 24に記載の診断薬。
[29] 前記特異的因子は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の核酸分子に対してス トリンジ ントな条件下でハイブリダィズする配列を有する核酸分子である、請求項 24 に記載の診断薬。
[30] 前記特異的因子は、配列番号 2または配列番号 6に示す配列のポリペプチドに対す る抗体である、請求項 24に記載の診断薬。
[31] 前記手段は、該 Raclの活性ィ匕を同定する手段である、請求項 24に記載の診断薬。
[32] 前記手段は、細胞または血清において Racl遺伝子の転写産物または Raclタンパ ク質の有無を検出する手段である、請求項 24に記載の診断薬。
[33] 前記手段は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の核酸分子の全部または一 部を増幅するように設計されたプライマーを含む、請求項 24に記載の診断薬。
[34] 前記手段は、配列番号 1または配列番号 5に示す配列の核酸分子の全部または一 部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含む、請求項 24に記載の診断 薬。
[35] 前記手段は、配列番号 2または配列番号 6に示す配列のポリペプチドを特異的に 認識する抗体を含む、請求項 24に記載の診断薬。
[36] 前記手段は、活性化型 Raclを特異的に認識する抗体を含む、請求項 24に記載の 診断薬。
[37] がんの診断薬をスクリーニングする方法であって、該方法は：
A)正常被験体とがん患者とにおける TSLC1または Raclのレベルの相違を観察 し、相違が見出される正常被験体とがん患者とを選択する工程;および
B)選択された正常被験体とがん患者とにお 、て TSLC1または Raclのレベルと 相関する因子を同定する工程 を包含する、方法。
[38] 請求項 37に記載のスクリーニング方法で同定されたがんの診断薬。
[39] がんの診断薬をスクリーニングするシステムであって、該システムは：
A)正常被験体とがん患者とにおける TSLC1または Raclのレベルの相違を観察 し、相違が見出される正常被験体とがん患者とを選択する手段；および
B)選択された正常被験体とがん患者とにお 、て TSLC1または Raclのレベルと 相関する因子を同定する手段とをそなえる、システム。
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