WO2007043630A1 - 上気道粘膜下に投与されるｎｋｔ細胞刺激剤 - Google Patents

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nkt
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Masaru Taniguchi
Shigetoshi Horiguchi
Yoshitaka Okamoto
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Riken
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Definitions

  • N K T cell stimulant administered submucosally in the upper respiratory tract N K T cell stimulant administered submucosally in the upper respiratory tract
  • the present invention relates to an NKT cell stimulating agent or the like administered under the upper airway mucosa. More specifically, the present invention contains an antigen-presenting cell pulsed with an NKT cell ligand and is administered submucosally in the upper respiratory tract, or an NKT cell stimulating agent (or NKT cell in the cervical lymph node) Inducer, interferon ⁇ production inducer, immunostimulant, etc.). ,
  • stage III and stage IV advanced cancers are generally treated in combination with surgery, radiation, and chemotherapy.
  • Surgical treatment especially since the late 1980s, has spread autologous tissue transplantation with free flaps, intestinal tracts, and vascularized bones.
  • the local control procedure has made great progress [Mitaka Okamoto, one treatment and problem for advanced head and neck cancer, otolaryngology 94: 577-585, 2001].
  • stage IV combined use of irradiation and chemotherapy is essential to improve treatment outcomes, but even in stage IV, N2c and N3 cases and carotid artery invasion cases have poor treatment outcomes even with extended resection. IfiJ was below 50% [OKamoto Y, Inugami A, Matsuzaki Z, Yokomizo M, Konno A, Togawa K, Kuribayashi K, Ogawa T, Kanno I, Carotid artery resection for head and neck cancer. Surgery 120: 54-59, 1996].
  • NKT cells are unique cells that express both T cell receptor (TCR) and NK cell receptor (N KR) on the same cell surface.
  • TCR T cell receptor
  • N KR NK cell receptor
  • T cell antigen receptor (TCR) of NKT cells has a very limited c chain (Va 14- Jc 281 in mice, 1 (Va 24-J a Q) in humans and 3 chains (V in mice) 38, V / 37, V] 32, in humans, Vj31 1) force, etc.
  • NKT cells can be specifically activated by presenting CD-ld with a-galactosylceramide, a glycolipid [Kawano T, Cui J, Koezuka Y, Toura I , Kaneko Y, Motoki K, Ueno H, Nakagawa R, Sato H, Kondo E, Koseki H, Taniguchi M, CDld-restric cted and TCR-mediated activation of ValphaH NKT cells by glycosylceratni des, Science 1997 Nov 28,278 (5343): 1626-9, Cui J, Shin T, Kawano T, Sato H, Kondo E, Toura I, Kaneko Y, Koseki H, Kanno M, Taniguchi M, Requireme nt for ValphaH NKT cells in IL-12-mediated rejection of tumors.
  • NKT cells activated by ligand rapidly produce large amounts of IFNy and IL-4 and exert strong cytotoxic activity via perforin / cranzyme B. After that, it has a unique mechanism of action in which various immune responses are induced, resulting in strong antitumor effects. It became clear.
  • DCs Dendritic cells
  • VEGF Vase ular Endothelial Growth Factor
  • tumor antigen-specific immunity is given by pulsing a tumor-specific antigen and then reinjected into a cancer patient, It is expected to be an effective treatment by overcoming the suppression status of DC maturation and activation in vivo.
  • DC therapy is considered to be a relatively safe treatment, but general DC therapy using tumor-specific molecules is expected to be effective only for limited tumors due to its specificity.
  • MHC is restricted by MHC, patients with different MHC and patients' tumor cells have a decrease in the expression of MHC class I molecules. Have.
  • ⁇ -Galactosylceramide pulse-disease-like disease was confirmed by the safety test of “a-Galactsyl Cermide (KRN7000) pulsed cell therapy for patients with recurrent cancer or advanced lung cancer” approved by the Ethics Committee of Chiba University. It was found that cell therapy can be safely performed.
  • a safety study in “A clinical study using activated sputum cells in patients with recurrent lung cancer and advanced lung cancer” found that intravenous administration of activated sputum cells can be safely performed.
  • ⁇ -galactosylceramide pulse dendritic cells have been studied intravenously, mainly in cases of recurrent lung cancer.
  • NKT cell ligands such as a-galactosylceramide
  • NKT cells can be more efficiently produced than when NKT cell ligands are administered directly into the living body. It is possible to stimulate, stimulate immunity, treat diseases such as tumors, but in order to achieve such effects, There is a problem that it is necessary to use the same number of antigen-presenting vesicles, and a large amount of reagent is consumed for the preparation thereof.
  • B Since a large amount of antigen-presenting cells are intravenously injected, it takes time. The physical burden on the patient is also large for reasons such as. Therefore, it is possible to achieve excellent effects such as NKT cell stimulating action, immunostimulating action, and antitumor action while reducing the number of antigen presenting cells
  • dendritic cells are highly selectively transferred to the cervical lymph nodes by administering dendritic cells pulsed with antigen 'into the nasal mucosa.
  • NKT cells were not detected in normal non-metastatic cervical lymph nodes, but it was confirmed that many NKT cells were detected in cervical lymph nodes where head and neck cancer had metastasized (Shigetoshi Horiguchi, Mitaka Okamoto, et al., “Nasal mucosal dendritic cell ⁇ in vivo movement”, Otolaryngology Immune allergy, 2 1 ⁇ , 2, p. 10-11, 2003, Chiba University CO ⁇ report, for pharyngeal cancer
  • NKT cells are actively induced into the lymph node, and the antitumor immunity mediated by NKT cells in the cervical lymph node is activated. Development is desired. ,
  • the present invention stimulates NKT cells efficiently and powerfully and stimulates immunity using the smallest number of antigen-presenting cells in NKT cell therapy and Gund pulse antigen-presenting cell therapy. And it aims at providing the administration method of the antigen presentation cell which can treat diseases, such as cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for selectively inducing NK T cells into cervical lymph nodes and activating anti-tumor immunity via NK T cells in the cervical lymph nodes. Disclosure of the invention
  • NKT cell ligand pulse antigen-presenting cells are not normally present in the cervical lymph nodes by administering to the submucosa of the upper respiratory tract.
  • NKT cells are selectively induced in the cervical lymph nodes.
  • this administration method is used, even in tissues other than cervical lymph nodes (peripheral blood, etc.), NKT cells can be efficiently stimulated by a very small amount of antigen-presenting cells, and the systemic immune response can be stimulated. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention relates to the following.
  • An NKT cell stimulator comprising antigen-presenting cells pulsed with an NKT cell ligand and administered submucosally in the upper respiratory tract.
  • a cervical lymphatic or intranodal sputum cell inducer characterized by containing antigen-presenting cells pulsed with a sputum cell ligand and administered submucosally in the upper respiratory tract.
  • An agent for inducing interferon y production comprising antigen-presenting cells pulsed with a sputum cell ligand, and administered under the upper airway mucosa.
  • An immunostimulant comprising an antigen-presenting cell pulsed with a sputum cell ligand and administered below the upper airway mucosa.
  • a method for stimulating sputum cells comprising administering antigen-presenting cells pulsed with sputum cell ligands to the upper airway mucosa.
  • a method for inducing NKT cells in a cervical lymph node which comprises injecting antigen-presenting cells pulsed with an NKT cell ligand under the upper airway mucosa.
  • a method for inducing interferon ⁇ production comprising administering antigen-presenting cells pulsed with an NKT cell ligand to the upper airway mucosa.
  • a method for stimulating an immune response comprising administering antigen-presenting cells pulsed with a sputum cell ligand under the upper airway mucosa.
  • vaginal cell ligand pulse antigen-presenting cells can stimulate vaginal cells extremely efficiently, stimulate an immune reaction, and treat diseases such as cancer. This greatly saves the reagents used to prepare the antigen-presenting cells and reduces the overall cost of the treatment. In addition, it is possible to drastically reduce the number of mononuclear cells collected from patients for the preparation of antigen-presenting cells, and the time required for administration of antigen-presenting cells is shortened. Is reduced. In addition, the amount of sputum cell ligand required for treatment is greatly reduced, further improving safety in treatment.
  • Figure 1 shows the expression of HLA-DR, CD11c and CD86 on the surface of administered rod cells.
  • the numbers in the gate indicate the percentage of positive cells (%).
  • Figure 2 shows NKT cells (CD 3 + Vc 24 + V j3 1 1 + cells) (upper) and NK cells (C, D 3—CD 56+ cells) (lower) in peripheral blood.
  • the numbers in the gate indicate the percentage of cells in each gate (%).
  • Arrows indicate administration of ⁇ -G a 1 Cer pulsed dendritic cells.
  • Figure 3 shows the changes in the number of NKT cells and NK cells per ml of peripheral blood.
  • Fig. 4 shows the change in the number of cells that produced yinterferone by c-Ga1Cer stimulation contained in the peripheral blood mononuclear cell fraction obtained by the Ellispot method.
  • FIG. 5 shows the expression of HLA-DR, CD11c and CD86 on the surface of administered dendritic cells.
  • the numbers in the gate indicate the percentage of positive cells (%).
  • Figure 6 shows NKT cells (GD 3 + Va 24 + V 1 1 + cells) (upper) and NK cells (CD 3—CD 56+ cells) (lower) in peripheral blood.
  • the numbers in the gate indicate the percentage of the number of cells in each 'gate (%).
  • Arrows indicate administration of ⁇ -G a 1 Cer pulsed dendritic cells.
  • FIG. 7 shows changes in the number of NKT cells and NK cells per ml of peripheral blood.
  • Fig. 8 shows the change in the number of cells that produced ⁇ -interferon by a-Ga1Cer stimulation contained in the peripheral blood mononuclear cell fraction obtained by the 1,000 resp method.
  • FIG. 9 shows the induction of NK T cells into the cervical lymph nodes by submucosal administration of ⁇ -GalCer pulse dendritic cells.
  • FIG. 10 shows the detection results of NKT cells in peripheral blood and lymph nodes.
  • the present invention comprises an antigen-presenting cell pulsed with an NKT cell ligand, and is administered submucosally in the upper respiratory tract (NKT cell stimulant, cervical lymph node NKT cell inducer, Ron ⁇ production inducer or immunostimulatory agent).
  • NKT cell stimulant e.g., IL-12
  • cervical lymph node NKT cell inducer e.g., IL-12
  • Ron ⁇ production inducer e.g., antigen-presenting cell pulsed with an NKT cell ligand, and is administered submucosally in the upper respiratory tract
  • a small number of sputum cell ligands when administered submucosally in the upper respiratory tract Pulse antigen presenting cells can stimulate NKT cells very efficiently, induce interferon ⁇ production, and stimulate immune responses.
  • administration of antigen-presenting cells pulsed with sputum cell ligands below the upper airway mucosa can selectively induce sputum cells in the cervical lymph nodes.
  • Vaginal cells are one of the lymphocytes that express two antigen receptors, the cell receptor (TCR) and the cell receptor. Vaginal cells recognize the NKT cell ligand J below, where the cell receptor on the cell is presented on a CD 1 (eg CD 1 d) molecule.
  • the repertoire of T cell receptors is very limited, for example, the ⁇ chain of the sputum cell receptor on mouse NKT cells (sometimes called V ct 14 NKT cells) is a non-polymorphic V ⁇ 14 and J ⁇ 28 1 gene segments (Proc Natl Acad Sci USA, 83, p.8708-8712, 1986, Proc Natl Acad Sci USA ,, 88, p.7518-7522, 1991, J Exp Med , 180, p.1097-1106, 1994) More than 90% of the j3 chain is V] 3 8 and can also include a limited repertoire of V / 37 and '2. Also on human NKT cells The T cell receptor is known to be a combination of non-polymorphic V ⁇ 24, which is highly homologous to mouse Vct l 4 and V] 3 1 1 closely related to V ⁇ 8.2 Yes.
  • “Spider cell ligand” refers to a compound that, when presented on a CD1 molecule, is specifically recognized by the T cell receptor on NKT cells and can specifically activate NKT cells.
  • Examples of the “NKT cell ligand” used in the present invention include ⁇ -glycosyl ceramide, isoglobulo hexosyl ceramide (Science, 306, p 1786-1789, 2004), OCH (Nature 413 531, 2001) and the like. Can be mentioned.
  • ⁇ -Glycosylceramide is a glycosphingolipid in which saccharides such as galactose and glucose are bound in the ⁇ -coordination, and WO 9 3/0505 5, WO 94/02 1 68, WO 94 090 20, WO 94/24 142, and WO 98/44928, Science, 278, p. 1626-1629, 1997, and the like.
  • (2 S, 3 S, 4 R)-1 -0- (a -D- galactoviranosyl) 1 2-hexacosanoylamino _ 1, 3, 4-octadeca Ntriol (referred to herein as ⁇ _galactosylceramide or a-Ga1Cer) is preferred.
  • NKT cell ligand is used to mean a salt thereof.
  • salts of NKT cell ligands salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal salts) are used, especially physiologically acceptable acids. Addition salts are preferred.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, ⁇ tansulfonic acid, and benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • succinic acid tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, ⁇ tansulfonic acid, and benzenesulfonic acid.
  • NKT cell ligand is used to include its solvate (hydrate, etc.).
  • an antigen-presenting cell refers to a cell that presents an antigen to lymphocytes and promotes lymphocyte activation.
  • antigen-presenting cells are dendritic cells or macrophages that can present antigen to T cells or NKT cells.
  • dendritic cells have a strong antigen-presenting ability, such as MHC Clas I, MHC Clas I-like molecules (CD 1 etc.), MHC Class II etc. expressed on the cell surface. It can be preferably used in the present invention since it can present antigens and activate T cells or NKT cells.
  • the antigen-presenting cell is preferably a CD 1 (eg, CD 1 d) -expressing cell so that the NKT cell ligand can be reliably presented to the NKT cell.
  • the antigen-presenting cell those derived from any mammal can be used.
  • Mammals include humans and mammals other than humans. Mammals excluding humans include, for example, rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, and laboratory animals such as rabbits, domestic animals such as pigs, rabbits, goats, horses, and hidges. And primates such as monkeys, cats, monkeys, orangutans and chimpanzees.
  • the genotype of the antigen-presenting cell contained in the agent of the present invention is not particularly limited, but is usually allogeneic, allogeneic or xenogeneic to the subject to which the agent of the present invention is administered. Are allogenic or allogeneic.
  • the antigen-presenting cell is preferably allogeneic with the subject to which the agent of the present invention is administered, and is derived from the subject to which the agent of the present invention is administered (ie, autologous dendritic cells).
  • Antigen-presenting cells can be isolated from the aforementioned mammalian tissues (for example, lymph nodes, spleen, peripheral blood, etc.) by a method known per se.
  • dendritic cells can be isolated by cell sorter, panning, antibody magnetic field method, etc., using an antibody against a cell surface marker specifically expressed on antigen-presenting cells.
  • cell surface markers that are specifically expressed on dendritic cells include, for example, CD 11 c, MHC C lass I, MHC C lass I-like molecules ( CD 1 etc.), MHC, C 1 ass II, CD 8 a, CD 85 k, CD 86, FD LM 1, DEC—205, etc. can be used.
  • Antigen-presenting cells can also be produced by culturing the above-described mammalian bone marrow cells, mononuclear cells, etc. under appropriate antigen-presenting cell differentiation conditions.
  • bone marrow cells differentiate into dendritic cells (bone marrow-derived dendritic cells: BMDC) by culturing for about 6 minutes in the presence of GM-CSF (in some cases, further IL-4). 408, p.740-745, 2000).
  • dendritic cells can be obtained by culturing mononuclear cells (especially monocytes, macrophages, etc.) in peripheral blood in the presence of GM-CSF (in some cases, IL-2 and / or IL-4). (Literature name.
  • the “pulse of NKT cell ligand to the antigen-presenting cell” refers to arranging the NKT cell ligand on the surface of the antigen-presenting cell so that the ligand can be presented to the NKT cell. More specifically, NKT cell ligand is released on the surface of antigen-presenting cells. It is meant to be presented on the expressed CD 1 molecule. Pulse of NKT cell ligand to the antigen presenting cell can be achieved by contacting the NKT cell ligand with the antigen presenting cell.
  • antigen-presenting cells are cultured in a physiological culture medium containing an NKT cell ligand. In this case, the concentration of the NKT cell ligand in the culture medium can be appropriately set depending on the type of NKT cell ligand.
  • the culture solution examples include basal media (minimum essential medium (MEM), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), which may contain appropriate additives (serum, albumin, buffer, amino acid, etc.), RPMI1640 medium, 199 medium) and the like.
  • the pH of the culture solution is usually about 6-8, the culture temperature is usually about 30-40 ° C, and the culture time is usually between 4-143, preferably 6-14 days.
  • the antigen-presenting cells are washed with a culture solution or physiological aqueous solution not containing NKT cell ligands, and the free NKT cell ligands are removed, so that antigen-presenting cells pulsed with NKT cell ligands can be obtained. Isolated.
  • the agent of the present invention can contain an antigen-presenting cell pulsed with an NKT cell ligand alone as an active ingredient, or as a mixture with any other therapeutic active ingredient.
  • the agent of the present invention is produced by any method well known in the technical field of pharmaceutics by mixing an effective amount of an active ingredient together with one or more pharmacologically acceptable carriers.
  • the -The agent of the present invention is usually provided in dosage forms such as injections and drops.
  • the agent of the present invention is preferably a suspension in which antigen-presenting cells pulsed with NKT cell ligand are suspended in a sterile aqueous carrier that is isotonic with the recipient's body fluid (blood, etc.).
  • the aqueous carrier include physiological saline and PBS.
  • a solubilizing agent, a buffering agent, a tonicity agent, a soothing agent, a preservative, a stabilizing agent and the like can be added as necessary.
  • the concentration of the antigen-presenting cells pulsed with the NKT cell ligand contained in the agent of the present invention is usually about 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 1 () Zm and preferably about 2 ⁇ 10 5 to 1 X
  • the range is 10 9 Zm 1, but is not particularly limited. If the cell concentration is too low, administration takes time, which increases the burden on the patient. If the cell concentration is too high, the cytologist may aggregate.
  • the agent of the present invention is safe and can be administered to any mammal. Examples of mammals include the mammals described above. The mammal is preferably human.
  • the agent of the present invention is characterized by being administered submucosally in the upper respiratory tract.
  • the upper airway mucosa is the mucosa present on the surface of the upper airway (nasal cavity, pharynx, tonsils, larynx; trachea, etc.) from the nasal cavity to the trachea. Since the nasal mucosa is rich in immunocompetent cells and blood vessels, the agent of the present invention is preferably administered under the nasal mucosa.
  • the nasal mucosa consists of upper, middle and lower nasal turbinate mucosa, upper, middle and lower nasal mucosa, nasal septal mucosa, etc., but there are abundant immunocompetent cells and easy administration.
  • the agent of the present invention is more preferably administered submucosally below the mucosa, more preferably submucosal anterior mucosa.
  • “Submucosal administration” refers to the injection of an active ingredient into the submucosal lamina limbal.
  • the dose of the agent of the present invention varies depending on the administration form, patient age, body weight, disease type, disease severity, NKT cell ligand type, etc.
  • the number of antigen-presenting cells pulsed is usually administered at a dose of 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 9 111 2 , preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 9 Zm 2 .
  • these doses vary depending on the various conditions described above.
  • NKT cells can be selectively induced in the cervical lymph nodes. This selectivity is strict and selectively induces NKT cells in the cervical lymph nodes on the same side of the upper airway mucosa to which dendritic cells are administered.
  • NKT cells when antigen-presenting cells pulsed with an NKT cell ligand are administered under the right nasal mucosa, NKT cells are selectively induced in the right cervical lymph node. NKT cells activated by ligands rapidly produce large amounts of interferon ⁇ and IL-4, exert strong cytotoxic activity via perforin / granzyme ⁇ , and then induce various immune responses, As a result, strong antitumor activity It has been reported to have a unique mechanism of action [Morita M, Motoki K, Akimoto ⁇ , Nat on T, Sakai T, Sawa E, Yamaji K, Koezuka Y, Kobayashi E, Fukushima H, Structure- activity relationship of
  • the agent of the present invention can be used for malignant tumors in the head and neck region (nasal / sinus cancer, pharyngeal cancer, oral cancer, laryngeal cancer, thyroid cancer, saliva It can be useful for the prevention and treatment of allergic diseases (such as nasal allergy) in the upper respiratory tract.
  • NKT cells are stimulated very efficiently by a small number of NKT cell ligand pulse antigen-presenting cells, and NKT cell proliferation and site force-in (interferon ⁇ , IL-4) Etc.) production can be induced.
  • Peripheral blood was collected from a head and neck cancer patient meeting the above criteria (approximately 100 ml). Furthermore, mononuclear cells were separated by density gradient centrifugation. Mononuclear cells that are considered to be sufficient for administration are cryopreserved.) 8 OO U ml GM—CSF (GeneTech Co., Ltd), 1 0 0 ⁇ / ⁇ 1 I L-2 (I unas_e Shionogi ) And 5% autologous serum ⁇ : AI in V medium (Invitrogen Corp.) 7-: I cultured for 4 days.
  • a -G a 1 C er pulsed rod cells were suspended in 2.5% albumin-added physiological saline (about 0.2 ml) and transfused into the base mucosa of the patient's lower nasal trunk; ⁇ .
  • Dendritic cells dosage was IxlO 8 pieces / m 2. '
  • a_G a 1 C er pulse dendritic cells were administered submucosally on day 7 and dayl4.
  • Blood was collected weekly for 5 weeks before and after administration, and the increase or decrease in peripheral blood NKT cells was evaluated. The evaluation was performed by flow cytometry using the following antibody.
  • CD 3 + V a 2 4 + V] 3 1 1 + cells were used as NKT cells. The number of NKT cells per ml of peripheral blood was measured and compared over time.
  • CD 3—CD 5 6 + cells were used as NK cells, and the number of NK cells was measured over time as a control.
  • Anti-human CD 3 mouse monoclonal antibody (UCTHl, PharMingen)
  • the expression of HLA-DR, CDllc, and CD86 on the cell surface was analyzed by flow cytometry, and strong expression of each surface antigen was confirmed (Fig. 1).
  • Figure 2 shows NKT cells (upper) and NK cells (lower) in peripheral blood obtained by flow cytometry. Furthermore, changes in the number of NKT cells and NK cells per ml were measured (Fig. 3). A single dose of ⁇ -G a 1 C er pulsed dendritic cells under the nasal mucosa increased the number of peripheral blood NKT cells. On the other hand, the number of peripheral blood NK cells did not change significantly after administration of a_G a 1 C er pulsed dendritic cells.
  • Figure 4 shows the change in the number of cells that produced ⁇ -interferon by a-GalCer stimulation, contained in the peripheral blood mononuclear cell fraction, obtained by the Elispot method.
  • Peripheral blood In response to the administration of ⁇ -Ga 1 Cer pulsed dendritic cells, the number of interferon-producing cells increased in response to the number of KT cells.
  • Case 2 48-year-old female Recurrence of left maxillary cancer (T3N0M0).
  • Figure 6 shows NKT cells (upper) and NK cells (lower) in peripheral blood obtained by the flow cytometry method. Furthermore, changes in the number of NKT cells and NK cells per ml were measured (Fig. 7). A single dose of ⁇ -G a 1 C er pulsed dendritic cells under the nasal mucosa increased the number of peripheral blood NKT cells. On the other hand, the number of peripheral blood NK cells did not change significantly with the administration of HI G a 1 G er pulsed dendritic cells.
  • Figure 8 shows the change in the number of cells that produced ⁇ -interferon by a-Ga1Cer stimulation, contained in the peripheral blood mononuclear cell fraction obtained by the Elispot method.
  • the number of interferon-producing cells increased in response to the number of peripheral blood cells.
  • the number of cells transferred was 5 x lOVm 2 for level 1, 2.5 x 10 8 / m 2 for level 2 , and level 3
  • the test was conducted at 1 x 10 9 / m 2 .
  • an increase in peripheral blood NKT cells was observed in one of the 11 patients participating in the study who had received a level 3 cell count.
  • the quantity of ⁇ - galactosylceramide pulsed dendritic cells at level 1 and level 2 does not provide an immune response that increases sputum cells in peripheral blood.
  • ⁇ -Ga1Cer pulsed dendritic cells prepared in the same manner as in Example 1 were suspended in 2.5% albumin-added saline (approximately 0.2 ml), and the lower nasal turbinates in the left nasal cavity of a head and neck cancer patient. The transfusion was transfused into the basal mucosa. The dose of dendritic cells was lxlO 8 / m 2 . Two days after administration, lymphocytes were collected from the left and right cervical lymph nodes by biopsy, and whether or not NKT cells were contained in the collected lymphocytes by flow cytometry as in Example 1. did. CD 3 + V ⁇ 24 + V] 3 1 1 + cells were used as NKT cells.
  • NKT cells were found in the cervical lymph node on the same side as the site where ⁇ -Ga1Cer pulsed dendritic cells were administered, but NKT was found in the cervical lymph node on the opposite side. The presence of KT cells was not observed (Fig. 9).
  • NKT cells are selectively induced in the cervical lymph nodes by submucosal administration of ⁇ -G a 1 C er pulse dendritic cells.
  • lymphocytes are collected from peripheral blood and non-metastatic cervical lymph nodes of head and neck cancer patients, and whether or not sputum cells are contained in the collected lymphocytes by flow cytometry.
  • CD 3 + Va 24 + V j3 1 1+ cells were designated as ⁇ 1: Ding cells.
  • NKT cell ligand pulse antigen-presenting cells can stimulate NKT cells extremely efficiently, stimulate an immune reaction, and treat diseases such as cancer. This makes it possible to save significant amounts of reagents used to prepare antigen-presenting cells, reducing the overall cost of treatment.
  • the amount of mononuclear cells collected from patients for the preparation of antigen-presenting cells can be greatly reduced, and the time required for administration of antigen-presenting cells can be shortened. Is reduced.
  • the amount of NKT cell ligand required for treatment is greatly reduced, further improving safety in treatment.

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Abstract

本発明は、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする、ＮＫＴ細胞刺激剤を提供する。上気道粘膜下に投与することにより、少ない数のＮＫＴ細胞リガンドパルス抗原提示細胞により、極めて効率的にＮＫＴ細胞を刺激し、免疫反応を刺激することが可能である。また、上気道粘膜下に投与することにより、ＮＫＴ細胞を選択的に頸部リンパ節に誘導することができる。

Description

明細書
上気道粘膜下に投与される N K T細胞刺激剤
技術分野 '
本発明は、 上気道粘膜下に投与される NKT細胞刺激剤等に関する。 より具体 的には、 本発明は NKT細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、 上 気道粘膜下に投与されることを特徴とする、 NKT細胞刺激剤 （又は頸部リンパ 節内 NKT細胞誘導剤、 インターフュロン γ産生誘導剤、 免疫刺激剤等） 等に関 する。 ，
背景技術 '
頭頸部鬲平上皮癌のうち、 III期、 IV期の進行癌に対しては、原則として手術、 放射線、化学療法による三者併用療法が行なわれる。 手術治療は、特に 1980年代 後半以降、 遊離皮弁、 腸管、、 血管柄付骨によ 自家組織移植が普及し、 拡大切除 が比較的容易となり、 機能や形態の保持にも一定の効果が得られ、 局所コント口 ールは大きく前進した [岡本美孝、 進行頭頸部癌の治療一対応と問題点、 耳鼻臨 床 94:577-585,2001]。 ^頸動脈や頭蓋底浸潤癌も絶対切除が可能となった [岡本 美孝、 内頸動脈浸潤癌への挑戦、 耳鼻展 42.232:239, 1999、 Chazono H, Okamoto' Y, Matsuzaki Z， Ogmo J, Endo S, Matsuoka T, Horikoshi T, Nukui H, Hadei shi H, Yasui N, Extra - intracranial bypass for reconstruction of internal carotid artery in the management of head and neck cancer. Ann Vase Surg 17· 260- 265,2003]。 ただ、切除範囲が広がれば、 再建手術による機能や形態の保 持にも限界があり、 患者の Q0Lも低下が目立つ。 また、 IV期では、 照射、 化学療 法併用も治療成績の向上には不可欠であるが、 IV期の中でも N2c, N3症例や、 頸 動脈浸潤症例では、拡大切除によっても治療成績は不良で 5年生存率は 50%を下 IfiJつた [OKamoto Y, Inugami A, Matsuzaki Z, Yokomizo M, Konno A, Togawa K, Kuribayashi K, Ogawa T， Kanno I， Carotid artery resection for head and neck cancer. Surgery 120:54-59, 1996]。 拡大切除を先行し、 その後に照射 .化 学療法を併用した治療では生存率が大幅に向上したが、 逆に喉頭などの機能保存 は困難であった。 、 一方、 国内でも 1985年の白金製剤の導入後、 化学療法の高い効果が期待され、 neo— adjuvantあるレヽ {ま adjuvant療法として用レヽら た [Okamoto Y, Konno A, T ogawa , Κ, Kato Τ, Tamakawa Υ, Amano Υ, Arterial chemoembol ization with ci splatin microcapsules. Br J Cancer 53 : 369-375， 198o、 Tomura N, Kobayashi M,' Watarai J, Okamoto Y, Togawa K， Chemoembol ization of head and neck ca ncer with carboplatin - microcapsules. Acta Radiologics 37 : 52_56， 199り」。 し かし、 欧米でのラ ダム化試験の結果、 neo-adjuvant治療は機能の保全には一定 の効果を示しても、照射単独治療ど比較して生存率の改善には寄与しないこと 1 約 10年前までにほほ、結論付けられてレヽる [Rischin D, Head and neck cancer d ebate : Does induction chemotherapy remain a worthy approach? Am Soc Cl in Oncol ' 300-304， 2003]。 現在、 concurrentの照射 '化学療法が 3者併用療法の 中心治療として注目されているが、 照射単独療法に比較して機 '能保持の可能性が 高いばかりでなく、 生存率の向上にも寄与していることがランダム化試験で報告 されてレヽる [Adelstein DJ, Lavertu P， Saxton JP, Secic M, Wood BG, Wanama ker JR, El iachar I， Strome M， Larto MA, Mature results of a phase I I I ra ndomized trial comparing concurrent chemotherapy with radiation alone in patients with stage I I I and IV squamous cel l carcinoma of the head and neck cancer 88 · 876-883, 2000]。 ただ、 生存率の向上の程度は 0〜8%であり、 5 年生存率も 20〜40%程度であり、 さらに多くの試験では N2c、 N3、 あるいは進行 T4症例を試験対象から除いているものが多い。 また、 salvage手術の成績は不良 である [Forasti ere AA, Goepfert H, Maor M， Pajak T, Weher R， Morri son M, Gl i sson B, Trott i A, Ridge JA, Chao C， Peters G, Lee DJ, Leaf A, Ensky J Cooper J, Concurrent し hemotherapy and radiotherapy for organ preservat i on in advanced laryngeal cancer N Engl J Med 349 : 2091-2098, 2003]。 このように進行頭頸部扁平上皮癌の治療は手術にせよ、 放射線、 化学療法にせ よ大きな問題がある。 その成績の向上、 さらには患者負担の軽減をはかるた に は新たな治療戦略が不可欠である [岡本美孝、頭頸部癌の治療：問題点と今後の展 望、 f葉医学 79 ',1-5, 2003]。 従来の細胞免疫治療は安全性は高いが、 その効果は 非常に限られたものしか得られていなかった。
NKT細胞は同一の細胞表面に T細胞レセプター （TCR) と NK細胞レセプター （N KR) をともに発現しているユニークな細胞であり、 T細胞、 B細胞、 NK細胞とは 区別される第 4のリンパ球と'して最初に報告されている [F9wlkes BJ, Kruisbee k AM, Ton - That H Weston MA, Coligan JE, Schwartz RH, Pardoll DM, A nove 1 population of T - cell receptor alpha beta-bearing thymocytes which pred ominantly expresses a single V beta gene family. Nature 1987 Sep 17-23,3 29(6136) 251-4, Budd RC, Miescher, GC, Howe RC, Lees RK, Br on C， MacDonal d HR, Developmental ly regulated expression of T cell receptor beta chain ' variable domains in immature thymocytes. J Exp Med 1987 Aug 1,166(2) :57 7-82、 Imai K, Kanno M, Kimoto H, Shigemoto K, Yamamoto S, Taniguchi M, S equence and expression of transcripts of the Γ - cell antigen receptor alp ha - chain gene in a functional, antigen - specif IC suppressor - T_cell hybrid oma. Proc Natl Acad Sci U S A 1986 Nov , 83 (22) : 8708-12]。 NKT細胞の T細胞 抗原受容体 （TCR) は、 極めて限定された c鎖 （マウスで Va 14- Jc 281、 ヒ トで (1 V a 24-J a Q) および ]3鎖 （マウスで V ]38、 V /37あるレ、は V ]32、 ヒ トでは Vj31 1) 力、ら構成されており [Dellabona P， Padovan E, Casorati G， Brockhaus M, Lanzavecchia A, An invariant V alpha 24-J alpha Q/V beta 11 T cell recep tor is expressed in ail individuals by clonal丄 y expanded CD4— 8— Γ cells, J Exp Med 1994 Sep 1,180(3) 1171-6, Porcelli S, Gerdes D, Fertig AM, Ba lk SP, Human T cells expressing an invariant V alpha 24-J alpha Q TCR al pha are CD4" and heterogeneous with respect to TCR beta expression, Hum Immunol 1996 Jun-Jul ,48 (1-2) -63-7 Makmo Y， Kanno R， Ito T, Higashmo K, Taniguchi M, Predominant expression of invariant V alpha 14+ TCR alpha chain in Ml. Γ T cell populations. Int Immunol 1995 Jul, 7 (7) : 1157- 61、、 T aniguchi M, Koseki H, Tokuhisa T, Masuda K, ' Sato H, Kondo E, Kawano T, C ui J, Perkes A, , Koyasu S, Makino Y, Essential requirement of an invarian t V alpha 14 T cell antigen receptor expression in the development of na tural killer T cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Oct 1 ,93 (20) · 11025 - 8 Makino Y, Kanno R, Koseki H, Taniguchi M, Development of Valphal4+ NK T cells in the early stages of embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 199 6 Jun 25,93(13) :6516-20]、 認識 ½"る分子も MHCクラス I類似の抗原提示分子で ある CDld分子であることが明らかにされている 「Bendelac A, Lantz 0, Quimby ME, Yewdell JW, Bennink JR, Brutkiewicz RR, CD1 recognition by mouse NK 1+ T lymphocytes, Science 1995 Ma 12， 268 (5212) · 863-5、 Adachi Y, Koseki H, Zijlstra M, Taniguchi M, Positive selection of invariant V alpha 14+ T cells by non-major histocompatibility complex-encoded class I- like mol ecules expressed on bone marrow-derived cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1995 Feb 14， 92 (4) · 1200- 4]。 最近、 糖脂質の 1つである a -ガラク トシルセラミ ドを CDldに提示することによって NKT細胞を特異的に活性化させることが きる ことが示された [Kawano T, Cui J, Koezuka Y， Toura I, Kaneko Y, Motoki K, Ueno H， Nakagawa R， Sato H, Kondo E, Koseki H, Taniguchi M, CDld-restri cted and TCR - mediated activation of ValphaH NKT cells by glycosylceratni des, Science 1997 Nov 28,278(5343)： 1626-9, Cui J, Shin T, Kawano T, Sato H, Kondo E, Toura I, Kaneko Y, Koseki H, Kanno M, Taniguchi M, Requireme nt for ValphaH NKT cells in IL-12-mediated rejection of tumors. Science 1997 Nov 28,278(5343) :1623-6]。 リガンドによって活性化された NKT細胞は、 迅速に大量の IFNyと IL- 4を産生し、 パーフォリン/クランザィム Bを介した強 力な細胞傷害活性を発揮する。 さらにその後、 さまざまな免疫反応が誘起され、 その結果として強い抗腫瘍作用が発揮されるというユニークな作用機構を有する ことが明らかになった。 α—ガラク トシルセラミ ドは、 マウスの各種肝転移モデ ルにおいて ΝΚΤ細胞依存的に顕著な抗寧瘍効果を発揮したことが報告されてレ、、る [Morita M, Motoki K, Akimoto K, Natori T, Sakai T, Sawa E, YamajiK, Koe zuka Y, Kobayashi E, Fukushima H, Structure-activity relationship of alp ha-galactosylceramides against B16 - bearing mice. J Med Chem 1995 Jun 9.3 8(12) :2176 - 87、 Nakagawa R, Motoki K, Ueno H, Iijima R, Nakamura H, Kobay ashi E， Shimosaka A, Koezuka Y, Treatment of hepatic metastasis of the c olon26 adenocarcinoma with an alpha_galactosyiceramide， KRN7000. Cancer Res 1998 Mar 15；58(6)： 1202-7, Kawano T, Cui J, Koezuka Y, Toura I, Kanek o Y, Sato H, Kondo E, Harada M,' Koseki H, Nakayama T, Tanaka Y, Taniguch l M, Natural killer-like nonspecific tumor cell lysis mediated by specif IC ligand - activated ValphaH NKT cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1998 Ma y 12,95(10) :5690- 3]。' また、 α _ガラク トシルセラミ ドは、 マウス ΝΚΤ細胞のみ ならず、 ヒ ト ΝΚΤ細胞も特異的に活性化できることが見出された [Kawano Τ, Na kayama T, Kama da N， Kaneko Y, Harada M, Ogura N, Akutsu Y, Motohashi S, Iizasa T, Endo H, Fuji sawa T, ihinkai H, Taniguchi M, Antitumor cytotoxi city mediated by ligand— activated human V a丄 pha24 NKT cells. Cancer Res 1999 Oct 15,59(20) :5102 - 5]。 これらの結果にもとづき、 固形癌の患者を対象に した α—ガラク トシルセラミ ドの IV投与による第 1相治験がオランダにて実施 されてレヽる [Giaccone G, Punt CJ, Ando Y， Ruijter R, Nishi N, Peters M, v on Blomberg BM， Scheper RJ, van der Vliet HJ, van den Eertwegh AJ, Roelv ink , Bei jnen J, Zwierzina H, Pinedo H , A phase I study of the natural killer T_ce丄丄 ligand alpha-galactosylceramide (KRN7000) in patients wit h solid tumors Clin Cancer Res. 2002 Dec.8 (12) , 3702 - 9]。
樹状細胞 （dendritic cells: DC) は、 T細胞依存性の免疫応答において最も強 力な抗原提示細胞である。 癌患者では、 腫瘍から分泌される IL- 10や VEGF (Vase ular Endothelial Growth Factor)などによって、 DCの成熟、 活性化および動員 が阻害されていると言われている。 しかし、 DCの前駆細胞を体外に取り出して成 熟過程へと誘導して、 さらに腫瘍特異的抗原をパルスして腫瘍抗原特異的免疫能 を与えた後に、癌患者に再輸注するならば、 前記の生体内での DCの成熟、 活性化 の抑制状況を打破して、 有効な治療となることが期待されている。 既に、 悪性リ ンノ、腫、 悪性黒色腫、 多発性骨髄腫、 前立腺癌、 腎細胞癌などに対し DCによる癌 ワクチン療法 （DC療法） の臨床試験が開始されており、 抗原特異的な細胞傷害性 T '細胞（CTL)の誘導や腫瘍縮小効果を認めたという予備的な報告がなされている。 DC療法に伴う副作用としては、 悪寒、 発熱等が報告されている。 世界的には、 副 作用として自己抗体の出現'（抗甲状腺抗体など） や慢性関節リゥマチを発症した という報告はあるが、 他に重篤な副作用、 合併症は,報告されておら "f、 DC療法は 比較的安全な治療法であると考えられる。 しかし、 腫瘍特異的な分子を利用する 一般的な DC療法では、その特異性があるために限られた腫瘍にしか有効性が期待 されず、 また MHCに拘束されるという点で、 異なった MHCの患者や、 患者の腫瘍 細胞において MHCクラス I分子の発現低下がみられる場合には CTLの標的とはな り得ない等の課題を有する。 '
他方、 前述の α—ガラク トシルセラミ ドの抗腫瘍作用機構に基づけば、 ひ 一ガ ラク トシルセラミ ドをパルスされた DCを坦癌マウスに移入することにより抗腫 瘍効果が得られることが予想された。 動物を用いた検討結果より、 悪性腫瘍転移 モデルにおいて α—ガラク トシルセラミ ドを投与する時期を遅らせた場合は、 転 移抑制効果が認められなくなるが、 α—ガラク トシルセラミ ドをパルスされた榭 状細胞 （DC) を担癌マウスに投与すると、 投与時期をある程度遅らせてもほぼ完 全に肺または肝転移が抑制されることが示された [Toura I, Kawano T, Akutsu Y, Nakayama T, Ochiai Ϊ, Taniguchi M, し utt ing edge ' Inhibit ion of experi mental tumor metastasis by dendritic ce l ls pul sea with alpha-galactosylc eramide. J Immunol 1999 Sep 1 , 163 (5) ' 2387-91]。 このことは、生体内で効率良 く NKT細胞を活性化するためには、 α—ガラク トシルセラミ ドを単に投与するよ りも、 DCに提示された形で投与した方が良いことを示唆している。 しかも、本治療法が利用する CDld分子— NKT細胞抗原受容体の系は万人で共通 であるため、 誰の NKT細胞でも α—ガラク トシルセラミ ドによって活性化す φこ とが可能である。 また、 活性化した ΝΚΤ細胞は、 ' MHCクラス I分子の発現とは無 関係 細胞傷害活性を起こすことから、癌特異的べプチドをパルスするような DC 療法の欠点を補完する利点を有すると考えられる。
千葉大学倫理委員会にて承認された 「 癌再発例ならびに進行肺癌患者を対象 にした a -Galactsyl Cermide (KRN7000)パルス細胞を用いた治療法」の安全性試験 により、 α—ガラク トシルセラミ ドパルス榭状細胞療法が安全に施行可能である ことが判明した。 また、 「肺癌再発^例ならびに進行期肺癌症例を対象とした活性 化 ΝΚΤ細胞を用いた臨床研究」 の安全性試験により活性化 ΝΚΤ細胞の静脈投与が 安全に施行可能であることが判明した。 - これまで、 肺癌の再発例を中心に α—ガラク トシルセラミ ドパルス樹状細胞の 静脈投与による検討がなされている。 第 1相試験では移入細胞数をレベル 1 とし て 5 X 107/m2、 レベル 2として 2.5 x 108/tn2、 レベル 3として 1 x 109/m2とエス カレーシヨンして試験が,行われた。 この結果、試験参加症例全 11例のうち、 レべ ル 3の細胞数を投与された一例に末梢血 NKT細胞の増加が観察された [Ishika wa A, Motohashi 5, Ishi awa E, Fuchida H， Higashino K, Otsuji M, 丄 izasa T, Nakayama T, Taniguchi M, Fujisawa T, A phase I study of alpha - galacto sylceramide (KRN7000) -pulsed dendritic cells in patients with advanced a nd recurrent non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2005 Mar 1,11 (5) :1910-7]。 しかしながら、 レベル 1およびレベル 2の α—ガラク トシルセラミ ドパルス樹状細胞の数量では、 末梢血中の NKT細胞数の増加等の免疫応答は得 られていない。
上述の様に、 a—ガラク トシルセラミ ド等の NKT細胞リガンドをパルスされ た抗原提示細胞を投与することにより、 NKT細胞リガンドを直接生体内へ投与 する場合と比較して、 より効率よく NKT細胞を刺激し、 免疫を刺激し、 腫瘍等 の疾患を処置することが可能であるが、 そのような効果を達成するためには、 相 当数の抗原提示^胞を用いる必要が^り、 その調製に大量の試薬を消費し、 |¾ として費用がかさんでしまうという問題があった。 また、 （a ) 抗原提示細胞 調 製するために、 患者から大量の単核球細胞を採取する必要がある、 （b ) 大量 抗 原提示細胞を点滴静注するため、 投^に時間がかかる、 等の理由により、 患者に 対する肉体的負担も大きい。 そこで、 用いる抗原提示細胞の数を減らしつつ 優 れた N K T細胞刺激作用、 免疫刺激作用、 抗腫瘍作用等の効果を達成し得るよう
'な、 抗原提示細胞の投与方法の開発が求められていた。
一方、 本発明者らは、 抗原'をパルスされた樹状細胞を鼻腔粘膜下に投与するこ とにより、 樹状細胞が高選択的に頸部リンパ節に移行することを報告している。 また、 正常非転移頸部リンパ節内には N K T細胞は検出されないが、 頭頸部癌が 転移した頸部リンパ節内には多数の N K T細胞が検出されたことを確認している (堀口茂俊、 岡本美孝ら、 「鼻粘膜樹状細胞 φ生体内移動」、 耳鼻咽喉科免疫ァレ ルギ一、 2 1卷、 2号、 p. 10- 11、 2003、 千葉大学 C O Ε報告書、 咽頭癌に対する
'細胞免疫療法ならびに重粒子治療の導入、 p. 116-118、 2005)。 従って、 頭頸部癌 が頸部リンパ節へ転移す,る前に、 リンパ節内へ N K T細胞を積極的に誘導し、 頸 部リンパ節内における N K T細胞を介した抗腫瘍免疫を活性化させる方法の開発 が望まれる。， ，
上記事情に鑑み、 本発明は、 N K T細胞リ、ガンドパルス抗原提示細胞療法にお いて、 出来るだけ少ない数の抗原提示細胞数を用いて、 効率的且つ強力に、 N K T細胞を刺激し、 免疫を刺激し、 癌等の疾患を処置し得る、 抗原提示細胞の投与 方法を提供することを目的とする。 また、 本発明は、 N K T細胞を選択的に頸部 リンパ節内に誘導し、 頸部リンパ節内における N K T細胞を介した抗腫瘍免疫を 活性化させる方法を提供することを目的とする。 発明の開示
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、 N K T細胞リガンドパルス抗原提示 細胞を上気道粘膜下へ投与することにより、 通常頸部リンパ節内には存在しない NKT細胞が選択的に頸部リンパ節に誘導されることを見出した。 更に該投与方 法を用いれば、 頸部リンパ節以外の組織 （末梢血等） においても、 極めて少量の 抗原提示細胞により、 効率的に NKT細胞が刺激され、 全身的な免疫応答が刺激 され得ることを見出し、 本発明を完成した。
即ち、 本発明は以下に関する。
(1) NKT細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、 上気道粘膜下 に投与されることを特徴とする、 NKT細胞刺激剤。
(2) NKT細胞リガンドが α—ガラク トシルセラミ ドである、 上記 （1) 記載 の剤。 ,
(3) 上気道粘膜が鼻腔粘膜である、 上記 （1) 記載の剤。
(4) ΝΚΤ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、 上気道粘膜下 に投与されることを特徴とする、 頸部リンパ,節内 ΝΚΤ細胞誘導剤。
(5) ΝΚΤ細胞リガンドがひ一ガラク トシルセラミ ドである、 上記 （4) 記載 'の剤。 ' ，'
(6) 上気道粘膜が鼻腔,粘膜である、 上記 （4) 記載の剤。
(7) ΝΚΤ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、 上気道粘膜下 に投与されることを特徴とする、 インターフェロン y産生誘導剤。
(8) NKT細胞リガンドが α—ガラク トシルセラミ ドである、 上記 （7) 記載 の剤。 ， (9) 上気道粘膜が鼻腔粘膜である、 上記 （7) 記載の剤。
(10) ΝΚΤ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、 上気道粘膜 下に投与されることを特徴とする、 免疫刺激剤。
(1 1) ΝΚΤ細胞リガンドが α—ガラク トシルセラミ ドである、 上記 （1 0) 記載の剤。
(1 2) 上気道粘膜が鼻腔粘膜である、 上記 （1 0) 記載の剤。
(1 3) ΝΚΤ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、 上気道粘膜下に投 与することを含む、 ΝΚΤ細胞を刺激する方法。 (14) NKT細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、 上気道粘膜下に投 与することを含む、 頸部リンパ節内に NKT細胞を誘導する方法。 、
(1 5) NKT細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、 上気道粘膜下に投 与することを含む、 インターフェロン γ産生を誘導する方法。
(1 6) ΝΚΤ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、 上気道粘膜下に投 与することを含む、 免疫反応を刺激する方法。
(1 7) 上気道粘膜下に投与される ΝΚΤ細胞刺激剤を製造するための、 ΝΚΤ 細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。 '
(1 8) 上気道粘膜下に投与される頸部リンパ節内 ΝΚΤ細胞誘導剤を製造する ための、 ΝΚΤ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
(1 9) 上気道粘膜下に投与されるインターフェロン γ産生誘導剤を製造する めの、 ΝΚΤ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
(20) 上気道粘膜下に投与される免疫刺激剤を製造するための、 ΝΚΤ細胞リ 'ガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。 '
本発明の剤を用いれば,、 少ない数の ΝΚΤ細胞リガンドパルス抗原提示細胞に より、 極めて効率的に ΝΚΤ細胞を刺激し、 免疫反応を刺激し、 癌等の疾患を治 療し得る。 これにより、 抗原提示細胞の調製に用いる試薬を大幅に節約する,こと が; 能となり、 治療全体のコストが軽減する。 また、 抗原提示細胞の調製のため に患者から採取される単核球細胞の暈を大幅に減らすことが可能となり、 また抗 原提示細胞の投与にかかる時間が短縮されるので、 患者への負担が軽減する。 更 に、 治療に要する ΝΚΤ細胞リガンドの量も大幅に減少するので、 治療における 安全性がより向上する。
更に、本発明の剤を用いれば、 ΝΚΤ細胞を選択的に頸部リンパ節内に誘導し、 頸部リンパ節内における Ν Κ Τ細胞を介した抗腫瘍免疫を活性化させることが可 能となる。 図面の簡単な説明 図 1は、 投与された榭状細胞表面の HL A— DR、 CD 1 1 c及び CD 86の 発現を示す。 ゲート中の数字は、 陽性細胞の割合を示す （％)。 、 図 2は、 末梢血中の NKT細胞 （CD 3+Vc 24+V j3 1 1 +細胞） （上段） お よび NK細胞 （C、D 3— CD 56+細胞） （下段） を示す。 ゲート中の数字は、 各 ゲート内の細胞数の割合を示す （％)。 矢印は、 α— G a 1 C e rパルス樹状細胞 の投与を示す。
,図 3は、 末梢血 1mlあたりの NKT細胞数および NK細胞数の変化を示す。 図 4は、 エリスポッ ト法で得られた、 末梢血単核球分画に含まれる、 c — G a 1 C e r刺激によ yィンターフェ口ンを産生した細胞数の変化を示す。
図 5は、 投与された樹状細胞表面の HL A— DR、 CD 1 1 c及び CD 86の 発現を示す。 ゲート中の数字は、 陽性細胞の割合を示す （％)。
図 6は、 末梢血中の NKT細胞 （GD 3+Va 24+V 1 1 +細胞） （上段） お よび NK細胞 （CD 3— CD 56+細胞） （下段） を示す。 ゲート中の数字は、 各 'ゲート内の細胞数の割合を示す （％)。 矢印は、 α— G a 1 C e rパルス樹状細胞 の投与を示す。
図 7は、 末梢血 lmlあたりの NKT細胞数および NK細胞数の変化を示す。 ， 図 8は、 千リスポッ ト法で得られた、 末梢血単核球分画に含まれる、 a— G a 1 C e r刺激により γインターフェロンを産生した細胞数の変化を示す。
図 9は、 α— G a l C e rパルス樹状細胞の鼻腔粘膜下投与による N K T細胞 の頸部リンパ節内への誘導を示す。
図 10は、 末梢血及びリンパ節中の NKT細胞の検出結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 NKT細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、 上気道 粘膜下に投与されることを特徴とする剤 （NKT細胞刺激剤、 頸部リンパ節内 N KT細胞誘導剤、 インターフ ロン γ産生誘導剤又は免疫刺激剤） を提供するも のである。 上気道粘膜下に投与することにより、 少ない数の ΝΚΤ細胞リガンド パルス抗原提示細胞により、 極めて効率的に NKT細胞を刺激し、 インターフエ ロン γ産生を誘導し、 免疫反応を刺激,し得る。 また、 上気道粘膜下に ΝΚΤ細胞 リガンドをパルスされた抗原提示細胞を投与することにより、 頸部リンパ節内に 選択 に ΝΚΤ紳胞を誘導することが出来る。
ΝΚΤ細胞は、 Τ細胞受容体 （TCR) と ΝΚ受容体の 2つの抗原レセプター を発現しているリンパ球の一つである。 ΝΚΤ細胞は、 当該細胞上の Τ細胞受容 体が CD 1 (例えば CD 1 d) 分子上に提示された下記の 「NKT細胞リガンド J を認識する。 通常の T細胞と'は異なり、 NKT細胞上の T細胞受容体のレパート リーは非常に限られている。 例えばマウス NKT細胞 （V ct 14 NKT細胞とい う場合がある） 上の Τ細胞受容体の α鎖は、 非多型性の V α 14及び J α 28 1 遺伝子セグメントによりコードされており （Proc Natl Acad Sci USA, 83， p.8708-8712, 1986 , Proc Natl Acad Sci USA,, 88， p.7518 - 7522, 1991, J Exp Med, 180, p.1097-1106, 1994) j3鎖の 90 %以上は V ]3 8であり、 他に V/37や ' 2という限られたレパートリーが含まれ得る。 また、 ヒ ト NKT細胞上の T細胞 受容体は、 マウスの Vct l 4と相同性の高い非多型性の V α 24、 及び V β 8. 2に近縁の V ]3 1 1の組み合わせであることが知られている。
「ΝΚΤ細胞リガンド」 とは、 CD 1分子上に提示されたときに、 NKT細胞 上の T細胞受容体により特異的に認識され、 NKT細胞を特異的に活性化させ得 る化合物をいう。 本発明において使用される 「NKT細胞リガンド」 としては、 例えば、 α—グリコシルセラミ ド、イソグロボトリへキソシルセラミ ド（Science, 306， p 1786-1789, 2004)、 OCH (Nature 413 · 531， 2001) 等を挙げることがで きる。 α—グリコシルセラミ ドは、 ガラク トース、 グルコースなどの糖類とセラ ミ ドとが α配位にて結合したスフィンゴ糖脂質であり、 WO 9 3/0505 5, WO 94/02 1 68、 WO 94 090 20、 WO 94/24 142、 および WO 98/44928、 Science, 278， p.1626-1629, 1997 等に開示されている ものを挙げることができる。 中でも、 （2 S， 3 S, 4 R) - 1 -0- (a -D- ガラク トビラノシル） 一 2—へキサコサノィルァミノ _ 1， 3， 4—ォクタデカ ントリオール （本明細書中、 α_ガラク トシルセラミ ド又は a— G a 1 C e rと 称する） が好ましい。 、 本明細書中、「NKT細胞リガンド」は、その塩をも含む意味として用いられる。 NKT細胞リガ^ドの塩としては生理学的に許容される酸 （例：無機酸、 有機酸） や塩基 （例： アルカリ金属塩） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容 される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩 酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 ^タンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが挙げら れる。
また、 本明細書中、 「NKT細胞リガンド」 は、 その溶媒和物 （水和物等） を 含む意味として用いられる。 ，
抗原提示細胞とは、 抗原をリンパ球に提示してリンパ球の活性化を促す細胞を いう。 通常、 抗原提示細胞は、 T細胞や NKT細胞に抗原を提示し得る樹状細胞 又はマクロファージである。 特に、 樹状細胞は、 強力な抗原提示能力を有してお り、 細胞表面上に発現された MHC C l a s s I、 MHC C l a s s I様分 子 （CD 1等）、 MHC C l a s s I I等を介して抗原を提示し、 T細胞又は N KT細胞を活性化させ得るので、本発明に好ましく用いられる。本発明において、 抗原提示細胞は、 NKT細胞リガンドを NKT細胞に確実に提示し得るように、 CD 1 (例えば CD 1 d) 発現細胞であることが好ましい。
抗原提示細胞としては、 任意の哺乳動物由来のものを用いることが出来る。 哺 乳動物としては、 ヒ ト及びヒ トを除く哺乳動物を挙げることが出来る。 ヒ トを除 く哺乳動物としては、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター、 モルモッ ト等のげ つ歯類やゥサギ等の実験動物、 ブタ、 ゥシ、 ャギ、 ゥマ、 ヒッジ等の家畜、 ィヌ、 ネコ等のペット、 サル、 オランウータン、 チンパンジーなどの霊長類を挙げるこ とが出来る。 本発明の剤に含有される抗原提示細胞の遺伝子型は、 特に限定されないが、 通 常、 本発明の剤が投与される対象と同種同系、 同種異系又は異種異系であり、 好 ましくは同種同系又は同種異系である。 拒絶反応を回避するために、 抗原提示細 胞は、 本発明の剤が投与される対象と同種同系であることが好ましく、 本発明の 剤が投与される対象由来 （即ち、 自家樹状細胞） であることがより好ましい。 抗原提示細胞は自体公知の方法によって、 上述の哺乳動物の組織 （例えばリン パ節、 脾臓、 末梢血等） から単離することが可能である。 例えば抗原提示細胞上 に特異的に発現する細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、 セルソーター、 パ ニング、 抗体磁気 'ーズ法等によ 樹状細胞を単離することができる。 抗原提示 細胞として樹状細胞を単離する場合には、 樹状細胞上に特異的に発現する細胞表 面マーカーとして、 例えば、 CD 1 1 c、 MHC C l a s s I、 MHC C l a s s I様分子 （CD 1等）、 MHC ,C 1 a s s I I、 CD 8 a、 CD 8 5 k、 CD 8 6、 FD L-M 1 , D E C— 2 0 5等を用いることが出来る。
また、 抗原提示細胞は、 上述の哺乳動物の骨髄細胞や単核球等を適切な抗原提 示細胞分化条件で培養することにより製造することもできる。 例えば、 骨髄細胞 は GM— C S F (場合によっては更に I L— 4) の存在下で約 6 間程度培養さ れることにより、樹状細胞（骨髄由来樹状細胞： BMDC)へと分化する （Nature, 408， p.740-745, 2000)。 また、 末梢血液中の単核球 （特に単球、 マクロファージ 等） を GM—C S F (場合によっては更に I L— 2及び 又は I L— 4) の存在 下で培養することにより、 樹状細胞を得ることが出来る （文献名 . Motohasi S， Kobayashi S, Ito T, Magara KK, Mikuni 0, Kamada N， Iizasa Γ, Nakayama J', Fujisa a T， Taniguchi M, Preserved IFN-alpha production of circulating Valpha24 NKT cells in primary lung cancer patients. , Int J Cancer, 2002, Nov.10， 102(2) · 159 - 165. Erratum in Int J Cancer. 2003， May 10, 104(6) :799)。
「抗原提示細胞への NKT細胞リガンドのパルス」 とは、 NKT細胞リガンド を抗原提示細胞表面に、 該リガンドが NKT細胞へ提示され得るように、 配匱す ることをいう。 より具体的には、 NKT細胞リガンドを、 抗原提示細胞表面に発 現された CD 1分子上に提示させることを意味する。 抗原提示細胞への NKT細 胞リガンドのパルスは、 NKT細胞リガンドを抗原提示細胞へ接触させるこ iに より達成することが出来る。 例えば NKT細胞リガンドを含有する生理的な培養 液中 抗原提示細胞が培養される。 この場合、 培養液中の NKT細胞リガンドの 濃度は、 NKT細胞リガンドの種類により適宜設定することが可能であるが、 例 えば 1〜： l O O O O n g/m 1、 好ましくは 10〜： L O O O n g /m 1である。 また、 培養液としては、 例えば、 適切な添加物 （血清、 アルブミン、 緩衝剤、 ァ ミノ酸等） を含んでいてもよい基礎培地 （最少必須培地 （MEM)、 ダルベッコ改変 イーグル培地 （DMEM)、 RPMI1640培地、 199培地） などを挙げることが出来る。 培 養液の p Hは通常約 6〜8であり、 培養温度は通常約 30〜40°Cであり、 '培養 時間は通常 4〜 143間、 好ましくは 6〜 14日間である。 更に、 培養後に抗原 提示細胞を、 NKT細胞リガンドを含まない培養液や生理的な水溶液で洗浄し、 フリ一の N K T細胞リガンドを除去することにより、 N K T細胞リガンドをパル スされた抗原提示細胞が単離される。
本発明の剤は、 有効成分として NKT細胞リガンドをパルスされた抗原提示細 胞単独で、 あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有する ことができる。 また、 本発明の剤は、 有効量の活性成分を薬理学的に許容される 一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく知 られている任意の方法により製造される。 - 本発明の剤は、通常は、注射剤、点滴剤等の剤型で提供される。本発明の剤は、 好ましくは、 受容者の体液 （血液等） と等張な滅菌水性担体中に、 NKT細胞リ ガンドをパルスされた抗原提示細胞が懸濁された懸濁液である。 該水性担体とし ては、 生理食塩水、 PB S等を挙げることが出来る。 これらの水性担体には、 更 に、 必要に応じて溶解補助剤、 緩衝剤、 等張化剤、 無痛化剤、 保存剤、 安定化剤 等を添加することもできる。
本発明の剤中に含まれる NKT細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の濃 度は、 通常、 約 1 X 105〜 1 X 101 ()個 Zmし 好ましくは約 2 X 1 05〜 1 X 1 0 9個 Zm 1 の範囲であるが、 特に限定されない。 細胞濃度が低すぎると、 投 与に時間がかかるため患者への負担が増大し、 細胞濃度が高すぎると、 細胞 士 が凝集してしまう可能性がある。 ' 本発明の剤は安全であり、 任意の哺乳動物に投与することが出来る。 哺乳動物 としては、 上述の哺乳動物を挙げることが出来る。 哺乳動物は、 好ましくはヒ ト である。
本発明の剤は、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする。上気道粘膜とは、 鼻腔から気管に至る上気道 （鼻腔、， 咽頭、 扁桃、 喉頭； 気管等） の表面に存在す る粘膜をいう。 鼻 粘膜には免疫担当細胞や血管が豊富に存在するため、 本発明 の剤は、 好ましくは鼻腔粘膜下に投与される。 鼻腔粘膜は、 上 · 中 ·下鼻甲介粘 膜、 上 · 中 ·下鼻道粘膜、 鼻中隔粘膜等からなるが、 免疫担当細胞が豊富に存在 し、 且つ、 投与が容易であ ¾ことから、 本発明の剤は、 より好ましくは下鼻甲介 粘膜下に、 更に好ましくは下鼻甲介粘膜前方粘膜下に投与される。 「粘膜下投与」 とは、 有効成分を粘膜上皮下の固有層内に注入することをいう。
本発明の剤の投与量は、 投与形態、 患者の年齢、 体重、 疾患の種類、 疾患の重 篤度、 N K T細胞リガンドの種類等により異なるが、 通常、 1回の投与につき、 N K T細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の数として、 通常 1 X 1 0 6〜 1 X 1 0 9個 111 2、 好ましくは 1 X 1 0 7〜 1 X 1 0 9個 Zm 2の用量で投与され る。 しかしながら、これら投与量に関しては、前述の種々の条件により変動する。 本発明の剤を用いれば、 頸部リンパ節内に選択的に N K T細胞を誘導すること が出来る。 この選択性は厳格であって、 樹状細胞が投与される上気道粘膜の部位 と同じ側（ipsi latelral)の頸部リンパ節内に選択的に N K T細胞が誘導される。 例えば、 右側の鼻腔粘膜下に N K T細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を 投与すると、 右側の頸部リンパ節に選択的に N K T細胞が誘導される。 リガンド によって活性化された N K T細胞は、 迅速に大量のインターフェロン γと I L— 4を産生し、パーフォリン /グランザィム Βを介した強力な細胞傷害活性を発揮し、 さらにその後さまざまな免疫反応を誘起し、 その結果として強い抗腫瘍作用が発 揮されるというユニークな作用機構を有することが報告されている [Morita M， Motoki K， Akimoto Κ， Nat on T, Sakai T， Sawa E， Yamaji K， Koezuka Y， Kobayashi E， Fukushima H, Structure-activity relationship of
alpha-galactosylceramides against B16 - bearing mice. J Med Chem 1995 Jun 9;38(12) :2176- 87、 Nakagawa R， Motoki K， Ueno H， Iijima R， Nakamura H，
Kobayashi E, Shimosaka A， Koezuka Y， Treatment of hepatic metastasis of the colon26 adenocarcinoma with an alpha-galactosylceramide, KRN7000. Cancer Res 1998 Mar 15,58(6) : 1202 - 7、 Kawano T， Cui J, Koezuka Y， Toura I， Kaneko Y, Sato H， Kondo E， Harada M， Koseki H， Nakayama T, Tanaka Y， Taniguchi M, Natural killer-like nonspecific tumor cell lysis mediated by specific ligand- activated ValphaH NKT cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1998 May
12,95(10) :5690- 3]。 従って、 本 ¾明の剤を用ノいれば、頸部リンパ節内における N
KT細胞を介した免疫反応を選択的に誘導することができるので、本発明の剤は、 頭頸部領域の悪性腫瘍 （鼻 ·副鼻腔癌、 咽頭癌、 口腔癌、 喉頭癌、 甲状腺癌、 唾 液腺癌等）、 上気道におけるアレルギー疾患 （鼻アレルギー等） 等の予防 '治療に 有用であり得る。 ， また、 本発明の剤を用いれば、 少ない数の N K T細胞リガンドパルス抗原提示 細胞により、 極めて効率的に NKT細胞を刺激し、 NKT細胞の増殖や、 サイ ト 力イン（インターフェロン γ、 I L— 4等）産生を誘導することができる。特に、 本発明の剤を用いれば、 頸部リンパ節のみならず、 末梢血中の ΝΚΤ細胞をも極 めて効率的に刺激することが可能となる。 従って、 本発明の剤を用いれば、 少な い数の ΝΚΤ細胞リガンドパルス抗原提示細胞により、 極めて効率的に免疫反応 を刺激することが可能であり、 腫瘍、 アレルギー等の疾患を予防 '治療し得る。 以下、 実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、 本発明は以下に示す 実施例によって何ら限定されるものではない。 実施例 [実施例 1 ]
(対象症例）
以下の基準を満たす頭頸部癌患者が選択された。
選択基準：
1. 頭頸部進行癌症例（ΠΙ、 IV期）
2. 年齢： 20〜80歳
3. ' Performance status： 0〜2
4. 下記の検査値を満たしている症例 （登録前 4週間以内の測定結果）
白血球数 3, 000/mレ 血小板数≥75, 000/mL、 血清クレアチン≤ 1. 5mg/dL、 総ビリ ルビン≤ 1. 5 mg/dL、 AST (GOT)、 ALT (GPT) ≤ 2. 5 X基準値上限
5. 本人または代諾者からの文書による同意が得られている症例
6. 末梢血に NKT細胞が存在する症例， ( 10個以上 末梢血 1ml)
除外基準：
1. 本臨床研究に参加する 4週以内に化学療法あるいは放射線療法を施行してい る症例
2. 予後が 6ヶ月に満たないと考えられる症例
3. 活動性の感染症を有する症例
4. 肝炎及びその既往を有する症例
5. HBs抗原、 HCV抗体、 HIV抗体又は HTLV- 1抗体が陽性の症例
6. 同時性重複癌の症例
7. 重篤な心疾患のある症例 （NYHA Class I I I以上）
8 併用薬としてコルチコステロイ ドを使用している症例
9. 妊娠あるいは妊娠の可能性のある女性。 授乳期の女性。
10. アルブミン過敏症の既往を有する症例
11. 自己免疫疾患を有する症例
12. 医学的、 心理的要因もしくは他の要因により、 担当医が本臨床研究への参加 を不適当と判断した症例 (方法）
a -G a 1 C e rパルス樹状細胞の調製
上記基準に合致した頭頸部癌患者から末梢血を採取 （約 100ml) した。 さらに 密度勾配遠心に り単核球を分離した。投与量に十分と考えられる単核球細胞 りは凍結保存） を、 8 0 0 Uノ m l GM— C S F (GeneTech Co. , Ltd), 1 0 0 υ/τη 1 I L- 2 (I unas_e Shionogi) 及び 5 %自己血清を^：有する A I Μ'— V培地 （Invitrogen Corp. ) 中で 7〜： I 4日間培養した。 投与前日に 1 0 0 n g/m 1 a -G a 1 C e r (KRN7000; Kirin Brewery) を加えて 1 間培養 し a— G a 1 C e r,パルス榭状細 （DC)とした。 細胞を洗浄後、 2.5%アルブミン 加生理食塩水に懸濁し同一患者の鼻腔粘膜に粘膜下投与した。
投与経路及び用量
a -G a 1 C e rパルス榭状細胞を、 2.5%アルブミン加生理食塩水に浮遊し（約 0.2ml),患者の下鼻甲;^の基部粘膜下に輸注した。樹状細胞投与量は、 IxlO8個/ m2 とした。 '
5週間にわたる試験期間のうち、 day 7及び dayl4に、 a _G a 1 C e rパルス 樹状細胞を鼻腔粘膜下に投与した。
(評価項目），
NKT細胞数評価
投与前後 5週間にわたり毎週採血を行い、末梢血 NKT細胞の増減を評価した。 該評価は下記抗体を用いたフローサイ トメ トリーにより行った。 CD 3 +V a 2 4+V ]3 1 1 +細胞を NKT細胞とした。末梢血 1 mlあたりの NKT細胞数を測定 し、 経時的に比較した。 また、 CD 3— CD 5 6 +細胞を NK細胞とし、 コント口 ールとして NK細胞数を経時的に測定した。
抗ヒ ト V α 2 4マウスモノクローナノレ抗体 (C15, Immunotech)
抗ヒ ト V /3 1 1マウスモノクローナル抗体 (C21, Immunotech)
抗ヒ ト CD 3マウスモノクローナノレ抗体 （UCTHl, PharMingen)
抗ヒ ト CD 5 6マウスモノクローナル抗体 （BectonDickinson) NKT細胞機能評価
投与前後 5週間にわたり毎週採 £を行い、末梢血単核球を分離し凍結保存 た。 6週目に細胞を解凍し、エリスポッ'ト法で α-ガラク トシルセラミ ドで γインター フエロン産生細胞の頻度を測定した。 エリスポッ トアツセィは、 キッ ト （MABTEClf 社製） 及びニトロセルロース膜 （Millititer, Millipore Corp. ) を用いて、 製造 者の指示書に従い行った。 細胞は、 100 n g/m l α— G a l C e rを含む 無血清 A I M— V培地中で 1 8時間培養することにより刺激された。 発色は BC I P/NBTシステム （Bio- Rad) を用いて行った。 スポットのカウントはコンビ ュ一ター画像解析によって客観的 k計測された。
(結果）
症例 1 ： 54歳 男性。 中咽頭癌（T4N2cMl)の再発例。
樹状細胞のプロファイル ,
投与した樹状細胞のプロファイルとして、 細胞表面上の HLA- DR、 CDllc、 及び CD86の発現をフローサイ トメ トリーにより解析したところ、それぞれの表面抗原 の強発現が確認された （図 1)。
末梢血 NKT細胞の応答 ,
1 ) 数量変化
図 2にフローサイ トメ トリー法で得られた末梢血中の NKT細胞 （上段） およ び NK細胞 （下段） を示す。 さらに lmlあたりの NKT細胞数および NK細胞数 の変化を測定した（図 3)。鼻腔粘膜下へ α— G a 1 C e rパルス樹状細胞の一回 投与により、 末梢血 NKT細胞の数量が増加した。 一方、 末梢血 NK細胞の数量 は、 a_G a 1 C e rパルス樹状細胞の投与による顕著な変化は認められなかつ た。
2) 機能変化
図 4にエリスポット法で得られた、 末梢血単核球分画に含まれる、 a—G a l C e r刺激により γインターフヱロンを産生した細胞数の変化を示す。 末梢血 Ν KT細胞数に呼応するように、 α— G a 1 C e rパルス樹状細胞の投与に応答し て、 "/インターフェロン産生細胞数が増加した。
症例 2 ： 48歳 女性 左上顎癌 （T3N0M0)の再発例。
榭状細胞のプロファイル
投与した榭状細胞のプロファイルとして、 細胞表面上の HLA- DR、 CDllc、 及び CD86の発現をフローサイ トメ トリーにより解析したところ、それぞれの表面抗原 の発現が確認された （図 5)。
末梢血 NKT細胞の応答
1) 数量変化
図 6にフローサイ トメ トリー法で得られた末梢血中の NKT細胞 （上段） およ び NK細胞 （下段） を示す。 さらに lmlあたりの NKT細胞数および NK細胞数 の変化を測定した （図 7)。鼻腔粘膜下へ α— G a 1 C e rパルス樹状細胞の一回 投与により、 末梢血 NKT細胞の数量が増加した。 一方、 末梢血 NK細胞の数量 は、 ひ一 G a 1 G e rパルス樹状細胞の投与による顕著な変化は認められなかつ た。
2) 機能変化
図 8にエリスポット法で得られた、 末梢血単核球分画に含まれる、 a— G a 1 C e r刺激により γインターフェロンを産生した細胞数の変化を示す。 末梢血 Ν ΚΤ細胞数に呼応するように、 α— G a 1 C e rパルス樹状細胞の投与に応答し て、 yインターフェロン産生細胞数が増加した。
これまで、 肺癌の再発例を中心に α—ガラク トシルセラミ ドパルス樹状細胞の 静脈投与による検討がなされている [Ishikawa A, Motohashi S, Ishikawa E, Fuchida H, Higashino K, Otsuji M, Iizasa T, Nakayama T, Taniguchi M, Fujisawa T, A phase I study of alpha-galactosylceramide (KRN7000) -pulsed dendritic cells in patients with advanced and recurrent non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2005 Mar 1， 11 (5) · 1910-7]。 それによると、 第 1相試験では移入細 胞数をレベル 1 として 5 X lOVm2, レベル 2として 2.5 X 108/m2、 レベル 3とし て 1 x 109/m2とエスカレーショ ンして試験が行われた。 この結果、 試験参加症例 全 11例のうち、レベル 3の細胞数を投 された一例に末梢血 NKT細胞の増加が 観察されている。 しかしながら、 レベル 1およびレベル 2の α—ガラク トシルセ ラミ ドパルス樹状細胞の数量では末梢血に ΝΚΤ細胞の増加する免疫応答は得ら れていない。
これに対して、 実施例に示すように、 ο;—ガラク トシルセラミ ドパルス樹状細 胞を上気道粘膜下へ投与すると、 わずか 1 X 108Zm2の用量で、 末梢血中の N KT細胞の数の増加が認められた。 更に、 数量のみならず、 機能的にも NKT細 胞のひ _G a 1 C e rに対するサイ トカイン ズインタ一フエロン γ) 産生応答が 増強された。
以上の結果より、 ΝΚΤ細胞リガンドパルス抗原提示細胞を上気道粘膜下に投 与することにより、 少ない数の ΝΚΤ細胞リガンドパルス抗原提示細胞により、 極めて効率的に末梢中の ΝΚΤ細胞を刺激し得ることが示された。
[実施例 2 ]
実施例 1と同様に調製された α—G a 1 C e rパルス樹状細胞を、 2.5%アルブ ミン加生理食塩水に浮遊し （約 0.2ml)、 頭頸部癌患者の左側鼻腔内の下鼻甲介の 基部粘膜下に輸注した。 樹状細胞投与量は、 lxlO8個/ m2とした。 投与から 2日後 に、 バイオプシーにより左右の頸部リンパ節からリンパ球を採取し、 実施例 1 と 同様にフローサイ トメ トリ一により、 採取されたリンパ球内に NKT細胞が含ま れるか否かを試験した。 CD 3 +V α 24+V ]3 1 1 +細胞を NKT細胞とした。 その結果、 α— G a 1 C e rパルス樹状細胞が投与された部位と同じ側の頸部 リンパ節内に NKT細胞の存在が認められたが、 反対側の頸部リンパ節内には N KT細胞の存在が認められなかった （図 9)。
以上の結果より、 α— G a 1 C e rパルス樹状細胞の上気道粘膜下投与により、 NKT細胞が選択的に頸部リンパ節に誘導されることが示された。
[参考例 1 ] 実施例 1及び 2と同様に、 頭頸部癌患者の末梢血及び非転移頸部リンパ節より リンパ球を採取し、 フローサイ トメ トリーにより、 採取されたリンパ球内に Τ細胞が含まれるか否かを試験、した。 CD 3+Va 24+V j3 1 1+細胞を^^1：丁 細胞とした。 ，
その結果、 末梢血中のリンパ球中には NKT細胞の存在が認められたが、 非転 移リンパ節内には NKT細胞は検出されなかった （図 1 0)。 産業上の利用可能性
本発明の剤を用 れば、 少ない数の NKT細胞リガンドパルス抗原提示細胞に より、 極めて効率的に NKT細胞を刺激し、 免疫反応を刺激し、 癌等の疾患を治 療し得る。 これにより、 抗原提示細胞の調製に用いる試薬を大幅に節約すること が可能となり、 治療全体のコス トが軽減する,。 また、 抗原提示細胞の調製のため に患者から採取され ^単核球細胞の量を大幅に減らすことが可能となり、 また抗 原提示細胞の投与にかかる時間が短縮されるので、 患者への負担が軽減する。 更 に、 治療に要する NKT細胞リガンドの量も大幅に減少するので、 治療における 安全性がより向上する。
更に、本発明の剤を用いれば、 N K T細胞を選択的に頸部リンパ節内に誘導し、 頸部リンパ節内における N K T細胞を介した抗腫瘍免疫を活性化させることが可 能となる。 本出願は日本で出願された特願 2005— 294 1 24 (出願 S ： 2005年 1 0月 6日） を基礎としており、 その内容は本明細書に全て包含されるものであ る。

Claims

請 範囲
1. N K T細胞リガンドをパルスされだ抗原提示細胞を含有 、 上気道粘膜: ^に 投与 れることを'特徴とする、 NKT糸ί胞刺激剤。
2. NKT細胞リガンドが α—ガラク トシルセラミ ドである、請求項 1記載の剤。
3. 上気道粘膜が鼻腔粘膜である、 請求項 1記載の剤。
4. ΝΚΤ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、 上気道粘膜下に 投与されることを特徴とする、 頸部リンパ節内 ΝΚΤ細胞誘導剤。
5. ΝΚΤ細胞リガンドがひ 一ガテク トシルセラミ ドである、請求項 4記載の剤。
6. 上気道粘膜が鼻腔粘膜である、 請求項 4記載の剤。
7. ΝΚΤ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、 上気道粘膜下に 投与されることを特徴とする、 インターフェロン γ産生誘導剤。
8. ΝΚΤ細胞リガンドがひ —ガラク トシルセラミ ドである、請求項 7記載の剤。
9. 上気道粘膜が鼻腔粘膜である、 請求項 7記載の剤。
1 0. ΝΚΤ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、 上気道粘膜下 に投与されることを特徴とする、 免疫刺激剤。
1 1. NKT細胞リガンドが α—ガラク トシルセラミ ドである、 請求項 10記載 の剤。
1 2. 上気道粘膜が鼻腔粘膜である、 請求項 10記載の剤。
1 3. ΝΚΤ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、 上気道粘膜下に投与 することを含む、 ΝΚΤ細胞を刺激する方法。
14. ΝΚΤ細胞リ,ガンドをパル された抗原提示細胞を、 上気道粘膜下に投与 することを含む、 頸部リンパ節内に ΝΚΤ細胞を誘導する方法。
1 5. ΝΚΤ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、 上気道粘膜下に投与 することを含む、 インターフュロン y産生を誘導する方法。
1 6. NKT細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、 上気道粘膜下に投与 することを含む、 免疫反応を刺激する方法。
1 7. 上気道粘膜下に投与される NKT細胞刺激剤を製造するための、 NKT細 胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
1 8. 上気道粘膜下に投与される頸部リンパ節内 NKT細胞誘導剤を製造するた めの、 NKT細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
1 9. 上気道粘膜下に投与されるインターフェロン γ産生誘導剤を製造するため の、 NKT細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
20..上気道粘膜下に投与される免疫刺激剤を製造するための、 NKT細胞リガ ンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
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