WO2007037530A1 - 超高速で生体分子反応を測定する方法 - Google Patents

超高速で生体分子反応を測定する方法 Download PDF

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Yasumasa Nakamura
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    • G01N2035/00158—Elements containing microarrays, i.e. "biochip"

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring ultra-high reactions using a microfluidic Tinofu system and for use in the method.
  • molecular reaction can be detected and measured with extremely high sensitivity in a very short time.
  • Microfluidic Tinov is widely used in the fields of medicine, drug discovery, chemical synthesis, and environment to enable measurement of biomolecular reactions in a small amount of sample at high speed and in a short time. Analysis of animals, plants and microbiota using microfluidic chinoffs Drug discovery support Clinical diagnosis Synthesis and analysis of food safety tests Environmental monitoring links It is possible to measure biomolecular reactions in a short time. Can quantification be achieved by further reducing the size of the high speed using microfabrication technology? Isn't it possible to reduce the reaction time and ultra-high speed? .
  • the biomolecular reaction such as antigen-antibody reaction usually takes several tens of minutes to one hour or more as a reaction time using a micro, and it becomes possible to produce this from several minutes to several tens of minutes using a microfluidic chinoff.
  • no technology has yet been established to accurately detect the reaction time from an instant to a very high speed. If a large-scale control device is used to detect an ultrafast reaction with a further microfluidic chinoff, the value of the microfluidic chinoff will be halved.
  • High speed microfluidic chino A microfluidic chinoff has been reported in the publication 2002-243734 for the purpose of providing a biological bio-noff having a structure that can be recovered and identified.
  • the present invention provides a biological component on a substrate, a microfluidic chinoff is installed on the substrate, and a fluid containing a molecule having affinity with the microscopic biomolecule is rapidly moved on the microfluidic chinoff.
  • a method for measuring a biomolecule reaction at a very high speed by performing a biomolecule reaction between the biomolecule and the affinity and further detecting the biomolecule reaction.
  • a structure in which the substrate is fixed and the micro-channel is constructed of the above-described micro-channel device and means for moving the suction or fluid at high speed including means for moving the fluid at high speed.
  • a method for precise and precise analysis using a small amount of sample is established, and it is possible to provide a simple microfluidic device in a very short time by realizing these methods.
  • Environmental monitoring link 14 or extremely high For example, in a medical place where the health status is constantly monitored from the tailor mate medical care, emergency medical care, and home, the body molecules can be analyzed at high speed and instantly, and treatment and necessary treatment can be performed. How to meet those demands 02 shows the relationship between suction pressure and flow rate by vacuum phone.
  • Grad 03 shows the binding ratio (03 a) and binding speed (03 b) in the binding reaction between capilla IgG and anti-IgG antibody.
  • 04 shows the relationship between the flow velocity (04a) and the flow velocity and the amount of binding (04b) in the reaction between hyacin and hyatin.
  • the inventors of the present invention provide a simple and concise apparatus system for realizing a method for detecting and measuring a biological reaction at an extremely high speed, that is, the present invention has a high effective concentration immobilized on a solid substrate of a microfluidic chinoff and It is intended to provide a method that makes it possible to accurately and rapidly extract biomolecules that have been fixed or exposed to a high flow rate so that they will not flow out while maintaining their effective concentration.
  • the present invention immobilizes biomolecules on the plate and moves the fluid having affinity for the biomolecules on the microfluidic chinoff at high speed on the microfluidic chinoff on the substrate.
  • the present invention it is a necessary requirement to obtain an effective concentration by increasing the exposed area of the biomolecule immobilized on the phase substrate for measuring the biological reaction at an extremely high speed.
  • a method a method of forming a porous structure of biomolecules on a substrate is suitable.
  • the emulsion rejuvenation method is suitable.
  • the immobilization substrate used in the present invention a glass plate coated with indium oxide (Indium Tin Oxide) and a substrate surface coated with a functional group such as artificial ehokkin, sukkunet, maleimitoamino calfokinle, etc. are used. Useful. However, the immobilization substrate should not be limited to that.
  • a microfluidic chinoff device that detects ultrafast reactions with high sensitivity is provided.
  • the apparatus stem of the present invention comprises a suction or pressurization circuit including means for moving a biomolecule as a microfluidic chinoff composed of a microchannel and a jig for connecting the fluid and the microchannel.
  • biomolecule reaction can be measured at a very high speed by shortening the time from several minutes to several tens of seconds.
  • “super-high-velocity biodegradation” means a biomolecular reaction in a short time of 0 01 seconds to 60 seconds, preferably 0 1 seconds to 20 or 0 1 seconds to 10 seconds. is there.
  • the flow rate for moving the fluid employed in the present invention is not limited to a high flow rate range of 1 500 mm / second, preferably 100 mm / second to 1 500 mm / second.
  • the flow rate used is a microphone It means to move.
  • microfluidic chino described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-243734 described in the microfluidic chino used for the purpose of carrying out the invention of the present application can be adopted as appropriate according to the sampler or the test conditions for testing the microfluidic chino.
  • the body chinoff used in the present invention is described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-243734, and it is possible to use other micro chinoffs based on the concept of the technique of the present invention.
  • the term “microfluidic chinoff” has a meaning in the art. Specifically, a hole for inserting a test substance or test W on a substrate of about several millimeters to several centimeters and thick. In addition, it means a device with a fine flow path of several hundred microns.
  • microfluidic chinoff Using microfluidic chinoff, the reaction efficiency is improved by a biological reaction on a minute flow path.
  • the whole apparatus nostem used in the method of the present invention is shown as 0 1 0 1
  • the system is a substrate (biological fluid c in 0 1) on which biomolecules are fixed and micro channel (0 1 in the fluid chinoff channel side micro fluid tynov fluid at high speed.
  • Pressure circuit suction circuit including vacuum phone 20 in 0 1 2 1 means for moving fluid at high speed and micro channel 1 0 — 17.
  • 10 types of living body Did you show 1 an ultra-fast analysis system consisting of 16 chan- nels of chinoff to which one kind of biomolecule (samples C 1 to C 10) is fixed? There is nothing to limit.
  • the microfluidic chinoff is connected to the fluid chinoff jig A, and the suction circuit including manov and vacuum phono 20 is connected. 2 1 — 2 5
  • the fluid chinoff jig A connects the suction circuit and the jig.
  • Elevating guide plate 1 3 It is composed of a compression slot for fixing and securing the connection.
  • the components of jig A are not limited to these, and can be modified as appropriate.
  • Vacuum hobbing pressure differs depending on the structure material of microfluidic chinoff b (flow channel side) c (test side).
  • the microfluidic suction pressure shown in 0 1 is preferably controlled from -l kPa to -l OOkPa or not in this range.
  • the microfluidic chinoff inlet bl has a dent for a capacity of 1 — 2 0 / X 1, or is the reactant solution or washing solution dripped by the hygroscopic densor?
  • the shape of the inlet is not limited to this method.
  • Microfluidic chinoff fixed to measure and analyze raw It means a reaction between a molecule and a molecule having biological affinity.
  • a biomolecular reaction reaction of antigen and antibody and reaction of hyotin.
  • Receptant and substrate of lycanto for the receptor The reaction between DNA and protein DNA can be described as a reaction with RNA.
  • a biomolecule reaction is carried out on a microphone by causing one of biomolecules having biological affinity to flow on a substrate at a high speed with a fluid containing the other biomolecule.
  • a frunokink reaction is preferably used in the present invention using a solution of skim milk or minna.
  • the reaction solution and the liquid solution such as the ligant substrate are used. It differs depending on the channel structure, diameter, length, material, and biomolecule.
  • the flow rate control at the microfluidic channel shown in 01 is shown in 02.
  • the means for use in the present invention is not particularly limited, and other means may be used. As such means, means using a phone with a suction phone, a means for giving vibration, and a centrifugal force have been given.
  • Biomolecular reactions can be detected directly or through an enzyme-labeled antibody through a single-step to multi-step reaction, such as absorption method, fluorescence method, light polarization method, time-resolved fluorescence method, and electrochemical measurement method.
  • the reaction of one to multiple steps proceeds under the control of the flow rate and detects the reaction. Is the flow rate controlled by each reaction? Depending on the type of reaction, the reaction solution can be instantly washed at a high flow rate. The list is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • a glass mask with a 1mm width is drilled on a glass substrate coated with a glass plate. Sprayed. On this substrate, a suction phono-stem with a microchannel made of Lunoxane (PDMS) was used.
  • PDMS Lunoxane
  • Alexa Fluor 56 antibody (Molecular Fove) was sprayed onto the IT0 coated substrate in 250 lOOOng units (1 shot) using an electrolysis device. Washing was performed by sucking 20 1 bronokink solution in 3 vacuum conditions under each condition by removing the cleaning path and removing the cleaning path in the dark and cooling with a BX51WI fluorescence microscope (Olin Yasu). Fluorescence observation was performed using Photonics. The fluorescence of Shonoto was measured by Naraisa. The average and standard error of the relative binding rate and the standard error when the amount of fluorescence at each wash was set to 100% were obtained.
  • Example 2 In the same manner as in Example 2, a mouse pathogen, Clostridium piliforme (Res. University Research Animal Diagnostics Laboratory), was placed on the substrate, and the microchannel was placed on the substrate for suction phone selection. After cleaning with Phlonoking solution Anti C pilifrome Anti Shed. L tg / ml after cleaning
  • Protein A (calhiochem) 10 / z l was combined with an anti-C pilifrome antibody that was similarly aspirated using lOkPa.
  • the DNA containing the Daryl recognition sequence was placed on the substrate.
  • the micro flow path is selected, and the flow path is set to a sample containing bronkin and ah and Ah and Ah.
  • biomolecules can be accurately and instantaneously accurately separated at research sites, manufacturing sites, and medical sites.

Abstract

本発明により、少量のサンプルを用いて超高速で正確に生体分子を測定・分析する方法が確立され、更には該方法を実現するためのコンパクトで簡便なマイクロ流体装置が提供された。本発明の方法およびマイクロ流体装置によれば、生体分子を超高速で瞬時に正確に分析できるので、研究現場、製造現場や医療現場、環境モニタリングなどにおいて利用価値が極めて大きい。

Description

明 細
超高速て生体分子反応を測定する方法 技術分野
本発明は マイクロ流体チノフシステムを用いて 超高 反応を測定する方法 およひ該方法に用いるためのための に関する。 本発明の方法及ひ装置ノステムを用いることに 分子反応を極めて短時間に且つ高感度に検出 測定するこ 背景技術
マイクロ流体チノフは 少量のサンフルて高速 短時間 場て生体分子反応の測定を可能にするために 医療や創薬 ォ分野 化学合成分野 環境分野なとの分野において広く としている。 マイクロ流体チノフを用いて 動植物や微生 タンハク質の解析 創薬支援 臨床診断 食品の安全 検 の合成や分析 環境モニタリ ンクなとを行なうことかてき ルて生体分子反応を短時間に測定することか可能てある。 量化は 微細加工技術を使ってテハイスのサイスをより縮 サンフルのハン卜 リ ンクの精密化を 0ることにより実現 きるか 反応時間の短縮化や超高速化については 未た克 的な障害か高い。
すなわち抗原抗体反応なとの生体分子反応は マイクロ 用いて 反応時間として通常数十分から一時間以上をかけ マイクロ流体チノフを用いることて これを数分から数十 出することか可能となった。 しかし 反応時間を瞬時から 超高速て正確に検出する技術は未た確立されていない。 更 卜なマイクロ流体チノフて超高速反応を検出するために 置ゃ大掛かりな制御装置を使うと マイクロ流体チノフに の価値は半減するのて 簡便てコンハク トな測定システム しかし そのような要求を満たす超高速マイクロ流体チノ 回収してその同定を行なえるような構造を持つ生体高分 ノフを提供することを目的としてマイクロ流体チノフの開 開 2002-243734号公報において報告している。
発明の開示
発明か解決しょうとする課題
そこてマイクロ流体チノフを用いて 生体分子反応を超 ることを可能にする測定方法と該方法に用いるための装 提供することか本発明の課題てある。
上記課題を解決するために本発明は 基板上に生体分 当該基板上にマイクロ流体チノフを設置し 当該マイクロ て当該生体分子と親和性を有する分子を含む流体を高速て 該マイクロ流体チノフ上て当該生体分子と当該親和性を 間との生体分子反応を行い 更に当該生体分子反応を検出 なる 超高速て生体分子反応を測定する方法を提供する。 子を固定した基板とマイクロチャン不ルょり構成される チノフ 流体を高速て移動させる手段を含む吸引または加 流体を高速て移動させる手段と前記マイクロチャン不ル 具より構成される。
本発明により 少量のサンフルを用いて超高速て正確に 定 分析する方法か確立され これらを実現することかて 卜て簡便なマイクロ流体装置を提供することか可能になっ を極めて短時間に その場て簡便に測定 分析てきること ン チノフゃホイント オフ ケアなと 研究現場 製造 場 環境モニタリンクなとにおいて必要 14か極めて高く も大きい。 例えはテーラー メート医療や 緊急医療や手 宅にいなから健康状態を常時モニターてきる医療の場なと 体分子を超高速て瞬時に正確に分析し 治療や必要な処置 か可能てあり 本発明により それらの要求を満たす方法 02は 真空ホンフによる吸引圧と流速の関係を示すグラ 03は ャギ IgGと抗ャキ IgG抗体との結合反応における 結合比率 （03 a) およひ流速の速さと結合量 （03 b)
04は ァヒシンとヒォチン結合反応における流速の速 (04 a) およひ流速の速さと結合量 （04 b) との関 フてある。
05は 高速洗净かタンハク質の基板結合量 およひ固定 ク質の表面構造に及ほす影響を示す 0てある。
符号の説明
1 0 流体チノフ排出口押さえ 1 1 流体チノフシ 2 流体チノフカイ ト板 1 3 流体チノフ昇降シー 治具へース 1 5 流体チノフ注入口側押さえ 1 イ トヒン 1 7 ンール 固定用圧縮スフリング 2 b2 流体チノフ （排出口） C 流体チノフ （試料側） 1 C2 試枓 2 C3 試 Η· 3 C4 試枓 4 C6 試 C7 試 7 C8 試 W8 C9 試 W 9 料 1 0 d ヒへノ 卜マンまたはテイスへンサ一
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは超高速て生体反応を検出 測定する手段を 方法を実現するための簡便てコンハク 卜な装置ノステムを なわち本発明は マイクロ流体チノフの固相基板に固定す 有効濃度か高く かつ固定された生体分子か高流速に曝さ 効濃度を保ったまま流出されないために 超高速て正確に 出する事を可能とする方法を提供するものてある。 本発明 板上に生体分子を固定化し 当該基板上にマイクロ流体チ 当該マイクロ流体チノフ上て当該生体分子と親和 を有 む流体を高速て移動させ 当該マイクロ流体チノフ上て当 能になるか 本発明において生体反応を超高速て測定する 相基板上に固定される生体分子の露出面積を大きくするこ い有効濃度を得られるようにすることか必要要件となる。 法としては 生体分子を基板上に多孔性構造を形成するよ る方法か好適てある。 また本発明の超高速測定において 高速て移動させても流出しないようにタンハク質を強固 定させる技術と （2)固相基板上に固定される生体分子の きく高い有効濃度にする技術 という 2つの要件を満たす れる。 かかる要件を満たす蛋白質の固定化技術として エ レーティホシション法は好適てある。
生体分子を基板上に多孔 14構造を形成するように固定す れに限定されるものてはないか エレク トロスフレーティ を採用することか好ましい。 生体高分子の固定化方法とし スフレ一ティホンンョ ン法は当業者に良く知られており イ ンクンェ ノ ト マイ ク ロコ ンタク トフ リ ンテイ ンク
Pavlovic E， Oscarsson S Recent advances in microconta
Anal Bioanal Chem 381 591-600, 2005) マイクロチャ た固定法 (Cesaro - Tadic S， Dernick G, Juncker D Buurman G H Michel B， Fat t inger C， Delamarche E High miniaturized immunoassays for tumor necrosis factor microf luidic systems Lab Chip 4 563-569 2004) なと かてきる。
本発明て使用する固定化基板としては 酸化イ ンン Indium Tin Oxide) て被覆加工したガラス板なと およひ 板表面にアルテヒ ト エホキン スクンエト マレイミ ト ァミノ カルホキンルなとの官能基て被覆されたものを用 ましい。 しかし固定化基板はそれに限定されるものてはな ルロースて被覆したスライ トガラスまたはフラスチノク基 超高速反応を高感度に検出するマイクロ流体チノフ装置 供するものてある。 本発明の装置ノステムは 生体分子を とマイクロチャンネルより構成されるマイクロ流体チノフ て移動させる手段を含む吸引または加圧回路 前記流体を せる手段と前記マイクロチャン不ルを接続する治具より構 本発明により 従来数分から数時間を要した生体分子の 時から数十秒に短縮し 生体分子反応を超高速て測定 分 可能となった。 なお本願明細書において 「超高速て生体分 する」 とは 0 01 秒から 60秒 好ましくは 0 1 秒から 20 しくは 0 1 秒から 1 0 秒という短時間て生体分子反応を測 意味するものてある。
なお本発明において採用する流体を移動させる流速は 1 500mm/秒 好ましくは 100mm/秒から 1 500mm/秒の高流速 の範囲に限定されるものてはない。 使用する流速はマイク 動させることを意味する。
本願発明を実施する目的て使用てきるマイクロ流体チノ に述へた特開 2002-243734号公報のマイクロチノフ 又は ノフを試験するへきサンフルや実験条件に応して適宜改 採用することかてきる。 しかし 本発明において使用され 体チノフはかならずしも特開 2002-243734号公報に記載さ 定されるものと解されるへきてなく 本発明の技術 S想の て他のマイクロチノフを使用することも可能てある。 なお おいて 「マイクロ流体チノフ」 という用語は当技術分野て れている意味てあり 具体的には数ミ リメ一トルから数セ 四方程度の基板上に 披検物質や試 Wを入れる穴と 太さ ら数百ミクロンの微細な流路を形成したものを意味する。
マイクロ流体チノフを用いて微細な流路上て生体反応 により 反応の効率か改善され 高感度且つ短時間て正確 本発明の方法に用いる装置ノステムの全体 0を 0 1 に示 システムは 生体分子を固定した基板 （0 1 における流体 c) とマイクロチャン不ル （0 1 における流体チノフ流路側 マイクロ流体チノフ 流体を高速て移動させる手段を含む 圧回路 （0 1 における真空ホンフ 2 0を含む吸引回路 2 1 ひ流体を高速て移動させる手段とマイクロチャン不ルを 1 0 — 1 7より構成される。 10種類の生体分子の試料 1か 類の生体分子 （試料 C 1 - C 10) を固定した 16チャン不ルの チノフからなる超高速分析ンステムを 1 に示したか チャン不ル数 ホンフンステムを含めて その記載は本発 ら限定するものてはない。
マイクロ流体チノフを流体チノフ治具 Aにセノ トし マ ノフと真空ホンフ 2 0を含む吸引回路 2 1 — 2 5を接続 なお流体チノフ治具 Aは 吸引回路と治具を接続するため 昇降ンール板 1 3 各治具を維持するための治具へース 1 フ注入口を押さえるための流体チノフ注入口側押さえ 1 5 昇降シール板 1 3をカイ 卜するための昇降用ガイ トヒン 1 フの固定及ひ接続をするためのンール 固定用圧縮スフリ 構成される。 しかし治具 Aの構成要素はこれらに限定され く 適宜改変を行なうことかてきる。
真空ホンフ 2 0 とマイクロ流体チノフ間の吸引回路には のハントハルフ 2 5 廃液回収用のトラノフ 2 4 吸引圧 力計 2 3 汚染防止用のフィルター 2 2 圧力制御用のレ 2 1か配管 2 6によって接続される。 正確な圧力制御を マイクロ流体チノフの排出口 b2 側にハン卜ハルフ 2 5と にレキュレーター 2 1 を設けた上て ハントハルブ 2 5 と チノフ排出口 b2の間の配管の距離をなるへく短くするこ 吸引回路内は常に真空ホンフ 2 0により減圧され レキュ マイクロ流体チノフの注入口 b l に注入された液は 真 により吸引圧制御下て一定の高流速て移動される。 真空ホ 引圧はマイクロ流体チノフ b (流路側） c (試 側） の構 さ 材質なとにより異なる。 0 1 に示したマイクロ流体チ 吸引圧は好ましくは- l kPa から- l OOkPa に制御されるか この範囲に規定されるものてはない。
また配管にはマイクロ流体チノフから排出された廃液 のトラ ノフ 2 4と トラノフ 2 4から漏れてた廃液か真空 入るのを防くフィルター 2 2を設けるのか望ましい。
マイクロ流体チノフの注入口 b l は 1 — 2 0 /X 1 の容量 するためのくぼみをもち 反応物溶液や洗净液は ヒへノ テイスへンサー d により滴下されるか マイクロ流体チノ 供給方法や注入口の形状はこの方法に限定されない。
マイクロ流体チノフて測定分析するために固定する生 子と生物学的な親和性を有する分子の間の反応を意味す そのような生体分子反応の具体例として 抗原と抗体の反 とヒォチンの反応 受容体と該受容体に対するリカントの 該酵素の基質の反応 DNA と蛋白質 DNA との反応 RNA との反応なとを挙けることかてきる。 本発明の方法におい うに生物学的な親和性を有する生体分子の一方を基板上に 方の生体分子を含む流体を高速て流すことにより マイク 上て生体分子反応を行なうことかてきる。
生体分子を固定化した後 後に流す被験サンフルなとか に非特異的に吸着することを防くために スキムミルクや ミンなとのタンハク質溶液を用いてフロ ノキンク反応を 本発明においても好ましい。
生体分子か固定化されたマイクロ流体チノフの流路内に リガント 基質なとの反応物溶液や冼净液を ホンフを用 チャンネルの構造や口径 長さ 材質 さらには生体分子 とにより異なる。 例として 0 1 に示したマイクロ流体チ 際の流速制御を 0 2に示す。 なお本発明において使用てき させるため手段は特に限定されるものてはなく 他の手段 ることかてきる。 そのような手段としては 吸引ホンフゃ とのホンフを用いる手段 振動を与える手段 遠心力を与 を挙げることかてきる。
生体分子反応の検出は 直接ないしは酵素標識抗体によ ように一段階から複数段階の反応を経て 吸光法 蛍光法 光偏光法 時間分解蛍光法 電気化学的測定法なとの種々 われる。 かく して 一段階から複数段階の反応 反応液の 連続的に流速制御下て進行し 反応を検出する。 各反応の により制御されるか それらの流速は反応の種類によって 反応液冼净も 高速流速下て瞬時に洗净することかてきる 載は本発明の範囲を何ら限定するものてはない。
(実施例 1 )
IT0 て被覆加工されたスライ トガラス基板上に 幅 1mm の線状の穴を開けた 0 1mm厚のガラス製のマスクを設置し ムノグロブリン G (IgG) (ンクマアルトリ ノチ） をエレク ティホシンョン装置を用いて lOOng噴霧した。 この基板上 ルンロキサン （PDMS) て作製したマイクロ流路を設置した した吸引ホンフノステムにセノ 卜した。
2% ECL アトハンスフロ ノキンクェーンェント - PBS 溶液 ク液） を 1チャン不ルあたり 10 1 lOkPa て流して瞬間 後 プロ ノキンク液て 800 ^g/ml に希釈したヘルォキシ夕 キ抗体 （シャクソン） を 10 1 15 6から 586mm/秒の高流 間的に流し 抗原抗体反応を行い チャン不ルをフロノキ て瞬間冼浄することて反応を停止した。 各条件 3チャン不 影した。 撮影画像における各スホノ 卜の発光強度はアレイ サー （日本ローハー） を用いて測定した。
各流速における 平均の結合比率 （発光強度） およひ単 の結合量をフロ ノ トした。 標準誤差をハーて表示した （0 3 a は流速と結合比率の関係を 03b は流速と単位当た 係を それそれ示す。 抗体 ^液の流速か早いほと IgGへの 結合比率は低下したか （03 a) 単位時間あたりの抗 IgG 流速に対し直線的に増加した （03b)。
(実施例 2)
実施例 1と同様に IT0基板上にァヒンン （ヮコ一） を lO 後 フロ ノキンク液て洗浄し 5 g/ml のヒォチン標識へ セ （シャクソン） を 5から 586mm/秒の流速て流し つた。 反応はチャン不ルをフロノキング液 20 1て冼净す した。 各条件 3チャン不ルずつ行い 各流速における結合 るほとヒォチンのァヒンンへの結合比率か低下したか （0 間あたりの結合量は直線的に増加した （04b)。
(実施例 3)
実施例 2と同様に IT0コート基板上に Alexa Fluor 56 識抗ャキ抗体 （モレキュラーフローブ） を エレク トロス ンンョン装置を用いて 250 lOOOngずつ （ 1スホノ トあた 噴霧した。 これにマイクロ流路をセノ トし フロ ノキンク 净した。 洗净は 20 1 のブロノキンク液を吸引ホンフシス て吸引することて 各条件 3チャン不ルずつ行った。 洗浄 路を外し 暗所内て BX51WI蛍光顕微鏡 （ォリン八ス） と冷 ホトニクス） を用いて蛍光観察した。 スホノ トの蛍光量は ナライサ一にて測定した。 各洗浄回数における蛍光量と 100%としたときの相対結合率の平均と標準誤差を求めた また 1スホノ トあたり 30ngスフレ一した蛍光標識タンハ ノ トあたり 8ngの条件 （黒丸） ては 高流速下て 4回冼净 低下かなく 蛍光標識抗体タンハク質の流出は認められな ホノ トあたり 30ng スフレ一した場合 （白四角） ては 一 蛍光か低下し テホシノ 卜した蛍光標識抗体の一部か流出 められたか 2回目以降の冼净において流出は検出されな エレク トロスフレ一された直後のタンハク質は径 10 数ナ ら百数十ナノメ一夕一径の拉子からなるの多孔質の形状に 後もこの形状は保たれていた （05下段）。
(実施例 4)
実施例 2と同様に IT0コート基板上に マウスの病原菌 トリシゥム ヒリ フオルメ （Clostridium piliforme) の リ大学 Research Animal Diagnost ic Laboratory) を lOOn スフレ一した後 マイクロ流路を基板上に載せ 吸引ホン セノ トした。 フロノキング液て洗浄後 抗 C pilifrome抗 を流した。 フロ ノキンク液て洗浄後 l tg/ml ヘルォキ
ProteinA (カルヒオケム） 10/z l を lOkPaて同様に吸引し 合した抗 C pilifrome抗体と結合させた。 そして実施例 2 化学発光により検出した。
その結果フ口 ノキンク液を流した場合のハノクグラウン 32に対し 陽性コントロールの発光は 204てあつた。 この 抗原と これに対する抗体の超高速の抗原抗体反応にあい クラウン卜に対し 6倍以上の有意なンクナルか得られた (実施例 5)
実施例 2と同様にしてァリルハイ トロカ一ホンレセフ夕 DRE認識配列を含む DNAを 基板上にエレク トロスフレ一 つた。 次にマイクロ流路をセノ トし 流路をブロ ノキン 夕ィォキンンを含む試料と Ahr およひ Ah レセフ夕一核
(Arnt) ^液を流路に流した そして基板上の DRE 配列 産業上の利用可能性
本発明により 少量のサンフルを用いて超高速て正確に 定 分析する方法か確立され 更には該方法を実現するた 卜て簡便なマイクロ流体装置か提供された。 本発明の方法 口流体装置によれは 生体分子を超高速て瞬時に正確に分 研究現場 製造現場や医療現場 環境モニタリングなとに 値か極めて大きい。

Claims

請 求 の 範 囲
基板上に生体分子を固定化し 当該基板上にマイクロ 設置し 当該マイクロ流体チノフ上て当該生体分子と る分子を含む流体を高速て移動させ 当該マイクロ流 当該生体分子と当該親和性を有する分子の間との生 行い 更に当該生体分子反応を検出することからなる 体分子反応を測定する方法。
前記生体分子を基板上に多孔 f生構造を形成するように 求項 1記載の方法。
エレク トロスフレーティホンンョン法て前記生体分子 化する請 *項 1 または請求項 2記載の方法
生体分子を固定化する前記基板か酸化ィンシゥム錫て ガラス盤てある請 *項 1ないし請 *項 3のいずれか 記載の方法。 前記生体分子か抗原または抗体てある請 *項 5記載の 流体を高速て移動させる手段か吸引ホンフあるいは加 る請求項 1ないし請求項 6のいずれか 1つの請求項記 生体分子反応を測定する前記マイクロ流体チノフ中の 移動させることを特徵とする 請 *項 1ないし請： *項 1つの請 *項記載の方法に用いるための装置システム 前記生体分子を固定した基板とマイクロチャン不ルよ マイクロ流体チノフ 流体を高速て移動させる手段を は加圧回路 前記流体を高速て移動させる手段と前記 ン不ルを接続する治具より構成される 請求項 8記載 ム
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