WO2007029689A1 - 抗原提示細胞の活性化処理方法 - Google Patents

抗原提示細胞の活性化処理方法 Download PDF

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cancer
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Mie Nieda
Manami Isogai
Masashi Takahara
Andrew Nicol
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Definitions

  • the present invention relates to an antigen-presenting cell co-sensitized with a bisphosphonate and a disease antigen.
  • the present invention also relates to a medicament containing the antigen-presenting cell, a therapeutic / preventive method using the rod-shaped cell, and a method for inducing immunocompetent cells using the antigen-presenting cell.
  • the present invention relates to an immunocompetent cell induced by the induction method, a medicament containing the immunocompetent cell, and a therapeutic / preventive method using the immunocompetent cell.
  • LAK Lymphokine Activated Killer
  • lymphocytes are activated by lymphokines outside the body and returned to the body
  • cytotoxic T cells that specifically recognize and damage lesions (Cytotoxic T cells) CTL therapy using Lymphocyte (hereinafter referred to as CTL) and rod cell therapy.
  • the aforementioned rod-shaped cell therapy uses a rod-shaped cell that is presented to MH C (Major Histocompatibility antigen Complex) after processing a disease antigen directly or in a cell.
  • the disease antigen to be presented include cancer antigen protein or peptide, infectious disease antigen protein or peptide, or a part thereof (see, for example, Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2).
  • Disease antigen-specific CTL can be induced in vitro (in vitro) by incubating rod cells and lymphocytes sensitized with a disease antigen and stimulating the lymphocytes with the rod cells.
  • a disease antigen for example, when a rod-like cell sensitized with a cancer antigen protein or peptide or an infectious disease antigen protein or peptide is used, the increase in the disease antigen CTL induced by a single mixed culture does not use the aforementioned rod-shaped cell. It is 5 to 20 times the case.
  • the induction efficiency of the disease antigen-specific CTL in vivo that is, It is known that the ratio of CTL to total lymphocytes increases to 2 to 14 times.
  • the rods in addition to sensitizing rod cells with disease antigens, the rods also contain drugs that react with Toll-like receptors (hereinafter referred to as TLR) on rod cells.
  • TLR Toll-like receptors
  • antigen presenting molecules other than MHC molecules on rod cells such as glycolipids on CD Id (Cluster Differ entiation Id) molecules
  • iNKT invariant Natural Killer T cells
  • This is a method for increasing the induction efficiency (adjuvant effect through immunocompetent cells other than disease antigen-specific CTLs, for example, see Non-Patent Document 5 and Non-Patent Document 6).
  • the disease antigen-specific CTL by the direct adjuvant effect through the TLR or the indirect adjuvant effect through the immunocompetent cells other than the disease antigen-specific CTL.
  • the increase in induction is about 4 times 6 times that in the case where these adjuvants are not used (in vitro). Therefore, development of a technique that can induce disease antigen-specific CTL more efficiently is desired.
  • Non-Patent Document 1 Blood 2004, 103,383-389
  • Non-Patent Document 2 Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98, 8809-8814
  • Non-Patent Document 3 Nat Rev Immunol. 2004, 4, 449-511
  • Non Patent Literature 4 Cancer Res. 2004, 64, 5461-5470
  • Non-Patent Document 5 J Clin Invest. 2004, 114, 1800-1811
  • Non-Patent Document 6 J Exp Med. 2002, 195, 617-624 Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and immunocompetent cells containing predominantly disease antigen-specific CD8 + CTL and / or 0 ⁇ ⁇ cells are selected in vivo and / or in vitro.
  • a method for activating antigen-presenting cells eg, rod-like cells
  • a medicament containing the activated antigen-presenting cells e.g, a treatment / prevention method using the activated antigen-presenting cells
  • Method for inducing immunocompetent cells including disease antigen-specific CD8 + CTL and Z or ⁇ sputum cells using the activated antigen-presenting cells, immunocompetent cells induced by the method, including the immunocompetent cells Provided are a medicine and a method for treatment and prevention using the immunocompetent cell.
  • the present inventors have studied to solve the above problems.
  • the proportion of disease antigen-specific CTL and ⁇ ⁇ ⁇ cells in total lymphocytes when sensitized with bisphosphonate in addition to sensitizing rod cells with disease antigen compared to when bisphosphonate was not added
  • the proportion of disease antigen-specific CTL in all lymphocytes is about 100 times higher and the proportion of ⁇ ⁇ ⁇ cells is about three times higher than without bisphosphonate.
  • Antigen-specific CTL can be about 90 times and ⁇ ⁇ cells can be about 6 times.
  • the present invention is not limited to these values. According to the present invention, further development of immune cell therapy that induces disease antigen-specific CD8 + CTL and ⁇ or ⁇ ⁇ cells to treat / prevent cancer and ⁇ or infection is promoted.
  • the present invention is as follows.
  • An antigen-presenting cell activation treatment method comprising the step of co-sensitizing the antigen-presenting cell with a bisphosphonate and a disease antigen
  • antigen-presenting cell activation treatment method wherein the antigen-presenting cell is selected from the group consisting of rod-shaped cells, immature rod-shaped cells, and artificial antigen-presenting cells,
  • the bisphosphonate is a compound represented by the following general formula (I), a salt thereof, and These hydrates,
  • R is a hydrogen atom or a lower alkyl group, and R and R are each
  • R and R examples include a halogen atom, a lower alkyl group, and a hydroxyl group.
  • a thiol group, an amino group, an alkoxy group, an aryl group, an aryl group, an aryloxy group, an alkylthio group, a cycloalkyl group, a heterocyclic group, and the like group force selected The antigen-presenting cell according to (1) or (2) Activation treatment method.
  • the bisphosphonate is selected from the group consisting of zoledronic acid, nomidronic acid, alendronic acid, risedronic acid, ibandronic acid, incadronic acid, etidronic acid, their salts, and their hydrates.
  • Kashi et al. (3) The activity of the antigen-presenting cell according to any one of V.
  • the concentration of the bisphosphonate in the sensitization is 0.001 to 20 i u M (1) to (4) The antigen-presenting cell activation treatment method according to any one of V,
  • the disease antigen is selected from the group consisting of cancer antigen or infectious disease antigen protein, peptide thereof, cell lysate of cancer cell or infectious disease cell, apoptotic cell, necrotic cell, and heat-treated product thereof.
  • the concentration of the disease antigen in the sensitization is 0.01 to 20
  • a method for producing an active antigen-presenting cell which comprises treating an antigen-presenting cell with the activation method described in any one of (1) to (9) V, Production method,
  • a pharmaceutical composition for cancer and Z or infection comprising the activated antigen-presenting cell according to (11),
  • An immunocompetent cell induction method comprising the following steps (i) and (ii):
  • the immunocompetent cell force to be induced The method for inducing an immunocompetent cell according to (16), comprising at least one of disease antigen-specific CD8 + CTL and ⁇ ⁇ cells,
  • the bisphosphonate is a compound represented by the following general formula (I), a salt thereof, and a hydrate thereof: Conversion:
  • R is a hydrogen atom or a lower alkyl group, and R and R are each
  • R and R examples include a halogen atom, a lower alkyl group, and a hydroxyl group.
  • the group force is selected from: a thiol group, an amino group, an alkoxy group, an aryl group, an aryl group, an aryloxy group, an alkylthio group, a cycloalkyl group, and a heterocyclic group Induction method of responsible cells.
  • the bisphosphonate is selected from the group power consisting of zoledronic acid, nomidronic acid, alendronic acid, risedronic acid, ibandronic acid, incadronic acid, etidronic acid, salts thereof, and hydrates thereof ( 16) to (19), the method for inducing immunocompetent cells described in any one of
  • the disease antigen is selected from the group consisting of cancer antigen or infectious disease antigen protein, peptide thereof, cell lysate of cancer cell or infectious disease cell, apoptotic cell, necrotic cell, and heat-treated product thereof.
  • (16) to (22) V the method for inducing an immunocompetent cell according to any one of the above
  • (24) The method for inducing immunocompetent cells according to any one of (16) to (23) V, wherein the concentration of the disease antigen in the sensitization is 0.01-20 8 ! 11,
  • a method for producing an immunocompetent cell comprising producing an immunocompetent cell comprising inducing the immunocompetent cell by the induction method according to any one of (16) to (25),
  • a pharmaceutical composition for cancer and epilepsy or infection comprising the immunocompetent cell according to (27),
  • (31) The method for preventing and treating cancer and epilepsy or infectious disease according to (30), wherein the antigen-presenting cell is autologous or derived from another family having the same HLA.
  • the bisphosphonate is a compound represented by the following general formula (I), a salt thereof, and a hydrate thereof,
  • R is a hydrogen atom or a lower alkyl group, and R and R are each
  • R and R examples include a halogen atom, a lower alkyl group, and a hydroxyl group.
  • An activation promoter for the antigen-presenting cells produced
  • the bisphosphonate is selected from the group consisting of zoledronic acid, nomidronic acid, alendronic acid, risedronic acid, ibandronic acid, incadronic acid, etidronic acid, their salts, and their hydrates (32) (34) V, an activation promoter for antigen-presenting cells when sensitized with the disease antigen described in any one of the above.
  • FIG. 1 is a graph showing an example of the results of measuring the ratio of A27L-specific CD8 + CTL.
  • the first 3 ⁇ 4-shaped cocoon production of the activated Kumahara presentation
  • the activated antigen-presenting cell of the present invention is an antigen-presenting cell co-sensitized with bisphosphonate and a disease antigen.
  • the antigen-presenting cells used in the present invention are not particularly limited.
  • immature rod cells In addition, mature rod cells, other antigen-presenting cells, artificial antigen-presenting cells, and mixtures thereof may be used. Among these, immature rod cells and mature rod cells are more preferable, and immature rod cells are more preferable. This is because immature rod cells can induce disease antigen-specific CTL and Z or ⁇ ⁇ cells more suitably when sensitized with bisphosphonate and disease antigen.
  • the artificial antigen-presenting cell is an artificially presented antigen-presenting cell that expresses, for example, at least major histocompatibility antigen ( ⁇ C) class I and costimulatory molecules (for example, CD80, CD86, etc.).
  • the artificial antigen-presenting cells may be those obtained by modifying a tumor-derived cell line to express MHC class I and costimulatory molecules as described above.
  • the cell lines include breast cancer-derived MDA-MB-231 (class I antigen HLA-A * 0201), renal cancer-derived TUHR10TKB (class I antigen HLA-A * 020lZA * 2402), gastric cancer-derived JR-st strain (class I antigen HLA-A * 2402) and the like. These cell lines can be obtained from, for example, ATCC and RIKEN BioResource Center.
  • the production of the artificial antigen-presenting cells is disclosed in US Publication No. US-2005-0048 646-A1, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
  • the bisphosphonate is not particularly limited and is an analog of pyrophosphate, in which P (O—P) of the pyrophosphate skeleton is substituted with C (carbon atom).
  • a compound examples of the bisphosphonate used in the present invention include a compound represented by the following general formula (I), a salt thereof, and a hydrate thereof.
  • R is a hydrogen atom or a lower alkyl group, and R and R are each
  • R and R may form part of the same cyclic structure.
  • R and R examples include a halogen atom, a lower alkyl group, and a hydride.
  • It is selected from the group consisting of oral xyl groups, thiol groups, amino groups, alkoxy groups, aryl groups, arylthio groups, aryloxy groups, alkylthio groups, cycloalkyl groups, heterocyclic groups and the like.
  • examples of the halogen atom include, for example, a fluoro atom, a black-atom atom, and an aromatic atom;
  • examples of the alkyl group include, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, pentyl, heptyl, octyl. , Straight chain or branched chain such as pentade group
  • aryl group for example, a phenyl, naphthyl group, etc .
  • aralkyl group for example, an aryl lower alkyl group, etc .
  • a cycloalkyl group for example, cyclooctyl, adamantyl, etc. C—C cycloalkyl group, etc .
  • bisphosphonates are preferred.
  • examples include bisphosphonates that have a bone resorption inhibitory action and are generally used as therapeutic agents for osteoporosis.
  • Examples include zoledronic acid, its salts and Z or their hydrates (eg sodium zoledronic acid hydrate (Zometa (trade name), Novartis Pharma)), pamidronic acid, its salts and Z or their hydrates.
  • the “disease” is not particularly limited, and examples thereof include cancer and infectious diseases.
  • the cancer is not particularly limited and includes any cancer, such as cancer that is difficult to treat (including precancerous conditions).
  • the infectious disease is not particularly limited, and examples thereof include viral infections such as AIDS and hepatitis B and C, cell infections, bacterial infections, fungal infections, and protozoal infections.
  • the form of the disease antigen used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include cancer antigens or infectious disease antigen proteins and peptides thereof. Examples of the disease antigen include cancer cell or infectious disease cell lysates, apoptotic cells, necrotic cells, and heat-treated products thereof.
  • any antigen can be used regardless of the type of cancer of the cancer antigen.
  • any cancer antigen such as prostate cancer, liver cancer or pancreatic cancer can be used.
  • the cancer antigen include those encoded by the MAGE gene family such as MAGE1, MAGE3, GAGE, BAGE and RAGE.
  • Other cancer antigens include, for example, cancer antigens caused by mutations in p53, K-ras, CDK4, and bcl-cabl gene products, and overexpression in cancer cells such as c-erb2 (neu) protein
  • cancer antigens and carcinogenic virus antigens such as HPV-16 E7 protein.
  • tumor fetal antigens such as carcinoembryonic antigen (CEA) and human fetoprotein (AFP), prostate specific antigen, and CD-10 (CALLA antigen) expressed on leukemia and lymphoma B cells. Minute antigens can also be used.
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • AFP human fetoprotein
  • CALLA antigen CD-10 expressed on leukemia and lymphoma B cells. Minute antigens can also be used.
  • infectious disease of the infectious disease antigen is not particularly limited, and among viral infectious diseases such as AIDS, hepatitis B, Epstein Barr virus (EBV) infection, HPV infection, etc. Intractable diseases are also included. Parasite antigens such as the malaria parasite sporozoide protein can also be used.
  • a synthetic peptide can be used as the disease antigen peptide.
  • cancer antigen protein or peptide for example, those listed in Tables 1 to 3 below can be used, and these can be easily used by those skilled in the art. Can be obtained or synthesized.
  • AIBP renal cancer CDC27 Melano EIF4EBP3 Linha'oma
  • CENF Breast cancer ETV6-AML1 Acute monocytic leukemia
  • APC Colorectal cancer etc. COR01A Brain tumor etc. GDF11 Brain tumor
  • BAZ2A Carcinoma DLG5 Brain tumor HDAC5 Large intestine, rectal cancer, etc.
  • bc “abl Chronic myeloid leukemia DNAJA1 Placenta HER2 / neu Breast cancer, Ovarian cancer, Gastric cancer
  • RPA2 Kidney cancer etc. SSP1 Liver cancer etc. U2AF1L2 Brain tumor
  • sensitizing an antigen-presenting cell with a substance refers to reacting the antigen-presenting cell with the substance.
  • the substance is directly applied on the surface of the antigen-presenting cell. Or to be presented indirectly.
  • co-sensitizing antigen-presenting cells means sensitizing antigen-presenting cells with two or more substances simultaneously, continuously, or intermittently.
  • Said substance is preferably bisphosphonate and Z or disease antigen.
  • the activation treatment method for antigen-presenting cells of the present invention and the method for producing activated antigen-presenting cells of the present invention will be described in detail based on the following example using rod-shaped cells as antigen-presenting cells.
  • the activation treatment of antigen-presenting cells refers to treatment including co-sensitization of antigen-presenting cells with bisphosphonate and a disease antigen as described above.
  • the preparation of antigen-presenting cells (in this example, rod-shaped cells) will be described.
  • the preparation of rod cells begins with obtaining a sample to obtain rod precursor cells.
  • peripheral blood, bone marrow fluid, umbilical cord blood and the like can be used.
  • Peripheral blood is preferably used in consideration of availability and low burden on patients. It is preferable to collect blood in such a volume that does not burden the provider.
  • a method for collecting blood collection of whole blood using a vacuum blood collection tube, a blood collection node, or the like can be used.
  • peripheral blood mononuclear cells it is possible to obtain peripheral blood mononuclear cells directly by using a method of collecting mononuclear cell components using a component blood collection device. You can add heparin and citrate so that the collected blood does not clot.
  • mononuclear cells containing progenitor cells of rod-shaped cells are separated from the collected blood.
  • any method for separating nucleated cells from erythrocyte power can be used.
  • methods utilizing Ficoll fractionation or Ficoll-Paque density gradients or elution are commonly used.
  • the collected cells are preferably washed several times with a medium, physiological saline, phosphate buffered saline (hereinafter referred to as PBS) or the like in order to remove platelets and the like.
  • PBS physiological saline
  • PBS phosphate buffered saline
  • monocytes (CD14 positive cells) that are progenitor cells of the rod-shaped cells are separated from the recovered mononuclear cells.
  • CD14 is known to be a marker expressed on monocytes, which are progenitor cells of rod cells. Therefore, Magnetic Cell using anti-CD14 antibody magnetic beads
  • Monocytes can be isolated and recovered using Sorting (Miltenyi Biotec, hereinafter referred to as MACS). This method is preferable because it is simple and the recovery rate of monocyte cells is high.
  • the recovered mononuclear cells are transferred to a culture flask and cultured at 34 ° C to 38 ° C, more preferably 37 ° C, 2% to 10%, more preferably 5% CO for 1 hour or longer.
  • AIM-V medium Invitrogen
  • RPMI-1640 medium Invitrogen
  • Dulbecco's modified Eagle medium Invitrogen, hereinafter referred to as DMEM
  • TIL Immuno-Biological Laboratories, Inc.
  • KBM epidermal keratinocyte medium
  • IMEM epidermal keratinocyte medium
  • immature rod cells are obtained by adding differentiation-inducing factors to the culture medium and culturing the precursor cells of the rod cells.
  • differentiation-inducing factors Any of the cytodynamics can be used as the differentiation inducing factor.
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • IL 4 interleukin 4
  • SCF stem self-actor
  • IL-13 tumor necrosis factor ⁇
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor ⁇
  • IL-1 IL-2
  • IL-3 IL-3
  • IL 4 a combination of GM-CSF and IL 4 can be used for efficient induction. Culture is performed at 34 ° C to 38 ° C, preferably 37 ° C, 2% to 10%, preferably 5% CO
  • the culture period is preferably 5-7 days.
  • PGE Prostaglandin E
  • IL-1 IL-2, IL3, etc.
  • Culturing is performed under conditions of 34 ° C to 38 ° C, preferably 37 ° C, 2% to 10%, preferably 5% CO, and the culture time is 24 to 4
  • hematopoietic stem cells (CD34 positive cells) were collected as progenitor cells of the rod-shaped cells, and GM-CSF, TNF-a and fit 3 ligand (FL), c-kit ligand (SCF), or thrombopoietin ( TPO) alone or a combination thereof is added to obtain immature rod cells or mature rod cells, or directly using a specific gravity solution such as Percoll from blood or peripheral blood mononuclear cells separated. A method for collecting the rod-shaped cell fraction can also be used.
  • the obtained antigen-presenting cells in this example, the immature rod cells or mature rod cells. Cells) with bisphosphonates and disease antigens.
  • the concentration of bisphosphonate is not particularly limited as long as it is a concentration that normally sensitizes cells with bisphosphonate.
  • the literature [The Journal of Immunology, 200 1, Vol. 166, 5508-5514, or Blood , 2001, Vol. 98, No. 5, 1616—161 8], 0. 001 M force and 20 M force, or even from 0.001 M to 5 ⁇ . Preferably there is.
  • the concentration of the disease antigen is not particularly limited as long as it is usually a concentration that sensitizes rod-shaped cells with the disease antigen.
  • a disease antigen protein or peptide as described above, the literature [Cancer Research, 1999, Vol. 59, 2167-2173, The Journal of Immunology, 1995, Vol. 154, 2257-2265, or The Journal of Immunology, 1994, 153, 996—1003] [This is described! Speaking] [0.01-20 g / mL is preferred, and 0.1-2 / ⁇ 8 It is preferable that ⁇ .
  • cancer cell or cancer cell line when sensitizing a rod-shaped cell with a cell group containing apoptotic cells and sputum or necrotic cells as a disease antigen, for example, 1) cancer cell or cancer cell line 2) Cancer cells or cancer cell lines are formed by UV irradiation (ljZcm 2 'sec for 2 minutes), 3) Cancer cells or cancer cell lines 85 A method of forming by heat treatment at 5 ° C for 10 minutes.
  • the activated antigen-presenting cells of the present invention (in this example, activated rod cells) prepared (produced) by the activation treatment method of the present invention are disease antigen-specific CD8 + CTL and Z Alternatively, immunocompetent cells that predominantly contain ⁇ ⁇ ⁇ cells can be efficiently induced.
  • the activated antigen-presenting cell of the present invention can induce immunocompetent cells that predominantly contain disease antigen-specific CTL and Z or ⁇ ⁇ cells. It can be used as a medicine. In particular, as a medicine, it is preferably used as a therapeutic / preventive agent for cancer and epilepsy or infectious diseases.
  • immunocompetent cells are recognized as antigen specificities including ⁇ cells, iNKT cells, ⁇ cells (Natural Killer Cells), B cells, monocytes, rod cells, macrophages and the like and Z Alternatively, it refers to a cell group capable of engaging in a specific immune reaction or a group of cells containing one or more of them.
  • disease antigen-specific CD8 + CTL and Z or ⁇ The predominance of T cells means that the ratio of disease antigen-specific CD8 + CTL and ⁇ or ⁇ ⁇ ⁇ cells and the number of ⁇ or cells are increased as compared with those before stimulation.
  • the activated antigen-presenting cell of the present invention when used in vitro, can be used as a composition capable of inducing immunocompetent cells containing predominantly disease antigen-specific CD8 + CTL and Z or ⁇ ⁇ cells. Is possible.
  • the active antigen-presenting cells of the present invention are superior to disease antigen-specific CD 8 + CTL and / or ⁇ ⁇ ⁇ cells after washing and removing free bisphosphonate and disease antigens when used in vivo. It can be used as a vaccine such as a rod-shaped cell vaccine that can induce immunocompetent cells contained in the above.
  • cyto force-in for example, IL-2
  • other proteins for example, albumin
  • the activated antigen-presenting cells (activated rod cells) obtained in the first embodiment described above are collected by a centrifugation method or the like.
  • the collected cells are washed.
  • physiological saline, PBS or the like As long as the liquid to be washed is isotonic and can be used as a medicine, it is possible to use a deviation.
  • physiological saline, PBS or the like it is preferable to use physiological saline, PBS or the like.
  • the collected rod-shaped cells can be used as a medicament by being suspended in physiological saline.
  • serum components such as albumin and cyto force-in can be added as necessary.
  • the medicament is preferably used as a therapeutic / preventive agent for cancer and Z or infectious diseases.
  • the present invention includes the use of the active antigen presenting cells of the present invention for the manufacture of a medicament for cancer and Z or infection.
  • the activated antigen-presenting cell of the present invention obtained in the first embodiment described above (activated rod-shaped cell) ), Or by administering the medicament of the present invention obtained by the second embodiment, it is possible to treat / prevent cancer and Z or infectious diseases.
  • the number of cells to be administered can be appropriately selected according to the administration method and the patient's condition, and is not particularly limited. Usually, it is preferably 10 6 to 10 8 per person in a single administration, more preferably 10 7 Z or more.
  • the number of doses varies depending on the patient's condition, but usually 4 to 6 doses are taken as one course.
  • the administration interval depends on the number of rod cells to be administered and is not particularly limited. It is usually preferred to be once a week to once a month, and if the number of rod cells to be administered is 5 x 10 6 once every 2 weeks and 2 x 10 7 or more Administration once a month is preferred.
  • the method of administration is not particularly limited, but it can be injected intravenously, subcutaneously, intradermally, directly into the regional lymph node, directly into the lesion, or administered systemically as an infusion It is also possible. Alternatively, arterial forces near the lesion can be injected.
  • These disease antigen-specific CTLs and ⁇ or ⁇ ⁇ ⁇ cells are cytokines such as interferon ⁇ (hereinafter referred to as IFN y) that directly kill cancer cells and infected cells. Since these cells can be indirectly injured through the blood, it can be effectively used for prevention of various treatments such as cancer and infectious diseases.
  • IFN y interferon ⁇
  • Advantages of using the activated antigen-presenting cell of the present invention as a vaccine include the following. That is, when a rod-shaped cell sensitized with only a conventional disease antigen is used as a vaccine, only the disease antigen-specific CD8 + CTL is activated.
  • the vaccine of activated antigen-presenting cells of the present invention can also activate ⁇ cells in addition to the activity of disease antigen-specific CD8 + CTL.
  • these disease antigen-specific CD8 + CTLs and cyto force-in induced from ⁇ or ⁇ ⁇ ⁇ cells activate helper ⁇ cells, ⁇ cells, iNKT cells (invariant Natural Killer T Cells) and B cells. You can do it.
  • the humoral and cellular immune systems throughout the living body are activated, and as a result, it is possible to improve the treatment and prevention effect.
  • the antigen-presenting cells used for the treatment of active ivy are derived from the patient's self or It is preferably derived from another family with the same HLA. This is because when administered to a patient, the function can be exhibited without being excluded by the patient's own immunity.
  • the method for inducing immunocompetent cells of the present invention is a method for inducing immunocompetent cells containing predominantly disease antigen-specific CD8 + CTL and ⁇ or ⁇ ⁇ cells, more specifically, bisphosphonate and disease.
  • An induction method comprising a step (i) of sensitizing antigen-presenting cells with an antigen and a step (ii) of culturing the antigen-presenting cells and lymphocytes in a mixed manner simultaneously with or after the sensitization.
  • immunocompetent cells include T cells, iNKT cells, NK cells, B cells, monocytes, rod cells, macrophages, etc., as described above, and recognize the specificity of antigens and Z or specific. ⁇ Cells that have the ability to participate in immune responses, or cells that contain one or more of these.
  • an antigen-presenting cell for example, a rod-shaped cell
  • the antigen-presenting cells and the reaction cells are seeded in a culture vessel and mixed and cultured (step (ii)).
  • disease antigen-specific stimulation from the antigen-presenting cells treated with the activity can be activated and the disease antigen-specific CD8 + CTL in the reaction cells can be activated.
  • ⁇ in the reaction cell is stimulated by an IPP dsopente nyl diphosphate (isopenterylphosphate) -like molecule presented on the antigen-presenting cell surface by inhibition of the antigen-presenting cell metabolic system by sensitization with bisphosphonate.
  • ⁇ cells can be activated.
  • IFN y produced from ⁇ ⁇ cells can help further activation and proliferation of the disease antigen specific CD8 + CTL.
  • the reactive cells here are, for example, human lymphocytes, and preferably mononuclear cells derived from peripheral blood. This reactive cell is preferably autologous or derived from another family with the same HLA.
  • the culture vessel is not particularly limited, and culture plates, petri dishes, flasks, nogs, etc. that are usually used in the field can be used.
  • the concentration at which each cell group is seeded can be freely set depending on the situation.
  • the mixed culture of the rod-shaped cell and the reactive cell includes for example, it can be cultured using AIM-V medium.
  • AIM-V medium commercially available media used for cell culture such as RPMI-1640 medium, DMEM, TIL, KBM, and IMEM can be used. Further, 5% to 20% of bovine serum, FBS, serum such as human plasma, cytodynamic force etc. may be added as necessary.
  • the culture is performed at 34 ° C to 38 ° C, preferably 37 ° C, for example, under CO conditions of 2% to 10%, preferably 5%.
  • the period is not particularly limited, but is preferably 5 to 21 days, and more preferably 7 to 14 days.
  • the number of rod cells and reaction cells to be seeded can be set according to the container to be seeded and the application. Further, the mixing ratio of the rod-shaped cells and the reaction cells can be appropriately set according to the situation, and is not particularly limited.
  • the ratio of reaction cells to rod cells is preferably 20: 1 to 2: 1.
  • the immunocompetent cells of the present invention that predominantly contain ⁇ cells.
  • the immunocompetent cells of the present invention obtained in this way can be stimulated directly or repeatedly with the activated antigen-presenting cells of the present invention, so that a higher proportion of the disease antigen-specific CD 8 + CTL and Z or ⁇ It can be used for immune cell therapy as immunocompetent cells including ⁇ sputum cells, and can be expected to have higher therapeutic and preventive effects against cancer and infectious diseases.
  • the advantage of preparing the immunocompetent cells of the present invention in vitro is that cancer cells and infectious cells can be directly killed by repeatedly stimulating reactive cells with the activated antigen-presenting cells of the present invention. Large amount of immunocompetent cells can be easily prepared.
  • the immunocompetent cells of the present invention which predominately contain the disease antigen-specific CD8 + CTL and Z or ⁇ sputum cells obtained in the fourth embodiment described above, are collected by centrifugation or the like. .
  • the collected cells are washed.
  • the liquid to be washed is isotonic, and any liquid can be used as long as it can be used as a medicine.
  • physiological saline, PBS or the like it is preferable to use physiological saline, PBS or the like in consideration of administration to a patient.
  • the immunocompetent cells that predominantly contain the recovered disease antigen-specific CD8 + CTL and ⁇ or ⁇ ⁇ ⁇ cells It becomes possible to use as a medicine by being suspended in physiological saline.
  • the medicament is particularly preferably used as a therapeutic / preventive agent for cancer and Z or infectious diseases. Therefore, as a related embodiment, the present invention includes the use of an active antigen-presenting cell of the present invention for the manufacture of a medicament for cancer and Z or infection.
  • the number of cells to be administered can be appropriately selected according to the administration method and the patient's condition, and is not particularly limited. Usually, it is preferable that the number of doses per administration is 10 8 to 10 12 Z people, more preferably 10 9 Z people or more. The number of doses varies depending on the patient's condition, but usually 4 to 6 doses are given as one course.
  • the administration interval is not particularly limited, but it is preferable to administer it once every two weeks or once a month, for example.
  • the method of administration is not particularly limited, but it can be injected by intravenous, subcutaneous, intracutaneous injection, direct injection into regional lymph nodes, direct injection into the affected area, or as a systemic infusion. It can also be administered.
  • the immunocompetent cell of the present invention is preferably derived from the patient's own origin or from another family with the same HLA. This is because, when administered to a patient, it can perform its function without being excluded by the patient's own immune system.
  • Seventh embodiment an agent for accelerating the activation of cells that are presented by Kyubara when sensitizing in disease
  • the activation promoter for antigen-presenting cells when sensitized with the disease antigen of the present invention contains bisphosphonate as an active ingredient.
  • the activation promoter may further comprise a pharmaceutically acceptable excipient and / or carrier.
  • the activation promoter is used when sensitizing antigen-presenting cells with a disease antigen in vivo and / or ex vivo, that is, sensitization with a disease antigen. It can be added at the same time as sensitizing with a disease antigen before and after sensitizing with Z or disease antigen.
  • Another aspect of the present invention is the use of a bisphosphonate for the production of an activity promoter for antigen-presenting cells when sensitized with a disease antigen.
  • the present invention provides treatment for cancer and Z or infection using bisphosphonate.
  • HLA-A * 0201 Healthy donor strength Peripheral blood was collected in 30 mL. Mononuclear cells were also obtained from the peripheral blood pressure of this healthy person. At this time, the mononuclear cell layer was recovered using a specific gravity solution for blood cell separation. The recovered cell force was washed several times with AIM-V supplemented with 10% FBS to remove platelets and the like, and then CD14-positive cells were isolated as monocyte components by MACS.
  • the surface antigens of the rod-shaped cells obtained by the preparation were detected using a flow cytometer (Epics XL-MCL, Beckman Coulter).
  • the target antibody was added to a suspension of the cells to be measured in PBS, followed by staining at 4 ° C for 15 minutes in the dark.
  • As the antibody PE-labeled anti-CD14 antibody, anti-CD83 antibody, and anti-HLA-DR antibody (Beckman Coulter) were used. Each antibody isotype was used as a negative control. Stained cells are washed with PBS and measured with Epics XL'MCL. It was.
  • cells cultured with GM-CSF and IL-4 showed CD14, CD83 negative, and HLA-DR positive, confirming that they were immature rod cell populations.
  • Example 1 3 Preparation of rod-shaped cells and reaction cells sensitized with Zometa (trade name) and disease antigen peptide>
  • Zometaron (trade name) (amino acid phosphonate), Zoledronic acid, becomes 0.01 ⁇ in a suspension of immature rod cells or mature rod cells derived from peripheral blood prepared as described above.
  • the cells were cultured for about 12 hours.
  • the cells used were rod-shaped cells cultured without adding Zometa (trade name) and antigenic peptide.
  • CD14 negative cell population mainly T cell population
  • DMSO foxoxide
  • Example 1 4 Analysis of properties of immunocompetent cells induced by rod-shaped cells sensitized with Zometa (trade name) and disease antigen peptide>
  • PE-labeled A27L tetramer (MBL) was first added to cells washed with PBS after culturing. After staining for 15 minutes at room temperature in the dark, FITC-labeled anti-CD8 antibody (BD Pharmingen) was added, and stained at 4 ° C for 15 minutes in the dark. The isotype of each antibody was used for control. Epics XL'MCL was used for cell measurement, and Epics32 was used for analysis of measurement results.
  • Table 4b and Fig. 1 show the results of a t-test performed by conducting the same experiment with an increasing number of subjects.
  • the proportion of CD8 + CTL obtained using rod-shaped cells sensitized with A27L and Zometa is higher than the proportion of CD8 + CTL obtained using rod-shaped cells sensitized with A27L alone. was found to be significantly different.
  • Example 2-1 Analysis of the properties of immunocompetent cells induced by co-culturing rod-like cells and reaction cells that are sensitized in the presence of Zometa (trade name) and A27L>
  • Peripheral blood-derived immature rod cells or mature rod cells prepared in Example 1 were seeded on a 24-well plate (SUMILON) at 1 ⁇ 10 5 cells each in a total volume of 1 mL.
  • Zometa trade name
  • an amino bisphosphonate agent to a concentration of 0.01 M
  • Z or A27L to a final concentration of 2 / z gZmL.
  • the proportion of ⁇ ⁇ ⁇ cells was calculated using FITC-labeled anti-TCR V ⁇ 9 antibody, ⁇ -labeled anti-TCR pan a / jS antibody, and PC5-labeled anti-CD3 antibody (all Beckman Coulter) . These antibodies were added to the cultured cells washed with PBS, and stained at 4 ° C for 15 minutes in the dark. For each negative control, the isotype of each antibody was used. Epics XL'MCL was used for cell measurement, and Epics32 was used for analysis of measurement results.
  • y ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ can be obtained by co-cultivating lymphocytes and sympathetic cells in the presence of 0.01 ⁇ Zometa (trade name) and A27L. An increase in cell induction was also confirmed.
  • the number of cells was calculated by multiplying the total number of cells by the ratio.
  • Example 2-2 IFN y production ability of immunocompetent cells induced by co-cultivating coagulated rod-shaped cells and reactive cells in the presence of Zometa (trade name) and A27L Analysis> Subsequently, the IFN y producing ability of the immunocompetent cells induced by the above mixed culture was analyzed as follows.
  • the number of cells indicates per well of an assay plate.
  • preculture of mixed culture cells only and preculture of rod cells and A27L alone were also performed.
  • the culture volume was adjusted to 100 / zL per lwell.
  • 300 L of culture was performed for 3 wells. After blocking, the cells that had been pre-cultured under each condition were seeded at 100 L / well, 3 wells on a plate washed with PBS, and cultured at 37 ° C under 5% CO. cultured cells from well
  • Piotin-labeled anti-IFN- ⁇ antibody for detection (clone: 7—B6-1, MABTECH ELISpot for Human Interferon - ⁇ kit) is diluted to 1 ⁇ gZmL with PBS containing 0.5% FBS and added to 100 ⁇ LZwell. Caro. The plate was left at room temperature for 2 hours. The plate was washed 5 times with 200 LZwell PBS. Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase (MABTECH ELISpot for Human Interferon— ⁇ kit) was diluted 1: 1000 with PBS containing 0.5% FBS, and 100 LZwell was added. The plate was left at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed 5 times with 200 LZwell of PBS.
  • BCIP / NBTplus substrate solution (Wako) was added at 100 ⁇ L / wel 1 and allowed to stand until a spot was confirmed in the dark. When spots were confirmed with the naked eye, they were thoroughly washed with distilled water. After confirming that the membrane of the plate was dry, the number of spots was measured using an ELISPot reader (AID Autoimmun Diagnostika GmbH), and the data was analyzed with AID software version 3.1 (AID).
  • the MART-1-positive melanoma-derived cancer cell line was collected in a 15 mL tube (BD Falcon) and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. The pelleted cell line was suspended in 10 mL of AIM-V medium, centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, and washed. The washing operation was repeated twice. The cell lines collected in this way were resuspended in AIM-V to 1 X 10 6 cells ZmL. Add 10 ⁇ camptothecin (sigma) to the cell suspension and grow for 24 hours at 37 ° C and 5% CO
  • the cultured cells were collected in a 15 mL tube and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes.
  • the pelleted cell line is suspended in 10 mL of AIM-V medium, centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, and washed. did. The washing operation was repeated twice. Cells obtained by centrifugation and washing were used as apoptotic cells.
  • Zometa (trade name), an aminobisphosphonate agent, was added to the suspension of immature rod cells.
  • the mixture was added to a volume of 01 ⁇ , and a cancer cell line containing the same amount of apoptotic cells as the rods or rod cells was added, and mixed and cultured for about 24 hours.
  • apoptotic cells and rod cells cultured for about 24 hours and rod cells cultured without adding Zometa (trade name) or apoptotic cells were used.
  • the mature rod-shaped cells obtained here were used as stimulating cells.
  • the remaining cells (CD14 negative cell population, mainly T cell population) after isolation of CD14 positive cells for the preparation of rod cells as reactive cells, 10% FBS, 10% dimethyl sulfoxide Cells frozen and stored in AIM-V medium supplemented with (DMSO) were thawed, washed and used. Culturing was performed under conditions of about 37 ° C and 5% CO. 20 UZmL IL-2 was added to this mixed culture solution.
  • Peripheral blood-derived immature rod cells prepared in Example 1 were seeded in a 48-well plate at 1 ⁇ 10 5 Zwell.
  • MART1 antigen peptide A27L (ELAGIGILTV) was added to each well as a disease antigen peptide to a final concentration of 2 ⁇ gZmL.
  • Zometa (trade name) (Novartis), an aminobisphosphonate agent, was added as zoledronic acid to a concentration of 0.01 ⁇ and prepared with no addition.
  • IX 10 6 lymphocytes from the same donor to Zwell and mix with rod cells at 37 ° C and 5% CO.
  • Lymphocytes on days 13 to 17 after the start of mixed culture were collected.
  • HLA-A * 0201 positive, MARTl-positive human melanoma cells 3 ⁇ 4 ⁇ COCB were labeled with PKH-26 (Sigma) to obtain target cells.
  • the collected lymphocytes were used as effector cells, mixed so that the effector cells: target cells were 5: 1 or 20: 1, and seeded in a 24-well plate. Incubation was performed for 4 hours at 37 ° C and 5% CO.
  • Table 9 below shows the percentage of A27L antigen-specific CD8 + CTL induced by active donor cells co-sensitized with A27L and Zometa for 2 donors, tetramer positive cells.
  • 1 shows the results of measuring the mean fluorescence intensity (MFI) and the percentage of apoptosis cells (%) at which Mn is detected.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • % percentage of apoptosis cells
  • lymphocytes 13 to 17 days after the start of culture are used as effector cells (E), and MART-1 positive and HLA-A * 0201-positive human melanoma cell lines are used as target cells (T) for mixed culture.
  • E effector cells
  • T target cells
  • the effector cell: target cell ratio of 5: 1 or 20: 1 the lymphocytes stimulated with active rods sympathized with A27L and Zometa were It showed higher target cell toxicity than lymphocytes stimulated with rod-shaped cells sensitized with A27L alone.
  • BMLF1 EBV antigen peptide B MLFl
  • the remaining cells (CD14-negative cell population, mainly T-cell population) after isolation of CD14-positive cells for the preparation of rod-shaped cells as reaction cells, which are 10% FBS, 10% dimethyl Cells that had been suspended and cryopreserved in AI M-V medium supplemented with sulfoxide (DMSO) were thawed, washed and used.
  • BMLF1-specific CD8 + CTL disease antigen-specific CD8 + CTL
  • PE-labeled BMLF1 tetramer (MBL) was first added to cells that had been cultured and washed with PBS. After staining for 15 minutes at room temperature in the dark, FITC-labeled anti-CD8 antibody (BD Pharmingen) was added and stained at 4 ° C for 15 minutes in the dark. The isotype of each antibody was used for control. Epics XL'MCL was used for cell measurement, and Epics32 was used for analysis of measurement results.
  • MDA-MB-231 (class I antigen HLA-A * 0201) was transfected with the human CD80 gene, a costimulatory molecule, by the lipofussion method.
  • Example 6-2 Artificial antigen co-sensitized with Zometa (trade name) and disease antigen peptide Analysis of properties of immunocompetent cells induced by presenting cells>
  • the artificial antigen-presenting cells prepared as described above were added to the suspension of MDA-MBZCD80.
  • Zometa (trade name) (Novartis), a phosphonate, was added as zoledronic acid to a concentration of 0.01 ⁇ M or 1 ⁇ , and at the same time, MART-1 antigen peptide A27L (ELAGIGILTV) was finally used as a disease antigen peptide.
  • the mixture was added to a concentration of 2 / z gZmL, and cultured at 37 ° C under 5% CO for about 12 hours.
  • Zometa (trade name) (Novartis), a phosphonate, was added as zoledronic acid to a concentration of 0.01 ⁇ M or 1 ⁇ , and at the same time, MART-1 antigen peptide A27L (ELAGIGILTV) was finally used as a disease antigen peptide.
  • the mixture was added to a concentration of 2 / z gZmL, and culture
  • activated MDA-MB ZCD80 cells co-sensitized with bisphosphonate and disease antigen peptide, MDA-MBZCD80 cells sensitized with either, and MDA-MBZCD80 cells not sensitized with either were used as stimulating cells.
  • the remaining cells CD14-negative cell population, mainly T cell population, HLA-A * 0201
  • CD14-positive cells were isolated for the preparation of rod cells as described above.
  • the cells that had been suspended and stored frozen in AIM-V medium supplemented with 10% FBS and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) were thawed, washed and used.
  • the active antigen-presenting cells of the present invention induce disease antigen-specific CD8 + CT L very efficiently compared to the rod-shaped cells sensitized with only conventional peptides.
  • it can be used as a composition for inducing disease antigen-specific CD8 + CTL and Z or ⁇ ⁇ cells.

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Abstract

疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を含む免疫担当細胞をｉｎ　ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて効率よく誘導させることができる活性化抗原提示細胞、該活性化抗原提示細胞を含む医薬、該活性化抗原提示細胞を用いた治療・予防方法、該活性化抗原提示細胞を用いて誘導された疾病抗原特異的ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を含む免疫担当細胞の誘導方法、該方法によって誘導された免疫担当細胞、該免疫担当細胞を含む医薬、及び該免疫担当細胞を用いた治療・予防方法の提供。抗原提示細胞を疾病抗原で感作するのに加えて、ビスホスホネートで共感作することにより、ビスホスホネートで共感作しない場合に比較して、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞の割合及び細胞数を増加させることができる。

Description

明 細 書
抗原提示細胞の活性化処理方法
技術分野
[0001] 本発明はビスホスホネートと疾病抗原で共感作した抗原提示細胞に関する。また本 発明は、該抗原提示細胞を含む医薬、該榭状細胞を用いた治療 ·予防方法、該抗 原提示細胞を用いた免疫担当細胞の誘導方法に関する。更に本発明は、該誘導方 法によって誘導された免疫担当細胞、該免疫担当細胞を含む医薬、該免疫担当細 胞を用いた治療 ·予防方法に関する。
背景技術
[0002] がんの治療方法としては手術による切除、放射線、抗がん剤を用いた化学療法が 行われている。近年ではそれらの療法以外にも様々な治療方法が研究され、実用化 されて 、る。その中の一つに免疫細胞を利用した免疫細胞療法がある。
[0003] 免疫細胞療法には、リンパ球を体外でリンフォカインにより活性ィ匕して体内に戻す L AK (Lymphokine Activated Killer)療法、病変を特異的に認識'傷害する細胞 傷害性 T細胞（Cytotoxic T Lymphocyte、以下、 CTLと記す）を用いた CTL療 法、及び、榭状細胞療法等が含まれる。
[0004] 前記榭状細胞療法は、疾病抗原を直接又は細胞内でプロセッシングした後に MH C (Major Histocompatibility antigen Complex、主要組織適合抗原複合体） に提示させた榭状細胞を用い、体内で病原を選択的に攻撃する疾病抗原特異的 C TLを誘導し、治療を行う療法である。提示させる前記疾病抗原には、例えば、がん 抗原蛋白若しくはペプチド、感染症抗原蛋白若しくはペプチド、又はその一部が含ま れる (例えば、非特許文献 1、非特許文献 2参照)。
[0005] 疾病抗原で感作した榭状細胞とリンパ球を混合培養して榭状細胞でリンパ球を刺 激することにより in vitro (体外)で疾病抗原特異的 CTLを誘導できる。例えば、が ん抗原蛋白若しくはペプチド又は感染症抗原蛋白若しくはペプチドを感作した榭状 細胞を使用した場合、 1回の混合培養で誘導される疾病抗原 CTLの増加は、前記 榭状細胞を使用しない場合に比べて 5〜20倍である。 [0006] がん抗原蛋白若しくはペプチド又は感染症抗原蛋白若しくはペプチドを感作した 榭状細胞を用いた榭状細胞療法では、 in vivo (体内）の疾病抗原特異的 CTLの誘 導効率、すなわち、全リンパ球に占める CTLの割合力 2〜 14倍まで上昇することが 知られている。
[0007] 榭状細胞による疾病抗原特異的 CTLの誘導効率を高めることにより榭状細胞療法 の効果を一層良好なものにするため、現在、主に 2つの方法が行われている。
[0008] 1つは、榭状細胞を疾病抗原で感作するのに加えて、さらに榭状細胞上の Toll様 受容体 (Toll like receptor、以下 TLRと記す）と反応する薬剤等を榭状細胞に反 応させて榭状細胞の抗原提示能力を高めることにより、直接的に疾病抗原特異的 C TLの誘導効率を高める方法である (TLRを介してのアジュバント効果、例えば、非特 許文献 3、非特許文献 4参照)。他方は、榭状細胞を疾病抗原で感作するのに加え て、榭状細胞上の MHC分子以外の抗原提示分子、例えば CD Id (Cluster Differ entiation Id)分子上に糖脂質等のようなものを提示させて疾病抗原特異的 CTL 以外の iNKT (invariant Natural Killer T cells)等を含む免疫担当細胞を活 性化し、この活性化した免疫担当細胞を介して間接的に疾病抗原特異的 CTLの誘 導効率を高める方法である（疾病抗原特異的 CTL以外の免疫担当細胞を介しての アジュバント効果、例えば、非特許文献 5、非特許文献 6参照)。
[0009] し力しながら、上記の TLRを介しての直接的なアジュバンド効果、又は疾病抗原特 異的 CTL以外の免疫担当細胞を介しての間接的なアジュバント効果による疾病抗 原特異的 CTL誘導の上昇は、これらのアジュバントを用いない場合に比べ 4倍力 6 倍程度である (in vitro) oしたがって、さらに効率よく疾病抗原特異的 CTLを誘導 できる技術の開発が望まれている。
非特許文献 1 : Blood 2004, 103,383- 389
非特許文献 2 : Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98, 8809-8814 非特許文献 3 : Nat Rev Immunol. 2004, 4, 449- 511
非特許文献 4: Cancer Res. 2004, 64, 5461 - 5470
非特許文献 5 : J Clin Invest. 2004, 114, 1800—1811
非特許文献 6 :J Exp Med. 2002, 195, 617-624 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、疾病抗原特異的 CD8 + CTL及 び/又は 0 δ Τ細胞を優位に含む免疫担当細胞を in vivo及び/又は in vitro〖こ ぉ ヽて効率よく誘導させるための抗原提示細胞 (例えば、榭状細胞等)の活性化処 理方法、該活性化抗原提示細胞を含む医薬、該活性化抗原提示細胞を用いた治療 •予防方法、該活性化抗原提示細胞を用 Vヽた疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び Z 又は γ δ Τ細胞を含む免疫担当細胞の誘導方法、該方法によって誘導された免疫 担当細胞、該免疫担当細胞を含む医薬、及び該免疫担当細胞を用いた治療，予防 方法を提供する。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは上記課題を解決するために研究を行った。その結果、榭状細胞を疾 病抗原で感作するのに加えてビスホスホネートで共感作すると、ビスホスホネートを添 カロしない場合に比べ、疾病抗原特異的 CTL及び γ δ Τ細胞の全リンパ球に占める 割合及び細胞数が著しく増加することを見出し、本発明を完成した。例えば、ビスホ スホネートの添加することにより、添加しない場合に比べて全リンパ球に占める疾病 抗原特異的 CTLの割合が約 100倍また γ δ Τ細胞の割合が約 3倍高くなり、細胞数 として疾病抗原特異的 CTLが約 90倍、 γ δ Τ細胞が約 6倍になりうる。ただし、本発 明は、これらの数値に限定されない。本発明によれば、疾病抗原特異的 CD8 + CT L及び Ζ又は Ί δ Τ細胞を誘導してがん及び Ζ又は感染症を治療 ·予防する免疫細 胞療法のさらなる発展が促される。
[0012] すなわち、本発明は以下の通りである。
[0013] (1)抗原提示細胞の活性化処理方法であって、ビスホスホネートと疾病抗原で前記 抗原提示細胞を共感作する工程を含むことを特徴とする抗原提示細胞の活性化処 理方法、
(2)前記抗原提示細胞が、榭状細胞、未成熟榭状細胞、人工抗原提示細胞からな る群から選択される（1)記載の抗原提示細胞の活性化処理方法、
(3)前記ビスホスホネートが下記一般式 (I)で表される化合物、その塩、及び、それ らの水和物であって、
[化 1]
Figure imgf000006_0001
上記式 (I)中、 Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、 Rと Rは、それぞれ
1 2
独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、ァリール 基又は置換されたァリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキ ルァミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択 され、又は Rと Rは同じ環状構造の一部を形成し、
1 2
上記 Rと Rにおける置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基
1 2
、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、ァリール基、ァリールチオ基、ァリールォキシ 基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基等力 なる群力 選択される（1 )又は（2)記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
(4)前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、ノ ミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン 酸、ィバンドロン酸、インカドロン酸、ェチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水和 物からなる群カゝら選択される (1)カゝら (3) Vヽずれかに記載の抗原提示細胞の活性ィ匕 処理方法、
(5)前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、 0. 001〜20 iu Mでぁる（ 1)から (4) Vヽずれかに記載の抗原提示細胞の活性化処理方法、
(6)前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、 0. 001〜5 /ζ Μである（5 )記載の抗原提示細胞の活性化処理方法、
(7)前記疾病抗原が、がん抗原又は感染症抗原蛋白、そのペプチド、がん細胞又 は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及び、それらの 熱処理物からなる群から選択される (1)カゝら (6) Vヽずれかに記載の抗原提示細胞の 活性化処理方法、
(8)前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、 0. 01〜20
Figure imgf000007_0001
から（7) Vヽずれかに記載の抗原提示細胞の活性化処理方法、
(9)前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、 0. 1〜2 μ gZmLである（8)記 載の抗原提示細胞の活性化処理方法、
(10)活性ィ匕抗原提示細胞の生産方法であって、 (1)から（9) V、ずれかに記載の活 性化処理方法で抗原提示細胞を処理することを含む活性化抗原提示細胞の生産方 法、
(11) (10)記載の生産方法により生産された活性ィ匕抗原提示細胞、
(12)がん及び Z又は感染症のための医薬組成物であって、（11)記載の活性化抗 原提示細胞を含む医薬組成物、
(13)前記抗原提示細胞が、自己由来又は HLAを同じくする他家由来である（12) 記載の医薬組成物、
(14)がん及び Z又は感染症の予防'治療方法であって、（11)記載の活性化抗原 提示細胞を投与することを含む予防，治療方法、
(15)前記抗原提示細胞が、自己由来又は HLAを同じくする他家由来である（14) 記載の予防'治療方法。
(16)免疫担当細胞の誘導方法であって、下記工程 (i)及び (ii)を含むことを特徴と する免疫担当細胞の誘導方法；
(i) ビスホスホネートと疾病抗原で抗原提示細胞を共感作する工程、
(ii)前記共感作と同時又はその後に、前記抗原提示細胞とリンパ球とを混合培養す る工程、
(17)誘導される免疫担当細胞力 疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び γ δ Τ細胞 の少なくとも一方を含む（16)記載の免疫担当細胞の誘導方法、
(18)前記抗原提示細胞が、榭状細胞、未成熟榭状細胞、人工抗原提示細胞から なる群から選択される（ 16)又は（ 17)記載の免疫担当細胞の誘導方法、
(19)前記ビスホスホネートが下記一般式 (I)で表される化合物、その塩、及び、そ れらの水和物であって、 化:
Figure imgf000008_0001
上記式 (I)中、 Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、 Rと Rは、それぞれ
1 2
独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、ァリール 基又は置換されたアルキル基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキ ルァミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択 され、又は Rと Rは同じ環状構造の一部を形成し、
1 2
上記 Rと Rにおける置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基
1 2
、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、ァリール基、ァリールチオ基、ァリールォキシ 基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基力 なる群力 選択される（16) から（18)いずれかに記載の免疫担当細胞の誘導方法。
(20)前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、ノ ミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロ ン酸、ィバンドロン酸、インカドロン酸、ェチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水 和物からなる群力 選択される（ 16)から（ 19) 、ずれかに記載の免疫担当細胞の誘 導方法、
(21)前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、 0. 001〜20 /ζ Μである (16)から（20) V、ずれかに記載の免疫担当細胞の誘導方法、
(22)前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、 0. 001〜5 iu Mでぁる（ 21)記載の免疫担当細胞の誘導方法、
(23)前記疾病抗原が、がん抗原又は感染症抗原蛋白、そのペプチド、がん細胞 又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及び、それら の熱処理物からなる群から選択される（16)から（22) V、ずれかに記載の免疫担当細 胞の誘導方法、 (24)前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、 0. 01〜20 8 !11しでぁる（1 6)から（23) V、ずれかに記載の免疫担当細胞の誘導方法、
(25)前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、 0. 1〜2
Figure imgf000009_0001
（24) 記載の免疫担当細胞の誘導方法。
[0015] (26)免疫担当細胞の生産方法であって、（16)から（25)いずれかに記載の誘導 方法により免疫担当細胞を誘導することを含む免疫担当細胞の生産方法、
(27) (26)記載の生産方法により生産された免疫担当細胞、
(28)がん及び Ζ又は感染症のための医薬組成物であって、（27)記載の免疫担当 細胞を含む医薬組成物、
(29)前記抗原提示細胞が、自己由来又は HLAを同じくする他家由来である（28) 記載のがん及び Ζ又は感染症のための医薬組成物、
(30)がん及び Ζ又は感染症の予防'治療方法であって、（27)記載の免疫担当細 胞を投与することを含む予防'治療方法、
(31)前記抗原提示細胞が、自己由来又は HLAを同じくする他家由来である（30) 記載のがん及び Ζ又は感染症の予防'治療方法。
[0016] (32)ビスホスホネートを有効成分として含有する疾病抗原で感作する際の抗原提 示細胞の活性化促進剤、
(33)前記抗原提示細胞が、榭状細胞、未成熟榭状細胞、人工抗原提示細胞から なる群から選択される（32)記載の疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化 促進剤、
(34)前記ビスホスホネートが下記一般式 (I)で表される化合物、その塩、及び、そ れらの水和物であって、
[化 1]
Figure imgf000010_0001
上記式 (I)中、 Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、 Rと Rは、それぞれ
1 2
独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、ァリール 基又は置換されたァリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキ ルァミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択 され、又は Rと Rは同じ環状構造の一部を形成し、
1 2
上記 Rと Rにおける置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基
1 2
、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、ァリール基、ァリールチオ基、ァリールォキシ 基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基力 なる群力 選択される（32) 又は（33)記載の疾病抗原で感作した抗原提示細胞の活性化促進剤、
前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、ノ ミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、 ィバンドロン酸、インカドロン酸、ェチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水和物か らなる群力 選択される (32)から（34) V、ずれかに記載の疾病抗原で感作する際の 抗原提示細胞の活性化促進剤。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1]図 1は、 A27L特異的 CD8 + CTLの割合を測定した結果の一例を示すグラフ である。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 第一の ¾施形餱：活件化杭原提示細朐の作製
まず、本発明の活性化抗原提示細胞につ ヽて詳説する。
[0019] 本発明の活性化抗原提示細胞とはビスホスホネート及び疾病抗原で共感作した抗 原提示細胞である。
[0020] 本発明に用いる前記抗原提示細胞は、特に制限されず、例えば、未成熟榭状細胞 、成熟榭状細胞、その他の抗原提示細胞、人工抗原提示細胞及びそれらの混合物 のいずれを用いてもよい。その中でも、未成熟榭状細胞及び成熟榭状細胞が好まし ぐより好ましくは、未成熟榭状細胞である。ビスホスホネートと疾病抗原とで共感作し た場合には未成熟榭状細胞のほうがより好適に疾病抗原特異的 CTL及び Z又は Ύ δ Τ細胞を誘導させることができるためである。また、前記人工抗原提示細胞とは、人 為的に作製した抗原提示細胞であって、例えば、少なくとも主要組織適合抗原 (ΜΗ C)クラス I及び補助刺激分子 (例えば、 CD80、 CD86など）を発現させるよう遺伝子 工学的に作製した細胞が挙げられる。さらに、前記人工抗原提示細胞は、腫瘍由来 の細胞株を上述のように MHCクラス I及び補助刺激分子を発現するよう改変したもの であってもよい。前記細胞株の例としては、乳がん由来の MDA-MB-231 (クラス I抗 原 HLA-A*0201)、腎がん由来の TUHR10TKB (クラス I抗原 HLA-A*020lZA *2402)、胃がん由来の JR-st株（クラス I抗原 HLA-A*2402)等が挙げられる。これ らの細胞株は、例えば、 ATCCや RIKEN BioResource Center等から入手でき る。前記人工抗原提示細胞の作製については、米国公開公報 US— 2005— 0048 646— A1に開示され、この引用によりその内容の全体がここに組み込まれる。
[0021] 本発明において、ビスホスホネートとは、特に制限されず、ピロリン酸のアナログで あって、ピロリン酸骨格の P— O— Pの O (酸素原子)を C (炭素原子)で置換したィ匕合 物をいう。本発明に用いるビスホスホネートは、例えば、下記一般式 (I)で表される化 合物、その塩、及び、それらの水和物が挙げられる。
[0022] [化 1]
Figure imgf000011_0001
[0023] 上記式 (I)中、 Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、 Rと Rは、それぞ
1 2
れ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、置換さ れていてもよいァリール基、置換されていてもよいアルキル基、低級アルキルアミノ基 、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、また
Rと Rは同じ環状構造の一部を形成してもよい。
1 2
上記 Rと Rにおける置換基としては、例えば、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒド
1 2
口キシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、ァリール基、ァリールチオ基、ァリ ールォキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基等からなる群から選 択される。
[0024] 本明細書において、ハロゲン原子としては、例えば、フルォロ原子、クロ口原子、臭 素原子等；アルキル基としては、例えば、メチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブ チル、ペンチル、ヘプチル、ォクチル、ペンタデ力-ル基等の直鎖又は分枝鎖 C
1
C アルキル基等;低級アルキル基としては、例えば、直鎖又は分枝鎖 C C アル
30 1 10 キル基等；ァリール基としては、例えば、フエ-ル、ナフチル基等；アルアルキル基と しては、例えば、ァリール 低級アルキル基等；シクロアルキル基としては、例えば、 シクロォクチル、ァダマンチル等の c—C シクロアルキル基等;複素環式基としては
1 10
、ピリジル、フリル、ピロリジ -ル、イミダゾリル、キノリル、イソキノリル基等をそれぞれ 示す。
[0025] また、本発明において、ビスホスホネートは、薬学的に許容されるものが好ましぐ 例えば、骨吸収抑制作用を有し、一般的に骨粗鬆症治療薬として使用されるものが 挙げられる。その例として、ゾレドロン酸、その塩及び Z又はそれらの水和物（例えば ゾレドロン酸ナトリウム水和物（Zometa (商品名）、ノバルティスファーマ））、パミドロン 酸、その塩及び Z又はそれらの水和物（例えばパミドロン酸ニナトリウム ·五水和物（ Aredia (商品名）、ノバルティスファーマ））、アレンドロン酸、その塩及び Z又はそれ らの水和物（例えばアレンドロン酸ナトリウム三水和物（Onclast (商品名）、萬有製薬 ) )、リセドロン酸、その塩及び Z又はそれらの水和物（例えばリセドロン酸ナトリウム水 和物）、ィバンドロン酸、その塩及び Z又はそれらの水和物（例えばィバンドロン酸ナ トリウム）、インカドロン酸、その塩及び Z又はそれらの水和物（例えばインカドロン酸 ニナトリウム）、ェチドロン酸、その塩及び Z又はそれらの水和物（例えばェチドロン 酸ニナトリウム）等が挙げられる。これらの中で、とりわけゾレドロン酸、ノ ミドロン酸、了 レンドロン酸、それらの塩及び Z又はそれらの水和物が好まし 、。
[0026] 本発明で使用する疾病抗原において、前記「疾病」とは、特に制限されないが、例 えば、がんや感染症等である。前記がんとしては、特に制限されず、あらゆるがんを 含み、例えば、治療が困難であるがん (前がん状態を含む)等が挙げられる。前記感 染症としては、特に制限されず、例えば、エイズ、 B型 'C型肝炎等のウィルス感染症 や、細胞感染、細菌感染、真菌感染、若しくは、原虫による感染症等が挙げられる。 本発明において使用する疾病抗原の形態は特に制限されず、例えば、がん抗原又 は感染症抗原蛋白及びそのペプチドが挙げられる。また、前記疾病抗原としては、 例えば、がん細胞又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス 細胞、及び、それらの熱処理物を使用できる。
[0027] 前記疾病抗原ががん抗原である場合、そのがん抗原のがんの種類は問わず、どの ような抗原も用いることができる。例えば、前立腺がん、肝がん、すい臓がん等のどの ようながん抗原であっても利用できる。前記がん抗原としては、例えば、 MAGE1、 M AGE3、 GAGE, BAGE及び RAGE等の MAGE遺伝子ファミリーにコードされるも のが挙げられる。他のがん抗原としては、例えば、 p53、 K-ras、 CDK4及び bcl-c-a bl遺伝子産物等の変異により生じるがん抗原、 c-erb2 (neu)蛋白等のがん細胞で 過剰発現されるがん抗原、および、 HPV- 16の E7蛋白等の発がんウィルス抗原等 が挙げられる。さらに、がん胎児抗原 (CEA)やひ-フエトプロテイン (AFP)等の腫瘍 胎児抗原、ならびに、前立腺特異的抗原や、白血病およびリンパ腫の B細胞で発現 する CD- 10 (CALLA抗原)等の分ィ匕抗原も使用することができる。
[0028] また、感染症抗原の感染症の種類も、特に制限されず、例えば、エイズや B型 型 肝炎、ェプスタインバーウィルス（EBV)感染症、 HPV感染症等のウィルス性感染症 の中でも難治性疾患も挙げられる。また、マラリア原虫のスポロゾイド周囲蛋白のよう な寄生虫の抗原も用いることができる。
[0029] また、本発明では前記疾病抗原ペプチドとして合成ペプチドを用いることができる。
これにより、自己のがん組織等力 採取したがん抗原を使用する場合と比べて患者 の負担を少なくすることが可能となる。前記がん抗原蛋白又はペプチドとしては、例 えば、下記表 1〜3に記載のものが使用でき、これらは、当該分野の当業者が容易に 入手又は合成できる。
[0030] [表 1]
(表 1 )
抗原名 がん種 抗原名 がん種 抗原名 がん種
AARS 胎盤 BMS1 L 骨髄腫 DUSP12 胎盤腫
ABL1 繊維芽細胞腫 BMX 前立腺がん他 DYH1 B 肝がん
ACADVL 盤腫 BRD2 Tリン /、。腫 EBP 肝がん
ACLT7B 脳腫蕩 BTG3 子宮がん EBV-BMLF1 Bリンハ11腫他
ACP2 リンハ°腫 C210RF2 肺がん他 EBV-EBNA- 2,3,4,6 Bリン Λ。腫他
ACVR2B 脳腫瘍 CALU ケラチノサイト EDF-1 膝がん
ADPRT 繊維芽細胞腫 CARHSP1 胎盤腫 EEF1G 肝がん他
ADSL 脳腫瘍 CASP-8 扁平上皮癌 EEF2
AF6 骨髄腫 CCN1 脳腫 EF1 D 皮虜がん他
AFP 肺がん CCT8 骨髄腫 EGLN1 扁桃がん
AGPAT2 ^がん CD43 腎がん EIF3S6IP 脳腫瘍,子宮頸がん他
AIBP 腎がん CDC27 メラノ EIF4EBP3 リンハ'腫
AI 1 肝がん CDC2L5 ク'リゎ'ラスト EIF4G2 胎盤腫他
AKAP9 M里癌 CDIPT こうがん ela2 急性リン Λ球性 0血病
ALDA 繊維芽細胞腫 CDK4 メラノ—マ E S1 乳がん
ALDOA 繊維芽細胞腫 CEA 大腸がん他 EPHB2 胃がん他
ALOX12B 脳腫瘍他 CENF 乳がん ETV6-AML1 急性単球性白血病
ALPHA NAC脳腫瘍 CENPB 子宮がん FBLN1 脳腫瘍
AMHR2 こラがん CHD3 胸腺腫 FBX07 塍がん
ANT3 脳腫瘍、肺がん他 CKAP1 骨髄腫 FDFT1 肝がん
ANXA11 亍ラトカルシノ CUC6 消化器がん FH 脳腫瘍
ANXA2 各種がん Cし K3 子宮頸がん FKSG1 1 乳がん
AP1 G2 肝がん CLN6 肺がん FNBP3 皮虜がん
AP1 1 肝がん CNTF 肺がん他 FXYD5 骨髄腫
AP2M1 骨髄腫 COG8 子宮がん GAGE3,4,5t6,7B メラノ-マ、各種癌
AP3D1 肉腫他 COPB2 肺がん GCC2 リン 腫
APC 大腸がん他 COR01A 脳腫瘍他 GDF11 脳腫瘍
APEXL2 肺がん他 COTL1 胎盤他 GUPR1 ゲリオ-マ
ARL1 膀胱がん CSDA 胎盤 GNB3 flP9腫瘍
ARL6IP 骨髄腫 CTAG1 メラノ—マ GNG4 脳腫揚
A隱し 1 M里傷 CTAG2 メラノーマ GOA4 胃がん"
ASNA1 子宮がん CTAGE-1 こうがん GOLGA1 子宮頸がん,こうがん
ATF3 肉腫 CTNNA1 大腸がん他 GOT1 肝がん
ATIC 肝がん CUL5 こうがん gp100 メラノ—マ
ATP5B 胎盤 DAD1 脳腫痕 GRB7 肺がん他
ATRX 各種がん DCTN1 脳腫揚 GTF2H2 皮慮がん他
BAG5 脳腫瘍 DDX5 肉腫 GTF2I 子宮頸がん
BAGE メラノ—マ、各種癌 DKFZP434N0735脳腫瘍 GUCY2D 網膜腫
BASP1 脳腫瘍 DKFZP434P1 12 こうがん H2AFY 肺がん他
BAZ1A 子宮頸がん DKFZP564C236 脳腫攝 HC58 肝がん
BAZ2A こうがん DLG5 脳腫瘍 HDAC5 大腸、直腸がん他 bc「abl 慢性骨髄性白血病 DNAJA1 胎盤 HER2/neu 乳がん、卵巣がん，胃がん
BIRC2 肝がん DNAJA2 皮膚がん HKF1 脳腫瘃
BIRC3 肝がん DNAJB1 胎盤腫 HMGA2 肝がん
B AL2 脳腫瘍 DSP 皮膚がん HMGN1 骨髄腫
[0031] [表 2]
Figure imgf000015_0001
3]
(表 3)
抗原名 がん種 抗原名 がん種 抗原名 がん種
PSMD9 肉腫 SLC25A2 こうがん T F1 子宮頸がん、膝がん
PSME3 肺がん他 SLC25A27 脳腫瘍 TNKS2 乳がん
PTMS 腎がん SLX13 脳腫瘍 TNNT1 肉腫
PTTG 脳腫瘍 SMTN 大腸がん TOP2B 各種がん
QPRT 脳腫瘍、脳、腎、肉腫他 SNN 腫瘍 TP53BP2 各種がん
RAB5C 肺がん他 SNT-1 子宮がん TPD52 乳がん
RAGE 肾がん SNX6 各種がん TPI1 肝がん
RAN 脳腫痕 SOX1 fd TPM1 肝がん
ras 膝がん大腸がん、肝がん他 SOX2 脳腫瘍 TRAPPC1 子宮がん
RASSF1 膝がん SPN 胥がん他 TRP1 ,2 メラノーマ
RB 10 肺がん骨髄腫 SR+89 肺がん TSTA3 肺がん
RB 6 肺がん SRP19 肝がん他 TTC12 '腫
RGS19IP1 肺がん他 SSA1 胸腺腫他 TXNRD1 膝がん他
RNF12 背がん SSA2 皮膚がん tyrosinase メラ マ
RNPC2 肝がん SSNA1 こうがん U2AF1L1 脳腫瘍
RPA2 腎がん他 SSP1 肝がん他 U2AF1L2 脳腫癢
RPL10 乳がん SSSCA1 子宮がん UBE1 胎盤
RPL10A 皮腐がん SSX1 繊維芽細胞腫 UBE2D2 こうがん
RPL21 大腸がん SSX4 膀胱がん他 UBQLN2 肺がん
RPL27A 大腸がん ST13 大腸がん UE3A ケラチノサ仆
PL3 大腸がん STARD10 大腸がん UN1 乳がん、肺がん、胃がん他
RPL30 乳がん STARD7 子宮がん他 USH1 C 大腸がん
RPL32 腎がん STIP1 肺がん USP1 こうがん
PL34 子宮がん STK11 肝がん他 USP10 骨髄腫
RPL37A 脳腫瘍 STM 腫 ½ USP16 こうがん
RPS15A 大腸がん STX4A 各種がん USP19 脳腫瘍
RPS18 胎盤腫 SUCLA2 肝がん他 USP32 脳腫瘍
RSN 単球性白血病 SULT1A3 脳腫瘍他 USP4 脳腫瘍
RUVBL1 大腸、直腸がん SURF5 肺がん、皮虜がん他 VCL 子宮がん
SART-1 各種がん SYCP1 こうがん VEGFB 繊維芽細胞腫
SATB1 肺がん TADA3L 各種がん VESPR 皮膚がん
SBDS 子宮がん TAF10 肝がん他 VPS45A 脳腫瘍
SCNN1A 腎がん他 TAF7 皮膚がん WT1 各種白血病、各種がん
SCP1 こうがん TBC1 D1 脳腫瘍他 YARS 肺がん他
SGP2 肝がん TBC1 D4 脳腫瘍 YWHAE 肝がん他
SCR3 肺がん TBC1 D5 骨髄腫 ZFP36し 2 Τ細胞性白血病
SDBCAG84孚しがん TCE1 腎がん ZIC2
SEC14L1 肺がん他 TCEB3 肺がん ZNF202 こうがん
1一 Sep 乳がん TCF4 胸腺腫 ZNF232 赤芽球
SFRS5 大腸がん TDRD3 胎盤腫 ZNF282 τ '球性白血病
SGPL1 脳腫瘍 TEL-A L1 急性単球性白血病 ZNF292 胎盤腫
SIN3A 脳腫瘍 TGFBI がん -力亍 メラノ
SK-Br-3 乳がん TIAF1 乳がん 抗体ィ亍'ィ才タイ Βリンハ '腫
SLC22A17 脳腫瘍 TI P3 腎がん
SLC25A11 脳腫殤 TKT 肝がん
[0033] 本発明にお ヽて、抗原提示細胞をある物質で感作するとは、抗原提示細胞をその 物質と反応させることをいい、好ましくは、前記物質を抗原提示細胞の表面上に直接 的に又は間接的に提示させることをいう。また、抗原提示細胞を共感作するとは、同 時、連続的、又は断続的に 2以上の物質で抗原提示細胞を感作することをいう。前記 物質は、好ましくは、ビスホスホネート及び Z又は疾病抗原である。
[0034] 次に、本発明の抗原提示細胞の活性化処理方法、及び、本発明の活性化抗原提 示細胞の生産方法を、榭状細胞を抗原提示細胞として用いた下記一例に基づき詳 説する。本発明において、抗原提示細胞の活性化処理とは、上述のとおり、抗原提 示細胞をビスホスホネート及び疾病抗原で共感作することを含む処理をいう。 [0035] まず、抗原提示細胞 (この例では、榭状細胞)の調製にっ 、て説明する。榭状細胞 の調製は、榭状細胞の前駆細胞を得るための試料を取得することから始める。前記 試料としては末梢血、骨髄液、臍帯血等が利用できる。入手の容易さ、患者への負 担の少なさを考慮して末梢血を利用することが好ましい。採血量は提供者の負担とな らない程度の量を採血するのが好ましい。採血する方法としては、真空採血管、採血 ノ ッグ等による全血採取を利用することができる。また、多量の細胞を確保する必要 がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取する方法を用いれば、 直接末梢血単核球を入手することが可能である。上記採取した血液には凝固が起こ らな 、ようにへパリンやクェン酸をカ卩えてもょ 、。
[0036] 次に、採取した血液から榭状細胞の前駆細胞を含む単核細胞を分離する。分離す る方法としては、有核細胞を赤血球力も分離するいかなる方法を用いることもできる。 例えばフイコール分画つまりフィコールパック（Ficoll— Paque)密度勾配又は溶出を 利用する方法が一般的に使用される。なお、回収した細胞は血小板等を除去するた めに培地、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（以下、 PBSと記す)等を用いて数回 洗浄することが好ましい。
[0037] 次に、回収した単核細胞から、榭状細胞の前駆細胞である単球 (CD14陽性細胞） を分離する。 CD14は榭状細胞の前駆細胞である単球に発現して 、るマーカーとし て知られている。そのため、抗 CD14抗体マグネットビーズを用いた Magnetic Cell
Sorting (Miltenyi Biotec、以下、 MACSと記す）を利用して単球を単離.回収 できる。この方法は、簡単でかつ単球細胞の回収率が高いため好ましい。あるいは、 回収した単核細胞を培養フラスコに移し， 34°C〜38°C、より好ましくは 37°C、 2%〜 10%、より好ましくは 5%COの条件下で 1時間以上培養し、付着細胞を榭状細胞の
2
前駆細胞として用いる方法等を使用してもょ 、。
[0038] その後、得られた榭状細胞の前駆細胞から未成熟榭状細胞あるいは成熟榭状細 胞への分化誘導を行う。培養のための培地として AIM— V培地（インビトロジェン）を 使用する。また AIM— V培地のほかに、 RPMI— 1640培地（インビトロジェン）、ダル べッコ改変イーグル培地 (インビトロジェン、以下、 DMEMと記す）、 TIL (株式会社 免疫生物研究所）、表皮角化細胞培地 (コージンバイオ株式会社、以下、 KBMと記 す）、イスコフ培地 (インビトロジ ン、以下、 IMEMと記す)等、細胞培養に使用され ている市販の培地を使用することができる。また、必要に応じて 0. 5〜20%の牛血清 、牛胎児血清 (以下、 FBSと記す)、ヒト血清、ヒト血漿等を添加することができる。
[0039] 未成熟榭状細胞を得る場合、培養培地に分化誘導因子を添加して榭状細胞の前 駆細胞を培養することにより未成熟榭状細胞を得る。分化誘導因子としてはサイト力 イン類のいずれを使用することもできる。例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激 因子（以下、 GM— CSFと記す）、インターロイキン 4 (以下、 IL 4と記す。他のインタ 一ロイキンについても同様に記す）、ステムセルフアクター（以下、 SCFと記す）、 IL— 13、腫瘍壊死因子 α (以下、 TNF— αと記す)等が、効率よく未成熟榭状細胞を誘 導できる。また、必要に応じて IL—1、 IL— 2、 IL— 3等を添加することが好ましい。よ り好ましくは GM— CSFと IL 4との組合せを用いると効率よく誘導することが可能で ある。培養は、 34°C〜38°C、好ましくは 37°C、 2%〜10%、好ましくは 5%CO条件
2 下で行い、培養期間は 5〜7日間が好ましい。
[0040] また、成熟榭状細胞を得る場合には、培養開始後 5〜7日目にさらなる分化誘導因 子を添加して更に培養する。分ィ匕誘導因子としてはサイト力イン類の 、ずれを使用す ることもできるが、例えば、 GM— CSF、 IL 4、 SCF、 IL— 1 j8、 IL— 6、 IL 13、 T NF— α、プロスタグランジン E (以下、 PGEと記す)等で効率よく成熟榭状細胞を誘
2 2
導することが好ましい。必要に応じて IL—1、 IL— 2、 IL 3等の添加することが好ま しい。より好ましくは GM— CSF、 IL— 4、 IL— 6、 IL—Ι β、 PGE及び TNF— aの
2
組合せを用いると効率よく誘導することが可能である。培養は、 34°C〜38°C、好まし くは 37°C、 2%〜10%、好ましくは 5%CO条件下で行い、培養時間としては 24〜4
2
8時間が好ましい。
[0041] また、榭状細胞の前駆細胞として造血幹細胞 (CD34陽性細胞）を回収し、 GM- CSF、 TNF- aと fit 3リガンド（FL)、 c— kitリガンド（SCF)、又はトロンボポェチ ン (TPO)を単独、又はこれらの組合せで添加し、未成熟榭状細胞又は成熟榭状細 胞を得る方法や、血液又は末梢血単核球を分離したものからパーコール等の比重液 を用いて直接榭状細胞分画を回収する方法も利用することができる。
[0042] 次に、得られた抗原提示細胞 (この例では、前記未成熟榭状細胞又は成熟榭状細 胞）をビスホスホネートと疾病抗原で共感作する。
[0043] ビスホスホネートの濃度は通常細胞をビスホスホネートにより感作する濃度であれば よぐ特に限定はされないが、例えば、文献 [The Journal of Immunology, 200 1, Vol. 166, 5508— 5514、又は、 Blood, 2001, Vol. 98, No. 5, 1616— 161 8]に記載されているように 0. 001 M力ら 20 Mであること力 子ましく、さらには 0. 001 Mから 5 μ Μであることが好ましい。
[0044] 疾病抗原の濃度は、通常榭状細胞を疾病抗原により感作する濃度であればよぐ 特に限定はされない。例えば、上述のような疾病抗原蛋白又はペプチドの場合、文 献 [Cancer Research, 1999, Vol. 59, 2167— 2173、 The Journal of Imm unology, 1995, Vol. 154, 2257— 2265、又は、 The Journal of Immunolo gy, 1994, 153, 996— 1003]【こ記載されて!ヽるよう【こ、 0. 01〜20 g/mLであ ることが好ましぐさらには 0. 1〜2 /ζ 8ΖπΛであることが好ましい。
[0045] また、疾病抗原としてアポトーシス細胞及び Ζ又はネクローシス細胞を含む細胞群 で榭状細胞を感作する場合、前記細胞群の調製方法として、例えば、 1)がん細胞又 はがん細胞株を培養し自然発生的に形成させる、 2)がん細胞又はがん細胞株に対 し UV照射（ljZcm2' secを 2分間）して形成させる、 3)がん細胞又はがん細胞株を 8 5°C、 10分間熱処理をして形成させる方法等が挙げられる。
[0046] このような本発明の活性化処理方法により調製 (生産)された本発明の活性化抗原 提示細胞 (この例では、活性化榭状細胞）は、疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び Z 又は γ δ Τ細胞を優位に含む免疫担当細胞を効率よく誘導することができる。例え ば、 in vitro及び in vivoのいずれの場合でも、本発明の活性化抗原提示細胞は、 疾病抗原特異的 CTL及び Z又は Ί δ Τ細胞を優位に含む免疫担当細胞を誘導す ることができる医薬として使用することができる。特に、医薬としては、がん及び Ζ又 は感染症の治療 ·予防剤用途が好ましい。本発明において、免疫担当細胞とは、 Τ 細胞、 iNKT細胞、 ΝΚ細胞（Natural Killer Cell)、 B細胞、単球、榭状細胞、マ クロファージ等を含む、抗原の特異性を認識したり及び Z若しくは特異的免疫反応 に携わったりする能力がある細胞、又は、これらの 1種類若しくは 2種類以上を含む細 胞群をいう。また、本発明において、疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び Z又は Ύ δ T細胞を優位に含むとは、刺激前に比較して疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び Ζ又 は γ δ Τ細胞の割合及び Ζ又は細胞数が増加することをいう。本発明の活性化抗原 提示細胞は、 in vitroで使用する場合、疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び Z又は Ύ δ Τ細胞を優位に含む免疫担当細胞誘導させることができる組成物として利用す ることが可能となる。また、本発明の活性ィ匕抗原提示細胞は、 in vivoで使用する場 合、遊離ビスホスホネート及び疾病抗原を洗浄、除去したのち、疾病抗原特異的 CD 8 + CTL及び/又は γ δ Τ細胞を優位に含む免疫担当細胞を誘導させることができ る榭状細胞ワクチンなどのワクチンとして使用可能である。また、本発明の活性化抗 原提示細胞を in vitro又は in vivoで用いるいずれの場合にも、必要に応じて、例 えば、サイト力イン (例えば IL— 2)やその他の蛋白（例えばアルブミン)等を併用して ちょい。
[0047] 第二の ¾施形餱:本発明の活件化杭原提示細q 含む疾
次に、本発明の活性ィ匕抗原提示細胞を用いた医薬について、上述と同様に、榭状 細胞を抗原提示細胞として用いた一例に基づき説明する。
[0048] まず、前述の第一の実施形態で得られた活性化抗原提示細胞 (活性化榭状細胞） を遠心分離法等によって回収する。次に、回収した前記細胞を洗浄する。洗浄する 液体としては等張であり、医薬品として用いることできる液体であれば 、ずれを用いる ことも可能である。この後、患者に投与することを考えると、生理食塩水、 PBS等を利 用することが好ましい。そして、回収された榭状細胞は生理食塩水に懸濁されること で医薬として用いることが可能となる。また、必要に応じてアルブミン等の血清成分や サイト力インを添加することができる。特に、当該医薬としてはがん及び Z又は感染症 の治療 ·予防剤用途であることが好ましい。したがって、関連する実施形態として、本 発明は、がん及び Z又は感染症のための医薬の製造するための本発明の活性ィ匕抗 原提示細胞の使用を含む。
[0049] 第三の実施形態：本発明の活件化杭原提示細胞を用いた '治療 ·予防方法
次に、本発明の榭状細胞を用いた治療 ·予防方法について、上述と同様に、榭状 細胞を抗原提示細胞として用いた一例に基づき説明する。
[0050] 前述の第一の実施形態で得られた本発明の活性化抗原提示細胞 (活性化榭状細 胞）、又は、第二の実施形態により得られた本発明の医薬を投与することにより、がん 及び Z又は感染症に対する治療 ·予防を行うことができる。
[0051] 投与する細胞数としては、投与方法、患者の状態に応じて適宜選択することが可能 であり、特に制限されない。通常、一回の投与で 106〜108個/人であることが好まし ぐより好ましくは 107個 Z人以上である。投与回数は患者の状態により異なるが、通 常、 4〜6回を 1クールとして投与する。投与間隔は投与する榭状細胞数に依存し、 特に制限されない。通常、 1週間から 1ヶ月に一度であることが好ましぐさらには投与 する榭状細胞数が 5 X 106個である場合には 2週間に 1度、 2 X 107以上であるならば 1ヶ月に一度投与することが好ましい。投与する方法は、特に制限されないが、静脈 、皮下、皮内等への注射により注入することも、所属リンパ節へ直接注入することも、 直接病変部に注入することも、点滴として全身投与することも可能である。あるいは、 病変部近辺の動脈力も注入することも可能である。
[0052] このようにして、本発明の活性ィ匕抗原提示細胞を投与することにより患者体内で疾 病抗原特異的 CD8 + CTLのみでなく γ δ Τ細胞を活性ィ匕して、増殖させることがで きる。
[0053] これら疾病抗原特異的 CTL及び Ζ又は Ί δ Τ細胞は直接的にがん細胞や感染細 胞を殺傷するば力りでなぐインターフェロン γ (以下、 IFN yと記す)等のサイトカイ ンを介して間接的にこれら細胞を傷害することができるため、例えば、がんや感染症 等、様々な治療 '予防に有効に用いることが可能である。本発明の活性化抗原提示 細胞をワクチンとして用いることの利点としては、以下のことが挙げられる。すなわち、 従来の疾病抗原のみで感作した榭状細胞をワクチンでは、疾病抗原特異的 CD8 + CTLのみが活性化される。それに対して、本発明の活性化抗原提示細胞のワクチン は、疾病抗原特異的 CD8 + CTLの活性ィ匕に加えて γ δ Τ細胞を活性ィ匕することも できる。さらには、これら疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び Ζ又は Ύ δ Τ細胞から誘 導されたサイト力インは、ヘルパー Τ細胞、 ΝΚ細胞や iNKT細胞（invariant Natu ral Killer T Cell)及び B細胞を活性ィ匕することができる。これにより、生体内全体 の液性及び細胞性免疫系が活性化され、その結果、治療'予防効果の向上をもたら すことができる。また、活性ィ匕処理に用いる抗原提示細胞は、患者の自己由来又は HLAを同じくする他家由来であることが好ましい。患者に投与された際に患者自身 の免疫に排除されることなぐその機能を発揮することが可能となるからである。
[0054] 第四の実施形 疾病杭原特異的 CD8 + CTL及び/又は / δ Τ細朐を傷位に含 む 糸田 の
次に、本発明の免疫担当細胞の誘導方法について説明する。本発明の免疫担当 細胞の誘導方法は、疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び Ζ又は Ύ δ Τ細胞を優位に 含む免疫担当細胞を誘導する方法であって、より具体的には、ビスホスホネートと疾 病抗原で抗原提示細胞を共感作する工程 (i)、及び、前記共感作と同時又はその後 に、前記抗原提示細胞とリンパ球とを混合培養する工程 (ii)を含む誘導方法である。 ここで、免疫担当細胞とは、上述のとおり、 T細胞、 iNKT細胞、 NK細胞、 B細胞、単 球、榭状細胞、マクロファージ等を含み、抗原の特異性を認識したり及び Z若しくは 特異的免疫反応に携わったりする能力がある細胞、又は、これらの 1種類若しくは 2 種類以上を含む細胞群を ヽぅ。
[0055] まず、第一の実施形態と同様に抗原提示細胞 (例えば、榭状細胞)の活性化処理 を行う（工程 (i) )。そして、前記共感作と同時又はその後に、前記抗原提示細胞と反 応細胞を培養容器に播種して混合培養をする（工程 (ii) )。これにより、前記活性ィ匕 処理された抗原提示細胞からの疾病抗原特異的刺激を受け、前記反応細胞中の疾 病抗原特異的 CD8 + CTLが活性ィ匕されうる。さら〖こ、ビスホスホネート感作による抗 原提示細胞代謝系阻害によって抗原提示細胞表面上に提示された IPP dsopente nyl diphosphate,イソペンテ-ルニリン酸)様分子からの刺激を受け、前記反応細 胞中の γ δ Τ細胞が活性ィ匕されうる。 γ δ Τ細胞から産生された IFN yは、前記疾 病抗原特異的 CD8 + CTLの更なる活性化と増殖を助けることができる。なお、ここで いう反応細胞とは、例えば、ヒトリンパ球であって、末梢血由来の単核球等が好ましい 。この反応細胞は、自己由来又は HLAを同じくする他家由来であることが好ましい。
[0056] 前記培養容器は特に限定されるものではなぐ通常、当該分野で使用される培養 用プレート、シャーレ、フラスコ、ノ ッグ等を利用することができる。各々の細胞群を播 種する濃度は実施する状況に応じて自由に設定することができる。
[0057] 前記抗原提示細胞が榭状細胞の場合、榭状細胞と反応細胞との混合培養には、 例えば、 AIM— V培地を用いて培養することができる。また、 AIM— V培地のほか、 RPMI— 1640培地、 DMEM、 TIL、 KBM、 IMEM等、細胞培養に使用されている 巿販の培地を利用することができる。さらに必要に応じて 5%〜20%の牛血清、 FBS 、ヒト血漿等の血清、サイト力イン等を添加してもよい。培養は、例えば、 34°C〜38°C 、好ましくは 37°Cで、例えば、 2%〜10%、好ましくは 5%の CO条件下で行う。培養
2
期間としては、特に制限されないが、 5〜21日間が好ましぐさらに 7〜14日間が好 ま ヽ。播種する榭状細胞及び反応細胞の数は播種する容器及び用途に応じて設 定することができる。また、榭状細胞と反応細胞を混合する割合は状況に応じて適宜 設定することが可能であり、特に制限されない。反応細胞中の疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び Z又は Ί δ Τ細胞の割合を増加させるという目的から、反応細胞と榭状 細胞の割合は 20 : 1から 2 : 1が好ましい。
[0058] このような本発明の誘導方法により、疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び Ζ又は Ύ
δ Τ細胞を優位に含む本発明の免疫担当細胞を調製 (生産)することが可能である。 また、このようにして得られた本発明の免疫担当細胞は、そのまま又は本発明の活性 化抗原提示細胞で繰り返し刺激することにより、より高い割合で疾病抗原特異的 CD 8 + CTL及び Z又は Ί δ Τ細胞を含む免疫担当細胞として免疫細胞療法に用いる ことができ、がんや感染症に対してより高い治療 ·予防効果が期待できる。
[0059] in vitroで本発明の免疫担当細胞を調製することの利点としては、本発明の活性 化抗原提示細胞によって反応細胞を繰り返し刺激することにより、がん細胞や感染症 細胞を直接殺傷可能な多量の免疫担当細胞を簡便に調製できることが挙げられる。
[0060] 第五の実施形態:本発明の免疫担当細胞を含む医蓉
次に、本発明の免疫担当細胞を含む医薬について説明する。
[0061] まず、前述の第四の実施形態で得られた疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び Z又 は γ δ Τ細胞を優位に含む本発明の免疫担当細胞を遠心分離法等によって回収す る。次に、回収した細胞を洗浄する。洗浄する液体は、等張であり、医薬品として用い ることできる液体であればいずれを用いることも可能である。この後、患者に投与する ことを考えると生理食塩水、 PBS等を利用することが好ましい。そして、回収された疾 病抗原特異的 CD8 + CTL及び Ζ又は Ύ δ Τ細胞を優位に含む免疫担当細胞は、 生理食塩水に懸濁されることで医薬として用いることが可能となる。また、必要に応じ てサイト力イン等を添加することができる。当該医薬としては特に、がん及び Z又は感 染症の治療 ·予防剤用途が好ましい。したがって、関連する実施形態として、本発明 は、がん及び Z又は感染症のための医薬の製造するための本発明の活性ィ匕抗原提 示細胞の使用を含む。
[0062] 第六の実施形 ：本発明の免疫担当細朐を用いた '治療 ·予防方法
次に、本発明の免疫担当細胞を用いた治療 ·予防方法について説明する。
[0063] 前述の第四の実施形態で得られた本発明の免疫担当細胞、又は、第五の実施形 態により得られた本発明の医薬を投与することにより、がん及び Z又は感染症に対す る治療 ·予防を行うことができる。
[0064] 投与する細胞数としては、投与方法、患者の状態に応じて適宜選択することが可能 であり、特に制限されない。通常、 1回の投与数は 108〜1012個 Z人であることが好ま しぐより好ましくは 109個 Z人以上である。投与回数は患者の状態により異なるが、 通常、 4— 6回を 1クールとして投与する。投与間隔は、特に制限されないが、例えば 2週間に 1回又は 1ヶ月に 1回投与することが好ましい。投与する方法は、特に制限さ れないが、静脈、皮下、皮内等への注射により注入することも、所属リンパ節へ直接 注入することも、直接病変部に注入することも、点滴として全身投与することも可能で ある。あるいは、病変部近辺の動脈から注入することも可能である。また、本発明の免 疫担当細胞は、患者の自己由来又は HLAを同じくする他家由来であることが好まし い。患者に投与された際に、患者自身の免疫系に排除されることなぐその機能を発 揮することが可能となるからである。
[0065] 第七の実施形態：疾病杭原で感作する際の杭原提示細胞の活件化促進剤
次に、本発明の疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤について 説明する。
[0066] 本発明の疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤は、ビスホスホ ネートを有効成分として含む。前記活性化促進剤は、さらに、薬学的に許容できる賦 形薬及び/又はキャリアを含んでもよい。前記活性化促進剤は、生体内及び/又は生 体外において抗原提示細胞を疾病抗原で感作する際、すなわち、疾病抗原で感作 する前、疾病抗原で感作すると同時及び Z又は疾病抗原で感作した後に添加する ことができる。本発明は、その他の態様として、疾病抗原で感作する際の抗原提示細 胞の活性ィ匕促進剤の製造のためのビスホスホネートの使用である。本発明は、さらに その他の態様として、ビスホスホネートを用いたがん及び Z又は感染症に対する治療
•予防方法である。
[0067] 以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定さ れるものでな 、ことは言うまでもな 、。
実施例 1
[0068] <実施例 1 1：榭状細胞の採取及び調製 >
健常人ドナー（HLA— A*0201)力 末梢血を 30mL採血した。この健常人末梢血 力も単核細胞を取得した。この際、血球分離用比重液を用いて単核細胞層を回収し た。回収した細胞力も血小板等を除去するために 10% FBSを添加した AIM— Vで 数回洗浄した後、 MACSにより単球成分として CD 14陽性細胞を単離した。
[0069] 得られた榭状細胞前駆細胞から榭状細胞への分化誘導を行った。培地は 10% F BSまたは AB血清を添カロした AIM— Vを使用し、これに 500UZmL GM— CSF (I MMUNEX)と 500U/mL IL— 4 (Osteogenetics GmbH)を添カ卩した。培養開 始から 5〜7日目で未成熟榭状細胞を得た。
[0070] さらに、培養開始後 5〜7日目に lOOUZmLもしくは lOngZmL IL— 6 (R&D s ystems)、 lOng/mL IL— l j8 (CHEMICON)ゝ lOng/mL TNF a (PHAR MINGEN)、及び 1 μ g/mL PGE (SIGMA)を添カ卩して更に培養し、 24〜48時
2
間後の細胞を成熟榭状細胞とした。
[0071] <実施例 1 2：榭状細胞の状態の確認 >
調製して得られた榭状細胞の表面抗原の検出をフローサイトメーター (Epics XL -MCL, Beckman Coulter)を用いて行った。
[0072] 測定する細胞を PBSに懸濁したものに目的の抗体を添カ卩し、遮光の状態で 4°C、 1 5分間染色した。抗体は PE標識された抗 CD14抗体、抗 CD83抗体、抗 HLA— DR 抗体（Beckman Coulter)を用いた。ネガティブコントロールとしてそれぞれの抗体 のアイソタイプを用いた。染色した細胞を PBSで洗浄後、 Epics XL'MCLで測定し た。
[0073] その結果、 GM— CSF、 IL— 4で培養した細胞は CD14、 CD83陰性、 HLA— DR は陽性を示しており、未成熟榭状細胞集団であることを確認した。また、 GM - CSF 、 IL— 4、 IL— 6、 IL- l j8、 TNF a , PGEで培養した細胞においては、 CD14以外
2
は陽性を示し、成熟榭状細胞集団であることを確認した。
[0074] <実施例 1 3： Zometa (商品名）及び疾病抗原ペプチドで共感作した榭状細胞 の調製及び反応細胞の調製 >
上述のとおり調製した末梢血由来の未成熟榭状細胞又は成熟榭状細胞の懸濁液 に、アミノビスホスホネート剤である Zometa (商品名）（Novartis)をゾレドロン酸とし て 0. 01 μ Μとなるよう〖こ添加し、及び Ζ又は、疾病抗原ペプチドとして MART— 1 抗原ペプチド A27L (ELAGIGILTV) (以下、 A27Lと記す）を最終濃度 2 gZmL となるように添加し、 37°C、 5%CO条件下で約 12時間培養した。ネガティブコント口
2
ールには、 Zometa (商品名）と抗原ペプチドを添加せずに培養した榭状細胞を用い た。
[0075] 約 12時間の培養後、 Zometa (商品名）及び抗原ペプチドで共感作した活性ィ匕榭 状細胞の一部を 15mLチューブ（BDファルコン）に回収し、 1500rpm、 5分間遠心し た。ペレットとなった榭状細胞を、 10%FBSを含む AIM— V培地 10mLに懸濁し、 1 500rpm、 5分間で遠心した後、洗浄した。洗浄作業を 2回繰り返し行った。これによ り回収された榭状細胞を刺激細胞とした。すなわち、ビスホスホネート及び疾病抗原 ペプチドで共感作した活性化榭状細胞、いずれか一方で感作した榭状細胞、及び、 どちらも感作していない榭状細胞を刺激細胞とした。また、反応細胞として、榭状細 胞調製のために CD14陽性細胞を単離したあとの残りの細胞 (CD14陰性細胞集団 、主に T細胞集団）であって、 10%FBS、 10%ジメチルスルフォキシド（DMSO)を 添加した AIM— V培地に懸濁して凍結保存された細胞を解凍、洗浄して用いた。
[0076] <実施例 1 4： Zometa (商品名）及び疾病抗原ペプチドで共感作した榭状細胞 によって誘導された免疫担当細胞の性状の解析 >
上述のようにして得られた刺激細胞 (榭状細胞） 2 X 105個を各々、全量を lmLとし て 24well plate (SUMILON)で反応細胞 2 X 106個と混合培養を行った (反応細 胞:榭状細胞 = 10 : 1)。培養は約 37°C、 5%CO条件下で 7日間行った。この混合
2
培養溶液中に 20UZmL IL— 2をカ卩えると、よりよい細胞増殖が認められた。細胞 の増殖が速い場合には、 4〜6日目に 40UZmL IL— 2、 10%FBSを含む AIM— V培地を lmL添加した。榭状細胞と反応細胞の混合培養開始から 7日後に標識抗 体と抗原特異的テトラマーを用いてフローサイトメーターで全細胞中にしめる A27L 特異的 CD8 + CTL (疾病抗原特異的 CD8 + CTL)の割合を測定した。
[0077] HLA-A*0201 A27Lテトラマー陽性、 CD8陽性細胞が占める割合を算出する 手順として、まず PE標識された A27Lテトラマー（MBL)を培養後 PBSで洗浄した細 胞に添加した。遮光の状態で室温 15分染色後、 FITC標識された抗 CD8抗体 (BD Pharmingen)を添カ卩し、遮光の状態で 4°C、 15分間染色した。コントロールには各 抗体のアイソタイプを利用した。細胞の測定は Epics XL'MCLを用い、測定結果 の解析には Epics32を用いた。
[0078] その結果を下記表 4aに示す。同表に示すとおり、 Zometa (商品名） 0. 01 μ Μと A 27L 2 μ gZmLで共感作された活性化榭状細胞は抗原特異的 CD8 + CTLを誘 導することが確認された。また、この活性ィ匕榭状細胞を用いた場合、ペプチドのみで 感作した榭状細胞が誘導する CTLの割合と比較すると、約 4倍高くなることが確認さ れた。
[0079] また、表 4b及び図 1は同様の実験を被験数を増やして行い、 t検定を行った結果で ある。 A27Lと Zometaで共感作した榭状細胞を用いて得られた CD8 + CTLの割合 は A27Lのみで感作した榭状細胞を用いて得られた CD8 + CTLの割合よりも高ぐ 両者の間には有意差があることが明らかとなった。
[0080] [表 4] (表 4a) Zometa及ぴ 又は A27 Lを用いて感作した活性化未成熟樹状細胞とリンパ球と を培養することにより誘導される疾病抗原特異的 CD8 +CTLの割合 ）
Figure imgf000028_0001
(表 4b) Zometa及び 又は A27Lを用いて感作した活性化未成熟樹状細胞とリンパ球と を培養することにより誘導される疾病抗原特異的 CD8 + CTLの割合（9ύ)
Figure imgf000028_0002
実施例 2
<実施例 2— 1： Zometa (商品名）及び A27L存在下で共感作されて ヽる榭状細 胞と反応細胞を混合培養して誘導された免疫担当細胞の性状の解析 >
実施例 1で調製した末梢血由来の未成熟榭状細胞、又は成熟榭状細胞を各々 1 X 105個、全量を lmLとして 24well plate (SUMILON)に播種した。さらに、ァミノ ビスホスホネート剤である Zometa (商品名）を 0. 01 Mとなるように添加し、及び Z 又は、 A27Lを最終濃度 2 /z gZmLとなるように添カ卩し、 37°C、 5%CO条件下で約
2
24時間培養した。ネガティブコントロールには、 Zometa (商品名）と抗原ペプチドを 添加せずに培養した榭状細胞を用いた。そして、この感作をおこなっているままの榭 状細胞を刺激細胞として、 12時間培養後、さらに反応細胞 2 X 106個を播種し、混合 培養を行った (反応細胞:刺激細胞 = 20 : 1)。培養は約 37°C、 5%CO条件下で 7
2
日若しくは 14日間行った。混合培養液中に、細胞の増殖に従って 1〜： LOOUZmL の IL— 2を加えた。
[0082] 混合培養開始から 7日と 14日後に増殖してくる全細胞数と標識抗体と抗原特異的 テトラマーを用いてフローサイトメーターで前記全細胞中にしめる抗原特異的 CD8 + T細胞と γ δ Τ細胞の割合を測定した。 ΡΕ標識された A27L tetramer (MBL)を 混合培養終了後 PBSで洗浄した細胞に添加し、遮光の状態で室温 15分間染色した 。その後、 FITC標識された抗 CD8抗体（BD Pharmingen)を添カ卩し、遮光の状態 で 4°C、 15分間染色した。 γ δ Τ細胞が占める割合の算出には FITC標識された抗 TCR V γ 9抗体、 ΡΕ標識された抗 TCR pan a / jS抗体、及び PC5標識された抗 CD3抗体（全て Beckman Coulter)を用いた。これらの抗体を培養後の細胞を PB Sで洗浄したものに添加し、遮光の状態で 4°C、 15分間染色した。ネガティブコント口 一ルには各抗体のアイソタイプを利用した。細胞の測定は Epics XL'MCLを用い、 測定結果の解析には Epics32を用いた。
[0083] その結果を下記表 5及び 6に示す。下記表 5に示されるように、 0. 01 μ Μの Zomet a (商品名）と 2 μ gZmLの A27L存在下で榭状細胞とリンパ球を混合培養すると、 A 27Lのみの存在下で榭状細胞とリンパ球を混合培養した場合に比べ、疾病抗原特 異的 CD8 + CTLの誘導の上昇が観察された。この結果は、 Zometa (商品名）の疾 病抗原特異的 CD8 + CTL誘導のアジュバント効果を示唆している。また、このアジュ バント効果は未成熟榭状細胞でより強いことが確認された。
[0084] さらに、下記表 6に示されるように、 0. 01 μ Μの Zometa (商品名）及び A27L存在 下で共感作されている榭状細胞とリンパ球を混合培養することにより y δ Τ細胞誘導 の上昇も確認された。
[0085] [表 5] (表 5) Zometa及び/又は A27 Lを用いて感作されている樹状細胞とリンパ球とを混
合培養することにより誘導される、疾病抗原特異的 CTLの a)全リンパ球中に占め る割合（％)及び b)細胞数 (個）
a)
Figure imgf000030_0002
b)
Figure imgf000030_0003
細胞数については全細胞数に割合を乗じて算出した。
[0086] [表 6]
(表 6) Zometa及び抗原ペプチドを用いて共感作されている樹状細胞とリンパ球とを混合培
Figure imgf000030_0004
Figure imgf000030_0001
[0087] <実施例 2— 2： Zometa (商品名）及び A27L存在下で共感作されて ヽる榭状細 胞と反応細胞を混合培養して誘導された免疫担当細胞の IFN y産生能の解析 > 続いて、上述の混合培養により誘導された免疫担当細胞の IFN y生産能を以下の ようにして解析した。
[0088] MultiScreenプレート（MILLIPORE)の各 wellに 70%エタノールを添カ卩し、 2分 以内に除去した。前記プレートの各 wellを 200 Lの PBSで 5回洗浄した。コーティ ング用抗 IFN— γ抗体（クローン： 1— D1K、 MABTECH ELISpot for Huma n Interferon- y kit)を 15 LZmLになるように PBSで希釈して前記プレートに 100 μ LZwell添カ卩した。このプレートを 4°Cでー晚静置した。このプレートを 200 μ L/wellの PBSで 4回洗浄した。 10%FBSを含む AIM—V培地を 200 μ L/well添 加し、 30分間以上室温でブロッキングを行った。ブロッキング培地を除去し、プレート を 200 LZwellの PBSで 4回洗浄した。上述の混合培養と同様の方法で得られた 各条件での混合培養細胞群を遠心分離により回収し、 AIM— Vにより 2回洗浄した。
[0089] 回収した混合培養細胞 2500個に実施例 1で得られた未成熟榭状細胞 500個及び A27Lを再刺激のため添カ卩し、 37°C、 5%CO条件下で 2時間の前培養を行った。
2
細胞数はアツセィプレート lwellあたりを示す。同時に混合培養細胞のみの前培養、 榭状細胞と A27Lのみの前培養も行った。また、培養容量は lwellあたり 100 /z Lに なるように調整した。各培養条件については 3well分、 300 Lの培養を行った。ブロ ッキング後 PBSで洗浄したプレートに、各条件での前培養を終えた細胞を 100 L /well, 3wellに播種し、 37°C、 5%CO条件下でー晚培養した。 wellから培養細胞
2
を除去し、 200 LZwellの PBSで 5回洗浄した。検出用のピオチン標識抗 IFN— γ抗体（クローン： 7— B6— 1、 MABTECH ELISpot for Human Interferon - γ kit)を、 0. 5%FBSを含む PBSで 1 μ gZmLに希釈し、 100 μ LZwell添カロ した。プレートを室温で 2時間静置した。プレートを 200 LZwellの PBSで 5回洗浄 した。アルカリフォスファターゼを結合したストレプトアビジン（MABTECH ELISpo t for Human Interferon— γ kit)を、 0. 5%FBSを含む PBSで 1： 1000に希 釈し、 100 LZwell添加した。プレートを室温で 1時間静置した。プレートを 200 LZwellの PBSで 5回洗浄した。 BCIP/NBTplus基質液（Wako)を 100 μ L/wel 1添加し、暗所でスポットが確認できるまで静置した。肉眼でスポットが確認されたら蒸 留水で十分に洗浄した。プレートのメンブレンが乾燥したことを確認した後、 ELISPo tリーダー（AID Autoimmun Diagnostika GmbH)を用いてスポット数を測定し 、データを AID software version 3. 1 (AID)にて解析した。
[0090] その結果を下記表 7に示す。同表に示されるように、 Zometa (商品名） 0. 01 M 及び A27L 2 μ gZmLで共感作した榭状細胞とリンパ球の混合培養細胞群を、 A2 7Lで感作した榭状細胞を用いて再刺激した場合に、最も IFN y産生細胞を示すス ポット数が増加した。この結果は実施例 1で示した A27Lテトラマー陽性細胞の割合 ( %) (表 4参照)とも相関した。
[0091] [表 7]
(表 7 ) Zometa (商品名）及び抗原ペプチドで共感作した樹状細胞とリンパ球とを混合培養
することで得られた全リンパ球 2500個中の IFN _ r産生細胞数（個）
Figure imgf000032_0001
実施例 3
[0092] < Zometa (商品名 )及びがん細胞株由来のアポトーシス細胞存在下で榭状細胞 及び反応細胞を混合培養して誘導された免疫担当細胞の性状の解析 >
健常人ドナーから末梢血を 200mL採血した。健常人末梢血から単核細胞を取得 した。この際、血球分離用比重液を用いて単核細胞層を回収した。回収した細胞か ら血小板等を除去するために数回洗浄した後， MACSにより単球成分として CD14 陽性細胞を単離した。得られた榭状細胞前駆細胞から榭状細胞への分化誘導を行 つた。培地は 10% FBSを添カ卩した AIM— Vを使用し、これに 500UZmL GM— CSF (IMMUNEX)と 500UZmL IL— 4 (Osteogenetics GmbH)を添カ卩した。 培養開始から 5〜7日目で未成熟榭状細胞を得た。
[0093] MART— 1陽性のメラノーマ由来がん細胞株を 15mLチューブ（BDファルコン）に 回収し、 1500rpm、 5分間遠心した。ペレットとなった細胞株を AIM— V培地 10mL に懸濁し、 1500rpm、 5分間遠心し、洗浄した。洗浄作業を 2回繰り返し行った。これ により回収された細胞株を 1 X 106個 ZmLとなるよう AIM— Vで再浮遊させた。細胞 浮遊液にカンプトテシン（sigma) 10 μ Μ加えて 37°C、 5%CO条件下で 24時間培
2
養した。培養後の細胞を 15mLチューブに回収し、 1500rpm、 5分間遠心した。ペレ ットとなった細胞株を AIM— V培地 10mLに懸濁し、 1500rpm、 5分間遠心し、洗浄 した。洗浄作業を 2回繰り返し行った。遠心、洗浄して得られた細胞をアポトーシス細 胞とした。
[0094] 未成熟榭状細胞の懸濁液にアミノビスホスホネート剤である Zometa (商品名）を 0.
01 μ Μとなるように添カ卩し、及び Ζ又は、榭状細胞と同量のアポトーシス細胞を含む がん細胞株を添加し、約 24時間混合培養した。コントロールにはアポトーシス細胞の みと約 24時間培養した榭状細胞、及び、 Zometa (商品名）とアポトーシス細胞のど ちらも添加せずに培養した榭状細胞を用いた。約 24時間培養した未熟榭状細胞に 1 OOU/mL IL— 6、 10ng/mL IL— 1 j8、 lOngZmL TNF a , 1 ^ g/mL P GEを添加して更に培養し、 48時間後の細胞を成熟榭状細胞とした。
2
[0095] ここで得られた成熟榭状細胞を刺激細胞とした。この刺激細胞 1 X 105個を各々、 反応細胞 2 X 106個と、全量を lmLとして 24well plate (SUMILON)で混合培養 を行った (反応細胞:刺激細胞 = 20 : 1)。反応細胞として、榭状細胞調製のために C D14陽性細胞を単離したあとの残りの細胞 (CD14陰性細胞集団、主に T細胞集団） であって、 10%FBS、 10%ジメチルスルフォキシド（DMSO)を添カ卩した AIM— V培 地に懸濁して凍結保存された細胞を解凍、洗浄して用いた。培養は、約 37°C、 5%C O条件下で行った。この混合培養溶液中に 20UZmL IL— 2を添加した。細胞の
2
増殖が速い場合には、 4〜6日目に 40U/mL IL— 2, 10%FBSを含む AIM—V 培地を lmL添カ卩した。
[0096] 混合培養開始から 7、 11、 14日後に増殖してくる全リンパ球数と、標識抗体と抗原 特異的テトラマーを用いてフローサイトメーターで前記全リンパ球中にしめる抗原特 異的 CD8 + CTLの割合を測定した。詳しくは PE標識された A27L tetramer (MB L)を培養後の細胞を PBSで洗浄したものに添加し、遮光の状態で室温 15分染色し た。その後、 FITC標識された抗 CD8抗体（BD Pharmingen)を添カ卩し、遮光の状 態で 4°C、 15分間染色した。ネガティブコントロールには各抗体のアイソタイプを利用 した。細胞の測定は Epics XL'MCLを用い、測定結果の解析には Epics32を用い た。
[0097] その結果を下記表 8に示す。同表に示すように、アポトーシスした細胞を含む細胞 株で感作した場合、培養 11日目に 0. 01%のテトラマー陽性細胞が確認された。ま た Zometa (商品名）をカ卩えることで 0. 14%と約 15倍増加することが確認された。
[0098] [表 8]
(表 8) Zometa及びアポトーシス細胞で共感作した活性化樹状細胞によって誘導された A2
7 L抗原特異的 CD8 + CTLの割合
Figure imgf000034_0001
実施例 4
[0099] < Zometa (商品名）及び疾病抗原ペプチドで共感作した榭状細胞との混合培養 を行ったリンパ球のメラノーマ細胞株に対する傷害性の解析 >
実施例 1で調製した末梢血由来の未成熟榭状細胞を 48well plateに 1 X 105個 Zwellとなるように播種した。各 wellに疾病抗原ペプチドとして MART1抗原べプチ ド A27L (ELAGIGILTV)を最終濃度が 2 μ gZmLとなるように添加した。同時にァ ミノビスホスホネート剤である Zometa (商品名）（Novartis)をゾレドロン酸として 0.01 μ Μとなるように添加したものと添加しな力 たものを準備した。同一ドナーのリンパ 球を I X 106個 Zwellとなるように添加し、 37°C、 5%CO条件下で榭状細胞との混
2
合培養を行った。
[0100] 混合培養を開始してから 13〜 17日目のリンパ球を回収した。 HLA— A*0201陽 性、 MARTl陽性のヒトメラノーマ細胞¾ίCOCBをPKH— 26 (Sigma)で標識し、タ 一ゲット細胞とした。回収したリンパ球をエフェクター細胞とし、エフェクター細胞：ター ゲット細胞が 5 : 1、もしくは 20 : 1となるように混合して 24well plateに播種した。 4時 間 37°C、 5%CO条件下で培養を行った。
2
[0101] 混合培養後の細胞を回収し、氷冷してお!、た PBSで洗浄した。遠心後の細胞を A nnexin V Binding Buffer (BD PerMingen)に懸濁し、 Annexin Vと 7AAD (共に Beckman Coulter)を添カ卩した。氷上で 15分反応させた後、 Annexin V Binding Bufferを 400〜500 Lずつ添カ卩し、 Flow Cytometry (Beckman C oulter)にてアポトーシス細胞（Annexin V陽性細胞）の割合（％ of cytotoxicit y)を測定した。
[0102] 下記表 9に、ドナー 2名につ 、て、 A27L及び Zometaで共感作した活性ィ匕榭状細 胞によって誘導された A27L抗原特異的 CD8 + CTLの割合（％)、テトラマー陽性 細胞が検出される平均蛍光強度（Mean Fluorescence Intensity ;MFI)及びァ ポトーシス細胞の割合（％)を測定した結果を示す。同表に示すとおり、ドナー 1及び 2の双方にぉ 、て、 A27L及び Zometaで共感作した活性ィ匕榭状細胞を用いて刺激 したリンパ球は、 A27Lのみで感作した榭状細胞で刺激したリンパ球よりも高 、割合 でテトラマー陽性細胞が認められた。また、このときのテトラマー陽性細胞が検出され る平均蛍光強度も、 A27L及び Zometaで共感作した場合の方が高値を示した。ま た、培養開始後 13〜17日後のリンパ球をエフェクター細胞 (E)とし、 MART— 1陽 性、 HLA— A*0201陽性のヒトメラノーマ細胞株をターゲット細胞 (T)として混合培 養を行った結果、エフェクター細胞：ターゲット細胞の比が 5 : 1、 20 : 1どちらの場合 にお 、ても、 A27L及び Zometaで共感作した活性ィ匕榭状細胞を用いて刺激したリ ンパ球は、 A27Lのみで感作した榭状細胞を用いて刺激したリンパ球よりも高 、標的 細胞の傷害性を示した。
[0103] [表 9]
(表 9)ドナ一 2名のリンパ球を A27 L及び Zometaで共感作した活性化樹状細胞によって誘
Figure imgf000035_0001
実施例 5
[0104] < Zometa (商品名）及び疾病抗原ペプチドで共感作した榭状細胞によって誘導さ れた免疫担当細胞の性状の解析 >
実施例 1で調製した末梢血由来の未成熟榭状細胞、又は成熟榭状細胞の懸濁液 にァミノビスホスホネート剤である Zometa (商品名）（Novartis)をゾレドロン酸として 0〜20 /ζ Mとなるように添加し、同時に疾病抗原ペプチドとして EBV抗原ペプチド B MLFl (GLCTLVAML) (以下、 BMLF1と記す）を最終濃度が 2 μ gZmLとなるよ うに添加し、 37°C、 5%CO条件下で約 12時間培養して活性ィ匕処理した。ネガティ
2
ブコントロールには、 Zometa (商品名）と抗原ペプチドを添加せずに培養した榭状細 胞を用いた。
[0105] 約 12時間の培養後、 Zometa (商品名）と抗原ペプチドを共感作した活性ィ匕榭状 細胞の一部を 15mLチューブ（BDファルコン）に回収し、 1500rpm、 5分間遠心した 。ペレットとなった榭状細胞を、 10%FBSを含む AIM— V培地 10mLに懸濁し、 150 Orpm、 5分間遠心し、洗浄した。洗浄作業を 2回繰り返し行った。これにより回収され た榭状細胞を刺激細胞とした。すなわち、ビスホスホネート及び疾病抗原ペプチドで 共感作した活性ィ匕榭状細胞、いずれか一方で感作した榭状細胞、及び、どちらも感 作していない榭状細胞を刺激細胞とした。また、反応細胞として、榭状細胞調製のた めに CD14陽性細胞を単離したあとの残りの細胞 (CD14陰性細胞集団、主に T細 胞集団）であって、 10%FBS、 10%ジメチルスルフォキシド（DMSO)を添カ卩した AI M— V培地に懸濁して凍結保存された細胞を解凍、洗浄して用いた。得られた刺激 細胞 (榭状細胞） 1 X 105個を各々、反応細胞 1 X 106個と、全量を ImLとして 48well plate (CORNING)で混合培養を行った (反応細胞:榭状細胞 = 10 : 1)。培養は、 約 37°C、 5%CO条件下で 7日間行った。この混合培養溶液中に 20UZmL IL-
2
2を加えると、よりよい細胞増殖が認められた。細胞の増殖が速い場合には、 4〜6日 目に 40UZmL IL— 2、 10%FBSを含む AIM—V培地を ImL添カ卩した。榭状細 胞及び反応細胞の混合培養開始から 7日後に標識抗体と抗原特異的テトラマーを 用いてフローサイトメーターで全細胞中に占める BMLF1特異的 CD8 + CTL (疾病 抗原特異的 CD8 + CTL)の割合を測定した。 [0106] HLA-A*0201 BMLF1テトラマー陽性、 CD8陽性細胞が占める割合を算出す る手順として、まず PE標識された BMLF1テトラマー（MBL)を培養後 PBSで洗浄し た細胞に添加した。遮光の状態で室温 15分染色後、 FITC標識された抗 CD8抗体 ( BD Pharmingen)を添カ卩し、遮光の状態で 4°C、 15分間染色した。コントロールに は各抗体のアイソタイプを利用した。細胞の測定は Epics XL'MCLを用い、測定 結果の解析には Epics32を用いた。
[0107] その結果を下記表 10に示す。同表に示すように、 Zometa (商品名） 0〜20 /ζ Mと BMLF1で共感作した活性ィ匕榭状細胞は抗原特異的 CD8 + CTLを誘導することが 確認された。また、ペプチドのみで感作された榭状細胞が誘導する CTLの割合と比 較すると、約 3. 2倍高くなることが確認された。
[0108] [表 10]
(表 1 0) BMLF1及び Zometaで共感作した活性化未成熟樹状細胞とリンパ球とを培養する
ことにより誘導される疾病抗原特異的 CD8 + CTLの割合（％)
Figure imgf000037_0001
実施例 6
[0109] <実施例 6— 1：人工抗原提示細胞株の作製 >
MHCクラス I分子を発現する乳がん由来の細胞株： MDA-MB-231 (クラス I抗原 HLA-A*0201)に、補助刺激分子であるヒト CD80遺伝子をリポフエクシヨン法により トランスフエクシヨンし、 MDA-MB-231細胞でヒト CD80を安定に恒常的に発現す る細胞株 MDA-MBZCD80を榭立した。米国公開公報 US— 2005— 0048646 A1に開示されるとおり、この MDA— MBZCD80細胞株の細胞は、抗原提示細 胞として機能し、 CTLを誘導することができる。
[0110] <実施例 6— 2： Zometa (商品名）及び疾病抗原ペプチドで共感作した人工抗原 提示細胞によって誘導された免疫担当細胞の性状の解析 >
上述のとおり調製した人工抗原提示細胞 MDA— MBZCD80の懸濁液にアミノビ スホスホネート剤である Zometa (商品名）（Novartis)をゾレドロン酸として 0. 01 ^ M又は 1 μ Μとなるように添加し、同時に疾病抗原ペプチドとして MART— 1抗原べ プチド A27L (ELAGIGILTV)を最終濃度 2 /z gZmLとなるように添カ卩し、 37°C、 5 %CO条件下で約 12時間培養した。ネガティブコントロールには、 Zometa (商品名
2
)と抗原ペプチドを添加せずに培養した MDA— MBZCD80細胞を用いた。
[0111] 約 12時間の培養後、 Zometa (商品名）と抗原ペプチドを共感作した活性ィ匕 MDA — MBZCD80細胞の一部を 15mLチューブ（BDファルコン）に回収し、 1500rpm 、 5分間遠心した。ペレットとなった MDA—MBZCD80細胞を、 10%FBSを含む A IM— V培地 10mLに懸濁し、 1500rpm、 5分間遠心し、洗浄した。洗浄作業を 2回 繰り返し行った。これにより回収された MDA— MBZCD80細胞を刺激細胞とした。 すなわち、ビスホスホネート及び疾病抗原ペプチドで共感作した活性化 MDA— MB ZCD80細胞、いずれか一方で感作させた MDA— MBZCD80細胞、及び、どちら も感作していない MDA— MBZCD80細胞を刺激細胞とした。また、反応細胞とし て、上述のとおり榭状細胞調製のために CD14陽性細胞を単離したあとの残りの細 胞（CD14陰性細胞集団、主に T細胞集団、 HLA— A*0201)であって、 10%FBS 、 10%ジメチルスルフォキシド（DMSO)を添カ卩した AIM— V培地に懸濁して凍結保 存されていた細胞を解凍、洗浄して用いた。
[0112] 上述のようにして得られた刺激細胞（MDA— MBZCD80細胞） 2 X 105個を各々 、反応細胞 2 X 106個と、全量を ImLとして 24well plate (SUMILON)で混合培養 を行った (反応細胞:刺激細胞 = 10 : 1)。培養は約 37°C、 5%CO条件下で 7日間
2
行った。この混合培養溶液中に 20UZmL IL— 2を加えると、よりよい細胞増殖が 認められた。細胞の増殖が速い場合には、 4〜6日目に 40UZmL IL— 2、 10%F BSを含む AIM— V培地を ImL添カ卩した。 MDA— MBZCD80細胞と反応細胞の 混合培養開始力も 7日後に標識抗体と抗原特異的テトラマーを用いてフローサイトメ 一ターで全細胞中にしめる A27L特異的 CD8 + CTL (疾病抗原特異的 CD8 + CT L)の割合を、上述のように測定した。
[0113] その結果を下記表 11に示す。同表に示すとおり、 Zometa (商品名） 0. 01 ^ MX は: L Mと、 A27L 2 μ gZmLとで共感作された活性化 MDA— MBZCD80細胞 は抗原特異的 CD8 + CTLを誘導することが確認された。また、この活性ィ匕 MDA— MBZCD80細胞を用いた場合、ペプチドのみで感作された MDA— MBZCD80 細胞が誘導する CTLの割合と比較すると、約 6倍高くなることが確認された。
[0114] [表 11]
(表 1 1 ) Zometa及び A27Lで共感作した活性化 MDA— MBZCD80細胞とリンパ球とを培
養することにより誘導される疾病抗原特異的 CD8 + CTLの割合（％)
Figure imgf000039_0001
産業上の利用可能性
[0115] 以上説明したように、本発明の活性ィ匕抗原提示細胞は疾病抗原特異的 CD8 + CT Lを、従来のペプチドのみで感作した榭状細胞と比較して、非常に効率よく誘導する ことができ、さらに γ δ Τ細胞を誘導することが可能である。そのため投与用組成物と して患者に投与することで in vivoにおいて疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び Z又 は γ δ Τ細胞を誘導し、がんや感染症に対する治療 ·予防効果が期待できる。さらに in vitroでは疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び Z又は γ δ Τ細胞を誘導するため の組成物として利用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 抗原提示細胞の活性化処理方法であって、ビスホスホネートと疾病抗原で前記抗 原提示細胞を共感作する工程を含むことを特徴とする抗原提示細胞の活性化処理 方法。 οOρpπM i,
[2] 前記抗原提示細胞が、榭状細胞、未成熟榭状細胞、人工抗原提示細胞からなる 群から選択される請求項 1記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
[3] 前記ビスホスホネートが下記一般式 (I)で表される化合物、その塩、及び、それらの 水和物であって、
[化 1]
(OR)
R り
Figure imgf000040_0001
上記式 (I)中、 Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、 Rと Rは、それぞれ
1 2
独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、ァリール 基又は置換されたァリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキ ルァミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択 され、又は Rと Rは同じ環状構造の一部を形成し、
1 2
上記 Rと Rにおける置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基
1 2
、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、ァリール基、ァリールチオ基、ァリールォキシ 基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基からなる群から選択される請求 項 1又は 2記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、ノ ミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、 ィバンドロン酸、インカドロン酸、ェチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水和物か らなる群から選択される請求項 1から 3いずれか一項記載の抗原提示細胞の活性ィ匕 処理方法。
[5] 前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、 0. 001-20 μ Μである請求 項 1から 4いずれか一項記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
[6] 前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、 0. 001-5 μ Μである請求 項 5記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
[7] 前記疾病抗原が、がん抗原又は感染症抗原蛋白、そのペプチド、がん細胞又は感 染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及び、それらの熱処 理物からなる群から選択される請求項 1から 6いずれか一項記載の抗原提示細胞の 活性化処理方法。
[8] 前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、 0. 01〜20 μ gZmLである請求項
1から 7いずれか一項記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
[9] 前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、 0. 1〜2 μ gZmLである請求項 8記 載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
[10] 活性ィ匕抗原提示細胞の生産方法であって、請求項 1から 9いずれか一項記載の活 性化処理方法で抗原提示細胞を処理することを含む活性化抗原提示細胞の生産方 法。
[11] 請求項 10記載の生産方法により生産された活性化抗原提示細胞。
[12] がん及び Z又は感染症のための医薬組成物であって、請求項 11記載の活性ィ匕抗 原提示細胞を含む医薬組成物。
[13] 前記抗原提示細胞が、自己由来又は HLAを同じくする他家由来である請求項 12 記載の医薬組成物。
[14] がん及び Z又は感染症の予防 ·治療方法であって、請求項 11記載の活性化抗原提 示細胞を投与することを含む予防，治療方法。
[15] 前記抗原提示細胞が、自己由来又は HLAを同じくする他家由来である請求項 14 記載の予防'治療方法。
[16] 免疫担当細胞の誘導方法であって、下記工程 (i)及び (ii)を含むことを特徴とする 免疫担当細胞の誘導方法。
(i) ビスホスホネートと疾病抗原で抗原提示細胞を共感作する工程。 (ii)前記共感作と同時又はその後に、前記抗原提示細胞とリンパ球とを混合培養す る工程。
[17] 誘導される免疫担当細胞が、疾病抗原特異的 CD8 + CTL及び γ δ Τ細胞の少な くとも一方を含 ΟΟΡΡΝΜ Ιむ請求項 16記載の免疫担当細胞の誘導方法。
[18] 前記抗原提示細 R胞が、榭状細胞、未成熟榭状細胞、人工抗原提示細胞からなる 群から選択される請求項 16又は 17記載の免疫担当細胞の誘導方法。
[19] 前記ビスホスホネートが下記一般式 (I)で表される化合物、その塩、及び、それらの 水和物であって、
[化 1]
Figure imgf000042_0001
(I)
上記式 (I)中、 Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、 Rと Rは、それぞれ
1 2
独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、ァリール 基又は置換されたァリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキ ルァミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択 され、又は Rと Rは同じ環状構造の一部を形成し、
1 2
上記 Rと Rにおける置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基
1 2
、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、ァリール基、ァリールチオ基、ァリールォキシ 基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基からなる群から選択される請求 項 16から 18記載の免疫担当細胞の誘導方法。
前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、ノ ミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、 ィバンドロン酸、インカドロン酸、ェチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水和物か らなる群から選択される請求項 16から 19いずれか一項記載の免疫担当細胞の誘導 方法。 [21] 前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、 0. 001-20 μ Μである請求 項 16から 20いずれか一項記載の免疫担当細胞の誘導方法。
[22] 前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、 0. 001-5 μ Μである請求 項 21記載の免疫担当細胞の誘導方法。
[23] 前記疾病抗原が、がん抗原又は感染症抗原蛋白、そのペプチド、がん細胞又は感 染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及び、それらの熱処 理物からなる群力も選択される請求項 16から 22いずれか一項記載の免疫担当細胞 の誘導方法。
[24] 前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、 0. 01〜20 μ gZmLである請求項
16から 23いずれか一項記載の免疫担当細胞の誘導方法。
[25] 前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、 0. 1〜2 μ gZmLである請求項 24 記載の免疫担当細胞の誘導方法。
[26] 免疫担当細胞の生産方法であって、請求項 16から 25いずれか一項記載の誘導方 法により免疫担当細胞を誘導することを含む免疫担当細胞の生産方法。
[27] 請求項記載の生産方法により生産された免疫担当細胞。
[28] がん及び Z又は感染症のための医薬組成物であって、請求項 27記載の免疫担当 細胞を含む医薬組成物。
[29] 前記抗原提示細胞が、自己由来又は HLAを同じくする他家由来である請求項 28 記載のがん及び Z又は感染症のための医薬組成物。
[30] がん及び Z又は感染症の予防'治療方法であって、請求項 27記載の免疫担当細 胞を投与することを含む予防'治療方法。
[31] 前記抗原提示細胞が、自己由来又は HLAを同じくする他家由来である請求項 30 記載のがん及び Z又は感染症の予防'治療方法。
[32] ビスホスホネートを有効成分として含有する疾病抗原で感作する際の抗原提示細 胞の活性化促進剤。
[33] 前記抗原提示細胞が、榭状細胞、未成熟榭状細胞、人工抗原提示細胞力 なる 群から選択される請求項 32記載の疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性 化促進剤。 前記ビスホスホネートが下記一般式 (I)で表される化合物、その塩、及び、それらの 水和物であって、
[化 1]
り
Figure imgf000044_0001
上記式 (I)中、 Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、 Rと Rは、それぞれ
1 2
独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、ァリール 基又は置換されたァリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキ ルァミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択 され、又は Rと Rは同じ環状構造の一部を形成し、
1 2
上記 Rと Rにおける置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基
1 2
、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、ァリール基、ァリールチオ基、ァリールォキシ 基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基からなる群から選択される請求 項 32又は 33記載の疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤。 前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、ノ ミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、 ィバンドロン酸、インカドロン酸、ェチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水和物か らなる群から選択される請求項 32から 34いずれか一項記載の疾病抗原で感作する 際の抗原提示細胞の活性化促進剤。
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