WO2007013613A1 - フコイダン又はフコイダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む組成物 - Google Patents

フコイダン又はフコイダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む組成物 Download PDF

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WO2007013613A1
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lactic acid
oligosaccharide
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Yuji Nonaka
Takeshi Yasumoto
Hideo Naoki
Toshihide Kusumoto
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Suntory Limited
Tropical Technology Center Ltd.
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Definitions

  • composition comprising fucoidan or fucoidan hydrolysis product and immunostimulatory material
  • the present invention includes fucoidan or a fucoidan hydrolysis product and an immunostimulatory material, and is intended to enhance food immunity, regulate immune function, etc., food and drink, pharmaceutical, health food, functional food, cosmetics It is related with the composition which can be utilized for such as.
  • Such materials include, for example, microorganisms such as lactobacilli (lactic acid cocci, lactobacilli), yeast and fungi; mushrooms such as shitake, maitake, ganoderma and agaritas; seaweeds; .
  • lactic acid bacteria are attracting attention for their immunostimulatory action, and some lactic acid bacteria have been reported to enhance NK (natural killer) activity and improve ThlZTh2 balance. .
  • lactic acid bacteria have been conventionally used for food and drink and are known to have high safety. Therefore, it is considered that lactic acid bacteria are desirable as a means for recovering the decline in immunity.
  • Fucoidan is a sulfated polysaccharide contained in algae, and has anti-blood coagulation, fat serum clarification (removing cholesterol and peracid lipids in blood), anti-tumor, cancer metastasis, anti-AIDS virus It has been reported to have various activities such as infectious action. Among them, the action of normalizing the immune function of the living body is attracting attention, and it is considered useful as a material for pharmaceuticals and health foods that have an immune function regulating action.
  • fucoidan is a sulfated polysaccharide having a very large molecular weight, and when used as it is as a food or drink, there are problems regarding absorbability, antigenicity, uniformity, anticoagulant activity and the like.
  • Patent Document 3 discloses a method for acid hydrolysis of fucoidan, and describes that the obtained low-molecular fucoidan has a molecular weight distribution of 5 ⁇ 10 3 or less.
  • Patent Document 4 describes a method for obtaining an oligosaccharide by hydrolyzing fucoidan without adding an acid to the external force. A method of hydrolyzing fucoidan with an enzyme as described in Patent Document 5 has also been reported! Speak.
  • Patent Document 1 JP 2005-68092 A
  • Patent Document 2 JP 2004-51504 A
  • Patent Document 3 JP-A-7-215990
  • Patent Document 4 JP 2002-226496
  • Patent Document 5 JP 2000-236889
  • Non-Patent Document 1 Carbohydrate research 4, 189-195 (1967)
  • Non-Patent Document 2 Carbohydrate research 37, 75-79 (1974)
  • Non-Patent Document 3 Carbohydrate research 41, 308-312 (1975)
  • an object of the present invention is to provide a substance capable of enhancing the immune function regulating action by combining immunostimulatory materials.
  • the immune function regulating action referred to here is as shown by some fucoidans that do not indirectly improve immune function by improving the gut microbiota, such as xylooligosaccharides. Directly activates immunocompetent cells.
  • a further object of the present invention is to provide a composition in which an effective amount can be accurately added to a food or drink or a pharmaceutical composition.
  • the present inventor can fucoidan or an acid hydrolysis product of fucoidan, preferably oligosaccharide, in combination with any lactic acid bacterium or an immunostimulatory material to synergistically enhance their immune function regulation or immunostimulatory activity.
  • fucoidan oligosaccharides derived from fucoidan are also referred to as fucoidan oligosaccharides.
  • composition comprising fucoidan or a fucoidan hydrolysis product and an immunostimulatory material
  • the hydrolysis product is obtained by hydrolyzing fucoidan with an acid of 0.1 to 6. ON at 25 to 100 ° C for 0.25 to 2.5 hours.
  • the hydrolysis product is obtained by hydrolyzing fucoidan with an acid of 0.5 to 4. ON at 30 to 90 ° C for 0.5 to 2.0 hours.
  • the oligosaccharide is a disaccharide to pentasaccharide oligosaccharide composed of at least one kind of sugar selected from fucose, sulfated fucose, acetylated fucose, and glucuronic acid, (5) A composition according to claim 1;
  • oligosaccharides As oligosaccharides, the following structural formulas (1), (11), (III), (IV) ⁇ (V) ⁇ (VI), (VII), (VIII), (IX), (X) and (XI) a compound power represented by (6), comprising at least one selected from the compound strengths;
  • the immunostimulatory material is fine, such as lactic acid bacteria (Lactococcus and Lactobacilli), yeast, and fungi. Organisms; mushrooms such as shitake, maitake, ganoderma, agaritas, etc .; immunogenic oligodeoxynucleotides (CpG—ODN) containing CpG motifs, PolyI: C-derived nucleic acids such as C; lipopolysaccharide (LPS), ⁇ -glucan; seaweed; Chinese medicine; cancer vaccines such as ⁇ 46 cancer antigen; concanapalin A (ConA); Krestin (registered trademark), OK-432 (pisibanil, registered trademark), lentinan (registered trademark)
  • BRM biological response modifier
  • composition according to (8), wherein the immunostimulatory material is a lactic acid bacterium
  • a pharmaceutical composition comprising the composition according to any one of (1) to (9);
  • the combination of the fucoidan of the present invention or a hydrolysis product thereof and the immunostimulatory material has a synergistically enhanced immune function regulation or immunostimulatory effect as compared with the case where they are used alone. . Therefore, it is possible to develop products that are more effective than foods and beverages and pharmaceuticals using conventional immunostimulatory materials. In addition, due to its high effect, it is possible to reduce the amount of immunostimulatory material added to foods, beverages, pharmaceuticals, and cosmetics.
  • lactic acid bacteria are used as the immunostimulatory material.
  • lactic acid bacteria with low water solubility can be prevented from precipitation if the amount added can be reduced.
  • the process of selecting lactic acid bacteria having both immunostimulatory activity and favorable fermentation characteristics can be omitted. As a result, development of a product containing lactic acid bacteria can be advantageously promoted.
  • fucoidan or a hydrolysis product thereof which is a constituent element of the composition of the present invention, has a gentle action because it is separated from food material strength, and has extremely high safety.
  • composition of the present invention is very useful, and its application range is not only food and drink, It can also be applied to pharmaceuticals and cosmetics.
  • FIG. 1 is an HPLC chart showing the sugar composition analysis of fucoidan obtained by offshore mozuku hot water extraction.
  • FIG. 2A shows the effect of the acid concentration used in hydrolyzing fucoidan on immunostimulatory activity.
  • FIG. 2B shows the effect of acid concentration used in hydrolyzing fucoidan on immunostimulatory activity.
  • FIG. 3A shows the effect of the reaction temperature when hydrolyzing fucoidan on immunostimulatory activity.
  • FIG. 3B shows the effect of the reaction temperature upon hydrolysis of fucoidan on the immunostimulatory activity.
  • FIG. 4 shows the effect of reaction time on the immunostimulatory activity when hydrolyzing fucoidan.
  • FIG. 5 shows an MS spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 340 represented by the formula (I).
  • FIG. 6 shows an MS spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 486 represented by the formula (II).
  • FIG. 7 shows a 1 H-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 340 represented by formula (I).
  • FIG. 8 shows a 13 C-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 340 represented by the formula (I).
  • FIG. 9 shows a 1 H-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 486 represented by the formula (II).
  • FIG. 10 shows a 13 C-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 486 represented by formula (II).
  • FIG. 11 shows a 1 H-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 390 represented by the formula (III).
  • FIG. 12 shows a 13 C-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 390 represented by the formula (III).
  • FIG. 13 shows a 1 H-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 566 represented by formula (V).
  • FIG. 14 shows a 13 C-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 566 represented by formula (V).
  • FIG. 15 shows a 1 H-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 712 represented by formula (VI).
  • FIG. 16 shows a 13 C-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 712 represented by formula (VI).
  • FIG. 17 shows a 1 H-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 754 represented by formula (VII).
  • FIG. 18 shows a 13 C-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 754 represented by formula (VII).
  • FIG. 19 shows a 1 H-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 808 represented by formula (VIII).
  • FIG. 20 shows a 13 C-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 808 represented by formula (VIII).
  • FIG. 21 shows a 1 H-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 850 represented by formula (IX).
  • FIG. 22 shows the 13 C-NMR spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 850 represented by formula (IX).
  • FIG. 23 shows a 1 H-NMR spectrum after regeneration of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 754 represented by formula (VII).
  • FIG. 24 shows a T OF-MS spectrum after regeneration of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 754 represented by formula (VII).
  • FIG. 25 shows an E SI MSZMS spectrum after regenerating a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 754 represented by formula (VII).
  • FIG. 26 shows the FAB-MS spectrum of the fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 420 represented by the formula (IV).
  • FIG. 27 shows an MSZMS spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 420 represented by the formula (IV).
  • FIG. 28 shows a FAB-MS spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 858 represented by formula (X) and a molecular weight of 900 represented by formula (XI).
  • FIG. 29 shows a FAB-MSZMS spectrum of fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 858 represented by formula (X).
  • FIG. 30 shows a FAB-MSZMS spectrum of a fucoidan oligosaccharide having a molecular weight of 900 represented by formula (XI).
  • FIG. 31 shows an ESI-MS chart that was hydrolyzed offshore mozuku and then fluorescently labeled with ABEE.
  • FIG. 32A shows that the combined use of fucoidan oligosaccharide represented by formula (I) and lactic acid bacteria synergistically enhances the IFN-y induction effect of splenocytes.
  • FIG. 32B shows that the combined use of fucoidan oligosaccharide represented by formula (II) and lactic acid bacteria synergistically enhances the IFN-y induction effect of splenocytes.
  • FIG. 33 shows that the combined use of a fucoidan oligosaccharide mixture and a lactic acid bacterium synergistically increases the IFN-inducing effect of splenocytes.
  • FIG. 34 shows that the combined use of fucoidan oligosaccharide and lactic acid bacteria synergistically increases the IL 12 -inducing effect of rod cells.
  • FIG. 35 shows that the combined use of fucoidan oligosaccharide and lactic acid bacteria synergistically increases the IL 10-inducing effect of rod cells.
  • FIG. 36 shows that the combined use of fucoidan oligosaccharide and lactic acid bacteria synergistically increases CTL activity.
  • FIG. 37 shows synergistic enhancement of IL-12 production by lactic acid bacteria with little activity and fucoidan hydrolysis products.
  • FIG. 38 shows synergistic enhancement of IF ⁇ - ⁇ production by immunostimulators other than lactic acid bacteria and fucoidan hydrolysis products.
  • FIG. 39 demonstrates in vivo that lactic acid bacteria and fucoidan hydrolysis products synergistically enhance sputum activity.
  • FIG. 40 shows that the combined use of fucoidan and lactic acid bacteria synergistically increases the IFN- ⁇ induction effect of splenocytes.
  • An immunostimulatory material refers to a material having an action of enhancing the immune response of an animal. Also called immune enhancement material.
  • the immunostimulatory material used in the present invention is not particularly limited; however, microorganisms such as lactic acid bacteria (Lactococcus, Lactobacillus), yeasts, fungi; Nucleic acid-derived substances such as protogenic oligodeoxynucleotide (CpG—ODN), PolyI: C; lipopolysaccharide (LPS); seaweed; vaginal medicine; cancer vaccine (eg, MM46 cancer antigen); concanaparin A ( ConA); well-known immunostimulants such as BR M (Biological Response Modifier) such as Krestin (registered trademark), OK-432 (Pisibanil, registered trademark), and Lentinan (registered trademark).
  • BR M Bio Response Modifier
  • CpG—ODN is an (short V) oligodeoxynucleotide (ODN) containing unmethylated cytosine-guanine dinucleotide (CpG) and contains such a CpG motif. Can directly activate antigen-presenting cells. As a result, the activity of NK cells and the like by CpG-ODN promotes the induction of Thl-type responses and the generation of cytotoxic T cells (Special Table 2004-519453).
  • Polyl is a polynucleotide copolymer composed of inosinic acid and cytidylic acid, and is also called polyinosine polycytidic acid. In primates, it is generally known to have an effect of increasing the concentration of interferon in body fluids.
  • Lipopolysaccharide is known as a substance that triggers the innate immune system.
  • MM46 is a type of breast cancer or tumor. Cancer antigens such as antigens for MM46 cancer activate immune functions that attack cancer cells and are therefore used in the prevention and treatment of cancer.
  • ConA is a lectin derived from the seeds of Jack bean. It is known to have various immunostimulatory effects.
  • BRM is a drug or treatment method that modifies the interaction between a tumor and a host by enhancing or regulating the immune function of the host in cancer treatment and leads to a therapeutic effect.
  • drugs include OK-432, Krestin (registered trademark), Lentinan (registered trademark), and the like.
  • OK-432 is an anti-neoplastic agent's treatment for lymphangioma, containing Streptococcus' Piogenes (Group A, Type 3) Su strain penicillin-treated lyophilized powder and dried cells as the main components.
  • Krestin is a drug used for the treatment of cancer, which contains a polysaccharide combined with protein obtained from mycelia of power agaric as a main component.
  • Lentinan is j8-1,3-glucan obtained with shitake ability.
  • the lactic acid bacterium used in the present invention is not limited to a specific strain, but is preferably a genus Lact obadllus, and among them, a plant lactic acid bacterium that can ferment a plant material is preferable. Furthermore, Tana or Lactobacillus plantarum is Lactobacillus pentosus. In the present invention, when used in combination with fucoidan or a hydrolysis product thereof, the lactic acid bacteria may be alive or dead.
  • the fucoidan used as a raw material for the composition of the present invention may have any structure and may acquire any algae power.
  • algae include Sphac elariales, Chordariales, Scytosiphonales, Dictyosiphonaies, Mutemo (Sporochnales, Sporochnales) (Dictyotales), Laminariales, and the seaweeds of Phaeophyceae, including the order of Fucales, preferably mozuku, more preferably offshore mozuku-derived fucoidan.
  • Fucoidan is preferably extracted from algal power as described above, but may be used in a state of being contained in algae.
  • the fucoidan hydrolysis product is obtained by subjecting fucoidan or algae containing it to the subsequent hydrolysis step.
  • the fucoidan hydrolysis product refers to sugar derivatives including monosaccharides and polysaccharides obtained by hydrolyzing fucoidan, which is a sulfated polysaccharide, and mixtures thereof.
  • the fucoidan hydrolysis product is preferably a polysaccharide, more preferably an oligosaccharide consisting of 2 to 10 monosaccharides, and even more preferably an oligosaccharide consisting of 2 to 5 monosaccharides.
  • the above oligosaccharide obtained by hydrolyzing fucoidan is also referred to as fucoidan oligosaccharide.
  • the monosaccharide constituting the oligosaccharide is preferably fucose, sulfated fucose, acetylated fucose, and Z or glucuronic acid.
  • Particularly preferred oligosaccharides are compounds of the above formulas (I) to (XI).
  • the fucoidan hydrolysis product is produced as follows.
  • the fucoidan hydrolysis product which is a constituent element of the present invention is obtained by hydrolyzing fucoidan by a method using an acid or an enzyme.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and nitric acid may be used, and organic acids such as acetic acid, citrate, oxalic acid, succinic acid, formic acid, and propionic acid are used. Also good.
  • Preferred acids are hydrochloric acid and sulfuric acid.
  • the following acid hydrolysis conditions are used.
  • the fraction or fucoidan containing fucoidan obtained as described above is used as an acid, preferably hydrochloric acid, 0.1 to 6.
  • the obtained reaction product is neutralized with a base, for example, about 1N NaOH, desalted by an appropriate means such as electrodialysis or gel filtration, and dried (for example, freeze-dried) to obtain a fucoidan oligosaccharide mixture.
  • a hydrolysis product containing can be obtained.
  • the hydrolysis product thus obtained may be used as a fucoidan hydrolysis product as it is, but it can be further purified to increase its activity.
  • purification of the fucoidan hydrolysis product methods such as chromatography, recrystallization, dialysis, and alcohol precipitation can be used alone or in combination.
  • purification is performed according to the following procedure.
  • a fucoidan hydrolysis product containing an oligosaccharide mixture is subjected to chromatography using an anion exchange resin, and passes through without adsorption, and contains an oligosaccharide containing no sulfate group.
  • the fraction neutral / acidic sugar fraction
  • the fraction is separated from the fraction containing sulfated oligosaccharides (sulfated sugar fraction) that are eluted by the acidic eluate.
  • each of the fractions thus obtained is preferable to use as a fucoidan hydrolysis product. It may be used after being isolated.
  • the sulfate-sucrose oligosaccharides (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX ), (X), or (XI)
  • Each component can be isolated.
  • Each oligosaccharide may be appropriately labeled or derivatized for easier purification and structural analysis.
  • oligosaccharides can be fluorescently labeled with a reagent such as 4-amino benzoate (ABEE), which facilitates oligosaccharide detection.
  • ABEE 4-amino benzoate
  • Pure oligosaccharides can be obtained by separating each labeled oligosaccharide and then removing the labeled portion.
  • Fucoidan is a combination of 7k-decomposed cattle and immunized materials.
  • the present invention is a composition comprising a combination of fucoidan or a hydrolysis product thereof obtained as described above and an immunostimulatory material. Such a combination synergistically enhances the immune function regulating action and Z or immune activation action of fucoidan or a hydrolysis product thereof and the immunostimulatory material.
  • a single fucoidan oligosaccharide may be used as a fucoidan hydrolysis product in combination with an immunostimulatory material (for example, lactic acid bacteria). Also, use multiple fucoidan oligosaccharides, for example three or more, in combination with an immunostimulatory material.
  • an immunostimulatory material for example, lactic acid bacteria.
  • multiple fucoidan oligosaccharides for example three or more, in combination with an immunostimulatory material.
  • a lactic acid bacterium When used in the combination of the present invention, it may be alive or dead.
  • oligosaccharides known as prebiotics such as xylo-oligosaccharides enhance the function of regulating immune functions mainly by promoting the growth of lactic acid bacteria.
  • the hydrolyzed product of the present invention is superior to the oligosaccharide used as a conventional prebiotic in that it can enhance the function of regulating immune functions caused by dead bacteria.
  • the preferred U, ratio of fucoidan or its hydrolysis product to be used for the immunostimulatory material is 1: 1 to LOOOO: 1, more preferably 250: 1 to 1000: 1 by weight.
  • fucoidan or a hydrolysis product thereof and an immunostimulatory material are used in combination to synergize their immune function regulation and Z or immunostimulatory action. Also included is a method of enhancing.
  • the combination of the present invention can be used for, for example, foods and drinks, pharmaceuticals, cosmetics, and the like to impart an immune function regulating action thereto.
  • the function of regulating immune function in the present specification refers to an action of enhancing a lowered immune response in a living body and suppressing Z or an enhanced immune response. Therefore, the action includes immunostimulatory action and immunosuppressive action.
  • the immune function-modulating action in the present specification can be measured by a method known in the art. It can be measured using, for example, an effect of inducing a site force-in having an immune function regulating effect as an index. Site force ins used for this purpose include interferon- ⁇ , interleukin-10, 12 and the like. In addition, the immune function-modulating action can be measured using maturation of rod cells involved in the immune response or the activity of cytotoxic rod cells (CTL) as an index.
  • CTL cytotoxic rod cells
  • the immune function-modulating agent of the present invention can be used for health promotion.
  • tumors eg, cancer metastasis, viral diseases (eg, case, AIDS, viral hepatitis), allergic diseases (eg, pollen) , Allergic rhinitis, atopy, asthma), autoimmune diseases (eg, rheumatoid arthritis), inflammatory diseases, diseases or conditions such as diabetes.
  • viral diseases eg, case, AIDS, viral hepatitis
  • allergic diseases eg, pollen
  • Allergic rhinitis eg, rhinitis
  • atopy atopy
  • asthma e.g, rheumatoid arthritis
  • inflammatory diseases eg, rheumatoid arthritis
  • Fucoidan is a 7k-decomposed cattle product.
  • the food additive containing the same and having an immune function-modulating action, food and drink, and immune function to which it is added It is preferably applied as a health food having a regulating action.
  • these can be mixed with various components such as known sweeteners, acidulants, vitamins, etc. to make products that suit the tastes of users.
  • Foods and beverages include, for example, tablets, strength drugs, soft drinks, tea drinks, drinks, dairy products such as yogurt and lactic acid bacteria drinks, seasonings, processed foods, desserts, and confectionery (e.g.
  • the food and drink of the present invention has a functional food (specific health food or conditionally specified health food) with a label indicating that it has an immune function-modulating effect on a container or instructions.
  • Product is included).
  • the labeling location is not limited to the ability to include the container or instructions attached to it.
  • Containers include, but are not limited to, bottles, cans, plastic bottles, plastic bottles, paper packs, and the like.
  • the display method is not limited to force including printing, stamping, and stickers.
  • the food and drink can be pet food or animal feed processed as pet food!
  • the present invention is a pharmaceutical composition comprising fucoidan or a hydrolysis product thereof and an immunostimulatory material, having an immune function regulating action, an immunostimulatory action, an antiallergic action, and an epilepsy or immunosuppressive action. .
  • the pharmaceutical composition is a pharmaceutical formulation technology such as diluent, carrier, excipient, binder, disintegrant, lubricant, flavoring agent, solubilizer, suspension agent, coating agent, etc. It can be formulated using known adjuvants that are usually used in the field. Examples of the dosage form include tablets, capsules, granules, powders, liquids, syrups, suppositories, creams, ointments, emulsions, hats, injections, etc. Absent.
  • the route of administration of the drug is not particularly limited, and includes, for example, oral administration, rectal administration, enteral administration and the like.
  • a cosmetic product having an immune function regulating action can be produced.
  • Cosmetics containing the combination of the present invention are, for example, facial cream, skin cream, hair cream, lotion, gel, mousse, shampoo, rinse and the like.
  • composition containing the combination of the present invention may be used by itself in foods and drinks, pharmaceutical compositions and cosmetics, but is a food material or substance having other immune function regulating action or immunostimulating action. It is also suitable to use together.
  • Such food ingredients or Examples of substances include lactic acid bacteria, mushrooms, and fucoidan.
  • the food / beverage product or composition of the present invention contains general ingredients such as carriers, diluents, excipients or additives according to specific embodiments. Can be blended.
  • the diluent, carrier and excipient are not particularly limited as long as they do not interfere with the physiological activity of fucoidan or a hydrolyzate thereof and an immunostimulatory material.
  • sucrose, glucose, fructose, maltose, trehalose for example, sucrose, glucose, fructose, maltose, trehalose.
  • Sugars such as lactose, starch, starch syrup, and catalyzed liquid sugar, alcohols such as ethanol, propylene glycol, glycerin, sorbitol, mannitol, erythritol, ratathitol, xylitol, maltitol, reduced palatinose, reduced starch degradation products
  • sugar alcohols such as triacetin, polysaccharides such as gum arabic, carrageenan, xanthan gum, guar gum, dielan gum and pectin, and water.
  • additives include auxiliaries such as chelating agents, fragrances, spice extracts, and preservatives. Diluents, carriers, additives and the like can be blended so long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the amount of fucoidan or a hydrolyzate thereof and an immunostimulatory material in foods and drinks, pharmaceutical compositions and cosmetics is appropriately selected depending on the relationship with other selected ingredients and is particularly limited. Is not to be done.
  • the total amount of fucoidan or its hydrolyzed product and immunostimulatory material is usually 0.01 to 10 gZ per 60 kg of individual body weight when added to a pharmaceutical composition in a beverage or food. Day, preferably 0.05 g to lgZ day, particularly preferably 0.05 g to 0.5 gZ day.
  • 0.01 to 20% by weight, preferably 0.05 to 15% by weight is used!
  • the fucoidan of the present invention or a hydrolysis product thereof and an oligosaccharide can be used alone in a food and drink, a pharmaceutical composition or a cosmetic as an extracted purified product or a synthesized product.
  • the obtained aqueous solution was neutralized with 2N NaOH, and labeled with ABEE to prepare a sample for monosaccharide analysis.
  • Fucoidan hydrolysis products were obtained under the various conditions described below, and the immune function regulating action was examined using a combination of these with lactic acid bacteria.
  • the fucoidan obtained in Example 1 is 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0N HC1. (80.C) for 1 hour, and then 0.1%, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 5.
  • fucoidan hydrolysis product was obtained. This was added at a concentration of 100 ⁇ g Zml to splenocytes (5 ⁇ 10 6 cells / ml) isolated from C57BLZ6 mice (8 weeks old, male, Nippon Charles River Co., Ltd.).
  • Lactic acid bacteria (Lactobacillus pentosus: FERM ABP-10028) were added, cultured for 24 hours, the culture supernatant was collected, and the production of IFN-y was measured using an ELISA kit (OptEIA, BD Pharmingen) (Fig. 2A).
  • OptEIA BD Pharmingen
  • Fig. 2A the same operation as described above was performed without using lactic acid bacteria (white bar graph). For comparison, the ones with nothing added (“none” in the white bar graph) and the ones with only lactic acid bacteria (“none” in the black bar graph) were used.
  • Fucoidan is 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100. After hydrolyzing with 1N HC1 of C for 1 hour, neutralized by adding 1N NaOH, desalted by electrodialysis and freeze-dried to obtain a fucoidan hydrolysis product. This was added to splenocytes (5 ⁇ 10 ° cells / ml) separated at a concentration of 100 gZml in C5 7BLZ6 mice (8 weeks old, male, Charles River Japan Co., Ltd.).
  • Fucoidan is hydrolyzed with IN HC1 (80 ° C) for 30, 60, 120 minutes, neutralized by adding 1N NaO H, desalted by electrodialysis, freeze-dried, and then hydrolyzed. The product was obtained. This was added at a concentration of 100 gZml to splenocytes (5 ⁇ 10 6 cells / ml) isolated from C57BLZ6 mice (8 weeks old, male, Charles River Japan Co., Ltd.).
  • the fucoidan hydrolysis product has a synergistically enhanced immune function regulation or immunostimulatory effect when used in combination with lactic acid bacteria.
  • oligosaccharide fractions were obtained by elution with water.
  • the sulfated sucrose fraction was subjected to gel filtration (Biogel P-6) and divided into Fr. A having a molecular weight of less than 500 and Fr. C having a molecular weight of 500 or more.
  • an oligosaccharide mixture was obtained by elution with 2N HC1 and 280 mg of a fraction containing oligosaccharides not containing sulfate groups (neutral 'acidic sugar fraction) obtained by elution with water and 2N HC1.
  • the fraction containing oligosaccharides containing a large amount of sulfate groups (sulfated sugar fraction) was separated into 425 mg.
  • the neutral / acidic sugar fraction lOOmg obtained in a) is subjected to gel filtration (Biogel P-4 (Bio-Rad), elution solvent: 0.2M potassium borate (KBO) aqueous solution).
  • Table 2 Results of 1 H-NMR and C-NMR analysis of the compound (I) labeled with ⁇ .
  • Acetic acid 410 1 was added and stirred at 65 ° C for 4 hours.
  • the product obtained is dried in vacuo, partitioned between water and chloroform, and the aqueous layer is separated on a reverse phase column (carrier: Lichroprep RP-8 (25—40 m) (Merck), ⁇ 10 X 220 mm; Solvent conditions: 5% CH CNZO. 1% TFA (100ml)
  • Aqueous TFA solution was eluted with a concentration gradient of 5 to 30%, and the molecular force of 39, 715, 861, 903, 957, and 999, and 6 labeled ⁇ fucoidan oligosaccharides with sulfate groups were mixed and separated (molecular weight Was determined by ESI-MS).
  • the obtained labeled oligosaccharide was measured for NMR spectrum and analyzed.
  • 1 H-NMR and 13 C-NMR charts of labeled oligosaccharides are shown in FIGS. 11 to 22, and the analysis results thereof are shown in Tables 4 to 7.
  • ABEE was removed by binding on each oligosaccharide, and a regenerated oligosaccharide product was obtained. Specifically, 10 1 each of hydrogen peroxide and acetic acid were added to 10 mg (100 1) of each of the labeled oligosaccharides thus separated, and the mixture was allowed to stand overnight, and then dried. Of the regenerated oligosaccharides obtained in this way, those obtained from a compound with a molecular weight of 903 were obtained using 1 H-NMR (Fig.
  • GlcA— (1 ⁇ 2) L Fuc, a trisaccharide with a molecular weight of 566, is represented by the formula (V) ⁇ — L Fuc -4-O-SO—— (1 ⁇ 3)-[a— D— GlcA— ( l ⁇ 2)] — L—Fuc, molecular weight 71
  • the tetrasaccharide of 2 is represented by the chemical formula (VI) a -L-Fuc-4-O -SO 1 ⁇ 3) — [a—D
  • a pentasaccharide with a molecular weight of 900 is represented by the chemical formula (XI) a —L— Fuc— 4— 0— SO
  • Fucoidan oligosaccharide (compound (I)) having a molecular weight of 340 was added to wells so as to be 100 gZml in 5 ⁇ 10 6 cells / ml of splenocytes prepared in the same manner as in Example 3.
  • fucose, sulfated fucose (MW164 and 244, respectively) and xylooligosaccharide (XOS) were used in equal amounts.
  • lactic acid bacteria Lacobacillus pentosus: FERM ABP-10028
  • the amount of ( ⁇ ) was 10, 100 and 300 gZml in well (FIG. 32B).
  • Fucoidan oligosaccharides act on TL 10, ⁇ 2 humility, and strong CTL activity in mouse cells
  • BALBZc mice (8 weeks old, male, Japan SLC, Inc.) the femoral force marrow cells were separated, so as to l X 10 6 cells / ml, 10% FBS, 20ng / ml GM- CSF (Peprotec), 20ng It was suspended in RPMI 1640 medium containing / ml IL-3 (Peprotec) and cultured in a 24-well plate. On the 3rd and 5th days from the start of the culture, the medium was changed to obtain adherent immature rod-like cells. The resulting rod-shaped cells were pretreated with compounds (1), (11), (111), (V), (VI), and (VII) at a concentration of 50 gZml, respectively.
  • lactic acid bacteria Lactobacillus pentosus iFERM ABP-10028 (dead bacteria) (dead bacteria) were added to each well in an amount of 0.1 gZml. After culturing for 2 days, the culture supernatant and cells were collected. In addition, in order to confirm the effect of the sugar compound alone, the same operation as described above was performed without adding lactic acid bacteria.
  • the collected cells were counted, prepared to 1 X 10 5 cellsZml, treated with mitomycin C (50 gZml) in 1 ml of cell suspension, and reacted at 37 ° C for 30 minutes. After completion of the reaction, mitomycin C was removed by washing with PBS, and 1 ml of C57BL / 6 mouse spleen cells (5 ⁇ 10 6 cells / ml) prepared by a conventional method was added and mixed and cultured for 4 days. After culture, the cells were collected and killed by targeting P-815 cells (SOOOcellsZlOO / zl) with C57BLZ6 mouse alloantigen for 4 hours at an E: T ratio of 40: 1 and 80: 1. CTL activity was determined by counting the number of P-815 by flow cytometry ( Figure 36). Compounds (1), (111), (V), (VI), and (VII) have enhanced CTL activity when used in combination with lactic acid bacteria. I understand.
  • Example 7 The results of Example 7 also indicate that the fucoidan hydrolysis product of the present invention is combined with lactic acid bacteria to provide a synergistically enhanced immune function regulation or immunostimulatory effect.
  • BALBZc mice (8 weeks old, male, Japan SLC Co., Ltd.) were administered intraperitoneally with 4. 05% thioglycolate medium (Difco), and 4 days later, cells that had infiltrated intraperitoneally were collected using 10 ml of PBS. . Thereafter, the cells were prepared to 1 ⁇ 10 6 cells / ml and cultured in a 24-well plate. Three hours after the start of the culture, floating cells were removed by medium exchange to obtain macrophages. Compound (I) and the oligosaccharide fraction described in Example 3 were added to each well at a concentration of 100 gZml. After 30 minutes, the immune function-controlling activity was strong!
  • Lactobacillus pentosus DS84C strain FE RM ABP-10028 received at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center on May 26, 2004
  • lactic acid bacterium A Commercially available Lactobacillus pentosus
  • lactic acid bacteria B Commercially available Lactobacillus plantarum (hereinafter referred to as lactic acid bacteria B)) was added at a concentration of 0.1 ⁇ g Zml and cultured for 24 hours. Thereafter, the culture supernatant was collected, and the production amount of IL-12 was measured (FIG. 37). For comparison, the same operation as above was performed using each of these three strains alone.
  • C57BLZ6 mice (8 weeks old, male, Nippon Charles River Co., Ltd.) force Spleen cells were isolated, prepared to 5 ⁇ 10 6 cells / ml, and cultured in 24-well plates. Fr of Example 3 .C fractions were added to each well at 30 / z gZml each. 30 minutes later, Polyl: C (SIGMA) 5 ⁇ g / ml, LPS (SIGMA) 2 ng / ml, CpG— ODN (5,-TCC ATG ACGTTCCTG) ATGCT-Obtained from 3 'integrated DNA Technologies, Inc.
  • MM46 cancer antigen MM46 breast cancer cells were homogenized in HANK' S solution (Nacalai Testa) and extracted from the protein: Teikyo University Medical School 50 ng prote in / ml and ConA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were supplied at 0.25 / ⁇ 8 ⁇ 1, each well. After culturing for 24 hours, the culture supernatant was collected, and the amount of IFN-y produced was measured using an ELISA kit (OptEIA, BD Pharmingen) (FIG. 38). For comparison, the same operation as described above was performed without using Fr. C. Each immune function modulator exerted almost no force to induce IFN- ⁇ at the concentration used in this experiment.
  • fucoidan hydrolysis products and oligosaccharides obtained therefrom can synergistically regulate their immunostimulation or immune function even when used in combination with other immunostimulatory materials as well as when used in combination with lactic acid bacteria. It became clear that the effect increased.
  • C57BLZ6 mice (8-week-old male, Charles River Japan Co., Ltd.) were divided into 4 groups, each with fucoidan hydrolyzed product alone (sulfated sugar fraction 500 mg / kg as described in Example 3, “Fucoidan oligo” Sugar ”), lactic acid bacteria alone (0.2 mg / kg), fucoidan hydrolysis products + lactic acid bacteria (“ lactic acid bacteria + fucoidan oligosaccharide ”in FIG. 39) were mixed in drinking water and allowed to ingest freely. The control group received tap water.
  • mouse force splenocytes were isolated according to a standard method, and sputum activity was measured using Yac-1 cells (5000 cells Zl00 ⁇ 1) as a target.
  • Vaginal activity was calculated by reacting at a ratio of 20: 1, 40: 1 for 4 hours and counting the number of killed Yac-1 by flow cytometry (Figure 39).
  • NK activity was enhanced by ingesting fucoidan oligosaccharides obtained by Fucoidanka et al.
  • fucoidan oligosaccharide and lactic acid bacteria increased NK activity. Therefore, by ingesting the combination of fucoidan hydrolysis products and lactic acid bacteria, It was also confirmed in vivo that Noh was active.

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Abstract

　乳酸菌などの免疫賦活素材の活性を増強させる素材を提供すること。そのような素材を提供することにより、免疫賦活素材の使用量を低減させることが可能となる。また、そのような素材を提供することにより、強力な免疫賦活活性と好ましい発酵特性を有する乳酸菌の選抜にかかる時間を短縮させることも可能となる。これら目的のため、フコイダンを酸加水分解することにより得られる生成物またはオリゴ糖を免疫賦活素材と組み合わせて用いる。このような組み合わせにより、それらの免疫機能調節作用または免疫賦活活性を相乗的に増強する。

Description

明 細 書
フコィダン又はフコィダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む組成 物
技術分野
[0001] 本発明は、フコィダン又はフコィダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含み、免 疫力の増強、免疫機能の調節などを目的とした飲食品、医薬品、健康食品、機能性 食品、化粧品等に利用可能な組成物に関する。
背景技術
[0002] 免疫陚活素材
近年、健康食品分野においては、免疫賦活作用を有する素材が注目されており、 それらを含む健康食品が多く開発されている。これらは、加齢やストレス、疾患などに より低下した免疫力の回復等の目的に用いられる。そのような素材には、例えば、乳 酸菌 (乳酸球菌、乳酸桿菌）、酵母、真菌類のような微生物;シィタケ、マイタケ、霊芝 、ァガリタスなどのキノコ類;海藻類;漢方薬等が含まれる。
[0003] 乳酸菌
上記免疫賦活素材の中でも、乳酸菌は、その免疫賦活作用が注目されており、一 部の乳酸菌に関して、 NK (ナチュラルキラー)活性を増強する作用や ThlZTh2バ ランスを改善する作用等が報告されている。また、乳酸菌は、従来から飲食用に供さ れており、安全性が高いことも知られている。従って、乳酸菌は、免疫力の低下を回 復する手段として望まし 、と考えられる。
[0004] 乳酸菌の免疫賦活作用の効果を高めるには、飲食品中の乳酸菌の含量を増やせ ばよい。しかし、乳酸菌を多量に飲料などに添加すると沈殿を生じるという問題があつ た。このような理由から、これまで乳酸菌を用いた飲食品としては、漬物のような固体 のものや、沈殿が気にならない飲食品（たとえばヨーグルトや乳飲料）がほとんどだつ た。また、たとえばヨーグルトのように、発酵により乳酸菌を増やす場合でも、乳酸菌 の数が一定量に達すればそれ以上は増えないため、飲食品中の乳酸菌含量を増や すのには限界があった。しかも、発酵食品を作る以上、機能だけでなぐ発酵の度合 い、発酵後の香味、発酵後の乳酸菌の数、なども考慮する必要があった。従って、乳 酸菌を用いて機能性飲食品、特に免疫機能調節を目的とした機能性発酵飲食品を 開発するためには、発酵特性に優れ、かつ免疫機能調節作用にも優れた乳酸菌を 用いることが必須である。しかし、乳酸菌の発酵特性と免疫機能調節作用には全く相 関が無い。したがってこのような乳酸菌を探索するのは容易なことではない。
[0005] 近年では乳酸菌などの免疫賦活素材の活性を高めるためのいくつかの方法が報 告されている。たとえば、 3〜8種の乳酸菌や酵母を混合培養することで免疫賦活作 用が増強するという報告や (特許文献 1)、乳酸菌とキノコを併用することで免疫賦活 作用を増強させる方法 (特許文献 2)などの報告がある。
[0006] フコィダンおよびフコィダン加水分解牛.成物
フコィダンは藻類に含まれる硫酸化多糖であり、抗血液凝固作用、脂血清澄作用（ 血液中のコレステロールや過酸ィ匕脂質を除去する作用）、抗腫瘍作用、癌転移抑制 作用、抗エイズウイルス感染作用等の様々な活性を有することが報告されている。中 でも、生体の免疫機能を正常化する作用が注目されており、免疫機能調節作用を有 する医薬品や健康食品の素材として有用であると考えられている。しかし、フコィダン は分子量が極めて大きい硫酸ィ匕多糖であり、そのまま飲食品や医薬品等として用い る際には、吸収性、抗原性、均一性、抗凝血活性等に関する問題がある。
[0007] これらの問題を解決するために、フコィダン力 低分子化合物を得るための試みが いくつかなされている。例えばこれまでに、化学合成によるフコース含有オリゴ糖が報 告されているが (非特許文献 1、 2および 3)、これらは有機合成反応により調製されて いるため食品などに使用するのは好ましくな力つた。
[0008] 一方、フコィダンを加水分解してフコィダンを低分子化する方法も報告されている。
例えば、特許文献 3には、フコィダンを酸加水分解する方法が開示されており、得ら れた低分子フコィダンは、 5 X 103以下の分子量分布を有していたことが記載されて いる。また、特許文献 4には、酸を外部力も添加することなくフコィダンを加水分解し てオリゴ糖を得る方法が記載されている。また、特許文献 5のように酵素によりフコィ ダンを加水分解する方法も報告されて！ヽる。
特許文献 1：特開 2005 - 68092 特許文献 2：特開 2004 - 51504
特許文献 3 :特開平 7— 215990
特許文献 4：特開 2002— 226496
特許文献 5：特開 2000 - 236889
非特許文献 1 : Carbohydrate research 4, 189-195 (1967)
非特許文献 2 : Carbohydrate research 37, 75-79 (1974)
非特許文献 3 : Carbohydrate research 41, 308-312 (1975)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] し力しながら、特許文献 1および 2の方法では、 V、ずれも不溶性素材同士を組み合 わせる方法であって、沈殿を防ぐことには至っていない。また、乳酸菌以外の免疫賦 活素材の活性を効果的に高めるような素材については、これまで検討がなされてい ない。
[0010] そこで、免疫賦活素材や乳酸菌の活性を相乗的に高める水溶性素材があれば、よ り強い効能を持った免疫機能調節剤や飲食品が開発できるだけでなぐ活性を維持 したまま免疫賦活素材や乳酸菌の使用量を減らすこともできるため、結果として免疫 賦活素材や乳酸菌の含有食品の開発範囲が広げることができる。更には良好な発 酵特性と免疫機能調節作用を兼ね備えた乳酸菌を探索する負担も軽減される。また 、食品や医薬品における用途を考慮すると、その物質は安全性が高くかつ簡便に製 造できるものであることが必要とされる。
[0011] したがって本発明の目的は、免疫賦活素材を組み合わせることによりそれらの免疫 機能調節作用を増強することができる物質を提供することである。
[0012] なお、ここでいう免疫機能調節作用とは、例えばキシロオリゴ糖のように腸内細菌叢 を改善して間接的に免疫機能を整えるものではなぐいくつかのフコィダンで示され ているように直接的に免疫担当細胞を活性ィ匕するものを指す。
[0013] 本発明のさらなる目的は、効果量を的確に飲食品または医薬組成物に添加するこ とができる組成物を提供することである。
課題を解決するための手段 [0014] 本発明者は、フコィダン又はフコィダンの酸加水分解生成物、好ましくはオリゴ糖を 任意の乳酸菌や免疫賦活素材と組み合わせることでそれらの免疫機能調節または 免疫賦活活性が相乗的に増強することを見出し、本発明の完成に至った。本発明に おいては、フコィダン由来のそれらオリゴ糖をフコィダンオリゴ糖とも称する。
[0015] すなわち本発明は、
(1)フコィダン又はフコィダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む組成物；
(2)加水分解生成物が、フコィダンを 0. 1〜6. ONの酸で、 25〜100°C、 0. 25〜2 . 5時間加水分解して得られるものである、（1)に記載の組成物；
(3)加水分解生成物が、フコィダンを 0. 5〜4. ONの酸で、 30〜90°C、 0. 5〜2. 0 時間加水分解して得られるものである、 (2)に記載の組成物；
(4)加水分解が塩酸又は硫酸で行なわれる、 (1)〜（3)のいずれか 1つ記載の組成 物；
(5)加水分解生成物がオリゴ糖である、 (1)〜 (4)のいずれか 1つに記載の組成物；
(6)オリゴ糖が、フコース、硫酸化フコース、ァセチル化フコース、及びグルクロン酸 力 なる群力 選択される少なくとも一種の糖で構成される二糖から五糖までのオリゴ 糖である、（5)に記載の組成物；
(7)オリゴ糖として、下記構造式 (1)、 (11)、（III)、 (IV)ゝ (V)ゝ (VI)、（VII)、（VIII)、 (IX )、（X)および (XI)で示される化合物力 選択される少なくとも一種を含む、（6)に記 載の組成物；
[0016] [化 1]
Figure imgf000006_0001
[0017] (分子量 340)
[0018] [化 2]
Figure imgf000007_0001
[0019] (分子量 486) [0020] [化 3]
Figure imgf000007_0002
[0021] (分子量 390) [0022] [化 4]
Figure imgf000007_0003
[0023] (分子量 420) [0024] [化 5]
Figure imgf000007_0004
[0025] (分子量 566)
[0026] [ィ匕 6]
Figure imgf000008_0001
[0027] (分子量 712) [0028] [化 7]
Figure imgf000008_0002
[0029] (分子量 754) [0030] [化 8]
Figure imgf000008_0003
[0031] (分子量 808)
[0032] [化 9]
Figure imgf000009_0001
[0033] (分子量 850)
[0034] [化 10]
Figure imgf000009_0002
[0035] (分子量 858)
[0036] [化 11]
Figure imgf000009_0003
[0037] (分子量 900)
(8)免疫賦活素材が、乳酸菌 (乳酸球菌および乳酸桿菌)、酵母、真菌類のような微 生物；シィタケ、マイタケ、霊芝、ァガリタスなどのキノコ類; CpGモチーフを含む免疫 原性オリゴデォキシヌクレオチド（CpG— ODN)、 PolyI : Cのような核酸由来物質；リ ポ多糖 (LPS)、 β—グルカン;海藻類;漢方薬; ΜΜ46癌抗原のような癌ワクチン;コ ンカナパリン A(ConA)；クレスチン（登録商標）、 OK— 432 (ピシバニール、登録商 標）、レンチナン (登録商標）のような BRM (生物学的応答修飾剤)から選択される少 なくとも一種である、 (1)〜（7)のいずれか 1つに記載の組成物；
(9)免疫賦活素材が乳酸菌である、 (8)に記載の組成物；
(10) (1)〜（9)の 、ずれか 1つに記載の組成物を含む免疫機能調節剤；
(11) (1)〜（9)のいずれか 1つに記載の組成物を添加した飲食品；
(12) (1)〜（9)のいずれか 1つに記載の組成物を含有し、免疫機能調節作用を有 する旨の表示を付した飲食品；
(13) (1)〜（9)のいずれか 1つに記載の組成物を含む医薬組成物；および
(14) (1)〜（9)のいずれか 1つに記載の組成物を含む化粧品
に関する。
発明の効果
[0038] 本発明のフコィダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材との組み合わせは、 それらを単独で用いた場合と比較して、相乗的に増強された免疫機能調節または免 疫賦活作用を有する。従って、これまでの免疫賦活素材を用いた飲食品や医薬品よ りも効果が高い製品を開発することが可能となる。また、その高い効果のため、免疫 賦活素材の飲食品、医薬品、化粧品への添加量を減らすことも可能となる。
[0039] これらの利点は、免疫賦活素材として乳酸菌を用いる際に特に重要となる。例えば 、水溶性の低い乳酸菌においては、その添加量を削減できれば、その沈殿を防止で きる。また、免疫賦活活性と好ましい発酵特性を兼ね備えた乳酸菌を選抜する過程 も省略できる。結果として、乳酸菌含有製品の開発を有利に進めることができる。
[0040] また、本発明の組成物の構成要件であるフコィダン又はその加水分解生成物は、 食品素材力 分離されたものであるため穏やかな作用を有し、極めて安全性が高 、
[0041] 従って、本発明組成物は非常に有用であり、その応用範囲は飲食品のみならず、 医薬品およびィ匕粧品にも適用可能である。
[0042] また、オリゴ糖として、上記構造式 (I)、 (II)、 (III)、 (IV)、 (V)、 (VI)、 (VII)、 (VIII)、
(IX)、（X)および (XI)で示される化合物カゝら選択される少なくとも一種を含むものを 用いることにより、簡便かつ正確に品質管理できる。また、これらフコィダン由来オリゴ 糖は低分子で扱いやすくまた簡便に製造でき、安全性も高いため、これらオリゴ糖を 免疫賦活素材と組み合わせた組成物は、飲食品や医薬品等、様々な用途に用いる ことができる。
図面の簡単な説明
[0043] [図 1]図 1は、沖縛モズク力 熱水抽出により得られるフコィダンの糖組成分析を示す HPLCチャートである。
[図 2A]図 2Aは、フコィダンを加水分解する際に用!ヽる酸濃度が免疫賦活活性に及 ぼす影響を示す。
[図 2B]図 2Bは、フコィダンを加水分解する際に用いる酸濃度が免疫賦活活性に及 ぼす影響を示す。
[図 3A]図 3Aは、フコィダンを加水分解する際に反応させる温度が免疫賦活活性に 及ぼす影響を示す。
[図 3B]図 3Bは、フコィダンを加水分解する際に反応させる温度が免疫賦活活性に 及ぼす影響を示す。
[図 4]図 4は、フコィダンを加水分解する際に反応させる時間が免疫賦活活性に及ぼ す影響を示す。
[図 5]図 5は、式（I)で表される分子量 340のフコィダンオリゴ糖の MSスペクトルを示 す。
[図 6]図 6は、式（II)で表される分子量 486のフコィダンオリゴ糖の MSスペクトルを示 す。
[図 7]図 7は、式（I)で表される分子量 340のフコィダンオリゴ糖の1 H— NMR^ぺクト ルを示す。
[図 8]図 8は、式（I)で表される分子量 340のフコィダンオリゴ糖の13 C— NMRスぺタト ルを示す。 [図 9]図 9は、式（II)で表される分子量 486のフコィダンオリゴ糖の1 H—NMR^ぺクト ルを示す。
[図 10]図 10は、式（II)で表される分子量 486のフコィダンオリゴ糖の13 C— NMRスぺ タトルを示す。
[図 11]図 11は、式（III)で表される分子量 390のフコィダンオリゴ糖の1 H— NMRスぺ タトルを示す。
[図 12]図 12は、式（III)で表される分子量 390のフコィダンオリゴ糖の13 C—NMRスぺ タトルを示す。
[図 13]図 13は、式 (V)で表される分子量 566のフコィダンオリゴ糖の1 H— NMRスぺ タトルを示す。
[図 14]図 14は、式 (V)で表される分子量 566のフコィダンオリゴ糖の13 C— NMRスぺ タトルを示す。
[図 15]図 15は、式 (VI)で表される分子量 712のフコィダンオリゴ糖の1 H - NMRスぺ タトルを示す。
[図 16]図 16は、式 (VI)で表される分子量 712のフコィダンオリゴ糖の13 C— NMRス ぺクトノレを示す。
[図 17]図 17は、式 (VII)で表される分子量 754のフコィダンオリゴ糖の1 H - NMRス ぺクトノレを示す。
[図 18]図 18は、式 (VII)で表される分子量 754のフコィダンオリゴ糖の13 C—NMRス ぺクトノレを示す。
[図 19]図 19は、式 (VIII)で表される分子量 808のフコィダンオリゴ糖の1 H— NMRス ぺクトノレを示す。
[図 20]図 20は、式 (VIII)で表される分子量 808のフコィダンオリゴ糖の13 C— NMRス ぺクトノレを示す。
[図 21]図 21は、式（IX)で表される分子量 850のフコィダンオリゴ糖の1 H— NMRスぺ タトルを示す。
[図 22]図 22は、式（IX)で表される分子量 850のフコィダンオリゴ糖の13 C— NMRス ぺクトノレを示す„ [図 23]図 23は、式 (VII)で表される分子量 754のフコィダンオリゴ糖を再生した後の1 H— NMRスペクトルを示す。
[図 24]図 24は、式 (VII)で表される分子量 754のフコィダンオリゴ糖を再生した後の T OF— MSスペクトルを示す。
[図 25]図 25は、式 (VII)で表される分子量 754のフコィダンオリゴ糖を再生した後の E SI MSZMSスペクトルを示す。
[図 26]図 26は、式 (IV)で表される分子量 420のフコィダンオリゴ糖の FAB— MSス ぺクトノレを示す。
[図 27]図 27は、式（IV)で表される分子量 420のフコィダンオリゴ糖の MSZMSスぺ タトルを示す。
[図 28]図 28は、式（X)で表される分子量 858および式（XI)で表される分子量 900の フコィダンオリゴ糖の FAB- MSスペクトルを示す。
[図 29]図 29は、式（X)で表される分子量 858のフコィダンオリゴ糖の FAB- MSZM Sスペクトルを示す。
[図 30]図 30は、式（XI)で表される分子量 900のフコィダンオリゴ糖の FAB-MSZM Sスペクトルを示す。
[図 31]図 31は、沖縛モズクを加水分解後、 ABEEで蛍光標識ィ匕した ESI— MSのチ ヤートを示す。
[図 32A]図 32Aは、式 (I)で表されるフコィダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に 脾細胞の IFN— y誘導効果を高めることを示す。
[図 32B]図 32Bは、式 (II)で表されるフコィダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に 脾細胞の IFN— y誘導効果を高めることを示す。
[図 33]図 33は、フコィダンオリゴ糖混合物と乳酸菌の併用が相乗的に脾細胞の IFN Ύ誘導効果を高めることを示す。
[図 34]図 34は、フコィダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に榭状細胞の IL 12誘 導効果を高めることを示す。
[図 35]図 35は、フコィダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に榭状細胞の IL 10誘 導効果を高めることを示す。 [図 36]図 36は、フコィダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に CTL活性を高めること を示す。
[図 37]図 37は、活性の殆どない乳酸菌とフコィダン加水分解生成物とによる IL— 12 産生の相乗的増強を示す。
[図 38]図 38は、乳酸菌以外の免疫賦活剤とフコィダン加水分解生成物とによる、 IF Ν- γ産生の相乗的増強を示す。
[図 39]図 39は、乳酸菌とフコィダン加水分解生成物が相乗的に ΝΚ活性を増強する ことを in vivoで証明する。
[図 40]図 40は、フコィダンと乳酸菌の併用が相乗的に脾細胞の IFN— γ誘導効果を 高めることを示す。
発明を実施するための最良の形態
[0044] 免痔陚活素材
免疫賦活素材とは、動物の免疫応答力を増強する作用を有する素材のことをいう。 免疫強化素材ともよばれる。本発明で用いる免疫賦活素材は、特に限定されないが 、乳酸菌 (乳酸球菌、乳酸桿菌）、酵母、真菌類のような微生物;シィタケ、マイタケ、 霊芝、ァガリタスなどのキノコ類; CpGモチーフを含む免疫原性オリゴデォキシヌクレ ォチド (CpG— ODN)、 PolyI : Cのような核酸由来物質;リポ多糖 (LPS)；海藻類;漠 方薬；癌ワクチン（例えば、 MM46癌抗原）；コンカナパリン A (ConA)；クレスチン（登 録商標）、 OK— 432 (ピシバニール、登録商標）、レンチナン (登録商標）のような BR M (生物学的応答修飾剤)等の公知の免疫賦活剤が含まれる。
[0045] CpG— ODNとは、非メチル化シトシンーグァニンジヌクレオチド（CpG)を含む（短 V、）オリゴデォキシヌクレオチド（ODN)であり、そのような CpGモチーフを含有する C pG— ODNは、抗原提示細胞を直接活性ィ匕することができる。その結果、 CpG— O DNによる NK細胞等の活性ィ匕は、 Thl型応答の誘発および細胞障害性 T細胞の発 生を促進する（特表 2004— 519453)。
[0046] Polyl： Cとは、イノシン酸とシチジル酸とからなるポリヌクレオチドコポリマーのことで あり、ポリイノシンポリシチジン酸ともよばれる。霊長類においては、インターフェロンの 体液中濃度を高める作用を有することが一般に知られている。 [0047] リポ多糖は、自然免疫系を誘導する引き金となる物質として知られている。
[0048] MM46とは、乳癌または腫瘍の一種である。 MM46癌に対する抗原等の癌ヮクチ ンは、癌細胞を攻撃する免疫機能を賦活化するため、癌の予防や治療に用いられる
[0049] ConAとは、タチナタマメ（Jack bean)の種子由来のレクチンである。種々の免疫賦 活作用を有することが知られている。
[0050] BRMとは、癌治療において宿主の免疫機能等を増強、調節することによって腫瘍 と宿主の相互関係を修飾し、治療効果を導き出す薬剤や治療法のことである。そのよ うな薬剤には、 OK— 432やクレスチン (登録商標）、レンチナン (登録商標)等が含ま れる。 OK— 432とは、主成分としてストレプトコックス 'ピオゲネス (A群 3型） Su株ぺ ニシリン処理凍結乾燥粉末、乾燥菌体を含有する、抗悪性腫瘍剤'リンパ管腫治療 剤である。クレスチンとは、主成分として力ワラタケの菌糸体より得られた、たん白質と 結合した多糖類を含有する、癌の治療に用いられる薬剤である。レンチナンとは、シ ィタケ力 得られた j8—1, 3—グルカンである。
[0051] .
本発明で用いる乳酸菌は特定の株に限定されるものではないが、好ましくは、 Lact obadllus属であり、その中でも植物素材を発酵できる植物性乳酸菌が好ましい。さら にタナ ¾しくは、 Lactobacillus plantarumま 7こは Lactobacillus pentosusである。本発明 にお 、てフコィダン又はその加水分解生成物と組み合わせて用いる場合には、乳酸 菌は、生きていてもよいし、死んでいてもよい。
[0052] フコィダン
本発明の組成物のための原料として用いられるフコィダンは、どのような構造のもの でもよぐまたいずれの藻類力も取得してもよい。藻類の例には、クロガシラ目（Sphac elariales)、ナガマツモ目（Chordariales)、カャモノリ目（Scytosiphonales)、ウイキヨゥ モ目 (Dictyosiphonaies)、ムテモ目 (し utlenalesノ、ケャリモ目 (Sporochnalesノ、ア^ン グサ目（Dictyotales)、コンブ目（Laminariales)、ヒバマタ目（Fucales)を含む褐藻綱 Ph aeophyceaeの海藻が含まれる。好ましくはモズク、より好ましくは沖縛モズク由来のフ コィダンを用いる。 [0053] フコィダンの抽出方法
フコィダンを藻類力 抽出する方法は種々検討されており、広く知られている（例え ば、特開平 10— 245334に記載されているような水を用いる方法、特開平 10— 195 106に記載されて ヽるような酸を用いる方法、特開 2002— 262788に記載されて ヽ るようなアルカリ水性溶媒を用いる方法等である)。本発明にお！/、て原料として用いる フコィダンはこれら公知の方法により取得することができる。本発明においては、例え ば、以下の方法により取得したものを用いる。
[0054] 即ち、藻類 (例えば沖縛モズク）に蒸留水 5〜10倍量をカ卩え、 50〜100°Cで数分 〜5時間、好ましくは 60〜90°Cで 0. 5〜2. 0時間、さらに好ましくは 80〜90°Cで約 1時間抽出する。このようにして得られた藻類抽出物を冷却、吸引濾過、脱塩および 乾燥することにより、容易に水に溶解するフコィダン画分を得ることができる。このよう にして得られたフコィダン画分は、さらに精製することなく次の工程に用いてもよいし 、更に精製して力も用いてもよい。
[0055] フコィダンは、好ましくは上記のように藻類力も抽出したものを用いるが、藻類に含 まれた状態で用いてもょ ヽ。フコィダンまたはそれを含む藻類を次の加水分解工程 に付すことによってフコィダン加水分解生成物が得られる。
[0056] フコィダン加水/解牛.成物
フコィダン加水分解生成物とは、硫酸ィ匕多糖であるフコィダンを加水分解すること により得られうる単糖および多糖類を包含する糖誘導体、並びにそれらの混合物のこ とをいう。フコィダン加水分解生成物は、好ましくは多糖類であり、より好ましくは 2〜1 0個の単糖からなるオリゴ糖、さらにより好ましくは 2〜5個の単糖からなるオリゴ糖で ある。本発明においては、フコィダンを加水分解して得られる上記のようなオリゴ糖を フコィダンオリゴ糖とも称する。オリゴ糖を構成する単糖は、好ましくはフコース、硫酸 化フコース、ァセチル化フコース、および Zまたはグルクロン酸である。特に好ましい オリゴ糖は、上記式 (I)〜 (XI)の化合物である。
[0057] フコィダン加水分解生成物は以下の様にして製造される。
[0058] フコィダン加水分解生成物の製造
(1)フコィダンの加水分解 本発明の構成要件であるフコィダン加水分解生成物は、特許文献 3〜5に記載さ れて 、るように、フコィダンを酸や酵素を用いる方法により加水分解することにより得 られる。酸加水分解を行なう場合には、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸等の無機酸を用い てもよいし、酢酸、クェン酸、シユウ酸、コハク酸、ギ酸、プロピオン酸等の有機酸を用 いてもよい。好ましい酸は、塩酸および硫酸である。好ましくは、以下の様な酸加水 分解条件を用いる。
[0059] 即ち、上記のようにして藻類力 得られたフコィダンを含む画分またはフコィダンを 、酸、好ましくは塩酸を用い、 0. 1〜6. ON、好ましくは 0. 5〜4. ON、さらに好ましく は 0. 5〜2. ONの HC1を含む、 25〜100。C、好ましくは 30〜90。C、さらに好ましくは 50〜80°Cの水性溶媒中で、 0. 1〜3時間、好ましくは 0. 25-2. 5時間、さらに好ま しくは 0. 5〜2. 0時間加水分解を行なう。得られた反応物を塩基、例えば約 1Nの N aOHで中和した後、電気透析もしくはゲル濾過等の適切な手段で脱塩し、乾燥 (例 えば、凍結乾燥)することにより、フコィダンオリゴ糖混合物を含有する加水分解生成 物を得ることができる。
[0060] このようにして得られた加水分解生成物は、このままフコィダン加水分解生成物とし て用いてもょ 、が、さらに精製してその活性を高めることができる。
[0061] (2)加 7k分解牛成物の精製: よびオリゴ糖の単離
フコィダン加水分解生成物の精製は、クロマトグラフィー、再結晶、透析、アルコー ル沈殿等の方法を単独で、または組み合わせて用いることができる。例えば、以下の 操作に従って精製を行なう。
[0062] 先ず、オリゴ糖混合物を含有するフコィダン加水分解生成物を陰イオン交換榭脂を 用いたクロマトグラフィーに付して、吸着されずに通過する、硫酸基を含まないオリゴ 糖を含有する画分（中性 ·酸性糖画分)と、酸性溶出液により溶出する、硫酸基を多く 含むオリゴ糖を含有する画分 (硫酸化糖画分)とを分離する。
[0063] 本発明にお ヽては、このようにして得られた各画分をフコィダン加水分解生成物と して用いることが好適である力 以下の様にして、さらに精製してオリゴ糖を単離して 用いてもよい。
[0064] 中性 ·酸性糖画分をさらにゲル濾過に付すことにより、式 (I)で表される二糖と式 (II) で表される三糖を得ることができる。
[0065] 一方、硫酸ィ匕糖画分をクロマトグラフィーに付すことにより、硫酸ィ匕オリゴ糖 (III)、 (I V)、（V)、（VI)、（VII)、（VIII)、（IX)、（X)、または (XI)各成分を単離することができ る。
[0066] 各オリゴ糖は、精製、構造解析をより容易にするために適宜標識化または誘導体化 してもよい。例えば、オリゴ糖は、 4—ァミノ安息香酸ェチル (ABEE)のような試薬で 蛍光標識ィ匕することができ、これによりオリゴ糖の検出が容易となる。標識化された各 オリゴ糖を分離した後にその標識ィ匕部分を除去することにより、純粋なオリゴ糖を取 得することができる。
[0067] フコイダン はその加 7k分解牛成物 免疫陚活素材 の み合わせ
本発明は、上記のようにして得られるフコィダン又はその加水分解生成物と免疫賦 活素材との組み合わせを含む組成物である。このような組み合わせにより、フコィダン 又はその加水分解生成物と免疫賦活素材の免疫機能調節作用および Zまたは免 疫賦活作用が相乗的に増強される。
[0068] 当該組成物においては、フコィダン加水分解生成物として単一のフコィダンオリゴ 糖を免疫賦活素材 (例えば乳酸菌）と組み合わせて用いてもよい。また、フコイダンォ リゴ糖を複数、例えば三種類またはそれ以上用いて、免疫賦活素材と組み合わせて ちょい。
[0069] 乳酸菌を本発明の組み合わせにおいて用いる場合には、それは生きていてもよい し、死んでいてもよい。これに対して、キシロオリゴ糖の様なプレバイオテイクスとして 知られているオリゴ糖は、主に乳酸菌の増殖を促すことにより免疫機能調節作用を増 強するものである。本発明の加水分解生成物は、死菌による免疫機能調節作用をも 増強できる点で、従来のプレバイオテイクスとして用いられて 、るオリゴ糖よりも優れて いる。
[0070] 用いられるフコィダン又はその加水分解生成物の免疫賦活素材に対する好ま U、 比率は、重量で 1： 1〜： LOOOO : 1、より好ましくは 250 : 1〜1000： 1である。
[0071] また、本発明には、フコィダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材とを組み合 わせて用いることによりそれらの免疫機能調節および Zまたは免疫賦活作用を相乗 的に増強する方法も含まれる。
[0072] 本発明の組み合わせを、例えば飲食品、医薬品およびィ匕粧品等に用いて、これら に免疫機能調節作用を付与することができる。
[0073] 免鐘 翻
本明細書における免疫機能調節作用とは、生体において低下している免疫反応を 高める、および Zまたは亢進している免疫反応を抑制する作用のことをいう。従って、 その作用には、免疫賦活作用および免疫抑制作用が含まれる。
[0074] 本明細書における免疫機能調節作用は、当該技術分野で知られて 、る方法で測 定することができる。それは、例えば、免疫機能調節作用を有するサイト力インを誘導 する作用を指標として測定することができる。この目的に用いられるサイト力インには 、インターフェロン— γ、インターロイキン— 10、 12等が含まれる。また、免疫機能調 節作用は、免疫応答に関与する榭状細胞の成熟化や、細胞障害性 Τ細胞 (CTL)の 活性を指標として測定することもできる。
[0075] 本発明の免疫機能調節剤は健康増進のために用いることができるが、腫瘍、癌の 転移、ウィルス性疾患 (例えば、カゼ、エイズ、ウィルス性肝炎）、アレルギー性疾患（ 例えば、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー、喘息）、自己免疫疾患 (例えば、リウ マチ様関節炎）、炎症性疾患、糖尿病のような疾患または状態に有効である。
[0076] フコイダン はその加 7k分解牛成物 免疫陚活素材 含む食品添加物： よび飲
απ
本発明のフコィダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材との組み合わせを飲 食品に用いる場合には、それを含み免疫機能調節作用を有する食品添加物および 飲食品として、並びにそれを添加した免疫機能調節作用を有する健康食品として実 施することが好適である。これらは、公知の甘味料、酸味料、ビタミン等の各種成分と 混合してユーザーの嗜好に合う製品とすることができる。飲食品は、例えば、錠剤、力 プセル剤、清涼飲料、茶飲料、ドリンク剤、ヨーグルトや乳酸菌飲料等の乳製品、調 味料、加工食品、デザート類、菓子 (例えば、ガム、キャンディ、ゼリー)等の形態で提 供することが可能である。本発明の飲食品には、免疫機能調節作用を有する旨の表 示を容器や説明書に付した機能性食品 (特定保健用食品や条件付き特定保健用食 品が含まれる)も含まれる。表示場所は容器またはそれに添付した指示書などが挙げ られる力 これらに限られない。容器には、瓶、缶、ペットボトル、プラスチックボトル、 紙パック等が含まれるが、それらに限定されない。また、表示の方法には、印刷、刻 印、シール等が含まれる力 それらに限定されない。また、飲食品は、ペットの餌とし て加工したペットフードや動物飼料等でもよ!/、。
[0077] フコィダン又はその加水分解牛.成物 免疫陚活素材 の組み合わせを含む医蓉組 本発明の組成物を医薬品として用いる場合には、例えば、免疫機能調節剤、免疫 賦活剤、抗アレルギー剤および免疫抑制剤として用いることができる。したがって、 1 つの態様において、本発明はフコィダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材と を含む、免疫機能調節作用、免疫賦活作用、抗アレルギー作用および Ζまたは免疫 抑制作用を有する医薬組成物である。
[0078] 医薬組成物は、主薬に希釈剤、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯 臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常 使用する公知の補助剤を用いて製剤化することができる。剤型としては、錠剤、カブ セル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、座剤、クリーム剤、軟膏剤、ェマルジヨン、 ハツプ剤、注射剤等を挙げることができ、特に限定されるものではない。本医薬品の 投与経路としては、例えば、経口投与、直腸投与、経腸投与等を挙げることができる 力 特に限定されるものではない。
[0079] フコィダン又はその加水分解牛.成物 免疫陚活素材 の組み合わせを含す 粧品
本発明の組み合わせを用いることにより、免疫機能調節作用を有する化粧品を製 造することができる。
[0080] 本発明の組み合わせを含む化粧品は、例えば、顔用、皮膚用、頭髪用のクリーム、 ローション、ゲル、ムース、シャンプー、リンス等である。
[0081] 他の成分 の併用
本発明の組み合わせを含む組成物は、飲食品、医薬組成物およびィ匕粧品におい て、それ自体単独で使用してもよいが、他の免疫機能調節作用または免疫賦活作用 を有する食品素材または物質と併用することも好適である。そのような食品素材また は物質としては、乳酸菌、キノコ類、フコィダン等が挙げられる。
[0082] 本発明の飲食品または組成物には、これら活性成分以外に、具体的な態様に応じ て、一般的な成分、例えば、担体、希釈剤、賦形剤または添加剤等の成分を配合す ることができる。ここで希釈剤、担体、賦形剤としては、フコィダン又はその加水分解 物および免疫賦活素材の生理活性を妨げないものであれば特に制限されず、例え ばシュクロース、グルコース、果糖、マルトース、トレハロース、乳糖、澱粉、水飴、異 性化液糖などの糖類、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール 類、ソルビトール、マン-トール、エリスリトール、ラタチトール、キシリトール、マルチト ール、還元パラチノース、還元澱粉分解物等の糖アルコール類、トリァセチン等の溶 剤、アラビアガム、カラギナン、キサンタンガム、グァーガム、ジエランガム、ぺクチン等 の多糖類、または水を挙げることができる。また添加剤としては、キレート剤等の助剤 、香料、香辛料抽出物、防腐剤などを挙げることができる。希釈剤、担体、添加剤等 を本発明の効果を損なわない限り配合することができる。
[0083] 飲食品、医薬組成物およびィ匕粧品におけるフコィダン又はその加水分解物および 免疫賦活素材の配合量は、選択する他の配合成分との関係等により適宜選択される ものであり、特に限定されるものではない。し力しながら、通常、フコィダン又はその加 水分解生成物と免疫賦活素材の合計量は、飲料または食品中、医薬組成物中に添 加する場合、個体の体重 60kgに対して 0.01g〜10gZ日、好ましくは 0.05g〜lgZ 日、特に好ましくは 0.05g〜0.5gZ日である。化粧品中には、 0.01〜20重量％、好 ましくは 0.05〜 15重量％用!、られる。
[0084] 本発明のフコィダン又はその加水分解生成物およびオリゴ糖は、抽出精製品や合 成製品を単独で飲食品、医薬組成物または化粧品に用いることもできる。
[0085] なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなぐ請求項に示した範 囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を 適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
[実施例]
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの 実施例に限定されな ヽことは言うまでもな ヽ。 [0086] 以下の実施例においては、特に明記しない限り、 ECA— 600型核磁気共鳴装置（ 日本電子株式会社)を用いて NMR分析を行なった。測定溶媒として重水 (D O)を
2 用いた。構成糖の結合様式は、 2D-NMRを用いて行なった。
実施例 1
[0087] フコィダン画分の調製
沖縛モズク藻体 lOOgに蒸留水を 1000mlカ卩え、 100°Cで 1時間抽出した。得られ た抽出物を冷却後、吸引濾過、電気透析 (脱塩)をして凍結乾燥し、フコィダン画分 を 2g得た。このフコィダンを 2N H SOを含む 100°Cの水溶液で 1時間加水分解し
2 4
、得られた水溶液を 2N NaOHを用いて中和し、 ABEEで蛍光標識ィ匕することで単 糖分析サンプルを調製した。その構成糖の組成は SFuc (硫酸ィ匕フコース）： GlcA( グルクロン酸）： Fuc (フコース）： Xyl (キシロース） =49. 3 :4. 9 : 12. 1 : 1であること を確認した（図 1)。
カラム： Cosmosil C18 AR— Π (4. 6mm X 250mm)
移動相： 10%ァセトニトリル含有 0. 2Mホウ酸カリウム緩衝液
流速： 1. OmlZ分
温度： 45°C
検出：蛍光検出器 (株式会社島津製作所)、 Ex: 305nm、 Em: 360nm
実施例 2
[0088] フコィダン加水分解 の観 ^^ 衞乍 fflの沏 I定
下記の各種条件でフコィダン加水分解生成物を得て、それらと乳酸菌との組み合 わせを用いて免疫機能調節作用を検討した。
[0089] 力 ΠτΚ分解の酴濃 が ,疫機 ffi活件に及ぼす影響
実施例 1で得られたフコィダンを 0. 1、 0. 2、 0. 3、 0. 4、 0. 5、 1. 0、 2. 0、 4. 0、 5. 0、 6. 0Nの HC1(80。C)で 1時間カロ水分解し、その後それぞれに 0. 1、 0. 2、 0. 3、 0. 4、 0. 5、 1. 0、 2. 0、 4. 0、 5. 0、 6. 0Nの NaOHを添加することで中和した 後、電気透析による脱塩、凍結乾燥を経て、フコィダン加水分解生成物を得た。これ を 100 μ gZmlの濃度で C57BLZ6マウス（8週齢、雄、日本チャールズリバ一株式 会社)から分離した脾細胞（5 X 106cells/ml)に添加した。 30分後に 0. 1 μ g/ml の乳酸菌（Lactobacillus pentosus:FERM ABP— 10028)を添加し、 24時間培養 し、培養上清を回収し、 IFN- yの産生量を ELISAキット（OptEIA、 BD Pharmin gen)を用いて測定した（図 2A)。また、フコィダン加水分解生成物単独の効果も検 討するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作も行った（白の棒グラフ)。比較対 照として、何も添カ卩していないもの（白の棒グラフ中の" none")、乳酸菌のみを添カロ したもの（黒の棒グラフ中の" none")を用いた。その結果、加水分解して得た生成物 を乳酸菌と併用すると、それら単独で得られる結果と比較して IFN— y産生が相乗 的に増強された。この相乗的効果は、 0.5〜4.0Nの HC1で加水分解して得られた生 成物において認められた。
[0090] また、加水分解前のフコィダンだけを用いて上記の実験を行な 、、他のサンプルと 効果を比較した（図 2B)。その結果、 0. 5〜4.0Nの HC1で加水分解して得た加水分 解生成物（図 2B、白い棒グラフ）は加水分解前のフコィダン（図 2B"フコィダン"）と同 程度の活性し力示さないが、乳酸菌を加えることにより（図 2B、黒い棒グラフ）、フコィ ダンで得られたもの以上の活性を示すことが明らカゝとなった。
[0091] ] が ぼす醫響
フコィダンを 25、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100。Cの 1Nの HC1で 1時間カロ水 分解し、その後 1Nの NaOHを添加することで中和した後、電気透析による脱塩、凍 結乾燥を経て、フコィダン加水分解生成物を得た。これを 100 gZmlの濃度で C5 7BLZ6マウス（8週齢、雄、 日本チャールズリバ一株式会社)力 分離した脾細胞（5 X 10°cells/ml)に添カ卩した。 30分後 0. 1 μ g/mlの乳酸菌 (Lactobacillus pentosus ； FERM ABP- 10028)を添加し、 24時間培養し、培養上清を回収し、 IFN— γの 産生量を ELISAキット（OptEIA、 BD Pharmingen)を用いて測定した（図 3A)。ま た、フコィダン加水分解生成物単独の効果も検討するため、乳酸菌を用いずに上記 と同様の操作も行った（白い棒グラフ)。比較対照として、何も添加していないもの（白 V、棒グラフの none)、乳酸菌のみを添カ卩したもの（黒 、棒グラフの none)を用いた。 その結果、 HC1で加水分解して得たフコィダン加水分解生成物を乳酸菌と併用する ことで、それら単独で得られる結果と比較して相乗的に増強された IFN— γ産生が 認められた。この相乗的効果は、 25〜100°Cで加水分解して得られた全ての生成物 において認められた力 特に、 30〜90°C (好ましくは 50〜80°C)で加水分解した場 合に優れていた。
[0092] また、加水分解前のフコィダンだけを用いて上記の実験を行な、、その効果を本願 発明のものと比較した。その結果、 50〜100°Cの HC1で加水分解して得た生成物は 、乳酸菌と組み合わせて用いると、加水分解前のフコィダンと同程度以上の活性を 示すことが明らかとなった（図 3B)。
[0093] が ぼす 響
フコィダンを INの HC1 (80°C)で 30、 60、 120分間加水分解し、その後 1Nの NaO Hを添加することで中和した後、電気透析による脱塩、凍結乾燥を経て、フコィダン 加水分解生成物を得た。これを 100 gZmlの濃度で C57BLZ6マウス（8週齢、雄 、 日本チャールズリバ一株式会社)から分離した脾細胞（5 X 106cells/ml)に添加し た。 30分後 0. 1 g/mlの乳酸菌（Lactobacillus pentosus: FERM ABP— 10028 )を添加し、 24時間培養し、培養上清を回収し、 IFN- yの産生量を ELISAキット（ OptEIA、 BD Pharmingen)を用いて測定した（図 4)。また、フコィダン加水分解 生成物単独の効果も検討するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作も行った。 なお、比較対照として、何も添カ卩していないもの、乳酸菌のみを添カ卩したものを用い た。その結果、 30〜120分間加水分解して得られた全ての生成物は、乳酸菌と併用 することで、それら単独で得られる結果と比較して IFN— y産生が相乗的に増強され た。
[0094] したがって、フコィダン加水分解生成物は、乳酸菌と組み合わせて用いることにより 、相乗的に増強した免疫機能調節または免疫賦活作用を有することが明らかとなつ た。
実施例 3
[0095] 製したフコィダン加水分解 の^^ 衞乍 ffl
フコィダン lgに 2NHC1を 100ml加えて 80°Cで 1時間酸カ卩水分解を行ない、次い で INNaOHで中和した。得られた反応液をゲル濾過（バイオゲル P— 6 (Bio—Rad ) )に供して脱塩し、凍結乾燥を行なうことによりフコィダンオリゴ糖混合物を含む画分 を得た (オリゴ糖画分)。得られたフコィダンオリゴ糖混合物は、蟻酸で活性化した陰 イオン交換榭脂 (東ソ一株式会社)を用いるクロマトグラフィーに供した。その結果、ォ リゴ糖画分は、水で溶出することで得られた硫酸基を含まな ヽオリゴ糖を含有する画 分 (Fr. B)と、 2NHC1で溶出することで得られた硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有す る画分 (硫酸化糖画分）に分離された。硫酸ィ匕糖画分をゲル濾過 (バイオゲル P— 6) に供し、分子量 500未満の Fr. Aと 500以上の Fr. Cに分けた。以上のように精製を 行ったフコィダン加水分解生成物の各画分をそれぞれ 100 g/mlの濃度で、 C57B LZ6マウス (8週齢、雄、 日本チャールズリバ一株式会社)から分離した脾細胞（5 X 106cells/ml)に添カ卩した。 30分後 0. 1 μ gZmlの乳酸菌 (Lactobacillus pentosus: FERM ABP- 10028)を添加し、 24時間培養し、培養上清を回収し、 IFN— γの 産生量を ELISAキット（OptEIA、 BD Pharmingen)を用いて測定した（表 1)。そ の結果、フコィダンに関は、濃度が低い時に活性を示した力 その濃度を高くすると 活性が消失した。一方、加水分解生成物 (オリゴ糖各分、 Fr. A〜C、硫酸化糖各分 )の全てにおいて、濃度依存的に免疫賦活能が高まり、かつフコィダンの活性よりも 強かった。特に、オリゴ糖を精製することによって活性が強まることも分力つた。比較 対照として用いた単糖 (フコース、硫酸ィ匕フコース)ゃプレバイオテイクスとして広く使 われているキシロオリゴ糖にもこのような作用が無力つた。
[表 1]
+0.1 ^ g/m l乳酸菌
3 1 0 30 1 00
( jt g/ml )
フコィダン 9.8 10.2 5.2 n.d.
フコース 1 .2 1.9 - 2.9
硫酸化フコース 1 .3 0.5 - n.d.
オリゴ糖画分 n.d n.d. 5.5 9.6
Fr.A 1 0.5 1 7.2 21 .2 15.8
Fr.B 4.6 6.7 1 1 .0 21 .2
Fr.C 5.0 1 1 .5 19.3 21 .0
硫酸化糖画分 0.0 19.8 一 21 .3
キシロオリゴ糖 n.d. n.d. - n.d.
0 0.1 μ g/ml
乳酸菌 n.d. n.d. 実施例 4 [0097] フコィダンオリゴ糖の製造
a)フコィダンの加水分解およびオリゴ糖混合物の分離
実施例 1で得られたフコィダン画分 lgに 2NHC1を 100ml加えて 50〜100°Cで 1時 間酸加水分解を行ない、次いで INNaOHで中和した。得られた反応液をゲル濾過 (バイオゲル P— 6 (Bio— Rad) )に付して脱塩し、凍結乾燥を行なうことによりフコイダ ンオリゴ糖混合物を 895mg得た。得られたフコィダンオリゴ糖混合物は、蟻酸で活性 化した陰イオン交換榭脂 (東ソ一株式会社)を用いるクロマトグラフィーに付した。結 果として、オリゴ糖混合物は、水で溶出することで得られた硫酸基を含まないオリゴ糖 を含有する画分（中性'酸性糖画分） 280mgと、 2N HC1で溶出することで得られた 硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分 (硫酸化糖画分) 425mgに分離された。
[0098] b)化合物（I)および (II)の単離
a)で得られた中性 ·酸性糖画分 lOOmgをゲル濾過（バイオゲル P— 4 (Bio— Rad) 、溶出溶媒: 0. 2Mホウ酸カリウム (K B O )水溶液）に付すことにより、当該画分から
2 4 7
分子量 340の二糖と分子量 486の三糖が分離された (化合物 I、 II：図 5、 6)。これらの 分子量は、 FAB— MSにより求めた (ィ匕合物（I) [M -H]" : 339. 2、化合物（II) [M— H]— : 485. 0)。これらの化合物 5mgに、水 lml、 ABEE (4—ァミノ安息香酸ェチル） 1.6g、 NaBH CN (水素化シァノほう素ナトリウム） 350mg、メタノール 3.5ml、酢酸 4
3
10 1を加え、 65°C、 4時間撹拌した。反応液をクロ口ホルムと水で分配することによ り蛍光標識化された上記二糖および三糖を約 7〜9mg取得した。これら標識化オリゴ 糖について測定した1 H— NMRおよび13 C— NMRのチャートを図 7〜10に示し、そ れらを解析した結果を表 2、 3に示した。これらの結果より、得られた分子量 340の二 糖は式（I)で表される at—D— GlcA—(l→2)—L—Fucであり、分子量 486の三糖 は式（II)で表される a - D - GlcA- ( 1→2) - a— L— Fuc— ( l→3)— L— Fucで あることが分力つた。
[0099] [表 2] 表 2 ： ϋί光標識した化合物 （I) についての1 H— NMRおよび C一 NMR解析結果
Figure imgf000027_0001
[0100] [表 3]
表 3 ：蛍光標識した化合物 （II) についての1 H— NMRおよび13 C— NMR解析結果
Figure imgf000027_0002
[0101] c)化合物 (III)〜 (XI)の製诰 次に、硫酸化糖画分をゲル濾過 (バイオゲル P— 6 (Bio— Rad) )に付すことにより 脱塩した。得られた硫酸ィ匕糖画分 lOOmgに、水 lml、 ABEE (4—ァミノ安息香酸ェ チル） 1. 6g、 NaBH CN (水素化シァノほう素ナトリウム） 350mg、メタノール 3. 5ml
3
、酢酸 410 1を加え、 65°C、 4時間撹拌した。得られた生成物を真空で乾燥させ、 水とクロ口ホルムに分配し、水層を逆相カラムで（担体： Lichroprep RP— 8 (25—4 0 m) (Merck)、 φ 10 X 220mm ;溶媒条件： 5%CH CNZO. 1%TFA ( 100ml)
3
、 8%CH CN/0. l%TFA (100ml)、 15%CH CN/0. l%TFA (100ml)、 20
3 3
%CH CN/0. l%TFA (100ml) )処理することにより蛍光標識ィ匕されたオリゴ糖の
3
混合物を得た。得られた蛍光標識化合物を HPLC (カラム： cosmosil 5C18— AR —Π、 10. O X 250mm ;溶媒条件： 12. 5%CH CN/0. 1%TFA (5分）、 12. 5
3
- 27. 5%CH CN/0. 1%TFA (50分）；流速： 3mlZ分）でァセトニトリル： 0. 1%
3
TFA水溶液を 5〜30%の濃度勾配で溶出して、分子量力 39、 715、 861、 903、 9 57、 999であり硫酸基を有する 6つの標識ィ匕フコィダンオリゴ糖を混合物力 分離し た (分子量は、 ESI— MSにより決定した)。得られた標識ィ匕オリゴ糖について NMR スペクトルを測定し、その結果を解析した。標識ィ匕オリゴ糖の1 H— NMRおよび13 C— NMRのチャートを図 11〜22に示し、それらを解析した結果を表 4〜 7に示す。これ ら結果力ら、分子量 539、 715、 861、 903、 957、 999のィ匕合物は、それぞれ、ィ匕合 物 (111)、 (V)ゝ (VI)、 （VII)、 （VIII)、 （IX)の標識体であることが明らかとなった。
[0102] 確認のため、各オリゴ糖上に結合して 、た ABEEを除去し、再生したオリゴ糖の純 品を得た。即ち、これら分離した各標識ィ匕オリゴ糖 10mg (100 1)に、過酸化水素、 酢酸を各 10 1加えて一昼夜放置した後、乾固した。こうして得られた再生オリゴ糖の うち、分子量 903の化合物から得られたものを1 H— NMR (図 23)、 TOF— MS (装 ¾\ oyager D -STR (Applied Biosystems)、 Ion mode: negative ^ Mode of operation： reflector ^ Accelerating voltage： 20kV、 Matrix： 2,5-dihydroxybenzoic acid) (|¾|24) 、 ESI— MSZMS (図 25)で解析したところ、その結果は、確かに式 (VII)の構造を 示していた。
[0103] また、上記方法で分離できなかった分子量 420、 858、 900の化合物（それぞれ (I V)、（X)、（XI) )に関しては、反応混合物を FAB— MSZMS (装置： HX110A/HX11 0A(JEOL)、 Ion mode : MS, MS/MS(negative)、 Xe atom beam : 5kV Ion source accele rating potential : 10kV Collision energy : 2keV Matrix : Glycerol)、および ESI— MS MSで分析することによりその存在を確認した。図 26に（IV)の FAB— MSチャート を、図 27に MSZMSチャートを示した。また図 28に（X)および（XI)の FAB— MSチ ヤートを、図 29 30にそれぞれの MS/MSチャートを示した。
[0104] これらの結果より、分子量 390の二糖は化学式（III)で表される α L Fuc— 4 O— SO—— (1→3) L Fuc、分子量 420の二糖は化学式（IV)で表される α— D
3
GlcA— (1→2) L Fuc、分子量 566の三糖は化学式 (V)で表される α— L Fuc -4-O - SO—― (1→3) - [ a— D— GlcA— (l→2) ]— L— Fuc、分子量 71
3
2の四糖は化学式 (VI)で表される a -L-Fuc-4-O - SO 1→3)— [ a—D
3
-GlcA- (1→2) ] - a— L— Fuc— (1→3)— L— Fuc、そして分子量 754の四糖 は化学式 (VII)で表される a -L-Fuc -4-O - SO 1→3)— [ a D— GlcA
3
- (1→2) ] - a— L— Fuc— 4— O ァセチルー（1→3)— L— Fuc、分子量 808の 5糖は化学式 (VIII)で表される [ α— D— GlcA— (1→2) a L Fuc—（1→3) ] - [ a -D-GlcA- (1→2) ] - a— L— Fuc— (l→3)— L— Fuc、分子量 850の 5 糖は化学式（IX)で表される [ α— D— GlcA— (1→2) a L Fuc—（1→3) ]— [ a -D-GlcA- (1→2) ]—4— 0 ァセチノレー a—L— Fuc—（1→3)—L— Fuc 、分子量 858の 5糖は化学式（X)で表される α— L Fuc— 4 O— SO——（1→3)
3
a L— Fuc— (1→3) a D— GlcA— (1→2) a L— Fuc— (1→3) — L— Fuc、分子量 900の 5糖は化学式（XI)で表される a—L— Fuc— 4— 0— SO
3 (1→3) a L— Fuc— (1→3)— [ a D— GlcA— (1→2) a L— Fuc — 4— O ァセチル一 (1→3)—L— Fucであることが分かった。
[0105] [表 4] ¾4. ^光標識した化台物 (III) についての1 H NMRおよぴ 1 :IC一 NMR解析結果
Figure imgf000030_0001
[0106] [表 5]
表 5. '光標識した化合物 (V) についての1 H NMRおよび13 C— NMR解析結果
Figure imgf000030_0002
[0107] [表 6] 表 6. ΐϊί光標識した化合物 （VI) についての1 Η— NMRおよび 13C— NMR解析結果
Figure imgf000031_0001
7]
表 7. ¾光標識した化合物 (VII) についての 'H - NMRおよび13 C NMR解析結果
Figure imgf000032_0001
実施例 5
ォキナヮモズク藻体 lOOgに 2NHC11000mlを入れ、 1時間、 50 100°Cで酸加 水分解を行った。得られた抽出物を冷却後、吸引濾過、電気透析 (脱塩)を行ない凍 結乾燥しフコィダン画分を 2g得た。得られたフコィダン画分を ABEEで蛍光標識ィ匕し たものを ESI— MS(4000Q TRAP LC/MS/MSシステム（Applied Biosyst ems J分析条件 Polarity： Negative ion mode； Declustering Potential：― 5 Ov; Collision energy:— lOeV; Temperature :550°C)で分析した結果、図 31で 示されるチャートが得られ、式 (I)〜(XI)に示されるフコィダンオリゴ糖の存在が確認 できた。
実施例 6 [oi io] フコィダンオリゴ糖化合物 乳酸菌の組み合わせによるネ目乗効果
マウス！!縣田 に する IFN— m im
実施例 3と同様に調製した脾細胞 5 X 106cells/mlに分子量 340のフコィダンオリ ゴ糖 (化合物（I) )を 100 gZmlになるように wellに添加した。比較対照としてフコー スと硫酸化フコース (それぞれ MW164、 244)、キシロオリゴ糖 (XOS)を等量用いた 。 30分後に、乳酸菌（Lactobacillus pentosus： FERM ABP-10028) (死菌）を 0. 1 μ gZmlずつ各 wellに添カ卩した。 24時間培養後、培養上清を回収し IFN— yの産 生量を ELISAキット（OptEIA、 BD Pharmingen)を用いて測定した（図 32A)。ま た、糖単独による効果を確認するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作を行な つた o
[0111] また、化合物 (II)に関しても、化合物 (I)と同様に実験を行った。用いられたィ匕合物
(Π)の量は、 well中、 10、 100及び 300 gZmlであった（図 32B)。
[0112] 化合物 (I)に関しては、それを乳酸菌と併用すると著しく強い IFN— γ誘導能が得 られた（図 32Α)。この作用は、化合物 (I)と乳酸菌をそれぞれ単独で用いて得られた 結果（図 32Α中、左力も 2番目および右力も 5番目）から予測できない程強ぐ両者を 組み合わせて用いることにより相乗的効果が生じることを裏付けている。また、化合物 (II)に関しても、同様に乳酸菌との相乗効果が認められた (図 32Β)。構成成分のフ コースや硫酸ィ匕フコースにはこのような活性が無ぐプレバイオテイクスとして広く使わ れているキシロオリゴ糖にもこのような作用が無力つた。従って、本発明のフコィダン オリゴ糖は、乳酸菌と併用することで相乗的に脾細胞を活性化させ、生体の免疫機 能の調節において非常に有用であることが明ら力となった。
[0113] また、同様に調製した脾細胞に、化合物 (I)〜 (VII)の化合物を任意に 3種類均等 に混合したものを 50 μ gZmlの濃度で添加し、 30分後に乳酸菌 (Lactobacillus pent osus ;FERM ABP- 10028) (死菌）を 0. 1 gZmlずつ各 wellに添カ卩した。 24時 間培養後、培養上清を回収し IFN— yの産生量を測定した（図 33)。図に示すとおり 、 (V)、 (VI)および (VII)の混合物、 (I)、 (V)および (VI)の混合物、および (I)、 (V)お よび (VII)の混合物を用いると、高い IFN— γ産生量が観測された。したがって、化 合物 (I)〜 (XI)が混在して ヽて ヽる場合でも乳酸菌と併用することで免疫機能調節 活性が上昇することがわ力つた。
実施例 7
[0114] フコィダンオリゴ糖による、マウス由 榭状細胞に針する TL 10、 ί2謙 作用、お よび CTL活件谐強作用
BALBZcマウス (8週齢、雄、日本 SLC株式会社)の大腿骨力 骨髄細胞を分離 し、 l X 106cells/mlになるように、 10%FBS、 20ng/ml GM— CSF (Peprotec )、 20ng/ml IL— 3 (Peprotec)を含む RPMI 1640培地中に懸濁し、 24wellプレ ートで培養した。培養開始 3、 5日目に培地交換を行ない、付着性の未成熟榭状細 胞を得た。得られた榭状細胞に、化合物 (1)、 （11)、 （111)、 （V)、 （VI)、および (VII)を それぞれ 50 gZmlの濃度で前処理した。前処理 30分後に、乳酸菌（Lactobacillus pentosus iFERM ABP- 10028) (死菌）を 0. 1 gZmlずつ各 wellに添カ卩した。 2 日間培養後、培養上清と細胞を回収した。また、糖ィ匕合物単独による効果も確認す るため、乳酸菌を添加しな 、で上記と同様の操作を行なった。
[0115] 回収した培養上清は ELISAキットを用いて IL— 12と IL— 10を測定した。結果をそ れぞれ図 34、 35に示した。化合物（I)は、それを乳酸菌と併用することで相乗的に IL —12を誘導した（図 34)。また、化合物 (11)、 （III)および (V)は乳酸菌と併用すること で IL— 10を誘導することも分力つた（図 35)。これらのことにより、本発明で見つかつ たフコィダンオリゴ糖には生体の免疫機能を正にも負にも調節する (低下した免疫を 活性化し、または過剰な免疫反応を抑制する)機能があることが分力つた。キシロオリ ゴ糖には、このような作用は認められなかった。
[0116] さらに、回収した細胞をカウントし、 1 X 105cellsZmlに調製後、 1mlの細胞懸濁液 中にマイトマイシン C (50 gZml)を処理し、 37°Cで 30分間反応させた。反応終了 後、 PBSの洗浄によりマイトマイシン Cを除去し、常法により調製した C57BL/6マウ スの脾細胞（5 X 106cells/ml)を lml添加し、 4日間混合培養した。培養後細胞を 回収し、 C57BLZ6マウスのァロ抗原を持つ P— 815細胞（SOOOcellsZlOO /z l)を ターゲットにし、 E :T比 40 : 1および 80 : 1の割合で 4時間反応させ、殺傷された P— 8 15の数をフローサイトメトリーでカウントすることにより CTL活性を求めた（図 36)。化 合物 (1)、 （111)、 （V)、 （VI)、 （VII)は乳酸菌と併用することで CTL活性が増強されるこ とも分かった。
[0117] 実施例 7の結果も、本発明のフコィダン加水分解生成物を乳酸菌と組み合わせるこ とにより、相乗的に増強した免疫機能調節または免疫賦活作用が得られることを示し ている。
実施例 8
[0118] 免疫機能調節活件 ほ ん 有さない ¾,酸^^の併用による TL 12 の相乗 ^^龟
BALBZcマウス（8週齢、雄、 日本 SLC株式会社）に 4. 05%チォグリコレート培地 (Difco)を腹腔内投与し、 4日後 10mlの PBSを用いて腹腔内に浸潤した細胞を回 収した。その後 1 X 106cells/mlに調製後、 24wellプレートで培養した。培養開始 3 時間後、培地交換により浮遊細胞を除去し、マクロファージを得た。各 wellに化合物 (I)および実施例 3記載のオリゴ糖画分を 100 gZmlの濃度で添加し、 30分後、免 疫機能調節活性の強!、乳酸菌 (Lactobacillus pentosus DS84C株；独立行政法人産 業技術総合研究所特許生物寄託センターに 2004年 5月 26日付けで受領された FE RM ABP-10028)、または免疫機能調節活性をほとんど有さない乳酸菌（市販の Lactobacillus pentosus (以下乳酸菌 A) ) (市販の Lactobacillus plantarum (以下乳酸 菌 B) ) 0. 1 μ gZmlの濃度で添加し、 24時間培養した。その後培養上清を回収し、 I L— 12の産生量を測定した（図 37)。比較のため、これら 3種類の株をそれぞれ単独 で用いて上記と同様の操作を行なった。乳酸菌 Aも乳酸菌 Bも、それ自身だけでは 検出できる程度の IL— 12誘導活性を示さな力つたが、これらの株をィ匕合物 (I)やオリ ゴ糖画分と併用することで顕著に増大した IL— 12誘導活性が得られた。したがって 本発明で得られるフコダン加水分解生成物は、免疫機能調節活性のな ヽ乳酸菌と 併用した場合でも、相乗的に強 、免疫機能調節作用を発揮することが明らかとなつ た。
実施例 9
[0119] 乳酸菌以外の物皙 のネ目乗効果
C57BLZ6マウス（8週齢、雄、 日本チャールズリバ一株式会社)力 脾細胞を分離 し、 5 X 106cells/mlになるように調製し、 24wellプレートで培養した。実施例 3の Fr .C画分をそれぞれ 30 /z gZmlになるように各 wellに添加した。 30分後に、免疫賦活 作用または免疫機能調節作用のある物質として、 Polyl： C (SIGMA)を 5 μ g/ml、 L PS (SIGMA)を 2ng/ml、 CpG— ODN (5， - TCC ATG ACGTTCCTG ATGCT - 3' integrated DNA Technologies, Inc.から入手）を 3 g/ml、 MM46癌 抗原（MM46乳癌細胞を HANK' S液（ナカライテスタ）中でホモジナイズし、そこから 抽出された蛋白質:帝京大学医真菌研究センターにより提供された)を 50ng prote in/ml, ConA (和光純薬）を 0.25 /ζ 8Ζπι1、それぞれ wellに添カ卩した。 24時間培養 後、培養上清を回収し IFN— yの産生量を ELISAキット（OptEIA、 BD Pharmin gen)を用いて測定した（図 38)。比較のため、 Fr. Cを用いないで上記と同様の操作 を行なった。各免疫機能調節物質は今回実験で用いた濃度にぉ 、てほとんど IFN- γを誘導しな力つた。し力しながら、それらを Fr. C、つまり、フコィダン加水分解生成 物 (オリゴ糖)と併用することで強い IFN— γ誘導能が得られた。したがって、フコイダ ン加水分解生成物およびそれから得られるオリゴ糖は、それを乳酸菌と併用した場 合だけでなぐ他の免疫賦活素材と併用した場合でも相乗的にそれらの免疫賦活ま たは免疫機能調節作用が高まることが明らかとなった。
実施例 10
ΝΚ活性増強効果 (In vivo)
C57BLZ6マウス（8週齢、雄、 日本チャールズリバ一株式会社)を 4群に分けそれ ぞれフコィダン加水分解生成物単独（実施例 3記載の硫酸化糖画分 500mg/kg、図 39の「フコィダンオリゴ糖」）、乳酸菌単独（0.2mg/kg)、フフコィダン加水分解生成 物 +乳酸菌（図 39の「乳酸菌 +フコィダンオリゴ糖」）をそれぞれ飲水中に混ぜ、自 由摂取させた。コントロール群には水道水を摂取させた。摂取開始 1週間後、マウス 力 脾細胞を定法にしたがって分離し、 Yac-1細胞（5000cellsZl00 μ 1)をターゲ ットにして ΝΚ活性を測定した。 ΝΚ活性は Ε :Τ比 20:1、 40: 1の割合で 4時間反応さ せ、殺傷された Yac-1の数をフローサイトメトリーでカウントすることにより算出した（図 39)。フコィダンカゝら得られたフコィダンオリゴ糖を摂取することで NK活性が増強した 。さらにフコィダンオリゴ糖と乳酸菌を併用することでより NK活性が高くなつた。した がって、フコィダン加水分解生成物と乳酸菌の組み合わせを摂取することで免疫機 能が活性ィ匕することが in vivoでも確認できた。
実施例 11
[0121] フコィダン I,酴 の み わせによるネ目
マウス肫細胞に針する TFN— V謙導作用
実施例 3と同様に調製した脾細胞 5 X 106cellsZmlにフコィダン A (株式会社サゥ スプロダクト）、フコィダン B (株式会社沖縛発酵ィ匕学)、フコィダン C (実施例 1で調製 したもの）のそれぞれを、 1、 10、 100 gZmlとなるよう〖こ well〖こ添加した。フコイダ ン添加 30分後に乳酸菌（Lactobacillus pentosus ; FERM ABP— 10028) (死菌） を 0.1 gZmlずつ各 wellに添カ卩した。 24時間培養後、培養上清を回収し、 IFN— yの産生量を ELISAキット（OptEIA、 BD Pharmingen)を用いて測定した (図 40) 。また、フコィダン単独による効果を確認するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の 操作を行った。
[0122] 3種のフコィダン各々を単独で用いた場合には、 IFN— y誘導能が認められた。さ らに、その活性は、それらを乳酸菌と併用することで予想以上に強くなつた。したがつ て、フコィダンは、乳酸菌と併用することで相乗的に脾細胞を活性化させ、生体の免 疫機能の調節において非常に有用であることが明らかとなった。

Claims

請求の範囲
[1] フコィダン又はフコィダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む組成物。
[2] 前記加水分解生成物が、フコィダンを 0. 1〜6. ONの酸で、 25〜100°C、 0. 25〜2
. 5時間加水分解して得られるものである、請求項 1に記載の組成物。
[3] 前記加水分解生成物が、フコィダンを 0. 5〜4. ONの酸で、 30〜90°C、 0. 5〜2. 0 時間加水分解して得られるものである、請求項 2に記載の組成物。
[4] 前記加水分解が塩酸又は硫酸で行なわれる、請求項 1〜3のいずれ力 1項に記載の 組成物。
[5] 前記加水分解生成物がオリゴ糖である、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の組成 物。
[6] 前記オリゴ糖力 フコース、硫酸ィ匕フコース、ァセチルイ匕フコース、及びグルクロン酸 力 なる群力 選択される少なくとも一種の糖で構成される二糖から五糖までのオリゴ 糖である、請求項 5に記載の組成物。
[7] 前記オリゴ糖として、下記構造式 (I)、 (II)、 (III)、 (IV)、 (V)、 (VI)、 (VII)、 (VIII)、 (I
X)、（X)および (XI)で示される化合物から選択される少なくと
も一種を含む、請求項 6に記載の組成物。
[化 1]
Figure imgf000038_0001
[化 3]
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000040_0002
Figure imgf000040_0003
[化 10]
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000041_0002
[8] 前記免疫賦活素材が、乳酸菌、酵母、真菌類のような微生物;シィタケ、マイタケ、霊 芝、ァガリタスなどのキノコ類; CpGモチーフを含む免疫原性オリゴデォキシヌクレオ チド（CpG— ODN)、 PolyI : Cのような核酸由来物質；リポ多糖 (LPS)、 β—グルカ ン；海藻類；漢方薬； ΜΜ46癌抗原のような癌ワクチン；コンカナパリン A (ConA)； B RM (生物学的応答修飾剤)力も選択される少なくとも一種である、請求項 1〜7の 、 ずれ力 1項に記載の組成物。
[9] 前記免疫賦活素材が乳酸菌である、請求項 8に記載の組成物。
[10] 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の組成物を含む免疫機能調節剤。
[11] 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の組成物を添加した飲食品。
[12] 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の組成物を含む医薬組成物。
[13] 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の組成物を含む化粧品。
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