WO2006106912A1 - 癌関連抗原アナログペプチド、およびその利用 - Google Patents

癌関連抗原アナログペプチド、およびその利用 Download PDF

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Mitsuo Okubo
Hiroo Maeda
Satoru Takeda
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a cancer-associated antigen analog peptide and use thereof.
  • Non-Patent Document 1 Cells that utilize the cellular immune response of the living body (this is different from private cell therapy)” Treatment “(Non-Patent Document 1).
  • LAK Lymphocyte activated killer
  • Non-patent Document 2 Blood containing natural killer cells: NK cells and T cells in the patient's blood is cultured in vitro and then returned to the person's vein.
  • Adoptive immunotherapy has a certain effect on the control of certain types of advanced cancer, but it does not limit the types of cancer cells originally. Whether it was clear or not.
  • Non-patent Document 3 Non-patent Document 3
  • Non-patent document 1 Mitsuo Okubo, Cell therapy, pp948-957, Transfusions revised 3rd edition, Hiroshi Toyama et al., Chugai Medical, Tokyo, 2004.
  • Non-specific literature 2 Rosenberg 3 ⁇ 4A, Spiess P, Laboure R: A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocyte. Science. 233: 1318-21, 1986.
  • Non-Patent Document 3 Rosenberg SA, Yang JC, Schwartzentruber DJ, et.al: Immunologic an d therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma. Nature Med. 4: 321—327, 1998.
  • Non-Patent Document 4 Mehrotra S, Stevens R, Zengou R, et al: Regulation of melanoma epit ope—specific cytolytic T lymphocyte response by immature and activated dendritic cells, in vitro. Cancer Research. 63: 5607-5614, 2003.
  • cancer antigen-specific cell therapy that is, a therapeutic method using an analog peptide of a cancer-associated antigen and T cells activated by the peptide.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and the object thereof is the amino acid sequence Phe-Thr-Leu-Asn-Phe-Thr-Ile-Thr-Asn (SEQ ID NO: 1). It is an object of the present invention to provide an ovarian cancer-related antigen analog peptide. Another object of the present invention is to provide T cells activated by administering the peptide, or to provide an antibody that binds to the peptide. Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer diseases using the peptide, the T cell, or the antibody. Another object is to provide a drug for preventing or treating cancer diseases, etc., comprising the peptide, the antibody, or the T cell as an active ingredient. Means for solving the problem
  • the present inventors have planned a new T cell treatment protocol for cancer diseases supplementing chemotherapy. Following this chemotherapy with anticancer drugs, this plan returns autologous ⁇ cells stimulated with cancer-related antigenic peptide analogs to the body, thereby causing an antitumor effect.
  • the present inventors analyzed a cell fraction contained in a blood sample of a patient after chemotherapy with an anticancer agent. As a result, the number of T cells and the number of B cells are in a normal range, and CD4 positive memory cells. It was confirmed that the monocyte system increased in calorie and that T cell treatment was possible after chemotherapy with anticancer drugs. Next, the presence of ovarian cancer antigen-specific T cells in the peripheral blood of ovarian cancer patients was confirmed by an experimental system that detects a combination of CD4 and IL-4 or IFN y. The present inventors analyzed antigen-specific CD4-positive T cells in the living body of patients and healthy individuals using an analog peptide of the core protein MUC16 of the ovarian cancer-related antibody C125.
  • T cells recognizing a specific amino acid sequence (analog peptide) of ovarian cancer antigen were present in patients' peripheral mononuclear cells at an average frequency of about 4%.
  • the present inventors analyzed the T cell epitope in the core protein MUC16 of the ovarian cancer-associated antigen CA125, and determined the amino acid sequence of FTLNFTITN (SEQ ID NO: 1) as a shorter epitope, It was found that OVCA11: GHTAPG PLLVPFTLNFTITN (SEQ ID NO: 11), which is an analog peptide containing this epitope, is suitable for T cell activation.
  • analog peptide stimulation was performed in the absence of IL-12.
  • CD4 positive Thl type T cells could be increased in patient mononuclear cell samples.
  • CD4-positive TNFa-producing T cells and CD8-positive TNFa-producing T cells could be induced. Therefore, after stimulating these cells with an analog peptide to reactivate memory T cells in an antigen-specific manner, the cells are transferred to the patient's peritoneal cavity (ascites), peripheral blood vessels, or lymphatic vessels, and thus antigen-specific.
  • the anti-tumor effect can be exerted by actions such as direct damage to cells that produce CA125, assistance to CD8 positive cells, production of specific antibodies, etc. by immune reaction.
  • the cancer antigen analog peptide is administered to reactivate memory T cells to prevent recurrence and improve long-term prognosis. It is effective as a treatment.
  • the present inventors have identified an ovarian cancer-related antigen epitope, and found that a cancer-associated antigen analog peptide containing the epitope activates T cells. Furthermore, following chemotherapy with an anticancer agent, by returning the autologous T cells activated with the cancer-related antigen analog peptide into the body, the antitumor effect was successfully induced, thereby completing the present invention. It was.
  • the present invention provides the following (1) to (30).
  • XI, X2, X3, X5, and X6 are amino acid residues or amino acid sequences that may optionally be included,
  • X4 is Phe-Thr-Leu-Asn-Phe-Thr-lie-Thr-Asn (SEQ ID NO: 1). )
  • a method of activating T cells in a subject comprising a step of administering the peptide according to any one of (1) to (7) to the subject.
  • a method for preventing or treating cancer disease or endometriosis in a subject comprising a step of administering to the subject the peptide according to any one of (1) to (7).
  • a method for preventing or treating cancer disease or endometriosis in a subject comprising a step of administering the antibody according to (12) or (13) to the subject.
  • a method for preventing or treating cancer disease or endometriosis in a subject comprising the following steps (a) to (c):
  • a drug for preventing or treating cancer diseases or eclampsia comprising the peptide according to any one of (1) to (7) as an active ingredient.
  • a drug for preventing or treating cancer disease or endometriosis comprising the antibody according to (12) or (13) as an active ingredient.
  • a drug for preventing or treating cancer disease or endometriosis comprising the T cell according to (17) as an active ingredient.
  • a cancer tumor marker, an antibody for immunostaining, or an endometrial cell marker comprising the antibody according to (12) or (13) as an active ingredient.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of MUC16 of CA125. “Repeated portion 1” and “analog peptide sequence 1” are shown. A new “analog peptide sequence 1” was designed by replacing a different amino acid sequence in the 12-row repeat sequence with a common amino acid. This sequence was divided into 20 amino acid residues and prepared as a synthetic peptide.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of MUC16 of CA125. “Repeated part 2” and “analog peptide sequence 2” are shown. A new “analog peptide sequence 2” was designed by replacing a different amino acid sequence among 11 repeated sequences with a common amino acid. This sequence was divided into 20 amino acid residues and prepared as a synthetic peptide.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence of MUC16 of CA125. The amino acid sequence without repeats is shown. All of this sequence was divided into 20 amino acid residues and prepared as a synthetic peptide.
  • FIG. 4 is a diagram showing a synthetic analog peptide series of 20 amino acid residues derived from MUC16 “Analog peptide sequence 2”. “Analog peptide sequence 2”, which showed a positive reaction in a preliminary experiment, was prepared as a synthetic peptide series OVCA8-14 with a synthesis of 20 amino acid residues so that 10 amino acid residues overlap each other.
  • FIG. 5 is a diagram showing a peptide sequence of 10 amino acid residues for determining T cell epitopes.
  • Peptide OVCA101-115 is shown in which the original sequence of the OVCA11 and OVCA12 analog peptides (original MUC 16) in which a positive reaction was obtained is restored.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of detection flow cytometry analysis results of CD4 and IL-4.
  • 3 CD4 positive and IL-4 positive T cell frequencies in the mononuclear cell samples were 0.04%, 0.07%, and 0.05%, respectively.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of detection flow cytometry analysis results of CD4 and IL-4.
  • Mononuclear cell samples with analog peptide OVCA11 contain 7.06% CD4-positive and IL-4 positive T cells.
  • FIG. 8 is a graph showing the frequency of CD4 positive and IL-4 producing T cells.
  • OVCA11 is! / Has a higher statistically significant positive cell frequency in the mononuclear cell sample group with OVCA12 than the mononuclear cell sample group with OVCA10 added.
  • the analog peptide concentration is 15 M each.
  • FIG. 9 is a view showing an example of detection flow cytometry analysis results of CD4 and IFN y.
  • Top Background with no added IL-2 or analog peptide.
  • Middle Only IL-2 is added, analog peptide is covered, and control is performed.
  • Bottom Mononuclear cell sample with IL-2 and analog peptide OVCA9.
  • the CD4-positive and IFN y-positive T cell frequencies in the 3 mononuclear cell samples were 0.02%, 0.08%, and 0.02%, respectively.
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of detection flow cytometry analysis results of CD4 and IFN y.
  • Upper Sample with IL-2 and analog peptide OVCA10 added.
  • Middle Sample with IL-2 and analog peptide OVC All added.
  • Bottom Sample with IL-2 and analog peptide OVCA12.
  • FIG. 11 is a graph showing the frequency of CD4 positive and ⁇ production ⁇ cells.
  • the mononuclear cell sample group added with OVCA11 or OVC A12 has a higher statistically significant positive cell frequency than the mononuclear cell sample group with OVCA10.
  • the analog peptide concentration is 15 ⁇ each.
  • FIG. 12 shows examples of detection flow cytometry analysis results of CD4 and TNF a and CD8 and TNF a.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of flow cytometry analysis results of CD4 and IL-4 detection at the time of epitope determination.
  • Upper Mononuclear cell sample with IL-2 and analog peptide OVCA107.
  • Middle Mononuclear cell sample with IL-2 and analog peptide OVCA108 added.
  • Bottom IL-2 and analog page Mononuclear cell sample with Chido OVCA115 added.
  • CD4 positive and IL-4 positive T cells are present in 6.32% and 1.17%, respectively.
  • FIG. 14 is a graph showing the frequency of CD4 positive and IL-4 producing T cells at the time of epitope determination. Mononuclear cell samples with OVCA1 07 or OVCA108 are frequently observed. ⁇ na log peptide concentration is each 15 ⁇ ⁇ .
  • FIG. 15 is a diagram showing an example of the result of detection flow cytometry analysis of CD4 and IFN ⁇ at the time of epitopic determination.
  • Upper Mononuclear cell sample with IL-2 and analog peptide OVCA107.
  • Middle Mononuclear cell sample with IL-2 and analog peptide OVCA108.
  • Bottom Mononuclear cell sample with IL-2 and analog peptide OVCA115.
  • mononuclear cell samples supplemented with the analog peptide OVCA107 or OVCA108 there are 2.10% and 1.27% CD4-positive IFN ⁇ -positive T cells, respectively.
  • FIG. 16 is a graph showing the frequency of CD4 positive and IFN y producing sputum cells at the time of epitope determination. Mononuclear cell samples with OVCA 107 or OVCA 108 are frequently observed. The analog peptide concentration is 15 ⁇ each.
  • FIG. 17 shows a strategy of antigen-specific sputum cell therapy that complements chemotherapy.
  • FIG. 18 shows a strategy for antigen-specific sputum cell therapy for endometriosis (uterine adenomyosis).
  • the present invention relates to a peptide comprising the amino acid sequence Phe-Thr-Leu-Asn-Phe-Thr-lie-Thr-Asn (SEQ ID NO: 1).
  • the amino acid sequence of other parts is not particularly limited.
  • One embodiment of the peptide of the present invention is preferably a peptide containing the following formula.
  • X4 is Phe-Thr-Leu-Asn-Phe-Thr-lie-Thr-Asn (SEQ ID NO: 1)
  • XI, X2, X3, X5, and X6 are optionally included Good amino acid residues, or amino acids
  • the amino acid sequence configuration is not particularly limited!
  • “functionally equivalent” means that the subject peptide has the same immunostimulatory activity as the peptide of the present invention.
  • examples of the immunostimulatory activity include activation of T cells or enhancement of antibody production ability.
  • amino acid residue corresponding to the above formula X3 is not particularly limited, and may be Pro or Leu.
  • the amino acid sequence corresponding to the above formula X2 includes Gly-His-Thr-Ala-Pro-Va Pro-Leu-Leu-lie (SEQ ID NO: 4), Gly-His-Thr-Ala- Pro- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (SEQ ID NO: 5), Arg- Pro- lie- Va ⁇ Pro- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (SEQ ID NO: 6), Glu- Thr- Thr -Ala- Thr- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (SEQ ID NO: 7), Gly- Pro- Thr- Thr- Ala- Ser- Pro- Leu— Leu— Val (SEQ ID NO: 8), Gly— Pro— Ser— Ala— Ala— Ser— Pro— Leu— Leu— Val (SEQ ID NO: 9) or Gly- Thr- Ser- Gly- Thr- Pro- Ala- Ser- Leu- Pro- Gly- His- A force capable of mentioning any
  • amino acid sequence corresponding to the above formula X2 includes Ala-Pro-Va Pro-Leu-Leu-Ile (SEQ ID NO: 46),
  • amino acid sequence corresponding to the above formula X5 can include Leu-Arg-Tyr-Glu-Glu-Asn-Met-Arg-His-Pro (SEQ ID NO: 10). Not.
  • the number of amino acid residues of the peptide of the present invention is not particularly limited, but the number of amino acid residues is 30 or less (specifically, 30, 25, 20, 15, or 10 or less). It is more preferable that
  • the origin of the peptide of the present invention is not particularly limited, but is preferably a peptide derived from a cancer-related antigen, more preferably a peptide derived from the core protein MUC16 of the ovarian cancer-related antigen CA125. Can be exemplified as the peptides of the present invention.
  • the present invention relates to DNA encoding the peptide of the present invention.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention includes genomic DNA, cDNA, and chemically synthesized DNA.
  • Genomic DNA and cDNA can be prepared by those skilled in the art using conventional means.
  • Genomic DNA is extracted from, for example, a cancer-associated antigen (preferably ovarian cancer antigen), and a genomic library (plasmid, phage, cosmid, BAC, PAC, etc. can be used as a vector) Expanding this, colony hybridization is possible using a probe prepared on the basis of the DNA encoding the peptide of the present invention! /, And can be prepared by performing plaque hybridization. Is possible.
  • a primer specific for the DNA encoding the peptide of the present invention it is also possible to prepare a primer specific for the DNA encoding the peptide of the present invention and perform PCR using this primer.
  • cDNA is synthesized based on mRNA extracted from a cancer-associated antigen (preferably ovarian cancer antigen) and inserted into a vector such as ⁇ ZAP to create a cDNA library.
  • the DNA of the present invention can be used for, for example, large-scale expression of epitopes of cancer-associated antigens or large-scale preparation of recombinant peptides.
  • the present invention relates to a vector containing the DNA and a transformant (host cell) into which the vector has been introduced. Further, the present invention relates to a method for producing the peptide, comprising the step of culturing or breeding the transformant, and recovering the recombinant protein from the cells or the culture supernatant.
  • the vector of the present invention is useful for retaining the DNA of the present invention or expressing the protein of the present invention in a host cell.
  • a vector for example, when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in Escherichia coli in order to amplify it in large quantities using Escherichia coli (for example, JM109, DH5a, HB101, XLlBlue), etc. If you have a selected gene for transformed E. coli (for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol), etc.) Absent.
  • Examples of vectors include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, and pCR-Script.
  • pGEM-T, pDIRECT, pT7 and the like can be mentioned.
  • an expression vector is particularly useful.
  • the host is E. coli such as JM109, DH5a, HB101, XLl-Blue.
  • a promoter that can be expressed efficiently in E. coli, such as the lacZ promoter, araB promoter, or T7 promoter!
  • pGEX-5X-1 manufactured by Pharmacia
  • QIAexpress system Qiagen
  • pEGFP pEGFP
  • pET the host expresses T7 RNA polymerase
  • BL21 is preferred,;
  • the vector includes a signal sequence for protein secretion! /!
  • the pelB signal sequence may be used in the case of production in E. coli periplasm.
  • Introduction of a vector into a host cell can be performed using, for example, the calcium chloride method or the electopore position method.
  • vectors for producing the protein of the present invention include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BO S, pEF, pCDM8).
  • mammalian-derived expression vectors for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BO S, pEF, pCDM8.
  • Insect cell-derived expression vectors eg, “Bac-to-BAC baculovairu s expression system” (Gibco BRL), pBacPAK8
  • plant-derived expression vectors eg, ⁇ 1, pMH2
  • animal virus-derived expression vectors For example, pHSV, pMV, pAdex Lew
  • a retrovirus-derived expression vector for example, pZIPneo
  • yeast-derived expression vector for example, “Pichia Expression KitJ (Invitrogen), pNVll, SP-Q01
  • Examples include expression vectors derived from Bacillus subtilis (for example, pPL608, pKTH50).
  • promoters required for expression in cells such as SV40 promoter, MML V-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter It is indispensable to have a CMV promoter, etc., and it is even more desirable if you have a gene for selecting cell transformation. That's right.
  • Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • the DHFR gene that complements the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway is used.
  • a vector having a vector for example, pCHOI
  • MTX methotrexate
  • a gene expressing the SV40T antigen An example is a method of transforming with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin using COS cells possessed on a chromosome.
  • a vector such as pcD
  • the replication origin those derived from poliovirus, adenovirus, ushipapilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vector is used as a selection marker for aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthine guanine phosphoribosyl transferase (Ecogpt) gene, dihydro A folate reductase (dhfr) gene and the like can be included.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • dhfr dihydro A folate reductase
  • the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, retrovirus method, ribosome method, cationic liposome method, adenovirus method, etc. Examples thereof include a method of introducing into a living body.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, Escherichia coli and various animal cells can be used.
  • the host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for production and expression of the protein of the present invention.
  • Production systems for protein production include in vitro and in vivo production systems. In vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as the host.
  • Animal cells include mammalian cells, such as CHO, COS, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells, such as African algae oocytes, or insect cells, such as S19, Sf21, Tn5 is known.
  • CHO cells dhfr-CHO and CHO K-1, which are CHO cells deficient in the DHFR gene, can be preferably used. Specially in animal cells for mass expression. CHO cells are preferred.
  • Vectors can be introduced into host cells by methods such as the calcium phosphate method, DEAE dextran method, cationic ribosome DOTAP (manufactured by Boehringer Mannheim), the electopore polarization method, and lipofusion. .
  • Plant cells are known, for example, as a cell force S protein production system derived from Nicotiana tabacum, and this may be cultured in callus.
  • a fungal cell a yeast, e.g., Saccharomyces (Saccharomyces) genus, for example, Saccharomyces 'selenides Pine (Saccharomyces cerevisiae), filamentous fungi, Column if, Fusupe Honoré 3 r Noresu (Aspergillus Bruno genus, for example, Asuperugirusu' two Gar (Aspergillus niger) is known.
  • Saccharomyces Saccharomyces genus
  • Saccharomyces 'selenides Pine Saccharomyces cerevisiae
  • filamentous fungi Column if, Fusupe Honoré 3 r Noresu (Aspergillus Bruno genus, for example, Asuperugirusu' two Gar (Aspergillus niger) is
  • Bacterial cells include E. coli, such as JM109, DH5a, HB101, etc., and Bacillus subtilis is also known.
  • Proteins can be obtained by transforming these cells with the target DNA and culturing the transformed cells in vitro.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture medium for animal cells.
  • serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used together, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culture is preferably about 6-8.
  • the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 200 hours, and medium exchange, aeration, and agitation are added as necessary.
  • examples of systems that produce proteins in vivo include production systems that use animals and production systems that use plants.
  • the target DNA is introduced into these animals or plants to produce and recover proteins in the animals or plants.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice and sushi When animals are used, there are production systems using mammals and insects. As mammals, goats, pigs, hidges, mice and sushi can be used. In addition, when a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • the target DNA is prepared as a fusion gene with a gene encoding a protein inherently produced in milk such as goat j8 casein. Then this fusion gene A DNA fragment containing is injected into a goat embryo and the embryo is transferred to a female goat.
  • the target protein can be obtained from the milk produced by the Transgene goat born or the offspring of the goat that has received the embryo.
  • hormones may be used in transgeneic goats as appropriate!
  • the target protein can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus into which DNA encoding the target protein is inserted.
  • tobacco when plants are used, for example, tobacco can be used.
  • the DNA encoding the protein of interest is inserted into a plant expression vector, such as pMON 530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumef aciens.
  • This bacterium can be infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired protein can be obtained from the leaves of this tobacco.
  • the peptide of the present invention thus obtained can be isolated from the inside of the host cell or outside the cell (such as a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous peptide.
  • Peptide separation and purification are not limited in any way by using the separation and purification methods used in normal protein purification. For example, select chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. If combined, the protein can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography. These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the present invention also includes highly purified proteins using these purification methods.
  • the protein can be arbitrarily modified or the peptide can be partially removed by allowing an appropriate protein modifying enzyme to act before or after purification of the protein.
  • Protein Examples of the quality-modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, darcosidase and the like.
  • the present invention relates to an antibody that binds to the peptide.
  • the present invention also provides an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • Examples of the antibody of the present invention include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, antibody variants, and fragments thereof.
  • a polyclonal antibody can be obtained as follows. Small animals such as rabbits, recombinant proteins expressed in microorganisms such as Escherichia coli as fusion proteins with juvenile hormone acid methyltransferase of silkworms, fruit fly, mosquitoes, grasshoppers, or tobacco moths, or GST. To obtain serum. For example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, silkworm, Drosophila, mosquito, scorpion, or tobacco moth juvenile hormone acid methyltransferase or a synthetic peptide coupled -Tee Prepared by purifying with a single ram.
  • a monoclonal antibody for example, a young formate methyltransferase or its partial peptide of silkworm, Drosophila mosquito, mosquito, Spodoptera or Tobacco moth is immunized to a small animal such as a mouse.
  • the spleen is removed and ground to separate the cells, and the cells and mouse myeloma cells are fused using a reagent such as polyethylene glycol. From the fused cells (neubridoma) formed thereby, Select clones that produce antibodies that bind to the juvenile hormone acid methyltransferases of silkworms, fruit flies, mosquitoes, carp, or tobacco.
  • the obtained hyperidoma was transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites was collected from the mouse. It can be prepared by purifying it using a column of a juvenile hormone acid methyltransferase or a synthetic peptide coupled with Drosophila, mosquito, moth, moth, or tobacco.
  • antibody variant means that one or more amino acid residues are modified.
  • the amino acid sequence of the antibody Any modified amino acid variant having the same binding specificity as the original antibody is included in the “antibody variant” of the present invention.
  • Such variants are at least 75%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, with the amino acid sequence of the variable domain of the heavy or light chain of the antibody, and Most preferably, it has at least 95% amino acid sequence homology or similarity and less than 100% sequence homology or similarity.
  • the antibody of the present invention By administering the antibody of the present invention to a subject, it is possible to detect cancer cells, cancer cell-related antigens, or endometrial cells generated in a site other than the inside of the uterus in the subject. Detection can be performed by a method known to those skilled in the art by binding a labeling substance to the antibody.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it can be used in an immunological assay. Specifically, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, radioactive substances, metal chelates and the like can be used.
  • Preferred labeling enzymes include, for example, peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, malate dehydrogenase, staphylococcal nuclease, delta-5-steroid isomerase, ⁇ -glycerol phosphate dehydrogenase, triose phosphate isomerase, horseradish peroxidase Examples include oxidase, asparaginase, glucose oxidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, darcoamylase, and acetylcholinesterase.
  • Preferable fluorescent substances include, for example, fluorescein isothiocyanate, phycobiliprotein, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, alophycocyanin, and orthophthalaldehyde.
  • Preferable luminescent materials include isoluminol, lucigenin, luminol, aromatic ataridium ester, imidazole, ataridinium salt and its modified ester, luciferin, luciferase, and equolin.
  • Preferred radioactive materials include 125 I, m I, 131 1, 14 C, 3 H,
  • cross-linking agents include N, ⁇ '-orthophenol dimaleimide, 4- ( ⁇ -maleimidomethyl) cyclohexanoic acid ⁇ -succinimide ester, 6-maleimidohexanoic acid ⁇ -succinimide ester, 4,4 '-Dithiopyridine and other known crosslinking agents can be used.
  • the reaction of these cross-linking agents with enzymes and antibodies may be carried out according to known methods depending on the properties of the respective cross-linking agents.
  • a method in which a low molecular weight hapten such as piotin, dinitrophenol, pyridoxal, or fluoresamine is bound to the antibody and indirectly labeled with a binding component that recognizes it can also be employed.
  • Avidin and streptavidin are used as recognition ligands for piotin.
  • dinitrophenol, pyridoxal, or fluoresamine antibodies that recognize these haptens are labeled.
  • western wasabi peroxidase can be used as the labeling enzyme. This enzyme is advantageous because it can react with many substrates and can be easily bound to antibodies by the periodate method.
  • a fragment thereof for example, Fab ′, Fab, F (ab ′) is used in some cases. Also related to polyclonal and monoclonal antibodies
  • the enzyme label can be obtained by the same treatment. If the enzyme label obtained by using the above-mentioned crosslinking agent is purified by a known method such as affinity chromatography, an immunoassay system with higher sensitivity becomes possible.
  • the purified enzyme-labeled antibody should be stored with Thimerosal as a preservative and glycerin as a stabilizer.
  • the labeled antibody can be stored for a longer period of time by lyophilization and storage in a cool and dark place.
  • the antibody of the present invention can be used as a cancer tumor marker, an antibody for immunostaining, or an endometrial cell marker when used in combination with the labeling substance.
  • the “subject” refers to an organism to which the agent of the present invention (including a marker or the like) is administered, a part of the organism, or a part removed or excreted from the organism.
  • Organisms include, but are not limited to, animals (eg, humans, domestic animal species, wild animals).
  • cancer cell in the present invention is leukemia, colon cancer, lung cancer, breast cancer, squamous cell carcinoma of the head and neck, esophageal cancer, stomach cancer, thyroid cancer, bone and soft tissue sarcoma, ovarian cancer, uterine cancer, renal cancer. And cancer cells in knee cancer, or darioblastoma.
  • the cancer cells in the present invention are not particularly limited, and more preferable examples include cancer cells in ovarian cancer, spleen cancer, or lung cancer.
  • the endometrial cell can be more specifically an endometrial cell generated in a site other than the inner side of the uterus in eclampsia.
  • the site other than the inner side of the uterus is not particularly limited, but preferably includes a myometrium.
  • endometriosis a condition in which the growth of the intima is confined to the ectomyus layer is called uterine adenomyosis.
  • administering includes oral or parenteral administration.
  • Oral administration can include administration in the form of oral preparations, and the dosage form such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions is selected as oral preparations. be able to.
  • Parenteral administration can include injections and! /, In the form of a tube, and injections include subcutaneous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, and the like. be able to.
  • the effect of the method of the present invention can be achieved by introducing a gene containing an oligonucleotide to be administered into a living body using a gene therapy technique.
  • the agent of the present invention can be locally administered to a region where treatment is desired.
  • administration can be by local injection during surgery, use of a catheter, or targeted gene delivery of DNA encoding a peptide of the invention.
  • Examples of the drug of the present invention include reagents and DNA vaccines.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as a preservative or a stabilizer may be added.
  • “Pharmaceutically acceptable” means a pharmaceutically acceptable material that itself does not have the above-mentioned activity and can be administered together with the above-mentioned drug.
  • a stabilizer about 0.2% gelatin or dextran, 0.1-1.0% sodium glutamate, or about 5% lactose or about 2% sorbitol can be used. Is not to be done. Preservatives include about 0.01% thimerosal and about 0.1% The force that can be used such as, but not limited to, beta propionorataton.
  • a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, a preservative, etc. are added as necessary, and a subcutaneous, intramuscular or intravenous injection is prepared by a conventional method.
  • the injection may be a solid preparation or a preparation prepared at the time of use by lyophilization after storing the solution in a container.
  • One dose may be stored in a container, or a dose may be stored in the same container.
  • the method for inoculating the drug of the present invention can be used as the method for inoculating the drug of the present invention.
  • the inoculation method subcutaneous injection, intramuscular injection, transdermal inoculation, etc. are preferable, but the dosage is not limited to these.
  • the container can be a vial or a pre-filled syringe product. If necessary, it may be a solution or a powder product such as freeze-dried. It can be used for single or multiple inoculations.
  • the dosage varies depending on the type, weight, age, administration method, etc. of the subject to be inoculated, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dosage.
  • the agent of the present invention when administering to a part of the organism removed or excreted from the organism, the agent of the present invention may be "contacted" with a part of the organism.
  • “contact” is performed according to the state of the organism. For example, spraying of the drug to a part of the organism, addition of the drug to a part of the organism, and the like can be mentioned, but the method is not limited to these methods.
  • a part of the organism is a cultured cell
  • the present drug is added to the culture medium of the cell, or the DNA containing the oligonucleotide of the present invention is introduced into a cell constituting a part of the organism. It is also possible to perform the above “contact”.
  • the agents of the invention may be administered as part of a pharmaceutical composition with at least one known chemotherapeutic agent.
  • the agent of the present invention may be administered separately from at least one known anticancer agent.
  • the agent of the present invention and the known chemotherapeutic agent may be administered substantially simultaneously.
  • the present invention relates to a method for activating T cells in a subject, comprising the step of administering the peptide to the subject, and a T cell activated by the method.
  • the activated T cells are not particularly limited.
  • Preferred examples include a helper T cell that promotes an immune response, a suppressor T cell that suppresses an immune response, and a killer T cell that directly kills a cell infected with a pathogen or a cancer cell.
  • More preferred examples include human CD4 positive T cells that produce IL-4, human CD4 positive T cells that produce IFN y, human CD4 positive T cells that produce TNFa, or human CD8 positive that produces TNFa T cells can be mentioned.
  • T cells are activated means that the functions of the above various cells are activated, and that the production of these cells is enhanced, This means that the cellular immune response is enhanced.
  • the cell activity can be measured by measuring the strength of a plurality of activity markers expressed on CD4 and CD8 cells.
  • activation markers helper ⁇ cells can include CD4 and IL-4 or IFN y or ⁇ NFa, and killer T cells and suppressor T cells can include CD8 and TNFa.
  • T cell activity can be measured by methods known to those skilled in the art. Specifically, it can also be performed by the method described in the examples.
  • the period during which the T cells are activated is not particularly limited, but the activation of the T cells may be temporarily enhanced or may be enhanced for a certain period.
  • Temporal enhancement means that the state in which T cells are activated due to administration of the peptide of the present invention continues for a certain period of time, and then the activity of T cells returns to a steady state again.
  • the present invention includes a step in a subject comprising administering the peptide or the antibody to the subject.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating cancer diseases.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating cancer disease or endometriosis in a subject, comprising the following steps (a) to (c).
  • the above method may include a step of performing chemotherapy with an anticancer agent on the subject before (a).
  • Chemotherapy with an anticancer agent is not particularly limited, but more preferable examples include chemotherapy with autologous peripheral blood stem cell transplantation.
  • preventing or treating cancer disease or endometriosis means that more specifically, a cell growth inhibitory effect or a cell death inducing effect is expressed. In addition, it is also within the above meaning to improve a cancer-related gene mutation or expression change in a cancer cell to a normal state. Furthermore, in the case of eclampsia, suppression of the expression of endometrial cells occurring at sites other than the inside of the eclampsia is also included in the above meaning.
  • the period during which cancer disease or endometriosis is improved is not particularly limited, but it may be a temporary improvement or an improvement over a certain period of time.
  • the present invention relates to a drug for preventing or treating cancer diseases or endometriosis comprising as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a drug for preventing or treating cancer diseases or endometriosis comprising the antibody as an active ingredient.
  • the present invention relates to a drug for preventing or treating cancer diseases or endometriosis, which comprises the T cell as an active ingredient.
  • Pharmaceutically acceptable carriers such as preservatives and stabilizers may be added to the agents of the present invention (including antibodies, T cells, markers, etc.).
  • “Pharmaceutically acceptable” means a pharmaceutically acceptable material that itself does not have the above activity and can be administered together with the above drug.
  • Stabilizers can use about 0.2% gelatin dextran, 0.1-1.0% sodium glutamate, or about 5% lactose or about 2% sorbitol, etc. is not. Preservatives include about 0.01% thimerosal and about 0.1% The force that can be used such as, but not limited to, beta propionorataton.
  • a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, a preservative, etc. are added as necessary, and a subcutaneous, intramuscular or intravenous injection is prepared by a conventional method.
  • the injection may be a solid preparation or a preparation prepared at the time of use by lyophilization after storing the solution in a container. Further, one dose may be stored in a container, or a dose may be stored in the same container. Which type of inoculation is appropriate is determined in consideration of the type of drug and the type of subject to be inoculated.
  • the container can be a vial or a pre-filled syringe product. If necessary, it may be a solution or a powder product by freeze-drying. It can be used for single or multiple inoculations.
  • the dose varies depending on the type, weight, age, and administration method of the subject to be inoculated, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • Peripheral venous blood samples including T cells, B cells, antigen-presenting cells, etc. as a mononuclear cell fraction
  • blood samples peripheral blood samples
  • 6 patients with ovarian cancer who are taking anticancer drugs are able to respond to chemotherapy for ovarian cancer (Ikeba K, Okubo M, Takeaa b, et al: Five-year results of cyclic semi-hign dos e chemotherapy supported by autologous peripheral blood.
  • the blood sample should be about 10 ml. Blood was collected safely into a test tube containing an anticoagulant (sodium heparin).
  • an anticoagulant sodium heparin
  • a human peripheral blood mononuclear cell fraction (including T cells, B cells, macrophages, etc., hereinafter referred to as a mononuclear cell sample) was prepared from the blood sample by specific gravity centrifugation.
  • the mononuclear cells were suspended in a complete medium consisting of the following composition so as to be l ⁇ 10 5 cells / ml.
  • monoclonal antibodies specific anti-human monoclonal antibodies derived from multiple mice with different fluorescence are used.
  • the monoclonal antibody used was a product labeled with a fluorescent substance phycoerythrin (hereinafter PE) or fluorescein isothiocyanate (FITC) (Miltenyi Biotec, Glandbach, Germany).
  • PE fluorescent substance phycoerythrin
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Detection was performed using a flow cytometry instrument FACScan (Becton Dickinson) to measure the frequency of cells bound by the monoclonal antibody.
  • the flow cytometry instrument handles the detection of positive cells automatically. The outline is to irradiate the cells with laser, capture the fluorescence excited only by the cells to which the target antibody is bound, and calculate and display the number of positive cells on the computer.
  • Example 1 Analysis of the presence or absence of a T cell fraction necessary for cell therapy in the peripheral blood of a patient after anticancer drug chemotherapy
  • Anticancer agents have side effects of immunosuppression or bone marrow suppression.
  • Chemotherapy in ovarian cancer may change the cellular fraction of the patient's peripheral blood, especially a decrease in the number of T cells. There Thus, the cell fraction contained in the blood samples of 6 patients on the day when the peripheral blood white blood cell count recovered to normal after chemotherapy with anticancer drugs (average 14 days later) was analyzed.
  • CD3 pan T cells
  • CD4 helper T cells
  • CD8 cytotoxic T cells
  • CD25 activated T cells
  • CD45RA no T cells
  • CD3 positive cells which are T cell markers
  • CD19 positive cells which are sputum cells
  • monocytes are 13.1% (3.0-26.1%)
  • CD14-positive cells 5.9% (2% or less) of certain CD14-positive cells, 31.0% of CD25-positive cells that are activated sputum cells, 19.5% of naive-type CD4-positive 45RA-positive cells that are helper sputum cells, and CD4-positive 45RO-positive cells that are memory-type 10.5%, total CD4 positive is 30.0% (24.0-61.0%), na ⁇ ve CD8 positive 45RA positive cells are 4.0%, CD8 positive 45RO positive cells are memory type 2.9%, The total CD8 positive was 6.9% (17.0-44.0%).
  • CA125 was reported in 1981 as an antigen name recognized by a monoclonal antibody produced by Bast RC Jr. et al. By immunizing mice with an ovarian cancer cell line antigen (Bast RC, Fenney M, Lazarus H Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. J Clin Invest. 68: 1331-1337, 1981.).
  • CA125 has an overall positive rate of about 70% for ovarian cancer, and about 90% for serous adenocarcinoma, the most common cell type of ovarian cancer. Tumor with characteristics and most characteristic of ovarian cancer cells It was used as a marker. However, the molecular structure has only recently been revealed.
  • CA125 is a protein with a sugar chain added to it, and is one of the macromolecules called mucins. After the mucin, the core protein portion is called MUC, and CA125 was named MU C16 as one of the multiple MUCs present in the body.
  • the amino acid sequence of the core protein of MUC16 is reported in 2001 by Yin B. et al. ("In BW, Lloyd KO. Molecular cloning of the A125 ovarian cancer antigen identification as a new mucin, MUC16.
  • CA125 has not been studied at all as to whether it can be used as a cancer sequestering antigen (an antigen that is recognized immunologically to eliminate cancer cells). Therefore, in the present invention, CA125, which is an ovarian cancer-related antigen, was used as a cancer sequestration antigen.
  • T cells basically recognize only the amino acid sequence presented on MHC, only the amino acid sequence of MUC16 of the core protein part not including the glycoprotein of CA125 was analyzed.
  • MUC16 contains two kinds of sequences that repeat 78 or 12 amino acids 12 or 11 times (Yin BW, Lloyd KO. Molecular cloning of the A125 ovarian cancer antigen identincation as a new mucin, MUC16. J Biol Chem. 276: 27371 -27375, 2001.).
  • the present inventors prepared a site having a repetitive sequence of these 78 amino acid residues as a synthetic peptide, the hydrophobicity, hydrophilicity, and charge of amino acids that are not exactly the same as the original sequence are common. Substitutive sequences were substituted and prepared as similar peptides (hereinafter referred to as analog peptides) (FIGS. 1 to 3).
  • Antigen-specific cells can produce IFN ⁇ or IL-4 when activated.
  • Fumihara Fujimi. T cell immune response T cell immune system pp 155-174. Fujiwara Daimi, edited by Chugai Medical, Tokyo, 1993.
  • T cells expressing IL-4 or IFN y are detected when ovarian cancer antigen MUC16 analog peptide is added to the mononuclear cell fraction containing T cells and cultured and stimulated, MUC16 antigen specific
  • the ovarian cancer antigen MUC16 analog peptide contains a T cell epitope. However, if any ovarian cancer antigen MUC16 analog peptide cannot be activated, there will be no MUC16 antigen-specific T cells.
  • the present inventors in 6 preliminary experiments, detected CD4 positive and IL-4 positive cells in the range of OVCA8 to OVCA14 out of 48 analog peptides.
  • CD4 and IL-4 or CD4 and IFNy were detected using 7 analog peptides from OVCA9 to OVCA13 (SEQ ID NO: 14, 13, 11, 12, 15) individually.
  • 27 mononuclear cell samples 84.4%) were IL-4 positive in 32 mononuclear cell samples stimulated by OVCA11, and 26 mononuclear cell samples (78.8%) in 32 mononuclear cell samples were IFN.
  • OVCA11 GHTAPGPLLVPFTLNFTITN (SEQ ID NO: 11) activated T cells in an antigen-specific manner.
  • OVCA12 PFTLNFTITNLRYEENMRHP (SEQ ID NO: 12) is a mononuclear cell sample of IL-4 positive T cell force S18 / 33 and activated in a mononuclear cell sample of ⁇ positive T cell force S13 / 33. It was. This positive reaction was concentration-dependent at analog peptide concentrations between 5 and 50 ⁇ .
  • FIGS. 6 and 7 show typical examples of the results of flow cytometry analysis in which IL-4 was detected.
  • the control with no analog peptide and the mononuclear cell sample with only IL-2 had a positive cell frequency of 0.04% and 0.07%, respectively.
  • the frequency of positive cells responding to stimulation with OVCA9 (SEQ ID NO: 14) and OVCA10 (SEQ ID NO: 13) is hardly observed at 0.05%.
  • stimulation with analog peptide of OVCA11 SEQ ID NO: 11
  • the frequency of CD4 positive IL-4 positive in all the mononuclear cell samples analyzed is the control mononuclear cell sample cultured in IL-2 only without analog peptide (hereinafter referred to as Ctr).
  • OVCA10 mononuclear cell sample
  • O VCA11-MNC mononuclear cell sample added with analog peptide OVCA12
  • OVCA12-MNC mononuclear cell sample added with analog peptide OVCA12
  • Ctr-MNC vs OVCA12—MNC: p 0.0028
  • OVCA10—MNC vs. OVCA12—MNC: p 0.0031
  • FIGS. 9 and 10 show the results of typical examples of flow cytometry analysis in which IFN y was detected.
  • the positive cells were 0.02% and 0.08%, respectively, in the control without analog peptide and in the sample added with IL-2, and almost no positive cells were observed.
  • T cells responding to stimulation with OVCA9 (SEQ ID NO: 14) and OVCA10 are low at 0.02% and 0.11%, respectively, even when analog peptides are added.
  • 3.12% of positive cells were observed by analog peptide stimulation of OVCA11 (SEQ ID NO: 11).
  • the frequency of CD4-positive IFN y-positive in the mononuclear cell samples of all the cases analyzed was calculated as Ctr- MNC, OVCA10- MNC, OVCA11- MNC, and OVCA12- MNC.
  • the number of samples was 0.243 ⁇ 0.258% (32), 0.328 ⁇ 0.525% (33), 3.037 ⁇ 2.234% (33), and 5.071 people, 10.315% (33), respectively.
  • the t-test results showed that Ctr-MNC vs. OVCA11- MNC: p ⁇ 0.001, Ctr-MNC vs.
  • OVCA10- MNC group mean + 2SD (1.148% for IL-4, 1.378% for IFN y) or higher positive mononuclear cell sample frequency when positive for antigenic peptide antigen-specific T cells Is shown in the upper part of Table 1.
  • OVCA11-MNC is recognized by many mononuclear cell samples, with IL-4 positivity at 84.4% and IFN y positivity at 78.8%, and the frequency is higher than OVCA12-MNC. It was.
  • the average number of IL-4 positive cells in the patient group and the healthy group is 12% and 4.89%, respectively, and the average number of IF ⁇ positive cells is 2.85% and 3.48%. However, the patient group tended to be less than the healthy group.
  • TNFa tumor necrosis factor
  • sputum cells produce TNFa (tumor necrosis factor) when sputum cells activated specifically for antigen damage target cells such as tumor cells. Therefore, the T cell force stimulated with OVCA11 obtained from [Example 3] was used to determine whether or not TN F a was actually produced in the same manner as in [Example 3], CD4 and TNFa and CD8 and TNF. o; was analyzed by flow cytometry. A typical example of the results is shown in Fig. 12. CD4 positive before OVCA stimulation and TNF o; positive T cell frequency was 0.44%, but increased to 5.76% after OVCA11 stimulation.
  • CD8 positive TNF o positive T cells, which are known to have stronger cytotoxic activity, also increased to 0.28% force 3.98%. Based on this result, OVCA11 analog peptide activates CD4 positive cells in an antigen-specific manner and produces not only IL-4 and IFN ⁇ but also CD4 positive and CD8 positive cells. I was able to confirm.
  • the site containing the T cell epitope is not within the range of the analog peptides OVCA11: GHTAPGPLLVPFTLNFTITN (SEQ ID NO: 11) and OVCA12: PF TLNFTITNLRYEENMRHP (SEQ ID NO: 12). Limited.
  • the 30 amino acid residues common to OVCA11 and OVCA12 MUTAP16 derived from GHTAPGPLLVPFTLNFTITNLR YEENMRHP (SEQ ID NO: 45) To the original amino acid sequence in the 11-repeat sequence, and further divided into 10 amino acid residues.
  • OVCA101 (SEQ ID NO: 4), 102 (SEQ ID NO: 5), 103 (SEQ ID NO: 6), 104 (SEQ ID NO: 7), 105 (SEQ ID NO: 8), 106 (SEQ ID NO: 9), 107 (SEQ ID NO: 2), 108 (SEQ ID NO: 3), 109, 110, 111, 112, 113, 114 115 (SEQ ID NO: 10) (FIG. 5) and IL-4 or IF-4 ⁇ positive T cells were detected by the same method as described above.
  • FIG. 13 shows the results of flow cytometry analysis of typical CD4 and IL-4 positive cells.
  • 6.32% of IL-4 positive cells were observed with OVCA107 peptide stimulation.
  • Fig. 14 is a graph showing the frequency of IL-4 positive cells shown by individual mononuclear cell samples.
  • OVCA101-MNC 0.181 ⁇ 0.231% (14)
  • FIG. 15 shows the results of flow cytometry analysis of typical CD4 and IFN y positive cells. In this example, 6.32% positive cells were observed with OVCA107 stimulation.
  • FIG. 16 is a graph showing the frequency of IFN y-positive cells exhibited by individual mononuclear cell samples.
  • OVCA107 SEQ ID NO: 2
  • OVCA108 SEQ ID NO: 3
  • OVCA101 to OVCA106 SEQ ID NO: 4 to 9
  • OVCA115 SEQ ID NO: 10
  • the amino acid sequence of the force CD4 positive T cell epitope is considered to be P / LFTL NFTITN (SEQ ID NO: 51).
  • OVCA107 (SEQ ID NO: 2) and 108 (SEQ ID NO: 3) are polypeptides having different amino acid sequences (P / L) (see FIG.
  • OVCA107 SEQ ID NO: 2
  • OVCA108 was recognized as the number of mononuclear cell samples with almost the same frequency, and there was little difference (see the lower part of Table 1). Therefore, it can be said that the shorter T cell epitope is FTLNFTITN (SEQ ID NO: 1).
  • the length of the epitope of CD4 positive T cells is about 20 amino acid residues.
  • Fujimi. T cell immune response T cell immune system. Pp 155-174. Fujiwara Daimi, edited by Chugai Medical Co., Tokyo, 1993.
  • the stimulation with OVCA11 was more positive than that with OVCA107 even if the peptide mol concentration was uniform.
  • the reaction was stable with small dispersion.
  • the analog peptide OVCA11 GHTAPGPLLVPFTLNFTITN (SEQ ID NO: 11) is considered most suitable for the activity of T cells.
  • the number of positive mononuclear cell samples showing a frequency of the mean value of the control + 2SD or more was higher than that of the OVCA107 stimulation, and the maximum was 84.4% in the OVCA11 stimulation.
  • the analog peptide is unlikely to produce an immune response difference that depends on an individual's MHC class II molecule, or a sequence with an acceptable affinity for multiple MHC class II molecules, or T cells. It is thought that it becomes a sequence that enhances the response. Therefore, an OVCA11 analog peptide with 20 amino acid residues may be more suitable for cell therapy than using only short epitopes as peptides.
  • Chemotherapy for solid cancers such as ovarian cancer is less effective at inhibiting hematopoietic cells with anticancer drugs than treatment for hematological tumors. Therefore, it is said that mature memory T cells remaining in the periphery proliferate and reconstitute before recovery of blood cells after suppression and increase of naive T cells in which both bone marrow forces are mobilized (Yosuke Takahama). Peripheral T cell dynamics 'maintenance' differentiation. Immunology latest illustrated. Shigeo Oyasu. Yodosha. Tokyo. 2003) o According to our analysis, peripheral blood after chemotherapy has memory T cells. It was shown to be in a favorable state for T-cell therapy after a standard dose of anticancer chemotherapy.
  • the best chemotherapy for advanced ovarian cancer is autologous peripheral blood stem cell transplantation (Ikeba K, Okubo M, Takeda S, et al: Fiv e-year results of cyclic semi-high dose chemotherapy supported by autologous perip heral blood stem cell transplantation in patients with advanced ovarian cancer.Int J Clin Oncol. 9: 113-119, 2004.) 0 Only hematopoietic stem cells contained in the peripheral blood mononuclear cell fraction of only a few percent were used only to rescue bone marrow deterioration by physiotherapy.
  • the result of the present invention is that the ovarian cancer antigen analog peptide-specific Thl type is activated by activating ovarian cancer patient T cells with ovarian cancer antigen analog peptide in vitro and then returning it to the patient's peripheral blood vessels and peritoneal cavity.
  • Mechanisms by which CD4-positive T cells damage cancer cells indirectly through IFN, directly through TNFa, mechanisms that support CD8-positive T cells and exert antitumor effects, specific antibodies It has been shown that treatment of advanced ovarian cancer is possible by the mechanism that produces the ovarian.
  • ovarian cancer antigen analog peptide is administered to ovarian cancer patients as a peptide vaccine to recognize ovarian cancer antigen analog peptides in the body of the patient.
  • T cells and antibodies By inducing T cells and antibodies, it is considered possible to treat or prevent ovarian cancer that produces ovarian cancer antigens.
  • ovarian cancer antigen analog peptide as an antigen, producing immune globulin (Immunoglobulin) components by heterogeneous immunity or genetic engineering techniques, and administering anti-ovarian cancer antigen (CA125) antibody to ovarian cancer patients, It can treat ovarian cancer that produces ovarian cancer antigen (CA125). is there.
  • the ovarian cancer antigen CA125 may also be produced in some parts of ovarian cancer, such as knee cancer, lung cancer, or endometriosis (especially adenomyosis), which is a benign disease. Similar treatment may be possible for all lesions producing CA125.

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Abstract

　本発明者らは、本発明の課題を解決するために、まず、CD4と、IL-4またはIFNγを組み合わせて検出する実験系により、卵巣癌患者の末梢血中の卵巣癌抗原特異的なT細胞の存在を確認した。次に、本発明者らは、卵巣癌関連抗体C125のコアタンパク質MUC16のアナログペプチドを用いて、患者および健常人の末梢単核球中に、抗原特異的CD4陽性T細胞が平均約4％の頻度で存在することを明らかにした。次に、本発明者らは、卵巣癌関連抗原CA125のコアタンパク質MUC16中でT細胞エピトープの解析を行い、より短いエピトープとしてFTLNFTITN（配列番号：1）のアミノ酸配列を決定した。さらに、本発明者らは、アナログペプチドであるOVCA11：GHTAPGPLLVPFTLNFTITN（配列番号：11）がT細胞の活性化に適していることを見出した。

Description

明 細 書
癌関連抗原アナログペプチド、およびその利用
技術分野
[0001] 本発明は、癌関連抗原アナログペプチド、およびその利用に関する。
背景技術
[0002] 日本における卵巣癌患者数は年々増加しており、国立がんセンター（日本)の報告 では 1998年 1年間に 6,742人が発症し、年間死亡者数も増え続け 2001年には 4,154人 に達して!/、る。病期分類 III-IV期の進行卵巣癌は手術療法単独での治療は困難であ り、抗癌剤による化学療法が行われる。しかし、予後は不良であり、国立がんセンター (日本）の 2000年の集計では、 III期の卵巣癌の 5年生存率は 30%、 IV期の卵巣癌の 5 年生存率は 12%と低ぐ新たな治療法の開発が待たれている。
[0003] 手術療法や化学療法を補完する癌の治療法として、科学的な根拠に基づ!ヽた (こ の点が民間細胞療法とは異なる）生体の持つ細胞免疫反応を利用する「細胞治療」 がある（非特許文献 1)。「細胞治療」の 1例として 1980年代に Rosenbergらによって開 発された「Lymphocyte activated killer (LAK) therapy:養子免疫療法」がよく知られて いる（非特許文献 2)。この方法は、患者の血液中の Natural killer cell : NK細胞と T細 胞を含む血液を試験管内で培養後、再度本人の静脈に戻すというものである。養子 免疫療法はある種の進行癌の制御に一定の効果をあげているが、もともと癌細胞の 種類を限定しな 、治療法のため、癌抗原特異的な免疫反応により腫瘍縮小効果を あげているかどうかは明確ではな力つた。そこで、悪性黒色腫を対象とした細胞治療 では、癌抗原のアミノ酸配列をもとに合成ペプチドを用いて、抗原特異的な CD8陽性 細胞障害性 Τ細胞を試験管内で活性ィ匕し、この Τ細胞を生体に戻すという方法が選 ばれ、一定の効果をあげた。この方法はペプチドで刺激した Τ細胞が抗原特異的に 腫瘍を縮小すると 、う治療戦略が可能である事を示した点で有益なものであった (非 特許文献 3)。
[0004] しかし、この治療法を他の癌腫に適応するためにはいくつかの問題点があり、現在 まだ実用化までには至っていない。それらの問題点としては、（1)癌隔絶抗原を臓器 ごとに決定するには、従来の方法では手間が力かり容易ではないこと、（2)必要な T 細胞数を得るための培養に時間が力かること、そして、 (3) CD8陽性細胞障害性 T細 胞は単独では癌隔絶抗原に対して tolerance :免疫学的寛容（以下トレランス）が成立 して 、る可能性が高 、こと (非特許文献 4)の 3点が挙げられて 、た。
非特許文献 1 :大久保光夫，細胞治療， pp948-957,輸血学改訂第 3版，遠山博他編 著，中外医学社,東京， 2004.
非特干文献 2： Rosenberg ¾A, Spiess P, Lafreiere R: A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocyte. Science. 233:1318—21 , 1986.
非特許文献 3 : Rosenberg SA, Yang JC, Schwartzentruber DJ, et. al: Immunologic an d therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma. Nature Med. 4:321—327, 1998.
非特許文献 4 : Mehrotra S, Stevens R, Zengou R, et al: Regulation of melanoma epit ope— specific cytolytic T lymphocyte response by immature and activated dendritic c ells, in vitro. Cancer Research. 63:5607 - 5614, 2003.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 進行卵巣癌は手術療法と抗癌剤による化学療法が行われているが、従来の治療で は予後不良であり、新たな治療法の開発が望まれていた。卵巣癌治療において、「 癌抗原特異的細胞治療」すなわち、癌関連抗原のアナログペプチド、および該ぺプ チドにより活性化された T細胞を利用する治療方法はこれまでに存在しなかった。
[0006] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、アミノ酸配列 P he-Thr-Leu-Asn- Phe-Thr-Ile-Thr-Asn (配列番号： 1)を含む卵巣癌関連抗原アナ ログペプチドを提供することにある。また、該ペプチドを投与することにより活性化され た T細胞の提供、または、該ペプチドに結合する抗体の提供を課題とする。また該ぺ プチド、該 T細胞、または該抗体を用いた癌疾患等を予防または治療する方法の提 供を課題とする。さらに、該ペプチド、該抗体、または該 T細胞を有効成分とする、癌 疾患等を予防または治療する薬剤の提供についても課題とする。 課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、上記の課題を解決するために、化学療法を補う癌疾患の新たな T 細胞治療プロトコールを計画した。この計画は抗癌剤による化学療法に引き続き、癌 関連抗原ペプチドアナログで刺激した自己 τ細胞を体内に戻し、抗腫瘍効果を惹起 するものである。
[0008] まず、本発明者らは、抗癌剤による化学療法後の患者の血液サンプルに含まれる 細胞分画を解析した所、 T細胞数、 B細胞数は正常範囲にあり、 CD4陽性メモリー細 胞と単球系は増カロして 、ることを確認し、抗癌剤化学療法後に T細胞治療が可能で あることを確認した。次に、卵巣癌患者の末梢血中の卵巣癌抗原特異的な T細胞の 存在を、 CD4と IL-4または IFN yを組み合わせて検出する実験系により確認した。本 発明者らは、卵巣癌関連抗体 C125のコアタンパク質 MUC16のアナログペプチドを用 いて、患者および健常人の生体内における、抗原特異的 CD4陽性 T細胞の解析を行 つた o
上記の解析の結果、卵巣癌抗原の特定のアミノ酸配列 (アナログペプチド)を認識 する T細胞が患者末梢単核球中に平均約 4%の頻度で存在することが初めて明かと なった。
[0009] さらに、本発明者らは、卵巣癌関連抗原 CA125のコアタンパク質 MUC16中で T細胞 ェピトープの解析を行い、より短いェピトープとして FTLNFTITN (配列番号： 1)のアミ ノ酸配列を決定し、このェピトープを含むアナログペプチドである OVCA11 : GHTAPG PLLVPFTLNFTITN (配列番号： 11)力 より T細胞の活性化に適していることを見出し た。
[0010] 本発明者らは以前の報告（Okubo M, Saito M, Inoku H, et al. Analysis of HLA- DR B*0901 -binding HPV- 16 E7 helper T cell epitope. J Obst Gynecol Res. 30: 120-12 9, 2004.)で、子宮頸癌関連抗原の合成ペプチドを用い、患者ヘルパー T細胞の認 識するェピトープを決定した。さらに、この合成ペプチドで末梢血単核球を刺激する 際に IL-12とともに試験管内で培養することにより、 CD4陽性でありながら細胞障害活 性をもつ Thlタイプの T細胞を誘導することに成功して!/、る (WO2002/100889)。
[0011] 本発明において対象とした、卵巣癌では、 IL-12非存在下アナログペプチド刺激で CD4陽性 Thlタイプ T細胞を患者単核球サンプル中で増加させることができた。また、 CD4陽性 TNF a産生 T細胞と CD8陽性 TNF a産生 T細胞も誘導できた。したがって、 この細胞をアナログペプチドで刺激してメモリー T細胞を抗原特異的に再活性ィ匕した 後、患者の腹腔 (腹水中）、末梢血管あるいはリンパ管に移入することにより、抗原特 異的な免疫反応により、 CA125を産生する細胞への直接の障害、 CD8陽性細胞への 補助、特異的抗体産生などの作用により、抗腫瘍効果を発揮できると考えられる。特 に、手術療法でほとんどの腫瘍細胞が摘除されたものの再発が心配される場合には 、癌抗原アナログペプチドを投与し、メモリー T細胞を再活性化して再発を抑え、長期 予後を改善するという治療として有効である。
[0012] 即ち、本発明者らは、卵巣癌関連抗原のェピトープを特定し、該ェピトープを含む 癌関連抗原アナログペプチドが、 T細胞を活性化させることを見出した。また、抗癌剤 による化学療法に引き続き、該癌関連抗原アナログペプチドで活性化させた自己 T 細胞を体内に戻すことで、抗腫瘍効果を誘導させることに成功し、これにより本発明 を完成するに至った。
[0013] 本発明は、より具体的には以下の（1)〜（30)を提供するものである。
(1)下記式を含むペプチド：
X1 -X2-X3 -X4-X5 -X6
(式中、 XI、 X2、 X3、 X5、および X6は、任意に含まれていてもよいアミノ酸残基、ま たはアミノ酸配列であり、
X4は、 Phe- Thr- Leu- Asn- Phe- Thr- lie- Thr- Asn (配列番号： 1)である。 )
(2) X3が、 Proまたは Leuである、（1)に記載のペプチド。
(3) X2が、
Gly- His- Thr- Ala- Pro- Va卜 Pro- Leu- Leu- lie (配列番号： 4)、
Gly- His- Thr- Ala- Pro- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 5)、
Arg- Pro- lie- Va Pro- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 6)、
Glu- Thr- Thr- Ala- Thr- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 7)、
Gly— Pro— Thr— Thr— Ala— Ser— Pro— Leu— Leu— Val (配列番号： 8)、
Gly- Pro- Ser- Ala- Ala- Ser- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 9)、または、 Gly— Thr— Ser— Gly— Thr— Pro— Ala— Ser— Leu— Pro— Gly— His— Thr— Ala— Pro— Gly— Pro— Leu— Leu-Val (配列番号： 13)のいずれかである、（1)または（2)に記載のペプチド。
(4) X2が、
Ala- Pro- Va卜 Pro- Leu- Leu- lie (配列番号： 46) 、
Ala- Pro- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 47) 、
Ala- Ser- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 48) 、
Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 49)、または
Pro-Leu-Leu-Val (配列番号： 50)のいずれかである、（1)または（2)に記載のぺプ チド。
(5) X5が、
Leu-Arg-Tyr-Glu-Glu-Asn-Met-Arg-His-Pro (配列番号： 10)である、（ 1 )〜（4)の V、ずれかに記載のペプチド。
(6)アミノ酸残基数が 30個以下である、 (1)〜（5)の 、ずれかに記載のペプチド。
(7)卵巣癌関連抗原 CA125のコアタンパク質 MUC16由来である（1)〜（6)のいずれ かに記載のペプチド。
(8) (1)〜（7)の!、ずれかに記載のペプチドをコードして!/、る DNA。
(9) (8)に記載の DNAを含むベクター。
(10) (9)記載のベクターが導入された形質転換体。
(11) (10)に記載の形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清 力も組換えタンパク質を回収する工程を含む、（1)〜（8)のいずれかに記載のぺプ チドの製造方法。
(12) (1)〜（7)のいずれかに記載のペプチドに結合する抗体。
(13)モノクローナル抗体である（12)に記載の抗体。
(14) (12)または（13)に記載の抗体を対象に投与する工程を含む、対象における 癌細胞、癌細胞関連抗原、または子宮の内側以外の部位に発生した子宮内膜細胞 を検出する方法。
(15) (1)〜（7)のいずれかに記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、対象に おける T細胞を活性ィ匕させる方法。 (16) T細胞が IL-4を産生するヒト CD4陽性 T細胞、 IFN γを産生するヒト CD4陽性 Τ細 胞、 TNF o;を産生するヒト CD4陽性 Τ細胞， TNF o;を産生するヒト CD8陽性 T細胞、で ある（15)に記載の方法。
(17) (15)または（16)に記載の方法によって、活性化された T細胞。
(18) (1)〜（7)のいずれかに記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、対象に おける癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する方法。
(19) (12)または（13)に記載の抗体を対象に投与する工程を含む、対象における 癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する方法。
(20)対象における癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する方法であって、 以下の工程 (a)〜(c)を含む方法。
(a) (1)〜（7)のいずれか〖こ記載のペプチドを T細胞に添加する工程、
(b) (a)の T細胞を培養する工程、
(c) (b)で得られた T細胞を対象に投与する工程。
(21)工程 (a)の前に、対象に抗癌剤による化学療法を行う工程を含む、（20)に記載 の方法。
(22)抗癌剤による化学療法が自己末梢血幹細胞移植併用化学療法である、 (21) に記載の方法。
(23)癌疾患が、卵巣癌、脾臓癌、または肺癌である（18)〜（22)のいずれかに記載 の方法。
(24)子宫内膜症が、子宫腺筋症である（18)〜（22)の 、ずれかに記載の方法。
(25) (1)〜（7)のいずれかに記載のペプチドを有効成分とする、癌疾患または子宫 内膜症を、予防または治療するための薬剤。
(26) (12)または（13)に記載の抗体を有効成分とする、癌疾患または子宮内膜症を 、予防または治療する薬剤。
(27) (17)に記載の T細胞を有効成分とする、癌疾患または子宮内膜症を、予防ま たは治療する薬剤。
(28)癌疾患が、卵巣癌、脾臓癌、または肺癌である（25)〜（27)のいずれかに記載 の薬剤。 (29)子宫内膜症が、子宫腺筋症である（25)〜（27)の 、ずれかに記載の方法。
(30) (12)または（13)に記載の抗体を有効成分とする、癌腫瘍マーカー、免疫染色 用抗体、または子宮内膜細胞マーカー。
図面の簡単な説明
[図 1]CA125の MUC16のアミノ酸配列を示す図である。「くり返し部分その 1」と「アナ口 グペプチド配列その 1」を示す。 12列の繰り返し配列のうち、異なるアミノ酸配列を共 通したアミノ酸に置き換えて新たに「アナログペプチド配列その 1」を設計した。この配 列を 20アミノ酸残基数ずつに区切って合成ペプチドとして準備した。
[図 2]CA125の MUC16のアミノ酸配列を示す図である。「くり返し部分その 2」と「アナ口 グペプチド配列その 2」を示す。 11列の繰り返し配列のうち、異なるアミノ酸配列を共 通したアミノ酸に置き換えて新たに「アナログペプチド配列その 2」を設計した。この配 列を 20アミノ酸残基数ずつに区切って合成ペプチドとして準備した。
[図 3]CA125の MUC16のアミノ酸配列を示す図である。くり返しを含まないアミノ酸配 列を示す。この配列のすべてを 20アミノ酸残基数ずつに区切って合成ペプチドとして 準備した。
[図 4]MUC16「アナログペプチド配列その 2」由来の 20アミノ酸残基数の合成アナログ ペプチドシリーズを示す図である。予備実験で陽性反応を示した「アナログペプチド 配列その 2」を 10アミノ酸残基数ずつお互いに重なるように 20アミノ酸残基数の合成 アナログペプチドシリーズ OVCA8-14として準備した。
[図 5]T細胞ェピトープ決定用の 10アミノ酸残基数のペプチド配列を示す図である。陽 性反応が得られた OVCA11と OVCA12のアナログペプチドの元の配列（原形の MUC 16)に戻したペプチド OVCA101-115を示す。
[図 6]CD4と IL-4の検出フローサイトメトリー解析結果例を示す図である。上段： IL-2も アナログペプチドも加えていないバックグラウンド。中段： IL-2のみ加え，アナログぺ プチドをカ卩えて 、な ヽコントロール。下段： IL- 2とアナログペプチド OVCA9をカ卩えた単 核球サンプル。 3単核球サンプルの CD4陽性かつ IL-4陽性 T細胞頻度は各々 0.04%、 0.07%、 0.05%でほとんど認められない。
[図 7]CD4と IL-4の検出フローサイトメトリー解析結果例を示す図である。上段： IL-2と アナログペプチド OVCA10を加えた単核球サンプル。中段： IL-2とアナログペプチド OVCA11をカ卩えた単核球サンプル。下段： IL- 2とアナログペプチド OVCA12をカ卩えた 単核球サンプル。アナログペプチド OVCA11をカ卩えた単核球サンプルでは CD4陽性 かつ IL-4陽性 T細胞が 7.06%存在する。
[図 8]CD4陽性かつ IL-4産生 T細胞頻度を示す図である。 OVCA11ある!/、は OVCA12 をカロえた単核球サンプル群は OVCA10を加えた単核球サンプル群より、陽性細胞頻 度が統計学的有意差を持って高い。アナログペプチド濃度は各 15 Mである。
[図 9]CD4と IFN yの検出フローサイトメトリー解析結果例を示す図である。上段: IL-2 もアナログペプチドも加えていないバックグラウンド。中段： IL-2のみ加え，アナログぺ プチドをカ卩えて 、な ヽコントロール。下段： IL- 2とアナログペプチド OVCA9をカ卩えた単 核球サンプル。 3単核球サンプルの CD4陽性かつ IFN y陽性 T細胞頻度は各々 0.02% , 0.08%, 0.02%でほとんど認められない。
[図 10]CD4と IFN yの検出フローサイトメトリー解析結果例を示す図である。上段: IL- 2とアナログペプチド OVCA10を加えたサンプル。中段： IL-2とアナログペプチド OVC Allを加えたサンプル。下段： IL- 2とアナログペプチド OVCA12をカ卩えたサンプル。ァ ナログペプチド OVCA11をカ卩えたサンプルでは CD4陽性かつ IFN γ陽性 Τ細胞が 3.1 2%存在する。
[図 11]CD4陽性かつ Ν γ産生 Τ細胞頻度を示す図である。 OVCA11あるいは OVC A12を加えた単核球サンプル群は OVCA10をカ卩えた単核球サンプル群より、陽性細 胞頻度が統計学的有意差を持って高 、。アナログペプチド濃度は各 15 μ Μである。
[図 12]CD4と TNF aおよび CD8と TNF aの検出フローサイトメトリー解析結果例を示 す図である。上段： IL-2とアナログペプチド OVCA11をカ卩えたサンプル。下段： IL-2と アナログペプチド OVCA11を加えたサンプル。アナログペプチド OVCA11をカ卩えたサ ンプルでは CD4陽性かつ TNF a陽性 T細胞が 5.76%、 CD8陽性かつ TNF a陽性 T細 胞が 3.98%存在する。
[図 13]ェピトープ決定時の CD4と IL- 4検出フローサイトメトリー解析結果例を示す図 である。上段： IL-2とアナログペプチド OVCA107をカ卩えた単核球サンプル。中段： IL- 2とアナログペプチド OVCA108を加えた単核球サンプル。下段： IL-2とアナログぺプ チド OVCA115を加えた単核球サンプル。アナログペプチド OVCA107あるいは OVCA 108を加えた単核球サンプルでは CD4陽性かつ IL-4陽性 T細胞が各々 6.32%、 1.17% 存在する。
[図 14]ェピトープ決定時 CD4陽性かつ IL-4産生 T細胞頻度を示す図である。 OVCA1 07あるいは OVCA108をカ卩えた単核球サンプル群は頻度が高い例が認められる。ァ ナログペプチド濃度は各 15 μ Μである。
[図 15]ェピトープ決定時の CD4と IFN γの検出フローサイトメトリー解析結果例を示す 図である。上段： IL-2とアナログペプチド OVCA107をカ卩えた単核球サンプル。中段： I L-2とアナログペプチド OVCA108をカ卩えた単核球サンプル。下段： IL-2とアナログぺ プチド OVCA115をカ卩えた単核球サンプル。アナログペプチド OVCA107あるいは OV CA108を加ぇた単核球サンプルではCD4陽性かっIFN γ陽性T細胞が各々2.10%、 1. 27%存在する。
[図 16]ェピトープ決定時 CD4陽性かつ IFN y産生 Τ細胞頻度を示す図である。 OVCA 107あるいは OVCA108をカ卩えた単核球サンプル群は頻度が高い例が認められる。ァ ナログペプチド濃度は各 15 μ Μである。
[図 17]化学療法を補完する抗原特異的 Τ細胞療法の戦略を示す図である。
[図 18]子宮内膜症 (子宮腺筋症）に対する抗原特異的 Τ細胞療法の戦略を示す図で ある。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 本発明は、アミノ酸配列 Phe- Thr- Leu- Asn- Phe- Thr- lie- Thr- Asn (配列番号： 1)を 含む、ペプチドに関する。本発明のペプチドは、アミノ酸配列 Phe-Thr-Leu-Asn- Phe - Thr-Ile-Thr-Asn (配列番号： 1)を含んでいれば、他の部分のアミノ酸配列について は特に制限はない。
[0016] 本発明のペプチドの一つの態様として、好ましくは下記式を含むペプチドを挙げる ことが出来る。
X1 -X2-X3-X4-X5-X6
式中、 X4は、 Phe- Thr- Leu- Asn- Phe- Thr- lie- Thr- Asn (配列番号： 1)であり、 XI、 X2、 X3、 X5、および X6は、任意に含まれていてもよいアミノ酸残基、またはアミノ酸 配列であり、本発明のペプチドと機能的に同等である限り、アミノ酸の配列構成につ V、ては特に限定をされな!、。
[0017] 本発明において「機能的に同等」とは、対象となるペプチドが、本発明のペプチドと 同様の免疫賦活活性を持つことをいう。本発明において免疫賦活活性としては、 T細 胞の活性化、または抗体産生能の増強等を挙げることが出来る。
上記式 X3に相当するアミノ酸残基としては、 Proまたは Leuが挙げられる力 特に限 定されるものではない。
[0018] また、上記式 X2に相当するアミノ酸配列としては、 Gly-His-Thr-Ala-Pro-Va卜 Pro- Leu- Leu- lie (配列番号： 4)、 Gly- His- Thr- Ala- Pro- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番 号： 5)、 Arg- Pro- lie- Va卜 Pro- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 6)、 Glu- Thr- Thr- Ala- Thr- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 7)、 Gly- Pro- Thr- Thr- Ala- Ser- Pro- Le u— Leu— Val (配列番号： 8)、 Gly— Pro— Ser— Ala— Ala— Ser— Pro— Leu— Leu— Val (配列番号： 9)、または、 Gly- Thr- Ser- Gly- Thr- Pro- Ala- Ser- Leu- Pro- Gly- His- Thr- Ala- Pro- G ly-Pro-Leu-Leu-Val (配列番号： 13)のいずれか一つを挙げることができる力 特に 限定されるものではない。
[0019] また、上記式 X2に相当するアミノ酸配列としては、 Ala-Pro-Va卜 Pro-Leu-Leu-Ile ( 配列番号: 46)、
Ala- Pro- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 47) 、 Ala- Ser- Pro- Leu- Leu- Val (配列 番号： 48) 、 Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 49)、または Pro- Leu- Leu- Val (配列 番号： 50)のいずれか一つを挙げることができる力 特に限定されるものではない。
[0020] また、上記式 X5に相当するアミノ酸配列としては、 Leu-Arg-Tyr-Glu-Glu-Asn-Me t-Arg-His-Pro (配列番号： 10)を挙げることができる力 特に限定されるものではな い。
[0021] 本発明のペプチドのアミノ酸残基数は特に限定されるものではないが、アミノ酸残 基数が 30個以下（具体的には 30個、 25個、 20個、 15個、 10個以下）であることがより 好ましい。
本発明のペプチドの由来は特に限定されないが、好ましくは癌関連抗原由来のぺ プチド、より好ましくは卵巣癌関連抗原 CA125のコアタンパク質 MUC16由来のぺプチ ドを、本発明のペプチドとして例示することが出来る。
[0022] 本発明は、上記の本発明のペプチドをコードしている DNAに関する。本発明のぺプ チドをコードする DNAには、ゲノム DNA、 cDNA、および化学合成 DNAが含まれる。ゲ ノム DNAおよび cDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能 である。ゲノム DNAは、例えば、癌関連抗原 (好ましくは卵巣癌抗原)からゲノム DNA を抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、 BA C、 PACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明のペプチドをコードする DNAを基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダィゼーシヨンある!/、はプラ ークハイブリダィゼーシヨンを行うことにより調製することが可能である。また、本発明 のペプチドをコードする DNAに特異的なプライマーを作成し、これを利用した PCRを おこなうことによって調製することも可能である。また、 cDNAは、例えば、癌関連抗原 (好ましくは卵巣癌抗原)カゝら抽出した mRNAを基に cDNAを合成し、これを λ ZAP等 のベクターに挿入して cDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロ ニーハイブリダィゼーシヨンあるいはプラークハイブリダィゼーシヨンを行うことにより、 また、 PCRを行うことにより調製することが可能である。
本発明の DNAは、例えば、癌関連抗原のェピトープの大量発現、または組み換え ペプチドの大量調製などに利用することが可能である。
[0023] 本発明は、該 DNAを含むベクター、および該ベクターが導入された形質転換体 (宿 主細胞）に関する。さらに、該形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその 培養上清力も組換えタンパク質を回収する工程を含む、該ペプチドの製造方法に関 する。
[0024] 本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明の DNAを保持させたり、本発明 のタンパク質を発現させるために有用である。
[0025] ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例え ば、 JM109、 DH5 a、 HB101、 XLlBlue)などで大量に増幅させ大量調製するために、 大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子 (例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフエ 二コール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すれば特に制限はない。 ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript、 pC R-Scriptなどが挙げられる。また、 cDNAのサブクローユング、切り出しを目的とした場 合、上記ベクターの他に、例えば、 pGEM- T、 pDIRECT、 pT7などが挙げられる。
[0026] 本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、 発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的 とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主を J M109、 DH5 a、 HB101、 XLl-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効 率よく発現できるようなプロモーター、例えば、 lacZプロモーター、 araBプロモーター、 または T7プロモーターなどを持って!/、ることが不可欠である。このようなベクターとし ては、上記ベクターの他に pGEX- 5X- 1 (フアルマシア社製）、「QIAexpress system] ( キアゲン社製）、 pEGFP、または pET (この場合、宿主は T7 RNAポリメラーゼを発現し て 、る BL21が好まし 、；)などが挙げられる。
[0027] また、ベクターには、タンパク質分泌のためのシグナル配列が含まれて!/、てもよ!/、。
タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる 場合、 pelBシグナル配列を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例え ば塩化カルシウム法、エレクト口ポレーシヨン法を用いて行うことができる。
[0028] 大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するためのベクターとしては、 哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、 pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、 pEGF-BO S、 pEF、 pCDM8)、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac- to- BAC baculovairu s expression system] (ギブコ BRL社製）、 pBacPAK8)、植物由来の発現ベクター（例 えば ρΜΗ1、 pMH2)、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdex Lew)、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、 pZIPneo)、酵母由来の発現べクタ 一（例えば、 「Pichia Expression KitJ (インビトロゲン社製）、 pNVll、 SP-Q01)、枯草 菌由来の発現ベクター（例えば、 pPL608、 pKTH50)が挙げられる。
[0029] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には 、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター、 MML V-LTRプロモーター、 EF1 αプロモーター、 CMVプロモーターなどを持っていること が不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子を有すればさらに好ま しい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK- RSV、 pBK-CMV, pOPRSV、 pOP13などが挙げられる。
[0030] さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を 目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CHO細胞にそれを相補する DHFR遺 伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート (MTX)により 増幅させる方法が挙げられ、 また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、 S V40T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起点 を持つベクター (pcDなど)で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、 また、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV)等の由来の ものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現べ クタ一は選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH)遺伝子、チミジ ンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラー ゼ (Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる。
[0031] 一方、動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、本発明の DNAを 適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リボソーム法、カチォニックリ ポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。
[0032] 本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなぐ例えば、大腸菌 や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、 本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。タン パク質製造のための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vitroの産生 系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる
[0033] 真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用い ることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、 CHO、 COS, 3T3、ミエロー マ、 BHK (baby hamster kidney)、 HeLa、 Vero、両生類細胞、例えばアフリカッメガエ ル卵母細胞、あるいは昆虫細胞、例えば、 S19、 Sf21、 Tn5が知られている。 CHO細胞 としては、特に、 DHFR遺伝子を欠損した CHO細胞である dhfr- CHOや CHO K-1を好 適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特 に CHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム 法、 DEAEデキストラン法、カチォニックリボソーム DOTAP (ベーリンガーマンハイム社 製）を用いた方法、エレクト口ポーレーシヨン法、リポフエクシヨンなどの方法で行うこと が可能である。
[0034] 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ 'タパカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞 力 Sタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞とし ては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えば、サッカロミセス'セレ ピンェ (Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌、 [列 ば、フスぺノレ3 rノレス (Aspergillusノ 属、例えば、ァスペルギルス '二ガー（Aspergillus niger)が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大 腸菌（E. coli)、例えば、 JM109, DH5 a、 HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知 られている。
[0035] これらの細胞を目的とする DNAにより形質転換し、形質転換された細胞を in vitroで 培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができ る。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、 DMEM、 MEM, RPMI1640, IMDMを 使用することができる。その際、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもで きるし、無血清培養してもよい。培養時の pHは、約 6〜8であるのが好ましい。培養は 、通常、約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌 を加える。
[0036] 一方、 in vivoでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生 系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とする DNA を導入し、動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における 「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
[0037] 動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物として は、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシを用いることができる。また、哺乳類動物を用いる 場合、トランスジエニック動物を用いることができる。
例えば、 目的とする DNAを、ャギ j8カゼインのような乳汁中に固有に産生されるタン パク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子 を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ移植する。胚を受容した ャギカ 生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁から、 目的のタ ンパク質を得ることができる。トランスジエニックャギカゝら産生されるタンパク質を含む 乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよ!ヽ
[0038] また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、 目的 のタンパク質をコードする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることに より、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる。
[0039] さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場 合、 目的とするタンパク質をコードする DNAを植物発現用ベクター、例えば pMON 53 0に挿入し、このベクターをァグロバタテリゥム 'ッメファシエンス（Agrobacterium tumef aciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ. タパカム（Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの葉より所望のタンパク質を得る ことができる。
[0040] これにより得られた本発明のペプチドは、宿主細胞内または細胞外 (培地など)から 単離し、実質的に純粋で均一なペプチドとして精製することができる。ペプチドの分 離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すれ ばよぐ何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、 限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタ ンパク質を分離、精製することができる。
[0041] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィユティークロマトグラフィー、イオン交換クロ マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着ク 口マトグラフィ一等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィ 一、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発 明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。
[0042] なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させるこ とにより、任意に修飾を加えたり、部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク 質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、リシルエンドべプチダーゼ 、プロテインキナーゼ、ダルコシダーゼなどが用いられる。
本発明は、該ペプチドに結合する抗体に関する。
また、本発明は、本発明のタンパク質と結合する抗体を提供する。本発明の抗体と しては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体変異体、これらの断片等が例 示できる。
[0043] これらの抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクロー ナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。カイコ、ショウジョ ゥバエ、蚊、ハスモンョトウ、またはォォタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素 、あるいは GSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコ ンビナントタンパク質、またはその部分ペプチドをゥサギ等の小動物に免疫し血清を 得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換 クロマトグラフィー、カイコ、ショウジヨウバエ、蚊、ハスモンョトウ、またはォォタバコガ の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素や合成ペプチドをカップリングしたァフィ-ティ 一力ラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例 えば、カイコ、ショウジヨウバエ、蚊、ハスモンョトウ、またはォォタバコガの幼若ホルモ ン酸メチル基転移酵素またはその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、 同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエ口 一マ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融 合細胞（ノヽイブリドーマ）の中から、カイコ、ショウジヨウバエ、蚊、ハスモンョトウ、また はォォタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素に結合する抗体を産生するクロ ーンを選択する。次いで、得られたハイプリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウス より腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、 プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、カイコ、ショウジヨウバエ、蚊 、 ノ、スモンョトウ、またはォォタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素や合成べ プチドをカップリングしたァフィユティーカラム等により精製することで、調製することが 可能である。
[0044] また、本発明にお 、て、「抗体変異体」とは、 1またそれ以上のアミノ酸残基が改変 された、抗体のアミノ酸配列ノ リアントを指す。どのように改変されたアミノ酸バリアント であれ、元となった抗体と同じ結合特異性を有すれば、本発明における「抗体変異 体」に含まれる。このような変異体は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変ドメインのァミノ 酸配列と少なくとも 75%、より好ましくは少なくとも 80%、さらに好ましくは少なくとも 85 %、さらにより好ましくは少なくとも 90%、そして、最も好ましくは少なくとも 95%のアミ ノ酸配列相同性または類似性を有するアミノ酸配列と 100%よりも少な 、配列相同性 、または類似性を有する。
[0045] 本発明の抗体を対象に投与することによって、対象における癌細胞、癌細胞関連 抗原、または子宮の内側以外の部位に発生した子宮内膜細胞を検出することが可能 である。検出は、該抗体に標識物質を結合させ、当業者に公知の方法で行うことが 可能である。
[0046] 標識物質は、免疫学的測定法に使用することができるものであれば特に限定され ない。具体的には、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質、金属キレート等を使用 することができる。好ましい標識酵素としては、例えばペルォキシダーゼ、アルカリフ ォスファターゼ、 β -D-ガラクトシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレ ァーゼ、デルタ - 5 -ステロイドイソメラーゼ、 α -グリセロールホスフェートデヒドロゲ ナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋わさびパーォキシダーゼ、ァスパラ ギナーゼ、グルコースォキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ゥレアーゼ、カタラーゼ、グル コースー6—ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ダルコアミラーゼ、およびアセチルコリン エステラーゼ等が挙げられる。好ましい蛍光物質としては、例えばフルォレセインイソ チアネート、フィコビリプロテイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシァニン、ァロフィ コシァニン、およびオルトフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましい発光物質として はイソルミノール、ルシゲニン、ルミノール、芳香族アタリジ-ゥムエステル、イミダゾー ル、アタリジニゥム塩及びその修飾エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびェ クオリン等が挙げられる。そして好ましい放射性物質としては、 125I、 mI、 1311、 14 C、 3H、
32p、あるいは35 S等が挙げられる。
[0047] 前記標識物質を抗体に結合する手法は公知である。具体的には、直接標識と間接 標識が利用できる。直接標識としては、架橋剤によって抗体、あるいは抗体断片と標 識とをィ匕学的に共有結合する方法が一般的である。架橋剤としては、 N, Ν'-オルトフ ェ-レンジマレイミド、 4- (Ν-マレイミドメチル）シクロへキサン酸 ·Ν-スクシンイミドエス テル、 6-マレイミドへキサン酸 ·Ν-スクシンイミドエステル、 4,4'-ジチォピリジン、その 他公知の架橋剤を利用することができる。これらの架橋剤と酵素および抗体との反応 は、それぞれの架橋剤の性質に応じて既知の方法に従って行えばよい。この他、抗 体にピオチン、ジニトロフエ-ル、ピリドキサール又はフルォレサミンのような低分子ハ プテンを結合させておき、これを認識する結合成分によって間接的に標識する方法 を採用することもできる。ピオチンに対してはアビジンやストレプトアビジンが認識リガ ンドとして利用される。一方、ジニトロフエ-ル、ピリドキサール又はフルォレサミンに ついては、これらのハプテンを認識する抗体が標識される。抗体を標識する場合、西 洋わさびペルォキシダーゼを標識ィ匕酵素として用いることができる。本酵素は多くの 基質と反応することができ、過ヨウ素酸法によって容易に抗体に結合させることができ るので有利である。また、抗体としては場合によっては、そのフラグメント、例えば Fab' 、 Fab、 F (ab')を用いる。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体にかかわら
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ず同様の処理により酵素標識体を得ることができる。上記架橋剤を用いて得られる酵 素標識体はァフィユティークロマトグラフィー等の公知の方法にて精製すれば更に感 度の高い免疫測定系が可能となる。精製した酵素標識化抗体は、防腐剤としてチメ 口サール (Thimerosal)等を、そして安定剤としてグリセリン等をカ卩えて保存する。標識 抗体は、凍結乾燥して冷暗所に保存することにより、より長期にわたって保存すること ができる。
[0048] 本発明の抗体は、上記標識物質と併用することにより、癌腫瘍マーカー、免疫染色 用抗体、または子宮内膜細胞マーカーとしても利用することが可能である。
本発明において、「対象とは」、本発明の薬剤 (マーカー等を含む)を投与する生物 体、該生物体の体内の一部分、または生物体より摘出または排出されたその一部分 をいう。生物体は、特に限定されるものではないが、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、 野生動物）を含む。
[0049] また、「生物体の体内の一部分」については特に限定されないが、好ましくは癌細 胞または子宮内膜細胞を挙げることが出来る。 本発明において癌細胞とは、より具体的には、白血病、大腸癌、肺癌、乳癌、頭頸 部扁平上皮癌、食道癌、胃癌、甲状腺癌、骨および軟部肉腫、卵巣癌、子宮癌、腎 癌、膝癌、またはダリオブラストーマにおける癌細胞を例示することができる。本発明 における癌細胞は特に限定されないが、より好ましくは、卵巣癌、脾臓癌、または肺 癌おける癌細胞を挙げることが出来る。また、本発明において子宮内膜細胞とは、よ り具体的には子宫内膜症において子宮の内側以外の部位に発生した子宮内膜細胞 を挙げることが出来る。子宮の内側以外の部位とは、特に限定されるものではないが 、好ましくは子宮筋層を挙げることができる。子宮内膜症において、内膜の生育が子 宫筋層に限局した症状を、子宮腺筋症と呼ぶ。
[0050] 本発明において、「投与する」とは、経口的、あるいは非経口的に投与することが含 まれる。
経口的な投与としては、経口剤という形での投与を挙げることができ、経口剤として は、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択 することができる。
[0051] 非経口的な投与としては、注射剤と!/、う形での投与を挙げることができ、注射剤とし ては、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。ま た、投与すべきオリゴヌクレオチドを含む遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体 に導入することにより、本発明の方法の効果を達成することができる。また、本発明の 薬剤を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局 所注入、カテーテルの使用、または本発明のペプチドをコードする DNAの標的化遺 伝子送達により投与することも可能である。
[0052] 本発明の薬剤としては、試薬や DNAワクチン等を挙げることが出来る。
本発明の薬剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体を添加してもよい 。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の活性を有さない材料であって、上記の薬 剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。
[0053] 安定剤としては、 0.2%程度のゼラチンゃデキストラン、 0.1-1.0%のグルタミン酸ナトリ ゥム、あるいは約 5%の乳糖や約 2%のソルビトールなどを使用することが出来る力 これ らに限定されるものではない。保存剤としては、 0.01%程度のチメロサールや 0.1%程度 のベータプロピオノラタトンなどを使用することが出来る力 これらに限定されるもので はない。
[0054] 注射剤を調製する場合、必要により、 pH調製剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を 添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に 収納後、凍結乾燥等によって、固形製剤として、用時調製の製剤としてもよい。また、 一投与量を容器に収納してもよぐまた、投与量を同一の容器に収納してもよい。
[0055] 本発明の薬剤の接種法としては、公知の種々の方法が使用できる。接種法として は皮下注射、筋肉注射、経皮接種等が好ましいが、これらに限定されるものではない 投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間 、あるいは該薬剤に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人 あたり、一回につき O.lmgから 500mgの範囲で、好ましくは 0.5mgから 20mgの範囲で投 与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よ りも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もあ る。
[0056] どの接種方法が適切かは薬剤の種類、接種する対象の種類等を考慮して決定され る。容器はバイアル、プレフィルドシリンジ製品 (pre-filled syringe)が可能である。必要 に応じて、溶液状でも凍結乾燥などによる粉末製品でもよい。一回接種用でも複数 回接種用でも良い。投与量は、接種する対象の種類や体重や年齢、投与方法など により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
[0057] また、生物体より摘出または排出された生物体の一部分に投与を行う際には、本発 明の薬剤を生物体の一部に「接触」させてもょ 、。
また、本発明において「接触」は、生物体の状態に応じて行う。例えば、生物体の一 部への本薬剤の散布、あるいは、生物体の一部の破砕物への本薬剤の添加等を挙 げることができるが、これらの方法に制限されない。生物体の一部が培養細胞の場合 には、該細胞の培養液への本薬剤の添加あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドを含 む DNAを、生物体の一部を構成する細胞へ導入することにより、上記「接触」を行うこ とも可能である。 [0058] 本発明の方法を実践する際に、本発明の薬剤は、少なくとも 1つの既知の化学療法 剤と共に薬学的組成物の一部として投与されてもよい。または、本発明の薬剤は、少 なくとも 1つの既知の抗がん剤と別に投与されてもよい。一つの態様において、本発 明の薬剤および既知の化学療法剤は、実質的に同時に投与されてもよい。
以下にお 1、て使用される「対象」および「投与」と 、う記載は、上記の意味を示すも のとする。
[0059] 本発明は、該ペプチドを対象に投与する工程を含む、対象における T細胞を活性 化させる方法、および該方法によって、活性ィ匕された T細胞に関する。
本発明において、活性ィ匕される T細胞は、特に限定されない。好ましい例として、免 疫応答を促進するヘルパー T細胞、逆に免疫反応を抑制するサブレッサー T細胞、 病原体に感染した細胞や癌細胞を直接殺すキラー T細胞を挙げることが出来る。 より好ましい例として、 IL-4を産生するヒト CD4陽性 T細胞、 IFN yを産生するヒト CD 4陽性 T細胞、 TNF aを産生するヒト CD4陽性 T細胞、または TNF aを産生するヒト CD 8陽性 T細胞を挙げることが出来る。
[0060] 本発明にお 、て、「T細胞が活性ィ匕される」とは、上記の各種 Τ細胞の機能を活性ィ匕 させること、および該 Τ細胞の産生が増強されること、すなわち、細胞性免疫応答が 増強されることと同等の意味を示す。 Τ細胞の活性ィ匕測定は、 CD4および CD8細胞上 に発現した複数の活性ィ匕マーカーの強度を測定することによって行うことが出来る。 活性化マーカーとしては、ヘルパー Τ細胞は CD4並びに IL-4または IFN yあるいは Τ NF a、キラー T細胞とサプレッサー T細胞は CD8並びに TNF aを挙げることが出来る 力 これらに限定されるものではない。
[0061] T細胞の活性ィ匕測定は、当業者に公知の手法で行うことができる。具体的には、実 施例に記載の手法によっても行うことが出来る。
本発明において、 T細胞が活性化される期間は特に限定されないが、 T細胞の活性 化は一時的な増強であってもよいし、一定期間の増強であってもよい。
一時的な増強とは、本発明のペプチドの投与に起因する、 T細胞が活性化された 状態が一定期間継続し、その後、 T細胞の活性が再度定常状態に戻ることをいう。 本発明は、該ペプチドまたは該抗体を対象に投与する工程を含む、対象における 癌疾患を予防または治療する方法に関する。
[0062] 本発明は、対象における癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する方法で あって、以下の工程 (a)〜(c)を含む方法に関する。
(a)該ペプチドを T細胞に添加する工程、
(b) (a)の T細胞を培養する工程、
(c) (b)で得られた T細胞を対象に投与する工程。
[0063] また、上記方法においては、 （a)の前に、対象に抗癌剤による化学療法を行う工程 を含んでいてもよい。抗癌剤による化学療法は、特に制限されるものではないが、より 好ましくは自己末梢血幹細胞移植併用化学療法を挙げることができる。
[0064] 本発明において、「癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する」とは、より具 体的には細胞増殖抑制効果、または細胞死誘導効果が発現することを意味する。ま た、癌細胞における癌関連遺伝子の変異または発現変化を、正常な状態に改善す ることも、上記の意味に含まれるものとする。さらに、子宫内膜症において、子宫内側 以外の部位で発生した子宮内膜細胞の発現を抑えることも、上記の意味に含まれる ものとする。上記の方法において、癌疾患または子宮内膜症が改善される期間は特 に限定されないが、一時的な改善であってもよいし、一定期間の改善であってもよい 本発明は、該ペプチドを有効成分とする癌疾患または子宮内膜症を、予防または 治療するための薬剤に関する。また、該抗体を有効成分とする癌疾患または子宮内 膜症を、予防または治療する薬剤に関する。さらに、該 T細胞を有効成分とする、癌 疾患または子宮内膜症を、予防または治療する薬剤に関する。
[0065] 本発明の薬剤 (抗体、 T細胞、およびマーカー等を含む）には、保存剤や安定剤等 の製剤上許容しうる担体を添加してもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記 の活性を有さない材料であって、上記の薬剤とともに投与可能な製剤上許容される 材料を意味する。
安定剤としては、 0.2%程度のゲラチンゃデキストラン、 0.1-1.0%のグルタミン酸ナトリ ゥム、あるいは約 5%の乳糖や約 2%のソルビトールなどを使用することが出来る力 これ らに限定されるものではない。保存剤としては、 0.01%程度のチメロサールや 0.1%程度 のベータプロピオノラタトンなどを使用することが出来る力 これらに限定されるもので はない。
[0066] 注射剤を調製する場合、必要により、 pH調製剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を 添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に 収納後、凍結乾燥等によって、固形製剤として、用時調製の製剤としてもよい。また 、一投与量を容器に収納してもよぐまた、投与量を同一の容器に収納してもよい。 どの接種方法が適切かは薬剤の種類、接種する対象の種類等を考慮して決定され る。容器はバイアル、プレフィルドシリンジ製品 (pre-filled syringe)が可能である。必 要に応じて、溶液状でも凍結乾燥などによる粉末製品でもよい。一回接種用でも複 数回接種用でも良い。投与量は、接種する対象の種類や体重や年齢、投与方法な どにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能であ る。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0067] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
各実施例は、以下の対象、実験条件に基づいて行われた。
[0068] <対象 >
埼玉医科大学倫理委員会（日本)で承認を受けた「卵巣癌に対する細胞治療に関 する研究」の説明を行い、同意の得られた卵巣癌患者 25名と健常人 8名から、本研究 に使用する末梢静脈血液 (T細胞、 B細胞、抗原提示細胞等を単核球分画として含 む)サンプル (以下血液サンプル)の提供を受け、無名化して解析した（1人 1血液サ ンプル)。これとは別に抗癌剤投与中の卵巣癌患者 6例力 は卵巣癌に対する化学 療法 (Ikeba K, Okubo M, Takeaa b, et al: Five-year results of cyclic semi-hign dos e chemotherapy supported by autologous peripheral blood stem cell transplantation i n patients with advanced ovarian cancer. Int J Clin Oncol. 9: 113-119, 2004.)後の 血液サンプルの提供も受けた。血液サンプルは、医師が参加者の静脈力ゝら約 10mlの 血液を抗凝固剤 (へパリンナトリウム)入り試験管内へ安全に採血した。
[0069] <細胞培養 >
細胞培養に関する操作は全て無菌的に行った。まず、血液サンプルから比重遠心 法によりヒト末梢血単核球分画 (T細胞、 B細胞、マクロファージなどを含む、以下単核 球サンプルという）を調整した。次にこの単核球を以下の組成カゝらなる完全培地に lx 105個/ mlとなるように浮遊させた。
完全培地： RPMI1640培養液（Gibco Laboratries Inc., Grand Island, NY)に 10% fetal bovine serum (Cell Culture Laboratories, Cleveland, OH)と 0.2 mM L— glutamineと 10 0 U/mL penicillin, 100 μ g/mL streptomycin (Gibco Laboratories Inc.)と 0.2 ng/mL recombinant human IL- 2 (大日本製薬、東京、日本）を混合させたもの。
[0070] これらの単核球サンプルはペプチドの存在下、非存在下で V底 96穴組織培養用プ ラスチックプレート (How Laboratories Inc., Horsham, PA)の中に静置し、 37°C48時間 CO培養装置 (サンョーメディ力、大阪、日本）内で培養した。
2
[0071] く CD4陽性細胞の細胞内サイト力インの検出 >
T細胞膜上の CDマーカーの CD4と CD8および T細胞内のサイト力インの検出を二重 染色により同時に解析するために、蛍光の異なる複数のマウス由来特異的抗ヒトモノ クローナル抗体（以下モノクローナル抗体）を用いた。モノクローナル抗体は蛍光物 質である phycoerythrin (以下 PE)または fluorescein isothiocyanate (以下 FITC)で標識 されている (Miltenyi Biotec, Glandbach, Germany)製品を用いた。検出はフローサイト メトリ-機器 FACScan (Becton Dickinson)を用いて、モノクローナル抗体が結合した細 胞頻度を測定した。フローサイトメトリー機器では陽性細胞の検出は自動的に処理さ れる。その概要は、細胞にレーザーを照射して、目的とする抗体が結合した細胞にの み励起する蛍光を捕らえて、コンピューター上で陽性細胞数を計算して表示させると いうものである。
[0072] 尚、サイト力インは細胞外に分泌された後では、陽性細胞を特定できないので、細 胞内に存在する段階で検出した。このために Cytofix/Cytoperm Kit (Pharmingen, Sa n Diego, CA)製品を用い、製造者の推奨する方法および同製品の推奨する検出用 陽性コントロールを置いて解析した（Prussin C, Metcalfe D. Detection of intracytopla smic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti— cytokine antibodies . J Immunol Meth. 188: 117-128, 1995.)。具体的には Golgi装置における蛋白産生 をとめるためにブレフエノレディン A (Pharmingen, San Diego,CA)を 0.7 1 / lml I lwe 11添加し、ペプチド刺激をカ卩えた単核球サンプルを 2時間 37°Cで処理した。次に、培 養プレートを氷上に置き、 4°C生理食塩水を加えて反応を止めた。 4°Cの生理食塩水 で洗うようにして、単核球サンプルを 15mlチューブに移し、 1600rpmで 10分間遠心し て上清を除いた。
[0073] まず細胞表面 CD4の染色を行うために、 FITC標識マウス抗ヒト CD4と対照としての C D8モノクローナル抗体を 10 μ 1添加し、 4°Cで 30分間反応させた。その後、 4°Cの 0.5% 牛血清アルブミン/生理食塩水で細胞をほぐし、 4°C0.5%牛血清アルブミン/生理食 塩水をカ卩ぇ 1600rpm、 10分間、 4°Cの条件で遠心し、上清を除いた。
[0074] 次に単核球サンプルの固定と細胞膜透過作業を行った。 Cytofix/Cytoperm (Phar mingen)液 250 /z lに細胞を浮遊させ、 4°Cで 20分間反応させた。この単核球サンプル に前述の蛍光標識抗 IFN yモノクローナル抗体あるいは抗 IL-4モノクローナル抗体 を 10 1添加し、 4°Cで 30分間反応させた。その後、 4°Cの 0.5%牛血清アルブミン/生 理食塩水液を入れて細胞をほぐし、さらに、 4°C0.5%BSA/PBSを加え 1600rpm、 10分 間、 4°Cの条件で遠心し、上清を除き洗浄した後、 PBSに再浮遊させて、フローサイト メトリー機器 FACScan (Becton Dickinson)にて解析した。
[0075] 結果は、二重染色陽性細胞数 ÷測定単核球総数 X 100 =陽性細胞頻度 (％)で記 録した。また、個々の単核球サンプルの陽性細胞頻度が陰性コントロールに相当す るアナログペプチド刺激単核球サンプル群 (OVCA10刺激)と比較して、陰性コント口 ール群の平均値加 2倍標準偏差 (mean+2SD)以上の場合、ペプチド抗原特異的 T 細胞の反応が陽性と判定した。尚、各ペプチド刺激群間の比較は、 t検定法により有 意差を検定した。
[0076] 〔実施例 1〕抗癌剤化学療法後の患者末梢血中に細胞治療に必要な T細胞分画が存 在するか否かの解析
抗癌剤は免疫抑制あるいは骨髄抑制の副作用が存在する。卵巣癌における化学 療法では、患者末梢血の細胞分画に変化、特に T細胞数減少の可能性がある。そこ で、抗癌剤による化学療法後の末梢血白血球数が正常値に回復した日（平均 14日 後）の 6例の患者の血液サンプルに含まれる細胞分画を解析した。血液細胞のクラス ター分類 (以下 CD)用の CD3 (汎 T細胞）、 CD4 (ヘルパー T細胞）、 CD8 (細胞障害性 T細胞）、 CD25 (活性化 T細胞）、 CD45RA (ナイーブ T細胞）、 CD4RO (メモリー T細胞 )、 CD14 (単球）、 CD19 (B細胞）のモノクローナル抗体 (藤沢薬品工業、東京、日本） で血液サンプルを蛍光免疫染色して、フローサイトメトリー機器 FACScan (Becton Die kinson, San Jose, CA)により陽性細胞数を解析した。
[0077] 上記の実験の結果、 T細胞のマーカーである CD3陽性細胞は 6例の平均値が 58.5 % (標準値範囲: 48.9-89.0%,中原一彦. Τ·Β細胞サブセット，血液表面マーカー. 臨床検査ガイド 2003-2004. ρρ 766-780.和田攻他編集，文光堂，東京.2003.)、同 様に Β細胞である CD19陽性細胞は 13.1% (3.0-26.1%)、単球である CD14陽性細胞 は 5.9% (2%以下）、活性化 Τ細胞である CD25陽性細胞は 31.0%、ヘルパー Τ細胞で ナイーブタイプの CD4陽性 45RA陽性細胞は 19.5%、メモリータイプの CD4陽性 45RO 陽性細胞は 10.5%、 CD4陽性の合計は 30.0% (24.0-61.0%)、細胞障害性 Τ細胞でナ ィーブタイプの CD8陽性 45RA陽性細胞は 4.0%、メモリータイプの CD8陽性 45RO陽性 細胞は 2.9%、また、 CD8陽性の合計は 6.9% (17.0-44.0%)であった。
[0078] これらの結果は化学療法後 14日後には、患者末梢血の Τ細胞数、 Β細胞数は正常 範囲にあり、単球系は増加していることを示していた。尚、 Τ細胞サブセットでは CD8 陽性 Τ細胞数は少なぐ CD4陽性 Τ細胞が多力つた。また、メモリー Τ細胞である CD4 陽性 45RO陽性細胞が単核球サンプルの 10.5%を占めるという結果は、化学療法後に も細胞治療に用いる成熟 Τ細胞が末梢血中に十分存在して 、ることを示して 、た。
[0079] 〔実施例 2〕アナログペプチドの設計
CA125は、 1981年に Bast RC Jr.らが卵巣癌細胞株抗原をマウスに免疫して作製し たモノクローナル抗体が認識する抗原名として報告されたものである（Bast RC, Fenn ey M, Lazarus H. Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma . J Clin Invest. 68: 1331-1337, 1981.)。 CA125は卵巣癌全体での陽性率が約 70%、 卵巣癌で最も頻度の高い細胞型の漿液性腺癌での陽性率が約 90%と高ぐ癌の進行 に伴って絶対量が増加するという特徴を持ち、卵巣癌細胞にもっとも特徴的な腫瘍 マーカーとして利用されていた。しかし、分子構造が明かとなったのはごく最近である
。 CA125全長のアミノ酸配列を配列番号: 45に示す。 CA125は蛋白に糖鎖が付加さ れたもので、ムチンと呼ばれる高分子のひとつである。ムチンにちなみコア蛋白部分 は MUCと呼ばれており、生体内に存在する複数の MUCのひとつとして CA125は MU C16と命名された。この MUC16のコアタンパク質のアミノ酸配列は 2001年に Yin B.ら 力報告して ヽる (" in BW, Lloyd KO. Molecular cloning of the し A125 ovarian cancer antigen identification as a new mucin, MUC16. J Biol Chem. 276: 27371—27375, 20 01.)。しかし、 CA125は今まで癌隔絶抗原 (癌細胞排除のために免疫学的に認識さ れる抗原）として利用できるかどうかについての検討は全くなされていな力つた。その ため、本発明では卵巣癌関連抗原である CA125を癌隔絶抗原として利用した。
[0080] T細胞は基本的には MHC上に提示されたアミノ酸配列のみを認識するため、 CA1 25の糖蛋白を含まないコア蛋白部分の MUC16のアミノ酸配列のみを解析対象とした 。 MUC16の中には 78アミノ酸を 12または 11回繰り返す配列が 2種類含まれる（Yin BW , Lloyd KO. Molecular cloning of theし A125 ovarian cancer antigen identincation as a new mucin, MUC16. J Biol Chem. 276: 27371-27375, 2001.)。本発明者らは、こ れらの 78アミノ酸残基数の繰り返し配列をもつ部位を合成ペプチドとして準備する際 に、もとの配列と全く同じではなぐアミノ酸の疎水性、親水性、電荷が共通する配列 に置換して類似ペプチド（以下アナログペプチド）として準備した（図 1〜3)。
[0081] 一般に CD4陽性 T細胞ェピトープのアミノ酸残基数は 20程度以下の長さであること から、まず、繰り返し配列 2ケ所と残りの全配列を 20アミノ酸残基数に区切ってアナ口 グペプチド総数 48本で予備実験を行った。これらの 48本のアナログペプチドは ISO90 01認証事業所 (シグマジエノシスジャパン、石狩巿、 日本)でカスタム合成された。次 に、予備実験で陽性反応が得られた 1ケ所の繰り返し配列部位をカルボキシル基末 端側が互いに 10アミノ酸残基数ずつ重なった 20アミノ酸残基数のアナログペプチドシ リーズとして計 7本準備して解析した（図 4)。尚、単核球刺激時のアナログペプチドの 濃度は 0, 5, 10, 15, 50 μ Μとした。
[0082] 〔実施例 3〕卵巣癌抗原特異的 CD4陽性 Τ細胞の検出
抗原特異的 Τ細胞が活性ィ匕すると IFN γあるいは IL-4を産生することがわ力つて ヽ る（藤原大美. T細胞の免疫応答， T細胞系の免系学 pp 155-174.藤原大美編著， 中外医学社，東京.1993.)。もし、 T細胞を含む単核球分画に卵巣癌抗原 MUC16ァ ナログペプチドをカ卩えて培養刺激した際に、 IL-4あるいは IFN yを発現する T細胞が 検出された場合、 MUC16抗原特異的な T細胞が存在することの証明となり、かつその 卵巣癌抗原 MUC16アナログペプチドは T細胞ェピトープを内包していることになる。 しかし、どの卵巣癌抗原 MUC16アナログペプチドでも活性ィ匕できな力つた場合には、 MUC16抗原特異的な T細胞は存在しないことになる。
[0083] 本発明者らは、 6例の予備実験により 48アナログペプチドのうち OVCA8から OVCA1 4の範囲に CD4陽性でかつ IL-4陽性細胞が検出されたため、次に対象 33例の単核 球サンプルにおいて OVCA9から OVCA13 (配列番号： 14,13,11,12,15)のアナログぺ プチド 7本を個別に用いて、 CD4と IL-4あるいは CD4と IFN yの検出を行った。その結 果（表 1上段）、 OVCA11刺激で 32単核球サンプル中 27単核球サンプル (84.4%)が IL- 4陽性、 32単核球サンプル中 26単核球サンプル (78.8%)が IFN y陽性となり、 OVCA11 ： GHTAPGPLLVPFTLNFTITN (配列番号： 11)により抗原特異的に T細胞が活性化さ れた事が示された。また、 OVCA12: PFTLNFTITNLRYEENMRHP (配列番号： 12)に より、 IL-4陽性 T細胞力 S18/33の単核球サンプルで、 Ν γ陽性 T細胞力 S13/33の単核 球サンプルで活性ィ匕された。尚、この陽性反応はアナログペプチド濃度が 5 Μから 5 0 μ Μの間で濃度依存性を示した。
[0084] IL-4を検出したフローサイトメトリー解析の結果の典型例を図 6と図 7に示す。この例 ではアナログペプチドをカ卩えないコントロールと IL-2のみ加えた単核球サンプルでは 陽性細胞頻度はそれぞれ 0.04%と 0.07%であり、ほとんど認められない。また、アナログ ペプチドを加えても OVCA9 (配列番号： 14)と OVCA10 (配列番号： 13)の刺激に反応 する陽性細胞頻度は 0.05%とほとんど認められない。しかし、 OVCA11 (配列番号： 11) のアナログペプチド刺激では単核球サンプルの 7.06%に陽性細胞が認められた。また 、 OVCA12 (配列番号： 12)にも若干の陽性細胞 (0.57%)が存在した。
[0085] 解析した全例の単核球サンプル中の CD4陽性 IL-4陽性の頻度（図 8)は、アナログ ペプチドをカ卩えず IL-2のみで培養したコントロール単核球サンプル（以下 Ctr-MNC) 、アナログペプチド OVCA10 (配列番号： 13)を加えた単核球サンプル (以下 OVCA10 - MNC)、アナログペプチド OVCA11 (配列番号： 11)を加えた単核球サンプル (以下 O VCA11-MNC)およびアナログペプチド OVCA12 (配列番号： 12)を加えた単核球サン プル (以下 OVCA12-MNC)の平均値士標準偏差（サンプル数）は各々順に 0.287±0. 405%(32)、 0.252±0.448%(33)、 4.314±2.805%(32)および 5.263±9.059%(33)であ つた。 Ctr-MNCならびに OVCA10-MNCに対して OVCA11-MNCあるいは OVCA12 - MNCにおける CD4陽性 IL-4陽性頻度を比較すると、 t検定において Ctr-MNC vs. O VCA11-MNC: p< 0.001、 Ctr-MNC vs. OVCA12— MNC: p=0.0028、 OVCA10— MNC vs. OVCA11-MNC: p< 0.001、 OVCA10— MNC vs. OVCA12— MNC: p=0.0031と統 計学的有意差を示した。
[0086] 次に IFN yを検出したフローサイトメトリー解析の典型例の結果を図 9と 10に示す。こ の例ではアナログペプチドをカ卩えないコントロールと IL-2のみ加えたサンプルでは、 陽性細胞はそれぞれ 0.02%と 0.08%であり、ほとんど認められない。また、アナログぺプ チドをカ卩えても OVCA9 (配列番号： 14)と OVCA10の刺激に反応する T細胞はそれぞ れ 0.02%と 0.11%と低い。し力し、 OVCA11 (配列番号： 11)のアナログペプチド刺激で は 3.12%の陽性細胞が認められた。また、 OVCA12 (配列番号： 12)にもわずかながら 陽性細胞 (0.28%)が存在した。
[0087] 解析した全例の単核球サンプル中の CD4陽性 IFN y陽性の頻度（図 11)は、 Ctr- MNC、 OVCA10- MNC、 OVCA11- MNCおよび OVCA12- MNCの順に平均値士標準 偏差（サンプル数）は、それぞれ 0.243±0.258%(32)、 0.328±0.525%(33)、 3.037±2 .234%(33)および 5.071士 10.315%(33)であった。各単核球サンプル群の CD4陽性 IF Ν γ陽性頻度を比較すると、 t検定の結果、 Ctr-MNC vs. OVCA11- MNC: p< 0.001 、 Ctr-MNC vs. OVCA12-MNC: p=0.0116、 OVCA10— MNC vs. OVCA11— MNC: p < 0.001、 OVCA10-MNC vs. OVCA12- MNC: p=0.0128と統計学的有意差を示した
[0088] OVCA10- MNC群の平均 + 2SD (IL- 4では 1.148%、 IFN yでは 1.378%)以上をアナ口 グペプチド抗原特異的 T細胞の反応が陽性と判定した場合の陽性単核球サンプル 頻度を表 1上段に示した。 OVCA11-MNCは IL-4陽性が 84.4%、 IFN y陽性が 78.8% と多くの単核球サンプルに認識されており、その頻度は OVCA12-MNCよりも高かつ た。尚、患者群と健常人群で IL-4陽性細胞数は各々の平均力 12%と 4.89%、また、 IF Ν γ陽性細胞数は各々の平均が 2.85%と 3.48%で、有意差はな力つたが患者群が健常 人群より少ない傾向にあった。以上の結果はヒト末梢血中には、 MUC16のアナログぺ プチド OVCA11と OVCA12のアミノ酸配列、つまり GHTAPGPLLVPFTLNFTITNLRYE ENMRHP (配列番号: 45)を抗原特異的に認識し、 IL-4または IFN γを産生する Τ細 胞が存在することを証明している。
[表 1]
ID Sequence CD4+ CD4+ IFNy+ 配列番
0VCA9 STPGTSTVHLGTSGTPASLP 0/29 0% 2/29 6.9% 14
OVCA10 GTSGTPASLPGHTAPGPLLV 1/33 3.0% 1/33 3.0% 13
OVCA11 GHTAPGPLLVPFTLNFTITN 27/32 84.4% 26/33 78.8% 1 1
OVCA12 PFTLNFTITNLRYEENMRHP 18/33 54.5% 13/33 39.4% 12
OVCA13 LRYEENMRHPGSRKFNTTER 0/6 0% 0/6 0% 15
ID Sequence CD4+ I + CD4+ IFNv+
OVCAIOI GHTAPVPLLI 0/14 0% 2/14 14.3% 4
OVCA102 GHTAPGPLLV 0/14 0% 1/14 7.1 % 5
OVCA103 RPIVPGPLLV 0/14 0% 1/14 7.1 % 6
OVCA104 ETTATGPLLV 0/14 0% 1/14 7.1 % 7
OVCA105 GPTTASPLLV 1/14 0% 1/14 7.1 % 8
OVCA106 GPSAASPLLV 2/14 14.3% 2/14 14.3% 9
OVCA107 PFTLNFTITN 5/9 55.6% 3/8 37.5% 2
OVCA108 LFTLNFTITN 5/9 55.6% 2/8 25.0% 3
OVCA115 LRYEENMRHP 1/9 11.1% 0/8 0% 10
Positive sample > mean of control + 2 X SD.
Number of positive samples I tested samples X 100 (%)
[0090] 〔実施例 4〕活性化された T細胞の腫瘍細胞傷害活性の測定
抗原特異的に活性化された Τ細胞が腫瘍細胞などの標的とする細胞を傷害する際 には、 Τ細胞は TNF a (tumor necrosis factor;腫瘍壊死因子）を産生することが知られ ている。そこで、〔実施例 3〕から求められた OVCA11で刺激した T細胞力 実際に TN F aを産生しているかどうかを〔実施例 3〕と同様の方法で CD4と TNF aおよぼ CD8と T NF o;の組み合わせで、フローサイトメトリーにより解析した。その結果の典型例を図 1 2に示す。 OVCA刺激前の CD4陽性で TNF o;陽性の T細胞頻度は 0.44%であったが 、 OVCA11刺激後では 5.76%に増加した。また、細胞傷害活性がより強いことが知ら れている CD8陽性 TNF o;陽性 T細胞は同じく 0.28%力 3.98%に増加した。この結果 から、 OVCA11アナログペプチドは CD4陽性細胞を抗原特異的に活性ィ匕し、 IL-4と I FN γを産生するだけではなぐ CD4陽性と CD8陽性細胞〖こさら〖こ TNF aを産生させ る事が確認できた。
[0091] 〔実施例 5〕 CD4陽性 T細胞ェピトープの解析
〔実施例 3〕の結果力 T細胞ェピトープを含む部位は (本来の配列ではな 、）アナ ログペプチド OVCA11： GHTAPGPLLVPFTLNFTITN (配列番号 : 11)と OVCA12： PF TLNFTITNLRYEENMRHP (配列番号： 12)の範囲内に限定された。
[0092] 次に（アナログではな 、原形の配列にもとづく） T細胞ェピトープを決定するために 、 OVCA11と OVCA12に共通した 30アミノ酸残配列： GHTAPGPLLVPFTLNFTITNLR YEENMRHP (配列番号： 45)の由来となった MUC16の 11回繰り返し配列におけるアミ ノ酸原形配列にもどし、さらにこれらを 10アミノ酸残基数ごとに区切り OVCA101 (配列 番号: 4)、 102 (配列番号: 5)、 103 (配列番号: 6)、 104 (配列番号: 7)、 105 (配列番号 : 8)、 106 (配列番号： 9)、 107 (配列番号： 2)、 108 (配列番号： 3)、 109、 110、 111、 112 、 113、 114、 115 (配列番号： 10) (図 5)を作成し、前述と同様の方法で IL-4あるいは IF Ν γ陽性 T細胞を検出した。
[0093] 図 13に典型例の CD4と IL-4陽性細胞のフローサイトメトリー解析結果を示した。この 例では OVCA107ペプチド刺激で 6.32%の IL-4陽性細胞が認められた。図 14は個々 の単核球サンプルが示した IL-4陽性細胞頻度をグラフに示したものである。患者単 核球サンプルにおける CD4陽性 IL-4陽性頻度：平均値士標準偏差0 /0 (サンプル数） を示すと、 OVCA101-MNC： 0.181 ±0.231%(14)、 OVCA102— MNC： 0.231 ±0.309%( 14)、 OVCA103-MNC： 0.211 ±0.269%(14)、 OVCA104— MNC： 0.301 ±0.340%(14)、 OVCA105—MNC : 0.243 ±0.358%(14)、 OVCA106—MNC : 0.649 ± 1.337%(14)、 OVC A107-MNC： 8.036± 12.870%(9)、 OVCA108— MNC： 6.471士 13.319%(9)、 OVCA115 -MNC： 0.281 ±0.424%(9)であった。
[0094] 図 15に典型例の CD4と IFN y陽性細胞のフローサイトメトリー解析結果を示した。こ の例では OVCA107刺激で 6.32%の陽性細胞が認められた。図 16は個々の単核球サ ンプルが示した IFN y陽性細胞頻度をグラフに示したものである。患者単核球サンプ ルにおける CD4陽性 IFN y発現陽性の頻度：平均士標準偏差0 /0 (サンプル数)を示 すと、 OVCA101-MNC : 0.471 ±0.562%(14)、 OVCA102-MNC : 0.532 ±0.545%(14) 、 OVCA103—MNC : 0.331 ±0.467%(14)、 OVCA104—MNC : 0.376 ±0.490%(14)、 OV CA105-MNC： 0.379 ±0.497%(14)、 OVCA106— MNC： 0.641 ± 1.082%(14)、 OVCA1 07-MNC： 7.626士 12.448%(8)、 OVCA108— MNC： 8.963士 19.939%(8)、 OVCA115— MNC : 0.161 ±0.157%(8)であった。
[0095] MUC16のアミノ酸一次構造配列を再現した 10アミノ酸残基数のペプチド（図 5)のう ち OVCA107 (配列番号： 2)と OVCA108 (配列番号： 3)は CD4陽性 T細胞に認識され 、 OVCA101から OVCA106 (配列番号： 4から 9)と OVCA115 (配列番号： 10)は認識さ れなかった (表 1)。この結果力 CD4陽性 T細胞ェピトープのアミノ酸配列は P/LFTL NFTITN (配列番号： 51)であると考えられる。尚、 OVCA107 (配列番号： 2)と 108 (配 列番号: 3)はひとつのアミノ酸配列が異なる（P/L)ポリペプチド（図 5参照）であるが、 OVCA107 (配列番号： 2)と OVCA108 (配列番号： 3)は、ほぼ同じ頻度の単核球サン プル数に認識され、ほとんど差はな力つた (表 1下段参照)。以上より Pまたは Lの置換 力 SMHCクラス II分子との親和性に関与しないと考えられるので、より短い T細胞ェピト ープは FTLNFTITN (配列番号： 1)であると言える。
[0096] この長さ 9または 10アミノ酸の配列をそのまま用いたペプチドを T細胞治療に用いる 事も可能である力 一般に CD4陽性 T細胞のェピトープの長さは 20アミノ酸残基数程 度であると言われている（藤原大美. T細胞の免疫応答， T細胞系の免系学. pp 155 -174.藤原大美編著， 中外医学社，東京. 1993) o実際、ェピトープのみの合成ぺプ チド OVCA107とアナログペプチド OVCA11の刺激で陽性となった T細胞の頻度を比 較すると、ペプチドの mol濃度を統一してあっても、 OVCA107よりも OVCA11による刺 激の方が陽性 T細胞頻度の値の分散が小さぐ反応が安定していた。したがって、ァ ナログペプチドである OVCA11： GHTAPGPLLVPFTLNFTITN (配列番号 : 11)が T細 胞の活性ィ匕に最も適していると考えられる。また、コントロールの平均値 + 2SD以上 の頻度を示す陽性単核球サンプル数が OVCA107刺激より多ぐ OVCA11刺激では 最高 84.4%に達していた。このことは、このアナログペプチドが、個人の MHCクラス II分 子に依存した免疫反応の差異を生じさせにくいか、または複数の MHCクラス II分子に 許容される親和性を持った配列、あるいは T細胞の反応を増強させる配列になって 、 ると考えられる。したがって、短いェピトープ部位だけをペプチドとして用いるよりも、 2 0アミノ酸残基数の OVCA11アナログペプチドが細胞治療により適していると考えられ る。
[0097] 本発明において、細胞治療でィ匕学療法を補完することができることが明らかとなつ た。つまり、化学療法の後に行われる事を想定して（図 17参照)、抗癌剤使用後の患 者末梢血の単核球分画を解析した。その結果、標準的化学療法 2週間後の T細胞数 と B細胞数は減少を続けることなく正常範囲にもどり、抗原提示細胞である単球数は 増加し、 CD4陽性 T細胞は増加していた。この CD4陽性 T細胞つまりヘルパー T細胞 には、抗原再認識にかかわる（CD4陽性 45RO陽性 T細胞)メモリー T細胞が十分含ま れていた。卵巣癌などの固形がんの化学療法は血液腫瘍における治療と比較すると 、抗癌剤による造血細胞の抑制は弱い。したがって、抑制後の血液細胞の回復も T 細胞も骨髄力 動員されるナイーブ T細胞の増加より先に、末梢に残存する成熟した メモリー T細胞が増殖して再構成すると言われている（高浜洋介.末梢 T細胞の動態' 維持'分化.免疫学最新イラストレイテッド. 小安重夫編.羊土社.東京. 2003) o本 発明者らの解析でも、化学療法後の末梢血にはメモリー T細胞が充分含まれており、 標準量の抗癌剤化学療法後はむしろ T細胞治療に有利な状態にあることを示してい た。
[0098] 進行卵巣癌に対して行われている化学療法でもっとも治療成績が良いものは、自 己末梢血幹細胞移植併用化学療法である（Ikeba K, Okubo M, Takeda S, et al: Fiv e-year results of cyclic semi-high dose chemotherapy supported by autologous perip heral blood stem cell transplantation in patients with advanced ovarian cancer. Int J Clin Oncol. 9: 113-119, 2004.) 0この治療法では大量に採取した末梢血単核球分 画中に数％程度含まれる造血幹細胞だけをィ匕学療法による骨髄機能低下の救済の ために使っているに過ぎな力つた。今回の解析で、化学療法後にも T細胞治療のた めの T細胞が充分得られることが明かとなったことから、自己末梢血幹細胞移植併用 化学療法の動員抗癌剤化学療法で採取した末梢血単核球分画が、 T細胞治療に利 用できることが示された。実際、末梢血幹細胞動員化学療法時の単核球採取は対外 循環式持続遠心分離装置を用いるので体重 50kg以上の成人患者では、ひとり当たり 2 X 101Q個以上という大量の単核球が採取できる。化学療法後でもメモリー T細胞は 10 .5%あるという今回の測定結果をもとにすれば、持続遠心分離装置を用いて採取でき るメモリー T細胞数は 2 X 109個に達する。これは細胞治療に利用できる十分な数であ る。従来の方法ではこれと同等の T細胞数を培養により得るためには、数ケ月を要す る。この点においても化学療法の回復期に大量採取した自己の T細胞を用いた、抗 原特異的 T細胞療法戦略が有利であると考えられる（図 17)。
産業上の利用可能性
本発明の結果は、試験管内で卵巣癌患者 T細胞を卵巣癌抗原アナログペプチドに て活性化した後、患者本人の末梢血管や腹腔に戻す事により、卵巣癌抗原アナログ ペプチド特異的な Thlタイプの CD4陽性 T細胞が IFNを介して間接的に、 TNF aを介 して直接的に癌細胞を障害する機序、 CD8陽性 T細胞を補助し抗腫瘍効果をおよぼ す機序、特異的抗体を産生する機序により進行卵巣癌の治療が可能となる事を示し ている。また、 T細胞を体外で活性ィ匕し、体内に戻す方法以外に、卵巣癌抗原アナ口 グペプチドを卵巣癌患者にペプチドワクチンとして投与して、患者の生体内に卵巣癌 抗原アナログペプチドを認識する T細胞と抗体を誘導する事により、卵巣癌抗原を産 生する卵巣癌の治療あるいは予防が可能性であると考えられる。さらに、卵巣癌抗原 アナログペプチドを抗原として用い、異種免疫あるいは遺伝子工学的手法により免 疫抗体 (Immunoglobulin)成分を工業生産し、抗卵巣癌抗原 (CA125)抗体を卵巣癌 患者に投与する事により、卵巣癌抗原 (CA125)を産生する卵巣癌の治療が可能で ある。また、この抗体は従来の糖鎖認識抗体とは異なり、アミノ酸を認識する抗体であ り、感度の高い腫瘍マーカーや免疫染色用抗体として広く利用できる。尚、卵巣癌抗 原 CA125は卵巣癌以外の膝癌、肺癌、または良性疾患である子宮内膜症 (特に子宮 腺筋症)などの一部でも産生が認められる場合があり、これら卵巣癌抗原 CA125を産 生する全ての病変に対して、同様の治療が可能であると考えられる。

Claims

請求の範囲
下記式を含むペプチド：
X1 -X2-X3-X4-X5-X6
(式中、 XI、 X2、 X3、 X5、および X6は、任意に含まれていてもよいアミノ酸残基、ま たはアミノ酸配列であり、
X4は、 Phe- Thr- Leu- Asn- Phe- Thr- lie- Thr- Asn (配列番号： 1)である。 )
X3が、 Proまたは Leuである、請求項 1に記載のペプチド。
X2が、
Gly- His- Thr- Ala- Pro- Va卜 Pro- Leu- Leu- lie (配列番号： 4)、
Gly- His- Thr- Ala- Pro- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 5)、
Arg- Pro- lie- Va Pro- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 6)、
Glu- Thr- Thr- Ala- Thr- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 7)、
Gly— Pro— Thr— Thr— Ala— Ser— Pro— Leu— Leu— Val (配列番号： 8)、
Gly- Pro- Ser- Ala- Ala- Ser- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 9)、または、
Gly— Thr— Ser— Gly— Thr— Pro— Ala— Ser— Leu— Pro— Gly— His— Thr— Ala— Pro— Gly— Pro— Leu—
Leu-Val (配列番号： 13)のいずれかである、請求項 1または 2に記載のペプチド。
X2が、
Ala- Pro- Va卜 Pro- Leu- Leu- lie (配列番号： 46) 、
Ala- Pro- Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 47) 、
Ala- Ser- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 48)、
Gly- Pro- Leu- Leu- Val (配列番号： 49) 、または
Pro-Leu-Leu-Val (配列番号： 50)のいずれかである、請求項 1または 2に記載のぺ プチド。
X5が、
Leu-Arg-Tyr-Glu-Glu-Asn-Met-Arg-His-Pro (配列番号： 10)である、請求項 1〜4 の！、ずれかに記載のペプチド。
アミノ酸残基数が 30個以下である、請求項 1〜5のいずれかに記載のペプチド。 卵巣癌関連抗原 CA125のコアタンパク質 MUC16由来である請求項 1〜6のいずれか に記載のペプチド。
[8] 請求項 1〜7のいずれかに記載のペプチドをコードしている DNA。
[9] 請求項 8に記載の DNAを含むベクター。
[10] 請求項 9記載のベクターが導入された形質転換体。
[11] 請求項 10に記載の形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清 力も組換えタンパク質を回収する工程を含む、請求項 1〜8のいずれかに記載のぺ プチドの製造方法。
[12] 請求項 1〜7のいずれかに記載のペプチドに結合する抗体。
[13] モノクローナル抗体である請求項 12に記載の抗体。
[14] 請求項 12または 13に記載の抗体を対象に投与する工程を含む、対象における癌細 胞、癌細胞関連抗原、または子宮の内側以外の部位に発生した子宮内膜細胞を検 出する方法。
[15] 請求項 1〜7のいずれかに記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、対象にお ける T細胞を活性ィ匕させる方法。
[16] T細胞が IL-4を産生するヒト CD4陽性 T細胞、 IFN yを産生するヒト CD4陽性 T細胞、 T
NF o;を産生するヒト CD4陽性 T細胞， TNF o;を産生するヒト CD8陽性 T細胞、である請 求項 15に記載の方法。
[17] 請求項 15または 16に記載の方法によって、活性化された T細胞。
[18] 請求項 1〜7のいずれかに記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、対象にお ける癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する方法。
[19] 請求項 12または 13に記載の抗体を対象に投与する工程を含む、対象における癌疾 患または子宮内膜症を、予防または治療する方法。
[20] 対象における癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する方法であって、以下 の工程 (a)〜(c)を含む方法。
(a)請求項 1〜7のいずれかに記載のペプチドを T細胞に添加する工程、
(b) (a)の T細胞を培養する工程、
(c) (b)で得られた T細胞を対象に投与する工程。
[21] 工程 (a)の前に、対象に抗癌剤による化学療法を行う工程を含む、請求項 20に記載 の方法。
[22] 抗癌剤による化学療法が自己末梢血幹細胞移植併用化学療法である、請求項 21に 記載の方法。
[23] 癌疾患が、卵巣癌、脾臓癌、または肺癌である請求項 18〜22のいずれかに記載の 方法。
[24] 子宫内膜症が、子宫腺筋症である請求項 18〜22のいずれかに記載の方法。
[25] 請求項 1〜7のいずれかに記載のペプチドを有効成分とする、癌疾患または子宫内 膜症を、予防または治療するための薬剤。
[26] 請求項 12または 13に記載の抗体を有効成分とする、癌疾患または子宫内膜症を、 予防または治療する薬剤。
[27] 請求項 17に記載の T細胞を有効成分とする、癌疾患または子宮内膜症を、予防また は治療する薬剤。
[28] 癌疾患が、卵巣癌、脾臓癌、または肺癌である請求項 25〜27のいずれかに記載の 薬剤。
[29] 子宫内膜症が、子宫腺筋症である請求項 25〜27のいずれかに記載の方法。
[30] 請求項 12または 13に記載の抗体を有効成分とする、癌腫瘍マーカー、免疫染色用 抗体、または子宮内膜細胞マーカー。
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