WO2006102979A2 - Inflammation markers and combinations thereof as biochemical markers for cardiovascular diseases - Google Patents

Inflammation markers and combinations thereof as biochemical markers for cardiovascular diseases Download PDF

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WO2006102979A2
WO2006102979A2 PCT/EP2006/002230 EP2006002230W WO2006102979A2 WO 2006102979 A2 WO2006102979 A2 WO 2006102979A2 EP 2006002230 W EP2006002230 W EP 2006002230W WO 2006102979 A2 WO2006102979 A2 WO 2006102979A2
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Stefan Blankenberg
Hans J. Rupprecht
Christoph Bickel
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Johannes Gutenberg-Universität Mainz
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
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    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction

Definitions

  • the invention relates to novel markers of vascular inflammation and combinations thereof as tools for diagnosis and their prognosis in patients with cardiovascular diseases.
  • the markers also serve as tools that facilitate the selection of drugs for the treatment of such diseases, and finally as a starting point for the treatment of cardiovascular diseases.
  • the invention relates to the creation of an individual risk profile of negative events associated with the progression of arteriosclerosis.
  • Thrombus formation in the coronary vasculature is the triggering event of unstable coronary heart disease.
  • the central role of platelet activation in patients with unstable coronary heart disease is further enhanced by thromboxane and prostaglandin metabolites released by the platelets. Therefore, platelet activation is a general therapeutic target. So far, such therapies have involved the use of aspirin, tienopyridines and a direct glycoprotein IIb / IIIa inhibitor.
  • MI myocardial infarction
  • the ECG has only limited prognostic relevance in this respect, as significant abnormalities are rare and their detection is less sensitive and specific (Kaul P, Fu Y, Chang WC, et al., J Am Coli Cardiol 2001; 38: 64-71 and Savonitto S, Ardissino D, Granger CB, et al JAMA 1999; 281: 707-13). Therefore, markers of necrosis of myocardial cells, especially cardiac troponins, have become valuable tools in the evaluation of patients with acute coronary syndromes (Hamm CW, Braunwald E. Circulation 2000, 102: 118-22).
  • troponins are not actively involved in the pathophysiology of acute coronary syndromes, but are rather a surrogate marker of fragile thrombus formation (Lindahl B, Diderholm E, Lagerqvist B, Venge P, Wallentin L. J Am Coli Cardio, 2001; : 979-86, Heeschen C, van den Brand MJ, Hamm CW, Simoon ML. Circulation 1999; 100: 1509-14; Benamer H, Steg PG, Benessiano J, et al. Am Heart J 1999; 137: 815-20).
  • Inflammatory markers that determine the activity of the disease could be important additional information for diagnostic and therapeutic stratification in patients with acute coronary syndromes.
  • the specific therapeutic inhibition of cytokines that are essential for plaque stability may be a new treatment strategy for patients with unstable and stable coronary heart disease.
  • markers there are many different molecular markers in the art which may be useful in the diagnosis of cardiovascular disease. Examples of such markers include: Pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A); C-reactive protein (CRP); hs-CRP; placental growth factor (PlGF); Interleukin-18 (IL-18 / IL-18b); Brain natriuretic peptide (BNP); NT-per brain natriuretic peptide (NT-pro NP); sCD40L, cTnI / T, IL-10, ICAM-I, VCAM-I, E-selectin, P-selectin, IL-6, VEGF, serum amyloid A (SAA), CKMB, MPO, ILI-RA, TAFl, soluble Fibrin, MCP-I, Tissue Factor (TF), MMP-9, bFGF, PCM and VEGF-A.
  • PAPP-A Pregnancy-associated plasma protein A
  • CRP C-reactive protein
  • the endothelium plays an important role in the regulation of vascular tone.
  • One factor of great importance for the maintenance of endothelial homeostasis is nitric oxide.
  • the substrate for endothelial nitric oxide synthesis is the amino acid L-arginine.
  • the endothelium is also capable of producing methylated amino acids, such as asymmetric dimethylarginine (ADMA), which are capable of being competitive with L-arginine as a substrate for endothelial nitric oxide synthase, resulting in endothelial dysfunction (for a summary, see Cooke JP, 2000).
  • ADMA asymmetric dimethylarginine
  • Resistin is a cytokine expressed by adipocytes.
  • the main function is antagonizing the insulin effect and impairing glucose tolerance.
  • MMPs tissue-matrix metalloproteinases
  • Several studies have shown that extracellular matrix degradation by tissue-matrix metalloproteinases (MMPs), particularly MMP-9, is involved in the pathogenesis of a wide range of cardiovascular diseases, including arteriosclerosis, restenosis, cardiomyopathy, congestive heart failure, myocardial infarction and aortic aneurysm (Dollery , Benjamin, 2001). Levels of circulating MMP-9 are associated with future cardiovascular events (Blankenberg, 2003).
  • TIMP-I tissue inhibitors of metalloproteinases
  • TIMP-I endogenous tissue inhibitors of metalloproteinases
  • TIMP-I is one of the best characterized TIMPs that binds to activated MMPs with high affinity.
  • TIMP-I appears to play an important role in the regulation of left ventricular structure and systolic function (Li, 1998, Timms, 2002) and plasma TIMP-I levels are elevated in coronary disease (Hirohata, 1997).
  • total TIMP-I was associated with significant cardiovascular risk factors (Sundstrom, 2004).
  • the direct mechanistic role of MMPs and TIMPs has not been fully established in the post-MI remodeling process.
  • Caspases have functions in apoptotic signaling pathways.
  • the primary role of caspase-1 is the regulation of inflammatory processes.
  • co-localization of caspase-1 with apoptotic cells in advanced human plaques was reported.
  • focal apoptosis of macrophages with extensive expression of caspase-1 was detected and associated with sudden cardiac death.
  • TnT is of particular value for the diagnosis and the Prediction of MI (see above).
  • Inflammatory markers such as CRP are valuable for the diagnosis and prediction of inflammation, which can lead to plaque rupture and MI.
  • cardiovascular risk stratification is currently performed using classical risk factors and various risk calculators (Framingham / PROCAM). Recently, it has been increasingly discussed to what extent highly sensitive C-reactive protein (CRP) as a marker of inflammation enables more accurate risk stratification.
  • CRP C-reactive protein
  • the association between different markers of inflammation (CRP, interleukin-6 or soluble intercellular adhesion molecule-1) and future cardiovascular risk has been confirmed in several studies.
  • the known solutions ie the determination of the cardiovascular risk by means of traditional risk factors, have less than 50% sensitivity and specificity.
  • ECG and troponin as well as CK value determinations do not provide 100% diagnostic accuracy for the acute coronary syndrome.
  • the object of the present invention is to provide a method by which the possibility of risk stratification of coronary heart disease is improved by the determination of specific individual markers and / or a specific "marker panel" consisting of biomarkers of inflammation be extended.
  • the attending physician should be better able than before to be able to select suitable measures in order to positively influence the patient, to prevent a disadvantageous event or at least to lessen its severity for the affected patient.
  • the object of the present invention is achieved by a method for the analysis of samples in connection with acute cardiovascular diseases.
  • the process according to the invention comprises the steps of:
  • c optionally, determining the concentration of at least one further marker selected from sTNFR-1, troponin T (TnT), IL-6, sILI-RA, CRP, soluble intercellular adhesion molecule-1, soluble vascular adhesion molecule-1, soluble E-selectin , Matrix metalloproteinase-9, CD40, lipoprotein-associated phospholipase A2 and other inflammatory markers, and (d) Comparison of the results obtained for the sample to be tested / s with reference values and / or the values from reference samples.
  • TnT troponin T
  • IL-6 intercellular adhesion molecule-1
  • soluble vascular adhesion molecule-1 soluble E-selectin
  • Matrix metalloproteinase-9 Matrix metalloproteinase-9
  • CD40 lipoprotein-associated phospholipase A2 and other inflammatory markers
  • This invention contemplates that various markers of inflammation (soluble tumor necrosis factor - receptor 1 and 2 (sTNFR-1 and sTNFR-2), soluble interleukin-1 receptor antagonist (sIL1-RA), interleukin-18 (IL-18 ), soluble intercellular adhesion molecule-1, soluble vascular adhesion molecule-1, soluble E-selectin, matrix metalloproteinase-9, interleukin-6 (IL-6), fibrinogen, ADMA, caspase-1, TIMP-I, resistin, sVCAM- 1 and C-reactive protein (CRP)) allow predicting the cardiovascular risk.
  • soluble tumor necrosis factor - receptor 1 and 2 soluble interleukin-1 receptor antagonist
  • IL-18 interleukin-18
  • soluble intercellular adhesion molecule-1 soluble vascular adhesion molecule-1
  • E-selectin matrix metalloproteinase-9
  • IL-6 interleukin-6
  • fibrinogen ADMA
  • caspase-1 TIMP-
  • markers have the potential to diagnose an acute coronary syndrome;
  • markers as well as a specially designed "marker cluster”, can be used to estimate the risk of suffering a fatal or non-fatal myocardial infarction, which extends the risk assessment currently available with classical risk factors.
  • acute phase reactants C-reactive protein, fibrinogen and interleukin-6
  • pro-inflammatory cytokines and soluble receptors pro-inflammatory cytokines and soluble receptors
  • soluble adhesion molecules intercellular adhesion molecules
  • a variety of inflammatory biomarkers are associated with cardiovascular prognosis. Particularly high is an inflammatory value consisting of the parallel determination of 8 biomarkers of inflammation (TIMP-I, ADMA, Resistin, caspase-1, sTNFR-2, IL-18, sVCAM-1, fibrinogen) with the risk of a future cardiovascular event associated.
  • TIMP-I 8 biomarkers of inflammation
  • an inflammatory marker panel is described as a strong and independent predictor of cardiovascular risk. Inflammatory vascular wall processes are causally involved in destabilizing arteriosclerotic plaques and enhancing thrombus formation. These results have triggered the search for circulating biochemical markers that reflect inflammatory activity within the vascular wall.
  • C-reactive protein In addition to fibrinogen, the first inflammatory biomarker associated with future cardiovascular risk, C-reactive protein has been the most widely studied. However, its clinical usefulness has recently been doubted.
  • Other (pro) inflammatory markers such as interleukin-6, soluble adhesion molecules, interleukin-18 or lipoprotein-associated phospholipase A2 are also potential emerging tools for cardiovascular risk prediction.
  • the inventors analyzed several circulating inflammatory biomarkers in a large cohort of patients with coronary heart disease.
  • the inventors selected among others acute phase reactants (C-reactive protein, fibrinogen and interleukin-6), proinflammatory cytokines and soluble receptors (tumor necrosis factor receptors 1 and 2, soluble interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-18), soluble adhesion molecules (intercellular Adhesion molecule-1, vascular adhesion molecule-1, soluble E-selectin) and matrix metalloproteinase-9.
  • acute phase reactants C-reactive protein, fibrinogen and interleukin-6
  • proinflammatory cytokines and soluble receptors tumor necrosis factor receptors 1 and 2, soluble interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-18
  • soluble adhesion molecules intercellular Adhesion molecule-1, vascular adhesion molecule-1, soluble E-selectin
  • matrix metalloproteinase-9 matrix metalloproteinase-9.
  • C-reactive protein (CRP) and hsCRP are markers of systemic inflammation, troponin cTnl / T as a marker of necrosis; the pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A) as a marker for macrophage activation; IL-10 (interleukin 10) as marker for the inflammatory balance, sCD40L as marker for the thrombo-inflammatory activation, MPO (myeloperoxidase) as marker for oxidative stress, placental growth factor (PlGF) as marker for vascular inflammation and the markers brain natriuretic Peptide (BNP) and NT-pro brain natriuretic peptide (NT-proNP) as markers of neurohumoral activation and ischemia.
  • C-reactive protein (CRP) and hsCRP are markers of systemic inflammation, troponin cTnl / T as a marker of necrosis; the pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A) as a marker for macrophage activ
  • interleukin-18 IL-18 / IL-18b
  • ICAM-1 interleukin-1
  • VCAN-I E-selectin
  • P-selectin IL-6
  • VEGF serum amyloid A
  • SAA serum amyloid A
  • CKMB CKMB
  • IL-I-RA IL-I-RA
  • TAF-I soluble fibrin
  • MCP-I 5 Tissue Factor (TF) MCP-I 5 Tissue Factor (TF)
  • bFGF bFGF
  • PCM VEGF-A
  • the sample to be examined and / or the reference sample originate from a mammal, in particular from humans.
  • the sample to be examined and / or the reference sample is selected from the group consisting of peripheral blood or fractions thereof and cell culture suspensions or fractions thereof. It is furthermore preferred that the examining sample and / or reference sample is blood serum or blood plasma. Peripheral whole blood is particularly preferred as the sample to be examined and / or the reference sample.
  • the sample to be examined and / or the reference sample can be pretreated, wherein the peripheral blood z.
  • a anticoagulant especially heparin, is added.
  • the analyzed markers and combinations thereof are selected from:
  • Particularly preferred according to the invention is then a method wherein the analyzed markers and combinations thereof are selected from fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 and fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + ADMA + caspase-1 + TIMP-I + Resistin + sVCAM-1,
  • the method used according to the invention for determining the concentration of the markers analyzed can be selected from any suitable method known to the person skilled in the art for the detection of proteins in biological samples.
  • the specific procedure is within the scope of the present.
  • the invention is not important as long as the method is sensitive enough to undercut the detection limit required for an accurate determination of the concentrations of the markers.
  • Suitable methods are usually based on the binding of a label to the label to be detected and the subsequent detection of this label.
  • the bond may be covalent or noncovalent and / or directly or indirectly.
  • Suitable measuring methods according to the present invention include e.g. For example, electrochemiluminescence. Turbidimetry, nephelometry and latex enhanced turbidimetry or nephelometry may also be used.
  • the concentration is determined by means of an immunological method by means of molecules binding to the marker.
  • examples of such methods are enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), sandwich enzyme immunoassay or solid phase immunoassay.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the molecules that bind to the markers are selected from the group consisting of anti-marker antibodies or parts thereof and marker receptors or parts thereof. These molecules can be selected from a very wide variety of molecules specific for the markers. It is preferred that the molecules that bind to the markers are selected from the group consisting of antibodies directed specifically against markers or against portions thereof, or portions or fragments thereof and a marker receptor or portions thereof or an integrin. Particularly preferred is a method according to the invention, wherein the antibodies, parts or fragments thereof include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, Fab fragments, scFv antibodies and diabodies.
  • components of the method may be bound to a solid phase, thus, the molecules that bind to a marker may be in solution or matrix immobilized.
  • matrices a variety of materials known to those skilled in the art may be used, such as resin matrices and / or conventional column matrices.
  • Particular preference is furthermore given to a method according to the invention in which the molecules binding to a marker are coupled to one or more detection molecules from the group consisting of fluorescein thioisocyanate, phycoerythrin, enzymes (for example horseradish peroxidase) and magnetic bead.
  • the molecules binding to the markers can be detected with an antibody to which one or more detection molecules are coupled. It is thus an indirect proof of the binding of the molecule.
  • two-stage detections are well known to those skilled in the art, for example, from the anti-antibody detection technique.
  • immunocytological methods can be used to analyze the sample. All methods are suitable which allow a specific determination based on the marker / molecule interaction. Preferred are methods selected from the group consisting of sandwich enzyme immunoassay, ELISA and solid phase immunoassays. The results obtained for the sample to be examined are usually compared with a reference sample. Which sample can serve as a reference sample will depend, in particular, on the type of sample being tested and the medical history of the individual from which the sample to be tested is derived. Preferred is a method according to the invention, in which the reference sample originates from one or the mean of several mammals in which a cardiovascular disease has been excluded. But this does not necessarily have to be the case if z. B. the progression of a disease is to be determined, an "old" sample of the same patient can be used as a reference sample. It is obvious to the person skilled in the art which samples are suitable as a reference sample for the method according to the invention.
  • the acute cardiovascular diseases to be diagnosed and / or prognosticated and / or their therapy may be selected from the group consisting of unstable angina, myocardial infarction, acute heart syndrome, coronary artery disease and cardiac insufficiency.
  • the method according to the invention is suitable and can still be used for other acute cardiac disease states.
  • a further aspect of the present invention relates to a diagnostic kit, wherein the kit comprises means for carrying out the method according to the invention, possibly together with further components and / or auxiliaries.
  • Such agents are preferably at least one antibody for detection of marker and means for subsequent quantification of the markers.
  • the kit may also contain other components and / or enzymes for carrying out the methods of the present invention, e.g. B. Instructions for use for interpreting the results of the test with regard to the risk profile of the patient and appropriate countermeasures and therapy suggestions.
  • Another aspect of the present invention thus relates to the use of the method according to the invention for the diagnosis and / or prognosis of acute cardiovascular diseases and / or for the monitoring of their therapy. This is done by the quantitative and critical determination of markers. On the basis of the risk profile which can then be created, appropriate countermeasures can then be carried out by the attending physician in order to positively influence the patient and to prevent or at least reduce the severity of the adverse event for the affected patient.
  • Such a therapy according to the invention z.
  • the administration of statins or inhibitors of the glycoprotein IIb / III receptor in particular abciximab include.
  • those skilled in the art will be aware of other possible therapies to treat cardiovascular diseases that may occur according to conventional schemes.
  • an anti-inflammatory agent may further be administered.
  • these agents came to be selected from non-steroid or steroid anti-inflammatory agents, which may include eg: alclofenac; alclometasone; dipropionate; Algestonacetonide; Alpha-amylase; Amcinafal; amcinafide; Amfenac sodium; Amiprilosehydrochlorid; anakinra; Anirolac; anitrazafen; apazone; Balsalazide disodium; bendazac; benoxaprofen; Benzydamine hydrochloride; bromelain; broperamole; Budesonide; carprofen; cicloprofen; Cintazon; Cliprofen; clobetasol propionate; clobetasone; clopirac; Cloticasonpropionat; Cormethasonacetat; cortodoxone; deflazacort; desonide; deoxymethasone; Dex
  • diagnosis refers to the verification of whether an individual has suffered from a particular cardiovascular event.
  • prognosis refers to predicting the likelihood (in%) of whether an individual will suffer from a particular cardiovascular event.
  • stratification of therapy refers to the determination of the appropriate therapeutic treatment for the cardiovascular event that will occur or has occurred.
  • monitoring therapy refers to the control and, optionally, discontinuation of the therapeutic treatment of an individual.
  • therapeutic treatment includes any treatment that may or may not include the pathophysiological condition of an individual and includes, for example: As the administration of pharmaceuticals and surgical treatment (eg., Balloon dilatation).
  • tumor necrosis factor- ⁇ and interleukin-1 are difficult to measure in the circulation because of their short half-life.
  • the increase in soluble tumor necrosis factor receptor and soluble interleukin-1 receptor antagonist are closely associated with tumor necrosis factor- ⁇ and interleukin-1, respectively, and show stable basal serum levels.
  • soluble tumor necrosis factor receptor 2 and soluble interleukin-1 receptor antagonist counteract potentially deleterious effects, endogenous production does not appear to be sufficient to prevent the negative effects of primary cytokines produced locally (26).
  • the soluble receptors seem to be better markers of the activity of the disease than the cytokines themselves (27).
  • the present invention demonstrates a strong association of soluble interleukin-1 receptor antagonist with cardiovascular risk in univariate analysis, however, the effect was no longer significant when several inflammatory markers were considered simultaneously. This may be due to the fact that soluble interleukin-1 receptor antagonist levels strongly correlate with soluble tumor necrosis factor receptor 2.
  • interleukin-18 expression another member of the interleukin-1 family has been identified in human arteriosclerotic plaques, and inhibition of interleukin-18 has been shown to be a beneficial effect on the progression of plaque formation and composition in animal models.
  • the association of baseline interleukin-18 levels with future cardiovascular death has recently been demonstrated in atherosclerotic examination in both stable angina pectoris and acute coronary syndrome, and was further confirmed in the cohort of initially healthy subjects in the PRIME study.
  • interleukin-18 levels are weakly correlated with other inflammatory markers, suggesting that interleukin-18 represents a rather distinct pathophysiological pathway.
  • the present invention recognizes the significant and independent role of fibrinogen, sTNFR-2, IL-18, ADMA, caspase-1, TIMP-I, resistin and sVCAM-1 as platelet activators for the diagnostic and therapeutic Risk stratification documented.
  • Figure 1 shows the pairwise Pearson correlation coefficients between inflammatory markers in patients with stable angina pectoris and those with acute coronary syndrome (log or square root transformations were used to normalize the distributions).
  • Figure 2 shows the hazard ratios of future cardiovascular events by increasing thirds of inflammatory markers. Hazard ratios were adjusted for age, sex, body mass index, smoking status, history of high pressure or diabetes, HDL cholesterol, statin therapy and number of stenotic vessels.
  • Figure 3 the Kaplan-Meier survival curves for cardiovascular events by inflammatory value in patients with stable angina (Panel A) and acute coronary syndrome (Panel B).
  • FIG. 4 shows the difference in the Akaike Information Criterion (AIC) between the model based on the 4-marker value (surrounded) and those based on the best 1-marker, 2-marker and 3-marker values (left) and the 5 Marker value (right).
  • AIC Akaike Information Criterion
  • Figures 5 and 6 show the Kaplan-Meier curves for event-free survival according to thirds of TIMP-1 levels.
  • FIG. 7 shows the predictive strength of TIMP-I in the context of the new biological markers CRP and BNP.
  • Figure 8 shows the Kaplan-Meier curves for event-free survival according to thirds of ADMA Spiegel.
  • FIG. 9 shows the predictive strength of TIMP-I in the context of the new biological markers CRP, BNP and creatinine.
  • the inventors first examined which outcomes of eleven inflammatory markers - some analyzed for the first time - are independently associated with future cardiovascular risk and whether the simultaneous identification of multiple inflammatory markers improved the ability to detect high-risk patients beyond the classic risk factors and single-marker determination.
  • An inflammatory value was next calculated by combining the 4 markers selected by stepwise analysis.
  • the value of an individual was defined as the number of markers in the upper third of the distribution.
  • the Cox model based on this 4-marker value was further compared for information with models based on values having a smaller or larger number of markers.
  • the Akaike Information Criterion (AIC) (19) was used, and the model with the minimum AIC (minAIC) was considered to have the best empirical support (20).
  • a model with an AIC difference ⁇ 2 with the minAIC was considered equivalent to the minAIC model, whereas a model with an AIC difference> 4 was considered different from the minAIC model (20, 21).
  • Figure 2 shows the hazard ratios of cardiovascular event, adjusted for classical risk factors, according to the increasing thirds of each marker.
  • the model included the classic risk factors and soluble tumor necrosis factor receptor 2, interleukin-18, soluble interleukin-1 receptor antagonist, soluble vascular adhesion molecule-1, matrix metalloproteinase-9 and fibrinogen as the representative of the cluster of acute phase reactants.
  • the inventors generated an inflammatory score that summarized the upper thirds of soluble tumor necrosis factor receptor-2, soluble vascular adhesion molecule-1, interleukin-18, and fibrinogen.
  • the value of an individual was defined as the number of markers in the upper third. The value varied from 0 to 4, with 24.9% (26.3%), 34.3% (35.4%), 26.6% (23.7%), 10.9% (11%) and 3.3% (3.6%) of patients with stable angina (acute coronary syndrome) who had 0, 1, 2, 3, and 4 markers in the upper third, respectively.
  • the inventors compared the AIC value of the Cox model based on the 4-marker value with those of the best 1 markers. , 2-marker and 3-marker values (FIG. 4).
  • the minAIC was obtained for the 4-marker value (on 0) and was considered to have the best empirical support. Values that had a lower number of markers had worse empirical support (AIC difference> 4), whereas the best model based on a 5 marker was not superior to the 4-marker value in terms of information (AIC difference ⁇ 2).
  • the inventors examined whether the inflammatory value added additional information beyond that provided by traditional risk factors. The addition of the inflammatory value to conventional risk factors increased the area under the receiver operating characteristics curve from 0.63 to 0.68,
  • Event (n 1057)
  • Event (n 235)
  • Triglycerides mg / dl 166.4 + 3.3 179.7 + 7.1 0.01
  • Categorical variables are expressed as percent of patients, continuous variables are given as age- and sex-adjusted means + standard deviation. * The relationship between cardiovascular output and each variable (categorical or continuous) was determined by Cox regression analysis, adjusted for age and gender. F The ejection fraction was determined in 1083 patients.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • CAD coronary artery disease
  • MI myocardial infarction
  • a log or * square root transform was used to normalize the distribution of each marker, and antilog or squared means (95% confidence interval) are given.
  • sTNF-R1 soluble tumor necrosis receptor 1 receptor (receptor 2)
  • IL-6, IL-18 Interleukin-6 or 18 sIL-IRa: soluble IL-1 receptor antagonist sICAM-1: soluble intercellular adhesion molecule-1 sV CAM-I: soluble vascular cell adhesion molecule-1
  • MMP-9 Matrix metalloproteinase-9 hs-CRP: highly sensitive C reactive protein
  • Resistin (ng / ml) was determined in 1194 patients with documented CHD at the time of study enrollment. Patients presented with stable angina pectoris (AP), troponin negative unstable AP, subacute and acute myocardial infarction (MI). During the observation period of 3.2 ⁇ 0.9 years, follow-up (f / u) was performed in 1171 patients (98.1%).
  • Plasma concentration of the resistin (ng / ml)
  • Resistin is highly predictive of the risk of acute coronary syndrome in patients with chest pain and is moderately associated with mortality risk.
  • Model 1 is not controlled; Model 2 is controlled by age and sex; Model 3 is additionally controlled for BMI, history of hypertension, diabetes, smoking, HDL
  • Model 4 additionally adjusted to multiple vascular disease, statin and beta
  • Model 5 is made by forward-probability variable selection from all
  • Serum TIMP-I was determined using the ELISA technique according to the manufacturer's instructions (Human, Biotrak, ELISA System, Amersham Biosciences, USA) at a range of 3.1-50 ng / ml. The test had a variation coefficient of between 8.9 - 11.4% within the test and between 13.1 - 15.25% variation between the test coefficients.
  • Plasma BNP was determined using a fluorescence immunoassay (Biosite Diagnostics Inc., San Diego, California). The indicated detection limit is less than 5 pg / ml. The test showed a coefficient of variation of close to 10% between tests and a yield of 100% of added peptide was found. C-reactive protein and lipid serum levels were determined as in Example 1 and by standard methods.
  • Table 6 provides baseline characteristics of the 75 study participants who subsequently died for cardiovascular reasons and 1870 who had no future cardiovascular event.
  • the left ventricular ejection fraction as determined by angiography was significantly higher in patients without cardiovascular death (P ⁇ 0.001).
  • Diabetes mellitus % 0.0001 no 84.0 62.7
  • Triglycerides mg / dl 131 (96-184) 149 (102-179) 0.34
  • the TIMP-I level was normally distributed among the study participants. It ranged from 6.0 to 2667 ng / ml, with a mean (+ SD) of 699 + 225, a median of 676 and an interquartile range of 561 to 803 ng / ml.
  • the baseline level of TIMP-I activity was significantly higher between those who died of cardiovascular causes than those who did not (820 vs 692 ng / ml; P ⁇ 0.0001).
  • BNP (P ⁇ 0.0001), CRP (P ⁇ 0.0001) and creatinine (P ⁇ 0.0001) were significantly increased in patients with future cardiovascular death.
  • Table 7 each represents the mean and median levels of inflammatory markers, such as TIMP-I, CRP and BNP, according to the prevalence of traditional risk factors and clinical variables.
  • TIMP-I was significantly higher among patients with diabetes, hypertension and severe vascular disease. Patients receiving statin medication had lower TIMP-I levels.
  • TIMP-I levels correlated inversely with the smoking history.
  • Figure 5 shows the Kaplan-Meier curves for event-free survival, according to thirds of TIMP-I levels.
  • the unadjusted rate of cardiovascular death was highest in patients within the upper third of TIMP-I levels (P log rank ⁇ 0.0001).
  • P log rank 0.002
  • Table 8 shows the hazard ratios for cardiovascular death associated with thirds of TIMP-I levels.
  • Asymmetric dimethylarginine was assayed from serum samples by competitive enzyme-linked immunosorbent assay (DLD Diagnostika GmbH, Hamburg, Germany) at a range of 0.1 ⁇ mol / 1 to 5.0 ⁇ mol / l. The detection specificity is 0.05 ⁇ mol / l. The cross-reactivity with methylarginines is low (arginine ⁇ 0.02 percent, A ⁇ monomethyl-L-arginine 1.0 percent, symmetrical dimethylarginine 1.2 percent). Plasma BNP was determined using a fluorescence immunoassay (Biosite Diagnostics Inc., San Diego, California). The indicated detection limit is less than 5 pg / ml. The test showed a coefficient of variation of close to 10% between tests and a yield of 100% of added peptide was found. Serum C-reactive protein and lipid levels were determined as in Example 1 and by standard methods.
  • a log transformation was performed and the hazard ratio applied per one standard deviation increment.
  • the hazard ratios for future coronary event according to thirds of asymmetric dimethylarginine were estimated by Cox regression models adjusted for potential confounders. Three discontinued models were constructed. The inventors focused first on age and sex and secondly on other traditional and clinical risk factors. The final model included clinical and therapeutic variables as well as C-reactive protein and B-type natriuretic peptide. Furthermore, the strengths of asymmetric dimethylarginine, B-type natriuretic peptide, C-reactive protein and creatinine for cardiovascular risk prediction were compared.
  • Cox predicative models were calculated for the upper third of each variable, set on cardiovascular confounders (model 2), and additionally for all three markers simultaneously (model 3). The hazard ratios and 95 percent confidence intervals are given.
  • areas under the receiver operating curves were used for the combined analysis of traditional risk factors (Model 1) and individual biomarkers. Determination, as well as simultaneous determination of all four markers in addition to classical risk factors calculated. The P values are two-sided; Values of p ⁇ 0.05 were considered significant. All calculations were compared using the SPSS version 11.05 program.
  • the median age of the study participants was 61.0 ⁇ 9.8 years, 79.1 percent were male.
  • the concentration of asymmetric dimethylarginine was slightly distorted among the study participants. It ranged from 0.07 to 7.49 with a mean of 0.68 and a median of 0.63 ⁇ mol / l with a 25 ⁇ 115 interquartile range of 0.53 / 0.74 ⁇ mol / l.
  • the baseline concentration of asymmetric dimethylarginine was significantly higher between those who died of cardiovascular causes than those who did not.
  • Plasma ADMA (umol / 1) 0.63 (0.53 / 0.74) 0.70 (0.60 / 0.82) 0.001
  • Plasma C-Reactive Protein 2.98 (1.40 / 7.43) 5.62 (2.51 / 15.43) 0.001
  • Table 10 provides the association of a standard deviation increment in log asymmetric dimethylarginine values with future cardiovascular event.
  • the increase in the asymmetric dimethylarginine level was associated with an increased risk of cardiovascular death (increase of 42 percent for asymmetric dimethylarginine for every increment of 1 standard deviation in log transformed asymmetric dimethylarginine values), coronary event and stroke.
  • these associations remained independently significant.
  • the primary endpoint of the study was death for cardiovascular reasons and non-fatal coronary event.
  • Figure 8 provides the Kaplan-Meier curves for event-free survival in one third of the asymmetric dimethylarginine level.
  • the unadjusted cardiovascular event rate increased in a stepwise fashion over the rising thirds of baseline asymmetric dimethylarginine levels (P ⁇ 0.001).
  • the inventors performed a series of Cox predictive models (Table 11). In an age and gender adjusted model, individuals in the upper third showed a 2.47 increase (95 percent confidence interval 1.51 to 4.03) in cardiovascular risk, compared to those in the first third. Further adjustment to clinical and therapeutic variables as well as C-reactive protein, creatinine, and B-type natriuretic peptide did not alter the hazard ratio associated with asymmetric dimethylarginine concentration.

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Abstract

The invention relates to novel markers of vascular inflammation and to combinations thereof that are used as diagnosis and prognosis tools in patients suffering from cardiovascular diseases. The markers also act as tools to facilitate the selection of active ingredients for treating diseases of this type and constitute the starting point for the treatment of cardiovascular diseases. The invention also relates to the creation of an individual risk profile of negative events, which are associated with the progression of arteriosclerosis.

Description

Entzündungsmarker und Kombinationen davon als biochemische Marker bei kardiovaskulären Erkrankungen Inflammatory markers and combinations thereof as biochemical markers in cardiovascular diseases
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft neue Marker der vaskulären Entzündung und Kombinationen davon als Werkzeuge zur Diagnose und deren Prognose in Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen. Die Marker dienen weiterhin als Werkzeuge, die die Auswahl von Wirkstoffen zur Behandlung solcher Erkrankungen erleichtern und schließlich als Ansatzpunkt für die Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen. Weiterhin betrifft die Erfindung die Erstellung eines individuellen Risikoprofils von negativen Vorgängen, die mit dem Fortschreiten der Arteriosklerose zusammenhängen.The invention relates to novel markers of vascular inflammation and combinations thereof as tools for diagnosis and their prognosis in patients with cardiovascular diseases. The markers also serve as tools that facilitate the selection of drugs for the treatment of such diseases, and finally as a starting point for the treatment of cardiovascular diseases. Furthermore, the invention relates to the creation of an individual risk profile of negative events associated with the progression of arteriosclerosis.
Hintergrund der ErfindungBackground of the invention
Kürzliche Fortschritte in der Grundlagenforschung haben eine fundamentale Rolle für die Entzündung bei der Vermittlung aller Phasen der Arteriosklerose, von ihrem Beginn über Fortschreiten und, letztendlich, den thrombotischen Komplikationen von arteriosklerotischen Läsionen etabliert (Libby P, Ridker PM, Maseri A. Entzündung und atherosclerosis. Circulation 2002; 105 (9): 1135-43, Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease. N Engl J Med 1999; 340 (2): 115-26, Davies MJ, Thomas AC. Plaque fissuring-the cause of akute myocardial infarction, sudden ischaemic death, and crescendo angina. Br Heart J 1985; 53 (4): 363-73, Libby P. Molecular bases of the akute coronary Syndromes. Circulation 1995; 91 (11): 2844- 50,).Recent advances in basic science have established a fundamental role in inflammation in mediating all stages of atherosclerosis, from their onset to progression and, ultimately, the thrombotic complications of atherosclerotic lesions (Libby P, Ridker PM, Maseri A. inflammation, and atherosclerosis. Circulation 2002; 105 (9): 1135-43, Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease N Engl J Med 1999; 340 (2): 115-26, Davies MJ, Thomas AC Plaque fissuring-the cause of acute myocardial infarction, sudden ischemic death, and crescendo angina Br Heart J 1985; 53 (4): 363-73, Libby P. Molecular bases of the acute coronary syndrome., Circulation 1995; 91 (11): 2844-50,).
Die aus dem Zusammenhang zwischen Entzündung und Arteriosklerose erhaltenen Ergebnisse bilden die Rationale zur Verwendung von zirkulierenden Entzündungsmarkern als potentielle prädiktive Instrumente bei Patienten mit akuten Koronarsyndromen. In der Tat gehen erhöhte Spiegel von Entzündungsmarkern, wie zum Beispiel hoch sensitives C-reaktives Protein (hsCRP), Serum Amyloid A, und Interleukin-6 (IL-6) nicht nur allgemein mit akuten Koronarsyndromen einher (Berk BC, Weintraub WS, Alexander RW. Elevation of C-reactive protein in "active" coronary artery disease. Am J Cordial 1990; 65 (3) : 168-72,, Biasucci LM, Vitelli A, Liuzzo G, et al. Elevated levels of interleukin-6 in unstable angina. Circulation 1996; 94 (5) : 874-7,), sondern - was wichtiger ist - können auch eine Aussage über den klinischen Ausgang von Patienten mit akuten Koronarsyndromen vorhersagen (Liuzzo G, Biasucci LM, Gallimore JR, et al. The prognostic value of C-reactive protein and serum amyloid a protein in severe unstable angina. N Engl J Med 1994; 331 (7) : 417-24, Biasucci LM, Liuzzo G, Grillo RL, et al. Elevated levels of C-reactive protein at discharge in patients with unstable angina predict recurrent instability. Circulation 1999; 99 (7): 855-60, Toss H, Lindahl B, Siegbahn A, Wallentin L. Prognostic influence of increased fibrinogen and C-reactive protein levels in unstable coronary artery disease. FRISC Study Group. Fragmin during Instability in Coronary Artery Disease. Circulation 1997; 96 (12) : 4204-10,).The results obtained from the association between inflammation and arteriosclerosis form the rationale for using circulating inflammatory markers as potential predictive tools in patients with acute coronary syndromes. In fact, elevated levels of inflammatory markers, such as highly sensitive C-reactive protein (hsCRP), serum amyloid A, and interleukin-6 (IL-6) are not only common with acute Coronary syndromes (Berk BC, Weintraub WS, Alexander RW, Elevation of C-reactive protein in "active" coronary artery disease .J Cordial 1990; 65 (3): 168-72 ,, Biasucci LM, Vitelli A, Liuzzo G, Elevated levels of interleukin-6 in unstable angina, Circulation 1996; 94 (5): 874-7), but more importantly, can also predict the clinical outcome of patients with acute coronary syndromes (Liuzzo G , Biasucci LM, Gallimore JR, et al The prognostic value of C-reactive protein and serum amyloid a protein in severe unstable angina N Engl J Med 1994; 331 (7): 417-24, Biasucci LM, Liuzzo G, Grillo RL, et al., Elevated levels of C-reactive protein at discharge in patients with unstable angina predict recurrent instability., Circulation 1999; 99 (7): 855-60, Toss H, Lindahl B, Siegbahn A, Wallentin L. Prognostic influence of increased fibrinogen and C-reactive protein levels in unstable coronary artery disease, FRISC Study Group tability in Coronary Artery Disease. Circulation 1997; 96 (12): 4204-10,).
Obwohl das "klassische" akute Phase Protein hsCRP als der am meisten versprechende Biomarker für klinische Zwecke angesehen wird, besteht eine substantielle Heterogenität im Hinblick auf die Prävalenz von erhöhten hsCRP Spiegeln in Patienten mit akuten Koronarsyndromen (Biasucci LM, Liuzzo G, Colizzi C, Rizzello V. Clinical use of C-reactive protein for the prognostic stratification of patients with ischemic heart disease. Ital Heart J 2001; 2 (3) : 164-71,). So zeigen mehr als 30 % der Patienten mit schwerer instabiler Angina keine erhöhten hsCRP Spiegel (Liuzzo G, Biasucci LM, Gallimore JR, et al. The prognostic value of C- reactive protein and serum amyloid a protein in severe unstable angina. N Engl J Med 1994; 331 (7) : 417-24,, Heeschen C, Hamm CW, Bruemmer J, Simeons ML. Predictive value of C-reactive protein and troponin T in patients with unstable angina : a comparative analysis. CAPTURE Investigators. Chimeric c7E3 Anti Platelet Therapy in unstable angina refractory to Standard treatment trial. J Am Coli Cardiol 2000; 35 (6) : 1535-42,). Darüber hinaus können individuelle Unterschiede im Ausmaß der Antwort auf bestimmte entzündliche Stimuli möglicherweise die Spiegel der "stromabwärts" akute-Phase Reaktanten, wie hsCRP beeinflussen (Pepys MB, Hirschfield GM. C-reactive protein and its role in the pathogenesis of myocardial infarction. Ital Heart J2001,2(l l) : 804-6, Liuzzo G, Biasucci LM, Rebuzzi AG, et al. Plasma protein acute- phase response in unstable angina is not induced by ischemic injury. Circulation 1996; 94 (10) : 2373-80,). Daher besteht immer noch eine wichtige Herausforderung darin, proximale Stimuli für vaskuläre Entzündung zu identifizieren, die als Risiko- vorhersagende Serummarker in Patienten mit koronarer Arteriosklerose verwendet werden können.Although the "classic" acute phase protein hsCRP is considered to be the most promising biomarker for clinical purposes, there is substantial heterogeneity in the prevalence of elevated hsCRP levels in patients with acute coronary syndromes (Biasucci LM, Liuzzo G, Colizzi C, Rizzello V. Clinical use of C-reactive protein for the prognostic stratification of patients with ischemic heart disease, Ital Heart J 2001; 2 (3): 164-71,). Thus, more than 30% of patients with severe unstable angina do not show elevated hsCRP levels (Liuzzo G, Biasucci LM, Gallimore JR, et al., The prognostic value of C-reactive protein and serum amyloid a protein in severe unstable angina Med 1994; 331 (7): 417-24, Heeschen C, Hamm CW, Bruemmer J, Simeons ML Predictive value of C-reactive protein and troponin T in patients with unstable angina: a comparative analysis.CAPTURE Investigators., Chimeric c7E3 Anti Platelet Therapy in unstable angina refractory to standard treatment trial J Am Coli Cardiol 2000; 35 (6): 1535-42,). In addition, individual differences in the extent of response to certain inflammatory stimuli may possibly affect levels of "downstream" acute-phase reactants, such as hsCRP (Pepys MB, Hirschfield GM, C-reactive protein and its role in the pathogenesis of myocardial infarction Heart J2001.2 (II): 804-6, Liuzzo G, Biasucci LM, Rebuzzi AG, et al., Plasma protein acute-phase response in unstable angina is not induced by ischemic injury. Circulation 1996; 94 (10): 2373- 80). Therefore, there is still an important challenge in getting proximal stimuli for identify vascular inflammation that can be used as risk-predictive serum markers in patients with coronary arteriosclerosis.
Eine Thrombusbildung im Koronargefäß ist das auslösende Ereignis einer instabilen koronaren Herzerkrankung. Die zentrale Rolle der Plättchenaktivierung wird bei Patienten mit einer instabilen koronaren Herzerkrankung zusätzlich noch durch Thromboxan- und Prostaglandin- Metaboliten, die von den Plättchen freigesetzt werden, gefördert. Deshalb ist die Plättchenaktivierung ein allgemeines therapeutisches Ziel. Bisher haben derartige Therapien die Verwendung von Aspirin, Tienopyridinen und einem direkten Glycoprotein Ilb/lIIa-Inhibitor umfasst.Thrombus formation in the coronary vasculature is the triggering event of unstable coronary heart disease. The central role of platelet activation in patients with unstable coronary heart disease is further enhanced by thromboxane and prostaglandin metabolites released by the platelets. Therefore, platelet activation is a general therapeutic target. So far, such therapies have involved the use of aspirin, tienopyridines and a direct glycoprotein IIb / IIIa inhibitor.
Allerdings konnte ein zuverlässiger biochemischer Marker der Plättchenaktivierung bis heute nicht identifiziert werden. Ergebnisse mit P-Selektin, dem bisher aussichtsreichsten Marker für eine Plättchenaktivierung, sind bis heute kontrovers.However, a reliable biochemical marker of platelet activation has not been identified to date. Results with P-selectin, the most promising marker for platelet activation to date, are still controversial.
Der Ausschluss von akuten Myokardinfarkten (MI) nach heutigen Standards ist nicht zufrieden stellend. In den letzten Jahren hat eine Konzentration auf die Risikostratifizierung und Steuerung der Behandlung stattgefunden mit dem Ziel, Patienten zu identifizieren, bei denen das Risiko besteht, lebensbedrohliche kardiologische Ereignisse zu entwickeln, und die vor allem von verbesserten therapeutischen und intervenierenden Strategien profitieren (Hamm CW, Bertrand M, Braunwald E. Lancet 2001; 358: 1533-8). Das EKG hat in dieser Hinsicht nur begrenzte prognostische Relevanz, da bedeutende Abnormitäten selten sind und ihr Nachweis wenig empfindlich und spezifisch ist (Kaul P, Fu Y, Chang WC, et al., J Am Coli Cardiol 2001; 38 : 64- 71 und Savonitto S, Ardissino D, Granger CB, et al. JAMA 1999; 281: 707-13). Deshalb haben sich Marker einer Nekrose von Myokardzellen, vor allem kardiale Troponine, zu wertvollen Werkzeugen bei der Evaluierung von Patienten mit akuten koronaren Syndromen entwickelt (Hamm CW, Braunwald E. Circulation 2000; 102 : 118-22). Troponine sind allerdings nicht aktiv an der Pathophysiologie akuter koronarer Syndrome beteiligt, sondern stellen eher eine Art Surrogat-Marker für die fragile Thrombusbildung dar (Lindahl B, Diderholm E, Lagerqvist B, Venge P, Wallentin L. J Am Coli Cardio. 2001; 38 : 979-86, Heeschen C, van Den Brand MJ, Hamm CW, Simoons ML. Circulation 1999; 100:1509-14; Benamer H, Steg PG, Benessiano J, et al.. Am Heart J 1999;137 : 815-20).The exclusion of acute myocardial infarction (MI) by today's standards is unsatisfactory. In recent years, a focus has been placed on risk stratification and control of treatment with the aim of identifying patients at risk of developing life-threatening cardiac events and, above all, benefiting from improved therapeutic and interventional strategies (Hamm CW. Bertrand M, Braunwald E. Lancet 2001; 358: 1533-8). The ECG has only limited prognostic relevance in this respect, as significant abnormalities are rare and their detection is less sensitive and specific (Kaul P, Fu Y, Chang WC, et al., J Am Coli Cardiol 2001; 38: 64-71 and Savonitto S, Ardissino D, Granger CB, et al JAMA 1999; 281: 707-13). Therefore, markers of necrosis of myocardial cells, especially cardiac troponins, have become valuable tools in the evaluation of patients with acute coronary syndromes (Hamm CW, Braunwald E. Circulation 2000, 102: 118-22). However, troponins are not actively involved in the pathophysiology of acute coronary syndromes, but are rather a surrogate marker of fragile thrombus formation (Lindahl B, Diderholm E, Lagerqvist B, Venge P, Wallentin L. J Am Coli Cardio, 2001; : 979-86, Heeschen C, van den Brand MJ, Hamm CW, Simoon ML. Circulation 1999; 100: 1509-14; Benamer H, Steg PG, Benessiano J, et al. Am Heart J 1999; 137: 815-20).
Entzündungsmarker, welche die Aktivität der Erkrankung bestimmen, möglichst bevor eine Myokardnekrose auftritt, könnten wichtige zusätzliche Informationen für die diagnostische und therapeutische Stratifizierung bei Patienten mit akuten Koronarsyndromen darstellen. Die spezifische therapeutische Inhibierung von Cytokinen, die für die Plaque-Stabilität wesentlich sind, mag eine neue Behandlungsstrategie für Patienten mit instabiler und stabiler koronarer Herzerkrankung sein.Inflammatory markers that determine the activity of the disease, preferably before myocardial necrosis occurs, could be important additional information for diagnostic and therapeutic stratification in patients with acute coronary syndromes. The specific therapeutic inhibition of cytokines that are essential for plaque stability may be a new treatment strategy for patients with unstable and stable coronary heart disease.
Im Stand der Technik finden sich viele verschiedene molekulare Marker, die für die Diagnose einer kardiovaskulären Erkrankung geeignet sein können. Beispiele solcher Marker sind unter anderem: Schwangerschaft-assoziiertes Plasma Protein A (PAPP-A); C-reaktives Protein (CRP); hs-CRP; plazentaler Wachstumsfaktor(PlGF); Interleukin-18 (IL-18/IL-18b); Hirn natriuretisches Peptid (BNP); NT-pro Hirn natriuretisches Peptid (NT-pro NP); sCD40L, cTnl/T, IL-10, ICAM-I, VCAM-I, E-Selektin, P-Selektin, IL-6, VEGF, Serum Amyloid A (SAA), CKMB, MPO, ILl-RA, TAFl, lösliches Fibrin, MCP-I, Gewebefaktor (TF), MMP-9, bFGF, PCM und VEGF-A.There are many different molecular markers in the art which may be useful in the diagnosis of cardiovascular disease. Examples of such markers include: Pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A); C-reactive protein (CRP); hs-CRP; placental growth factor (PlGF); Interleukin-18 (IL-18 / IL-18b); Brain natriuretic peptide (BNP); NT-per brain natriuretic peptide (NT-pro NP); sCD40L, cTnI / T, IL-10, ICAM-I, VCAM-I, E-selectin, P-selectin, IL-6, VEGF, serum amyloid A (SAA), CKMB, MPO, ILI-RA, TAFl, soluble Fibrin, MCP-I, Tissue Factor (TF), MMP-9, bFGF, PCM and VEGF-A.
Das Endothel spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des vaskulären Tonus. Ein Faktor von großer Wichtigkeit für die Aufrechterhaltung der endothelialen Homeostase ist Stickoxid. Das Substrat für die endotheliale Stickoxidsynthese ist die Aminosäure L-Arginin. Das Endothel ist auch in der Lage, methylierte Aminosäuren, wie zum Beispiel asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), zu produzieren, die in der Lage sind, mit L-Arginin als ein Substrat für die endotheliale Stickoxidsynthase kompetitiv zu sein, was zu endothelialer Dysfunktion führt (für eine Zusammenfassung, siehe Cooke JP, 2000). Es haben sich Hinweise darauf ergeben, dass zirkulierende Spiegel von asymmetrischem Dimethylarginin in Patienten mit kardiovaskulären Risikofaktoren und Nierenversagen erhöht sind.The endothelium plays an important role in the regulation of vascular tone. One factor of great importance for the maintenance of endothelial homeostasis is nitric oxide. The substrate for endothelial nitric oxide synthesis is the amino acid L-arginine. The endothelium is also capable of producing methylated amino acids, such as asymmetric dimethylarginine (ADMA), which are capable of being competitive with L-arginine as a substrate for endothelial nitric oxide synthase, resulting in endothelial dysfunction ( for a summary, see Cooke JP, 2000). There has been some evidence that circulating levels of asymmetric dimethylarginine are elevated in patients with cardiovascular risk factors and kidney failure.
Resistin ist ein Cytokin, das von Adipozyten exprimiert wird. Die Funktion liegt vor allem in der Antagonisierung des Insulineffekts und der Beeinträchtigung der Glukosetoleranz. Mehrere Untersuchungen haben gezeigt, dass die extrazelluläre Matrixdegradation durch Gewebe-Matrix Metalloproteinasen (MMPs), insbesondere MMP-9 an der Pathogenese eines weiten Spektrums von kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt ist, einschließlich Arteriosklerose, Restenose, Kardiomyopathie, kongestivem Herzversagen, Myokardinfarkt und aortischer Aneurysmie (Dollery, 1995; Benjamin, 2001). Spiegel von zirkulierender MMP-9 sind mit zukünftigen kardiovaskulären Ereignissen assoziiert (Blankenberg, 2003).Resistin is a cytokine expressed by adipocytes. The main function is antagonizing the insulin effect and impairing glucose tolerance. Several studies have shown that extracellular matrix degradation by tissue-matrix metalloproteinases (MMPs), particularly MMP-9, is involved in the pathogenesis of a wide range of cardiovascular diseases, including arteriosclerosis, restenosis, cardiomyopathy, congestive heart failure, myocardial infarction and aortic aneurysm (Dollery , Benjamin, 2001). Levels of circulating MMP-9 are associated with future cardiovascular events (Blankenberg, 2003).
Die MMP Aktivität wird durch endogene Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs) kontrolliert, von denen es vier bekannte Familienmitglieder gibt (Nagase, 1996; Liu, 2003). TIMP-I ist einer der am besten charakterisierten TIMPs, der mit hoher Affinität an aktivierte MMPs bindet. TIMP-I scheint eine wichtige Rolle in der Regulation der linken Ventrikelstruktur und systolischen Funktion zu haben (Li, 1998; Timms, 2002) und Plasma TIMP-I Spiegel sind in koronarer Erkrankung erhöht (Hirohata, 1997). In der Framingham Herzstudie war gesamt- TIMP-I mit bedeutenden kardiovaskulären Risikofaktoren assoziiert (Sundstrom, 2004). Jedoch wurde die direkte mechanistische Rolle von MMPs und TIMPs in dem post-MI Remodellingprozeß nicht vollständig etabliert.MMP activity is controlled by endogenous tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), of which there are four known family members (Nagase, 1996, Liu, 2003). TIMP-I is one of the best characterized TIMPs that binds to activated MMPs with high affinity. TIMP-I appears to play an important role in the regulation of left ventricular structure and systolic function (Li, 1998, Timms, 2002) and plasma TIMP-I levels are elevated in coronary disease (Hirohata, 1997). In the Framingham Heart Study, total TIMP-I was associated with significant cardiovascular risk factors (Sundstrom, 2004). However, the direct mechanistic role of MMPs and TIMPs has not been fully established in the post-MI remodeling process.
Caspasen weisen Funktionen in apoptotischen Signalwegen auf. Die primäre Rolle von Caspase- 1 ist jedoch die Regulation von entzündlichen Prozessen. In 1995 wurde die co-Lokalisierung von Caspase-1 mit apoptotischen Zellen in fortgeschrittenen menschlichen Plaques berichtet. An Stellen der Plaqueruptur wurde eine fokale Apoptose von Makrophagen mit einer extensiven Expression von Caspase-1 nachgewiesen und mit plötzlichem Herztod assoziiert.Caspases have functions in apoptotic signaling pathways. However, the primary role of caspase-1 is the regulation of inflammatory processes. In 1995 co-localization of caspase-1 with apoptotic cells in advanced human plaques was reported. At sites of plaque rupture, focal apoptosis of macrophages with extensive expression of caspase-1 was detected and associated with sudden cardiac death.
Einige der oben genannten Marker sind somit bekannte und charakterisierte Marker für die Untersuchung von koronaren Erkrankungen, andere wurden bisher jedoch noch nicht entsprechend untersucht.Some of the above-mentioned markers are thus known and characterized markers for the investigation of coronary diseases, but others have not yet been adequately investigated.
Fast alle angegebenen Marker besitzen einen diagnostischen Wert im Hinblick auf bestimmte kardiovaskuläre Vorfälle. Zum Beispiel ist TnT von besonderem Wert für die Diagnose und die Vorhersage von MI (siehe oben). Entzündliche Marker wie CRP sind für die Diagnose und Vorhersage von einer Entzündung wertvoll, die zu einer Plaqueruptur und MI fuhren kann.Almost all indicated markers have a diagnostic value with regard to certain cardiovascular events. For example, TnT is of particular value for the diagnosis and the Prediction of MI (see above). Inflammatory markers such as CRP are valuable for the diagnosis and prediction of inflammation, which can lead to plaque rupture and MI.
Viele der oben genannten Marker besitzen einen diagnostischen Wert für kardiovaskulären Erkrankungen. Die Verwendung einer Kombination von Markern wurde jedoch nur sehr zurückhaltend beschrieben.Many of the above-mentioned markers have a diagnostic value for cardiovascular diseases. However, the use of a combination of markers has been described with great caution.
Lund et al. in Circulation. 2003,108 : 1924-1926, beschreiben die Kombination von PAPP-A mit TnI (Troponin I); Peng et al. in Clinica Chimica Acta 319 (2002) 19-26, beschreiben die Kombination von sCD40L mitsICAM-1 und sVCAM-1. Lenderink et al. in European Heart Journal (2003) 24,77-85, beschreiben die Kombination von TnT mit CRP. Heeschen et al. in Journal of the American College of Cardiology; Vol. 35, No. 6,2000, erwähnen die Kombination von TnT mit CRP.Lund et al. in circulation. 2003, 108: 1924-1926, describe the combination of PAPP-A with TnI (troponin I); Peng et al. in Clinica Chimica Acta 319 (2002) 19-26, describe the combination of sCD40L with ICAM-1 and sVCAM-1. Lenderink et al. in European Heart Journal (2003) 24, 77-85 describe the combination of TnT with CRP. Heeschen et al. in Journal of the American College of Cardiology; Vol. 35, no. 6.2000, mention the combination of TnT with CRP.
Heeschen et al. in Circulation. 2003; 107 : 2109-2114, beschreiben die Kombination von TnT, CRP und IL-10, Blankenberg et al. in Circulation. 2002; 106 : 24-30, beschreiben die Kombination von CRP und IL-6, Autiero et al. in Journal of Thrombosis and Haemostasis, 1 :1356-1370, beschreiben die Kombination von PlGF und VEGF.Heeschen et al. in circulation. 2003; 107: 2109-2114, describe the combination of TnT, CRP and IL-10, Blankenberg et al. in circulation. 2002; 106: 24-30, describe the combination of CRP and IL-6, Autiero et al. in Journal of Thrombosis and Haemostasis, 1: 1356-1370, describe the combination of PlGF and VEGF.
Jedoch ist das Potential der verbesserten Analyse durch die Kombination bis jetzt weder untersucht, noch wurde die Entwicklung gezielter überlegener Marker-Tests abgeschlossen. Welche Marker sich zu einer effektiven Diagnose eignen, lässt sich somit aus den oben genannten Dokumenten nicht ohne weiteres erschließen.However, the potential of the improved analysis by the combination has not been studied, nor has the development of targeted superior marker assays been completed. Which markers are suitable for an effective diagnosis can thus not easily be deduced from the above-mentioned documents.
Zusammengefasst wird die kardiovaskuläre Risikostratifizierung zur Zeit mittels klassischer Risikofaktoren und diversen Risikorechnern (Framingham/PROCAM) durchgeführt. In letzter Zeit wurde zunehmend diskutiert, inwieweit hoch sensitives C-reaktives Protein (CRP) als Marker der Entzündung eine genauere Risikostratifizierung ermöglicht. Die Assoziation zwischen verschiedenen Markern der Entzündung (CRP, Interleukin-6 oder lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekül- 1) und zukünftigem kardiovaskulären Risiko wurde bereits in mehreren Studien bestätigt. Die bekannten Lösungen, d.h. die Ermittlung des kardiovaskulären Risikos mittels traditioneller Risikofaktoren, besitzen jedoch eine weniger als 50%ige Sensitivität und Spezifität. Gleiches gilt für die Diagnose des akuten Koronarsyndroms: EKG und Troponin sowie CK- Wert Bestimmungen bieten keine 100%ige Diagnosesicherheit für das akute Koronarsyndrom.In summary, cardiovascular risk stratification is currently performed using classical risk factors and various risk calculators (Framingham / PROCAM). Recently, it has been increasingly discussed to what extent highly sensitive C-reactive protein (CRP) as a marker of inflammation enables more accurate risk stratification. The association between different markers of inflammation (CRP, interleukin-6 or soluble intercellular adhesion molecule-1) and future cardiovascular risk has been confirmed in several studies. However, the known solutions, ie the determination of the cardiovascular risk by means of traditional risk factors, have less than 50% sensitivity and specificity. The same applies to the diagnosis of acute coronary syndrome: ECG and troponin as well as CK value determinations do not provide 100% diagnostic accuracy for the acute coronary syndrome.
Im Hinblick auf das oben Genannte ist es somit eine. Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem die Möglichkeit der Risikostratifizierung der Koronaren Herzerkrankung durch die Bestimmung bestimmter Einzelmarker und/oder eines bestimmten „Markerpanels" bestehend aus Biomarkern der Entzündung verbessert wird. Weiterhin soll die Diagnosemöglichkeit des „Akuten Koronarsyndroms" erweitert werden.In view of the above, it is thus one. The object of the present invention is to provide a method by which the possibility of risk stratification of coronary heart disease is improved by the determination of specific individual markers and / or a specific "marker panel" consisting of biomarkers of inflammation be extended.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist weiterhin, ein Verfahren zur Evaluierung der Wahrscheinlichkeit, dass eine Behandlung mit einem Wirkstoff zur Hemmung der Plättchenaktivierung von Vorteil ist, zu entwickeln. Mit Hilfe dieses Verfahren soll der behandelnden Arzt besser als bisher in die Lage versetzt wer- den, geeignete Maßnahmen auswählen zu können, um den Patienten positiv zu beeinflussen, ein nachteiliges Ereignis zu verhindern oder zumindest in seiner Schwere für den betroffenen Patienten zu vermindern.It is another object of the present invention to develop a method for evaluating the likelihood that treatment with an agent to inhibit platelet activation is beneficial. With the aid of this method, the attending physician should be better able than before to be able to select suitable measures in order to positively influence the patient, to prevent a disadvantageous event or at least to lessen its severity for the affected patient.
In einem ersten Aspekt davon wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zur Analyse von Proben in Zusammenhang mit akuten kardiovaskulären Erkrankungen gelöst. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Schritte von:In a first aspect thereof, the object of the present invention is achieved by a method for the analysis of samples in connection with acute cardiovascular diseases. The process according to the invention comprises the steps of:
(a) Zur Verfügung stellen einer zu untersuchenden biologischen Probe aus einem Subjekt;(a) providing a biological sample to be examined from a subject;
(b) Bestimmen der Konzentration von mindestens einem Entzündungsmarker, ausgewählt aus Fibrinogen, sTNFR-2, IL- 18, ADMA, Caspase-1, TIMP-I, Resistin und sVCAM-1,(b) determining the concentration of at least one inflammatory marker selected from fibrinogen, sTNFR-2, IL-18, ADMA, caspase-1, TIMP-I, resistin and sVCAM-1,
(c) gegebenenfalls, Bestimmen der Konzentration mindestens eines weiteren Marker ausgewählt aus sTNFR-1, Troponin T (TnT), IL-6, sILl-RA, CRP, lösliches Interzelluläres Adhäsionsmolekül- 1, lösliches vaskuläres Adhäsionsmolekül- 1, lösliches E-Selektin, Matrix- Metalloproteinase-9, CD40, Lipoprotein-assoziierte Phospholipase A2 und weiteren entzündlichen Markern, und (d) Vergleich des/der für die zu untersuchende Probe erhaltenen Ergebnisse/s mit Referenzwerten und/oder den Werten aus Referenzproben.(c) optionally, determining the concentration of at least one further marker selected from sTNFR-1, troponin T (TnT), IL-6, sILI-RA, CRP, soluble intercellular adhesion molecule-1, soluble vascular adhesion molecule-1, soluble E-selectin , Matrix metalloproteinase-9, CD40, lipoprotein-associated phospholipase A2 and other inflammatory markers, and (d) Comparison of the results obtained for the sample to be tested / s with reference values and / or the values from reference samples.
Diese Erfindung hat zum Inhalt, dass verschiedene Marker der Entzündung (löslicher Tumor Nekrose Faktor - Rezeptor 1 und 2 (sTNFR-1 und sTNFR-2), löslicher Interleukin-1 Rezeptor Antagonist (sILl-RA), Interleukin-18 (IL- 18), lösliches Interzelluläres Adhäsionsmolekül- 1, lösliches vaskuläres Adhäsionsmolekül- 1, lösliches E-Selektin, Matrix-Metalloproteinase-9, Interleukin-6 (IL-6), Fibrinogen, ADMA, Caspase-1, TIMP-I, Resistin, sVCAM-1 und C- reaktives Protein (CRP)) eine Vorhersage des kardiovaskulären Risikos ermöglichen. Diese Marker beinhalten einerseits das Potential, ein akutes Koronarsyndrom zu diagnostizieren; andererseits kann anhand dieser Marker wie auch eines speziell gebildeten „Markerclusters" das Risiko, einen fatalen oder nicht-fatalen Myokardinfarkt zu erleiden, abgeschätzt werden. Diese Risikoabschätzung erweitert diejenige, welche zur Zeit mit klassischen Risikofaktoren möglich ist.This invention contemplates that various markers of inflammation (soluble tumor necrosis factor - receptor 1 and 2 (sTNFR-1 and sTNFR-2), soluble interleukin-1 receptor antagonist (sIL1-RA), interleukin-18 (IL-18 ), soluble intercellular adhesion molecule-1, soluble vascular adhesion molecule-1, soluble E-selectin, matrix metalloproteinase-9, interleukin-6 (IL-6), fibrinogen, ADMA, caspase-1, TIMP-I, resistin, sVCAM- 1 and C-reactive protein (CRP)) allow predicting the cardiovascular risk. On the one hand, these markers have the potential to diagnose an acute coronary syndrome; On the other hand, these markers, as well as a specially designed "marker cluster", can be used to estimate the risk of suffering a fatal or non-fatal myocardial infarction, which extends the risk assessment currently available with classical risk factors.
Dabei wurden unter anderem akute Phase Reaktanten (C-reaktives Protein, Fibrinogen und Interleukin-6), proinflammatorische Cytokine und lösliche Rezeptoren (Tumornekrosefaktor- Rezeptoren 1 und 2, löslicher Interleukin-1 Rezeptorantagonist und Interleukin-18), lösliche Adhäsionsmoleküle (interzelluläres Adhäsionsmolekül- 1, vaskuläres Adhäsionsmolekül- 1, lösliches E-Selektin) und Matrixmetalloρroteinase-9 ausgewählt.Among others, acute phase reactants (C-reactive protein, fibrinogen and interleukin-6), pro-inflammatory cytokines and soluble receptors (tumor necrosis factor receptors 1 and 2, soluble interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-18), soluble adhesion molecules (intercellular adhesion molecules) were investigated. 1, vascular adhesion molecule-1, soluble E-selectin) and matrix metalloproteinase-9.
Eine Vielzahl entzündlicher Biomarker ist mit der kardiovaskulären Prognose assoziiert. Besonders stark ist ein inflammatorischer Wert bestehend aus der parallelen Bestimmung von 8 Biomarkem der Entzündung (TIMP-I, ADMA, Resistin, Casρase-1, sTNFR-2, IL-18, sVCAM-1, Fibrinogen) mit dem Risiko eines zukünftigen kardiovaskulären Ereignisses assoziiert.A variety of inflammatory biomarkers are associated with cardiovascular prognosis. Particularly high is an inflammatory value consisting of the parallel determination of 8 biomarkers of inflammation (TIMP-I, ADMA, Resistin, caspase-1, sTNFR-2, IL-18, sVCAM-1, fibrinogen) with the risk of a future cardiovascular event associated.
Weiter bevorzugt ist die gefundene Assoziierung der Einzelmarker Caspase-1 und sTNFR-2 mit dem zukünftigen myokardialen Ereignis. Ebenfalls erstmals wird ein inflammatorisches Markerpanel als starker und unabhängiger Prädiktor des kardiovaskulären Risikos beschrieben. Entzündliche Gefäßwandprozesse sind ursächlich an der Destabilisierung der arteriosklerotischen Plaques und der Verstärkung der der Thrombusbildung beteiligt. Diese Ergebnisse haben die Suche nach zirkulierenden biochemische Markern ausgelöst, die die entzündliche Aktivität innerhalb der vaskulären Wand widerspiegeln. Zusätzlich zu Fibrinogen, dem ersten entzündlichen Biomarker, der mit zukünftigem kardiovaskulärem Risiko in Zusammenhang gebracht wurde, wurde das C-reaktive Protein am meisten untersucht. Seine klinische Brauchbarkeit wurde jedoch kürzlich bezweifelt. Andere (pro)inflammatorische Marker, wie z.B. Interleukin-6, lösliche Adhäsionsmoleküle, Interleukin-18 oder Lipoprotein-assoziierte Phospholipase A2 sind ebenfalls aufkommende potentielle Werkzeuge für eine kardiovaskuläre Risiko-Vorhersage.Further preferred is the association found of the single markers caspase-1 and sTNFR-2 with the future myocardial event. Also for the first time, an inflammatory marker panel is described as a strong and independent predictor of cardiovascular risk. Inflammatory vascular wall processes are causally involved in destabilizing arteriosclerotic plaques and enhancing thrombus formation. These results have triggered the search for circulating biochemical markers that reflect inflammatory activity within the vascular wall. In addition to fibrinogen, the first inflammatory biomarker associated with future cardiovascular risk, C-reactive protein has been the most widely studied. However, its clinical usefulness has recently been doubted. Other (pro) inflammatory markers such as interleukin-6, soluble adhesion molecules, interleukin-18 or lipoprotein-associated phospholipase A2 are also potential emerging tools for cardiovascular risk prediction.
Um zu ermitteln, ob die gleichzeitige Untersuchung von ausgewählten inflammatorischen Markera eine zusätzliche Information gegenüber den klassischen Risikofaktoren und einzelnen Markern ergibt, analysierten die Erfinder mehrere zirkulierende entzündlichen Biomarker in einer großen Kohorte von Patienten mit koronarer Herzerkrankung. Die Erfinder wählten dafür unter anderem akute Phase Reaktanten (C-reaktives Protein, Fibrinogen und Interleukin-6), proinflammatorische Cytokine und lösliche Rezeptoren (Tumornekrosefaktor-Rezeptoren 1 und 2, löslicher Interleukin-1 Rezeptorantagonist und Interleukin-18), lösliche Adhäsionsmoleküle (interzelluläres Adhäsionsmolekül- 1, vaskuläres Adhäsionsmolekül- 1, lösliches E-Selektin) und Matrixmetalloproteinase-9 aus.To determine whether concurrent examination of selected inflammatory markers provides additional information against the classic risk factors and individual markers, the inventors analyzed several circulating inflammatory biomarkers in a large cohort of patients with coronary heart disease. The inventors selected among others acute phase reactants (C-reactive protein, fibrinogen and interleukin-6), proinflammatory cytokines and soluble receptors (tumor necrosis factor receptors 1 and 2, soluble interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-18), soluble adhesion molecules (intercellular Adhesion molecule-1, vascular adhesion molecule-1, soluble E-selectin) and matrix metalloproteinase-9.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde evaluiert, welche Basislinien-Spiegel dieser entzündlichen Biomarker unabhängig mit dem zukünftigen Risiko kardiovaskulärer Erkrankung assoziiert sind und ob die gleichzeitige Untersuchung von speziellen inflammatorischen Markern eine verbesserte Fähigkeit ergab, hoch-Risikopatienten außerhalb klassischer Risikofaktoren und einzelner Marker Bestimmung zu identifizieren.In the context of the present invention, it was evaluated which baseline levels of these inflammatory biomarkers are independently associated with the future risk of cardiovascular disease, and whether the simultaneous study of specific inflammatory markers revealed an improved ability to identify high-risk patients outside of classical risk factors and single marker determination ,
Die zur Analyse im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Marker sind zum größten Teil aus dem Stand der Technik gut bekannte und charakterisierte Marker, die jedoch bisher immer noch unzureichend für die Verwendung zur Diagnose einer akuten kardiovaskulären Erkrankung charakterisiert waren. So sind das C-reaktive Protein (CRP) und hsCRP als Marker der systemischen Entzündung, Troponin cTnl/T als Marker für Nekrose; das Schwangerschaft assoziierte Plasmaprotein A (PAPP-A) als Marker für Makrophagen Aktivierung; IL-IO (Interleukin 10) als Marker für die inflammatorische Balance, sCD40L als Marker für die Thrombo-inflammatorische Aktivierung, MPO (Myeloperoxidase) als Marker für oxidativen Stress, der plazentale Wachstumsfaktor (PlGF) als Marker für vaskuläre Entzündung und die Marker Hirn natriuretisches Peptid (BNP) und NT-pro Hirn natriuretisches Peptid (NT-proNP) als Marker neurohumoraler Aktivierung und der Ischämie charakterisiert. Andere ähnliche und auch verwendbare Marker sind Interleukin- 18 (IL-18/IL-18b), ICAM- 1,VCAN-I, E-Selektin, P-Selektin, IL-6, VEGF, Serum Amyloid A (SAA), CKMB, IL-I-RA, TAF-I, lösliches Fibrin, MCP-I5 Gewebefaktor (TF), MMP-9, bFGF, PCM und VEGF-A.The markers used for analysis in the present invention are, for the most part, markers well known and characterized in the art, but which have heretofore still been insufficiently characterized for use in the diagnosis of acute cardiovascular disease. Thus, C-reactive protein (CRP) and hsCRP are markers of systemic inflammation, troponin cTnl / T as a marker of necrosis; the pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A) as a marker for macrophage activation; IL-10 (interleukin 10) as marker for the inflammatory balance, sCD40L as marker for the thrombo-inflammatory activation, MPO (myeloperoxidase) as marker for oxidative stress, placental growth factor (PlGF) as marker for vascular inflammation and the markers brain natriuretic Peptide (BNP) and NT-pro brain natriuretic peptide (NT-proNP) as markers of neurohumoral activation and ischemia. Other similar and also useful markers are interleukin-18 (IL-18 / IL-18b), ICAM-1, VCAN-I, E-selectin, P-selectin, IL-6, VEGF, serum amyloid A (SAA), CKMB , IL-I-RA, TAF-I, soluble fibrin, MCP-I 5 Tissue Factor (TF), MMP-9, bFGF, PCM and VEGF-A.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die zu untersuchende Probe und/oder die Referenzprobe aus einem Säugetier, insbesondere aus dem Menschen, stammen. Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die zu untersuchende Probe und/oder die Referenzprobe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus peripherem Blut oder Fraktionen davon und Zellkultur-Suspensionen oder Fraktionen davon. Bevorzugt ist weiterhin, dass die untersuchende Probe und/oder Referenzprobe Blutserum oder Blutplasma ist. Besonders bevorzugt ist peripheres Vollblut als zu untersuchende Probe und/oder Referenzprobe.Preferred is a method according to the invention, wherein the sample to be examined and / or the reference sample originate from a mammal, in particular from humans. Further preferred is a method according to the invention, wherein the sample to be examined and / or the reference sample is selected from the group consisting of peripheral blood or fractions thereof and cell culture suspensions or fractions thereof. It is furthermore preferred that the examining sample and / or reference sample is blood serum or blood plasma. Peripheral whole blood is particularly preferred as the sample to be examined and / or the reference sample.
Gemäß einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die zu untersuchende Probe und/oder die Referenzprobe vorbehandelt sein, wobei dem peripheren Blut z. B. ein Gerinnungshemmer, insbesondere Heparin, zugesetzt wird.According to a further aspect of the method according to the invention, the sample to be examined and / or the reference sample can be pretreated, wherein the peripheral blood z. As a anticoagulant, especially heparin, is added.
Erfindungsgemäß konnte überraschenderweise gefunden werden, dass neben der Einzelanalyse verschiedener der oben genannten Marker zur Diagnose oder der Verfolgung akuter kardialer Ereignisse auch Kombinationen von solchen Markern möglich sind, die eine erheblich verbesserte Analyse ermöglichen. Als besonders bevorzugt haben sich dabei Kombinationen von Markern erwiesen, die verschiedene Aspekte des nachteiligen kardialen Ereignisses betreffen, sich aber gleichzeitig (also simultan oder in einer mehr oder weniger zeitlich beanstandeten Messreihe) analysieren lassen.According to the invention, it has surprisingly been found that, in addition to the individual analysis of various of the abovementioned markers for the diagnosis or the monitoring of acute cardiac events, combinations of such markers are also possible which enable a considerably improved analysis. Combinations of markers which relate to various aspects of the adverse cardiac event have proven to be particularly preferred. but at the same time (ie simultaneously or in a more or less time-challenged series of measurements) can be analyzed.
Gemäß einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die analysierten Marker und Kombinationen daraus ausgewählt aus:According to a further aspect of the method according to the invention, the analyzed markers and combinations thereof are selected from:
Fibrinogen + sTNFR-2, Fibrinogen + IL- 18, Fibrinogen + sVCAM-1, Fibrinogen + ADMA, Fibrinogen + Caspase-1, Fibrinogen + TIMP-I, Fibrinogen + Resistin, sTNFR-2 + IL-18, sTNFR-2 + sVCAM-1, sTNFR-2 + ADMA, sTNFR-2 + Caspase-1, sTNFR-2 + TIMP-I, sTNFR-2 + Resistin, IL-18 + sVCAM-1, IL-18 + ADMA, IL-18 + Caspase-1, IL-18 + TIMP-I, IL-18 + Resistin, sVCAM-1 + ADMA, sVCAM-1 + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-I, sVCAM-1 + Resistin, ADMA + Caspase-1, ADMA + TIMP-I, ADMA + Resistin, Caspase-1 + TIMP-I, Casapse-1 + Resistin, TIMP-I + Resistin,Fibrinogen + sTNFR-2, fibrinogen + IL-18, fibrinogen + sVCAM-1, fibrinogen + ADMA, fibrinogen + caspase-1, fibrinogen + TIMP-I, fibrinogen + resistin, sTNFR-2 + IL-18, sTNFR-2 + sVCAM-1, sTNFR-2 + ADMA, sTNFR-2 + caspase-1, sTNFR-2 + TIMP-I, sTNFR-2 + resistin, IL-18 + sVCAM-1, IL-18 + ADMA, IL-18 + Caspase-1, IL-18 + TIMP-I, IL-18 + Resistin, sVCAM-1 + ADMA, sVCAM-1 + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-I, sVCAM-1 + Resistin, ADMA + Caspase- 1, ADMA + TIMP-I, ADMA + Resistin, Caspase-1 + TIMP-I, Casapse-1 + Resistin, TIMP-I + Resistin,
Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18, Fibrinogen + sVCAM-1 + IL-18, Fibrinogen + ADMA + IL-18, Fibrinogen + Caspase-1 + IL-18, Fibrinogen + TIMP-I + IL-18, Fibrinogen + Resistin + IL-18, sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1, sTNFR-2 + ADMA + s VCAM-I, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1, sTNFR-2 + TIMP-I + sVCAM-1, sTNFR-2 + Resistin + sVCAM-1, IL-18 + s VCAM-I + ADMA, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, IL-18 + TIMP-I + ADMA, IL-18 + Resistin + ADMA, sVCAM-1 + ADMA + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-I + Caspase-1, sVCAM-1 + Resistin + Caspase-1, ADMA + Caspase-1 + TIMP-I, ADMA + Resistin + TIMP-I, Caspase-1 + TIMP-I + Resistin,Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18, fibrinogen + sVCAM-1 + IL-18, fibrinogen + ADMA + IL-18, fibrinogen + caspase-1 + IL-18, fibrinogen + TIMP-I + IL-18, fibrinogen + Resistin + IL-18, sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1, sTNFR-2 + ADMA + s VCAM-I, sTNFR-2 + caspase-1 + sVCAM-1, sTNFR-2 + TIMP-I + sVCAM -1, sTNFR-2 + Resistin + sVCAM-1, IL-18 + s VCAM-I + ADMA, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, IL-18 + TIMP-I + ADMA, IL-18 + Resistin + ADMA, sVCAM-1 + ADMA + caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-I + caspase-1, sVCAM-1 + resistin + caspase-1, ADMA + caspase-1 + TIMP-I, ADMA + resistin + TIMP- I, Caspase-1 + TIMP-I + Resistin,
Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1, Fibrinogen + ADMA + IL-18 + Caspase-1, Fibrinogen + TIMP-I + IL-18 + Resistin, sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-I, sTNFR-2 + Resistin + sVCAM-1 + IL18, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, + TIMP-I, IL-18 + Resistin + ADMA + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-I + Caspase-1 + Resistin, ADMA + Caspase-1 + TIMP-I + Resistin,Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1, fibrinogen + ADMA + IL-18 + caspase-1, fibrinogen + TIMP-I + IL-18 + resistin, sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-I, sTNFR-2 + Resistin + sVCAM-1 + IL18, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, + TIMP-I, IL-18 + Resistin + ADMA + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-I + Caspase-1 + Resistin, ADMA + Caspase-1 + TIMP-I + Resistin,
Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + s VCAM-I + ADMA, Fibrinogen + TIMP-I + IL-18 + Resistin + sTNFR-2, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-I + sTNFR-2, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, + TIMP-I + Resistin, s VCAM-I + TIMP-I + Caspase-1 + Resistin + ADMA, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA + TIMP-I, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-I + sTNFR-2 + IL-18, Fibrinogen + sVCAM-1 + TIMP-I + Caspase-1 + Resistin + ADMA, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + s VCAM-I + ADMA + TIMP-I + Caspase-Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + s VCAM-I + ADMA, fibrinogen + TIMP-I + IL-18 + resistin + sTNFR-2, sTNFR-2 + caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-I + sTNFR -2, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, + TIMP-I + Resistin, s VCAM-I + TIMP-I + Caspase-1 + Resistin + ADMA, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA + TIMP-I, sTNFR-2 + caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-I + sTNFR-2 + IL-18, fibrinogen + sVCAM-1 + TIMP-I + caspase-1 + Resistin + ADMA, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + s VCAM-I + ADMA + TIMP-I + Caspase-
1, Fibrinogen + sVCAM-1 + TIMP-I + Caspase-1 + Resistin + ADMA + sTNFR-2 und Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + ADMA + Caspase-1 + TIMP-I + Resistin + sVCAM-1,1, fibrinogen + sVCAM-1 + TIMP-I + caspase-1 + resistin + ADMA + sTNFR-2 and fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + ADMA + caspase-1 + TIMP-I + resistin + sVCAM-1,
Bevorzugt ist dann die weitere Kombination mit mindestens einem weiteren der Marker ausgewählt aus sTNFR-1, Troponin T (TnT), IL-6, CRP, Selektin(en), CD40, Lipoprotein- assoziierte Phospholipase A2 und weiteren entzündlichen Markern.Preferred is then the further combination with at least one of the markers selected from sTNFR-1, troponin T (TnT), IL-6, CRP, selectin (s), CD40, lipoprotein-associated phospholipase A2 and other inflammatory markers.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist dann ein Verfahren wobei die analysierten Marker und Kombinationen daraus ausgewählt sind aus Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 und Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + ADMA + Caspase-1 + TIMP-I + Resistin + sVCAM-1,Particularly preferred according to the invention is then a method wherein the analyzed markers and combinations thereof are selected from fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 and fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + ADMA + caspase-1 + TIMP-I + Resistin + sVCAM-1,
Das erfindungsgemäß verwendete Verfahren zum Bestimmen der Konzentration der analysierten Marker kann aus allen dem Fachmann zum Nachweis von Proteinen in biologischen Proben bekannten geeigneten Verfahren ausgewählt sein. Das spezifische Verfahren ist im Rahmen der vorliegenden. Erfindung solange nicht wichtig, wie das Verfahren empfindlich genug ist, um die für eine genaue Bestimmung der Konzentrationen der Marker erforderliche Nachweisgrenze zu unterschreiten. Geeignete Verfahren beruhen normalerweise auf der Bindung einer Markierung an den nachzuweisenden Marker und den anschließenden Nachweis dieser Markierung. Die Bindung kann dabei kovalent oder nicht-kovalent sein und/oder direkt oder indirekt erfolgen. Geeignete Messverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung schließen z. B. die Elektrochemilumineszenz ein. Turbidimetrie, Nephelometrie und Latex-verstärkte Turbidimetrie oder Nephelometrie können ebenfalls verwendet werden.The method used according to the invention for determining the concentration of the markers analyzed can be selected from any suitable method known to the person skilled in the art for the detection of proteins in biological samples. The specific procedure is within the scope of the present. The invention is not important as long as the method is sensitive enough to undercut the detection limit required for an accurate determination of the concentrations of the markers. Suitable methods are usually based on the binding of a label to the label to be detected and the subsequent detection of this label. The bond may be covalent or noncovalent and / or directly or indirectly. Suitable measuring methods according to the present invention include e.g. For example, electrochemiluminescence. Turbidimetry, nephelometry and latex enhanced turbidimetry or nephelometry may also be used.
Auf Grund ihrer hohen Sensitivität und der Tatsache, dass sich diese Verfahren auch auf Hoch- Durchsatz-Umgebungen anpassen lassen, sind erfindungsgemäß Verfahren bevorzugt, wobei das Bestimmen der Konzentration mittels eines immunologischen Verfahrens mittels an die Marker bindenden Moleküle erfolgt. Beispiele für solche Verfahren sind ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), Sandwich Enzymimmuntests oder Festphasen Immuntests. Bevorzugt ist somit, dass die an die Marker bindenden Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus anti-Marker-Antikörpern oder Teilen davon und Marker-Rezeptoren oder Teilen davon. Diese Moleküle können aus einer sehr großen Vielzahl von für die Marker spezifischen Molekülen ausgewählt sein. Bevorzugt ist, dass die an die Marker bindenden Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, die spezifisch gegen Marker oder gegen Teile davon gerichtet sind, oder Teilen oder Fragmenten davon und einem Marker- Rezeptor oder Teilen davon oder einem Integrin. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Antikörper, Teile oder Fragmente davon polyklonale Antikörpern, monoklonale Antikörpern, Fab-Fragmente, scFv-Antikörper und Diabodies umfassen.Due to their high sensitivity and the fact that these methods can also be adapted to high-throughput environments, methods according to the invention are preferred, wherein the concentration is determined by means of an immunological method by means of molecules binding to the marker. Examples of such methods are enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), sandwich enzyme immunoassay or solid phase immunoassay. Thus, it is preferred that the molecules that bind to the markers are selected from the group consisting of anti-marker antibodies or parts thereof and marker receptors or parts thereof. These molecules can be selected from a very wide variety of molecules specific for the markers. It is preferred that the molecules that bind to the markers are selected from the group consisting of antibodies directed specifically against markers or against portions thereof, or portions or fragments thereof and a marker receptor or portions thereof or an integrin. Particularly preferred is a method according to the invention, wherein the antibodies, parts or fragments thereof include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, Fab fragments, scFv antibodies and diabodies.
Gemäß eines weiteren Aspekts des Verfahrens der vorliegenden Erfindung können Komponenten des Verfahrens an eine feste Phase gebunden vorliegen, somit können die an einen Marker bindenden Moleküle in Lösung oder Matrix-immobilisiert vorliegen. Als Matrices können eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Materialien verwendet werden, wie zum Beispiel Harz- Matrices und/oder herkömmliche Säulenmatrices. Besonders bevorzugt ist weiterhin ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die an einen Marker bindenden Moleküle an eines oder mehrere Detektionsmoleküle aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszeinthioisocyanat, Phycoerythrin, Enzymen (zum Beispiel Meerrettich-Peroxidase) und magnetisches Bead gekoppelt sind.According to another aspect of the method of the present invention, components of the method may be bound to a solid phase, thus, the molecules that bind to a marker may be in solution or matrix immobilized. As matrices, a variety of materials known to those skilled in the art may be used, such as resin matrices and / or conventional column matrices. Particular preference is furthermore given to a method according to the invention in which the molecules binding to a marker are coupled to one or more detection molecules from the group consisting of fluorescein thioisocyanate, phycoerythrin, enzymes (for example horseradish peroxidase) and magnetic bead.
Gemäß einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens können die an die Marker bindenden Moleküle mit einem Antikörper, an den eine oder mehrere Detektionsmoleküle gekoppelt sind, nachgewiesen werden. Es handelt sich somit um einen indirekten Nachweis der Bindung des Moleküls. Solche zweistufigen Nachweise sind dem Fachmann zum Beispiel aus der anti-Antikörper-Nachweistechnik bestens bekannt.According to a further aspect of the method according to the invention, the molecules binding to the markers can be detected with an antibody to which one or more detection molecules are coupled. It is thus an indirect proof of the binding of the molecule. Such two-stage detections are well known to those skilled in the art, for example, from the anti-antibody detection technique.
Gemäß einem weiteren Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung können zur Analyse der Probe immunzytologischen Verfahren angewandt werden. Dabei sind alle Verfahren geeignet, die eine spezifische Bestimmung anhand der Marker/Molekül-Interaktion erlauben. Bevorzugt sind Verfahren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sandwich-Enzym- Immuntest, ELISA und Festphasen-Immuntests. Die für die zu untersuchende Probe ermittelten Ergebnisse werden üblicherweise mit einer Referenzprobe verglichen. Welche Probe als Referenzprobe dienen kann, wird insbesondere von der Art der untersuchten Probe und der Krankengeschichte des Individuums, aus dem die zu untersuchende Probe stammt, abhängen. Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die Referenzprobe aus einem oder dem Mittelwert mehrerer Säugetiere stammt, in dem/in denen eine kardiovaskuläre Erkrankung ausgeschlossen wurde. Dies muss aber nicht zwangsläufig so sein, wenn z. B. das Fortschreiten einer Erkrankung bestimmt werden soll, kann auch eine "alte" Probe desselben Patienten als Referenzprobe verwendet werden. Dem Fachmann ist offensichtlich, welche Proben als Referenzprobe für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind.According to another aspect of the method according to the present invention, immunocytological methods can be used to analyze the sample. All methods are suitable which allow a specific determination based on the marker / molecule interaction. Preferred are methods selected from the group consisting of sandwich enzyme immunoassay, ELISA and solid phase immunoassays. The results obtained for the sample to be examined are usually compared with a reference sample. Which sample can serve as a reference sample will depend, in particular, on the type of sample being tested and the medical history of the individual from which the sample to be tested is derived. Preferred is a method according to the invention, in which the reference sample originates from one or the mean of several mammals in which a cardiovascular disease has been excluded. But this does not necessarily have to be the case if z. B. the progression of a disease is to be determined, an "old" sample of the same patient can be used as a reference sample. It is obvious to the person skilled in the art which samples are suitable as a reference sample for the method according to the invention.
Gemäß einem weiteren Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung können die zu diagnostizierenden und/oder prognostizierenden und/oder deren Therapie zu überwachen- den akuten kardiovaskulären Erkrankungen ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus instabiler Angina, Myokardinfarkt, akutem Herzsyndrom, koronarer Arterienerkrankung und Herzinsuffizienz. Es soll jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren noch für weitere akute kardiologische Erkrankungszustände eignet und anwenden lässt.According to a further aspect of the method according to the present invention, the acute cardiovascular diseases to be diagnosed and / or prognosticated and / or their therapy may be selected from the group consisting of unstable angina, myocardial infarction, acute heart syndrome, coronary artery disease and cardiac insufficiency. However, it should not be ruled out that the method according to the invention is suitable and can still be used for other acute cardiac disease states.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft, einen, diagnostischen Kit, wobei der Kit Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, unter Umständen zusammen mit weiteren Komponenten und/oder Hilfsstoffen umfasst. Solche Mittel sind bevorzugterweise mindestens ein Antikörper zum Nachweis von Marker und Mittel zur anschließenden Quantifizierung der Marker. Der Kit kann außerdem andere Komponenten und/oder Enzyme zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, z. B. Gebrauchsanweisungen zur Interpretation der Ergebnisse des Tests im Hinblick auf das Risikoprofil des Patienten und entsprechende Gegenmaßnahmen und Therapievorschläge enthalten.A further aspect of the present invention relates to a diagnostic kit, wherein the kit comprises means for carrying out the method according to the invention, possibly together with further components and / or auxiliaries. Such agents are preferably at least one antibody for detection of marker and means for subsequent quantification of the markers. The kit may also contain other components and / or enzymes for carrying out the methods of the present invention, e.g. B. Instructions for use for interpreting the results of the test with regard to the risk profile of the patient and appropriate countermeasures and therapy suggestions.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose und/oder Prognose akuter kardiovaskulärer Erkrankungen und/oder zur Überwachung von deren Therapie. Dies geschieht durch die quantitative und kritische Bestimmung von Markern. Aufgrund des daraufhin erstellbaren Risikoprofils können dann geeignete Gegenmaßnahmen durch den behandelnden Arzt durchgeführt werden, um den Patienten positiv zu beeinflussen und das nachteilige Ereignis zu verhindern oder zumindest in seiner Schwere für den betroffenen Patienten zu vermindern. Eine solche Therapie kann erfindungsgemäß z. B. die Verabreichung von Statinen oder Inhibitoren des Glycoprotein Ilb/III-Rezeptors insbesondere Abciximab umfassen. Dem Fachmann sind jedoch weitere mögliche Therapien bekannt, um kardiovaskuläre Erkrankungen zu therapieren, die nach herkömmlichen Schemata erfolgen können.Another aspect of the present invention thus relates to the use of the method according to the invention for the diagnosis and / or prognosis of acute cardiovascular diseases and / or for the monitoring of their therapy. This is done by the quantitative and critical determination of markers. On the basis of the risk profile which can then be created, appropriate countermeasures can then be carried out by the attending physician in order to positively influence the patient and to prevent or at least reduce the severity of the adverse event for the affected patient. Such a therapy according to the invention z. B. the administration of statins or inhibitors of the glycoprotein IIb / III receptor in particular abciximab include. However, those skilled in the art will be aware of other possible therapies to treat cardiovascular diseases that may occur according to conventional schemes.
In einer weiteren Ausfuhrungsform der Erfindung kann weiterhin ein anti-inflammatorisches Mittel mit verabreicht werden. Dieses Mittel kamen ausgewählt sein aus nicht-Steroid oder Steroid anti-inflammatorischen Mitteln, die z.B. einschließen können: Alclofenac; Alclometason; Dipropionat; Algestonacetonide; Alpha-Amylase; Amcinafal; Amcinafid; Amfenac Natrium; Amiprilosehydrochlorid; Anakinra; Anirolac; Anitrazafen; Apazon; Balsalazid Dinatrium; Bendazac; Benoxaprofen; Benzydamin Hydrochlorid; Bromelain; Broperamol; Budesonid; Carprofen; Cicloprofen; Cintazon; Cliprofen; Clobetasolpropionat; Clobetasonbutyrat; Clopirac; Cloticasonpropionat; Cormethasonacetat; Cortodoxon; Deflazacort; Desonid; Desoximetason; Dexamethasondipropionat; Diclofenac Kalium; Diclofenac Natrium; Diflorasondiacetat; Diflunudon Natrium; Diflunisal; Difluprednat; Diftalon; Dimethylsulfoxid; Drocinonid; Endryson; Enlimomab; Enolicam Natrium; Epirizol; Etodolac; Etofenamat; Felbinac; Fenamol; Fenbufen; Fenclofenac; Fenclorac; Fendosal; Fenpipalon; Fentiazac; Flazalon; Fluazacort; Flufenaminsäure; Flumizol; Runisolidacetat; Plunixin; Flunixin Meglumin; Fluocortin Butyl;Fluormetholonacetat; Fluquazon; Flurbiprofen; Fluretofen; Fluticasonpropionat; Puraprofen; Furobufen; Halcinonid; Halobetasolpropionat; Halopredonacetat; Ibufenac; Ibuprofen; Ibuprofen Aluminium; Ibuprofen Piconol; Ilonidap; Indomethacin; Indometacin Natrium; Indorofen; Indoxol; Mitrazol; Isoflupredonacetat; Isoxepac; Isoxicam; Ketoprofen; Lofemizol Hydrochlorid; Lomoxicam; Loteprednol Etabonat; Meclofenamat Natrium; Meclofenaminsäure; Meclorison Dibutyrat; Mefenaminsäure; Mesalamin; Meseclazon; MethylprednisolonSuleptanat; Momiflumat; Nabumeton; Naproxen; Naproxen Natrium; Naproxol; Nimazon; Olsalazin Natrium; Orgotein; Orpanoxin; Oxaprozin; Oxyphenbutazon; Paranylin Hydrochlorid; Pentosan Polysulfat Natrium; Phenbutazon Natriumglycerat; Pirfenidon;Piroxicam; Piroxicam Cinnamat; Piroxicam Olamin; Pirprofen; Prednazat; Prifelon; Prodolinsäure; Proquazon; Proxazol; Proxazolcitrat; Rimexolon; Romazarit; Salcolex; Salnacedin; Salsalat; Salicylate; Sanguinariumchlorid; Seclazon; Sermetacin; Sudoxicam; Sulindac; Suprofen; Talmetacin; Talniflumat; Talosalat; Tebufelon; Tenidap; Tenidap Natrium; Tenoxicam; Tesicam; Tesimid; Tetrydamin; Tiopinac; Tixocortol Pivalat; Tolmetin; Tolmetin Natrium; Triclonid; Triflumidat; Zidometacin; Glucocorticoide; Zomepirac Natrium.In a further embodiment of the invention, an anti-inflammatory agent may further be administered. These agents came to be selected from non-steroid or steroid anti-inflammatory agents, which may include eg: alclofenac; alclometasone; dipropionate; Algestonacetonide; Alpha-amylase; Amcinafal; amcinafide; Amfenac sodium; Amiprilosehydrochlorid; anakinra; Anirolac; anitrazafen; apazone; Balsalazide disodium; bendazac; benoxaprofen; Benzydamine hydrochloride; bromelain; broperamole; Budesonide; carprofen; cicloprofen; Cintazon; Cliprofen; clobetasol propionate; clobetasone; clopirac; Cloticasonpropionat; Cormethasonacetat; cortodoxone; deflazacort; desonide; deoxymethasone; Dexamethasondipropionat; Diclofenac potassium; Diclofenac sodium; diflorasone diacetate; Diflunudone sodium; diflunisal; difluprednate; Diftalon; dimethyl sulfoxide; Drocinonid; Endryson; Enlimomab; Enolicam Sodium; epirizole; etodolac; etofenamate; felbinac; Fenamol; fenbufen; fenclofenac; fenclorac; fendosal; Fenpipalon; fentiazac; Flazalon; fluazacort; flufenamic; Flumizol; Runisolidacetat; Plunixin; Flunixin meglumine; Fluocortin butyl; fluorometholone acetate; Fluquazon; flurbiprofen; Fluretofen; fluticasone propionate; Puraprofen; Furobufen; halcinonide; halobetasol; halopredone; ibufenac; ibuprofen; Ibuprofen aluminum; Ibuprofen piconol; Ilonidap; indomethacin; Indomethacin sodium; Indorofen; indoxole; Mitrazol; Isoflupredonacetat; isoxepac; isoxicam; ketoprofen; Lofemizole hydrochloride; Lomoxicam; Loteprednol etabonate; Meclofenamate sodium; meclofenamic; Meliorisone dibutyrate; mefenamic; mesalamine; Meseclazon; MethylprednisolonSuleptanat; Momiflumat; nabumetone; naproxen; Naproxen sodium; naproxol; Nimazon; Olsalazine Sodium; Orgotein; orpanoxin; oxaprozin; oxyphenbutazone; Paranylin hydrochloride; Pentosan polysulfate sodium; Phenbutazone sodium glycerate; Pirfenidone; piroxicam; Piroxicam cinnamate; Piroxicam olamine; pirprofen; Prednazat; Prifelon; Prodolinsäure; proquazone; Proxazole; Proxazolcitrat; rimexolone; Romazarit; Salcolex; Salnacedin; salsalate; salicylates; Sanguinariumchlorid; Seclazon; Sermetacin; sudoxicam; sulindac; suprofen; talmetacin; talniflumate; Talosalate; tebufelone; tenidap; Tenidap sodium; tenoxicam; Tesicam; Tesimid; Tetrydamine; tiopinac; Tixocortol Pivalate; tolmetin; Tolmetin sodium; Triclonid; Triflumidat; zidometacin; glucocorticoids; Zomepirac sodium.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft "Diagnose" die Überprüfung, ob ein Individuum an einem bestimmten kardiovaskulären Ereignis gelitten hat. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft "Prognose" die Vorhersage der Wahrscheinlichkeit (in %) ob ein Individuum an einem bestimmten kardiovaskulären Ereignis leiden wird. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft "Stratifizierung der Therapie" die Ermittlung der geeigneten therapeutischen Behandlung für das kardiovaskuläre Ereignis, das auftreten wird oder aufgetreten ist.In the context of the present invention, "diagnosis" refers to the verification of whether an individual has suffered from a particular cardiovascular event. In the context of the present invention, "prognosis" refers to predicting the likelihood (in%) of whether an individual will suffer from a particular cardiovascular event. In the context of the present invention, "stratification of therapy" refers to the determination of the appropriate therapeutic treatment for the cardiovascular event that will occur or has occurred.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft "Überwachung der Therapie" die Kontrolle und, gegebenenfalls, ein Einstellen der therapeutischen Behandlung eines Individuums. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft "therapeutische Behandlung" schließt jede Behandlung ein, die möglicherweise den pathophysiologischen Zustand eines Individuums und schließt z. B. die Verabreichung von Pharmazeutika sowie chirurgische Behandlung (z. B. Ballondilatation).In the context of the present invention, "monitoring therapy" refers to the control and, optionally, discontinuation of the therapeutic treatment of an individual. In the context of the present invention, "therapeutic treatment" includes any treatment that may or may not include the pathophysiological condition of an individual and includes, for example: As the administration of pharmaceuticals and surgical treatment (eg., Balloon dilatation).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden Patienten mit koronarer Arterienerkrankung für mehr als 5 Jahre verfolgt, es wurde dabei der Einfluss von elf inflammatorischen Markern bei der Vorhersage eines zukünftigen kardiovaskulären Ereignisses untersucht. Einzeln berücksichtigt waren die meisten der Marker unabhängig von klassischen Risikofaktoren hoch prädiktiv. Jedoch verblieben einige wenige dieser Marker, nämlich lösliches vaskuläres Zeiladhäsionsmolekül- 1, löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2, Interleukin-18 und Fibrinogen - unabhängige Risiko- Vorhersageparameter. Die Analyse eines Wertes, der diese vier Marker kombinierte ließ vermuten, dass die Untersuchung von mehreren sorgfältig ausgewählten Markern etwas zur individuellen Vorhersagekraft einzelner Marker hinzufügte. Das Konzept des Multi- Markerwertes, assoziiert mit dem Risiko koronarer Arterienerkrankung wird auch durch die Ergebnisse aus der HOPE Studie unterstützt, wobei gezeigt wird, dass ein Wert, der 3 inflammatorische Marker einschließt, in einer Kohorte von Hochrisikopatienten stark mit kardiovaskulärem Ausgang assoziiert war.In the context of the present invention, patients with coronary artery disease have been followed for more than 5 years, the influence of eleven inflammatory markers in the prediction of a future cardiovascular event was investigated. Individually, most of the markers were highly predictive, regardless of classical risk factors. However, a few of these markers remained, namely soluble vascular adhesion adhesion molecule 1, soluble tumor necrosis factor receptor 2, interleukin-18 and fibrinogen-independent risk prediction parameters. Analysis of a value combining these four markers suggested that the study of several carefully selected markers added something to the individual predictive power of individual markers. The concept of multi-marker value associated with the risk of coronary artery disease is also supported by the results from the HOPE study, showing that a value that is 3 inflammatory markers in a cohort of high-risk patients was strongly associated with cardiovascular output.
Von wesentlicher Bedeutung sind die Definition und Interpretation der hier vorgestellten inflammatorischen Werte. Die Erfinder verwendeten ein schrittweises Verfahren zur Auswahl der Marker, die unabhängig mit dem Ausgang assoziiert waren. Das vorwärts- und rückwärts- Verfahren zur Auswahl ergab ähnliche Ergebnisse. Interessanterweise gehörten die vier ausgewählten Marker zu verschiedenen Signalwegs, was auf die Aktivierung von distinkten pathophysiologischen Systemen hindeutet - dem Tumornekrosefaktor Signalweg, dem Interleukin-18 (oder allgemeiner dem Interleukin-1) Signalweg, der Adhäsionsmolekül-Familie und dem Cluster von akute-Phase Reaktanten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass jeder Schritt innerhalb der pathophysiologischen Kaskade von Entzündung einen unabhängigen Beitrag zur Vorhersage des Risikos aufweist. Die Kombination mehrerer Marker, die aus einem gemeinsamen pathophysiologischen Signalweg und daher eng miteinander verwandt sind, würden zu einer Redundanz fuhren, wie kürzlich in einer prospektiven Untersuchung gesunder Männer gezeigt wurde, wobei die gleichzeitige Messung von fünf Entzündungs-sensitiven Plasmaproteinen — die alle die akute Phase Antwort widerspiegelten - keine weitere Information für die klinische Risikovorhersage, verglichen mit CRP Messung allein, ergab.Of essential importance are the definition and interpretation of the inflammatory values presented here. The inventors used a stepwise method to select the markers that were independently associated with the output. The forward and backward selection procedure gave similar results. Interestingly, the four selected markers belonged to different signaling pathways, indicating the activation of distinct pathophysiological systems - the tumor necrosis factor signaling pathway, the interleukin-18 (or more generally the interleukin-1) signaling pathway, the adhesion molecule family and the cluster of acute-phase reactants , These results suggest that each step within the pathophysiological cascade of inflammation has an independent contribution to the prediction of the risk. The combination of several markers, which are closely related to each other, from a common pathophysiological pathway would lead to redundancy, as has recently been shown in a prospective study of healthy men, with simultaneous measurement of five inflammation-sensitive plasma proteins - all of which are acute Phase response - no further information for the clinical risk prediction, compared with CRP measurement alone, revealed.
Mehrere mechanistische Untersuchungen betreffen die kausative Rolle von Tumornekrosefaktor und Interleukin-1 Familien im arteriosklerotischen Prozess. Jedoch sind Tumornekrosefaktor-α und Interleukin-1 im Kreislauf aufgrund ihrer kurzen Halbwertszeit schwer zu messen. Im Gegenzug sind die Erhöhung des löslichen Tumornekrosefaktor-Rezeptors und löslichen Interleukin-1 Rezeptorantagonists eng mit jeweils Tumornekrosefaktor-α und Interleukin-1 assoziiert und zeigen stabile basale Serumspiegel. Obwohl löslicher Tumornekrosefaktor- Rezeptor 2 und löslicher Interleukin-1 Rezeptorantagonist potentiell schädlichen Effekten entgegenwirken, scheint die endogene Produktion nicht ausreichend zu sein, um die negativen Effekte der primären Cytokine zu verhindern, die lokal produziert werden (26). Daher scheinen die löslichen Rezeptoren bessere Marker für die Aktivität der Erkrankung zu sein, als die Cytokine selber (27). Die vorliegende Erfindung zeigt eine starken Zusammenhang von löslichem Interleukin-1 Rezeptorantagonist mit kardiovaskulärem Risiko in univarianter Analyse, jedoch war der Effekt nicht länger signifikant, wenn mehrere entzündliche Marker gleichzeitig berücksichtigt wurden. Dies ist möglicherweise in der Tatsache begründet, dass löslicher Interleukin-1 Rezeptorantagonist-Spiegel mit löslichem Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 stark korrelieren.Several mechanistic studies address the causative role of tumor necrosis factor and interleukin-1 families in the arteriosclerotic process. However, tumor necrosis factor-α and interleukin-1 are difficult to measure in the circulation because of their short half-life. In turn, the increase in soluble tumor necrosis factor receptor and soluble interleukin-1 receptor antagonist are closely associated with tumor necrosis factor-α and interleukin-1, respectively, and show stable basal serum levels. Although soluble tumor necrosis factor receptor 2 and soluble interleukin-1 receptor antagonist counteract potentially deleterious effects, endogenous production does not appear to be sufficient to prevent the negative effects of primary cytokines produced locally (26). Therefore, the soluble receptors seem to be better markers of the activity of the disease than the cytokines themselves (27). The present invention demonstrates a strong association of soluble interleukin-1 receptor antagonist with cardiovascular risk in univariate analysis, however, the effect was no longer significant when several inflammatory markers were considered simultaneously. This may be due to the fact that soluble interleukin-1 receptor antagonist levels strongly correlate with soluble tumor necrosis factor receptor 2.
Kürzlich wurde eine erhöhte Interleukin-18 Expression - einem weiteren Mitglied der Interleukin-1 Familie in menschlichen arteriosklerotischen Plaques identifiziert, und die Inhibierung von Interleukin-18 wurde als einen vorteilhaften Effekt auf das Fortschreiten der Plaquebildung und -Zusammensetzung in Tiermodellen gezeigt. Die Assoziierung von Basislinien-Interleukin-18 Spiegeln mit zukünftigem kardiovaskulärem Tod wurde kürzlich in der AtheroGeπe Untersuchung sowohl in stabiler Angina pectoris und akutem Koronarsyndrom gezeigt und wurde weiter in der Kohorte von anfänglich gesunden Subjekten der PRIME Studie bestätigt. In der vorliegenden Erfindung sind die Interleukin-18 Spiegel schwach mit anderen entzündlichen Markern korreliert, was vermuten lässt, dass Interleukin-18 einen eher distinkten pathophysiologischen Signalweg darstellt.Recently, increased interleukin-18 expression - another member of the interleukin-1 family has been identified in human arteriosclerotic plaques, and inhibition of interleukin-18 has been shown to be a beneficial effect on the progression of plaque formation and composition in animal models. The association of baseline interleukin-18 levels with future cardiovascular death has recently been demonstrated in atherosclerotic examination in both stable angina pectoris and acute coronary syndrome, and was further confirmed in the cohort of initially healthy subjects in the PRIME study. In the present invention, interleukin-18 levels are weakly correlated with other inflammatory markers, suggesting that interleukin-18 represents a rather distinct pathophysiological pathway.
Aus klinischer Sicht ist es wichtig, dass der systemisch nachweisbare entzündliche Zustand, der durch multiple Marker widergespiegelt wird, klar eine bessere Abschätzung des kardiovaskulären Risikos zur Verfügung stellt, als einzelne Biomarker.From a clinical perspective, it is important that the systemically detectable inflammatory condition, which is reflected by multiple markers, clearly provides a better estimate of cardiovascular risk than individual biomarkers.
Zusammenfassend lässt sich somit sagen, dass die vorliegende Erfindung die bedeutende und unabhängige Rolle von Fibrinogen, sTNFR-2, IL- 18, ADMA, Caspase-1, TIMP-I, Resistin und sVCAM-1 als Marker der Plättchenaktivierung für die diagnostische und therapeutische Risikostratifizierung dokumentiert.In summary, therefore, the present invention recognizes the significant and independent role of fibrinogen, sTNFR-2, IL-18, ADMA, caspase-1, TIMP-I, resistin and sVCAM-1 as platelet activators for the diagnostic and therapeutic Risk stratification documented.
Die Erfindung soll nun im Folgenden anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren näher erläutert werden, ohne jedoch dadurch begrenzt zu werden. In den Figuren zeigt: Figur 1 die paarweise Pearson-Korrelationskoeffizienten zwischen inflammatorischen Markern in Patienten mit stabiler Angina pectoris und denjenigen mit akutem Koronarsyndrom (log oder Quadratwurzel Transformationen wurden verwendet, um die Verteilungen zu normalisieren).The invention will now be described in more detail below by way of example with reference to the accompanying figures, without, however, being limited thereby. In the figures shows: Figure 1 shows the pairwise Pearson correlation coefficients between inflammatory markers in patients with stable angina pectoris and those with acute coronary syndrome (log or square root transformations were used to normalize the distributions).
Figur 2 die Hazard- Verhältnisse von zukünftigen kardiovaskulären Ereignissen durch erhöhende Drittel inflammatorischer Marker. Die Hazard- Verhältnisse wurden auf Alter, Geschlecht, Body- Mass-Index, Raucherstatus, Geschichte von Hochdruck oder Diabetes, HDL-Cholesterin, Statintherapie und Zahl der stenösen Gefäße angepasst.Figure 2 shows the hazard ratios of future cardiovascular events by increasing thirds of inflammatory markers. Hazard ratios were adjusted for age, sex, body mass index, smoking status, history of high pressure or diabetes, HDL cholesterol, statin therapy and number of stenotic vessels.
Figur 3 die Kaplan-Meier Überlebenskurven für kardiovaskuläre Ereignisse durch inflammatorischen Wert bei Patienten mit stabiler Angina (Panel A) und akutem Koronarsyndrom (Panel B).Figure 3 the Kaplan-Meier survival curves for cardiovascular events by inflammatory value in patients with stable angina (Panel A) and acute coronary syndrome (Panel B).
Figur 4 den Unterschied im Akaike Informations Kriterium (AIC) zwischen dem Modell basierend auf dem 4-Marker Wert (umgeben) und denjenigen basierend auf den besten 1-Marker- , 2-Marker- und 3 -Markerwerten (links) und dem 5-Markerwert (rechts). Der minAIC wurde für den 4-Markerwert erhalten und auf 0 gesetzt.FIG. 4 shows the difference in the Akaike Information Criterion (AIC) between the model based on the 4-marker value (surrounded) and those based on the best 1-marker, 2-marker and 3-marker values (left) and the 5 Marker value (right). The minAIC was obtained for the 4-marker value and set to 0.
Figur 5 und 6 die Kaplan-Meier Kurven für Ereignis-freies Überleben gemäß Dritteln von TIMP- 1 Spiegel.Figures 5 and 6 show the Kaplan-Meier curves for event-free survival according to thirds of TIMP-1 levels.
Figur 7 die prädiktive Stärke von TIMP-I im Kontext mit den neuen biologischen Markern CRP und BNP.FIG. 7 shows the predictive strength of TIMP-I in the context of the new biological markers CRP and BNP.
Figur 8 die Kaplan-Meier Kurven für Ereignis-freies Überleben gemäß Dritteln von ADMA Spiegel.Figure 8 shows the Kaplan-Meier curves for event-free survival according to thirds of ADMA Spiegel.
Figur 9 die prädiktive Stärke von TIMP-I im Kontext mit den neuen biologischen Markern CRP, BNP und Creatinin.FIG. 9 shows the predictive strength of TIMP-I in the context of the new biological markers CRP, BNP and creatinine.
Beispiele Beispiel 1 - Untersuchung von elf entzündlichen MarkernExamples Example 1 - Examination of Eleven Inflammatory Markers
Die Erfinder untersuchten zunächst, welche Ausgangsspiegel von elf entzündlichen Markern — einige zum ersten Mal analysiert — unabhängig mit zukünftigem kardiovaskulärem Risiko assoziiert warten und ob die gleichzeitige Ermittlung von multiplen entzündlichen Markern die Fähigkeit verbesserte, Hoch-Risikopatienten über die klassischen Risikofaktoren und Einzelmarkerbestimmung hinaus nachzuweisen.The inventors first examined which outcomes of eleven inflammatory markers - some analyzed for the first time - are independently associated with future cardiovascular risk and whether the simultaneous identification of multiple inflammatory markers improved the ability to detect high-risk patients beyond the classic risk factors and single-marker determination.
Studienpopulationstudy population
Eine genaue Beschreibung des Aufbaus der AtheroGewe Studie wurde bereits vorher beschrieben (18). Zwischen November 1996 und Juni 2000 wurden 1303 Patienten, die koronarer Angiographie in der medizinischen Abteilung II der Johannes Gutenberg-Universität Mainz oder dem Bundeswehrzentralkrankenhaus Koblenz unterzogen wurden, und die mindestens eine Stenose von >30% in einer Haupt-Koronararterie diagnostiziert hatten, in ein kardiovaskuläres Register aufgenommen. Von den Patienten erschienen 880 (67,5%) mit stabiler Angina pectoris und 423 (32,5%) mit einem akuten Koronarsyndrom; in der zuletzt genannten Gruppe, wiesen 367 Patienten eine instabile Angina, klassifiziert durch Braunwald Klassifikation (Klasse B oder C) auf und 56 wiesen einen akuten Myokardinfarkt innerhalb der vorherigen 48 Stunden auf. Die Ausschlußkriterien waren Auftreten von hämodynamisch signifikante valvuläre Herzerkrankung, Chirurgie oder Trauma innerhalb des vorhergehenden Monats, bekannte Kardiomyopathie, bekannte maligne Erkrankungen, febrile Zustände oder orale Antikoagulans-Therapie innerhalb der letzten vier Wochen.A detailed description of the structure of the AtheroGewe study has been previously described (18). Between November 1996 and June 2000, 1303 patients who underwent coronary angiography in the Department of Medicine II of the Johannes Gutenberg University Mainz or the Bundeswehr Central Hospital Koblenz, and who had diagnosed at least one stenosis of> 30% in a major coronary artery, were included cardiovascular register. Of the patients, 880 (67.5%) with stable angina pectoris and 423 (32.5%) with acute coronary syndrome appeared; in the latter group, 367 patients had unstable angina classified by Braunwald classification (class B or C) and 56 had acute myocardial infarction within the previous 48 hours. The exclusion criteria were occurrence of hemodynamically significant valvular heart disease, surgery or trauma within the previous month, known cardiomyopathy, known malignancies, febrile conditions, or oral anticoagulant therapy within the past four weeks.
Evaluierung von EndpunktenEvaluation of endpoints
Eine Gesamtzahl von 1292 (99,2%) Patienten wurde während einer mittleren Zeitdauer von 5,4 (Maximum 7,6) Jahren nach-verfolgt. Die Patienten wurden entweder an der Klinik der Erfinder präsentiert (78,2 %) oder wurden durch geschultes medizinisches Personal per Telefon befragt. Die Nachfolge-Information wurde über Tod aus kardiovaskulären Gründen (n=168), Tod aus Gründen, die nicht mit kardiovaskulärer Erkrankung zusammenhing (n=61), nicht fatalem Myokardinfarkt (n=67) und nicht fatalem Schlaganfall (n=45) erhalten. Die Information über die Todesursache oder klinische Ereignisse wurden aus Krankenhaus- oder Arztpraxisakten erhalten.A total of 1292 (99.2%) patients were followed up for a mean time of 5.4 (maximum 7.6) years. Patients were either presented to the inventors clinic (78.2%) or interviewed by trained medical personnel by telephone. Succession information was not fatal on death for cardiovascular reasons (n = 168), death for reasons not related to cardiovascular disease (n = 61) Myocardial infarction (n = 67) and not fatal stroke (n = 45). Information about the cause of death or clinical events was obtained from hospital or physician's medical records.
Laborverfahrenlaboratory procedures
Blut wurde von allen Studiensubjekten unter standardisierten Bedingungen abgenommen, bevor die Koronarangiographie durchgeführt wurde. Die Proben wurden bei -800C bis zur Analyse gelagert. C-reaktives Protein wurde durch einen hoch-sensitiven, Latexpartikel-verstärkten Immuntest (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) bestimmt. Serum Interleukin-6, löslicher Interleukin-1 Rezeptorantagonist, lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekül- 1 (alle EASIA™, Biosource Europe), löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 und 2 (R&D Systems, Europe), Interleukin-18 (MBL Co, Ltd), sowie Plasma lösliches vaskuläres Adhäsionsmolekül- 1 (EASIA™, Biosource Europe), Plasma-lösliches E-Selektin, (Bender Medical Systems, Austria), und Plasma Metalloproteinase-9 (Fuji Chemical Industries, Japan) wurden unter der Verwendung der ELISA Technik gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Von allen ELISA Messungen waren wiederholte Messungen der selben Proben hoch korreliert (von 0,96 bis 0,99) und die Koeffizienten der Variation reichten von 2% bis 17%. Fibrinogen (abgeleitetes Verfahren, Dade Behring, Germany) und Serum Lipidspiegel (gesamtes Cholesterin, HDL- Cholesterin, LDL-Cholesterin und Triglyceride) wurden sofort bestimmt.Blood was withdrawn from all study subjects under standardized conditions before coronary angiography was performed. The samples were stored at -80 0 C until analysis. C-reactive protein was determined by a highly sensitive, latex particle-amplified immunoassay (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Serum interleukin-6, soluble interleukin-1 receptor antagonist, soluble intercellular adhesion molecule-1 (all EASIA ™, Biosource Europe), soluble tumor necrosis factor receptor 1 and 2 (R & D Systems, Europe), interleukin-18 (MBL Co, Ltd), as well Plasma soluble vascular adhesion molecule-1 (EASIA ™, Biosource Europe), plasma-soluble E-selectin (Bender Medical Systems, Austria), and plasma metalloproteinase-9 (Fuji Chemical Industries, Japan) were synthesized using the ELISA technique according to the Manufacturer's instructions determined. Of all the ELISA measurements, repeated measurements of the same samples were highly correlated (from 0.96 to 0.99) and the coefficients of variation ranged from 2% to 17%. Fibrinogen (derived method, Dade Behring, Germany) and serum lipid levels (total cholesterol, HDL cholesterol, LDL cholesterol and triglycerides) were determined immediately.
Statistische AnalyseStatistical analysis
In allen Überlebensanalysen war der kombinierte Endpunkt Tod aus kardiovaskulären Gründen und nicht fataler Myokardinfarkt (n=235) und Daten von Patienten, die aus anderen Gründen starben wurden zum Todeszeitpunkt zensiert. Alters- und Geschlechts-eingestellte Mittlere Spiegel von entzündlichem Marker wurden in Patienten mit und ohne kardiovaskulärem Ereignis durch ein allgemein lineares Modell abgeschätzt. Die Assoziierung von entzündlichem Marker mit Ausgang wurde auch durch Cox Regressionsanalyse durch Teilen der Marker in Drittel - getrennt bei Patienten mit stabiler Angina und akutem Koronarsyndrom - und Kontrollieren auf klassische Risikofaktoren (Alter, Geschlecht, Body-Mass-Index, Rauchen, Geschichte von Bluthochdruck oder Diabetes, HDL-Cholesterin, Statintherapie und die Zahl von Stenosen Gefäßen) evaluiert. Eine schrittweise Cox Regressionsanalyse wurde durchgeführt, um diejenigen entzündlichen Marker zu identifizieren, die unabhängig mit Ausgang assoziiert waren. Ein entzündlicher Wert wurde als nächstes durch Kombinieren der 4 Marker, die durch schrittweise Analyse ausgewählt waren, berechnet. Der Wert eines Individuums wurde als die Zahl von Marker in dem oberen Drittel der Verteilung definiert. Das Cox Modell basierend auf diesem 4-Marker Wert wurde weiter im Hinblick auf Information mit Modellen basierend auf Werten, die eine kleinere oder größere Zahl von Markern aufwiesen, verglichen. Zu diesen Zweck wurde das Akaike Informations Kriterium (AIC) (19) verwendet, und das Modell mit dem Minimum AIC (minAIC) wurde als die beste empirische Stützung aufweisend betrachtet (20). Ein Modell mit einer AIC Differenz < 2 mit dem minAIC wurde als äquivalent mit dem minAIC Modell betrachtet, wohingegen ein Modell mit einer AIC Differenz > 4 als verschieden von dem minAIC Modell betrachtet wurde (20, 21). Die Annahme der Proportionalität der Gefährdungen wurde durch die Einführung einen Interaktions-Begriffes Wert*log(Zeit) in das Cox Modell eingeführt, und wurde nicht zurückgewiesen (P = 0,46 und 0,60 jeweils in der stabiler Angina und akutes Koronarsyndromgruppe). Die Hazard- Verhältnisse (HRs) und 95% CI wurden dargestellt. P < 0,05 wurde als signifikant betrachtet. Alle Analysen wurden mit der SAS Software Version 8,2 (SAS Institute Inc., Gary, NC, USA) durchgeführt.In all survival analyzes, the combined outcome was death for cardiovascular reasons and not fatal myocardial infarction (n = 235) and data from patients who died for other reasons were censored at death. Age and sex-adjusted median levels of inflammatory marker were estimated in patients with and without cardiovascular event by a generally linear model. The association of inflammatory marker with outcome was also assessed by Cox regression analysis by dividing the markers in thirds - separated in patients with stable angina and acute coronary syndrome - and controlling for classical risk factors (age, sex, body mass index, smoking, history of hypertension or diabetes, HDL cholesterol, statin therapy, and the number of stenotic vessels). A stepwise Cox regression analysis was performed to identify those inflammatory markers that were independently associated with output. An inflammatory value was next calculated by combining the 4 markers selected by stepwise analysis. The value of an individual was defined as the number of markers in the upper third of the distribution. The Cox model based on this 4-marker value was further compared for information with models based on values having a smaller or larger number of markers. For this purpose, the Akaike Information Criterion (AIC) (19) was used, and the model with the minimum AIC (minAIC) was considered to have the best empirical support (20). A model with an AIC difference <2 with the minAIC was considered equivalent to the minAIC model, whereas a model with an AIC difference> 4 was considered different from the minAIC model (20, 21). The assumption of proportionality of hazards was introduced by introducing an interaction term value * log (time) into the Cox model, and was not rejected (P = 0.46 and 0.60 respectively in the stable angina and acute coronary syndrome group). The hazard ratios (HRs) and 95% CI were shown. P <0.05 was considered significant. All analyzes were performed with the SAS software version 8.2 (SAS Institute Inc., Gary, NC, USA).
Ausgangsliniendaten und zirkulierende Spiegel von entzündlichem Marker im Verhältnis zu kardiovaskulärem AusgangBaseline data and circulating levels of inflammatory marker relative to cardiovascular output
Im Hinblick auf klassische Risikofaktoren und klinische Daten ergaben geringe Ausstoßfraktion, Diabetes mellitus, Alter und niedrige HDL-Cholesterinspiegel die stärkste Assoziierung mit zukünftigem kardiovaskulärem Ereignis (Tabelle 1). Da 33% of Patienten bei Studieneintritt eine Statintherapie erhielten, waren die Spiegel von LDL- und Gesamt-Cholesterin bereits therapeutisch beeinträchtigt und nicht zusammenhängend - im Gegensatz zu HDL-Cholesterin und Triglyceridspiegeln - mit zukünftigen kardiovaskulären Ereignissen. Alle entzündlichen Marker, außer löslichem E-Selektin, waren in der Ausgangslinie in Patienten die ein kardiovaskulärem Ereignis (Tabelle 2) erfuhren, signifikant erhöht. Die Erhöhung der Markerspiegel war allgemein von vergleichbarer Größenordnung zwischen Patienten mit stabiler Angina pectoris und denjenigen mit akutem Koronarsyndrom.With regard to classic risk factors and clinical data, low ejection fraction, diabetes mellitus, age, and low HDL cholesterol levels were the strongest association with future cardiovascular events (Table 1). Since 33% of patients received statin therapy at baseline, the levels of LDL and total cholesterol were already therapeutically impaired and non-contiguous - in contrast to HDL cholesterol and triglyceride levels - with future cardiovascular events. All inflammatory markers, other than soluble E-selectin, were significantly elevated in the baseline in patients experiencing a cardiovascular event (Table 2). The increase in marker levels was generally of comparable magnitude between patients with stable angina pectoris and those with acute coronary syndrome.
Es gab zwei Cluster von stark assoziierten Markern, wobei der erste löslichen Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 und 2 und löslichen Interleukin-1 Rezeptorantagonist umfasste, und der zweite akute-Phase Entzündungsmarker (C-reaktives Protein, Fibrinogen, und Interleukin-6) (Figur 1) umfasste. Die Korrelationen schienen in ihrer Größenordnung zwischen Patienten mit stabiler Angina und denjenigen mit akutem Koronarsyndrom sehr ähnlich.There were two clusters of strongly associated markers, the first soluble tumor necrosis factor receptor comprising 1 and 2 and soluble interleukin-1 receptor antagonist, and the second acute phase inflammatory marker (C-reactive protein, fibrinogen, and interleukin-6) (FIG ) included. The correlations appeared to be very similar in magnitude between patients with stable angina and those with acute coronary syndrome.
Prospektive Evaluierung der entzündlichen Marker im Hinblick auf kardiovaskulären AusgangProspective evaluation of inflammatory markers for cardiovascular outcomes
Figur 2 zeigt die Hazard-Verhältnisse von kardiovaskulärem Ereignis, eingestellt auf klassische Risikofaktoren, gemäß den ansteigenden Dritteln jedes Markers. In der stabilen Angina zukünftigem kardiovaskulärem Ereignis-Gruppe zeigten die Patienten eine zunehmende Gefahrdung in dem obersten gegenüber dem untersten Drittel der Verteilung von jeweils löslichem Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (HR=2,2, P=O5OOl), Interleukin-18 (HR=2,0, P=0,003), löslichem Interleukin-1 Rezeptorantagonist (HR=1,9, P=0,008), löslichem vaskulärem Adhäsionsmolekül- 1 (HR=2,2, P=O5OOl), Matrix Metalloproteinase-9 (HR=2,3, P=0,0004) und Interleukin-6 (HR= 1,6, P=0,02). In Patienten mit akutem Koronarsyndrom waren die Hazard- Verhältnisse, die mit dem obersten Drittel des Markers assoziiert waren, von vergleichbarer Größenordnung zu denjenigen, die in der stabilen Anginagruppe gesehen wurden, mit Ausnahme von Matrix Metalloproteinase-9 und Interleukin-6, die ihre Signifikanz verloren. Umgekehrt war Fibrinogen signifikant mit dem Ausgang in dieser Gruppe assoziiert (HR= 1,9, P=0,03). Lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekül- 1, C-reaktives Protein und lösliches E-Selektin waren nicht mit dem Ausgang in beiden Gruppe assoziiert.Figure 2 shows the hazard ratios of cardiovascular event, adjusted for classical risk factors, according to the increasing thirds of each marker. In the stable angina prospective cardiovascular event group, patients showed an increasing risk in the top compared to the bottom third of the distribution of each soluble tumor necrosis factor receptor 2 (HR = 2.2, P = O 5 OOl), interleukin-18 (HR = 2.0, P = 0.003), soluble interleukin-1 receptor antagonist (HR = 1.9, P = 0.008), soluble vascular adhesion molecule-1 (HR = 2.2, P = O 5 OOI), matrix metalloproteinase-9 (HR = 2.3, P = 0.0004) and interleukin-6 (HR = 1.6, P = 0.02). In patients with acute coronary syndrome, the hazard ratios associated with the top third of the marker were of comparable magnitude to those seen in the stable angina group, with the exception of matrix metalloproteinase-9 and interleukin-6, which were their significance lost. Conversely, fibrinogen was significantly associated with the outcome in this group (HR = 1.9, P = 0.03). Soluble intercellular adhesion molecule-1, C-reactive protein and soluble E-selectin were not associated with the outcome in either group.
Gleichzeitige Ermittlung von multiplen entzündlichen Markern auf kardiovaskulären Ausgang Aufgrund der starken Korrelationen zwischen Markern führten die Erfinder eine schrittweise Cox Regressionsanalyse durch um zu bestimmen, welche der Marker unabhängig mit dem Ausgang assoziiert waren. Das Modell schloss die klassischen Risikofaktoren und löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2, Interleukin-18, löslichen Interleukin-1 Rezeptorantagonist, lösliches vaskuläres Adhäsionsmolekül- 1, Matrix Metalloproteinase-9 und Fibrinogen als die Repräsentativen des Clusters der akute Phase Reaktanten ein. Die durch das Modell ausgewählten Variablen waren lösliches vaskuläres Adhäsionsmolekül- 1 (PO5OOl), löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (P=0,013), Interleukin-18 (P=0,018) und Fibrinogen (P=0,019).Simultaneous detection of multiple inflammatory markers on cardiovascular output Because of the strong correlations between markers, the inventors performed a stepwise Cox regression analysis to determine which of the markers were independently associated with the output. The model included the classic risk factors and soluble tumor necrosis factor receptor 2, interleukin-18, soluble interleukin-1 receptor antagonist, soluble vascular adhesion molecule-1, matrix metalloproteinase-9 and fibrinogen as the representative of the cluster of acute phase reactants. The variables selected by the model were soluble vascular adhesion molecule-1 (PO 5 OOI), soluble tumor necrosis factor receptor 2 (P = 0.013), interleukin-18 (P = 0.018), and fibrinogen (P = 0.019).
Prospektive Evaluierung eines entzündlichen Werts auf kardiovaskulären AusgangProspective evaluation of an inflammatory value on cardiovascular outcome
Basierend auf diesen Ergebnissen erzeugten die Erfinder einen entzündlichen Wert, der die oberen Drittel von löslichem Tumomekrosefaktor-Rezeptor-2, löslichem vaskulärem Adhäsionsmolekül- 1, Interleukin-18 und Fibrinogen zusammenfasste. Der Wert eines Individuums wurde als die Zahl von Marker in dem oberen Drittel definiert. Der Wert variierte von 0 bis 4, mit 24,9% (26,3%), 34,3% (35,4%), 26,6% (23,7%), 10,9% (11%) und 3,3% (3,6%) of Patienten mit stabiler Angina (jeweils akutes Koronarsyndrom) die jeweils 0, 1, 2, 3 und 4 Marker im oberen Drittel aufwiesen.Based on these results, the inventors generated an inflammatory score that summarized the upper thirds of soluble tumor necrosis factor receptor-2, soluble vascular adhesion molecule-1, interleukin-18, and fibrinogen. The value of an individual was defined as the number of markers in the upper third. The value varied from 0 to 4, with 24.9% (26.3%), 34.3% (35.4%), 26.6% (23.7%), 10.9% (11%) and 3.3% (3.6%) of patients with stable angina (acute coronary syndrome) who had 0, 1, 2, 3, and 4 markers in the upper third, respectively.
Der entzündliche Wert war stark mit kardiovaskulärem Ausgang assoziiert, auf eine sehr ähnliche Weise in stabiler Angina- und akutem Koronarsyndrom-Patienten (Tabelle 3). Patienten, die drei erhöhte Marker aufwiesen, wiesen eine 4-fache Erhöhung an Gefährdung auf, verglichen mit Patienten, die keinen erhöhten Marker aufwiesen, während diejenigen mit vier erhöhten Markern eine 7- bis 8-fache Erhöhung an Gefährdung hatten. Die Anpassung an klassische Risikofaktoren modifizierte die Hazard-Verhältnisse wenig (Tabelle 3). Figur 3 stellt die Kaplan-Meier Überlebenskurven nach dem entzündlichen Wert in stabilen Angina- (Panel A) und akutes Koronarsyndrom- (Panel B) Patienten dar.The inflammatory value was strongly associated with cardiovascular output, in a very similar manner in stable angina and acute coronary syndrome patients (Table 3). Patients who had three elevated markers had a 4-fold increase in risk compared to patients who did not have an elevated marker, while those with four elevated markers had a 7 to 8-fold increase in hazard. The adaptation to classical risk factors did little to modify the hazard ratios (Table 3). Figure 3 presents the Kaplan-Meier survival curves by inflammatory value in stable angina (Panel A) and acute coronary syndrome (Panel B) patients.
Um zu bestimmen, ob der entzündliche Wert, der diese 4 Marker einschloss im Hinblick auf Information besser als Werte mit weniger Markern war, verglichen die Erfinder den AIC Wert des Cox Modells basierend auf dem 4-Marker Wert mit denjenigen der besten 1 -Marker-, 2- Marker- und 3-Marker- Werte (Figur 4). Das minAIC wurde für den 4-Marker Wert erhalten (auf 0 gesetzt) und wurde als die beste empirische Stützung aufweisend betrachtet. Werte die eine geringere Zahl von Markern aufwiesen hatten eine schlechtere empirische Stützung (AIC Differenz > 4), wohingegen das best Modell basierend auf einem 5-Marker nicht dem 4-Marker Wert im Hinblick auf Information überlegen war (AIC Differenz < 2). Als ein Maß der klinischen Brauchbarkeit untersuchten die Erfinder, ob der entzündliche Wert zusätzliche Information über die durch traditionelle Risikofaktoren hinaus hinzufügte. Die Hinzufύgung des entzündlichen Werts zu herkömmlichen Risikofaktoren erhöhte die Fläche unter der Receiver-operating- Charakteristika Kurve von 0,63 auf 0,68,To determine whether the inflammatory value, which included these 4 markers in terms of information, was better than values with fewer markers, the inventors compared the AIC value of the Cox model based on the 4-marker value with those of the best 1 markers. , 2-marker and 3-marker values (FIG. 4). The minAIC was obtained for the 4-marker value (on 0) and was considered to have the best empirical support. Values that had a lower number of markers had worse empirical support (AIC difference> 4), whereas the best model based on a 5 marker was not superior to the 4-marker value in terms of information (AIC difference <2). As a measure of clinical usefulness, the inventors examined whether the inflammatory value added additional information beyond that provided by traditional risk factors. The addition of the inflammatory value to conventional risk factors increased the area under the receiver operating characteristics curve from 0.63 to 0.68,
Tabelle 1. Basislinien-Charakteristika von Patienten mit und ohne kardiovaskulärem Ereignis während der NachfolgezeitTable 1. Baseline characteristics of patients with and without cardiovascular event during follow-up
Charakteristika Patienten ohne Patienten mit P-Wert* kardiovaskuläres kardiovaskuläremCharacteristics Patients without patients with P-value * cardiovascular cardiovascular
Ereignis (n = 1057) Ereignis (n = 235)Event (n = 1057) Event (n = 235)
Alter, Jahre 61,1 + 0,3 64,8 ± 0,7 0,001Age, years 61.1 + 0.3 64.8 ± 0.7 0.001
Body-Mass-Index, kg/m2 27,0 + 0,1 27,0 + 0,2 0,69Body mass index, kg / m 2 27.0 + 0.1 27.0 + 0.2 0.69
Männlich, % 75,2 75,3 0,94Male,% 75.2 75.3 0.94
Hochdruck, % 71,1 73,2 0,92High pressure,% 71.1 73.2 0.92
Diabetes mellitus, % 26,0 37,5 0,004Diabetes mellitus,% 26.0 37.5 0.004
Familiäre Geschichte von CAD 41,3 32,3 0,04Family History of CAD 41.3 32.3 0.04
Raucher 25,0 24,3 0,04Smoker 25.0 24.3 0.04
Lipidstatuslipid status
Gesamt-Cholesterin, mg/dl 220,1 + 1,4 220,8 + 2,9 0,86Total cholesterol, mg / dl 220.1 + 1.4 220.8 + 2.9-086
LDL-Cholesterin, mg/dl 141,7 + 1,2 142,2 + 2,6 0,83LDL cholesterol, mg / dl 141.7 + 1.2 142.2 + 2.6 0.83
HDL-Cholesterin, mg/dl 48,1 + 0,4 45,0 + 0,9 0,002HDL cholesterol, mg / dl 48.1 + 0.4 45.0 + 0.9 0.002
Triglyceride, mg/dl 166,4 + 3,3 179,7 + 7,1 0,01Triglycerides, mg / dl 166.4 + 3.3 179.7 + 7.1 0.01
Vorheriger MI, % 48,3 54,5 0,11Previous MI,% 48.3 54.5 0.11
Zahl von beeinträchtigtenNumber of affected
Koronararterien, %Coronary arteries,%
1 Gefäß 27,2 20,41 vessel 27.2 20.4
2 Gefäße 29,0 30,2 0,282 vessels 29.0 30.2 0.28
> 3 Gefäße 43,8 49,4> 3 vessels 43.8 49.4
Ausstoßfraktion < 40, % t 6,8 25,3 <0,001Discharge fraction <40,% t 6.8 25.3 <0.001
Medikation bei AufnahmeMedication on admission
Beta-Blocker 59,4 51,1 0,10Beta-blocker 59.4 51.1 0.10
ACE Inhibitoren 47,0 58,3 0,01 Calcium Antagonisten 17,1 17,0 0,40ACE inhibitors 47.0 58.3 0.01 Calcium antagonists 17.1 17.0 0.40
Statine H5 25,5 0,051Statins H5 25.5 0.051
Kategorische Variablen sind als Prozent von Patienten, kontinuierliche Variablen sind als Altersund Geschlecht-angepasste Mittelwerte + Standardabweichung angegeben * Der Zusammenhang zwischen kardiovaskulärem Ausgang und jeder Variable (kategorisch oder kontinuierlich) wurden durch Cox Regressionsanalyse, eingestellt auf Alter und Geschlecht, bestimmt f Die Ausstoßfraktion wurde bei 1083 Patienten bestimmt. ACE - Angiotensin überführendes Enzym CAD - Koronare Arterienerkrankung MI - Myokardinfarkt Categorical variables are expressed as percent of patients, continuous variables are given as age- and sex-adjusted means + standard deviation. * The relationship between cardiovascular output and each variable (categorical or continuous) was determined by Cox regression analysis, adjusted for age and gender. F The ejection fraction was determined in 1083 patients. ACE - angiotensin converting enzyme CAD - coronary artery disease MI - myocardial infarction
Tabelle 2, Alters- und Geschlechts-angepaßte zirkulierende Spiegel von entzündlichem Marker in Patienten mit und ohne kardiovaskulärem Ereignis während der NachfolgezeitTable 2, age- and sex-matched circulating levels of inflammatory marker in patients with and without cardiovascular event during follow-up
Patienten mit stabiler Angina Patienten mil : akutem KoronarsyndromPatients with stable angina patients with: acute coronary syndrome
Ohne Mit P-Wertf Ohne Mit P-Wertf P- Wert für kardiovaskuläres kardiovaskulärem kardiovaskuläres kardiovaskulärem InteractionjWithout P-Value Without P-Value f P-value for cardiovascular cardiovascular cardiovascular cardiovascular interaction
Ereignis (n=711) Ereignis (n=164) Ereignis (n=346) Ereignis (n=71) sTNF-Rl, pg/ml 1765,0 1906,4 0,053 1744,4 2185,8 0,005 0,09Event (n = 711) Event (n = 164) Event (n = 346) Event (n = 71) sTNF-Rl, pg / ml 1765.0 1906.4 0.053 1744.4 2185.8 0.005 0.09
1699,4 - 1833,2 1755,5 - 2070,2 1645,4 - 1849,3 1924,8 - 2482,0 sTNF-R2, pg/ml 3175,5 3603,4 0,004 3337,4 4525,5 O5OOOl 0,041699.4 - 1833.2 1755.5 - 2070.2 1645.4 - 1849.3 1924.8 - 2482.0 sTNF-R2, pg / ml 3175.5 3603.4 0.004 3337.4 4525.5 O 5 OOOl 0.04
3059,2 - 3296,2 3322,3 - 3908,3 3166,4 - 3517,6 4035,8 - 5074,7 sIL-IRa, ng/ml 282,1 363,8 0,001 319,8 499,8 0,0001 0,303059.2 - 3296.2 3322.3 - 3908.3 3166.4 - 3517.6 4035.8 - 5074.7 sIL-IRa, ng / ml 282.1 363.8 0.001 319.8 499.8 0, 0001 0.30
264,8 - 300,5 317,1 - 417,4 290,4 - 352,2 405,1 - 616,7264.8 - 300.5 317.1 - 417.4 290.4 - 352.2 405.1 - 616.7
IL-18, pg/ml 60,0 65,0 0,06 61,5 73,2 0,003 0,18IL-18, pg / ml 60.0 65.0 0.06 61.5 73.2 0.003 0.18
58,0 - 62,1 60,3 - 70,0 58,7 - 64,5 65,8 - 81,5 sICAM-1, ng/ml 272,7 300,5 0,03 288,4 308,1 0,26 0,8358.0 - 62.1 60.3 - 70.0 58.7 - 64.5 65.8 - 81.5 sICAM-1, ng / ml 272.7 300.5 0.03 288.4 308.1 0.26 0.83
262,4 - 283,5 276,7 - 326,4 274,2 - 303,2 274,8 - 345,4 sVCAM-1, ng/ml 1123,4 1312,1 0,0005 1285,1 1468,2 0,052 0,91262.4 - 283.5 276.7 - 326.4 274.2 - 303.2 274.8 - 345.4 sVCAM-1, ng / ml 1123.4 1312.1 0.0005 1285.1 1468.2 0.052 0.91
1085,3 - 1162,9 1214,2 - 1417,9 1218,7 - 1355,2 1296,9 - 1662,2 sE-Selektin, ng/ml* 64,3 67,5 0,41 63,1 66,3 0,43 0,981085.3 - 1162.9 1214.2 - 1417.9 1218.7 - 1355.2 1296.9 - 1662.2 sE-selectin, ng / ml * 64.3 67.5 0.41 63.1 66, 3 0.43 0.98
61,5 - 67,1 61,3 - 74,1 58,9 - 67,3 56,6 - 76,761.5 - 67.1 61.3 - 74.1 58.9 - 67.3 56.6 - 76.7
MMP-9, ng/ml 48,2 60,9 0,0001 47,1 56,3 0,10 0,35MMP-9, ng / ml 48.2 60.9 0.0001 47.1 56.3 0.10 0.35
46,1 - 50,5 55,2 - 67,2 43,6 - 50,9 47,2 - 67,146.1 - 50.5 55.2 - 67.2 43.6 - 50.9 47.2 - 67.1
IL-6, ng/ml 8,9 12,4 0,005 12,1 18,5 0,005 0,38IL-6, ng / ml 8.9 12.4 0.005 12.1 18.5 0.005 0.38
8,1-9,8 10,1-15,2 10,6-13,8 13,7-24,88.1-9.8 10.1-15.2 10.6-13.8 13.7-24.8
Fibrinogen, mg/dl 336,4 361,2 0,007 341,7 384,3 0,003 0,34Fibrinogen, mg / dl 336.4 361.2 0.007 341.7 384.3 0.003 0.34
329,0 - 343,9 344,8 - 378,3 330,0 - 353,8 355,5 - 415,3 hs-CRP, mg/1 4,5 5,6 0,059 6,5 9,7 0,016 0,36329.0 - 343.9 344.8 - 378.3 330.0 - 353.8 355.5 - 415.3 hs-CRP, mg / 1 4.5 5.6 0.059 6.5 9.7 0.016 0 , 36
4,1 - 5,0 4,6 - 6,9 5,6 - 7,5 7,0 - 13,44.1 - 5.0 4.6 - 6.9 5.6 - 7.5 7.0 - 13.4
Eine log oder * Quadratwurzel-Transformation wurde verwendet, um die Verteilung jedes Markers zu normalisieren, und antiloge oder quadratisierte Mittel (95% Konfidenzintervall) sind angegeben. A log or * square root transform was used to normalize the distribution of each marker, and antilog or squared means (95% confidence interval) are given.
f Der Zusammenhang zwischen kardiovaskulärem Ausgang und jedem entzündlichen Marker und Interaktion mit klinischem Status wurden durch Cox Regressionsanalyse, eingestellt auf Alter und Geschlecht, bestimmt sTNF-Rl (R2): löslicher Tumornekrosefaktor Rezeptor 1 (Rezeptor 2)f The association between cardiovascular outcomes and each inflammatory marker and interaction with clinical status was determined by Cox regression analysis, adjusted for age and gender. sTNF-R1 (R2): soluble tumor necrosis receptor 1 receptor (receptor 2)
IL-6, IL-18: Interleukin-6 oder 18 sIL-IRa: löslicher IL-I Rezeptorantagonist sICAM-1: lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekül- 1 sV CAM-I: lösliches vaskuläres Zelladhäsionsmolekül-1IL-6, IL-18: Interleukin-6 or 18 sIL-IRa: soluble IL-1 receptor antagonist sICAM-1: soluble intercellular adhesion molecule-1 sV CAM-I: soluble vascular cell adhesion molecule-1
MMP-9: Matrix Metalloproteinase-9 hs-CRP: hoch-sensitives C reaktives Protein MMP-9: Matrix metalloproteinase-9 hs-CRP: highly sensitive C reactive protein
Tabelle 3 Hazard-Verhältnisse von zukünftigem kardiovaskulärem Ereignis gemäß eines multiplen entzündlichen Markerwerts basierend auf sTNFR2, sVCAM-1, IL- 18 und Fibrinogen (ein Wert eines Individuums stellt die Zahl an Markern im oberen Drittel dar)Table 3 Hazard ratios of future cardiovascular event according to a multiple inflammatory marker value based on sTNFR2, sVCAM-1, IL-18 and fibrinogen (a value of an individual represents the number of markers in the upper third)
Stabile Angina pectorisStable angina pectoris
Entzündlicher Wert unter der Verwendung von Cutoff-Punkten, basierend auf oberen Dritteln 0 1 2 3 4 P für TrendFlammable value using cutoff points based on upper thirds 0 1 2 3 4 P for trend
No. 13/165 28/227 26/176 21/72 11/22No. 13/165 28/227 26/176 21/72 11/22
% 7,9 12,3 14,8 29,2 50,0% 7.9 12.3 14.8 29.2 50.0
Rohe Hazard-VerhältnisseRaw hazard ratios
HR 1,00 1,61 1,96 4,08 8,45 O5OOOlHR 1.00 1.61 1.96 4.08 8.45 O 5 OOOl
95% CI - 0,84 - 3,11 1,01 - 3,82 2,04 - 8,15 3,78 - 18,8695% CI - 0.84 - 3.11 1.01 - 3.82 2.04 - 8.15 3.78 - 18.86
P-Wert - 0,15 0,047 0,0001 0,0001P value - 0.15 0.047 0.0001 0.0001
Eingestellte-Hazard- Verhältnisse*Set hazard ratios *
HR 1,00 1,57 1,80 3,69 7,17 O5OOOlHR 1.00 1.57 1.80 3.69 7.17 O 5 OOOl
95% CI - 0,81 - 3,05 0,91 - 3,56 1,80 - 7,54 3,03 - 16,9795% CI - 0.81 - 3.05 0.91 - 3.56 1.80 - 7.54 3.03 - 16.97
P-Wert _ 0,18 0,09 0,0004 0,0001 Akutes KoronarsyndromP-value _ 0.18 0.09 0.0004 0.0001 Acute coronary syndrome
Entzündlicher Wert unter der Verwendung von Cutoff-Punkten, basierend auf oberen Dritteln 0 1 2 3 4 P für TrendFlammable value using cutoff points based on upper thirds 0 1 2 3 4 P for trend
No. 7/81 16/109 12/73 10/34 5/11No. 7/81 16/109 12/73 10/34 5/11
% 8,6 14,7 16,4 29,4 45,5% 8.6 14.7 16.4 29.4 45.5
Rohe Hazard-VerhältnisseRaw hazard ratios
HR 1,00 1,76 1,94 3,94 6,98 0,0003 95% CI 0,73 - 4,29 0,76 - 4,92 1,50 -10,34 2,21 - 22,03 P-Wert 0,21 0,16 0,005 0,0009HR 1.00 1.76 1.94 3.94 6.98 0.0003 95% CI 0.73 - 4.29 0.76 - 4.92 1.50 -10.34 2.21 - 22.03 P value 0.21 0.16 0.005 0.0009
Eingestellte-Hazard- Verhältnisse*Set hazard ratios *
HR 1,00 1,80 1,67 3,45 5,07 0,005 95% CI 0,73 - 4,45 0,64 - 4,31 1,26 - 9,46 1,49 - 17,27 P-Wert 0^20 0,29 0,016 0,009HR 1.00 1.80 1.67 3.45 5.07 0.005 95% CI 0.73-4.45 0.64-4.31 1.26-9.46 1.49-17.27 P- Value 0 ^ 20 0.29 0.016 0.009
* Eingestellt auf Alter, Geschlecht, Body-Mass-Index, Rauchen, Geschichte von Bluthochdruck oder Diabetes, HDL-Cholesterin, Statintherapie und die Zahl von erkrankten Gefäßen* Listed by age, gender, body mass index, smoking, history of high blood pressure or diabetes, HDL cholesterol, statin therapy and the number of diseased vessels
Beispiel 2 - ResistinExample 2 - Resistin
Methoden: Bei 1194 Patienten mit dokumentierter KHK wurde zum Zeitpunkt des Studieneinschlusses Resistin (ng/ml) bestimmt. Patienten präsentierten sich mit stabiler Angina pectoris (AP), Troponin negativer instabiler AP, subakuten und akuten Myokardinfarkt (MI). Während des Beobachtungszeitraumes von 3,2 ± 0,9 Jahren wurde ein Follow up (f/u) bei 1171 Patienten (98,1%) durchgeführt.Methods: Resistin (ng / ml) was determined in 1194 patients with documented CHD at the time of study enrollment. Patients presented with stable angina pectoris (AP), troponin negative unstable AP, subacute and acute myocardial infarction (MI). During the observation period of 3.2 ± 0.9 years, follow-up (f / u) was performed in 1171 patients (98.1%).
Ergebnisse: Es besteht eine signifikante Assoziation zwischen Resistin Konzentration und Troponin negativer instabiler AP sowie AMI (Tabelle 4). Bei Patienten mit erhöhtem Mortalitätsrisiko ist Resistin erhöht (5,8 ng/ml vs. 6,6 ng/ml; p=0,068). Der Anstieg pro Standardabweichung geht mit einem l,3fach (95% CI 1,1-1,5; p=0,008) erhöhten Mortalitätsrisiko einher.Results: There is a significant association between resist concentration and troponin negative unstable AP and AMI (Table 4). In patients at increased mortality risk, resistin is elevated (5.8 ng / ml vs. 6.6 ng / ml, p = 0.068). The increase per Standard deviation is associated with a l, 3-fold (95% CI 1.1-1.5, p = 0.008) increased mortality risk.
Nach Einstellung auf Alter und Geschlecht besteht eine signifikante Assoziation mit zukünftigen kardialen Ereignissen (Hazard Risiko Verhältnis (HRR) 1,2 (95% CI 1,0-1,5; p=0,02). Diese Assoziation bleibt nach Einstellung auf Diabetes und Nikotin nicht mehr unabhängig signifikant, da Diabetes (p=0,08) und Nikotin (p=0,06) starke Resistin- sowie Mortalitätsprädiktoren darstellen.After adjustment for age and gender, there is a significant association with future cardiac events (hazard risk ratio (HRR) 1.2 (95% CI 1.0-1.5, p = 0.02).) This association remains after adjustment for diabetes and nicotine are no longer independently significant, as diabetes (p = 0.08) and nicotine (p = 0.06) are strong resistance and mortality predictors.
Tabelle 4Table 4
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000031_0001
Plasmakonzentration des Resistins (ng/ml)Plasma concentration of the resistin (ng / ml)
Bei Patienten mit Brustschmerz besitzt Resistin somit eine hohe Aussagekraft über das Risiko eines akuten Koronarsyndroms und ist moderat mit dem Mortalitätsrisiko assoziiert.Resistin is highly predictive of the risk of acute coronary syndrome in patients with chest pain and is moderately associated with mortality risk.
Beispiel 3 - Caspase-1;Example 3 - caspase-1;
Tabelle 5 Hazard- Verhältnisse von zukünftigem kardiovaskulären Ereignis gemäß Quartilen von Caspase-1 PlasmakonzentrationTable 5 Hazard ratios of future cardiovascular event according to quartiles of caspase-1 plasma concentration
Quartile Ql Q2 Q3 Q4 nτ ^ ,..Quartile Ql Q2 Q3 Q4 nτ ^, ..
Caspase-1 (pg/mL) < 35,9 36,0 - 48,3 48,4 - 64,1 >64,1 ^«t teCaspase-1 (pg / mL) <35.9 36.0 - 48.3 48.4 - 64.1> 64.1 ^ te
Trendtrend
Zahl der Ereignisse 9/468 12/472 13/473 37/474Number of events 9/468 12/472 13/473 37/474
% Ereignisse 1,9 2,5 2,7 7,8 Modell 1% Events 1.9 2.5 2.7 7.8 Model 1
Hazard-Verhältnis (HR) 1,27 1,47 3,95 <0,0005 95% CI 0,53 - 3,07 0,63 - 3,45 1,90 - 8,20 P-Wert 0,59 0,37 <0,0005 Modell 2Hazard Ratio (HR) 1.27 1.47 3.95 <0.0005 95% CI 0.53 - 3.07 0.63 - 3.45 1.90 - 8.20 P value 0.59 0 , 37 <0.0005 Model 2
HR 1,27 1,46 3,68 <0,0005HR 1.27 1.46 3.68 <0.0005
95% CI 0,53-3,06 0,63-3,42 1,77-7,65 P-Wert 0,60 0,38 0,0005 Modell 395% CI 0.53-3.06 0.63-3.42 1.77-7.65 P-value 0.60 0.38 0.0005 Model 3
HR 1,26 1,32 3,23 0,001HR 1.26 1.32 3.23 0.001
95% CI 0,52-3,06 0,56-3,09 1,55-6,73 P-Wert 0,60 0,53 0,002 Modell 495% CI 0.52-3.06 0.56-3.09 1.55-6.73 P-value 0.60 0.53 0.002 Model 4
HR 1,21 1,28 3,14 0,001HR 1.21 1.28 3.14 0.001
95% CI 0,50-2,93 0,54-3,01 1,50-6,58 P-Wert 0,67 0,58 0,002 Modell 595% CI 0.50-2.93 0.54-3.01 1.50-6.58 P-value 0.67 0.58 0.002 Model 5
HR 1,21 1,37 3,48 0,0005HR 1.21 1.37 3.48 0.0005
95% CI 0,50-2,94 0,58-3,21 1,67-7,23 P-Wert 0,66 0,47 0,00195% CI 0.50-2.94 0.58-3.21 1.67-7.23 P value 0.66 0.47 0.001
Modell 1 ist nicht kontrolliert; Modell 2 ist kontrolliert auf Alter und Geschlecht; Modell 3 ist zusätzlich kontrolliert auf BMI, Geschichte von Hochdruck, Diabetes, Rauchen, HDL-Model 1 is not controlled; Model 2 is controlled by age and sex; Model 3 is additionally controlled for BMI, history of hypertension, diabetes, smoking, HDL
Cholesterinspiegel, FHCholesterol level, FH
Modell 4 zusätzlich eingestellt auf multiple Gefäßerkrankung, Statin und beta-Model 4 additionally adjusted to multiple vascular disease, statin and beta
Blockertherapie, ACSBlocker therapy, ACS
Modell 5 wird durch Forward-Wahrscheinlichkeits- Verhältnis variable Auswahl aus allenModel 5 is made by forward-probability variable selection from all
Variablen in Modell 4 erhaltenReceived variables in model 4
Modell 1Model 1
Variablen in der GleichungVariables in the equation
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Figure imgf000032_0001
Modell 2 Variablen in der GleichungModel 2 Variables in the equation
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Modell 3Model 3
Variablen in der GleichungVariables in the equation
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Modell 4Model 4
Variablen in der GleichungVariables in the equation
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Modell 5
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Model 5
Variablen in der GleichungVariables in the equation
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000034_0001
Beispiel 4 - TIMP-IExample 4 - TIMP-I
Studienpopulationstudy population
Zwischen Juni 1999 und Februar 2004 wurden 1979 Patienten in das AthexoGene Register wie in Beispiel 1 aufgenommen. Zusätzlich wurden Diabetes mellitus, Bluthochdruck und Hyperlipoproteinämie diagnostiziert und die Patienten nach ihren Rauchgewohnheiten aufgeteilt.Between June 1999 and February 2004, patients were enrolled in the AthexoGene registry in 1979 as in Example 1. In addition, diabetes mellitus, hypertension and hyperlipoproteinemia were diagnosed and patients were divided according to their smoking habits.
Eine Gesamtzahl von 1945 (98,4%) Patienten wurde während einer mittleren Zeitdauer von 2,6 (Maximum 5,0) Jahren nach- verfolgt. Es gab 75 Tote aus kardiovaskulären Gründen, 33 Tote aus anderen Gründen, und 47 nicht fatale Myokardinfarkte und 49 nicht fatale Schlaganfälle. Die Information über die Todesursache oder klinische Ereignisse wurden aus Krankenhaus- oder Arztpraxisakten erhalten.A total of 1945 (98.4%) patients were followed up for a median of 2.6 (maximum 5.0) years. There were 75 deaths for cardiovascular reasons, 33 deaths for other reasons, and 47 nonfatal myocardial infarctions and 49 nonfatal strokes. Information about the cause of death or clinical events was obtained from hospital or physician's medical records.
Laborverfahrenlaboratory procedures
Blut wurde von allen Studiensubjekten unter standardisierten Bedingungen abgenommen, bevor die Koronarangiographie durchgeführt wurde. Die Proben wurden bei 4000g für 10 Minuten zentrifugiert, in Aliquots aufgeteilt und bei -80°C bis zur Analyse gelagert. Serum TIMP-I wurde unter der Verwendung der ELISA Technik gemäß den Anweisungen des Herstellers (Human, Biotrak, ELISA System, Amersham Biosciences, USA) mit einem Bereich von 3,1 - 50 ng/ml bestimmt. Der Test wies einen innerhalb des Tests Koeffizienten der Variation von zwischen 8,9 - 11,4 % und einen zwischen den Tests Koeffizienten der Variation von zwischen 13,1 - 15,25 % auf.Blood was withdrawn from all study subjects under standardized conditions before coronary angiography was performed. The samples were at 4000g for 10 Centrifuged, aliquoted and stored at -80 ° C until analysis. Serum TIMP-I was determined using the ELISA technique according to the manufacturer's instructions (Human, Biotrak, ELISA System, Amersham Biosciences, USA) at a range of 3.1-50 ng / ml. The test had a variation coefficient of between 8.9 - 11.4% within the test and between 13.1 - 15.25% variation between the test coefficients.
Plasma BNP wurde unter der Verwendung eines Fluoreszenz Immuntest (Biosite Diagnostics Inc., San Diego, Kalifornien) bestimmt. Die angegebene Nach weisgrenze ist weniger als 5 pg/ml. Der Test wies einen zwischen den Tests Koeffizienten der Variation von nahe 10 % auf, und eine Ausbeute von 100% von hinzugefügtem Peptid wurde gefunden. C-reaktives Protein und Lipid Serumspiegel wurden wie in Beispiel 1 und durch Standardverfahren bestimmt.Plasma BNP was determined using a fluorescence immunoassay (Biosite Diagnostics Inc., San Diego, California). The indicated detection limit is less than 5 pg / ml. The test showed a coefficient of variation of close to 10% between tests and a yield of 100% of added peptide was found. C-reactive protein and lipid serum levels were determined as in Example 1 and by standard methods.
Statistische AnalyseStatistical analysis
Mittlere Spiegel und Anteile von Basislinien kardiovaskulären Risikofaktoren wurden für Patienten mit und ohne kardiovaskulärem Tod berechnet. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Mitteln für die zwei Gruppen wurde mit dem Studenten t-Test ermittelt, und die Signifikanz der Unterschiede in Anteilen wurde mit der chi-Quadrat Statistik getestet. Variablen mit einer verzerrten Verteilung wurden als Mediane dargestellt und der Mann- Whitney-U Test wurde angewendet. Um die Assoziierung zwischen TIMP-I und Überleben zu untersuchen, verwendeten die Erfinder das Kaplan-Meier Verfahren und den log-rank Test. Der primäre Endpunkt war Tod aus kardiovaskulären Gründen. Die Daten von Patienten, die aus anderen Gründen starben wurden zum Zeitpunkt des Todes zensiert. Um die Verteilung von verzerrten Variablen zu normalisieren, wurde eine log Transformation durchgeführt. Zusätzlich, um den unabhängigen prädiktiven Wert von Dritteln von TIMP-I Spiegel auf das Risiko von kardiovaskulärem Tod anzuzeigen, wurden verschiedene Cox Regressionsmodelle durchgeführt. Das erste Modell wurde auf Alter und Geschlecht angepasst und das zweite zusätzlich auf traditionelle Risikofaktoren sowie klinische und therapeutische Variablen. Eine weitere Einstellung wurde für Ausstoßfraktion (Modell 3) vorgenommen und zuletzt für andere kardiovaskuläre Biomarker (Modell 4). Subgruppen- Analysen wurden durch Konstruieren von Cox Regressionsmodellen durchgeführt, wobei die oberen gegenüber den unteren Dritteln von TIMP-I verglichen wurden. Zuletzt wurde die prognostische Stärke von neuen Biomarkern durch Berechnen der Hazard Verhältnisse für das obere Drittel jedes Biomarkers in verschiedenen Cox Regressionsmodellen, eingestellt auf kardiovaskuläre Confounder, und zusätzlich für alle drei Marker gleichzeitig verglichen. Die Hazard Verhältnisse und 95 Prozent Konfidenzintervalle sind dargestellt. Die P Werte sind zweiseitig; Werte von p < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Alle Berechnungen wurden unter der Verwendung des SPSS Version 11,05 Programms verglichen.Mean levels and baseline cardiovascular risk factors were calculated for patients with and without cardiovascular death. The significance of the differences between the means for the two groups was determined by the Student t-test, and the significance of the differences in proportions was tested with the chi-square statistic. Variables with a distorted distribution were presented as medians and the Mann-Whitney-U test was used. To investigate the association between TIMP-I and survival, the inventors used the Kaplan-Meier method and the log-rank test. The primary end point was death for cardiovascular reasons. Data from patients who died for other reasons were censored at the time of death. To normalize the distribution of distorted variables, a log transformation was performed. In addition, to assess the independent predictive value of thirds of TIMP-I levels on the risk of cardiovascular death, various Cox regression models were performed. The first model was adapted to age and gender and the second to traditional risk factors as well as clinical and therapeutic variables. Another adjustment was made for ejection fraction (model 3) and last for other cardiovascular biomarkers (model 4). Subgroup analyzes were performed by constructing Cox regression models, comparing the upper and lower thirds of TIMP-I. Lastly, the prognostic strength of new biomarkers was calculated by calculating the hazard ratios for the upper third of each Biomarkers in different Cox regression models, adjusted for cardiovascular confounders, and additionally compared for all three markers simultaneously. The hazard ratios and 95 percent confidence intervals are shown. The P values are two-sided; Values of p <0.05 were considered significant. All calculations were compared using the SPSS version 11.05 program.
Basislinien CharakteristikaBaseline characteristics
Tabelle 6 stellt die Basislinien Charakteristika der 75 Studien-Teilnehmer zur Verfügung, die anschließend aus kardiovaskulären Gründen starben und der 1870, die kein zukünftiges kardiovaskuläres Ereignis hatten. Die linke ventrikuläre Ausstoßfraktion, wie durch Angiographie bestimmt, war signifikant höher in Patienten ohne kardiovaskulären Tod (P < 0,001).Table 6 provides baseline characteristics of the 75 study participants who subsequently died for cardiovascular reasons and 1870 who had no future cardiovascular event. The left ventricular ejection fraction as determined by angiography was significantly higher in patients without cardiovascular death (P <0.001).
Tabelle 6: Basislinien CharakteristikaTable 6: Baseline Characteristics
Charakteristika Patienten ohne Patienten mit P-Wert kardiovaskuläres Tod kardiovaskulärem (n = 1870) Tod (n = 75)Characteristics Patients without patients with P-value Cardiovascular death Cardiovascular death (n = 1870) Death (n = 75)
Alter, Jahre 61,0 + 9,6 65,2 + 9,6 0,0001Age, years 61.0 + 9.6 65.2 + 9.6 0.0001
Männlich, % 79,0 74,7 0,36Male,% 79.0 74.7 0.36
Body-Mass-Index, kg/m2 27,7 ± 3,9 27,5 ± 4,2 0,55Body mass index, kg / m 2 27.7 ± 3.9 27.5 ± 4.2 0.55
Diabetes mellitus, % 0,0001 keine 84,0 62,7Diabetes mellitus,% 0.0001 no 84.0 62.7
Orale Medikation 8,6 9,3Oral medication 8,6 9,3
Insulin-abhängig 7,4 28,0Insulin-dependent 7.4 28.0
Hochdruck, % 74,8 76,0 0,82High pressure,% 74.8 76.0 0.82
Raucher (%) 0,27Smoker (%) 0.27
Nie geraucht 35,8 30,7Never smoked 35.8 30.7
Früher Raucher 44,9 42,7Early smoker 44.9 42.7
Raucher 19,3 26,7Smoker 19.3 26.7
Lipid-VariablenLipid variables
LDL-Cholesterin, mg/dl 127 ± 41,3 124 + 39,0 0,56LDL cholesterol, mg / dl 127 ± 41.3 124 + 39.0 0.56
HDL-Cholesterin, mg/dl 49,5 + 13,6 45,8 + 13,4 0,02HDL cholesterol, mg / dl 49.5 + 13.6 45.8 + 13.4 0.02
Triglyceride, mg/dl 131 (96-184) 149 (102-179) 0,34Triglycerides, mg / dl 131 (96-184) 149 (102-179) 0.34
Familiäre Geschichte von CAD 37,6 28,0 0,09Family History of CAD 37.6 28.0 0.09
Herz-Medikation (%)Heart medication (%)
Beta-Blocker 65,1 50,7 0,01Beta-blocker 65.1 50.7 0.01
Statine 50,4 49,3 0,86Statins 50.4 49.3 0.86
ACE Inhibitoren 49,3 53,3 0,49 Klinische VariablenACE inhibitors 49.3 53.3 0.49 Clinical variables
Zahl von beeinträchtigten 0,003Number of affected 0.003
Koronararterien, %Coronary arteries,%
1 Gefäß 27,8 12,01 vessel 27.8 12.0
2 Gefäße 31,3 30,72 vessels 31,3 30,7
> 3 Gefäße 40,9 57,3> 3 vessels 40.9 57.3
Geschichte eines 36,8 53,3 0,004History of a 36.8 53.3 0.004
Myokardinfarkts %Myocardial infarction%
Linke Ausstoßfraktion % 63,4 + 15,0 49,3 + 18,6 0,0001Left ejection fraction% 63.4 + 15.0 49.3 + 18.6 0.0001
Biomarkerbiomarkers
Gewebe Inhibitor von 692 + 220 820 + 264 0,0001Tissue inhibitor of 692 + 220 820 + 264 0.0001
Metalloproteinase 1 (ng/ml) 673 (559-798) 779 (635-894)Metalloproteinase 1 (ng / ml) 673 (559-798) 779 (635-894)
B -Typ natriuretisches Peptid 48,4 (16,4-144) 233 (58,9-594) O5OOOlB-type natriuretic peptide 48.4 (16.4-144) 233 (58.9-594) O 5 OOOl
(ρg/ml)(Ρg / ml)
C-reaktives Protein (mg/1) 3,1 (1,4-7,6) 6,9 (2,9-23,0) 0,0001C-reactive protein (mg / l) 3.1 (1.4-7.6) 6.9 (2.9-23.0) 0.0001
Creatinin (mg/dl) 0,93 (0,82-1,06) 1,09 (0,89-1,29) O5OOOlCreatinine (mg / dl) 0.93 (0.82-1.06) 1.09 (0.89-1.29) O 5 OOOl
Der TIMP-I Spiegel war unter den Studien-Teilnehmern normal verteilt. Er reichte von 6,0 bis 2667 ng/ml, mit einem Mittel (+ SD) von 699 + 225, einem Median von 676 und einem interquartilen Bereich von 561 bis 803 ng/ml. Der Basislinien Spiegel der TIMP-I Aktivität war signifikant höher zwischen denjenigen, die aus kardiovaskulären Ursachen starben, als zwischen denjenigen, die nicht daran starben (820 gegenüber 692 ng/ml; P < 0,0001). Wie erwartet, waren in Patienten mit zukünftigem kardiovaskulärem Tod BNP (P < 0,0001), CRP (P < 0,0001) und Creatinin (P < 0,0001) signifikant erhöht.The TIMP-I level was normally distributed among the study participants. It ranged from 6.0 to 2667 ng / ml, with a mean (+ SD) of 699 + 225, a median of 676 and an interquartile range of 561 to 803 ng / ml. The baseline level of TIMP-I activity was significantly higher between those who died of cardiovascular causes than those who did not (820 vs 692 ng / ml; P <0.0001). As expected, BNP (P <0.0001), CRP (P <0.0001) and creatinine (P <0.0001) were significantly increased in patients with future cardiovascular death.
Prädiktoren von TIMP-IPredictors of TIMP-I
Tabelle 7 stellt jeweils die mittleren und medianen Spiegel von entzündlichen Markern dar, wie zum Beispiel TIMP-I, CRP und BNP, gemäß der Prävalenz von traditionellen Risikofaktoren und klinischen Variablen. TIMP-I war signifikant höher unter Patienten mit Diabetes, Bluthochdruck und schwerer Gefäßerkrankung. Patienten, die Statinmedikation erhielten, wiesen niedrigere TIMP-I Spiegel auf. Interessanterweise korrelierten TIMP-I Spiegel invers mit der Rauchergeschichte.Table 7 each represents the mean and median levels of inflammatory markers, such as TIMP-I, CRP and BNP, according to the prevalence of traditional risk factors and clinical variables. TIMP-I was significantly higher among patients with diabetes, hypertension and severe vascular disease. Patients receiving statin medication had lower TIMP-I levels. Interestingly, TIMP-I levels correlated inversely with the smoking history.
Tabelle 7; mediane Spiegel von entzündlichen MarkernTable 7; median levels of inflammatory markers
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TIMP-I und zukünftiges kardiovaskuläres EreignisTIMP-I and future cardiovascular event
Figur 5 zeigt die Kaplan-Meier Kurven für Ereignis-freies Überleben, gemäß Dritteln von TIMP-I Spiegel. Die nicht-eingestellte Rate an kardiovaskulärem Tod war am höchsten in Patienten innerhalb des oberen Drittels an TIMP-I Spiegel (P log rank < 0,0001). Wichtigerweise wurden ähnliche Ergebnisse erhalten, wenn die Analyse gemäß Patienten, die mit stabiler Angina (P log Rang über Drittel = 0,002) und akutem Koronarsyndrom (Figur 6; P log Rang über Drittel = 0,0005) präsentiert wurden, stratifiziert wurde.Figure 5 shows the Kaplan-Meier curves for event-free survival, according to thirds of TIMP-I levels. The unadjusted rate of cardiovascular death was highest in patients within the upper third of TIMP-I levels (P log rank <0.0001). Importantly, similar results were obtained when the analysis was stratified according to patients presented with stable angina (P log rank above one-third = 0.002) and acute coronary syndrome (Figure 6; P log rank above one-third = 0.0005).
Tabelle 8 zeigt die Hazard- Verhältnisse für kardiovaskulärem Tod, assoziiert mit Dritteln von TIMP-I Spiegel. Um den unabhängigen prädiktiven Wert zu ermitteln, verwendeten die Erfinder verschieden Cox prädiktive Modelle. Das Hazard-Verhältnis von zukünftigem kardiovaskulärem Tod stieg mit ansteigenden Dritteln an (P = 0,001) so dass Patienten innerhalb des obersten Drittel von TIMP-I Spiegel ein 2,54faches (95% CI 1,38 bis 4,68; P = 0,003) erhöhtes Risiko, verglichen zu Individuen als innerhalb des untersten Drittels in einem Alters- und Geschlecht-eingestellten Modell hatten. Die Hazard-Verhältnisse verblieben nach Einstellung auf kardiovaskuläre Risikofaktoren und klinische Merkmale (Modell 2) nahezu unverändert. Eine weitere Einstellung auf Ausstoßfraktion (Modell 3) sowie C-reaktives Protein und B-Typ natriuretisches Peptid (Modell 4) veränderte die mit TIMP-I Spiegel assoziierten Hazard-Verhältnisse auch nicht. Tabelle 8: Hazard-Verhältnisse für kardiovaskulärem Tod, assoziiert mit Dritteln von TIMP-I Spiegel.Table 8 shows the hazard ratios for cardiovascular death associated with thirds of TIMP-I levels. To determine the independent predictive value, the inventors used various Cox predictive models. The hazard ratio of future cardiovascular death increased with increasing thirds (P = 0.001) so that patients within the top third of TIMP-I levels a 2.54-fold (95% CI 1.38 to 4.68, P = 0.003) had higher risk compared to individuals than within the bottom third in an age- and gender-adjusted model. Hazard ratios remained virtually unchanged after adjustment for cardiovascular risk factors and clinical features (model 2). Further adjustment to ejection fraction (model 3) as well as C-reactive protein and B-type natriuretic peptide (model 4) also did not alter the hazard ratios associated with TIMP-I levels. Table 8: Cardiovascular death hazard ratios associated with thirds of TIMP-I levels.
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Die Hazard-Verhältnisse von zukünftigem kardiovaskulärem Tod, assoziiert mit dem obersten Drittel von TIMP-I Spiegel, waren in allen analysierten Untergruppen ähnlich.The hazard ratios of future cardiovascular death associated with the top third of TIMP-I levels were similar in all subgroups analyzed.
Vergleichende Analysen von kardiovaskulärem Biomarker Zuletzt platzierten die Erfinder die prädiktive Stärke von TIMP-I in den Kontext von denjenigen, die von den neuen biologischen Markern CRP und BNP (Figur 7) erhalten wurde. Wenn getrennt in ein auf Alter, Geschlecht und herkömmliche Risikofaktoren angepasstes Modell, ergab BNP die stärkste Assoziierung mit zukünftigem kardiovaskulärem Tod (HR 3,4, 95% CI 2,0 bis 5,7; P < 0,0001), wohingegen die prädiktive Stärke von TIMP-I und CRP eine ähnliche Größenordnung aufwies. Wenn auf die drei respektiven Marker gleichzeitig eingestellt, behielt TIMP-I seine unabhängige Assoziierung mit zukünftigem kardiovaskulärem Tod bei, jedoch blieb BNP immer noch der stärkste prognostische Faktor.Comparative analyzes of cardiovascular biomarker Recently, the inventors placed the predictive strength of TIMP-I in the context of those obtained from the new biological markers CRP and BNP (Figure 7). When separated into a model adapted to age, gender and conventional risk factors, BNP gave the strongest association with future cardiovascular death (HR 3.4, 95% CI 2.0 to 5.7, P <0.0001), whereas the predictive Strength of TIMP-I and CRP had a similar magnitude. When adjusted to the three respective markers simultaneously, TIMP-I retained its independent association with future cardiovascular death, however, BNP remained the strongest prognostic factor.
Beispiel 5 - ADMAExample 5 - ADMA
Studienpopulationstudy population
Eine genaue Beschreibung des Aufbaus der AtheroGene Studie wurde bereits vorher beschrieben. Zwischen Juni 1999 und Februar 2004 wurden 1908 Patienten wie in Beispiel 1 aufgenommen. Zusätzlich wurden Diabetes mellitus, Bluthochdruck und Hyperlipoproteinämie diagnostiziert und die Patienten nach ihren Rauchgewohnheiten aufgeteilt.A detailed description of the structure of the AtheroGene study has been previously described. Between June 1999 and February 2004, 1908 patients were enrolled as in Example 1. In addition, diabetes mellitus, hypertension and hyperlipoproteinemia were diagnosed and patients were divided according to their smoking habits.
Eine Gesamtzahl von 1874 (98,2 %) Patienten wurde während einer mittleren Zeitdauer von 2,6 (Maximum 5,0) Jahren nach-verfolgt. Es gab 69 Tote aus kardiovaskulären Gründen, 32 Tote aus anderen Gründen, und 45 nicht fatale Myokardinfarkte und 45 nicht fatale Schlaganfälle. Die Information über die Todesursache oder klinische Ereignisse wurden aus Krankenhaus- oder Arztpraxisakten erhalten.A total of 1874 (98.2%) patients were followed for a median of 2.6 (maximum 5.0) years. There were 69 deaths for cardiovascular reasons, 32 deaths for other reasons, and 45 nonfatal myocardial infarctions and 45 nonfatal strokes. Information about the cause of death or clinical events was obtained from hospital or physician's medical records.
Laborverfahrenlaboratory procedures
Blut wurde von allen Studiensubjekten wie in Beispiel 1 abgenommen und gelagert.Blood was collected from all study subjects as in Example 1 and stored.
Asymmetrisches Dimethylarginin wurde aus Serumproben durch kompetitive Enzym verknüpften Immunabsorbent-Test (DLD Diagnostika GmbH, Hamburg, Germany) mit einem Bereich von 0,1 μmol/1 bis 5,0 μmol/1 durchgeführt. Die Nachweisspezifität ist 0,05 μmol/1. Die Kreuzreaktivität mit Methylargininen ist als gering angegeben (Arginin <0,02 Prozent; A^-Monomethyl-L- Ar ginin 1,0 Prozent; symmetrisches Dimethylarginin 1,2 Prozent). Plasma BNP wurde unter der Verwendung eines Fluoreszenz Immuntest (Biosite Diagnostics Inc., San Diego, Kalifornien) bestimmt. Die angegebene Nachweisgrenze ist weniger als 5 pg/ml. Der Test wies einen zwischen den Tests Koeffizienten der Variation von nahe 10 % auf, und eine Ausbeute von 100% von hinzugefügtem Peptid wurde gefunden. C-reaktives Protein- und Lipid-Serumspiegel wurden wie in Beispiel 1 und durch Standardverfahren bestimmt.Asymmetric dimethylarginine was assayed from serum samples by competitive enzyme-linked immunosorbent assay (DLD Diagnostika GmbH, Hamburg, Germany) at a range of 0.1 μmol / 1 to 5.0 μmol / l. The detection specificity is 0.05 μmol / l. The cross-reactivity with methylarginines is low (arginine <0.02 percent, A ^ monomethyl-L-arginine 1.0 percent, symmetrical dimethylarginine 1.2 percent). Plasma BNP was determined using a fluorescence immunoassay (Biosite Diagnostics Inc., San Diego, California). The indicated detection limit is less than 5 pg / ml. The test showed a coefficient of variation of close to 10% between tests and a yield of 100% of added peptide was found. Serum C-reactive protein and lipid levels were determined as in Example 1 and by standard methods.
Statistische AnalyseStatistical analysis
Mittlere Spiegel und Anteile von Basislinien kardiovaskulären Risikofaktoren wurden für Patienten mit und ohne kardiovaskulärem Tod berechnet. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Mitteln für die zwei Gruppen wurde mit dem Studenten t-Test ermittelt, und die Signifikanz der Unterschiede in Anteilen wurde mit der chi-Quadrat Statistik getestet. Variablen mit einer verzerrten Verteilung wurden als Mediane dargestellt und der Wilcoxon Rang- Summen Test wurde angewendet. Die kumulativen Ereignisplots gemäß Dritteln von asymmetrischem Dimethylarginin wurden durch das Kaplan-Meier Verfahren abgeschätzt und mit der Verwendung des log-Rang Test verglichen. Der primäre Endpunkt war Tod aus kardiovaskulären Gründen oder nicht-fatalem Myokardinfarkt. Die Daten von Patienten, die aus anderen Gründen starben wurden zum Zeitpunkt des Todes zensiert. Um die Verteilung von verzerrten Variablen zu normalisieren, wurde eine log Transformation durchgeführt und das Hazard- Verhältnis pro ein Standardabweichung-Inkrement angewandt. Zusätzlich wurden die Hazard-Verhältnisse für zukünftiges koronares Ereignis gemäß Dritteln von asymmetrischem Dimethylarginin durch Cox Regressionsmodelle, eingestellt auf potentielle Confounder, abgeschätzt. Drei eingestellte Modelle wurden konstruiert. Die Erfinder stellten zunächst auf Alter und Geschlecht ein und Zweitens auf andere traditionelle und klinische Risikofaktoren. Das finale Modell schloss klinische und therapeutische Variablen sowie C- reaktives Protein und B-Typ natriuretisches Peptid ein. Weiterhin wurde die Stärke von asymmetrischem Dimethylarginin, B-Typ natriuretischem Peptid, C-reaktivem Protein und Creatinin für kardiovaskulärem Risikovorhersage verglichen. Daher wurden Cox prädikative Modelle für das obere Drittel von jeder Variable, eingestellt auf kardiovaskuläre Confounders (Modell 2), und zusätzlich für alle drei Marker gleichzeitig (Modell 3), berechnet. Die Hazard-Verhältnisse und 95 Prozent Konfidenzintervalle sind angegeben. Um einen potentielle Anstieg in der prädiktiven Information im Hinblick auf zukünftige kardiovaskuläre Ereignisse zu ermitteln, wurden Bereiche unter den Receiver-Operating-Kurven für die kombinierte Analyse von traditionellen Risikofaktoren (Modell 1) und einzelner Biomarker- Bestimmung, sowie gleichzeitiger Ermittlung aller vier Marker zusätzlich zu klassischen Risikofaktoren berechnet. Die P Werte sind zweiseitig; Werte von p < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Alle Berechnungen wurden unter der Verwendung des SPSS Version 11,05 Programms verglichen.Mean levels and baseline cardiovascular risk factors were calculated for patients with and without cardiovascular death. The significance of the differences between the means for the two groups was determined by the Student t-test, and the significance of the differences in proportions was tested with the chi-square statistic. Variables with a distorted distribution were represented as medians and the Wilcoxon rank-sum test was applied. The cumulative event plots in thirds of asymmetric dimethylarginine were estimated by the Kaplan-Meier method and compared with the use of the log-rank test. The primary end point was death for cardiovascular reasons or non-fatal myocardial infarction. Data from patients who died for other reasons were censored at the time of death. To normalize the distribution of distorted variables, a log transformation was performed and the hazard ratio applied per one standard deviation increment. In addition, the hazard ratios for future coronary event according to thirds of asymmetric dimethylarginine were estimated by Cox regression models adjusted for potential confounders. Three discontinued models were constructed. The inventors focused first on age and sex and secondly on other traditional and clinical risk factors. The final model included clinical and therapeutic variables as well as C-reactive protein and B-type natriuretic peptide. Furthermore, the strengths of asymmetric dimethylarginine, B-type natriuretic peptide, C-reactive protein and creatinine for cardiovascular risk prediction were compared. Therefore, Cox predicative models were calculated for the upper third of each variable, set on cardiovascular confounders (model 2), and additionally for all three markers simultaneously (model 3). The hazard ratios and 95 percent confidence intervals are given. To identify a potential increase in predictive information for future cardiovascular events, areas under the receiver operating curves were used for the combined analysis of traditional risk factors (Model 1) and individual biomarkers. Determination, as well as simultaneous determination of all four markers in addition to classical risk factors calculated. The P values are two-sided; Values of p <0.05 were considered significant. All calculations were compared using the SPSS version 11.05 program.
Basislinien CharakteristikaBaseline characteristics
Das mittlere Alter der Studienteilnehmer war 61,0 ± 9,8 Jahre, 79,1 Prozent waren männlich. Die Konzentration an asymmetrischem Dimethylarginin war unter den Studienteilnehmern leicht verzerrt. Sie reichte von 0,07 bis 7,49 mit einem Mittel von 0,68 und einem Median von 0,63 μmol/1 mit einem 25^115^ interquartil-Bereich von 0,53/0,74 μmol/1. Patienten, die mit akutem Koronarsyndrom präsentiert wurden, hatten ähnliche asymmetrische Dimethylarginin Konzentrationen, verglichen zu stabiler Angina-Patienten (0,63 gegenüber 0,64 μmol/1; P=0,72). Die Basislinien-Konzentration an asymmetrischem Dimethylarginin war signifikant höher zwischen denjenigen, die aus kardiovaskulären Ursachen starben, als zwischen denjenigen, die nicht daran starben. Wie erwartet, waren in Patienten mit zukünftigem kardiovaskulärem Ereignis die Plasmaspiegel von B-Typ natriuretischem Peptid (P<0,001), C-reaktivem Protein (P<0,001) und Creatinin (P<0,001) erhöht. Weitere Charakteristika der 114 Studienteilnehmer, die ein kardiovaskuläres Ereignis entwickelten und der 1760, die dies nicht taten, sind in Tabelle 9 angegeben, die asymmetrischen Dimethylarginin Spiegel waren weder signifikant mit Alter oder Geschlecht assoziiert. Der stärkste Prädiktor des Spiegels an asymmetrischem Dimethylarginin waren Raucherstatus und Diabetes. Signifikant höhere Serumkonzentrationen wurden in laufenden und jemals Rauchern gegenüber niemals Rauchern gemessen (0,64 gegenüber 0,61 μmol/1 in Nichtrauchern; P=0,002). Diabetische Patienten zeigten erhöhte asymmetrischem Dimethylarginin Spiegel im Vergleich mit nichtDiabetikern (0,65 gegenüber 0,63 μmol/L; P=O5012). Keine Assoziierung von Serumkonzentrationen und einer Geschichte von Bluthochdruck oder einem erhöhten Body- Mass-Index wurde nachgewiesen.The median age of the study participants was 61.0 ± 9.8 years, 79.1 percent were male. The concentration of asymmetric dimethylarginine was slightly distorted among the study participants. It ranged from 0.07 to 7.49 with a mean of 0.68 and a median of 0.63 μmol / l with a 25 ^ 115 interquartile range of 0.53 / 0.74 μmol / l. Patients presenting with acute coronary syndrome had similar asymmetric dimethylarginine concentrations compared to stable angina patients (0.63 vs 0.64 μmol / 1, P = 0.72). The baseline concentration of asymmetric dimethylarginine was significantly higher between those who died of cardiovascular causes than those who did not. As expected, plasma levels of B-type natriuretic peptide (P <0.001), C-reactive protein (P <0.001) and creatinine (P <0.001) were elevated in patients with future cardiovascular events. Other characteristics of the 114 study participants who developed a cardiovascular event and those who did not do so in 1760 are shown in Table 9; asymmetric dimethylarginine levels were not significantly associated with age or gender. The strongest predictor of the level of asymmetric dimethylarginine was smoker status and diabetes. Significantly higher serum concentrations were measured in current and ever smokers versus never smokers (0.64 vs. 0.61 μmol / 1 in non-smokers, P = 0.002). Diabetic patients showed elevated asymmetric dimethylarginine levels compared with non-diabetics (0.65 vs. 0.63 μmol / L, P = O 5 012). No association of serum concentrations and a history of hypertension or increased body mass index has been demonstrated.
Tabelle 9 Basislinien CharakteristikaTable 9 Baseline Characteristics
Charakteristika Patienten ohne Patienten mit P-Wert kardiovaskuläres Tod kardiovaskulärem (n= 1760) Tod (n= 114)Characteristics Patients without patients with P-value Cardiovascular death Cardiovascular death (n = 1760) Death (n = 114)
Alter, Jahre 61,1 ± 9,6 62,9 ± 10,5 0,053 Männlich, % 79,4 75,4 0,14Age, years 61.1 ± 9.6 62.9 ± 10.5 0.053 Male,% 79.4 75.4 0.14
Body-Mass-Index, kg/m2 27,7 ± 3,9 27,6 ± 4,1 0,75Body mass index, kg / m 2 27.7 ± 3.9 27.6 ± 4.1 0.75
Diabetes mellitus, % <0,001 keine 84,2 67,5Diabetes mellitus,% <0.001 none 84.2 67.5
Orale Medikation 8,6 7,9Oral medication 8,6 7,9
Insulin-abhängig 7,2 24,6Insulin dependent 7.2 24.6
Hochdruck, % 74,5 75,4 0,83 jemals Raucher % 63,9 69,3 0,24High pressure,% 74.5 75.4 0.83 ever smoker% 63.9 69.3 0.24
Lipid-VariablenLipid variables
LDL-Cholesterin, mg/dl 126,3 ± 41,6 131,5 + 40,2 0,20LDL cholesterol, mg / dl 126.3 ± 41.6 131.5 + 40.2 0.20
HDL-Cholesterin, mg/dl 49,5 + 13,6 47,8 ± 13,0 0,21HDL cholesterol, mg / dl 49.5 + 13.6 47.8 ± 13.0 0.21
Gesamt Cholesterin, mg/dl 200,5 ± 47,5 208,6 ± 46,6 0,08Total cholesterol, mg / dl 200.5 ± 47.5 208.6 ± 46.6 0.08
Herz-Medikation (%)Heart medication (%)
Beta-Blocker 65,3 56,1 0,048Beta-blocker 65.3 56.1 0.048
Statine 56,9 48,2 0,07Statins 56.9 48.2 0.07
ACE Inhibitoren 49,1 54,4 0,23ACE inhibitors 49.1 54.4 0.23
Klinische VariablenClinical variables
Mehrere beeinträchtigte 72,4 81,6 0,03Several impaired 72.4, 81.6, 0.03
Gefäße %Vessels%
Linke Ausstoßfraktion % 64,4 ± 15,0 54,3 ± 19,0 <0,01Left ejection fraction% 64.4 ± 15.0 54.3 ± 19.0 <0.01
Biomarkerbiomarkers
Plasma ADMA (umol/1) 0,63 (0,53/0,74) 0,70 (0,60/0,82) 0,001Plasma ADMA (umol / 1) 0.63 (0.53 / 0.74) 0.70 (0.60 / 0.82) 0.001
Plasma B-Typ natriuretisches 47,34 (16,10/144,04) 132,87 <0,001Plasma B-type natriuretic 47.34 (16.10 / 144.04) 132.87 <0.001
Peptid (ρg/ml) (44,20/411,79)Peptide (ρg / ml) (44.20 / 411.79)
Plasma C-reaktives Protein 2,98 (1,40/7,43) 5,62 (2,51/15,43) 0,001Plasma C-Reactive Protein 2.98 (1.40 / 7.43) 5.62 (2.51 / 15.43) 0.001
(mg/1)(Mg / 1)
Serum Creatinin (mg/dl) 0,94 (0,83/1,06) 1,02 (0,82/1,19) 0,011Serum creatinine (mg / dl) 0.94 (0.83 / 1.06) 1.02 (0.82 / 1.19) 0.011
Keine Korrelation wurde zwischen asymmetrischem Dimethylarginin Spiegel und C- reaktivem Protein, B-Typ natriuretischem Peptid oder jeglichem Lipidspiegel (Lipoprotein hoher Dichte: r=-0,02; Lipoprotein geringer Dichte: r=-0,01) beobachtet. Jedoch wurde eine moderate Beziehung zwischen C-reaktivem Protein und B-Typ natriuretischem Peptid beobachtet (r=0,34).No correlation was observed between asymmetric dimethylarginine level and C-reactive protein, B-type natriuretic peptide or any lipid level (high density lipoprotein: r = -0.02, low density lipoprotein: r = -0.01). However, a moderate relationship was observed between C-reactive protein and B-type natriuretic peptide (r = 0.34).
Auftreten von anschließendem EreignisOccurrence of subsequent event
Tabelle 10 stellt die Assoziierung von ein Standardabweichung-Inkrement in log asymmetrischem Dimethylarginin Werten mit zukünftigem kardiovaskulärem Ereignis zur Verfügung. Die Erhöhung des asymmetrischen Dimethylarginin Spiegels war mit einem erhöhten Risiko von kardiovaskulärem Tod (Erhöhung of 42 Prozent für asymmetrisches Dimethylarginin für jedes Inkrement von 1 Standardabweichung in log transformierten asymmetrischen Dimethylarginin- Werten), koronarem Ereignis und Schlaganfall assoziiert. Nach Einstellung auf klinische und therapeutische Variablen blieben diese Assoziierungen unabhängig signifikant. Im Gegensatz wurde keine signifikante Assoziierung zwischen asymmetrischem Dimethylarginin- Werten und Tod aus anderen als kardiovaskulären Gründen (Hazard- Verhältnis 1,14; 95 Prozent Drittel 0,86 bis 1,52; P=0,36) beobachtet. Der primäre Endpunkt der Studie war Tod aus kardiovaskulären Gründen und nicht-fatales Koronarereignis. Figur 8 stellt die Kaplan-Meier Kurven für Ereignis-freies Überleben gemäß Dritteln am asymmetrischem Dimethylarginin-Spiegel zur Verfügung. Die nicht eingestellte kardiovaskuläre Ereignisrate erhöhte sich auf eine schrittweise Art über die ansteigenden Drittel von Basislinien asymmetrischen Dimethylarginin-Spiegeln (P< 0,001). Um den unabhängigen prädiktiven Wert von asymmetrischem Dimethylarginin Konzentration zu ermitteln, führten die Erfinder eine Reihe von Cox prädiktiven Modellen durch (Tabelle 11). In einem Alters und Geschlecht eingestellten Modell, zeigten Individuen in dem oberen Drittel eine 2,47 Erhöhung (95 Prozent Konfidenzintervall 1,51 bis 4,03) in kardiovaskulärem Risiko, verglichen zu denen in dem ersten Drittel. Eine weitere Einstellung auf klinische und therapeutische Variablen sowie C-reaktives Protein, Creatinin, und B-Typ natriuretisches Peptid veränderte das mit asymmetrischem Dimethylarginin Konzentration assoziierte Hazard-Verhältnis nicht.Table 10 provides the association of a standard deviation increment in log asymmetric dimethylarginine values with future cardiovascular event. The increase in the asymmetric dimethylarginine level was associated with an increased risk of cardiovascular death (increase of 42 percent for asymmetric dimethylarginine for every increment of 1 standard deviation in log transformed asymmetric dimethylarginine values), coronary event and stroke. After adjustment for clinical and therapeutic variables, these associations remained independently significant. In contrast, no significant association was observed between asymmetric dimethylarginine values and death for other than cardiovascular reasons (hazard ratio 1.14, 95 percent third 0.86 to 1.52, P = 0.36). The primary endpoint of the study was death for cardiovascular reasons and non-fatal coronary event. Figure 8 provides the Kaplan-Meier curves for event-free survival in one third of the asymmetric dimethylarginine level. The unadjusted cardiovascular event rate increased in a stepwise fashion over the rising thirds of baseline asymmetric dimethylarginine levels (P <0.001). To determine the independent predictive value of asymmetric dimethylarginine concentration, the inventors performed a series of Cox predictive models (Table 11). In an age and gender adjusted model, individuals in the upper third showed a 2.47 increase (95 percent confidence interval 1.51 to 4.03) in cardiovascular risk, compared to those in the first third. Further adjustment to clinical and therapeutic variables as well as C-reactive protein, creatinine, and B-type natriuretic peptide did not alter the hazard ratio associated with asymmetric dimethylarginine concentration.
Tabelle 10Table 10
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Tabelle 11Table 11
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Vergleichende Analysen von kardiovaskulärem BiomarkerComparative analyzes of cardiovascular biomarker
Um den prädiktiven Wert an Basislinie asymmetrischem Dimethylarginin Spiegel in den Kontext von denjenigen wie erhalten aus Messungen von B-Typ natriuretischem Peptid, C- reaktivem Protein und Creatinin-Spiegel als ein Maß der Nierenfunktion zu platzieren, wandten die Erfinder zwei Cox prädiktive Modelle an, wie in Figur 9 angegeben, Werte oberhalb der oberen Tertile von asymmetrischem Dimethylarginin (>0,70 μmol/1), B-Typ natriuretischem Peptid (> 102,31 pg/mL), Creatinin (>l,02 mg/dL), und C-reaktivem Protein (>5,44 mg/1) waren unabhängig mit einer Erhöhung im Risiko von kardiovaskulärem Ereignis von jeweils 76 Prozent, 124 Prozent, 78 Prozent, und 91 Prozent assoziiert, in einem Modell, das auf potentielle kardiovaskuläre Confounder angepasst war. In multivariablen Analysen, die zusätzlich alle Marker gleichzeitig einschlössen, ergaben asymmetrisches Dimethylarginin (Hazard- Verhältnis 1,87, 95 Prozent Konfidenzintervall 1,25 bis 2,78) und B-Typ natriuretisches Peptid (Hazard-Verhältnis 1,92, 95 Prozent Konfidenzintervall 1,25 bis 2,95) den stärksten prädiktiven Wert. Der Bereich unter der Receiver-Operating-Kurve, 0,67 in dem Modell, das alle traditionellen Risikofaktoren einschloss, erhöhte sich moderat mit zusätzlichem B-Typ natriuretischem Peptid oder asymmetrischem Dimethylarginin (Bereich unter der Kurve: 0,69). Wenn alle Marker gleichzeitig eingeschlossen wurden, erhöhte sich der Bereich unter der Receiver-Operating-Kurve auf 0,71, In order to place the predictive value of baseline asymmetric dimethylarginine levels in the context of those obtained from measurements of B-type natriuretic peptide, C-reactive protein, and creatinine levels as a measure of renal function, the inventors applied two Cox predictive models, as indicated in FIG. 9, values above the upper tertiles of asymmetric dimethylarginine (> 0.70 μmol / l), B-type natriuretic peptide (> 102.31 pg / ml), creatinine (> l, 02 mg / dl), and C-reactive protein (> 5.44 mg / l) were independently associated with an increase in the risk of cardiovascular events of 76 percent, 124 percent, 78 percent, and 91 percent, respectively, in a model adapted to potential cardiovascular confounders was. In multivariable analyzes, which additionally included all markers simultaneously, gave asymmetric dimethylarginine (hazard ratio 1.87, 95 percent confidence interval 1.25 to 2.78) and B-type natriuretic peptide (hazard ratio 1.92, 95 percent confidence interval 1.25 to 2.95) has the strongest predictive value. The range below the receiver operating curve, 0.67 in the model, which included all traditional risk factors, moderately increased with additional B-type natriuretic peptide or asymmetric dimethylarginine (area under the curve: 0.69). If all markers were included at the same time, the range under the receiver operating curve increased to 0.71,

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Analyse von Proben in Zusammenhang mit akuten kardiovaskulären Erkrankungen, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:A method of analyzing samples associated with acute cardiovascular disease, the method comprising the steps of:
(a) Zur Verfügung stellen einer zu untersuchenden biologischen Probe aus einem Subjekt;(a) providing a biological sample to be examined from a subject;
(b) Bestimmen der Konzentration von mindestens einem Entzündungsmarker, ausgewählt aus Fibrinogen, sTNFR-2, IL-18, ADMA, Caspase-1, TIMP-I, Resistin und sVCAM-1,(b) determining the concentration of at least one inflammatory marker selected from fibrinogen, sTNFR-2, IL-18, ADMA, caspase-1, TIMP-I, resistin and sVCAM-1,
(c) gegebenenfalls, Bestimmen der Konzentration mindestens eines weiteren Marker ausgewählt aus sTNFR-1, Troponin T (TnT), IL-6, CRP, Selektin(en), CD40, Lipoprotein- assoziierte Phospholipase A2 und weiteren entzündlichen Markern, und(c) optionally, determining the concentration of at least one additional marker selected from sTNFR-1, troponin T (TnT), IL-6, CRP, selectin (s), CD40, lipoprotein-associated phospholipase A2 and other inflammatory markers, and
(d) Vergleich des/der für die zu untersuchende Probe erhaltenen Ergebnisse/s mit Referenzwerten und/oder den Werten aus Referenzproben.(d) Comparison of the results obtained for the sample to be tested / s with reference values and / or the values from reference samples.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zu untersuchende Probe und/oder die Referenzprobe aus einem Menschen stammt.2. The method of claim 1, wherein the sample to be examined and / or the reference sample originates from a human.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zu untersuchende Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus peripherem Blut oder Fraktionen davon und Zellkultur- Suspensionen oder Fraktionen davon.3. The method of claim 1 or 2, wherein the sample to be examined is selected from the group consisting of peripheral blood or fractions thereof and cell culture suspensions or fractions thereof.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die zu untersuchende Probe Blutplasma ist.4. The method of claim 3, wherein the sample to be examined is blood plasma.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei dem peripheren Blut ein Gerinnungshemmer, insbesondere Heparin, zugesetzt wird.5. The method according to claim 3, wherein an anticoagulant, in particular heparin, is added to the peripheral blood.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die analysierten Marker und Kombinationen daraus ausgewählt sind aus Fibrinogen + sTNFR-2, Fibrinogen + IL- 18, Fibrinogen + sVCAM-1, Fibrinogen + ADMA, Fibrinogen + Caspase-1, Fibrinogen + TIMP- 1, Fibrinogen + Resistin, sTNFR-2 + IL-18, sTNFR-2 + sVCAM-1, sTNFR-2 + ADMA, sTNFR-2 + Caspase-1, sTNFR-2 + TIMP-I, sTNFR-2 + Resistin, IL-18 + sVCAM-1, IL-18 + ADMA, IL-18 + Caspase-1, IL-18 + TIMP-I, IL-18 + Resistin, sVCAM-1 + ADMA, sVCAM-1 + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-I, sVCAM-1 + Resistin, ADMA + Caspase-1, ADMA + TIMP-I, ADMA + Resistin, Caspase-1 + TIMP-I, Casapse-1 + Resistin, TIMP-I + Resistin, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18, Fibrinogen + s VC AM-I + IL-18, Fibrinogen + ADMA + IL-18, Fibrinogen + Caspase-1 + IL-18, Fibrinogen + TIMP-I + IL-18, Fibrinogen + Resistin + IL-18, sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1, sTNFR-2 + ADMA + sVCAM-1, sTNFR- 2 + Caspase-1 + sVCAM-1, sTNFR-2 + TIMP-I + sVCAM-1, sTNFR-2 + Resistin + sVCAM-1, IL-18 + s VC AM-I + ADMA, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, IL- 18 + TIMP-I + ADMA5 IL-18 + Resistin + ADMA, sVCAM-1 + ADMA + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-I + Caspase-1, s VC AM-I + Resistin + Caspase-1, ADMA + Caspase-1 + TIMP-I, ADMA + Resistin + TIMP-I, Caspase-1 + TIMP-I + Resistin, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1, Fibrinogen + ADMA + IL-18 + Caspase-1, Fibrinogen + TIMP-I + IL-18 + Resistin, sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-I, sTNFR-2 + Resistin + sVCAM-1 + IL18, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, + TIMP-I, IL-18 + Resistin + ADMA + Caspase-1, s VC AM-I + TIMP-I + Caspase-1 + Resistin, ADMA + Caspase-1 + TIMP-I + Resistin, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA, Fibrinogen + TIMP-I + IL-18 + Resistin + sTNFR-2, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-I + sTNFR-2, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, + TIMP-I + Resistin, sVCAM-1 + TIMP-I + Caspase-1 + Resistin + ADMA, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA + TIMP-I, sTNFR-2 + Caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-I + sTNFR-2 + IL-18, Fibrinogen + sVCAM-1 + TIMP-I + Caspase-1 + Resistin + ADMA, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA + TIMP-I + Caspase-1, Fibrinogen + sVCAM-1 + TIMP-I + Caspase-1 + Resistin + ADMA + sTNFR-2 und Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + ADMA + Caspase-1 + TIMP-I + Resistin + s VCAM- 15 6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the analyzed markers and combinations thereof are selected from fibrinogen + sTNFR-2, fibrinogen + IL-18, fibrinogen + sVCAM-1, fibrinogen + ADMA, fibrinogen + caspase-1, fibrinogen + TIMP-1, fibrinogen + resistin, sTNFR-2 + IL-18, sTNFR-2 + sVCAM-1, sTNFR-2 + ADMA, sTNFR-2 + caspase-1, sTNFR-2 + TIMP-I, sTNFR-2 + Resistin, IL-18 + sVCAM-1, IL-18 + ADMA, IL-18 + Caspase-1, IL-18 + TIMP-I, IL-18 + Resistin, sVCAM-1 + ADMA, sVCAM-1 + caspase -1, sVCAM-1 + TIMP-I, sVCAM-1 + Resistin, ADMA + Caspase-1, ADMA + TIMP-I, ADMA + Resistin, Caspase-1 + TIMP-I, Casapse-1 + Resistin, TIMP-I + Resistin, fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18, fibrinogen + s VC AM-I + IL-18, fibrinogen + ADMA + IL-18, fibrinogen + caspase-1 + IL-18, fibrinogen + TIMP-I + IL-18, fibrinogen + resistin + IL-18, sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1, sTNFR-2 + ADMA + sVCAM-1, sTNFR-2 + caspase-1 + sVCAM-1, sTNFR-2 + TIMP-I + sVCAM-1, sTNFR-2 + resistin + sVCAM-1, IL-18 + s VC AM-I + ADMA, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, IL-18 + TIMP-I + ADMA 5 IL-18 + Resistin + ADMA, sVCAM-1 + ADMA + Caspase-1, sVCAM-1 + TIMP-I + Caspase- 1, s VC AM-I + Resistin + Caspase-1, ADMA + Caspase-1 + TIMP-I, ADMA + Resistin + TIMP-I, Caspase-1 + TIMP-I + Resistin, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL- 18 + sVCAM-1, fibrinogen + ADMA + IL-18 + caspase-1, fibrinogen + TIMP-I + IL-18 + resistin, sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA, sTNFR-2 + caspase 1 + sVCAM-1 + TIMP-I, sTNFR-2 + Resistin + sVCAM-1 + IL18, IL-18 + Caspase-1 + ADMA, + TIMP-I, IL-18 + Resistin + ADMA + Caspase-1, s VC AM-I + TIMP-I + Caspase-1 + Resistin, ADMA + Caspase-1 + TIMP-I + Resistin, Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA, Fibrinogen + TIMP-I + IL -18 + resistin + s TNFR-2, sTNFR-2 + caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-I + sTNFR-2, IL-18 + caspase-1 + ADMA, + TIMP-I + resistin, sVCAM-1 + TIMP-I + caspase -1 + resistin + ADMA, fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA + TIMP-I, sTNFR-2 + caspase-1 + sVCAM-1 + TIMP-I + sTNFR-2 + IL-18 , Fibrinogen + sVCAM-1 + TIMP-I + caspase-1 + resistin + ADMA, fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 + ADMA + TIMP-I + caspase-1, fibrinogen + sVCAM-1 + TIMP -I + caspase-1 + resistin + ADMA + sTNFR-2 and fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + ADMA + caspase-1 + TIMP-I + resistin + s VCAM-1 5
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die analysierten Marker und Kombinationen daraus ausgewählt sind aus Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 und Fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + ADMA + Caspase-1 + TIMP-I + Resistin + sVCAM-1,The method of any one of claims 1 to 5, wherein the analyzed markers and combinations thereof are selected from fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + sVCAM-1 and fibrinogen + sTNFR-2 + IL-18 + ADMA + caspase-1 + TIMP-I + resistin + sVCAM-1,
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Bestimmen der Konzentration mittels eines immunologischen Verfahrens mittels an die Marker bindenden Moleküle erfolgt.8. The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the determination of the concentration by means of an immunological method by means of binding to the marker molecules.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die an die Marker bindenden Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus anti-Marker-Antikörpern oder Teilen davon und Marker- Rezeptoren oder Teilen davon. 9. The method of claim 8, wherein the molecules that bind to the marker are selected from the group consisting of anti-marker antibodies or parts thereof and marker receptors or parts thereof.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Antikörper, Teile oder Fragmente davon polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, Fab-Fragmente, scFv-Fragmente und Diabodies umfassen.The method of claim 9, wherein the antibodies, portions or fragments thereof include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, Fab fragments, scFv fragments and diabodies.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Marker und/oder die an die Marker bindenden Moleküle in Lösung oder Matrix-immobilisiert vorliegen.11. The method according to claim 9 or 10, wherein the markers and / or the molecules binding to the marker are present in solution or matrix immobilized.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die an die Marker bindenden Moleküle an eines oder mehrere Nachweisgruppen aus der Gruppe bestehend aus Fluoresceinthioisocyanat, Phycoerythrin, einem Enzym und magnetisches Bead gekoppelt sind.The method of any one of claims 9 to 11, wherein the molecules that bind to the marker are coupled to one or more detection groups selected from the group consisting of fluorescein thioisocyanate, phycoerythrin, an enzyme, and magnetic bead.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die an die Marker bindenden Moleküle mit einem Antikörper, an den eine oder mehrere Nachweismoleküle gekoppelt sind, nachgewiesen werden.13. The method according to any one of claims 9 to 12, wherein the binding to the marker molecules with an antibody to which one or more detection molecules are coupled, are detected.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die immunologischen Verfahren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sandwich-Enzym-Immuntest, ELISA und Festphasen-Immuntests.The method of any of claims 9 to 13, wherein the immunological methods are selected from the group consisting of sandwich enzyme immunoassay, ELISA and solid phase immunoassays.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die kardiovaskulären Erkrankungen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus instabiler Angina, Myokardinfarkt, akutem Herzsyndrom, koronarer Arterienerkrankung und Herzinsuffizienz.The method of any one of claims 1 to 14, wherein the cardiovascular disorders are selected from the group consisting of unstable angina, myocardial infarction, acute heart syndrome, coronary artery disease, and heart failure.
16. Diagnostischer Kit, umfassend Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, gegebenenfalls zusammen mit weiteren Komponenten und/oder Hüfsstoffen.16. A diagnostic kit comprising means for carrying out the method according to any one of claims 1 to 15, optionally together with other components and / or Hüfsstoffen.
17. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Kits nach Anspruch 16 zur Diagnose und/oder Prognose akuter kardiovaskulärer Erkrankungen und/oder zur Überwachung von deren Therapie. 17. Use of the method according to any one of claims 1 to 15 or a kit according to claim 16 for the diagnosis and / or prognosis of acute cardiovascular diseases and / or for the monitoring of their therapy.
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