WO2006075671A1 - 所望の染色体を除去する方法およびそれを利用したテイラーメイド医療 - Google Patents

所望の染色体を除去する方法およびそれを利用したテイラーメイド医療 Download PDF

Info

Publication number
WO2006075671A1
WO2006075671A1 PCT/JP2006/300311 JP2006300311W WO2006075671A1 WO 2006075671 A1 WO2006075671 A1 WO 2006075671A1 JP 2006300311 W JP2006300311 W JP 2006300311W WO 2006075671 A1 WO2006075671 A1 WO 2006075671A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
chromosome
gene
cells
sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/300311
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takashi Tada
Norio Nakatsuji
Hiroyuki Matsumura
Masako Tada
Original Assignee
Kyoto University
Reprocell Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto University, Reprocell Inc. filed Critical Kyoto University
Priority to JP2006552968A priority Critical patent/JPWO2006075671A1/ja
Priority to EP06702679A priority patent/EP1842909A1/en
Priority to CA002598022A priority patent/CA2598022A1/en
Priority to US11/813,930 priority patent/US20090264312A1/en
Publication of WO2006075671A1 publication Critical patent/WO2006075671A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the present invention relates generally to the field of regenerative medicine.
  • a reproducible cell lacking a desired chromosome, a production method thereof, and a gene cassette and kit for use therein are provided.
  • ES cells are rapidly proliferating, undifferentiated totipotent cells derived from early embryos and show similar properties to embryonic tumor cells.
  • ES cells were first established by culturing an inner cell mass (ICM) of a mouse blastocyst on a feeder layer of mouse fibroblasts.
  • ICM inner cell mass
  • ES cells have an infinite life span under conditions that maintain their unbroken state in the presence of a feeder cell layer and Z or leukemia inhibitory factor (L IF)
  • Non-Patent Document 1 R. Williams et al., Nature 336: 684—687 (1988)]. It is also known that it has a high in vitro differentiation ability and can be differentiated into many types of cells simply by culturing as an aggregate.
  • ES cells are cells that have been established from pre-implantation embryos and have multipotency to differentiate into various cell types derived from the three germ layers of ectoderm, mesoderm, and endoderm
  • Non-patent Document 2 MJ Evans and MH Kaufman. Nature 292: 154-156 (1981);
  • Non-Patent Document 3 GR Martin, Proc. Natal. Acad. Sci. USA. 78: 7634-7638 (1981)]. That is, ES cells have the ability to differentiate into any adult mature cell, for example, differentiation into both somatic and germ cells of a chimeric animal by introduction into a normal early embryo to form a chimeric embryo.
  • Non-Patent Document 4 RL Brinster, J. Exp.
  • Non-Patent Document 5 A. Bradley et al., Nature 309: 255—256 (1984) ].
  • ES cell-derived cells By mating chimera animals in which ES cell-derived cells are introduced into germ cells such as testis and ovary, progeny composed only of ES cell-derived cells can be obtained. This means that animals with genetically well-controlled artifacts can be obtained. Such animals will allow us to study developmental and differential mechanisms not only in vitro but also at the individual level.
  • ES cells are normal cells that retain normal diploid karyotypes, and have a high probability of differentiating into germline cells with high chimera formation [Non-patent Documents]. 5] The scope of use of ES cells is expanding beyond the embryology field.
  • Non-patent literature 7 W. Miller- Hance et al., J. Biol. Chem. 268
  • Non-patent literature 8 VA Maltsev et a 1., Mech. Dev. 44: 41-50 (1993);
  • Non-patent literature 9 G. Bain et al., Dev. B iol. 168: 342-357 (1995)].
  • Attempts to induce mouse ES cells to differentiate into useful cells involved the production of hematopoietic cells, myocardium, specific neurons, and blood vessels.
  • Non-patent literature 10 T.
  • Non-patent literature 11 R. Pacacios et al., Proc. Natal. Acad. Sci. USA 92: 7530-7534 (1995);
  • Non-patent literature 8 VA Maltsev et al., Mec h. Dev. 44: 41-50 (1993);
  • Non-patent literature 12 SH Lee et al., Nat. Biotec hnol. 18: 675—679 (1999);
  • Non-Patent Document 13 H. Kawasaki et al., Neuron 28: 31—40 (2000);
  • Non-Patent Document 14 S. -I. Nishikawa, Development 125: 1747— 1757 ( 1998);
  • Non-patent document 15 M. Hirashima et al., Blood 93: 1 253-1263 (1999)].
  • ES cells have been established for various animals such as hamsters and mice. Human ES cells have also been established, and they showed a similar ability to that of mouse ES cells.
  • Reference 16 JA Thomson et al., Science282: 1145-1147 (1998);
  • Non-patent literature 17 JA Thomson et al., Dev. Biol. 38: 133-165 (1998);
  • Non-patent literature 18 BE Reubinoff et al., Nat. Biotechnol. 18: 399—404 (2000)].
  • human ES cells can be transplanted in many diseases including myocardial infarction, Parkinson's disease, diabetes and leukemia.
  • a factor that causes graft rejection is called a transplant antigen or a histocompatibility antigen. All somatic cells except erythrocytes have a transplanted antigen. Red blood cells have their own blood group (ABO) antigens.
  • the main human transplantation antigen is called the major histocompatibility antigen or HLA (human leukocyte group A) and is dominated by the gene on chromosome 6.
  • HLA antigens are classified into two groups: class I antigens, which are the target of rejection, and class II antigens, which serve to initiate rejection. Class I antigens are found in all tissues. Class II antigens are expressed in large numbers in rod-shaped cells with finger-like processes, which are macrophage-like cells. There have been experimental successes in attempting to remove such cells from organ transplants so that rejection reactions do not start, but they are not practical and not currently applied clinically. .
  • the rejection that develops after transplantation can be classified into hyperacute rejection, accelerated acute rejection, acute rejection, and chronic rejection.
  • Hyperacute rejection occurs when there is an existing antibody / responder in the recipient's serum that reacts to the donor's HLA antigen! After the vascular connection is completed and blood flow to the organ is resumed, the transplanted organ is immediately abolished due to severe rejection within a few hours.
  • the treatment method is to conduct a lymphocyte crossover test before transplantation, and if it is found that the recipient serum has an antibody that reacts with donor lymphocytes, it can be prevented by giving up the transplantation. Can only be prevented.
  • An accelerated acute rejection response develops when it is present in the recipient's body prior to transplantation of T lymphocytes reactive to the donor's HLA antigen.
  • hyperacute rejection which often develops within 7 days after transplantation, it is an intense rejection, but it has become possible to be cured by recent advances in therapeutics.
  • Acute rejection occurs mainly as a result of the cellular immune response induced by T lymphocytes by the donor HLA antigen in the transplanted organ. It is the most common rejection after transplantation, and usually 2 weeks after transplantation is also observed by about 1 month.
  • Chronic rejection is clinically characterized by gradual decline in organ function that progresses against treatment, and often develops force 6 months to 1 year after transplantation.
  • transplantation caused by the immune response of the recipient activated by the invasion of donor HLA antigens. Due to the tissue damage of the organ and the reaction of the organ tissue corresponding to it, it is considered to be tissue degeneration. Unless an organ with the same MHC molecular structure as the recipient is transplanted, rejection always occurs. At present, how to control rejection is a major challenge.
  • Immunosuppressive methods for preventing the above-described rejection reaction are roughly classified into those using an immunosuppressive agent, surgical operation, radiation irradiation, and the like.
  • an immunosuppressive agent surgical operation, radiation irradiation, and the like.
  • corticosteroids reduce the number of circulating T cells, inhibit lymphocyte nucleic acid metabolism and cytoplasmic in-production, suppress their functions, suppress macrophage migration and metabolism, and suppress immune responses.
  • Cyclosporine and FK506, are similar in action, binding to receptors on the surface of helper T cells and entering the cell, acting directly on DNA and inhibiting interleukin 2 production.
  • killer T cells cannot function and immunosuppressive action occurs.
  • Side effects are a problem in the use of these immunosuppressants.
  • Steroids have many side effects, and cyclosporine is toxic to the liver * kidney.
  • FK506 is also toxic to the kidney.
  • examples of surgical operations include lymph node removal, splenectomy, and thymectomy, but their effects have not been fully proven.
  • Thoracic fistula is one of the surgical procedures, and it has been confirmed to be effective in leading circulating lymphocytes to the outside of the body. There is.
  • Non-Patent Document 23 Polejaeva IA et al., Nature 407: 86—90 (2000)].
  • the somatic cell nuclei from the host undergoing transplantation can be reprogrammed using egg cells to produce totipotent cells that can produce grafts that do not elicit immune rejection. it is conceivable that.
  • such a cell culture method seems to be able to solve the shortage of donors.
  • Non-patent Document 24 Weissman, IL, N Engl J Med 346, 1576-1579. (2002 )) 0
  • the above method has a problem from an ethical point of view that it is necessary to use egg cells.
  • ES cells are derived from undifferentiated cells in early embryos and the fact that there are no adult early embryos, the state after the early embryos, especially the host power that is adult, There is a fundamental problem that ES cells cannot be established. Therefore, obtaining a pluripotent stem cell such as an ES cell corresponding to an individual has not been achieved so far, and is a problem that is desired to be solved in this field.
  • transplantation derived from embryonic stem cells also referred to as ES cells in this specification
  • ES cells embryonic stem cells
  • Patent Document 1 International Publication WO03Z027278.
  • Patent Document 1 discloses a method of bringing cells into an undifferentiated state using cell fusion. This document describes the removal of a specific gene, but is related to producing a fused cell from which the desired chromosome has been removed, and thus the undifferentiated state and regenerative cells. The technology is not described.
  • Non-Patent Document 25 (Mark Lewandosk & GR Martin, Nature Genetics Vol. 17, 1997 223-25) discloses a method for removing the Y chromosome from the XY chromosome.
  • This document does not describe techniques related to producing fused cells from which the desired chromosome has been removed as a result, excluding chromosomes, and cells that are thereby rendered undifferentiated and can be regenerated.
  • the technique of this document cannot generate cells that can be used for regenerative treatment because the cells produced can only be malformed.
  • Non-Patent Document 26 and Patent Document 2 attempt to lose the chromosome of embryonic stem cells using a construct in which ⁇ sequences are inserted in the same direction. However, this method is no different from the conventional method, so the loss is not efficient. Therefore, the technique of this document cannot provide cells that can be used efficiently for regenerative treatment.
  • Patent Document 1 International Publication WO03Z027278
  • Patent Document 2 Special Table 2003— 512053
  • Non-Patent Document 1 R. Williams et al., Nature 336: 684-687 (1988)
  • Non-Patent Document 2 M. J. Evans and M. H. Kaufman. Nature 292: 154—156 (
  • Non-Patent Document 3 G. R. Martin, Proc. Natal. Acad. Sci. USA. 78: 7634-7638 (1981)
  • Non-Patent Document 4 RL Brinster, J. Exp. Med. 140: 1949-1956 (1974)
  • Non-Patent Document 5 A. Bradley et al., Nature 309: 255-256 (1984)
  • Non-Patent Document 6 M. Wiles et al., Development 111: 259-267 (1991)
  • Non-patent document 7 W. Miller-Hance et al., J. Biol. Chem. 268: 25244-2525
  • Non-Patent Document 8 V. A. Maltsev et al., Mech. Dev. 44: 41-50 (1993)
  • Non-Patent Document 9 G. Bain et al., Dev. Biol. 168: 342-357 (1995)
  • Non-Patent Document 10 T. Nakano et al., Science 265: 1098-1101 (1994)
  • Non-Patent Document 11 R. Pacacios et al., Proc. Natal. Acad. Sci. USA 92: 753
  • Non-Patent Document 12 SH Lee et al., Nat. Biotechnol. 18: 675—679 (1999)
  • Non-patent document 13 H. Kawasaki et al., Neuron 28: 31-40 (2000)
  • Non-patent document 14 S.-I.Nishikawa, Development 125: 1747-1757 (1998)
  • Non-patent document 15 M. Hirashima et al., Blood 93: 1253-1263 (1999)
  • Non-patent document 16 A. Thomson et al., Science282: 1145-1147 (1998)
  • Non-patent document 17 JA Thomson et al., Dev. Biol. 38: 133 — 165 (1998)
  • Non-Patent Document 18 BE Reubinoff et al., Nat. Biotechnol. 18: 399-404 (20
  • Non-Patent Document 19 Wilmut I. et al., Nature 385: 810-813 (1997)
  • Non-patent document 20 KatoY. Et al., Science 282: 2095-2098 (1998)
  • Non-patent document 21 Wakayama T. et al., Nature 394: 369-374
  • Non-patent document 22 Onishi A. et. al., Science 289: 1188-1190 (2000)
  • Non-patent literature 23 Polejaeva IA et al., Nature 407: 86-90 (2000)
  • Non-patent literature 24 Weissman, IL, N Engl J Med 346, 1576-1579 (200
  • Non-Patent Document 25 Mark Lewandosk & G. R. Martin, Nature Genetics V ol. 17, 1997 223-25
  • Non-Patent Document 26 Koike, H., Horie, K., Fukuyama, H., Kondoh, G., Nagat a, S. and Takeda, J. (2002) Efficient biallelic mutagenesis with CreZ loxP-mediated inter-chromosomal recombination EMBO Rep 3, 43 3-7
  • An object of the present invention is to provide a reproducible cell in which a desired chromosome is deleted, a production method thereof, and a gene cassette and kit for use therein.
  • the present invention has an object to easily obtain a personalized pluripotent stem cell. More specifically, the present invention treats a disease without inducing immune rejection, without newly extracting and establishing stem cells such as ES cells and using egg cells as a material. Efficient identification of cells, tissues and organs that can be donors The challenge is to stand up.
  • the present invention relates to a gene cassette in which two recombinase recognition sites are inserted not in the cis direction but in one direction or in the reverse direction and marker genes are linked, and this cassette is applied to cell fusion technology. Solved by.
  • a desired chromosome is removed, and a cell that can be regenerated and preferably has an undifferentiated state is provided.
  • tailor-made stem cells for example, ES cells
  • the present invention provides a technique for deleting an unnecessary chromosome from a cell having a desired genome and imparted with pluripotency without losing pluripotency.
  • a gene other than the desired genome can be obtained! /, There can be no rejection reaction! /, And a “complete” individual-compatible pluripotent stem cell can be obtained.
  • a cell freely differentiated from a pluripotent stem cell having a desired genome and efficiently removing unnecessary chromosomes, such as a fused cell or a reprogrammed somatic cell When introduced into a recipient, tissues and organs allow for the desired treatment of tiller amide, e.g., a recipe compared to a cell derived from a cell having all of the transplanted antigens derived from stem cells (e.g., ES cells). Treatment such as reduction or complete elimination of rejection in the ent is achieved efficiently. That is, the pluripotent stem cell of the present invention can be an ideal material for establishing cells, tissues, and organs that serve as donors for treating diseases. These cells, tissues, and organs have great applications in tailor-made medicine, and their industrial utility is high.
  • human and mouse embryonic stem (ES) cells can confer pluripotency to adult somatic nuclei in ES-somatic cell hybrid cells (Tada, M., Takahama, Y., Abe, ⁇ ., Nakatsuji, ⁇ . And Tada, ⁇ . Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr Biol 11, 1553— 8,, (2001); Cowan, CA, Atienza, J., Melton , DA and Eggan, K. Nu clear reprogramming of somatic cells after fusion with human emb ryonic stem cells. Science 309, 1369—73 (2005)).
  • CEC universal chromosome elimination cassette
  • Our invention is in stem cell therapy through the removal of ES-derived MHC chromosomes from hybrid cells, or through replacement of ES cell-derived MHC chromosomes with somatic cell-derived MHC chromosomes in ES cells. It has been proven that the production of personalized pluripotent stem cells for use is practically feasible. Finally, all ES-derived chromosomes can be removed from the hybrid cells. Equally important is the prospect of creating pluripotent stem cells with various mutations by targeting the removal of normal ES cell chromosomes from patients to investigate the cause and treatment of human disease. .
  • the present invention provides the following.
  • recombinase recognition sequence is a homologous recombination sequence comprising a sequence selected from the group consisting of ⁇ sequence, FRT site, attB sequence, attP sequence and res site sequence ability.
  • the marker gene is a gene selected from the group consisting of a green fluorescent protein (GFP) gene, a yellow fluorescent protein (YFP) gene, a cyan fluorescent protein (CFP) gene, and a red fluorescent protein (dsRED) gene.
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • CFP cyan fluorescent protein
  • dsRED red fluorescent protein
  • the gene cassette according to item 1 further comprising a selection sequence.
  • the above selection sequences include thymidine kinase (TK) gene, puromycin resistance-conferring gene, neomycin resistance-conferring gene, no, idalomycin resistance-conferring gene, blasticidin resistance-conferring gene, and zeocin resistance-conferring gene.
  • the gene cassette according to item 4 comprising a sequence encoding a gene selected from the group consisting of a HAT resistance-conferring gene, a diphtheria toxin-conferring gene and a fluorouracil resistance-conferring gene.
  • a gene cassette for removing a desired chromosome comprising a gene cassette comprising a recombinase recognition sequence or a gene coding sequence comprising a marker gene.
  • composition according to item 11 wherein the chromosome comprises a pluripotency-related gene.
  • a kit for removing a desired chromosome
  • a kit for removing a desired chromosome also having stem cell power.
  • a kit for removing a desired chromosome from a cell having a desired genome, chromosome, or chromosome group, and possibly imparting the ability to the cell is provided.
  • a cell force having a desired genome is a method for removing a desired chromosome or group of chromosomes and possibly imparting the ability to the cells,
  • Exchange cells
  • the fusion cell wherein the desired chromosome is a chromosome containing a sequence encoding the ES cell MHC, a rejection-related gene or a gene corresponding thereto.
  • the desired chromosome is a chromosome selected from the group consisting of mouse chromosome 6, chromosome 11, chromosome 12 and chromosome 17, human chromosome 6 of the ES cell mouse or the above chromosome.
  • a fused cell that is a chromosome containing one or both copies of the corresponding chromosome.
  • the fused cell, wherein the desired chromosome is a chromosome containing one or more of the ES cell chromosomes.
  • the fused cell, wherein the desired chromosome is the entire chromosome of the ES cell.
  • the cell having the desired genome, chromosome or chromosome group is an individual affected with a disease.
  • a fused cell which is a cell having a genome, chromosome or chromosome group derived from the body.
  • the cell having the desired genome, chromosome or chromosome group is a cell having a genome, chromosome or chromosome group derived from a diseased individual, and the desired chromosome is
  • a cell library comprising a plurality of types of cells from which a desired chromosome has been removed.
  • a gene cassette comprising one or two recombinase recognition sequences in the reverse direction for producing a composition for removing a desired chromosome of a gene cassette comprising a sequence encoding a marker gene use.
  • a method for producing a chromosome exchange cell comprising:
  • a recombinase that recognizes the recombinase recognition sequence or a recombinase that recognizes the chromosome of the first cell corresponding to the desired chromosome of the second cell so that the chromosome of the first cell can be removed.
  • the present invention provides a technique capable of efficiently removing a target chromosome at will. Therefore, the lack of chromosomes at will facilitates regenerative medicine and tailor-made treatment, for example, reducing or suppressing immune rejection.
  • a transcript derived from a specific chromosome is derived only from a somatic cell.
  • FIG. 1A shows an implementation scheme of one embodiment of the present invention.
  • FIG. 1B shows that the chromosome removal cassette has been introduced into the end of mouse chromosome 11 by FISH analysis.
  • Figure 1C is a chromosomal analysis of a fusion cell of ES cells and somatic cells into which a chromosome removal cassette has been introduced.
  • the white arrow shows mouse chromosome 11.
  • FIG. 1D is a Facs analysis of the fused cells after Cre enzyme treatment. Circles indicate GFP positive cell population and hexagons indicate GFP negative cell population.
  • FIG. 1E is a chromosomal analysis of a cell clone from which mouse chromosome 11 introduced with a chromosome removal cassette has been removed. A white circle indicates that the chromosome has been removed. Yes.
  • Figure IF is a chromosomal analysis of a cell clone independent of Figure IE. As in Figure 1E, mouse chromosome 11 has been removed.
  • FIG. 2 shows the experimental results of the distribution of deleted chromosomes by karyotype analysis of cells of one embodiment in mice. Here, it can be seen that chromosome 11 has been successfully removed.
  • FIG. 3 is a schematic diagram for explaining the mechanism of chromosome removal according to the present invention.
  • FIG. 4 shows the introduction of a chromosome removal cassette into ES cells and the FISH analysis of the introduction cassette.
  • Figure 5 shows a fusion experiment of ES cells (CEC-ES) cells and somatic cells into which a chromosome removal cassette has been introduced.
  • the fused cell has 80 chromosomes and retains all chromosomes derived from ES cells and somatic cells.
  • FIG. 6 shows an example of selectively removing chromosome 11 by treating a fusion cell of an ES cell (CEC-ES) cell and a somatic cell into which a chromosome removal cassette has been introduced with a Cre enzyme.
  • CEC-ES ES cell
  • Cre enzyme Cre enzyme
  • FIG. 7 shows an example in which a chromosome removal cassette is introduced into chromosome 5 or 12 of mouse ES cells.
  • the removal cassette insertion site on the chromosome was analyzed by FISH method.
  • FIG. 8 shows a schematic view of production of a fusion cell for tailor-made treatment, which is a preferred embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 shows embryonic stem (ES) cells having a chromosome excision cassette (CEC) and cell fusion with somatic cells.
  • CEC chromosome excision cassette
  • FIG. 9b shows embryonic stem (ES) cells with chromosome excision cassettes (CEC) and cell fusion with somatic cells.
  • CEC chromosome excision cassettes
  • FIG. 9 shows embryonic stem (ES) cells having a chromosome excision cassette (CEC) and cell fusion with somatic cells.
  • CEC chromosome excision cassette
  • FIG. 9 shows embryonic stem (ES) cells having somatic chromosome cassette (CEC) and somatic cells. And shows cell fusion.
  • CEC11 hybrid G band-forming karyotype of a hybrid cell (CEC11 hybrid) having a single CEC tagi chromosome 11 before Cre treatment (before Cre).
  • FIG. 9e shows embryonic stem (ES) cells with chromosome excision cassettes (CEC) and cell fusion with somatic cells.
  • ES embryonic stem
  • CEC chromosome excision cassettes
  • e G-band forming karyotype of Cre prehybrid cell (CEC 12 hybrid) with a single CEC tagi ⁇ chromosome 12.
  • FIG. 9 shows embryonic stem (ES) cells having a chromosome excision cassette (CEC) and cell fusion with somatic cells.
  • CEC chromosome excision cassette
  • f Pre-Cre and Cre-treated (post-Cre) CEC11 hybrid cells and CEC12 hybrid cells F ACS analysis. GFP negative hybrid cells are in box R2, while GFP positive hybrid cells are in box R3.
  • FIG. 9 shows embryonic stem (ES) cells having a chromosome excision cassette (CEC) and cell fusion with somatic cells. g. FP expression in CEC11 hybrid clones before and after Cre.
  • CEC chromosome excision cassette
  • FIG. 10 shows chromosome painting and metaphase karyotype after removal of chromosomes 11 and 12.
  • a. CEC 11 chromosome binding before Cre treatment (before Cre).
  • Four chromosomes 11 in the nucleus are recognized as red painting signals.
  • FIG. 10 shows chromosome painting and metaphase karyotype after removal of chromosomes 11 and 12.
  • b Chromosome painting of Cre-treated (after Cre) CFC11 hybrid cells. Chromosome removal resulted in three chromosomes 11 in each nucleus, recognized as a red painting signal.
  • FIG. 10 shows chromosomal painting and metaphase karyotype after removal of chromosomes 11 and 12. c Chromosome binding of pre-CRE CEC 12 hybrid cells. The four chromosome 12 forces in the nucleus are recognized as red painting signals.
  • FIG. 10d shows chromosome painting and metaphase karyotype after removal of chromosomes 11 and 12.
  • d Chromosome binding of CEC 12 hybrid cells after Cre. Chromosome removal resulted in three chromosomes 12 in each nucleus, recognized as a red painting signal.
  • FIG. 10e shows chromosome painting and metaphase karyotype after removal of chromosomes 11 and 12.
  • e G band karyotype of CEC11 hybrid cells after Cre.
  • White arrows indicate the three chromosomes in the nucleus. Open circles represent selective removal of one chromosome 11.
  • Figure 10 shows chromosome painting and metaphase karyotypes after removal of chromosomes 11 and 12.
  • f G band nucleation of CEC12 hybrid cells after Cre.
  • White arrows indicate three chromosomes 12 in the nucleus. The white circle represents the selective removal of one 12th chromophore.
  • FIG. 10 shows chromosome painting and metaphase karyotype after removal of chromosomes 11 and 12.
  • M Micro-chromosome
  • Cre Small chromosomes (white arrows) consist mostly of centromeric heterochromatin, as shown by FISH.
  • FIG 11 shows the targeted removal of ES-derived chromosome 6 pair in the hybrid cell nucleus.
  • ES cell homozygotes for CEC were selected by high dose 0418 treatment.
  • Figure 11 shows the targeted removal of ES-derived chromosome 6 pair in the hybrid cell nucleus.
  • b Southern blot hybridization analysis of homozygous recombination in CEC6tgZ + ES cells and CEC6tgZtg ES cells.
  • l The lkb band is specific for the wild type counterpart, while the 2.3 kb band is specific for the knock-in allele.
  • FIG. 11 shows the targeted removal of ES-derived chromosome 6 pair in the hybrid cell nucleus.
  • c Chromosome painting (red) of CEC6 (tg Ztg) hybrid cells with two chromosomes 6 in the nucleus 3 days after Cre treatment.
  • FIG. 11 shows the targeted removal of ES-derived chromosome 6 pair in the hybrid cell nucleus.
  • d Chromosome painting of GFP-negative CEC6 (tg / tg) hybrid cells with 3 chromosomes 6 (red) and 4 chromosomes 17 (green) in the nucleus 7 days after Cre treatment.
  • FIG. 11 shows the targeted removal of ES-derived chromosome 6 pair in the hybrid cell nucleus.
  • GFP-negative CEC hybrid cells with two-armed chromosomes formed by a Robertson translocation between two chromosomes in the nucleus 7 days after Cre treatment, and normal cells Chromosome painting of chromosome 6.
  • FIG. 11 shows removal targeted at the ES-derived chromosome 6 pair in the hybrid cell nucleus.
  • f Location of CEC6 (green dot) and marker locus on chromosome 6.
  • g Determination of the origin of chromosome 6 by genomic PCR analysis using three marker loci on chromosome 6.
  • FIG. 11 shows removal targeted at the ES-derived chromosome 6 pair in the hybrid cell nucleus.
  • h Determination of the origin of Nanog and StellaZPGC7 transcripts by RT-PCR analysis of polymorphic products.
  • FIG. 11 shows the targeted removal of ES-derived chromosome 6 pair in the hybrid cell nucleus. i. Expression of NANOG and OCT4 in ES-derived hybrid cells lacking chromosome 6 (immunohistochemical staining).
  • FIG. 11 shows removal targeted at the ES-derived chromosome 6 pair in the hybrid cell nucleus.
  • j NANOG expression level in post-Cre hybrid cells by Western blot hybridization.
  • SEQ ID NO: 1 is a ⁇ array.
  • SEQ ID NO: 2 is the IRES sequence.
  • SEQ ID NO: 3 is the CAG sequence.
  • SEQ ID NO: 4 is the FRT site.
  • SEQ ID NO: 5 is the attB sequence.
  • SEQ ID NO: 6 is the attP sequence.
  • SEQ ID NO: 7 is the sequence of green fluorescent protein.
  • SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence of green fluorescent protein.
  • SEQ ID NO: 9 is the coding sequence of a puromycin resistance-conferring gene.
  • SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of the puromycin resistance-conferring gene.
  • SEQ ID NO: 11 is the entire CEC sequence.
  • SEQ ID NO: 12 is D6Mitl83, primer 1: 5 TTCTCAATGAACACTAGA ACATTCG 1 3 ′.
  • SEQ ID NO: 13 is D6Mitl83, primer 2: 5 AAAACACAGGTAGAAAA CATACATACA-3 ′.
  • SEQ ID NO: 14 is D6Mitl02, primer 1: 5 CCATGTGGATATCTTCCC TTG-3 ′.
  • SEQ ID NO: 15 is D6Mitl02, primer 2: 5 GTATACCCAGTTGTAAAT CTTGTGTG 1-3.
  • SEQ ID NO: 16 is D6Mitl4, primer 1: 5′-ATGC AG AAAC ATG AGTGG GG—3 ′.
  • SEQ ID NO: 17 is D6Mitl4, primer 2: 5,-CACAAGGCCTGATGACCTC T 1 3 ′.
  • SEQ ID NO: 18 is the GFP F primer: 5′—CGTAAACGGCC AC AAGTTC A-3 ′.
  • SEQ ID NO: 19 is a GFP R primer: 5′—CGCTTTACTTGTACAGCTCGT 1 ′.
  • Sequence number 20 is Nanog F1 primer: 5,-GCGCATTTTAGCACCCCAC A-3 '.
  • SEQ ID NO: 21 is Nanog R1 primer: 5′—GTTCTAAGTCCTAGGTTTGC one 3 ′.
  • SEQ ID NO: 22 is Stella / PGC7 F primer: 5′-ACAG ACTGACTGCTA ATTGG-3 ′.
  • SEQ ID NO: 23 is Stella / PGC7 R primer: 5, — GGAAATTAGAACGTA CATACTCC-3 ′.
  • IJ No. 24 is G3pdh F primer: 5, -TG AAGGTCGGTGTG AACGG A TTTGGC-3 '.
  • SEQ ID NO: 25 is the G3pdh R primer: 5, one CATGTAGGCCATGAGGTCCA C 3 '.
  • the term “cell” is defined in the same way as the broadest meaning used in the field, and is a structural unit of a tissue of a multicellular organism and is a membrane that isolates the outside world.
  • the cells used herein may be naturally occurring cells or artificially modified cells (for example, fusion cells, genetically modified cells).
  • stem cell refers to a self-replicating ability and pluripotency (ie, pluripotency).
  • stem cells are usually able to regenerate the tissue when it is damaged.
  • stem cells can be, but are not limited to, ES cells or tissue stem cells (also tissue specific stem cells or somatic stem cells).
  • an artificially produced cell for example, a fusion cell described herein, a reprogrammed cell, etc.
  • ES cells refer to pluripotent stem cells derived from early embryos. ES cells were first established in 1981 and have been applied since 1989 to the production of knockout mice. In 1998, human ES cells were established and are being used in regenerative medicine.
  • Tissue stem cells unlike ES cells, are cells that have a limited direction of differentiation, exist at specific locations in the tissue, and have an undifferentiated intracellular structure. Therefore, tissue stem cells have a low level of pluripotency. Tissue stem cells are poor in organelles with a high nuclear Z cytoplasm ratio. Tissue stem cells generally have pluripotency and maintain proliferative ability over the life of an individual with a slow cell cycle. As used herein, tissue stem cells can also be used depending on the force situation where the stem cells can preferably be ES cells.
  • tissue stem cells are, for example, the skin system, digestive system, bone marrow It can be divided into system and nervous system.
  • skin tissue stem cells include epidermal stem cells and hair follicle stem cells.
  • tissue stem cells of the extinguisher include knee (common) stem cells and liver stem cells.
  • myeloid thread and tissue stem cells include hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells.
  • Neural tissue stem cells include neural stem cells and retinal stem cells.
  • somatic cells refers to all cells that are cells other than germ cells, such as eggs and sperm, and that do not pass the DNA directly to the next generation. Somatic cells usually have power or loss of limited pluripotency. As used herein, somatic cells may be naturally occurring or genetically modified.
  • Cells may be classified into stem cells derived from ectoderm, mesoderm and endoderm, depending on origin.
  • Cells derived from ectoderm are mainly present in the brain and include neural stem cells.
  • Cells derived from mesoderm are mainly present in bone marrow, and include vascular stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and the like.
  • Endoderm-derived cells are mainly present in organs, and include liver stem cells, spleen stem cells, and the like.
  • somatic cells may be derived from any germ layer.
  • lymphocytes, spleen cells or testis-derived cells, and bone marrow cells can be used as the somatic cells.
  • isolated means that, in a normal environment, it is at least reduced, preferably substantially free of naturally associated substances.
  • an isolated cell refers to a cell that is substantially free of other substances (eg, other cells, proteins, nucleic acids, etc.) that accompany it in its natural environment.
  • isolated is, for example, substantially free of cellular material or culture medium when made by recombinant DNA technology, and precursor when chemically synthesized.
  • An isolated nucleic acid is preferably a sequence that naturally flanks the nucleic acid in the organism from which the nucleic acid is derived (ie, sequences located at the 5 'and 3' ends of the nucleic acid). Not included.
  • an "established” or “established” cell is one that maintains certain properties (eg, pluripotency) and that the cell is cultured under culture conditions. It means a state where it has continued to grow stably. Thus, the established stem cells maintain pluripotency. In the present invention It is preferable to use an established stem cell because the host power can avoid the step of collecting a new stem cell.
  • non-embryonic means not derived directly from an early embryo. Therefore, cells derived from parts of the body other than the early embryo can be obtained by applying modifications (for example, genetic modification, fusion, etc.) to the ES cells. is there.
  • the term "divided cell” refers to a cell (eg, muscle cell, nerve cell, etc.) that has specialized functions and morphology. There is little or no ability.
  • differentiated cells include epidermal cells, splenic parenchymal cells, splenic duct cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, skeletal myoblasts, nerve cells, vascular endothelial cells, dyes Examples thereof include cells, smooth muscle cells, fat cells, bone cells, and chondrocytes.
  • a split cell can also be used as or instead of a somatic cell in the present invention.
  • differentiation has morphological and Z or functional qualitative differences among daughter cell populations resulting from the division of one cell.
  • cell differentiation it is common to consider cell differentiation as a state in which a specific gene group in the genome is expressed. By searching for intracellular or extracellular factors or conditions that cause such a gene expression state, cell differentiation is considered. ⁇ can be identified.
  • the results of cell sorting are in principle stable, especially in animal cells, sorting into other types of cells can only occur exceptionally. Therefore, it is very valuable that genetic modification of acquired pluripotent cells as in the present invention can be easily performed.
  • pluripotency or "probably pluripotency” is used interchangeably, refers to the nature of a cell, and is divided into one or more, preferably two or more various tissues or organs. The ability to deceive Say. Therefore, “pluripotency” and “multipotency” are used interchangeably with “undifferentiated” in this specification unless otherwise specified. Normally, the pluripotency of a cell is limited as it develops, and in adults, the cells of one tissue or organ rarely change to another. Therefore, pluripotency is usually lost. In particular, epithelial cells are unlikely to change into other epithelial cells. When this happens, it is usually a pathological condition and is called metaplasia.
  • mesenchymal cells have a high degree of pluripotency because they are susceptible to metaplasia instead of other mesenchymal cells with a relatively simple stimulus.
  • ES cells are pluripotent.
  • Tissue Stem cells are pluripotent.
  • pluripotency the ability to distribute to all types of cells constituting a living body, such as a fertilized egg, is called totipotency, and pluripotency can encompass the concept of totipotency.
  • pluripotency includes, but is not limited to, formation of an embryoid body in an in vitro culture system, culture under differentiation induction conditions, and the like.
  • assesi methods for the presence or absence of pluripotency using living organisms include the formation of malformed species (teratomas) by transplantation into immunodeficient mice, the formation of chimeric embryos by injection into blastocysts, and transplantation into living tissues Examples include, but are not limited to, proliferation by injection into ascites.
  • the cells used in the present invention are cells derived from any organism (for example, any type of multicellular organism (eg, animal (eg, vertebrate, invertebrate)), plant (eg, monocotyledonous plant, It may be a dicotyledonous plant)))).
  • any organism for example, any type of multicellular organism (eg, animal (eg, vertebrate, invertebrate)), plant (eg, monocotyledonous plant, It may be a dicotyledonous plant))
  • vertebrates for example, metaraunagi, shark eels, cartilaginous fish, teleosts, amphibians, reptiles, birds, mammals, etc.
  • mammals eg, single pores
  • Marsupials rodents, wings, wings, carnivores, carnivores, long noses, odd-hoofed animals, even-hoofed animals, rodents, scales, marine cattle, cetaceans, Cells derived from primates, rodents, maggots, etc. are used. More preferably, cells derived from primates (for example, chimpanzees, dihonkeys, humans) are used. Most preferably, human-derived cells are used.
  • the organ targeted by the present invention may be any organ, and the tissue or cell targeted by the present invention may be derived from any organ or organ of an organism.
  • the organs targeted by the present invention include skin, blood vessels, cornea, kidney, heart, liver, umbilical cord, intestine, nerve, lung, placenta, spleen, brain, peripheral limbs, retina and the like. It is not limited to them.
  • cells that also have pluripotent cell power according to the present invention include epidermal cells, splenic parenchymal cells, knee duct cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, skeletal cells. Examples include, but are not limited to, myoblasts, nerve cells, vascular endothelial cells, pigment cells, smooth muscle cells, adipocytes, bone cells, and chondrocytes.
  • tissue refers to a cell population having substantially the same function and Z or morphology in a multicellular organism.
  • tissue can be referred to as a tissue if it has the same function and Z- or morphology even if it is a population of cells with the same origin but different origins. Therefore, when a tissue is regenerated using the stem cells of the present invention, cell populations having two or more different origins can constitute one tissue.
  • the tissue forms part of an organ. Animal tissues are classified into epithelial tissue, connective tissue, muscle tissue, nerve tissue, etc. based on morphological, functional or developmental basis. Plants are divided into meristems and permanent tissues according to the developmental stage of the constituent cells, and are classified into single tissues and complex tissues according to the type of constituent cells. The
  • a gene construct or vector is introduced into a cell.
  • nucleic acid construct As used herein, "gene construct”, “nucleic acid construct” or “gene cassette” is used interchangeably and refers to a nucleic acid molecule (eg, DNA, RNA) encoding a gene, And a nucleic acid sequence operably linked as needed (ie, so as to control the expression of the nucleic acid), and a control sequence (eg, A nucleic acid molecule comprising a promoter) and a heterologous gene operably linked thereto (ie, in frame). It is also within the scope of the present invention to use this cassette or construct in combination with other regulatory elements as required. Preferred expression cassettes can be cleaved with specific restriction enzymes and easily recovered Gene cassette or nucleic acid construct.
  • any method for introducing such a gene construct or vector any method can be used as long as it introduces a nucleic acid molecule such as DNA into a cell.
  • transfection, transduction, transformation and the like can be used.
  • Such nucleic acid molecule introduction techniques are well known and commonly used in the art, for example, Ausubel FA et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York ;, NY; Sambrook J et al. (1987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. And his brother three liR, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY , 1997 and the like.
  • Gene transfer can be confirmed using methods described herein, such as Northern blots, Western blot analysis, or other well-known conventional techniques.
  • vector refers to a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence to a target cell.
  • vectors can replicate autonomously in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, animal individuals and plant individuals, or can be threaded into chromosomes. Examples include those containing a promoter at a position suitable for transcription of the polynucleotide of the present invention.
  • any of the methods described above for introducing a nucleic acid molecule such as DNA into a cell can be used.
  • transfection transduction, transformation, etc.
  • calcium phosphate method for example, calcium phosphate method, ribosome method, DEAE dextran method, electo-poration method [Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)], methods using a notion gun (gene gun)), lipofussion method, spheroplast Method [Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)], Lithium acetate method Q [. Bacteriol., 153, 163 (1983)], Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
  • gene introduction reagent refers to a nucleic acid (normally encoding a gene, but It is not limited to this, but refers to a reagent that is used to promote the efficiency of introduction, based on the introduction method.
  • gene introduction reagents include, but are not limited to, cationic polymers, cationic lipids, polyamine reagents, polyimine reagents, calcium phosphate, and the like.
  • Specific examples of reagents used in the transformation include those commercially available from various sources, such as Effectene Transfecti on Reagent (cat. No. 301425, Qiagen, CJ), TransFastTM Transfection.
  • a gene introduction reagent can be used when introducing the nucleic acid molecule of the present invention into a cell.
  • “Recombinant vectors” for prokaryotic cells include pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (all available from Roche Molecular Biochemicals), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX—1 [Promega], pQE—8 (QIAGEN ), PK YP10 (JP 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (198 4)], pLSAl [Agric. Biol.
  • prokaryotic cells are mainly used when a gene is manipulated.
  • “recombinant vectors” for animal cells include pcDNAlZAmp, pcDNAI, pCDM8 (all commercially available from Funakoshi), pAGE107 [JP-A-3-229 (Invitrogen), pAGE103 Q [. Biochem., 101]. , 1307 (1987)], ⁇ , ⁇ A [J. Biol. Chem., 268, 22782— 22787 (1993)], retrovirus-type expression vector based on Murine Stem Cell Virus (MSCV) Etc. are exemplified.
  • MSCV Murine Stem Cell Virus
  • retroviral vectors used in the present invention include, but are not limited to, retroviral expression vectors based on Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) and Murine Stem Cell Virus (MSCV). Not
  • transformant refers to all or part of a living organism such as a cell produced by transformation.
  • examples of transformants include prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells and the like.
  • a transformant is also referred to as a transformed cell, a transformed tissue, a transformed host or the like depending on the subject.
  • the cell used in the present invention may be a transformant.
  • the prokaryotic mitochondrial cells include Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, ⁇ , Microbacterium ⁇ .
  • animal cells include mouse 'myeloma cells, rat.myeloma cells, mouse's cells, hybridoma cells, Chinese' cells, CHO cells and BHK cells that are Muster's cells. And African green monkey kidney cells, human leukemia cells, HBT563 7 (JP-A 63-299), and human colon cancer cell lines.
  • Mouse 'myeloma cells such as ps20, NSO, rat' myeloma cells such as YB2Z0, human fetal kidney cells such as HEK293 (ATCC: CRL-1573), human leukemia cells such as BALL-1 and African green monkeys
  • kidney cells include COS-1, COS-7, and human colon cancer cell lines include HCT-15.
  • the retrovirus infection method is well known in the art as described in, for example, Current Protocols in Molecular Biology, supra (particularly Units 9.9-9.14).
  • a culture supernatant of virus-producing cells packetaging cell lines
  • a sufficient amount of infected cells can be obtained by co-culture together for 1-2 hours.
  • detection or “quantification” of gene expression (eg, mRNA expression, polypeptide expression) refers to appropriate methods including, for example, mRNA measurement and immunological measurement methods. Can be achieved. Examples of molecular biological measurement methods include Northern blot method, dot plot method, PCR method and the like. Examples of the immunological measurement method include an ELISA method using a microtiter plate, an RIA method, a fluorescent antibody method, a Western plot method, and an immunohistochemical staining method. Examples of the quantification method include ELISA and RIA. It can also be performed by a gene analysis method using an array (for example, DNA array, protein array).
  • an array for example, DNA array, protein array.
  • DNA arrays have been extensively outlined in (edited by Shujunsha, separate volume of cell engineering “DNA microarrays and the latest PCR method”). For protein arrays, see Nat Genet. 2002 Dec; 32 Suppl: 526 Detailed in —32.
  • gene expression analysis methods include, but are not limited to, RT-PCR, RACE method, SSCP method, immunoprecipitation method, two-hybrid system, and in vitro translation. Such further analysis methods are described in, for example, the genome analysis experiment method 'Yusuke Nakamura Lab' manual, edited 'Yusuke Nakamura Yodosha (2002), etc., all of which are referred to in this specification. Incorporated as.
  • expression of a gene product such as a gene, polynucleotide, or polypeptide means that the gene product or the like is subjected to a certain action in vivo to take another form.
  • it refers to force transcription and translation of genes, polynucleotides and the like to form a polypeptide, but transcription to produce mRNA can also be a form of expression. More preferably, such a polypeptide form may have undergone post-translational processing.
  • expression level refers to the amount by which a polypeptide or mRNA is expressed in a target cell or the like. Such expression level is evaluated by any appropriate method including immunological measurement methods such as ELI SA method, RIA method, fluorescent antibody method, Western plot method, immunohistological staining method, etc. using the antibody of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention evaluated by any appropriate method including molecular biological measurement methods such as Northern blot method, dot blot method, PCR method, etc.
  • Expression level at the mRNA level “Change in expression level” means the expression level at the protein level or mRNA level of the polypeptide of the present invention evaluated by any appropriate method including the immunological measurement method or molecular biological measurement method described above. It means increase or decrease.
  • expression or “reduction” in “expression amount” of a gene, polynucleotide, polypeptide, etc. means an effect when the factor of the present invention is applied. This means that the amount of expression is significantly reduced compared to when not.
  • the decrease in expression includes a decrease in the expression level of the polypeptide.
  • expression or “increase” in “expression” or “expression level” of a gene, polynucleotide, polypeptide or the like refers to a factor related to gene expression in a cell (eg, a gene to be expressed or regulates it) When the factor is introduced, the amount of expression increases significantly compared to when the agent is not allowed to act.
  • the increase in expression is An increase in the expression level of the polypeptide.
  • induction of “expression” of a gene means that a certain factor acts on a certain cell to increase the expression level of the gene. Therefore, the induction of expression means that the gene is expressed when the expression of the gene is not seen at all, and the expression of the gene has already been seen! / Including the increase in the expression of the gene when drowning.
  • the expression "specifically expresses" a gene means that the gene is at a level (preferably high) different from other sites or times at a specific site or time. It means being expressed.
  • the expression specifically means that it may be expressed only at a certain site (specific site) or at other sites.
  • the expression specifically preferably means that it is expressed only at a certain site.
  • a gene introduced into an organism or cell according to the present invention may be modified so that it is specifically expressed.
  • biological activity refers to an activity that a certain factor (for example, a polypeptide or a protein) has in vivo, and has various functions (for example, transcription-promoting activity). ) Is exhibited.
  • a certain factor for example, a polypeptide or a protein
  • its biological activity includes the formation of conjugates or other biological changes.
  • such biological activity can be gene translocation activity or the like. The gene translocation activity can be determined by confirming the movement of the sequence encoding the gene of interest by any method.
  • the biological activity includes the enzyme activity.
  • the ligand includes binding to the corresponding receptor.
  • Such biological activity can be measured by techniques well known in the art (see Molecular Cloning, Current Protocols (cited herein), etc.)
  • gene refers to a factor that defines a genetic trait. Usually arranged in a certain order on a chromosome. Those that define the primary structure of a protein are called structural genes, and those that affect their expression are called regulatory genes (for example, promoters). In this specification, genes include structural genes and regulatory genes unless otherwise stated. To do. Thus, for example, a recombinase gene usually includes both a recombinase structural gene and a recombinase promoter, but may refer only to a structural gene or a variant thereof as long as the object of the present invention can be achieved. . In the present specification, a gene usually includes a regulatory region, a coding region, an exon, and an intron.
  • gene refers to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid”.
  • a “gene product” also refers to a “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” expressed by a gene and z or “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide”. And “peptide”.
  • a gene product is, depending on the situation. Therefore, usually, in this specification, a gene includes not only double-stranded DNA but also each single-stranded DNA such as a sense strand and an antisense strand constituting the DNA, and the length of the gene is not limited. It is not limited.
  • the gene of the present invention includes a double-stranded DNA containing human genomic DNA, a single-stranded DNA containing a cDNA (sense strand), and a single strand having a sequence complementary to the sense strand. This includes strand DNA (antisense strand) and their excursions!
  • homology refers to the degree of identity of two or more gene sequences with each other. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity. Whether two genes have homology can be determined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions.
  • the DNA sequence between the gene sequences is typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% If they are 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical, the genes have homology.
  • sequences for example, nucleic acid sequences, amino acid sequences, etc. refers to two or more gene sequences when conservative substitutions are regarded as positive (identical) in the above homology. , Refers to the degree of identity to each other. Therefore, save Where there is a conservative substitution, identity and similarity differ depending on the presence of the conservative substitution. When there is no conservative substitution, identity and similarity indicate the same numerical value.
  • the comparison of similarity, identity and homology between amino acid sequences and base sequences is calculated using default parameters in BLAST, a tool for sequence analysis.
  • the identity search can be performed, for example, using NCBI's BLAST 2.2.9 (issued on May 12, 2004).
  • the identity value usually refers to a value obtained by aligning using the above BLAST under the default conditions. However, if a higher value is obtained by changing the parameter, the highest value is the identity value. When identity is evaluated in multiple areas, the highest value is used as the identity value
  • the terms "protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length.
  • the polymer may be linear or branched or cyclic.
  • the amino acid may be a modified amino acid, which may be natural or non-natural.
  • the term may also include those assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, daricosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component). .
  • This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of amino acids (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids), and those known in the art. Other modifications are included.
  • the gene product of a protein usually takes the form of a polypeptide, but may be a variant of a polypeptide as long as it has a similar function.
  • Polypeptides having a specific amino acid sequence include fragments, homologues, derivatives and modifications thereof.
  • polynucleotide As used herein, the terms “polynucleotide”, “oligonucleotide”, “nucleic acid molecule” and “nucleic acid” are used interchangeably herein and are any length of a polymer of nucleotides. Say. The term also includes “derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide”. “Derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide” "” Refers to an oligonucleotide or polynucleotide comprising a derivative of a nucleotide or having an unusual linkage between nucleotides, and is used interchangeably.
  • oligonucleotides include, for example, 2 ′ O-methyl-ribonucleotides, derivative oligonucleotides in which phosphodiester bonds in oligonucleotides are converted to phosphoroate bonds, in oligonucleotides Derivative oligonucleotide in which phosphodiester bond is converted to N3, 1 P5, phosphoramidate bond, derivative oligonucleotide in which ribose and phosphodiester bond in oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bond, in oligonucleotide Derivative oligonucleotides in which uracil is substituted with C 5 propyruuracil, derivative oligonucleotides in which uracil in the oligonucleotide is substituted with C 5 thiazoleuracil, derivatives in which cytosine in the oligonucleotide is replaced with C 5 propy
  • a particular nucleic acid sequence is also a conservatively modified variant (e.g., a degenerate codon substitute) and a complementary sequence, as well as the explicitly indicated sequence. Is intended to be included.
  • a degenerate codon substitute creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and a Z or doxyinosine residue.
  • nucleotide refers to a nucleoside in which the sugar moiety is a phosphate ester, and includes DNA, RNA, etc., and may be natural or non-natural.
  • a nucleoside refers to a compound in which a base and a sugar are N-glycosidic bonds.
  • Derivative nucleotides or “nucleotide analogs” refer to those that are different from naturally occurring nucleotides but have the same function as the original nucleotide. Such derivative nucleotides And nucleotide analogs are well known in the art.
  • DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
  • the "variant" refers to a substance in which a part of the original substance such as a polypeptide or polynucleotide is changed. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. Alleles are genetic variants that belong to the same locus and are distinguished from each other. Therefore, an “allelic variant” refers to a variant that has an allelic relationship with a gene. “Species homologue” refers to homology (preferably 60% or more homology, more preferably 80% or more, 85%) with a certain gene at the amino acid level or nucleotide level. Or more, 90% or more, 95% or more). The method for obtaining such species homologues is also apparent in the description herein. Thus, the cells used in the present invention may contain modified nucleic acids or polypeptides! /.
  • the variant is a naturally occurring allelic variant, a non-naturally occurring variant, a deletion, substitution, addition, and a Z or insertion variant; It can mean a polynucleotide sequence that does not substantially alter the function of the polypeptide.
  • these amino acid sequence alterations may occur in nature due to mutations, post-translational modifications, etc., but naturally derived genes (eg, specific genes of the present invention) ) To do this artificially.
  • the polypeptide is at least 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and even more preferred allelic variants, homologues, natural variants. Or 97% homologous.
  • the "corresponding" amino acid or nucleic acid refers to a polypeptide molecule or a polypeptide as a reference for comparison with a certain polypeptide molecule or polynucleotide molecule, respectively.
  • a transposon sequence may be a similar part in an ortholog corresponding to a specific part of the transposon sequence.
  • a "corresponding" gene eg, a nucleic acid molecule, a polypeptide, etc.
  • a corresponding gene has the same action as a given gene in a species as a reference for comparison in a certain species. Or a gene that has the same origin in evolution when there are multiple genes that have such an action.
  • the corresponding gene of a gene can be an ortholog or species homologue of that gene. Therefore, genes corresponding to mouse recombinase and the like can be found in other animals. Such corresponding genes can be identified using techniques well known in the art.
  • a corresponding gene in an animal is obtained by using the sequence of the gene that serves as a reference for the corresponding gene (for example, mouse recombinase) as a query sequence (for example, human, rat, inu, cat).
  • a query sequence for example, human, rat, inu, cat.
  • Such a corresponding gene can be easily obtained by those skilled in the art using a genome database. Methods for obtaining such genomic sequences are well known in the art and are described elsewhere herein. In the present invention, sequences obtained by such a search can also be used.
  • a “fragment” refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length from 1 to n ⁇ 1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length n).
  • the length of the fragment can be changed as appropriate according to its purpose.
  • the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 in the case of a polypeptide. , 15, 2, 0, 25, 30, 40, 50 and more, and lengths expressed in integers not specifically listed here (for example, 11 etc.) are also suitable as lower limits. It can be.
  • examples include 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides.
  • Integer lengths may also be appropriate as lower bounds.
  • Polypeptide and polynucleotide lengths can be expressed in terms of the number of amino acids or nucleic acids, respectively, as described above, but the above numbers are not absolute and have the same function (for example, mouse recombinase). As long as it has a function), the above number as the upper limit or the lower limit is intended to include the upper and lower numbers (or, for example, 10% above and below) of the number. In order to express such intention, in this specification, “about” may be added before the number. However, it should be understood herein that the presence or absence of “about” does not affect the interpretation of the figures.
  • biomolecule refers to a molecule related to a living body.
  • a biomolecule includes a molecule extracted from a living body, but is not limited thereto, and any molecule that can affect a living body falls within the definition of a biomolecule. Therefore, molecules synthesized by combinatorial chemistry, and small molecules that can be used as pharmaceuticals (for example, small molecule ligands) also enter the definition of biomolecules because they can be intended for effects on living bodies.
  • biomolecules include proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA, genomic DNA, RNA such as mRNA), poly Examples include saccharides, oligosaccharides, lipids, small molecules (for example, hormones, ligands, signal transmitters, organic small molecules, etc.), and complex molecules of these (glycolipids, glycoproteins, lipoproteins, etc.). It is not limited to them. Biomolecules can also include the cell itself, or a portion of tissue, as long as introduction into the cell is contemplated.
  • biomolecules can be nucleic acids, proteins, lipids, sugars, proteolipids, lipoproteins, glycoproteins, proteodalycans, and the like.
  • the biomolecule comprises a nucleic acid (DNA or RNA) or protein.
  • the biomolecule is a nucleic acid (eg, genomic DNA or cDNA, or DNA synthesized by PCR, etc.).
  • the biomolecule can be a protein.
  • such biomolecules can be hormones or cytopower in.
  • search refers to other nuclei having a specific function and Z or property using a certain nucleobase sequence electronically or biologically or by other methods. This refers to finding an acid-base sequence.
  • Electronic searches include BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403—410 (1990)), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444). — 2448 (1988)), Smith and Waterman method (Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147: 195—197 (1981)), and Needleman and Wunsch method (Needleman and Wunsch, J. Mol.
  • Biological searches include stringent hybridization, macroarrays with genomic DNA affixed to nylon membranes, or microarrays (microarray assay) affixed to glass plates, PCR and in situ noise. Examples include, but are not limited to redization.
  • a recombinase sequence identified by such a search can also be used.
  • “highly stringent conditions” allow for hybridization of DNA strands that have a high degree of complementarity in nucleic acid sequences, and DNA hybridization that has significant mismatches. Exclude conditions designed to be excluded!
  • the stringency of a hybridization is mainly determined by the temperature, ionic strength, and conditions of the denaturing agent such as formamide. Examples of “highly stringent conditions” for such hybridization and washing are 0.0015M sodium chloride, 0.0015M sodium quenate, 65-68. C, or 0.005M sodium chloride, 0.0015M sodium citrate, and 50% formamide, 42 ° C.
  • hybridization buffer and wash buffer examples include 0.1% ushi serum albumin, 0.1% polybulurpyrrolidone, 0.1% sodium pyrophosphate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (NaDodSO or SDS), Ficoll, Denhardt solution,
  • Sonicated salmon sperm DNA or another non-complementary DNA
  • dextran sulfate but other suitable agents can also be used.
  • concentration and type of these additives can be varied without substantially affecting the stringency of the hybridization conditions.
  • Hybridization experiments are usually carried out at pH 6.8 to 7.4; however, under typical ionic strength conditions, the speed of hybridization is almost exclusively at pH. See Anderson et al., Nucleic Acid Hybridization: a Practical Ap proach, Chapter 4, IRL Press Limited (Oxford, England).
  • Factors affecting the stability of DNA duplex include base composition, length, and degree of base pair mismatch. Hybridization conditions can be adjusted by those skilled in the art to apply these variables and allow different sequence related DNAs to form hybrids.
  • the melting temperature of a perfectly matched DNA duplex can be estimated by the following equation:
  • N is the length of the double chain formed
  • [Na +] is the molar concentration of sodium ions in the noble, hybridization solution or wash solution
  • % G + C is The percentage of (guanine + cytosine) bases in the.
  • the melting temperature decreases by about 1 ° C for each 1% mismatch.
  • moderately stringent conditions refers to the formation of DNA duplexes having a higher degree of base pair mismatch than can occur under "highly stringent conditions”. The condition to obtain. Typical examples of ⁇ moderately stringent conditions '' are 0.005M salt sodium silicate, 0.0015M sodium quenate, 50-65 ° C, or 0.015M sodium chloride, 0.005M salt sodium. 0015M sodium citrate, and 20% formamide, 37-50. C. As an example, a “moderately stringent” condition of 50 ° C in 0.015M sodium ion will allow about 21% discrepancy.
  • the melting temperature of a perfectly matched long DNA is about 71 ° C.
  • this allows about 6% mismatch.
  • one skilled in the art can simply decrease the temperature or increase the ionic strength.
  • Tm (2 ° C per A—T base) + (4 ° C per G—C base pair)
  • the sodium ion concentration in 6 X citrate sodium salt (SSC) is 1 M (see Suggs et al., Developmental Biology Using Purified Genes, page 683, Brown and Fox (ed.) (1981)).
  • a natural nucleic acid encoding a protein such as a recombinase or a recombinase recognition sequence or a variant or fragment thereof and a promoter used in the present invention for example, a nucleic acid sequence used and exemplified in the Examples.
  • a cDNA library having a PCR primer and a hybridization probe containing all or part of (for example, SEQ ID NO: 1) or a variant thereof and a hybridization probe is easily separated.
  • the preferred nucleic acid encoding LV, recombinase or recombinase recognition sequence or a variant or fragment thereof is essentially 1% sushi serum albumin (BSA); 500 mM sodium phosphate (NaPO); lmM EDTA; 42 ° C Hybrid containing 7% SDS at temperatures of
  • BSA sushi serum albumin
  • NaPO sodium phosphate
  • lmM EDTA 42 ° C Hybrid containing 7% SDS at temperatures
  • wash buffer containing a seed buffer and essentially 2 X SSC (600 mM NaCl; 60 mM sodium taenoate); 50 ° C 0.1% SDS 1% ushi serum albumin (BS A) at a temperature of 50 ° C; 500 mM sodium phosphate (NaPO); 15% formamide; ImM EDTA; 7%
  • Low stringency conditions defined by a hybridization buffer containing SDS and essentially 1X SSC (300 mM NaCl; 30 mM sodium citrate) at 50 ° C; wash buffer containing 1% SDS Bottom, most preferably essentially 1% ushi serum albumin (BSA) at a temperature of 50 ° C .; 200 mM sodium phosphate (NaPO 4); 15% formamide; lm
  • a "probe” refers to a substance to be searched that is used in biological experiments such as screening, such as in vitro and Z or in vivo. And a nucleic acid molecule containing a specific base sequence or a peptide containing a specific amino acid sequence.
  • At least 30 contiguous nucleotides at least 15 contiguous nucleotides, at least 20 contiguous nucleotides, at least 25 contiguous nucleotides, at least 30 contiguous nucleotides Of at least 40 contiguous nucleotides, at least 50 contiguous nucleotides of length, and at least a nucleic acid sequence.
  • Nucleic acid sequences used as probes include nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, more preferably at least 90% homologous, at least 95% homologous to the sequences described above. Is included. By using such a probe, a transposon that can be used in the present invention can be obtained.
  • the "primer” in the present specification refers to a substance necessary for the start of the reaction of the polymer compound synthesized in the polymer synthase reaction.
  • a nucleic acid molecule for example, DNA or RNA
  • complementary to a partial sequence of the polymer compound to be synthesized can be used.
  • nucleic acid molecules that are usually used as primers include those having a nucleic acid sequence of at least 8 consecutive nucleotides that is complementary to the nucleic acid sequence of the target gene. Such a nucleic acid sequence preferably has at least 9 sequences. More preferably, 10 consecutive nucleotide lengths, more preferably 11 consecutive nucleotide lengths, 12 consecutive nucleotide lengths, 13 consecutive nucleotide lengths, 14 consecutive nucleotide lengths.
  • Nucleic acid sequences used as probes include nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, more preferably 90% homologous, 95% homologous to the sequences described above. It is.
  • a sequence suitable as a primer may vary depending on the nature of the sequence intended for synthesis (amplification), but those skilled in the art can appropriately design a primer according to the intended sequence.
  • the design of such primers is well known in the art and can be done manually or using a computer program (eg, LASERGENE, PrimerSelect, DNAStar)!
  • the transposon used in the present invention can be prepared using such a primer.
  • a factor that specifically binds to a nucleic acid molecule or polypeptide refers to the binding level of the factor to the nucleic acid molecule or polypeptide, or a nucleic acid molecule or polypeptide other than the nucleic acid molecule or polypeptide.
  • such factors include, when the target is a nucleic acid molecule, a nucleic acid molecule having a sequence complementary to the target nucleic acid molecule, a polypeptide that binds to the target nucleic acid sequence (for example, a transcription factor)
  • a polypeptide that binds to the target nucleic acid sequence for example, a transcription factor
  • examples include, but are not limited to, an antibody, a single-chain antibody, a receptor / ligand pair, an enzyme / substrate, etc. .
  • an agent that specifically binds for example, an agent that specifically binds calcium, an antibody against a specific gene product, etc.
  • agent refers to any substance or other element (eg, energy such as light, radioactivity, heat, electricity, etc.) as long as the intended purpose can be achieved. It may be.
  • substances include, for example, proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA, genomic DNA, RNA such as mRNA), Polysaccharides, oligosaccharides, lipids, small organic molecules (e.g.
  • a specific factor for a polynucleotide is typically a polynucleotide having a certain sequence homology to the polynucleotide sequence (for example, 70% or more sequence identity) and complementarity. And a polypeptide such as a transcription factor that binds to the promoter region, but is not limited thereto.
  • Factors specific for a polypeptide typically include an antibody specifically directed against the polypeptide or a derivative or analog thereof (eg, a single chain antibody), a polypeptide thereof. Examples include, but are not limited to, a specific ligand or receptor when the peptide is a receptor or a ligand, and a substrate when the polypeptide is an enzyme.
  • contacting refers to bringing a compound in physical proximity to the polypeptide or polynucleotide of the present invention, either directly or indirectly. Means that.
  • the polypeptide or polynucleotide can be present in many buffers, salts, solutions, and the like. Contact includes placing the compound in, for example, a beaker, microtiter plate, cell culture flask or microarray (eg, gene chip) containing a polypeptide encoding a nucleic acid molecule or fragment thereof.
  • amino acids included in the sequence may be present in other protein structures, such as, for example, the cationic region or the binding site of a substrate molecule, with no apparent reduction or loss of interaction binding capacity.
  • amino acids It is the protein's ability to interact and the nature that defines the biological function of a protein.
  • specific amino acid substitutions can be made in the amino acid sequence or at the level of its DNA coding sequence, resulting in a protein that still retains its original properties after substitution. Accordingly, various modifications can be made herein without apparent loss of biological utility. Or the corresponding DNA encoding this peptide.
  • the hydrophobicity index of amino acids can be considered.
  • the importance of the hydrophobic amino acid index in conferring interactive biological functions in proteins is generally recognized in the art (Kyte. J and Doolittle, RFJ Mol. Biol. 157 (1): 105-132, 1982).
  • the hydrophobic nature of amino acids contributes to the secondary structure of the protein produced, and then defines the interaction of the protein with other molecules (eg, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.).
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on their hydrophobicity and charge properties.
  • One amino acid can be replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and still result in a protein having a similar biological function (eg, a protein equivalent in enzyme activity)
  • the hydrophobicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5. It is understood in the art that such substitution of amino acids based on hydrophobicity is efficient.
  • the hydrophilicity index can also be taken into account when modifying the amino acid sequence. As described in US Pat. No. 4,554,101, the following hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid ( + 3.0 ⁇ 1); glutamic acid (+ 3.0 ⁇ 1); serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); Threonine (one 0.4); proline (one 0.5 ⁇ 1); alanine (one 0.5); histidine (—0.5); cystine (one 1.0); methionine (one 1.3); Valine (one 1.5); leucine (one 1.8); isoleucine (one 1.8); tyrosine (one 2.3); ferulalanin (one 2.5); Tohuan (1 3.4).
  • an amino acid can be replaced with another that has a similar hydrophilicity index and still can provide a biological equivalent.
  • the hydrophilicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • the “kit” refers to a unit that is usually divided into two or more compartments to provide the parts to be provided (eg, reagents, particles, etc.).
  • a gene cassette or the like is supplied as a product in the form of a kit, or a cell or the like is provided as a library.
  • cells are provided as a kit, they can be provided in a state preserved by a preservation method such as freezing.
  • This kit form is preferred when it is intended to provide a composition that is preferably used in admixture just prior to use.
  • Such a kit is advantageously provided with instructions describing how to treat the provided parts (eg reagents, particles, etc.). Such instructions may be any medium.
  • Examples of such a medium include, but are not limited to, a paper medium, a transmission medium, and a recording medium.
  • Examples of the transmission medium include, but are not limited to, the Internet, an intranet, an extranet, and a LAN.
  • Recording media include, but are not limited to, CD-ROM, CD-R, flexible disc, DVD-ROM, MD, mini-disc, MO, and memory stick.
  • the method of creating a transgenic (target genetically modified) mouse having a loss of function or an altered mutation by replacing or destroying an endogenous target gene was targeted. Since the mutation is introduced only into the gene, it is useful for analyzing the gene function.
  • the obtained recombinant ES cells are mixed with normal embryos by the scutellum injection method or the assembly chimera method to produce chimeric mice of ES cells and host embryos .
  • blastocyst injection ES cells are injected into a blastocyst with a glass pipette.
  • assembly chimera method the ES cell mass and the 8-cell embryo from which the zona pellucida has been removed are adhered.
  • a blastocyst into which ES cells have been introduced is transplanted into the uterus of a surrogate mother who has been pseudopregnant to obtain a chimeric mouse.
  • ES cells are totipotent, they can be sorted into all types of cells, including germ cells, in vivo.
  • a mouse having the ES cell chromosome heterozygous is obtained, and when these mice are mated, a transgene having a homologous ES cell modified chromosome A mouse is obtained.
  • Transient expression of Cre enzyme, DNA mapping on the chromosome, etc. used in the method of removing genomes or loci used in the present specification are the cytology separate experiment protocol series “FISH experiment”. Protocol is well known in the art as described in “Human 'Genomic Analysis Capability Chromosome / Genetic Diagnosis” Kenichi Matsubara, Hiroshi Yoshikawa, Hidejunsha (Tokyo), etc.
  • Cre-loxP introduces a neomycin resistance gene into a position that does not inhibit the expression of the target gene, and introduces a targeting vector into which the loxP sequence is inserted so as to sandwich an exon to be deleted later. The homologous recombinant is then isolated. A chimeric mouse is produced by obtaining a chimeric mouse from the isolated cloner.
  • Cre site-specific recombination enzyme derived from the P1 phage of E. coli
  • Cre specifically recognizes the loxP sequence (approximately 34 bp) and causes recombination with the sequence between the two loxP sequences, which is destroyed.
  • Cre can be expressed in an adult using a mouse mated with a transgenic mouse having a Cre gene linked to an organ-specific promoter, or a viral vector having a Cre gene.
  • recombinase means both a recombinase and a specific sequence on DNA (for example, a sequence called loxP in the case of Cre recombinase).
  • An enzyme that promotes Examples of the recombinase include Cre recombinase.
  • examples of recombinases that can be used include ⁇ 31 (ACCESSION NC 001978; GI: 40807285). However, it is not limited to these.
  • recombinase recognition sequence refers to a sequence recognized by at least one recombinase, and such a sequence is usually specific for a recombinase.
  • a recognition sequence can be determined as follows: Southern hybridization analysis, DNA base sequence of PCR product, and the like. Examples of such recognition sequences include, but are not limited to, ⁇ sequences, FRT sites, attB sequences, attP sequences, and res site sequences. The specific sequence of such a recognition sequence is as follows:
  • Such a recombinase recognition sequence may include one or more substitutions, additions, and Z or deletions to these sequences as long as they are recognized by the recombinase, which may include all of the above sequences. It may contain a loss.
  • another recombinase recognition sequence can be prepared by screening with a recombinase and a library of arbitrary sequences under certain conditions.
  • the term "reverse direction" means that when a recombinase recognition sequence is used when a recombinase recognition sequence is arranged on one side of a double-stranded DNA, the recombinase recognition sequence is arranged on the other strand. It means that Preferably, substantially homologous sequences are arranged in 5 ′ to 3 ′ orientation on one strand and 5 ′ to 3 ′ orientation on the other strand. More preferably, the same sequence is 5 ′ to 3 ′ orientation on one strand and 5 ′ to 3 ′ on the other strand. It is arranged in the direction.
  • the recombinase recognition sequence exerts the activity of recombinase, and as a result, it has been considered that two or more recombinase recognition sequences are required in the same direction for recombination to occur. Alternatively, it has been found that by using only one recombinase recognition sequence, the desired chromosomal deletion can be caused. In particular, it was an unexpected discovery that cells still have regenerative capacity after chromosomal deletions.
  • the gene trap method has attracted attention as a method for analyzing specific genes.
  • a reporter gene that does not have a promoter is introduced into a cell, and when that gene is accidentally inserted into the genome, the reporter gene appears to be used to isolate a new gene ( Trapped).
  • the gene trap method is an efficient insertion mutation and unknown gene identification method based on the mouse early embryo manipulation method, embryonic stem cell culture method, and gene targeting method by homologous recombination (Stanford W L., et al., Nature Genetics 2: 756-768 (2001)).
  • gene transfer and insertion mutant selection and phenotype analysis are relatively easy.
  • a gene trap vector in which ⁇ -geo, a fusion gene of lacZ and neo, is linked between a splicing Z acceptor sequence and a poly A addition signal is introduced into ES cells.
  • G418 When selected with G418, only clones that accidentally trapped genes expressed in ES cells are selected.
  • a desired transgenic organism can be prescreened.
  • the gene trap method can be used (Zambrowicz et al .; Nature, 392: 608-611 (1998); Gossler et al .; Science, 2 44: 463-465 (1989). Skal lnes, WC. Et al .; Genes Dev. 6: 903-918 (1 992); Friedrich, G. et al .; Genes Dev. 5: 1513-1523 (1991)). in this way Transgenenic Transgenics in which both genes of a pair of chromosomes have been mutated by pre-selecting organisms and then mating for two generations or other appropriate means Living creatures can be obtained.
  • the novel organism of the present invention provides a convenient model system for elucidating gene functions at the chromosomal level.
  • This embodiment of the present invention can provide a disease model system for the study of inherited diseases in a living animal model.
  • disease genes that can be targeted in animal models include human disease-causing genes or their homologous genes in organisms, such as cDNA full-length cDNA fragments, cDNA gene fragments, genomic DNA full-length genes, or genomic DNA genes. One that is a fragment.
  • the disease-causing gene is introduced into a living organism and the resulting transgenic organism can be used for research as a human disease model animal, it is a human disease-causing gene. Preferred.
  • marker gene refers to any gene that encodes a gene product that can be confirmed by an explicit method such as visual recognition of whether or not a transformation force has been performed.
  • marker genes include, but are not limited to, green fluorescent protein (GFP), yellow fluorescent protein (YFP), cyan fluorescent protein (CFP), and red fluorescent protein (dsRED).
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • CFP cyan fluorescent protein
  • dsRED red fluorescent protein
  • sequence of the green fluorescent protein include the sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • selection sequence refers to a sequence that enables selection between a non-introduced cell and an introduced cell when a nucleic acid containing the sequence is introduced into a cell. Examples include genes for imparting resistance to biomaterials. Examples of such selection sequences include, for example, thymidine kinase (TK) gene, puromycin resistance-conferring gene, neomycin resistance-conferring gene, hygromycin resistance-conferring gene, blastcidin resistance-conferring gene, and zeocin resistance.
  • TK thymidine kinase
  • IRES sequence or "internal ribosomal entry site sequence” is used interchangeably and is also referred to as polycistron and is dependent on CAP structure cost. A sequence that intervenes in the translation mechanism. Various such IRES sequences are known and have been databased. For example,
  • CAG sequence refers to a sequence in which CAG is repeated, and repeats are usually found in 10 to 30.
  • the coding sequence has glutamine repeats.
  • CAG repeats There is a protein that recognizes mRNA with CAG repeats, and the more CAG repeats in this protein, the more strongly it binds to mRNA and regulates the expression of other proteins.
  • the transgenic organism of the present invention can be used as a donor for organ donation.
  • organs that can be considered as donors for transplantation of xenogeneic organs into humans include nerve cells, heart, lung, liver, spleen, kidney, cornea, and skin.
  • the gene to be introduced is preferably a gene having a function of reducing rejection in organ transplantation between different species or a gene having a function of expecting an increase in engraftment rate.
  • knockout when referring to a gene, means that the gene is destroyed (deficient) or dysfunctional. Therefore, the concept of knockout is Included in Lancegienic.
  • knockout organism refers to an organism (for example, a mouse) in which a gene has been knocked out. Therefore, the concept of knockout organisms is included in transgenic organisms.
  • the “animal” may be any animal as long as it can be used for introduction of a nucleic acid sequence (preferably a foreign sequence encoding a gene).
  • animals include vertebrates and invertebrates.
  • Animals include mammals (eg, mice, dogs, cats, rats, monkeys, pigs, sushi, hidge, usagis, dolphins, whales, captives, horses, etc.), birds (eg, ⁇ -birds, quails) Etc.), amphibians (eg, power el), reptiles, insects (eg, fruit fly) and the like.
  • the animal can be a mammal, more preferably an animal (eg, a mouse) that is easy to create a knockout.
  • the animal may be an animal (eg, monkey) that has been found to be suitable as a human model animal.
  • the animal can be, but is not limited to, a non-human animal or a non-human mammal. Examples thereof include pigs, monkeys, horses, hidges, cats, dogs, rabbits, mice, rats, or hamsters, and more preferably mice or rats.
  • the organism of the present invention includes not only a mammal individual but also a part of the individual and an organ or organ of the individual. These are useful as human disease models and as organ transplant donors.
  • gene transfer techniques include microinjection, a combination of a nucleic acid fragment and a cationic lipid endoplasmic reticulum or a DNA condensing reagent; and a nucleic acid fragment introduced into a viral vector, and the viral vector is introduced into a cell. And methods selected from the group consisting of particle bombardment and electoral position force.
  • Viral vectors that can be used herein include lentiviral vectors, letto Examples include, but are not limited to, those selected from the group consisting of rovirus vector, adenovirus vector, herpes virus or adeno-associated virus vector.
  • retrovirus refers to a virus having genetic information in the form of RNA and synthesizing DNA from the RNA information by reverse transcriptase. Therefore, “retroviral vector” refers to a form in which a retrovirus is used as a gene carrier or hand (vector). Examples of “retroviral vectors” used in the present invention include, but are not limited to, retroviral expression vectors based on Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) and Murine Stem Cell Virus (MSCV).
  • MMLV Moloney Murine Leukemia Virus
  • MSCV Murine Stem Cell Virus
  • retroviral vectors include, but are not limited to, pGen-, pMSCV, and the like.
  • gene trap means that a reporter gene lacking a promoter is introduced into a target cell, for example, downstream of a promoter activated on a chromosome. This refers to a gene identification method that utilizes reporter activity only when it is inserted into. Such a gene trap is achieved by introducing a “gene trap vector 1” into a eukaryotic host chromosome to destroy the host gene. Since the gene into which the reporter gene is inserted expresses a complex protein with the reporter, it is possible to identify the gene by monitoring the protein. Therefore, since the reporter gene is incorporated into the original locus as in the case of homologous recombination, a reporter system with complete transcriptional regulation can be created. By using this method, it is possible to identify genes that could not be obtained by the method of isolating mutants by gene disruption. Therefore, such a gene trap method can also be used in the present invention.
  • Gene trap vector refers to a vector inserted into a gene by utilizing the phenomenon of splicing in the process of eukaryotic gene mRNA becoming mature mRNA. It is a vector to do.
  • Gene trap vectors include (1) a vector containing a reporter gene coding region without a promoter and a DNA sequence containing a splice receptor site, or (2) a promoter. Examples include, but are not limited to, a vector containing a DNA sequence containing a reporter gene coding region and a splice donor site, and ( 3 ) a vector containing both of these (1) and (2) DNA sequences! .
  • the gene trap vector containing the splice acceptor sequence as described above may contain a poly A addition signal, if necessary.
  • the gene trap vector containing the splice donor sequence may optionally contain an enzyme region and a Z or mRNA unstable region.
  • the poly A addition signal is not limited to “AATAAA”.
  • Examples of the promoter used in the present invention include MC1 promoter and RNA pol I I promoter, but are not limited thereto.
  • Examples of the enhancer used in the present invention include, but are not limited to, Polio-mavirus virus enhancer (PYF441).
  • the splice donor sequence used in the present invention includes, but is not limited to, the mouse hprt gene exon 8 splice donor.
  • splice acceptor sequences used in the present invention include, but are not limited to, human bcl-2 gene exon 3 splice acceptor.
  • reporter molecule or “reporter” gene as used herein refers to a molecule (eg, a polypeptide) or gene that can be used as an indicator of gene expression in a cell.
  • a known reporter protein can be used, for example, chloramphee-cholacetyltransferase (CAT), ⁇ -glucurodase (GUS), ⁇ D-galactosidase, luciferase, green fluorescent protein (GFP) Or equorin.
  • CAT chloramphee-cholacetyltransferase
  • GUS ⁇ -glucurodase
  • GFP green fluorescent protein
  • the gene introduction method itself can be performed using a desired material using a technique known in the art!
  • the target embryonic stem cell may have, for example, a reporter gene lacking a promoter (eg, luciferase gene, green fluorescent gene, ⁇ -galactosidase gene (lacZ), alkaline phosphatase gene, Cre recombinase gene, etc.)
  • the reporter activity is detected only when it is inserted downstream of the promoter activated on the chromosome.
  • the vector used is this reporter
  • it may contain a selection marker gene (eg, neomycin resistance gene, hygromycin resistance gene, puromycin resistance gene, rescue marker gene (eg, ampicillin resistance gene + colicin E1 replication origin).
  • the selectable marker gene is used to select the host containing the vector
  • the rescue marker gene is used to rescue the vector (Joyner, AL ed. Gene Targeting, 2 n edition (Oxford See University Press, 2000)) Using the techniques described above, embryonic stem cells are generated, which are gene trapped, where they are trapped. Means that the endogenous gene is destroyed by the insertion of the trap vector into the genome and at the same time the vector The state where the gene destroyed by the mark is marked.
  • oligonucleotides with a specific sequence in the art can be carried out using well known techniques, for example, Joyner, AL ed. "Gene Targeting, 2 nd editio n" (Oxford University Press, 2000 ). Oligonucleotides can be labeled with fluorescence, radioactivity, etc., as necessary. Such labeling methods are well known in the art and are described in the references cited herein.
  • screening refers to selecting a target such as a target organism or substance having a specific property from a large number of populations using a specific operation Z evaluation method.
  • the method or organism of the present invention can be used for screening.
  • any nucleic acid molecule and its function regulator can be screened.
  • any nucleic acid molecule can be screened by using the nucleic acid molecule, method or system of the present invention.
  • the present invention is also intended to encompass chemical substances identified by such screening or combinations thereof.
  • the system of the present invention can be applied to various fields. For example, the identification, isolation and characterization of genes involved in the growth, maintenance, regulation and development of living organisms can be determined (for example, Kaiser et al., 1995 “Eukervotic transposable, elements as tools to stu dy gene structure and function Mobile Genetic Elements, IRL Press, pp. 69-100); can identify, isolate and identify transcriptional regulatory sequences that regulate the growth, maintenance, regulation and development of organisms ( For example, Anderson et al., 1996, Mol. Mar. Biol. Biotech., 5, 105-113).
  • the present invention provides a gene force set comprising a gene cassette comprising one or two recombinase recognition sequences in the reverse direction and comprising a sequence encoding a marker gene. It was revealed that this gene cassette can be used in a recombination system using recombinase. In particular, it was not expected that recombinase could be used to produce cells from which the desired chromosome was removed from reproducible cells (ie, capable of producing the next generation) (especially stem cells). Therefore, the present invention provides an unexpectedly excellent effect.
  • recombinase recognition sequences are not arranged in the same direction. Furthermore, it has been found that recombinase can be used to produce cells from which a desired chromosome has been removed from reproducible (ie, capable of producing the next generation) cells (particularly stem cells). In the conventional method, cells that are not reproducible are produced, or the efficiency of the desired chromosome removal is not good, and therefore, it can be said that the present invention has a remarkable effect.
  • the conventional method of chromosome removal is to introduce a Hprt gene into the chromosome of Hprt (-) cells and select the drug with 6TG (6 thioguanine), thereby screening for cells in which the Hprt introduced chromosome has been deleted due to sudden mutation. It was done.
  • chromosome removal is not a force observed was 10_ 6 or less probability.
  • chromosome removal can be performed at a rate 100 times higher than mutation by introducing a chromosome removal cassette.
  • the method of the present invention is excellent in that it is possible to easily remove a plurality of chromosomes. ing.
  • the recombinase recognition sequence used in the present invention may be any sequence as long as it can recognize the recombinase used, and those skilled in the art of recombinase technology will recognize such a recombinase recognition sequence. Can be designed easily. In the present specification, whether such a recombinase recognition sequence is a recombinase recognition sequence is determined by recombinase enzyme treatment, resulting in DNA recombination between two recombinase sequences, resulting in integration of the recombinase sequences into one. Therefore, it can be easily identified by deletion or binding of DNA between recombinase sequences.
  • sequences include, but are not limited to, ⁇ sequences, FRT sites, attB sequences, attP sequences and res site sequences.
  • a recombinase recognition sequence includes the sequence shown in SEQ ID NO: 1 ( ⁇ sequence).
  • the marker gene used in the present invention can be any gene as long as it is capable of identifying the cell when the gene is introduced into the cell.
  • Examples of such marker genes include GFP gene (including E GFP gene), CFP gene, YFP gene, dsRED gene and the like.
  • the gene cassette of the present invention may further have a selection sequence.
  • the selection sequence used in the present invention for example, any sequence can be used as long as the introduced cell can be selected under specific conditions after gene introduction.
  • antibiotic resistance-conferring genes for example, thymidine kinase (TK) gene, puromycin resistance-conferring gene, neomycin resistance-conferring gene, neomycin resistance-conferring gene, hygromycin resistance-conferring gene, blasting
  • antibiotic resistance-conferring genes for example, thymidine kinase (TK) gene, puromycin resistance-conferring gene, neomycin resistance-conferring gene, neomycin resistance-conferring gene, hygromycin resistance-conferring gene, blasting
  • examples include, but are not limited to, a gene for conferring saidin resistance, a gene for conferring zeocin resistance, a gene for conferring diphtheria toxin resistance, a gene for conferring
  • the gene cassette of the present invention may comprise an IRES sequence (SEQ ID NO: 2).
  • the IRES sequence used in the present invention may be any sequence as long as it has an IRES activity.
  • Such an IRES sequence is set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the gene cassette of the present invention may further comprise a CAG sequence (SEQ ID NO: 3).
  • the CAG sequence used in the present invention may be any sequence as long as the CAG sequence has a normal activity.
  • Such CAG sequences include the sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or a functional equivalent thereof (eg, including 1 or several substitutions, additions or deletions).
  • two recombinase recognition sequences are contained in the reverse direction, and between the recombinase recognition sequences, a CAG, a marker sequence, and an IRES sequence. And a selection sequence.
  • a selection sequence In another preferred embodiment, it comprises Pgk, a selection sequence, (IRES sequence), a marker sequence.
  • the former is a sequence used for random introduction, and the latter is used for introduction into a target chromosome by homologous recombination. The latter can be used in selecting CEC homo ES cells with high concentrations of G418.
  • the present invention provides a gene cassette comprising a gene cassette comprising one or two recombinase recognition sequences in the reverse direction, wherein the gene cassette comprises a sequence encoding a marker gene.
  • a composition for removing water is provided. It will be understood that the gene cassette contained therein can adopt any form described in the above (Gene cassette).
  • the target cell from which a desired chromosome is removed includes any cell.
  • examples of such cells include stem cells such as ES cells, EG cells, yarn and woven stem cells, somatic cells, or fused cells of somatic cells and stem cells (see International Publication WO03Z027278), and reprogramming.
  • stem cells see International Publication WO03Z027277, International Publication WO03Z027278, etc.
  • Stem cells see International Publication WO03Z027277, International Publication WO03Z027278, etc.
  • any chromosome can be mentioned, and any autosome other than X chromosome and Y chromosome can be a target.
  • examples of such chromosomes include, for example, in humans having 46 chromosomes, chromosomes 1 to 22, especially chromosome 5, chromosome 9, chromosome 11, chromosome 13, chromosome 18, List chromosome 21 etc. Can.
  • chromosome 1 and chromosome 19 especially chromosomes 2, 7, and 11 can be mentioned.
  • a chromosome has two chromatid forces. The place where the chromatids are joined is called the centromere. At the time of nuclear fission, microtubules bind here and pull to both poles. The long side is the long arm and the short side is the short arm. The end of the chromosome has a unique structure called a telomere. In the first stage of mitosis, the chromatin chain gradually congeals! During this process, the chromosome changes from a form that functions as genetic material to a compact form that can be moved. Eventually, the two corresponding chromatids (condensed chromatin chains) become centromeric linked chromosomes.
  • chromosomes Long microtubules (spindle yarn) that extend as much as possible of cells bind to centromeres. During mitosis, the spindle thread separates each chromatid towards the cell's poles, and ultimately each daughter cell inherits a set of chromatids.
  • a polyploid has more than 3 sets of chromosomes, and a haploid has only one set.
  • the diploid egg cells still undergo meiosis and the fertilized egg matures.
  • the corresponding chromosomes of the mother and father cross each other and exchange their parts. Fusion cells of stem cells and somatic cells produced by fusion are tetraploid.
  • the sister chromatid after DNA replication undergoes homologous recombination between the CECs due to the action of the recombinase, which disrupts the centromere and telomeres and removes the chromosome.
  • a haploid is also called a single phase and a diploid is also called a double phase.
  • a schematic diagram for performing chromosome removal of the present invention is also illustrated in FIG.
  • the chromosome to be removed in the cell targeted by the composition of the present invention may contain a pluripotency-related gene.
  • the pluripotency-related gene include Nanog, Oct3Z4, and other specific antigens.
  • the chromosome to be removed in another embodiment, in the cell targeted by the composition of the present invention, can be both copies.
  • the present invention relates to A) a gene cassette comprising one recombinase recognition sequence or two in the reverse direction, the gene cassette comprising a sequence encoding a marker gene, and B) corresponding to the recombinase recognition sequence.
  • a nucleic acid molecule comprising a recombinase or a nucleic acid sequence encoding the recombinase, and a kit for removing a desired chromosome.
  • Gene cassette any form described in the above (Gene cassette) can be used as the gene cassette.
  • the recombinase or nucleic acid molecule used here may be any suitable recombinase or nucleic acid sequence encoding the same. Such an appropriate recombinase can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the recombinase recognition sequence contained. In this case, the following correspondence is illustrated. Is:
  • the present invention provides: A) a gene cassette comprising one or two recombinase recognition sequences in the reverse direction, the gene cassette comprising a sequence encoding a marker gene; and B) the recombinase A kit for removing a desired chromosome from a stem cell, comprising: a nucleic acid molecule comprising a recombinase corresponding to a recognition sequence or a nucleic acid sequence encoding it; and C) a stem cell.
  • the stem cell any stem cell intended to remove a desired chromosome can be provided.
  • the present invention has a remarkable effect in that it provides a technique capable of removing a chromosome from a cell having multipotency such as a stem cell, possibly retaining its ability to function.
  • the stem cells used may be provided in a raw state or in a stored state. For such storage, stem cells such as ES cells are frequently cryopreserved.
  • Conventional slow cooling methods eg, Freshney RI, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Wiley-Liss, Inc., pp. 255—265, 1994
  • This method is slower in efficiency and has a higher pulling force and simpler than the cooling method).
  • the present invention provides: A) a gene cassette comprising one or two recombinase recognition sequences in the reverse direction, the gene cassette comprising a sequence encoding a marker gene; and B) the recombinase A nucleic acid molecule comprising a recombinase corresponding to a recognition sequence or a nucleic acid sequence encoding it, C) a stem cell, and D) a cell having a desired genome, and a desired chromosome from a cell having the desired genome.
  • a kit for removing and conferring pluripotency to the cells is provided.
  • stem cells and cells with the desired genome Then, a desired tailor-made stem cell can be prepared.
  • a method for producing fused cells is described in WO03Z027278, the description of which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • a method for fusing a stem cell (eg, ES cell) and a somatic cell is not particularly limited as long as the stem cell and the somatic cell are fused by contact to form a fused cell.
  • ES cells and somatic cells are mixed and washed at a fixed ratio, for example, a ratio of 1: 5 when making a fusion cell of ES cells and thymocytes. It can be prepared by suspending cells in an appropriate buffer such as Mann-Tol buffer and electrofusion.
  • fusion or “cell fusion” of cells is used interchangeably and refers to a phenomenon in which multiple cells are fused to cause multinucleation of cells. Forces that occur in nature, such as during fertilization of germ cells. It is also used as a means of cell engineering.
  • To fuse two different cells are fused together chemically or physically and cultured using a selective medium that allows only the fused cells to grow.
  • viruses that have been inactivated by ultraviolet light for example, HVJ (Sendai virus), parainfluenza viruses such as parainfluenza virus, Newcastle disease virus, etc.
  • HVJ Sendai virus
  • parainfluenza viruses such as parainfluenza virus, Newcastle disease virus, etc.
  • lysolecithin polyethylene glycol (PEG) 600, glycerol oleate and the like are used.
  • cell fusion electrofusion
  • Cell fusion with chemicals is preferred because it is independent of specificity for the virus.
  • the present invention is directed to cell force having a desired genome.
  • a method for conferring, possibly conferring on the cells A) a gene cassette comprising one recombinase recognition sequence or two in the reverse direction, comprising a sequence encoding a marker gene Providing a gene cassette; B) introducing the gene cassette into a stem cell; C) fusing the stem cell with a cell having a desired genome; and D) adding the fused cell to the fused cell.
  • nucleic acid molecule comprising a recombinase that recognizes a recombinase recognition sequence or a nucleic acid sequence encoding the recombinase
  • the present invention provides a method for removing a desired chromosome also from a cell having a desired genome, chromosome or chromosome group, comprising: A) recombinase recognition sequence in one or reverse direction A gene cassette comprising two gene cassettes, comprising a sequence encoding a marker gene, B) introducing the gene cassette into a cell, C) the cell and a desired genome, Fusing a cell having a chromosome or a group of chromosomes, D) providing the fused cell with a nucleic acid molecule comprising a recombinase that recognizes the recombinase recognition sequence or a nucleic acid sequence encoding the recombinase, and E ) Exposing the fused cells to conditions under which reconstitution occurs; and F) observing a signal derived from the marker gene of the fused cells to remove the cells from which the desired chromosome has been removed.
  • the present invention provides a method for producing a chromosome exchange cell comprising:
  • D) of the first cell corresponding to the desired chromosome of the second cell Providing a nucleic acid molecule comprising a recombinase that recognizes the recombinase recognition sequence or a nucleic acid sequence encoding the recombinase so as to allow removal of the chromosome of the first cell so as to allow removal of the chromosome; Exposing the fused cells to the resulting conditions; and F) signals derived from the marker genes of the fused cells. Observing and selecting cells from which the desired chromosome has been removed.
  • recombinase recognition sequence, gene cassette, marker gene and the like to be used can be in any form described in (gene cassette) in the present specification.
  • any cells can be used as the stem cells and cells having a desired genome used in the method of the present invention as long as they can be fused.
  • any condition described in the present specification can be used as the condition "to enable removal of a chromosome".
  • conditions under which reconstruction occurs may be used.
  • condition under which rearrangement occurs refers to any conditions under which recombination occurs, and such conditions can be easily selected by those skilled in the art.
  • the conditions under which such reorganization occurs include, for example, 1.
  • the cell is dividing; 2.
  • the cell is maintained in an undifferentiated state.
  • the signal derived from the marker gene can be observed by means appropriately selected by those skilled in the art according to the signal emitted by the marker gene.
  • a green fluorescent protein can be implemented by using a means for observing fluorescence, such as a fluorescence microscope.
  • the present invention relates to a cell force having a desired genome, a method for removing a desired chromosome, comprising A) a gene cassette comprising one recombinase recognition sequence or two in the reverse direction. Providing a gene cassette comprising a sequence encoding a marker gene; B) introducing the gene cassette into a cell; and C) recombinase recognizing the recombinase recognition sequence in the cell.
  • nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding the same; D) exposing the cell to conditions that cause reconstitution; E) observing a signal derived from the marker gene of the cell and observing the desired chromosome Removed Selecting the treated cells.
  • the present invention also provides a cell from which a desired chromosome has been removed (eg, a stem cell such as an ES cell).
  • a desired chromosome eg, a stem cell such as an ES cell.
  • Such cells can be prepared, for example, by the method of the present invention.
  • the cell has a chromosome containing MHC removed.
  • Such chromosome-removed cells have not been successfully obtained in the past;
  • the present invention provides a cell obtained by the method of the present invention.
  • the present invention provides a fusion cell of an ES cell and a cell having a desired genome, wherein the desired chromosome is removed from the fusion cell and has pluripotency.
  • the present invention provides a fusion cell of an ES cell and a cell having a desired genome, from which the major histocompatibility (antigen gene) complex of the ES cell is obtained.
  • a chromosome containing a sequence encoding (MHC) has been removed, and a fused cell having pluripotency is provided.
  • MHC a sequence encoding
  • Examples of such MHC or a gene corresponding thereto include mouse H2 antigen (chromosome 17) and human HLA antigen (chromosome 6).
  • the cell is a fusion cell of an ES cell and a cell having a desired genome
  • the desired chromosome is a mouse chromosome 6, chromosome 11, or 12 stain of the ES cell.
  • a pluripotent fusion cell is provided in which one or more of these chromosomes has been removed.
  • chromosomes synthetic
  • html etc. can be used for determination using known techniques.
  • “synthus” refers to a region in which genes are arranged in the same order between chromosomes of different species. Before genome sequencing, synthesizing was confirmed by genetic maps, chromosome mapping, etc. Now we can compare human and puffer chromosomes.
  • a fusion cell of an ES cell and a cell having a desired genome wherein the desired chromosome is a chromosome containing the ES cell Nanog gene, and Pluripotent cells are provided in which one or both copies of the chromosome have been removed.
  • a pluripotent cell that is a fusion cell of an ES cell and a cell having a desired genome, wherein one or more chromosomes (eg, all) of the ES cell have been removed
  • a fused cell is provided. It is preferred that all be removed. Such cells are more preferred because substantially all of the chromosomes or groups of chromosomes associated with the ES cell-derived disease are removed. This is because immune rejection can be prevented.
  • one chromosome removal technique provided in the present invention may be repeated several times. Such techniques can be implemented based on specific chromosome sequence information by applying techniques well known in the art. By repeating the number of chromosomes, all desired chromosomes can be removed. For example, all ES cell-derived chromosomes can be removed from a fusion cell of an ES cell and a desired cell.
  • the cell having the network genome in a fusion cell of an ES cell and a cell having the desired genome, can be a cell from an individual affected with the disease. Such cells can be used to investigate the cause of the disease.
  • a fusion cell of an ES cell and a cell having a desired genome is a cell derived from an individual affected with a disease, and a pluripotent fusion cell from which all chromosomes of ES cells have been removed is provided. Such cells are more preferred for investigating the cause of the disease.
  • the present invention provides a chromosome-replacement cell in which a desired chromosome or group of chromosomes has been exchanged.
  • a cytoplasm having a chromosome (2 copies or 1 copy) of a somatic cell is fused with an ES cell, and the same ES cell-derived chromosome as the inserted chromosome can be removed with a cassette.
  • the cell may preferably be, but is not limited to, a chromosome-exchanged stem cell with the desired chromosome or group of chromosomes exchanged.
  • stem cells may be ES cells.
  • the present invention provides a fusion cell of an ES cell and a micronucleus having a desired genome, chromosome or chromosome group, and the ES cell-derived hope from the fusion cell.
  • a chromosome-exchange cell having a pluripotency is provided.
  • the present invention also provides any cell produced by the techniques of the present invention.
  • the present invention provides a gene cassette comprising one or two recombinase recognition sequences in the reverse direction, for removing a desired chromosome of a gene cassette comprising a sequence encoding a marker gene. Provide the use of.
  • the present invention relates to a gene cassette comprising one or two recombinase recognition sequences in the reverse direction, wherein a desired chromosome of a gene cassette comprising a sequence encoding a marker gene is obtained.
  • a desired chromosome of a gene cassette comprising a sequence encoding a marker gene is obtained.
  • Use for the manufacture of a composition for removal is provided.
  • the present invention provides a cell library comprising a plurality of types of cells from which a desired chromosome has been removed.
  • a gene cassette for removing a target chromosome is prepared by using the gene cassette of the present invention described in (Gene cassette) above, and cells from which various chromosomes have been removed are prepared.
  • a method for designing a gene cassette to remove a desired chromosome is as follows:
  • the DNA sequence to be used has a length of 5 kb or more and that both sides of the inserted gene cassette have an equal length (2.5 kb on one side).
  • the present invention preferably eliminates chromosome-by-chromosome deletions that have been impossible or inefficient. It achieves an unexpected effect compared to the conventional method in that it can be performed easily while maintaining the vitality or possibly the ability.
  • the CEC designed as the first step of the experiment was confirmed to be able to remove a specific chromosome, and after confirming the function of the CEC, we attempted to introduce CEC into a specific chromosome by homologous recombination as the second step.
  • CEC consisted of LoxP ⁇ CAG—GFP—IRES—Puro LoxP (SEQ ID NO: 11). Recombination occurred between homologous chromatids by the LoxP sequence introduced in the reverse direction. Two centromeric and acentromeric chromosomes were formed at a certain frequency by the combination of homologous recombination. These more chromosomes were removed from the cell through cell division. As a result, CEC Cells lacking only the introduced chromosome were produced.
  • FIG. 1 The results are shown in FIG. 1 (particularly FIG. 1E and FIG. 1F) and FIG.
  • the distribution of deleted chromosomes is shown by karyotype analysis of one embodiment of cells in mice.
  • the No. 11 dye is brilliantly removed.
  • CEC is a male ES cell line deficient in the Hprt gene, HM-1 (Selfridge, J., Pow, A.M., McWhir, J., Magin, TM and Melton, DW (1992) Gene targeting using a mouse HPRT minigene / HPRT-deficient embryonic stern cell system: inactivation of the mouse ERCC-1 gene. Somat Cell Mol Genet 18, 325-36. In this example, Dr. Mart in J. Evans, in School of Biosciences, Cambridge University, Cambridge, Wales, UK. Obtained with permission to use (Distributed and licensed). By using HM-1 for experiments, it became possible to select fused cells of Hprt (+) with all normal somatic cells using HAT medium.
  • HM-1 Gene introduction into HM-1 was carried out by the electrovolution method, which prompted the introduction of a single copy of CEC.
  • 50-100 ⁇ g of pCEC DNA was introduced into 1 ⁇ 10 cells under conditions of 250VZ500 ⁇ F. After selecting the drug with puromycin, GFP positive cells were selectively cloned under a microscope. The obtained clones were also extracted for DNA, and the transgene was reconfirmed by PCR, and the introduced CEC copy number was confirmed by the Southern High Predisposition method. A single copy was introduced and a GFP high expression clone was used for the cell fusion experiment. The results are shown in Fig. 4.
  • Figure 4 shows the introduction of the chromosome removal cassette into ES cells and the FISH analysis of the introduced cassette. As illustrated in the schematic diagram illustrating the mechanism of chromosome removal according to the present invention shown in FIG. 3, various mechanisms may occur and the possibility of occurrence is considered.
  • CEC ES cells and 129Rosa26-derived thymocytes were electrically fused.
  • ECM2001 (BTX) apparatus existing
  • the cell mixture of ES cells and thymocytes (1: 5) was treated under the conditions of 10 V (AC) ⁇ 905-250 ⁇ ( ⁇ ⁇ 0 / ⁇ s), and cell fusion was performed.
  • AC 10 V
  • ES-thymocyte fusion cells were able to survive by culturing in AT selective medium.
  • the expression of GFP in the fused cells and the normal karyotype were confirmed. The results are shown in Fig. 5.
  • a schematic diagram is illustrated in FIG.
  • PCMV—Cre was introduced into the fused cells by lipofection, and the Cre enzyme was transiently expressed, and cultured for 48-96 hours to induce recombination on the CEC-introduced chromosome.
  • CEC-HM-1 ES cells before cell fusion were subjected to chromosome FIS H (fluorescence in situ hybiridization) analysis using pCEC as a probe to identify the chromosome into which CEC was introduced. If the CEC chromosome is the same as the chromosome identified in 5., it means that the chromosome was selectively removed by CEC.
  • FISH analysis with chromosome-specific repeat sequences was used in parallel to confirm the identified chromosome. The results are shown in Figure 46.
  • the pLoxP ⁇ Pgk-Neo-IRES-GFP LoxP CEC cassette was mounted on an arbitrary chromosome. ES cells with CEC homozygous were obtained by treatment with neomycin at a high concentration (8 mgZml).
  • Fusion of an ES library with CEC homologous to a specific chromosome and a somatic cell, and removal of the ES cell-derived chromosome by treatment of the fused cell with Cre enzyme frees the fused cell in which a specific chromosome set is derived only from the somatic cell.
  • the mouse genomic library or genomic force also clones the genomic DNA of the H2b gene on chromosome 17 directly by PCR. Genomic fragments (right arm (RA) and left arm (LA)) required for homologous recombination are joined to CEC. -IRES-hygro ⁇ LoxP-built LA. A schematic diagram is shown in the upper left of Figure 3.
  • pRA-LoxP ⁇ CAG-GFP-IRES-Puro LoxP-LA is placed on chromosome 17 by homologous recombination.
  • pRA— LoxP ⁇ CAG -Use dsRed-IRES-hygro LoxP-LA place it on the second locus.
  • ES cells into which CEC was introduced at both loci of the H2-b gene were obtained.
  • ES cells with CEC in each chromosome were identified and a library was created.
  • Example 4 Removal of chromosomes carrying HLA-related genes using homologous recombination
  • the chromosomes containing HLA-related genes are removed. Since the HLA-related gene is contained in human chromosome 6, the experiment is performed according to the above example except that the procedure specific to human chromosome 6 is used in the above procedure. It can be seen that human chromosome 6 is also efficiently removed.
  • Chromosome removal is performed using FRT sequences instead of LoxP sequences.
  • the FRT site is Flp integrase as G integrase, and a removal experiment is performed based on the above example.
  • a chromosome removal experiment targeting mouse chromosome 17 shows that the target chromosome is also removed efficiently.
  • EG Embryonic Germ
  • ⁇ 2 cassette vector (pBS246 (Gibco—BRL) was PCR amplified and subcloned into pGEM—T Easy (Promega). The ⁇ site was re-cloned in the opposite direction (pGEM—CEC). CAG-gfp / lRES (internal ribosome entry site). The puro- pA fragment was incorporated into this pGEM- CEC, and pC EC-C AG-gf p / lRES. 9a). In order to remove chromosome 6, pGEM—CEC was subcloned into pBS—SK (+) (Stratagene) (pBS—C EC).
  • the Pgk-neo / lRES.gfp-pA fragment was incorporated into pBS-CEC to prepare pCEC-Pgk-neo / lRES.gfp pA.
  • CEC—Pgk—neo / lRES.gfp—pA is incorporated into pROSA26—pA 7 pROSA26—and EC) (srmivas, S. reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus, BMC Dev Biol 1, 4 (2001)) ( Figure l la).
  • pCEC—CAG—gfpZlRES .puro-pA DN A linearized with Seal was applied to HMl ES cells using Gene Pulser II (BioRad). did.
  • the Cre expression vector, pBS185 (pCMV—Cre) (Gibco-BRL) was transiently expressed into hybrid cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
  • pROSA-CEC plasmid DNA linearized with Pvul was eletroporated into HMl ES cells.
  • HMl ES cells (129Zo la: Mus musculus domesticus) defective for the Hprt gene were cultured on primary embryonic fibroblast feeder cells in ES medium (Ta da,. Et al., Pluripotency oi re programmed somatic genomes embry onic stem hybrid cells. Dev Dyn 227, 504—10 (2003)).
  • CEC Transgenic HMl ES cells were transformed into female 129ROSA26 (M m. Domesticus) or 3 ⁇ 4JF1 ( M m. Molossinus) was electrically fused with thymocytes collected from mice (Tada, M. et al., Pluripotency of reprogrammed somatic genomes m embryonic stem hybrid cells. Dev Dyn 227, 504-10 (2003)). Hybrid cell clones were selected on HAT medium.
  • Transgenic ES cells into which the Pgk-neo cassette has been introduced are selected with 250 / z gZml G418.
  • G418 meta ES cells ( 6 x 5xl0) are seeded on a 3 cm diameter culture dish (6-well plate) and cultured in the presence of 5-10 mg / ml high concentration G418 for 3 days. During this time, the selective medium is changed every day.
  • the hybrid cells were suspended in PBS containing 2% sushi fetal serum and 2 gZml of iodide iodide (Sigma). About 10,000-500,000 Itoda vesicles were quantitatively analyzed. 100-1,000 GFP negative hybrid cells were collected by FACS Vantage (Becton Dickinson).
  • Chromosome analysis was performed according to the standard G-banding procedure (Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Baton, SC and Sura ni, MA Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. EMBO J. 16, 6510—20 (1997)).
  • chromosomal preparations were prepared using CEC vector-specific probes or centromere major satellite specific probes (Lehnertz, B. et al., Suv39h—mediated histone H3 lysine 9 methylation. dire cts DNA methylation to major satellite repeats at pericentric hete rochromatin.
  • Genomic PCR products were amplified for 35 cycles at an annealing temperature of 60 ° C.
  • D6Mitl 83, D6Mitl02 and D6Mitl4 were used as mouse chromosome 6 specific markers to detect DNA sequence polymorphisms between 129 ⁇ JF1: D6Mitl83 (129; 94bp, and JF1; 190bp), Primer 1; 5,-TTCTC AATG AAC ACTAG AAC A TTCG-3 '(SEQ ID NO: 12), and Primer 2; 5,-AAAAC AC AGGTAG AA A AC ATAC ATAC A-3' (SEQ ID NO: 13); D6Mitl02 (129 177bp, and JFI; 125bp), primer 1; 5,-CCATGTGGATATCTTCCCTTG-3 '(SEQ ID NO: 14) and primer 2; 5, — GTATACCCAGTTGTAAATCTTGTGTG-3, (SEQ ID NO: 15); D6Mitl4 (129; 155bp,
  • GFP DNA was PCR amplified using the following primer sets: GFPF; 5, one CGTAAACGGCCACAAGT TCA-3 '(SEQ ID NO: 18) and GFPR; 5, CGCTTTACTTGTACAGCTCGT-3, (SEQ ID NO: 19).
  • cDNA was synthesized using DNasel-treated RNA extracted from ES cells, Cre hybrid cells and Cre-treated hybrid cells using oligo dT primers. The RT-PCR product was amplified for 30 cycles at an annealing temperature of 60 ° C.
  • Nanog F 1 5′-GCGCATTTTAGCACCCCACA-3 ′ (SEQ ID NO: 20) and Rl; -GTTCTAAGTCCTAGGTTTGC-3 '(SEQ ID NO: 21); Stella / PGC7 F; 5,-AC AG ACTG ACTGCTAATTGG-3, (SEQ ID NO: 22) and R; 5'—G GAAATTAGAACGTACATACTCC-3 '(SEQ ID NO: 23).
  • G3pdh was amplified using the following primers; F; 5, -TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3 '(SEQ ID NO: 24) and R; 5,-CATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3' (SEQ ID NO: 25).
  • genomic DNA was also extracted from GFP positive clones, digested with EcoRV, separated on a 1.0% agarose gel, and transferred to Hybond N + membrane by alkaline blotting.
  • the membrane was pre Haiburidizu, then Mega prime DNA labeling use the system (Amersham), Te 32 P - dCTP-labeled Prosa 2 S Nofusu ⁇ DOO (srmivas, S.
  • Cre-treated hybrid cells were fixed with 4% formaldehyde for 10 minutes. Following a 1 hour pretreatment with blocking solution (2% skim milk), the cells were treated with anti-NANOG polyclonal antibody (Rusagi IgG) (1: 500) (Abeam) and anti-OCT4 monoclonal antibody (mouse IgG) (1: 100). ) (Santa Cruz) and incubated at 4 ° C. After rinsing the sample, Alexa 546—conjugated anti-rabbit IgG antibody (1: 500) (Molecular Pro 11 ⁇ 25) 11 ⁇ Combined anti-mouse with 0 (1: 1000) (Zymed) for 1 hour incubation I started.
  • Alexa 546 conjuggated anti-rabbit IgG antibody
  • CEC containing a GFP reporter and a puro resistance gene (pCEC-CAG-gfp / lRES.puro-pA) was electorporated into Hprt-deficient HM-1 ES cells.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • CEC-mediated sister chromatid recombination was induced in CEC11 and CEC12 hybrid cells by transient Cre expression followed by pCMV-Cre lipofusion. After three or four times subculture to further 10 days of culture without sorting, about 5. 0 X 10 4 ⁇ 2. 5 X 10 5 cells were FACS sorting (Figure 9f). Without Cre treatment, the GFP negative population was 0.8% and 3.3% in CEC11 hybrid cells and CEC12 hybrid cells, respectively. However, after Cre treatment, the population increased to 2.2% and 10.1%, respectively. Consistent with this, in the absence of Cre treatment, all hybrid cells were GFP positive, whereas Cre treated, FACS-sorted GFP negative hybrid cells produced GFP negative colonies (FIG. 9g).
  • Cre-treated CEC11 hybrid cells and CEC12 hybrid cells were karyotyped. Two separately isolated CEC 11 hybrid clones had 79, XXXY, -11 karyotypes with little or no adverse effects on other chromosomes ( Figure 10e) . On the other hand, CEC12 hybrid clones analyzed had karyotypes of 79, XXXY, 112, + markers (FIG. 10f).
  • This marker was a chromophore containing a microcentromeric repeat, as shown by FISH analysis using a major satellite-specific probe ( Figure 10g).
  • FISH analysis using a major satellite-specific probe ( Figure 10g).
  • our analysis clearly shows that individual autosomal power 3 ⁇ 4 S X somatic cell hybrid nuclear power can be effectively removed.
  • the frequency of chromosome removal is 26.1% for CE C11 hybrid cells showing the loss of chromosome 11 between the two integration sites, and CEC 12 hybrid cells showing the loss of chromosome 12. 88. Very different from 4% (Table 1).
  • Nanog expression is essential for maintaining a reproducible pluripotent state in ES cells and early embryonic cells (Hata no, S. et al., Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity. Mech Dev 122, 67 — 79 (2005); Mitsui, K. et al., The Homeoprot ein Nanog Is Required for Maintenance of Pluripotency in Mouse Epiblast and ES Cells.Cell 113, 631—42. (2003)), and silent copies of Nanog somatic cells It has been previously reactivated by nuclear transfer and cell fusion (Hatano, S. et al., Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity. Mech Dev 122, 67-79 (2005)).
  • the Gt (ROSA) 26Sor locus is the upstream domain of Nanog, where homologous recombination is known to occur efficiently.
  • a target vector (FIG. 11a) having a CEC containing the Pgk-neo / lRE S. gfp gene subcloned in pROSA26-pA was electroporated into HM1 ES cells. Of the 18 G418 resistant clones tested, two were correctly targeted (CEC6tgZ +) and found to produce a 2.3 kb knock-in specific EcoRV fragment by Southern plot analysis ( Figure l ib ) And confirmed by FISH analysis ( Figure 1 If).
  • chromosomes 6 Three chromosomes 6 are derived from somatic cells CFF1) as determined by PCR analysis of 129 JF1 non-specific DNA sequence polymorphisms in proximal D6Mitl 83, central D6Mitl02, and distal D6Mitl l4 (Fig. L lf ⁇ g).
  • GFP-negative hybrid cells that are deficient with respect to ES-derived chromosome 6 have the ability to survive in an undifferentiated state, and immunohistochemistry with anti-NANOG and anti-OCT4 antibodies. Staining was confirmed by positive (Fig. L li). Indeed, Western blot hybridization analysis showed that the relative NANOG expression level in three separate Cre-treated hybrid clones was approximately 1.5 times that in ES cells ( Figure l). lj). Moreover, epigenetic reprogramming of ES fusion-induced somatic cell-derived Nanog genes was confirmed to be sufficient to maintain the undifferentiated state of hybrid cells without the contribution of ES-derived Nanog. It was done.
  • This CEC method is a newly developed approach to induce large-scale changes in hybrid cell genomic components through targeted chromosome removal.
  • MHC-matched, personalized stem cells are highly sought after as a source for generating transplanted tissues with reduced potential for immune rejection.
  • Most of the MHC class I and class II genes form a population on human chromosome 6 and mouse chromosome 17.
  • selective removal of the ES X somatic cell hybrid cell force in a chromosome containing an ES-derived MHC gene would result in an individualized MHC-compatible hybrid cell without requiring therapeutic cloning.
  • a source can be provided.
  • both copies of ES-derived MHC chromosomes are combined with our targeted chromosome removal technology and micronucleus-mediated chromosome transfer to create ES MHC chromosomes derived from somatic cells in the nucleus can be replaced.
  • our CEC method enables the generation of syngeneic pluripotent stem cells as individuals from individual body cells through the removal of all ES-derived chromosomes. Predict.
  • targeted chromosome removal is applicable to various biomedical studies. Generating human ES cells with genetic mutations from patients understands the causes of human diseases, and how to develop appropriate drugs according to pharmacological evaluation using mutant ES-derived cells. Bring.
  • human and mouse embryonic stem cells can confer pluripotency to adult somatic cell nuclei in ES somatic cell hybrid cells.
  • This is a powerful tool for generating somatic cell force reprogrammed pluripotent stem cells without the use of embryonic material. This removes the target chromosome from the hybrid cell and makes a significant contribution to medical progress.
  • CEC universal chromosome removal cassette
  • ES cells have nuclear reprogramming capabilities. Reprogramming ability is the ability to confer pluripotency to somatic cell origin by cell fusion technology in mouse and human therapy. This approach can be removed from ES cell-derived chromosomal power hybrid cells and is very useful.
  • a chromosome in which tetrasomy is found can be restored to a normal body using any method known in the art. This includes the Cre-lox system.
  • chromosomes can be removed according to the examples described in Examples 1-8. By repeating this, a plurality of chromosomes can be removed. [0245] Furthermore, if these steps are repeated, all the chromosomes to be removed (for example, all the chromosomes derived from ES cells) can be removed.
  • the CEC or the basic principle and basic design is the introduction of modified CEC using the CEC into all chromosomes of the ES cell before fusion. Confirm the introduction by Zazan blot analysis or FIS H analysis.
  • GFP or other marker gene (M) into the patient's somatic cell by viral vector (M-somatic cell).
  • the fused cells are selected from a single gene derived from somatic cells.
  • the created personalized stem cells are induced to differentiate into the necessary cells of the patient and used for transplantation treatment.
  • Example 8 Experiments similar to Example 8 can be performed on human cells. Describe the protocol.
  • G418 (10 mg / ml) solution G418 (Geneticin, 860-1811U, GIBCO) lg is dissolved in 100 ml of serum-free medium (DMEM) containing 100 ⁇ HEPES, adjusted to pH 7.1, 0.2 After filter sterilization with m filter-store at 20 ° C. Make selective culture When diluting, use it.
  • DMEM serum-free medium
  • PEG (1: 1.4) solution (adjustment): Dissolve 5 g of polyethylene glycol (PEG-1000, U2 18 -07, BAKER) in 6 ml of serum-free medium (DMEM), and finally dimethylsulfoxide (DMSO ) And sterilize by filtration through a 0.22 m filter.
  • PEG-1000, U2 18 -07, BAKER polyethylene glycol
  • DMEM serum-free medium
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • PEG (1: 3) solution (adjustment): Dissolve 5 g of polyethylene glycol (PEG-1000) in 15 ml of serum-free medium (DMEM) and filter sterilize with a 0.22 m filter.
  • Colcemid (lmgZml) solution Colcemide (DEMECOLCINE, D— 7385, SIGM
  • Cytochalasin B (10 g / ml) solution: 10 mg of cytochalasin B (c -6762, SIGMA) dissolved in 1 ml of DMSO, dissolved in 1000 ml of serum-free medium (DMEM), and 0.22 m filter Store at 4 ° C after sterilization. This solution can be used repeatedly.
  • PHA—P (lmg / ml) solution Phytohemagglutinin—P (311056, DIFCO) 10 mg is dissolved in 10 ml of distilled water, sterilized with a 0.22 m filter and stored at 20 ° C. Prepare a serum-free medium (DMEM) containing PHA-P (50 ⁇ g / ml) by diluting this solution.
  • DMEM serum-free medium
  • ES cells Cells established as described below can be used. [0252] Establishment of the ES cell line is performed using a feeder cell. Usually, ES cells are established by culturing the inner cell mass (ICM) separated from the blastocyst force on a feeder cell. Usually, mouse fetal fibroblasts or a cell line derived therefrom, STO, is used as one feeder cell.
  • ICM inner cell mass
  • STO cell line derived therefrom
  • Human ES cells should be prepared in a form that is completely protected with the consent of the provider.
  • the general procedure is as follows. Obtain embryos that are the source of ES cells and freeze them. Thereafter, the frozen embryo is thawed and cultured to the blastocyst stage. Next, the inner cell mass is separated and the cell line is established. Confirm stem cells, especially ES cells, by the presence or absence of stem cell marker expression and chromosome test. To confirm ES cells, detect stem cell markers (alkaline phosphatase activity, specific antigen, Oct3Z4, Nanog, etc.). Also, karyotype analysis is performed to test whether the number and morphology of chromosomes are normal. Thereafter, differentiation potential is tested.
  • stem cell markers alkaline phosphatase activity, specific antigen, Oct3Z4, Nanog, etc.
  • cell differentiation is induced by changing the culture conditions and creating cell aggregates, and the ability to differentiate into various functional cells is analyzed.
  • transplantation to immunodeficient animals will be conducted to analyze the ability of tissue differentiation due to teratoma formation.
  • Non-essential amino acids (Gibco) 0.8 ml
  • the culture dish for making the feeder is pre-gelatin coated. 0.1. Cover with 1% gelatin solution (swine skin, Type A: Sigma) and incubate at 37 ° C for at least 1 hour. Remove the gelatin solution from the culture dish and add the cell suspension. It can be used as a feeder cell after several hours.
  • gelatin solution swine skin, Type A: Sigma
  • the zona pellucida was removed by enzyme treatment or the like, and was incubated in an antibody solution that reacts with surface antigens. Next, incubation in complement solution removed the outermost cell vegetative ectoderm and separated the inner cell mass.
  • the separated inner cell mass was cultured on one feeder cell.
  • the cells established in this Example are confirmed to be stem cells.
  • DMEMZF12 is exemplified as the basic medium, but it is shown that DMEM or other basic medium can be used without any problem.
  • ES cells were fixed with 4% PFA, and standard culture cell immunostaining (Willingham, MC et. Al., 1985. An Atlas of Immunofluorescence m Cultured Cell, Academic Press, Orlando, FL, pp. 1-13 ) [Kobei! /, Immunostain. Block with 0.1% Triton XZPBSZ 2% skim milk for 1 hour at room temperature, and wash with 0.1% TritonXZPBS for 5 minutes at room temperature 4 times.
  • Primary antibodies are SSEA-4 and TRA-1-60 monoclonal antibodies, 200 ⁇ g / ml (CLONTECH) diluted 1 Z100, and secondary antibodies are FITC-labeled goat anti-mouse IgG (H + L) ( ZY MED LABORATORIES, INC) diluted 1Z200 was used. After the reaction of the secondary antibody, staining is performed in the order of rhodamine phalloidin (Molecular Probe) and DAPI (SIGMA) to detect the signal.
  • SSEA-4 and TRA-1-60 monoclonal antibodies 200 ⁇ g / ml (CLONTECH) diluted 1 Z100
  • secondary antibodies are FITC-labeled goat anti-mouse IgG (H + L) ( ZY MED LABORATORIES, INC) diluted 1Z200 was used. After the reaction of the secondary antibody, staining is performed in the order of rhodamine phalloidin (Molecular Probe) and DAPI (SIGMA) to detect the signal.
  • ALP alkaline phosphatase
  • 'Micronuclear cell purification filter Place the filter (8 / z m, 5 ⁇ ⁇ , 3 ⁇ ⁇ ; SN110614, SN—110613, SN11061 2, NUCLEPORE) in the holder made by Swinnex 25mm MILLIPORE and sterilize by autoclave.
  • Cells are dispersed by trypsin treatment, and each cell (1 X 10 6 cells / each) suspended in a culture solution (10% FBS, DMEM) is simultaneously implanted in a culture flask (25 cm 2 ). Incubate for 1 day.
  • Uwabain (1 X 10 _5 M) and G418 (800 ⁇ g / ml) double selection medium containing (10% FBS, DMEM) cells suspended in (2 X 10 5 cells / plate) are planted in a plastic petri dish (diameter: 100 mm) and cultured for about 3 weeks (change the culture medium every 2 to 3 days).
  • cytochalasin B solution after centrifugation is removed, the micronucleated cells located in the corners of the centrifuge flask are suspended in 1 ml of serum-free culture medium (DMEM), and then collected. Wash with serum medium and combine with the initial micronucleus suspension (approximately 12 ml total).
  • DMEM serum-free culture medium
  • the purified micronucleus cell suspension is centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes and then resuspended in 2 ml of serum-free medium (DMEM) containing PHA-P (50 ⁇ g / ml).
  • DMEM serum-free medium
  • ⁇ 418 800 Cells are suspended in a selective culture medium (D MEM) containing 3 in a plastic petri dish (diameter 100 mm) and cultured for about 3 weeks (change the culture medium every 2 to 3 days). (7) Clone colonies that appear in petri dishes and have G418-resistant different cell strength.
  • D MEM selective culture medium
  • Clone colonies that appear in petri dishes and have G418-resistant different cell strength (5) Identification of human chromosomes in micronucleus hybrid cells: Chromosome analysis is performed by the quinacrine 'hexist staining method, and it is confirmed that normal human chromosomes are contained in the selected G418 resistant different cell clones. In addition, the chromosome in situ hybridization method is used to identify the labeled site of the chromosome removal cassette on the existing human chromosome.
  • a somatic cell is fused with an ES cell in which CEC is homologously introduced at a desired locus of a desired chromosome. Treat the fused cells with pCMV-Cre to obtain a clone from which the desired chromosome derived from ES cells has been removed.
  • This genetically engineered ES cell is induced in various tissues in vivo and in vitro and tested for the presence and extent of rejection by transplantation experiments.
  • Transgenic ES cells into which the Pgk-neo cassette has been introduced are selected with 250 / z gZml G4.
  • G418 meta ES cells ( 6 x 5xl0) are seeded on a 3 cm diameter culture dish (6-well plate) and cultured in the presence of 5-10 mg / ml high concentration G418 for 3 days. During this time, the selective medium is changed every day.
  • the procedure consists in fusing a cytoplasm having somatic cell chromosomes (2 or 1 copy) with ES cells and removing the same ES cell-derived chromosome with the cassette as the inserted chromosome! The specific procedure is shown below.
  • ES cells are prepared as MHC-CEC ES cells in which CEC (GFP or HSV-TK gene is included in one marker) is introduced into two MHC chromosomes.
  • FACS sorting for GFP-negative cells or drug selection for ganciclovir resistant cells MHC chromosomes derived from ES cells are removed, and MHC individual-compatible diploid ES cells with MHC chromosomes derived from somatic cells are selected ( MHC chromosome exchange stem cells).
  • the created MHC individualized stem cells (diploid) are induced into the necessary cells of the patient and used for transplantation treatment.
  • chromosome exchange cells can be produced and used for medical applications.
  • DNA kits cassettes (as genetic engineering tools) to remove the desired chromosomes, cells from which the desired chromosomes have been removed, and their libraries, by removing the desired chromosomes (especially MHC) By introducing the necessary genes accordingly, tailor-made medical care becomes possible.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　本発明は、所望の染色体が欠失している再生可能な細胞、その生産方法、それに使用するための遺伝子カセットおよびキットを提供することを課題とする。より詳細には、本発明は、個人対応型の多能性幹細胞を簡便に入手することを課題とする。より特定すると、本発明は免疫的拒絶反応を惹起せず、ＥＳ細胞などの幹細胞を新たにその個人から取り出し樹立することをせずに、しかも卵細胞を材料とせずに、疾病を処置するためのドナーとなり得る細胞、組織および臓器を効率的に確立することを課題とする。本発明は、レコンビナーゼ認識部位をシス方向に２つ挿入するのではなく、１つまたは逆方向に挿入し、マーカー遺伝子を連結した遺伝子カセット、およびこのカセットを細胞融合技術に応用することによって解決した。

Description

明 細 書
所望の染色体を除去する方法およびそれを利用したティラーメイド医療 技術分野
[0001] 本発明は、概して再生医療の分野に関する。所望の染色体が欠失している再生可 能な細胞、その生産方法、それに使用するための遺伝子カセットおよびキットを提供 する。
背景技術
[0002] 再生医学 (再生医療）による疾患治療が最近注目を浴びて 、る。しかし、これを臓 器ないし組織機能不全を呈する多くの患者に対して日常的に適応するまでには至つ ていない。現在まで、そのような患者の治療として、臓器移植のほか、医療機器での 補助システムの利用がごく限られた患者に適応されているにすぎない。しかし、これら の治療法には、ドナー不足、拒絶、感染、耐用年数などの問題がある。特に、ドナー 不足は深刻な問題であり、骨髄移植の場合、国内外で骨髄ないし臍帯血バンクが次 第に充実してきたといっても、限られたサンプルを多くの患者に提供することが困難 である。従って、これらの問題を克服するために胚性幹細胞 (ES細胞)などを利用し た幹細胞治療とその応用を中心とした再生医学に対する期待がますます高まってい る。
[0003] ES細胞は、初期の胚から誘導される迅速に増殖する未分化の全能性細胞であり、 胚性腫瘍細胞と類似の性質を示す。 ES細胞は最初、マウス胚盤胞の内部細胞塊 (I nner cell mass ;ICM)をマウス繊維芽細胞のフィーダ一細胞層上で培養すること により確立された。 ES細胞は、フィーダ一細胞層および Zまたは白血病阻害因子 (L IF)の存在下のその未分ィ匕の状態を維持するような条件下では無限の寿命を有する [非特許文献 1 =R. Williams et al. , Nature 336 : 684— 687 (1988) ]。また 、高いインビトロ分ィ匕能を有し、集合塊として培養するだけで多種類の細胞に分化さ せることができることが知られている。 ES細胞は、着床前の段階の胚より確立され、外 胚葉、中胚葉および内胚葉の 3胚葉由来の種々の細胞型へ分化する多分化能を有 する細胞である [非特許文献 2 = M. J. Evans and M. H. Kaufman. Nature 292 : 154- 156 (1981)；非特許文献 3 = G. R. Martin, Proc. Natal. Acad. Sc i. USA. 78 : 7634— 7638 (1981) ]。即ち、 ES細胞は成体のあらゆる成熟細胞へ と分化する能力を有し、例えば、正常な初期の胚中に導入しキメラ胚を形成させるこ とによりキメラ動物の体細胞および生殖細胞の両方へ分化させることができる [非特 許文献 4=R. L. Brinster, J. Exp. Med. 140 : 1949— 1956 (1974)；非特許文 献 5 = A. Bradley et al. , Nature 309 : 255— 256 (1984) ]。精巣および卵巣 等の生殖細胞に ES細胞由来の細胞が導入されたキメラ動物を親として交配すること により、 ES細胞由来の細胞のみで構成される子孫を得ることができる。これは即ち、 遺伝学的に十分制御された人為的素質を有する動物を獲得できるということである。 このような動物により、インビトロに限らず個体レベルにおいても発生および分ィ匕のメ 力ニズムについての研究が可能となる。 ES細胞は、胚性腫瘍細胞とは異なり、その 多くが正常二倍体の核型を保持した正常細胞であり、キメラ形成率が高ぐ生殖系列 の細胞へ分化する確率も高く [非特許文献 5]、発生学分野以外でも ES細胞の利用 範囲は広がりつつある。
ES細胞はまた、細胞研究および細胞分ィ匕を決定する遺伝子研究にとって重要な 役割と果たしている。例えば、配列の知られた遺伝子の機能解析のため、マウス ES 細胞は遺伝的改変を導入し、遺伝子の破壊されたマウス株の産生に用いられてきた 。未分化 ES細胞の使用は、ヒトゲノム解読後の機能解析作業においてきわめて効率 力 く有効である。また、 ES細胞はインビトロにおいて、広い範囲にわたる種々の細 胞型へ分ィ匕することができるため、胚発生の際の細胞分化機構を研究するために使 用されてきた。 ES細胞を成長因子の添加、または胚様体を形成することにより造血 細胞、心筋、および、幾つかの型のニューロン等の臨床的に有用な細胞へと分ィ匕す るよう促すことが可能となってきた [非特許文献 6 = M. Wiles et al. , Developme nt 111 : 259— 267 (1991)；非特許文献 7=W. Miller— Hance et al. , J. Bi ol. Chem. 268 : 25244— 25252 (1993)；非特許文献 8 =V. A. Maltsev et a 1. , Mech. Dev. 44 : 41— 50 (1993)；非特許文献 9 = G. Bain et al. , Dev. B iol. 168 : 342— 357 (1995) ]。有用な細胞へと分化させるマウス ES細胞について の誘導の試みは、造血細胞、心筋、特異的ニューロン、および、血管の製造につい て成功している [非特許文献 10=T. Nakano et al. , Science 265:1098— 1 101(1994)；非特許文献 11=R. Pacacios et al. , Proc. Natal. Acad. Sci. USA 92:7530— 7534(1995)；非特許文献 8=V. A. Maltsev et al. , Mec h. Dev.44:41-50(1993)；非特許文献 12 = S. H. Lee et al. , Nat. Biotec hnol. 18:675— 679(1999)；非特許文献 13=H. Kawasaki et al. , Neuron 28:31— 40(2000)；非特許文献 14 = S. -I. Nishikawa, Development 125 :1747— 1757(1998)；非特許文献 15 = M. Hirashima et al. , Blood 93:1 253— 1263(1999)]。
[0005] 現在、ハムスター、マウスなどの種々の動物について ES細胞が確立されているほ 力 ヒト ES細胞も確立されており、それらはマウス ES細胞と類似した分ィ匕能を示した [非特許文献 16=J. A. Thomson et al. , Science282: 1145-1147(1998) ；非特許文献 17=J. A. Thomson et al. , Dev. Biol. 38:133-165(1998)； 非特許文献 18 = B. E. Reubinoff et al. , Nat. Biotechnol. 18:399— 404( 2000)]。主に、マウス ES細胞を用いて得られた分ィ匕誘導調節について蓄積された 膨大な知識を適用することにより、ヒト ES細胞が心筋梗塞、パーキンソン病、糖尿病 および白血病を含む多数の疾病における移植治療用の種々の細胞 ·組織の無限の 材料となり、移植治療におけるドナー不足問題が解消されることが期待されている。 2 000年の 6月 23日には、豪 '米'独による 3つの研究チーム力 国際幹細胞生物シン ポジゥムにお 、て、ヒト ES細胞から神経細胞および筋肉細胞などを初めて作り出すこ とに成功したことを報告した。また、最近、ヒト ES細胞力もの造血細胞を分ィ匕させる方 法についても報告されている。し力しながら、移植治療において ES細胞を用いる場 合にも、今日の臓器移植と同様に免疫的拒絶反応は生じるという問題は残されてい る。
[0006] 生きた組織の移植は種々の理由で行なわれて!/ヽる。臓器移植により欠損した機能 を補い、例えば、腎臓のような重要臓器の致命的疾患を救うこともできる。同一個体 で他の部位に移植する場合、これは自家移植と呼ばれ、自家移植片は拒絶されな ヽ 。一卵性双生児間および近交系動物間での移植を同系移植といい、この場合も、移 植片は宿主にいつまでも生着する。同種間の移植を同種 (異系)移植といい、拒絶を 防ぐ特別な処置を行なわない場合には移植片は拒絶される。また、異なる種属間の 移植を異種移植と ヽ、移植片は宿主により速やかに破壊される。
[0007] 移植片拒絶を招く因子は、移植抗原あるいは組織適合性抗原と呼ばれる。赤血球 を除くすべての体細胞は移植抗原を有して 、る。赤血球は独自の血液型 (ABO)抗 原を持つ。主なヒト移植抗原は、主要組織適合抗原または HLA (ヒト白血球グループ A)と呼ばれ、第 6染色体の遺伝子によって支配される。 HLA抗原は、拒絶反応の標 的であるクラス I抗原、および拒絶反応の開始の役を果たすクラス II抗原の 2群に分 類される。クラス I抗原は全ての組織にみられる力 クラス II抗原はそうではなぐマクロ ファージ様の細胞である指状の突起を有する榭状細胞に多数発現して 、る。拒絶反 応が開始しないよう、このような細胞を臓器移植組織から除去する試みについては実 験的な成功例はあるが、実用には向かず、現在のところ臨床的には応用されていな い。
[0008] 移植後に発症する拒絶反応は、超急性拒絶反応、促進型急性拒絶反応、急性拒 絶反応、慢性拒絶反応に分類することができる。超急性拒絶反応はレシピエントの血 清中にドナーの HLA抗原に反応する既存抗体が存在して!/ヽるときに起こる。血管結 合が終了し、臓器への血流を再開した後、数時間以内に起こる激しい拒絶反応で移 植臓器は直ちに廃絶される。現在、治療法はなぐ移植前にリンパ球交差試験を行 い、レシピエント血清中にドナーリンパ球に反応する抗体を持つことが認められた場 合、その移植を断念することで予防することでしか防ぐことができない。促進型急性拒 絶反応は、ドナーの HLA抗原に反応性の Tリンパ球力 移植前にレシピエントの体 の中に存在するときに発現する。移植後 7日以内に発症することが多ぐ超急性拒絶 反応同様、激しい拒絶反応であるが、近年の治療薬の進歩により治癒させることも可 能となってきて 、る。急性拒絶反応は移植された臓器のドナー HLA抗原によって、 主に Tリンパ球による細胞性の免疫反応が惹起された結果として起こるものである。 移植後に最もよくみられる拒絶反応で、通常、移植後 2週目力も 1か月位までに認め られる。慢性拒絶反応は、臨床的には治療に抗して徐々に進行する臓器機能の低 下を特徴とし、多くは移植後 6か月から 1年を経過して力も発症する。基本的には、ド ナー HLA抗原の侵入により活性化されたレシピエントの免疫反応が引き起こす移植 臓器の組織障害と、それに対応した臓器組織の反応により、長期にわたって進行し て!、く組織変性と考えられて 、る。レシピエントと同じ MHC分子構造の臓器を移植し ない限り、必ず拒絶反応が起こる。現在のところ、どのように拒絶反応をコントロール するかは大きな課題である。
[0009] 上述のような拒絶反応を起こさないようにする免疫抑制法として、大きく分けて、免 疫抑制剤によるもの、外科的手術、放射線照射等が挙げられる。まず、免疫抑制剤と して主なものとして副腎皮質ステロイド薬、シクロスポリン、 FK506等がある。副腎皮 質ステロイド薬は循環性 T細胞の数を減少させ、リンパ球の核酸代謝、サイト力イン産 生を阻害してその機能を抑え、マクロファージの遊走および代謝を抑制して免疫反 応を抑える。一方、シクロスポリンおよび FK506の作用は類似しており、ヘルパー T 細胞の表面にある受容体と結合して細胞内に入り込み、 DNAに直接働いてインター ロイキン 2の生成を阻害する。最終的には、キラー T細胞が機能できなくなり免疫抑制 作用が起こる。これらの免疫抑制剤の使用においては副作用が問題となる。ステロイ ドは特に副作用が多ぐまた、シクロスポリンは肝臓 *腎臓に対する毒性がある。また、 FK506は腎臓に対する毒性を有する。次に外科的手術としては、例えば、リンパ節 摘出、脾臓摘出、胸腺摘除が挙げられるが、これらについてはその効果が十分に証 明されてはいない。外科的手術の中でも胸菅ろうとは、循環しているリンパ球を体外 に導くものであり効果も確認されているが、大量の血清タンパク質および脂肪の流出 を引き起こし、栄養障害が起こりやすくなるという欠点がある。放射線照射には全身 照射と移植片照射があるが、効果が不確実な面もあり、レシピエントに対する負担が 大きいので、前述の免疫抑制剤との併用により利用されている。上述のいずれの方 法も拒絶反応の防止に理想的ではないことは明らかである。
[0010] 現在、除核した卵細胞への体細胞核の導入により、体細胞核が全能性に再プログ ラム化されることが哺乳動物でも示され、クローンヒッジ、クローンゥシ、クローンマウス 、およびクローンブタ等が作成されている〔非特許文献 19 = Wilmut I. et al. , Na ture 385 : 810— 813 (1997)；非特許文献 20=KatoY. et al. , Science 282 : 2095— 2098 (1998)；非特許文献 21 =Wakayama T. et al. , Nature 394 : 369— 374 (1998)；非特許文献 22 = Onishi A. et al. , Science 289 : 1188 — 1190 (2000)；非特許文献 23 = Polejaeva I. A. et al. , Nature 407 : 86— 90 (2000) ]。この技術を利用し、移植を受ける宿主由来の体細胞の核を、卵細胞を 用いて再プログラム化し、全能性の細胞を作製することにより免疫的拒絶反応を惹起 しない移植片を作製することができると考えられる。また、このような細胞培養の方法 によれば、ドナー不足をも解消することができると思われる。
[0011] し力しながら、ヒトの治療用クローユングは、生物医学的倫理問題という社会問題に 遭遇している（非特許文献 24=Weissman, I. L. , N Engl J Med 346, 1576 - 1579. (2002) )0上述の方法では卵細胞を用いる必要があることが倫理的な観 点で問題となっている。また、ヒトにおいては、 ES細胞は初期胚の未分化な細胞に由 来するということ、および成体の初期胚は存在しないという現実を考慮すると、初期胚 より後の状態、特に成体である宿主力 ES細胞を榭立できないという原理的な問題 がある。従って、個人に対応した ES細胞のような多能性幹細胞を得るということは今 までに達成されておらず、当該分野において解決されることが渴望されている課題で ある。
[0012] 本発明者らは、このような情況のもと、個人に対応したティラーメイド治療を実現す るために、以前に、胚性幹細胞 (本明細書において ES細胞ともいう）由来の移植抗 原の一部または全部を欠失させた、細胞融合による多能性幹細胞の製造方法、なら びにその融合細胞力 体細胞由来の主要組織適合抗原のみを発現する細胞、組織 または臓器を分化させることを含む、細胞、組織または臓器の製造方法を開発した（ 特許文献 1 =国際公開 WO03Z027278号)。しかし、所望の遺伝子または染色体（ 特に HLA遺伝子を含む 6番染色体)の除去については、従来法を用いるのみであり その除去効率はそれほど優れたものではな力つた。従って、このような多能性幹細胞 の調製においても使用可能で、効率がよぐ再生能および多分化能を保持させるよう な遺伝子除去方法の開発が求められていた。特許文献 1は、細胞融合を用いて細胞 を未分化状態にする方法を開示する。この文献は、特定の遺伝子を除くことを記載 するが、染色体を除き、その結果、所望の染色体が除かれた融合細胞およびそれに よって未分化状態にされ再生可能な細胞を生産することに関連する技術は記載され ていない。 [0013] 非特許文献 25 (Mark Lewandosk & G. R. Martin, Nature Genetics Vol. 17, 1997 223— 25)は、 XY染色体のうち Y染色体を除く方法を開示す る。この文献は、染色体を除き、その結果、所望の染色体が除かれた融合細胞およ びそれによって未分化状態にされ再生可能な細胞を生産することに関連する技術は 記載されていない。この文献の技術では、生成される細胞は奇形しか発生し得ず、 再生治療に使用可能な細胞は提供できない。
[0014] 非特許文献 26および特許文献 2では、同方向に ΙοχΡ配列を入れた構築物を用い て胚性幹細胞の染色体を喪失させようと試みている。しかし、この方法は、従来方法 と何ら変わることなぐ従って、喪失の効率も悪い。従って、この文献の技術では、効 率よく再生治療に使用可能な細胞を提供することはできない。
特許文献 1：国際公開 WO03Z027278号
特許文献 2：特表 2003— 512053
非特許文献 1:R. Williams et al. , Nature 336:684-687(1988) 非特許文献 2: M. J. Evans and M. H. Kaufman. Nature 292:154— 156(
1981)
非特許文献 3: G. R. Martin, Proc. Natal. Acad. Sci. USA. 78:7634-7638 (1981)
非特許文献 4:R. L. Brinster, J. Exp. Med. 140:1949-1956(1974) 非特許文献 5: A. Bradley et al. , Nature 309:255-256(1984) 非特許文献 6: M. Wiles et al. , Development 111:259-267(1991) 非特許文献 7:W. Miller -Hance et al. , J. Biol. Chem. 268:25244-2525
2(1993)
非特許文献 8:V. A. Maltsev et al. , Mech. Dev.44:41-50(1993) 非特許文献 9: G. Bain et al. , Dev. Biol. 168:342-357(1995)
非特許文献 10:T. Nakano et al. , Science 265:1098-1101(1994) 非特許文献 11: R. Pacacios et al. , Proc. Natal. Acad. Sci. USA 92:753
0-7534(1995)
非特許文献 12: S. H. Lee et al. , Nat. Biotechnol. 18:675— 679(1999) 非特許文献 13: H. Kawasaki et al. , Neuron 28:31—40(2000) 非特許文献 14:S. -I. Nishikawa, Development 125:1747-1757(1998) 非特許文献 15:M. Hirashima et al. , Blood 93:1253-1263(1999) 非特許文献 16 A. Thomson et al. , Science282: 1145-1147(1998) 非特許文献 17 :J. A. Thomson et al. , Dev. Biol. 38:133— 165(1998) 非特許文献 18: B. E. Reubinoff et al. , Nat. Biotechnol. 18:399-404(20
00)
非特許文献 19:Wilmut I. et al. , Nature 385:810-813(1997)
非特許文献 20:KatoY. et al. , Science 282:2095-2098(1998) 非特許文献 21:Wakayama T. et al. , Nature 394:369-374(1998) 非特許文献 22:Onishi A. et al. , Science 289:1188-1190(2000) 非特許文献 23:Polejaeva I. A. et al. , Nature 407:86-90(2000) 非特許文献 24:Weissman, I. L. , N Engl J Med 346, 1576-1579. (200
2)
非特許文献 25: Mark Lewandosk & G. R. Martin, Nature Genetics V ol. 17, 1997 223-25
非特許文献 26: Koike, H. , Horie, K. , Fukuyama, H. , Kondoh, G. , Nagat a, S. and Takeda, J. (2002) Efficient biallelic mutagenesis with CreZ loxP― mediated inter— chromosomal recombination. EMBO Rep 3, 43 3-7
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0015] 本発明は、所望の染色体が欠失している再生可能な細胞、その生産方法、それに 使用するための遺伝子カセットおよびキットを提供することを課題とする。
[0016] より詳細には、本発明は、個人対応型の多能性幹細胞を簡便に入手することを課 題とする。より特定すると、本発明は免疫的拒絶反応を惹起せず、 ES細胞などの幹 細胞を新たにその個人力 取り出し榭立することをせずに、しかも卵細胞を材料とせ ずに、疾病を処置するためのドナーとなり得る細胞、組織および臓器を効率的に確 立することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0017] 本発明は、レコンビナーゼ認識部位をシス方向に 2つ挿入するのではなぐ 1つまた は逆方向に挿入し、マーカー遺伝子を連結した遺伝子カセット、およびこのカセット を細胞融合技術に応用することによって解決した。
[0018] この結果、所望の染色体が除かれ、かつ、再生可能であり、好ましくは未分化状態 を有する細胞が提供される。この技術を応用することにより、ティラーメイドの幹細胞（ 例えば、 ES細胞）が提供される。
[0019] さらに、本発明は、所望のゲノムを有し、多能性が付与された細胞から、不要な染 色体を効率よぐ多能性を失うことなく欠失させる技術を提供することによって、テイラ ーメイド多能性幹細胞を作製することに成功した。好ましくは、本発明では、所望のゲ ノム以外の遺伝子を有しな!/、、拒絶反応の全くな!/、「完全」個人対応型多能性幹細 胞を得ることができる。
[0020] 本発明では、融合細胞、または再プログラム化された体細胞などの、所望のゲノム を有し、不要な染色体が効率よく除去された多能性幹細胞から、自在に分化された 細胞、組織および臓器であって、レシピエントに導入された場合に、所望のティラーメ イド治療が可能になり、例えば、幹細胞 (例えば、 ES細胞）由来の移植抗原の全てを 有する細胞由来のものと比べレシピエントにお 、て受ける拒絶反応が減少または完 全に除去されるなどの治療が効率よく実現される。即ち、本発明の多能性幹細胞は 疾病を処置するためのドナーとなる細胞、組織および臓器を確立するための理想的 な材料となり得る。これらの細胞、組織および臓器は、ティラーメイド型医療において 多大な適用を有し、その産業上の有用性は高い。
[0021] このように、ヒトおよびマウス胚性幹（ES)細胞は、 ES—体細胞ハイブリッド細胞に おいて成体の体細胞核に多能性を与え得る（Tada, M. , Takahama, Y. , Abe, Κ. , Nakatsuji, Ν.および Tada, Τ. Nuclear reprogramming of somatic c ells by in vitro hybridization with ES cells. Curr Biol 11, 1553— 8 , (2001)； Cowan, C. A. , Atienza, J. , Melton, D. A.および Eggan, K. Nu clear reprogramming of somatic cells after fusion with human emb ryonic stem cells. Science 309, 1369— 73 (2005) )。これは、体細胞力ら、 胚性物質を使用することなく再プログラム化された多能性幹細胞を作製するための 強力なアプローチであり、標的染色体がハイブリッド細胞から除去され得る場合、ヒト 医療における進歩に対して非常に大きな意味を有する。この目的の実現ィ匕に向けて 、本発明者らは、万能染色体除去カセット（universal chromosome elimination cassette) (CEC)を開発した。本明細書において、本発明者らは、いくつかの重要 な多能性関連遺伝子 (Nanogが挙げられる）を有するハイブリッド細胞力もの、 ES起 由来の第 6番染色体の両コピーを標的として除去するための、 CECの使用を示す。 その後のハイブリッド細胞の多能性の存続は、再プログラム化された体細胞核からの Nanogの発現による。本発明者らの発明は、ハイブリッド細胞からの ES由来 MHC 染色体の除去を通じてか、または ES細胞中での、 ES細胞由来 MHC染色体の体細 胞由来の MHC染色体への置き換えを通じた、幹細胞治療における使用のための、 個人化された多能性幹細胞の作製が実質的に実施可能であることが証明されたこと になる。最終的に、全ての ES由来染色体は、ハイブリッド細胞から除去され得る。ヒト 疾患の原因および治療を調べるための、患者由来の、正常な ES細胞染色体を標的 として除去することによって種々の変異を有した多能性幹細胞の作製への展望も、同 様に重要である。
従って、本発明は、以下を提供する。
(1) レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであつ て、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセット。
(2) 上記レコンビナーゼ認識配列は、 ΙοχΡ配列、 FRT部位、 attB配列， attP配列 および res部位配列力もなる群より選択される配列を含む相同組み換え配列である、 項目 1に記載の遺伝子カセット。
(3) 上記マーカー遺伝子は、グリーン蛍光タンパク質 (GFP)遺伝子、イェロー蛍光 タンパク質 (YFP)遺伝子、シアン蛍光タンパク質 (CFP)遺伝子およびレッド蛍光タ ンパク質 (dsRED)遺伝子からなる群より選択される遺伝子を含む、項目 1に記載の 遺伝子カセット。
(4) さらに、選択配列を含む、項目 1に記載の遺伝子カセット。 (5) 上記選択配列は、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、ピューロマイシン抵抗性付 与遺伝子、ネオマイシン抵抗性付与遺伝子、ノ、イダロマイシン抵抗性付与遺伝子、 ブラストサイジン抵抗性付与遺伝子、ゼォシン抵抗性付与遺伝子、 HAT抵抗性付 与遺伝子、ジフテリアトキシン抵抗性付与遺伝子およびフルォロウラシル抵抗性付与 遺伝子からなる群より選択される遺伝子をコードする配列を含む、項目 4に記載の遺 伝子カセット。
(6) 上記レコンビナーゼ認識配列は、配列番号 1に記載される配列 ATAACTTC GTATAATGTATGCTATACGAAGTTATを含む、項目 1に記載の遺伝子カセ ッ卜。
(7) さらに、配列番号 2に記載される IRES配列を含む、項目 1に記載の遺伝子カセ ッ卜。
(8) さらに、配列番号 3に記載される CAG配列を含む、項目 1に記載の遺伝子カセ ッ卜。
(9) 上記レコンビナーゼ認識配列は、逆方向に 2つ含まれる、項目 1に記載の遺伝 子カセット。
(10) 上記レコンビナーゼ認識配列は、逆方向に 2つ含まれ、上記レコンビナーゼ 認識配列の間に、 CAG、マーカー配列、 IRES配列、および選択配列を含む、項目 1に記載の遺伝子カセット。
(11) レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであつ て、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを含む、所望の染色体 を除去するための糸且成物。
(12) 上記染色体が、多能性関連遺伝子を含む、項目 11に記載の組成物。
(13) 上記除去は、上記染色体の両コピーの除去を含む、項目 11に記載の組成物
(14) A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットで あって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、
B)上記レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする 核酸配列を含む核酸分子と、 を備える、所望の染色体を除去するためのキット。
(15) A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットで あって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、
B)上記レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする 核酸配列を含む核酸分子と、
C)幹細胞と、
を備える、幹細胞力も所望の染色体を除去するためのキット。
(16) A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットで あって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、
B)上記レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする 核酸配列を含む核酸分子と、
C)幹細胞と、
D)所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞と、
を備える、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞から所望の染色体を 除去し、上記細胞に多分ィ匕能を付与するためのキット。
(17) 所望のゲノムを有する細胞力 所望の染色体または染色体群を除去し、上記 細胞に多分ィ匕能を付与するための方法であって、
A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって 、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、
B)上記遺伝子カセットを幹細胞に導入する工程と、
C)上記幹細胞と所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞とを融合する 工程と、
D)上記融合された細胞に、上記レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナー ゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、
E)再構成が生じる条件に上記融合された細胞を曝す工程と、
F)融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色 体が除去された細胞を選択する工程と、
を包含する、方法。 (18)項目 17に記載の方法によって得られた細胞。
(19)所望の染色体が除去された、細胞。
(20)所望の染色体が除去された、幹細胞。
(21)上記幹細胞は、 ES細胞である、項目 20に記載の幹細胞。
(22)上記染色体が MHCまたは対応する遺伝子をコードする配列を含む、項目 19 に記載の細胞。
(23)所望の染色体または染色体群が交換された、染色体交換細胞。
(24)所望の染色体または染色体群が交換された、染色体交換された幹細胞。
(25)上記幹細胞は、 ES細胞である、項目 24に記載の幹細胞。
(26) ES細胞と、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する微小核との融合細 胞であって、上記融合細胞から ES細胞由来の所望の染色体が除去され、多分化能 を有する、染色体交換細胞。
(27) ES細胞と、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞との融合細胞 であって、上記融合細胞から、所望の染色体が除去され、多分化能を有する、融合 細胞。
(28) ES細胞と、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞との融合細胞 であって、上記融合細胞から、上記 ES細胞の染色体が除去され、多分化能を有す る、融合細胞。
(29)上記所望の染色体は、上記 ES細胞の MHC、拒絶反応関連遺伝子またはそ れに対応する遺伝子をコードする配列を含む染色体である、融合細胞。
(30)上記所望の染色体は、上記 ES細胞のマウスの第 6染色体、第 11染色体、第 1 2染色体および第 17染色体、ヒトの第 6染色体からなる群より選択される染色体また は上記染色体に対応する染色体の一方コピーまたは両コピーを含む染色体である、 融合細胞。
(31)上記所望の染色体は、上記 ES細胞の染色体のうち 1つまたは 2つ以上を含む 染色体である、融合細胞。
(32)上記所望の染色体は、上記 ES細胞の染色体全部である、融合細胞。
(33)上記所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞は、疾患に罹患した個 体由来のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞である、融合細胞。
(34)上記所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞は、疾患に罹患した個 体由来のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞であり、上記所望の染色体は
、上記 ES細胞の染色体全部である、融合細胞。
(35)所望の染色体が除去された細胞を複数種類含む、細胞ライブラリー。
(36)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって 、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットの、所望の染色体を除去 するための使用。
(37)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって 、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットの、所望の染色体を除去 するための組成物の製造のための使用。
(38) 所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞から所望の染色体を除去 するための方法であって、
A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって 、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、
B)上記遺伝子カセットを細胞に導入する工程と、
C)上記細胞と所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞とを融合するェ 程と、
D)上記融合された細胞に、上記レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナー ゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、
E)再構成が生じる条件に上記融合された細胞を曝す工程と、
F)融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色 体が除去された細胞を選択する工程と、
を包含する、方法。
(39) 染色体交換細胞を生産するための方法であって、
A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって 、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、
B)上記遺伝子カセットを第 1の細胞に導入する工程と、 C)所望の染色体を有する第 2の細胞の細胞質と、第 1の細胞とを融合させる工程；
D)上記第 2の細胞の所望の染色体に対応する上記第 1の細胞の染色体を、上記 第 1の細胞の上記染色体の除去を可能にするように、上記レコンビナーゼ認識配列 を認識するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供 する工程
E)再構成が生じる条件に上記融合された細胞を曝す工程と、
F)融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色 体が除去された細胞を選択する工程と、
を包含する、方法。
(40)項目 38または 39に記載の方法によって生産される細胞。
[0023] 従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な 説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白〖こなることが理解される。
発明の効果
[0024] 本発明は、自在に目的の染色体を効率よく除去することができるという技術を提供 する。従って、自在に染色体を欠如させることにより、例えば、免疫拒絶を低減または 抑制した再生医療、ティラーメイド治療が容易になった。
[0025] 好ましい実施形態においては、本発明により、 ES細胞由来染色体の除去により、 特定の染色体由来の転写産物は体細胞由来のみとなる。このことを応用して、個人 対応型の薬剤効果の検定等で創薬分野への応用が考えられる。
図面の簡単な説明
[0026] [図 1A]図 1Aは、本発明の 1実施形態の実施スキームを示す。
[図 1BC]図 1Bは、染色体除去カセットがマウス 11番染色体の末端に導入されている ことを FISH解析により確認した図である。図 1Cは、染色体除去カセット導入 ES細胞 と体細胞の融合細胞の染色体解析である。白矢はマウス 11番染色体を示して 、る。
[図 1D]図 1Dは、 Cre酵素処理後の融合細胞の Facs解析である。丸印が GFP陽性 細胞集団、六角形印が GFP陰性細胞集団を示している。
[図 1EF]図 1Eは、染色体除去カセットが導入されたマウス 11番染色体が除去された 細胞クローンの染色体解析である。白丸印により染色体が除去された事が示されて いる。図 IFは、図 IEとは独立した細胞クローンの染色体解析である。図 1Eと同様に マウス 11番染色体が除去されている。
[図 2]図 2は、マウスにおける 1実施形態の細胞の核型分析による欠失染色体の分布 の実験結果を示す。ここで、 11番染色体が見事に除去されていることが理解される。
[図 3]図 3は、本発明の染色体除去のメカニズムを説明する模式図である。
[図 4]図 4は、染色体除去カセットの ES細胞への導入および導入カセットの FISH解 析である。
[図 5]図 5は、染色体除去カセットが導入された ES細胞 (CEC— ES)細胞と体細胞と の融合実験。融合細胞は染色体数が 80本で ES細胞と体細胞に由来するすべての 染色体を保持している。マウス 11番染色体は、 4本存在する。
[図 6]図 6は、染色体除去カセットが導入された ES細胞 (CEC— ES)細胞と体細胞と の融合細胞を Cre酵素で処理し 11番染色体を選択的に除去した例を示す。 11番染 色体が除去された細胞は GFP蛍光が消失し、 Facsソーティングにより容易に分取可 能である。分取した代表的な 2細胞クローンの核型を示す。ともに、染色体除去カセ ットが挿入された 11番染色体が除去されて!ヽる。
[図 7]染色体除去カセットがマウス ES細胞の 5番染色体または 12番染色体に導入さ れた例を示す。染色体上の除去カセット挿入部位を FISH法により解析した。
[図 8]図 8は、本発明の好ましい実施形態である、ティラーメイド治療のための融合細 胞の作製模式図を示す。
[図 9a]図 9は、染色体除去カセット（CEC)を有する胚性幹 (ES)細胞、および体細胞 との細胞融合を示す。 a. ES細胞と体細胞との間の細胞融合、ならびに CEC—タグ 化 ES染色体を標的とした除去の模式図。白矢印は、緑色シグナルによって検出され る CEC組み込み部位を示す。
[図 9b]図 9は、染色体除去カセット（CEC)を有する胚性幹 (ES)細胞、および体細胞 との細胞融合を示す。 b. ES細胞の第 11番染色体上の CECの地図。
[図 9c]図 9は、染色体除去カセット (CEC)を有する胚性幹 (ES)細胞、および体細胞 との細胞融合を示す。 c ES細胞の第 12番染色体上の CECの地図。
[図 9d]図 9は、染色体除去カセット（CEC)を有する胚性幹 (ES)細胞、および体細胞 との細胞融合を示す。 d. Cre処理前 (Cre前）の、単一の CECタグィ匕第 11番染色体 を有するハイブリッド細胞 (CEC11ハイブリッド)の Gバンド形成核型。
[図 9e]図 9は、染色体除去カセット（CEC)を有する胚性幹 (ES)細胞、および体細胞 との細胞融合を示す。 e.単一の CECタグィ匕第 12番染色体を有する Cre前ハイブリツ ド細胞（CEC 12ハイブリッド）の Gバンド形成核型。
[図 9f]図 9は、染色体除去カセット（CEC)を有する胚性幹 (ES)細胞、および体細胞 との細胞融合を示す。 f. Cre前および Cre処理された (Cre後） CEC11ハイブリッド 細胞および CEC12ハイブリッド細胞 F ACS分析。 GFPネガティブハイブリッド細胞は 、囲み R2中にあり、一方 GFPポジティブハイブリッド細胞は、囲み R3中にある。
[図 9g]図 9は、染色体除去カセット（CEC)を有する胚性幹 (ES)細胞、および体細胞 との細胞融合を示す。 g. Cre前および Cre後 CEC11ハイブリッドクローンにおける G FP発現。
[図 10a]図 10は、第 11番染色体および第 12番染色体の除去後の、染色体ペインテ イングおよび***中期の核型を示す。 a. Cre処理前の（Cre前） CEC 11の染色体べ インティング。核内の 4つの第 11番染色体は、赤色のペインティングシグナルとして 認識される。
[図 10b]図 10は、第 11番染色体および第 12番染色体の除去後の、染色体ペインテ イングおよび***中期の核型を示す。 b. Cre処理された (Cre後） CFC11ハイブリツ ド細胞の染色体ペインティング。赤色のペインティングシグナルとして認識されるよう に、染色体除去により、各核内に 3つの第 11番染色体が生じた。
[図 10c]図 10は、第 11番染色体および第 12番染色体の除去後の、染色体ペインテ イングおよび***中期の核型を示す。 c Cre前 CEC 12ハイブリッド細胞の染色体べ インティング。核内における 4つの第 12番染色体力 赤色のペインティングシグナル として認識される。
[図 10d]図 10は、第 11番染色体および第 12番染色体の除去後の、染色体ペインテ イングおよび***中期の核型を示す。 d. Cre後 CEC 12ハイブリッド細胞の染色体べ インティング。赤色のペインティングシグナルとして認識されるように、染色体除去によ り、各核内に 3つの第 12番染色体が生じた。 [図 10e]図 10は、第 11番染色体および第 12番染色体の除去後の、染色体ペインテ イングおよび***中期の核型を示す。 e. Cre後 CEC11ハイブリッド細胞の Gバンド 形成核型。 白矢印は、核内の 3つの第 11番染色体を示す。白丸は、 1つの第 11番 染色体の選択的除去を表す。
圆 10f]図 10は、第 11番染色体および第 12番染色体の除去後の、染色体ペインティ ングおよび***中期の核型を示す。 f. Cre後 CEC12ハイブリッド細胞の Gバンド形 成核型。 白矢印は、核内の 3つの第 12番染色体を示す。白丸は、 1つの第 12番染 色体の選択的除去を表す。
[図 10g]図 10は、第 11番染色体および第 12番染色体の除去後の、染色体ペインテ イングおよび***中期の核型を示す。 g. Cre後 CEC12ハイブリッド細胞における微 小染色体 (M)。小型染色体（白矢印）は、大部分、 FISHによって示されるように、動 原体異質染色質からなる。
圆 11a]図 11は、ハイブリッド細胞核中の ES由来第 6番染色体対を標的とする除去を 示す。 a相同組み換えによる Gt (ROSA) 26Sor座への CEC—neo/gfpカセットの 組み込みの模式図（CEC6tgZ + )。 CECに対する ES 細胞ホモ接合体（CEC6tg Ztg)を、高用量 0418処理によって選別した。
[図 lib]図 11は、ハイブリッド細胞核中の ES由来第 6番染色体対を標的とする除去 を示す。 b. CEC6tgZ+ES細胞および CEC6tgZtg ES細胞における、ホモ接合 体組み換えのサザンブロットハイブリダィゼーシヨン分析。 l lkbバンドは、野生型対 立遺伝子に特異的であり、一方 2. 3kbバンドは、ノックイン対立遺伝子に特異的であ る。
[図 11c]図 11は、ハイブリッド細胞核中の ES由来第 6番染色体対を標的とする除去を 示す。 c Cre処理の 3日後における、核内に 2つの第 6番染色体を有する CEC6 (tg Ztg)ハイブリッド細胞の染色体ペインティング (赤色)。
[図 lid]図 11は、ハイブリッド細胞核中の ES由来第 6番染色体対を標的とする除去 を示す。 d. Cre処理の 7日後における、核内に 3つの第 6番染色体 (赤色）および 4つ の第 17番染色体 (緑色）を有する GFPネガティブ CEC6 (tg/tg)ハイブリッド細胞の 染色体ペインティング。 [図 lie]図 11は、ハイブリッド細胞核中の ES由来第 6番染色体対を標的とする除去を 示す。 e. Cre処理の 7日後における、核内の、 2つの第 6番染色体間のロバートソン 転座によって形成された二腕染色体を有する GFPネガティブ CEC (tg/tg)ハイプリ ッド細胞、ならびに正常第 6番染色体の、染色体ペインティング。
[図 llfg]図 11は、ハイブリッド細胞核中の ES由来第 6番染色体対を標的とする除去 を示す。 f.第 6番染色体上の、 CEC6 (緑点）およびマーカー遺伝子座の位置。 g. 第 6番染色体上の 3つのマーカー遺伝子座を用いたゲノム PCR分析による、第 6番 染色体の起源の決定。
[図 llh]図 11は、ハイブリッド細胞核中の ES由来第 6番染色体対を標的とする除去 を示す。 h.多型産物の RT—PCR分析による、 Nanog および StellaZPGC7転写 物の起源の決定。
[図 lli]図 11は、ハイブリッド細胞核中の ES由来第 6番染色体対を標的とする除去を 示す。 i. ES由来の第 6番染色体を欠くハイブリッド細胞における NANOGおよび O CT4の発現 (免疫組織化学染色)。
[図 llj]図 11は、ハイブリッド細胞核中の ES由来第 6番染色体対を標的とする除去を 示す。 j.ウェスタンブロットハイブリダィゼーシヨンによる Cre後ハイブリッド細胞におけ る、 NANOGの発現レベル。
配列表の説明
配列番号 1は、 ΙοχΡ配列である。
配列番号 2は、 IRES配列である。
配列番号 3は、 CAG配列である。
配列番号 4は、 FRT部位である。
配列番号 5は、 attB配列である。
配列番号 6は、 attP配列である。
配列番号 7は、グリーン蛍光タンパク質の配列である。
配列番号 8は、グリーン蛍光タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号 9は、ピューロマイシン抵抗性付与遺伝子のコード配列である。
配列番号 10は、ピューロマイシン抵抗性付与遺伝子のアミノ酸配列である。 配列番号 11は、 CEC全配列である。
配列番号 12は、 D6Mitl83、プライマー 1 : 5 TTCTCAATGAACACTAGA ACATTCG一 3 'である。
配列番号 13は、 D6Mitl83、プライマー 2 : 5 AAAACACAGGTAGAAAA CATACATACA— 3 'である。
配列番号 14は、 D6Mitl02、プライマー 1 : 5 CCATGTGGATATCTTCCC TTG— 3'でぁる。
配列番号 15は、 D6Mitl02、プライマー 2 : 5 GTATACCCAGTTGTAAAT CTTGTGTG一 3，である。
配列番号 16は D6Mitl4、プライマー 1 : 5' - ATGC AG AAAC ATG AGTGG GG— 3'である。
配列番号 17は D6Mitl4、プライマー 2 : 5， - CACAAGGCCTGATGACCTC T一 3 'である。
配列番号 18は GFP Fプライマー： 5 '— CGTAAACGGCC AC AAGTTC A - 3 'である。
配列番号 19は GFP Rプライマー： 5 '— CGCTTTACTTGTACAGCTCGT 一 3'である。
配列番号 20は Nanog F1プライマー：5， - GCGCATTTTAGCACCCCAC A— 3 'である。
配列番号 21は Nanog R1プライマー： 5 '— GTTCTAAGTCCTAGGTTTGC 一 3'である。
配列番号 22は Stella/PGC7 Fプライマー： 5 ' - ACAG ACTGACTGCTA ATTGG— 3'である。
配列番号 23は、 Stella/PGC7 Rプライマー： 5，— GGAAATTAGAACGTA CATACTCC - 3 'である。
酉己歹 IJ番号 24は、 G3pdh Fプライマー： 5， - TG AAGGTCGGTGTG AACGG A TTTGGC— 3'である。
配列番号 25は、 G3pdh Rプライマー： 5，一 CATGTAGGCCATGAGGTCCA C 3'である。
発明を実施するための最良の形態
[0028] 以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞 (例えば、英語 の場合は「a」、「an」、「the」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、 特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、 本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いら れる意味で用いられることが理解されるべきである。
[0029] (一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手 法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Maniatis, T. e t al. (,1989) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring
Harborおよびその 3rd Ed. (2001)； Ausubel, F. M. (1987) . Current Pro tocols in Molecular Biology, Greene Pub. AssociatESand Wiley— Inte rscience ; Ausubel, F. M. (1989) . Short Protocols in Molecular Biolog y : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecul ar Biology, Greene Pub. Associates ana
Figure imgf000022_0001
； Sambroo k, J. et al. (1989) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor ; Innis, M. A. (1990) . PCR Protocols： A Guide to Me thods and Applications, Academic Press ; Ausubel, F. M. (1992) . Shor t Protocols in Molecular Biology： A Compendium of Methods fro m Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates ; Ausubel, F. M. (1995) . Short Protocols in Molecular Biology: A Co mpendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biolog y, Greene Pub. Associates ; Innis, M. A. et al. (1995) . PCR Strategies , Academic Press ; Ausubel, F. M. (1999) . Short Protocols in Molecul ar Biology： A じ ompendium of Methods from Current Protocols in
Molecular Biology, Wiley, and annual updates ; Sninsky, J. J. et al. (1 999) . PCR Applications： Protocols for Functional Genomics, Acade mic Press、別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに 記載されており、これらは本明細書において関連する部分 (全部であり得る）が参考と して援用される。
[0030] (用語の説明）
以下に本明細書において使用される用語を説明する。
[0031] (細胞生物学）
本明細書にぉ 、て使用される「細胞」は、当該分野にぉ 、て用いられる最も広義の 意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜 構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する 生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であって も、人工的に改変された細胞 (例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞)であってもよい
[0032] 本明細書にぉ 、て「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能 (すなわち多能性）
(「pluripotency」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときに その組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、 ES細胞または組織幹細 胞 (組織特異的幹細胞または体性幹細胞とも 、う）であり得るがそれらに限定されな い。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞 (たとえば、本明細書 において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など)もまた、幹細胞であり 得る。 ES細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。 ES細胞は、 1981年に初 めて樹立され、 1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。 1998年には ヒト ES細胞が榭立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、 ES 細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に 存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが 低い。組織幹細胞は、核 Z細胞質比が高ぐ細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は 、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅ぐ個体の一生以上に増殖能を維持する。 本明細書において使用される場合は、幹細胞は好ましくは ES細胞であり得る力 状 況に応じて組織幹細胞も使用され得る。
[0033] 由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄 系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹 細胞などが挙げられる。消ィ匕器系の組織幹細胞としては、膝 (共通)幹細胞、肝幹細 胞などが挙げられる。骨髄系の糸且織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞な どが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙 げられる。
[0034] 本明細書にぉ 、て「体細胞」とは、卵子、***などの生殖細胞以外の細胞であり、 その DNAを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性 が限定されている力または消失している。本明細書において使用される体細胞は、 天然に存在するものであってもよぐ遺伝子改変されたものであってもよい。
[0035] 細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され 得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉 由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞 などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、脾幹細胞など が含まれる。本明細書では、体細胞はどのような胚葉由来でもよい。好ましくは、体細 胞は、リンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞、骨髄細胞が使用され得る。
[0036] 本明細書にお!、て「単離された」とは、通常の環境にお!、て天然に付随する物質が 少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離 された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質 (たとえば、他の細胞、タン パク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについて いう場合、「単離された」とは、たとえば、組換え DNA技術により作製された場合には 細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学 物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す 。単離された核酸は、好ましくは、該核酸が由来する生物において天然に該核酸に 隣接して ヽる (flanking)配列（即ち、該核酸の 5 '末端および 3 '末端に位置する配 列)を含まない。
[0037] 本明細書にぉ 、て、「榭立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質 (例え ば、多分化能)を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになつ た状態をいう。したがって、榭立された幹細胞は、多分化能を維持する。本発明では 、榭立された幹細胞を使用することは、宿主力 新たに幹細胞を採取するという工程 を回避することができるので好まし 、。
[0038] 本明細書において、「非胚性」とは、初期胚に直接由来しないことをいう。従って、 初期胚以外の身体部分に由来する細胞がこれに該当する力 ES細胞に改変（例え ば、遺伝的改変、融合など）を加えて得られる細胞もまた、非胚性細胞の範囲内にあ る。
[0039] 本明細書にぉ 、て「分ィ匕 (した)細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞 (例 えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほ とんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、脾実質細胞、脾管細胞、肝 細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血 管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられ る。従って、本発明の 1つの実施形態において、ある分ィ匕細胞を本発明の再プロダラ ムィ匕因子で処理することによって（f列えば、 WO03/027277, WO03/027278な どを参照）、多能性を獲得することができる場合、そのような分ィ匕細胞もまた本発明に おける体細胞としてまたはその代わりに使用され得る。
[0040] 本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、 1個の細胞の***によって由 来した娘細胞集団の中で形態的および Zまたは機能的に質的な差をもった二つ以 上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない 細胞に由来する細胞集団（細胞系譜)が、特定のタンパク質の産生などはっきりした 特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定 の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態 をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分ィ匕を 同定することができる。細胞分ィ匕の結果は原則として安定であって、特に動物細胞で は，別のタイプの細胞に分ィ匕することは例外的にしか起こらない。従って、本発明に おけるような後天的に生じた多能性細胞の遺伝子改変を容易に行えるようになったこ とは非常に価値が高い。
[0041] 本明細書において「多能性」または「多分ィ匕能」とは、互換可能に用いられ、細胞の 性質をいい、 1以上、好ましくは 2以上の種々の組織または臓器に分ィ匕し得る能力を いう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない 限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて 制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化す ることは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮 性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生 (metaplasia )と呼ばれる。し力し間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり 化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。 ES細胞は、多能性を有する。組織 幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体 を構成する全ての種類の細胞に分ィ匕する能力は全能性といい、多能性は全能性の 概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系に おける、胚様体 (Embryoid Body)の形成、分ィ匕誘導条件下での培養等が挙げら れるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアツセィ 法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形種 (テラトーマ）の形成、胚盤胞への 注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げ られるがそれらに限定されない。
[0042] 本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞 (たとえば、任意の種類の多細 胞生物 (例えば、動物 (たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物 (たとえば、単子葉 植物、双子葉植物など)など)）でもよい。好ましくは、脊椎動物 (たとえば、メタラウナ ギ類、ャッメゥナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など） 由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物 (例えば、単孔類、有袋類、貧歯類 、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海 牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ゥサギ目など）由来の細胞が用いられる。さらに好 ましくは、霊長類 (たとえば、チンパンジー、二ホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられ る。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。
[0043] 本発明が対象とする臓器はどのような臓器でもよぐまた本発明が対象とする組織 または細胞は、生物のどの臓器または器官に由来するものでもよい。本明細書にお いて「臓器」または「器官」とは、互換可能に用いられ、生物個体のある機能が個体内 の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造 体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置を もついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞力もなる。そのような臓器または器 官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。 1つの実施形態では、 本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経 、肺、胎盤、脾臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。 本明細書において、本発明の多能性細胞力も分ィ匕した細胞としては、表皮細胞、脾 実質細胞、膝管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格 筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、 軟骨細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0044] 本明細書において「組織」（tissue)とは、多細胞生物において、実質的に同一の 機能および Zまたは形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有する 力 異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および Z-または形態を有す るのであれば、組織と呼ばれ得る。従って、本発明の幹細胞を用いて組織を再生す る場合、 2以上の異なる起源を有する細胞集団が一つの組織を構成し得る。通常、 組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠 に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。植物では、 構成細胞の発達段階によって***組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種 類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、 V、ろ 、ろな分類が行われて 、る。
[0045] (分子生物学、遺伝子操作）
本発明の方法では、細胞に遺伝子構築物またはベクターが導入される。
[0046] 本明細書にぉ 、て、「遺伝子構築物」、「核酸構築物」または「遺伝子カセット」とは、 交換可能に用いられ、遺伝子をコードする核酸分子 (例えば、 DNA、 RNA)と、これ に必要に応じて作動可能に（すなわち、その核酸の発現を制御し得るように)連結さ れた制御配列（例えば、プロモーター）とを含む核酸配列、ならびに、必要に応じて 制御配列（例えば、プロモーター）と、これに作動可能に（すなわち、インフレームに） 連結された異種遺伝子とを含む核酸分子をいう。このカセットまたは構築物は、必要 に応じて他の調節エレメントと組み合わせて使用することもまた、本発明の範囲に含 まれる。好ましい発現カセットは、特定の制限酵素で切断され、容易に回収され得る 遺伝子カセットまたは核酸構築物である。
[0047] そのような遺伝子構築物またはベクターの導入方法としては、細胞に DNAなどの 核酸分子を導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフエク シヨン、形質導入、形質転換などが挙げられる（例えば、エレクト口ポレーシヨン法、パ 一ティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法など)。そのような核酸分子の導入技術は、 当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、 Ausubel F. A.ら編 (1988)、 Current Protocols in Molecular Biology、 Wiley、 New York；、 NY; Sambrook Jら (1987) Molecular Cloning : A Laboratory Man ual, 2nd Ed.およびその弟三 liR, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊 土社、 1997などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロッ ト分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認す ることがでさる。
[0048] 本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えべ クタ一」とは、 目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるべ クタ一をいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、 昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、ま たは染色体中への糸且込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置 にプロモーターを含有して 、るものが例示される。
[0049] また、ベクターの導入方法としては、細胞に DNAなどの核酸分子を導入する上述 のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフエクシヨン、形質 導入、形質転換など (例えば、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAEデキストラン 法、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods. Enzymol. , 194, 182 (1990) ]、ノ ーテ ィクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）、リポフエクシヨン法、スフエロプラスト法 [Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978) ]、酢酸リチウム法 Q[. Bacteriol. , 153, 163 (1983) ]、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の 方法が挙げられる。
[0050] 本明細書において「遺伝子導入試薬」とは、核酸 (通常遺伝子をコードするが、そ れに限定されな ヽ）の導入方法にぉ ヽて、導入効率を促進するために用いられる試 薬をいう。そのような遺伝子導入試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン 性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそ れらに限定されない。トランスフエクシヨンの際に利用される試薬の具体例としては、 種々なソースから市販されている試薬が挙げられ、例えば、 Effectene Transfecti on Reagent (cat. no. 301425, Qiagen, CJ ) , TransFastTM Transfection
Reagent (E2431, Promega, Wl) , Tfx™— 20 Reagent (E2391, Promega , WI) , SuperFect Transfection Reagent (301305, Qiagen, CA) , PolyFe ct Transfection Reagent (301105, Qiagen, CA) , LipofectAMINE 2000
Reagent (11668— 019, Invitrogen corporation, CA) , JetPEI ( X 4) cone. (101 - 30, Polyplus - transfection, France)および ExGen 500 (R0511, Fe rmentas Inc. , MD)などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明において は、本発明の核酸分子を細胞に導入する際にこのような遺伝子導入試薬が使用され 得る。
原核細胞に対する「組み換えベクター」としては、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (い ずれも Roche Molecular Biochemicalsより市販）、 pKK233— 2 (Pharmacia) 、 pSE280 (Invitrogen)、 pGEMEX— 1 [Promega]、 pQE— 8 (QIAGEN)、 pK YP10 (特開昭 58— 110600)、 pKYP200 [Agric. Biol. Chem. , 48, 669 (198 4) ]、 pLSAl [Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989) ]、 pGELl [Proc. Natl. A cad. Sci. USA, 82, 4306 (1985) ]、 pBluescript II SK+ (Stratagene)、 pB luescript II SK (—）（Stratagene)、 pTrs30 (FERM BP— 5407)、 pTrs32 ( FERM BP— 5408)、 pGHA2 (FERM BP— 400)、 pGKA2 (FERM B— 679 8)、 pTerm2 (特開平 3— 22979、 US4686191、 US4939094, US5160735) , pEG400 C[. Bacteriol. , 172, 2392 (1990) ]、 pGEX (Pharmacia；)、 pETシステ ム (Novagen)、 pSupex、 pUB110、 pTP5、 pC194、 pTrxFus (Invitrogen)、 pM AL-c2 (New England Biolabs) , pUC19 [Gene, 33, 103 (1985) ]、 pSTV 28 (宝酒造）、 pUC118 (宝酒造）、 pPAl (特開昭 63— 233798)などが例示される 。本明細書において原核生物細胞は、遺伝子を操作するときに主に用いられる。 [0052] 本明細書において動物細胞に対する「組み換えベクター」としては、 pcDNAlZA mp、 pcDNAI、 pCDM8 (いずれもフナコシより市販）、 pAGE107 [特開平 3— 229 (Invitrogen)、 pAGE103 Q[. Biochem. , 101, 1307 (1987) ]、 ρΑΜο、 ρΑΜο A[J. Biol. Chem. , 268, 22782— 22787 (1993) ]、マウス幹細胞ウィルス（Mur ine Stem Cell Virus) (MSCV)に基づいたレトロウイルス型発現ベクターなどが 例示される。
[0053] 本発明において使用される「レトロウイルスベクター」としては、例えば、 Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) , Murine Stem Cell Virus (MSCV) にもとづいたレトロウイルス型発現ベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない
[0054] 本明細書にぉ ヽて「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生 命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植 物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転 換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられ る細胞は、形質転換体であってもよい。
[0055] 本発明にお ヽて遺伝子操作などにぉ ヽて原核生物細胞が使用される場合、原核 生物糸田胞としては、 Escherichia属、 Serratia属、 Bacillus属、 Brevibacterium属 、 Corynebacterium,禺、 Microbacterium晨、 Pseudomonas厲などに属す 原核 生物細胞、例えば、 Escherichia coli XL 1— Blueゝ Escherichia coli XL2— B lue、 Escherichia coli DH1、 Escherichia coli MC1000、 Escherichia col i KY3276、 Escherichia coli W1485、 Escherichia coli JM109、 Escheric hia coli HB 101、 Escherichia coli No. 49、 Escherichia coli W3110、 E scherichia coli NY49、 Escherichia coli BL21 (DE3) ^ Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS, Escherichia coli HMS 174 (DE3)、 Escherichia coli HMS 174 (DE3) pLysS、 Serratia ficaria、 Serratia fonticola、 Serratia liq uefaciens、 Serratia marcescens、 Bacillus subtilis、 Bacillus amyloliquefa ciens、 Brevibacterium ammmoniagenes、 Brevibacterium immariophilum ATCC14068、 Brevibacterium saccharolyticumATCC 14066^ Coryneba cterium glutamicum ATCC13032、 Corynebacterium glutamicum ATC C14067、 Corynebacterium glutamicum ATCC13869、 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870、 Microbacterium ammoniaphilum AT CC15354、 Pseudomonas sp. D— 0110など力 列示される。
[0056] 本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス'ミエローマ細胞、ラ ット.ミエローマ細胞、マウス'ノ、イブリドーマ細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞で ある CHO細胞、 BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、 HBT563 7 (特開昭 63— 299)、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス'ミエローマ 細胞としては、 ps20、 NSOなど、ラット 'ミエローマ細胞としては YB2Z0など、ヒト胎 児腎臓細胞としては HEK293 (ATCC : CRL— 1573)など、ヒト白血病細胞としては BALL— 1など、アフリカミドリザル腎臓細胞としては COS— 1、 COS— 7、ヒト結腸癌 細胞株としては HCT— 15などが例示される。
[0057] 本明細書において、レトロウイルスの感染方法は、例えば、 Current Protocols i n Molecular Biology 前出（特に Units 9. 9— 9. 14)などに記載されるように、 当該分野において周知であり、例えば、トリプシナイズして ES細胞を単一細胞懸濁 物、 single— cell suspension)にした後、ウイノレス産生糸田胞、 virus— producing c ells) (パッケージング細胞株 = packaging cell lines)の培養上清と一緒に 1—2 時間共培養 (co— culture)することにより、十分量の感染細胞を得ることができる。
[0058] 本明細書にぉ 、て遺伝子発現 (たとえば、 mRNA発現、ポリペプチド発現)の「検 出」または「定量」は、例えば、 mRNAの測定および免疫学的測定方法を含む適切 な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブ ロット法、ドットプロット法または PCR法などが例示される。免疫学的測定方法としては 、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いる ELISA法、 RIA法、蛍光 抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法と しては、 ELISA法または RIA法などが例示される。アレイ（例えば、 DNAアレイ、プロ ティンアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。 DNAアレイにっ 、て は、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新 PCR法」）に広く概説され ている。プロテインアレイについては、 Nat Genet. 2002 Dec ; 32 Suppl: 526 —32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述にカ卩えて、 RT— PCR、 RACE法、 SSCP法、免疫沈降法、 two— hybridシステム、インビトロ翻訳などが挙 げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解 析実験法'中村祐輔ラボ'マニュアル、編集'中村祐輔 羊土社 (2002)などに記載さ れており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
[0059] 本明細書にお!、て遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現 」とは、その遺伝子など力 ンビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう 。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなど力 転写および翻訳されて、ポリペプチド の形態になることをいうが、転写されて mRNAが作製されることもまた発現の一形態 であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを 受けたものであり得る。
[0060] 本明細書にぉ 、て「発現量」とは、目的の細胞などにお!、て、ポリペプチドまたは m RNAが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いて ELI SA法、 RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などの免疫学的 測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク 質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、 PCR法などの分子 生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチド の mRNAレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測 定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本 発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたは mRNAレベルでの発現量が増加ある いは減少することを意味する。
[0061] 従って、本明細書にぉ 、て遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」ま たは「発現量」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよ りも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチド の発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド などの「発現」または「発現量」の「増加」とは、細胞内に遺伝子発現に関連する因子（ 例えば、発現されるべき遺伝子またはそれを調節する因子)を導入したときに、作用 させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は 、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」 とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増カロさせることをいう。 したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られな力つた場合にその 遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られて！/ヽた場 合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
[0062] 本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、特定の部 位または時期にお 、て他の部位または時期とは異なる (好ましくは高 、）レベルで発 現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位 (特異的部位）にのみ発現して もよぐそれ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現する とは、ある部位においてのみ発現することをいう。本発明によって生物または細胞に 導入される遺伝子は、特異的に発現するように改変されて ヽてもよ ヽ。
[0063] 本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子 (例えば、ポリペプチドまたはタ ンパク質）力 生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能 (例えば、転写 促進活性)を発揮する活性が包含される。例えば、コラーゲンがそのリガンドと相互作 用する場合、その生物学的活性は、結合体の形成または他の生物学的変化を包含 する。別の好ましい実施形態では、そのような生物学的活性は、遺伝子転位活性な どであり得る。遺伝子転位活性は、その目的とする遺伝子をコードする配列の移動を 任意の方法によって確認することによって判定され得る。例えば、ある因子が酵素で ある場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子 力 Sリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。その ような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる (Molecular Cloning, Current Protocols (本明細書において引用）などを参照
) o
[0064] (生化学'分子生物学）
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体 上に一定の順序に配列して 、る。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝 子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子 (たとえば、プロモーター）という。本 明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含 する。したがって、例えば、レコンビナーゼ遺伝子というときは、通常、レコンビナーゼ の構造遺伝子およびレコンビナーゼのプロモーターの両方を包含するが、本発明の 目的を達成することができる限り、構造遺伝子またはその改変体のみをさしてもよい。 本明細書において通常、遺伝子とは、調節領域、コード領域、ェキソン、イントロンを 含む。
[0065] 本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸
」ならびに Zまたは「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド
」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発 現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに zまたは「タ ンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者 であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。したが つて、通常、本明細書において、遺伝子は、 2本鎖 DNAのみならず、それを構成す るセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各 1本鎖 DNAを包含し、またその長さに何 ら制限されるものではない。従って、本発明の遺伝子には、特に言及しない限り、ヒト ゲノム DNAを含む 2本鎖 DNA、および cDNAを含む 1本鎖 DNA (センス鎖）、なら びにそのセンス鎖と相補的な配列を有する 1本鎖 DNA (アンチセンス鎖）、およびそ れらのフラグメントの!/、ずれもが含まれる。
[0066] 本明細書にぉ 、て配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、 2 以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある 2つの遺伝子 の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。 2種類の遺伝子 が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェント な条件下でのハイブリダィゼーシヨン法によって調べられ得る。 2つの遺伝子配列を 直接比較する場合、その遺伝子配列間で DNA配列が、代表的には少なくとも 50% 同一である場合、好ましくは少なくとも 70%同一である場合、より好ましくは少なくとも 80%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%または 99%同一である場合、それらの遺伝 子は相同性を有する。本明細書において、配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列な ど）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなし た場合の、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存 的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。 また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
[0067] 本明細書では、特に言及しない限り、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一 性および相同性の比較は、配列分析用ツールである BLASTにお 、てデフォルトパ ラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、 NCBIの BLAST 2. 2. 9 ( 2004. 5. 12 発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通 常は上記 BLASTを用い、デフォルトの条件でァラインした際の値をいう。ただし、パ ラメ一ターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。 複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする
[0068] 本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」 および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸 のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよぐ環状であって もよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよぐ改変されたァ ミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとァセンブ ルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたァミノ 酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフイド結合形成、ダリ コシル化、脂質化、ァセチル化、リン酸ィ匕または任意の他の操作もしくは改変（例え ば、標識成分との結合体化）を包含する。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1ま たは 2以上のアナログを含むポリペプチド (例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ぺ プチド様化合物（例えば、ぺプトイド)および当該分野において公知の他の改変が包 含される。タンパク質の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとるが、同様の機能 を有する限り、ポリペプチドの改変体であってもよい。特定のアミノ酸配列を有するポ リペプチドは、そのフラグメント、同族体、誘導体、改変体を含む。
[0069] 本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸 分子」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレ ォチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体 ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド 」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異な るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのような オリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、 2' O—メチルーリボヌクレオチド、ォ リゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合に変換された誘 導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N3，一 P5， ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中 のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴ ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C 5プロピ-ルゥラシルで置換され た誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C 5チアゾールゥラ シルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンが C 5 プロピ-ルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシ トシンがフエノキサジン修飾シトシン（phenoxazine— modified cytosine)で置換さ れた誘導体オリゴヌクレオチド、 DNA中のリボースが 2，—O プロピルリボースで置 換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが 2，ーメトキ シエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそう ではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様 に、その保存的に改変された改変体 (例えば、縮重コドン置換体)および相補配列を 包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、 1またはそれ以上の 選択された (または、すべての）コドンの 3番目の位置が混合塩基および Zまたはデ ォキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzerら、 Nucleic Acid Res. 19： 5081 (1991) ; Ohtsukaら、 Biol. Chem. 260 : 260 5 - 2608 (1985)； Rossoliniら、 Mol. Cell. Probes 8 : 91— 98 (1994) )。タンパ ク質などをコードする遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。
本明細書にぉ 、て「ヌクレオチド」は、糖部分がリン酸エステルになって 、るヌクレオ シドをいい、 DNA、 RNAなどを含み、天然のものでも非天然のものでもよい。ここで 、ヌクレオシドは、塩基と糖とが N グリコシド結合をしたィ匕合物をいう。「誘導体ヌクレ ォチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるが もとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドお よびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレ ォチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチォエート、ホスホノレアミデ ート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、 2— O—メチルリボヌクレオチド、 ペプチド 核酸（PNA)が含まれる力 これらに限定されない。 DNAは、 cDNA、ゲ ノム DNA、合成 DNAを含む。
[0071] 本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの 物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改 変体、付加改変体、欠失改変体、短縮 (truncated)改変体、対立遺伝子変異体な どが挙げられる。対立遺伝子 (allele)とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される 遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して 、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体 (homolog)」とは、ある種の中 で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性 (好ましくは、 60 %以上の相同性、より好ましくは、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95%以上の相 同性)を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載 力も明らかである。このように、本発明において使用される細胞は、改変された核酸ま たはポリペプチドを含んで 、てもよ!/、。
[0072] 1つの実施形態において、改変体は、天然に存在する対立遺伝子変異体、天然に 存在しない変異体、欠失、置換、付加、および Zまたは挿入がなされた変異体;コー ドされるポリペプチドの機能を実質的に変更しないポリヌクレオチド配列を意味し得る
[0073] 1つの実施形態において、これらアミノ酸配列の改変（変異等）は、天然において、 例えば変異、翻訳後の修飾等により生じることもあるが、天然由来の遺伝子 (例えば 本発明の具体例遺伝子)を利用して人為的にこれを行なうこともできる。
[0074] 1つの実施形態にお!、て、上記ポリペプチドは、対立遺伝子変異体、ホモログ、天 然の変異体で少なくとも 70%、好ましくは 80%、より好ましくは 95%、さらにより好まし くは 97%相同なものを含む。
[0075] 本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド 分子またはポリヌクレオチド分子にぉ 、て、比較の基準となるポリペプチドまたはポリ ヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有する力、あるいは有することが 予測されるアミノ酸または核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同 様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、あるトランス ポゾン配列であれば、そのトランスポゾン配列の特定の部分に対応するオルソログに おける同様の部分であり得る。
[0076] 本明細書にぉ 、て、「対応する」遺伝子 (例えば、核酸分子、ポリペプチドなど）とは 、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有す る力、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子 が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子 の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログあるいは種相同体であり得る。したが つて、マウスレコンビナーゼなどに対応する遺伝子は、他の動物においても見出すこ とができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同 定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応 する遺伝子の基準となる遺伝子 (例えば、マウスレコンビナーゼなど）の配列をクエリ 配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット、ィヌ、ネコ）の配列データベースを検 索することによって見出すことができる。このような対応する遺伝子は、ゲノムデータ ベースを利用すれば、当業者は容易に得ることができる。そのようなゲノム配列の入 手方法は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所に記載される 。本発明では、このような検索によって得られた配列も利用可能である。
[0077] 本明細書にぉ 、て「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（ 長さが n)に対して、 l〜n— 1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオ チドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例え ば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 2 0、 25、 30、 40、 50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙して いない整数で表される長さ (例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。また 、ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 20、 25、 30、 40、 50、 75、 100 およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙して!/、な!/、整数で表 される長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、 ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核 酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなぐ同じ機能 (例 えば、マウスレコンビナーゼなどの機能)を有する限り、上限または下限としての上述 の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下 10%)のものも含むことが意図さ れる。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表 現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響 を与えな ヽことが理解されるべきである。
[0078] 本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。
[0079] 本明細書にぉ 、て「生体」とは、生物学的な有機体を 、い、動物、植物、菌類、ウイ ルスなどを含むがそれらに限定されない。従って、本明細書では生体分子は、生体 カゝら抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子 であれば生体分子の定義に入る。したがって、コンビナトリアルケミストリで合成された 分子、医薬品として利用され得る低分子 (たとえば、低分子リガンドなど)もまた生体 への効果が意図され得る力ぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、 タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオ チド、ヌクレオチド、核酸（例えば、 cDNA、ゲノム DNAのような DNA、 mRNAのよう な RNAを含む）、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、脂質、低分子 (例えば、ホルモ ン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など)、これらの複合分子 (糖脂質、糖タン パク質、リポタンパク質など)などが包含されるがそれらに限定されない。生体分子に はまた、細胞への導入が企図される限り、細胞自体、組織の一部も包含され得る。通 常、生体分子は、核酸、タンパク質、脂質、糖、プロテオリピッド、リポプロテイン、糖タ ンパク質およびプロテオダリカンなどであり得る。好ましくは、生体分子は、核酸 (DN Aまたは RNA)またはタンパク質を含む。別の好ましい実施形態では、生体分子は、 核酸（例えば、ゲノム DNAまたは cDNA、あるいは PCRなどによって合成された DN A)である。他の好ましい実施形態では、生体分子はタンパク質であり得る。好ましく は、そのような生体分子は、ホルモンまたはサイト力インであり得る。
[0080] 本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法によ り、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および Zまたは性質を有する他の核 酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、 BLAST (Altschul et al . , J. Mol. Biol. 215 :403— 410 (1990) )、 FASTA (Pearson & Lipman, Pr oc. Natl. Acad. Sci. , USA 85 : 2444— 2448 (1988) )、 Smith and Water man法（Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147 : 195— 197 (1981) )、およ び Needleman and Wunsch法 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 :443— 453 (1970) )などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索と しては、ストリンジェントハイブリダィゼーシヨン、ゲノム DNAをナイロンメンブレン等に 貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ (マイクロアレイアツ セィ）、 PCRおよび in situノヽイブリダィゼーシヨンなどが挙げられるがそれらに限定 されない。本発明では、このような検索によって同定されたレコンビナーゼ配列なども また、使用され得る。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相 補性を有する DNA鎖のハイブリダィゼーシヨンを可能にし、そしてミスマッチを有意 に有する DNAのハイブリダィゼーシヨンを除外するように設計された条件を!、う。ハイ ブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムァ ミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダィゼーシヨンおよ び洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、 0. 0015M 塩化ナトリウム 、 0. 0015M クェン酸ナトリウム、 65〜68。C、または 0. 015M 塩ィ匕ナ卜リウム、 0. 0015M クェン酸ナトリウム、および 50% ホルムアミド、 42°Cである。このような高 度にストリンジェントな条件については、 Sambrook et al. , Molecular Cloning ： A Laboratory Manual^弟 2版、 Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, N, Y. 1989)；および Anderson et al.、 Nucleic Acid Hy bridization： a Practical approach^ IV、 IRL Press Limited (Oxford, Engl and) , Limited, Oxford, Englandを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな 条件 (例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の 変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なノ、イブリダィゼーシヨンおよび
Zまたはバックグラウンドのハイブリダィゼーシヨンを減少する目的で、ハイブリダィゼ ーシヨン緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、 0. 1%ゥシ血清アルブミン、 0. 1%ポリビュルピロリドン、 0. 1%ピロリン酸ナトリウム、 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウム（NaDodSOまたは SDS)、 Ficoll、 Denhardt溶液、
4
超音波処理されたサケ*** DNA (または別の非相補的 DNA)および硫酸デキストラ ンであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型 は、ハイブリダィゼーシヨン条件のストリンジエンシーに実質的に影響を与えることなく 変更され得る。ハイブリダィゼーシヨン実験は、通常、 pH6. 8〜7. 4で実施されるが； 代表的なイオン強度条件において、ハイブリダィゼーシヨンの速度は、ほとんど pH独 で teる。 Anderson et al. 、 Nucleic Acid Hybridization： a Practical Ap proach、第 4章、 IRL Press Limited (Oxford, England)を参照のこと。
[0082] DNA二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基 対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダィゼーシヨン条件は、当業者によって調整 され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性の DNAがハイブリッドを 形成するのを可能にする。完全に一致した DNA二重鎖の融解温度は、以下の式に よって概算され得る。
Tm (°C) =81. 5 + 16. 6 (log[Na+]) +0. 41 (%G + C) -600/N-O. 72 (%ホ ルムアミド）
ここで、 Nは、形成される二重鎖の長さであり、 [Na+]は、ノ、イブリダィゼーシヨン溶 液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％G + Cは、ノ、イブリツド 中の（グァニン +シトシン)塩基のパーセンテージである。不完全に一致したノヽイブリ ッドに関して、融解温度は、各 1%不一致 (ミスマッチ）に対して約 1°Cずつ減少する。
[0083] 本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェント な条件」下で生じ得るよりも高 、程度の塩基対不一致を有する DNA二重鎖が、形成 し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジヱントな条件」の例は、 0. 015M 塩 ィ匕ナ卜リクム、 0. 0015M クェン酸ナトリウム、 50〜65°C、または 0. 015M 塩ィ匕ナ トリウム、 0. 0015M クェン酸ナトリウム、および 20%ホルムアミド、 37〜50。Cである 。例として、 0. 015M ナトリウムイオン中、 50°Cの「中程度にストリンジェントな」条件 は、約 21%の不一致を許容する。
[0084] 本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条 件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される
。例えば、 0. 015M ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した 長い DNAの融解温度は、約 71°Cである。 65°C (同じイオン強度）での洗浄において 、これは、約 6%不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、 当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
[0085] 約 20ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、 1M NaClにおける 融解温度の適切な概算は、
Tm= (1つの A— T塩基につき 2°C) + (1つの G— C塩基対につき 4°C)
によって提供される。なお、 6 Xクェン酸ナトリウム塩 (SSC)におけるナトリウムイオン 濃度は、 1Mである（Suggsら、 Developmental Biology Using Purified Gen es、 683頁、 Brownおよび Fox (編）（1981)を参照のこと）。
[0086] レコンビナーゼもしくはレコンビナーゼ認識配列またはその改変体もしくはフラグメ ントなどのタンパク質をコードする天然の核酸および本発明で使用されるプロモータ 一配列などは、例えば、実施例において使用され、例示される核酸配列（例えば、配 列番号 1など）の全部もしくは部またはその改変体を含む PCRプライマーおよびハイ ブリダィゼーシヨンプローブを有する cDNAライブラリ一力 容易に分離される。好ま LV、レコンビナーゼもしくはレコンビナーゼ認識配列またはその改変体もしくはフラグ メントなどをコードする核酸は、本質的に 1%ゥシ血清アルブミン（BSA) ; 500mM リ ン酸ナトリウム（NaPO ) ; lmM EDTA;42°Cの温度で 7%SDSを含むハイブリダィ
4
ゼーシヨン緩衝液、および本質的に 2 X SSC (600mM NaCl; 60mM タエン酸ナ トリウム）； 50°Cの 0. 1% SDSを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェ ント条件下、さらに好ましくは本質的に 50°Cの温度での 1%ゥシ血清アルブミン (BS A) ; 500mM リン酸ナトリウム（NaPO ) ; 15%ホルムアミド； ImM EDTA; 7%
4
SDS を含むハイブリダィゼーシヨン緩衝液、および本質的に 50°Cの 1 X SSC (300 mM NaCl; 30mM クェン酸ナトリウム）； 1% SDSを含む洗浄緩衝液によって定 義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に 50°Cの温度での 1%ゥシ 血清アルブミン（BSA) ; 200mM リン酸ナトリウム（NaPO )； 15%ホルムアミド； lm
4
M EDTA; 7%SDSを含むハイブリダィゼーシヨン緩衝液、および本質的に 65°Cの 0. 5 X SSC (150mM NaCl; 15mM クェン酸ナトリウム）； 0. 1% SDSを含む洗 浄緩衝液によって定義される低ストリンジヱント条件下に、例えば、標的となる配列番 号 1などに示される核酸配列の 1つまたはその一部とハイブリダィズし得る。
[0087] 本明細書にぉ 、て「プローブ」とは、インビトロおよび Zまたはインビボなどのスクリ 一ユングなどの生物学的実験にぉ 、て用いられる、検索の対象となる物質を 、 、、 例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド などが挙げられるがそれに限定されない。
[0088] 通常プローブとして用いられる核酸分子としては、 目的とする遺伝子の核酸配列と 相同なまたは相補的な、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するも のが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも 9の連続するヌクレオ チド長の、より好ましくは少なくとも 10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは 少なくとも 11の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 12の連続するヌクレオチド長の 、少なくとも 13の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 14の連続するヌクレオチド長 の、少なくとも 15の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 20の連続するヌクレオチド 長の、少なくとも 25の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 30の連続するヌクレオチ ド長の、少なくとも 40の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 50の連続するヌクレオ チド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、 上述の配列に対して、少なくとも 70%相同な、より好ましくは、少なくとも 80%相同な 、さらに好ましくは、少なくとも 90%相同な、少なくとも 95%相同な核酸配列が含まれ る。このようなプローブを用いて本発明にお 、て使用され得るトランスポゾンを得ること ができる。
[0089] 本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される 高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成 されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子 (例えば、 DNAまたは RNAなど）が用いられ得る。
[0090] 遺伝子工学分野にお!、て通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、 目的 とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長の核酸 配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも 9の連 続するヌクレオチド長の、より好ましく 10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましく は 11の連続するヌクレオチド長の、 12の連続するヌクレオチド長の、 13の連続するヌ クレオチド長の、 14の連続するヌクレオチド長の、 15の連続するヌクレオチド長の、 1 6の連続するヌクレオチド長の、 17の連続するヌクレオチド長の、 18の連続するヌクレ ォチド長の、 19の連続するヌクレオチド長の、 20の連続するヌクレオチド長の、 25の 連続するヌクレオチド長の、 30の連続するヌクレオチド長の、 40の連続するヌクレオ チド長の、 50の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用 される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも 70%相同な、より好ましくは、 少なくとも 80%相同な、さらに好ましくは、 90%相同な、 95%相同な核酸配列が含ま れる。プライマーとして適切な配列は、合成 (増幅）が意図される配列の性質によって 変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することが できる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこな つてもよくコンピュータプログラム（例えば、 LASERGENE, PrimerSelect, DNAS tar)を用いて行ってもよ!ヽ。このようなプライマーを用いて本発明に用いるトランスポ ゾンを作製することができる。
[0091] 本明細書においてある核酸分子またはポリペプチドに「特異的に結合する因子」と は、その核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベル力 その核酸 分子またはポリペプチド以外の核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結 合レベルと同じ力またはそれよりも高い因子をいう。そのような因子としては、例えば、 対象が核酸分子の場合、対象となる核酸分子に対して相補的な配列を有する核酸 分子、対象となる核酸配列に対して結合するポリペプチド (例えば、転写因子など)な どが挙げられ、対象がポリペプチドの場合、抗体、単鎖抗体、レセプタ一一リガンドの 対のいずれか一方、酵素一基質のいずれか一方などが挙げられるがそれらに限定さ れない。本明細書において、このような特異的に結合する因子 (例えば、カルシウム に特異的に結合する因子、特定の遺伝子産物に対する抗体など）は、シグナル伝達 を測定する際に利用され得る。
[0092] 本明細書において「因子」（agent)としては、意図する目的を達成することができる 限りどのような物質または他の要素 (例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー )でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリ ゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸 (例え ば、 cDNA、ゲノム DNAのような DNA、 mRNAのような RNAを含む）、ポリサッカリド 、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子 (例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、 有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る 低分子 (例えば、低分子リガンドなど)など）、これらの複合分子が挙げられるがそれら に限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、その ポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を (例えば、 70%以上の配列同 一性)もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因 子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対 して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向さ れた抗体またはその誘導体あるいはその類似物 (例えば、単鎖抗体)、そのポリぺプ チドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そ のポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されな い。
[0093] 本明細書中で使用される「接触 (させる）」とは、化合物を、直接的または間接的の いずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接さ せることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液 などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリぺプ チドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマ イクロアレイ (例えば、遺伝子チップ)などに化合物を置くことが挙げられる。
[0094] あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力 の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合 部位のようなタンパク質構造にぉ 、て他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の 生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従つ て、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはその DNAコード配列のレ ベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る 。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書におい て開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応する DNAにおいて行わ れ得る。
[0095] 上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク 質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性 は、一般に当該分野で認められている（Kyte. Jおよび Doolittle, R. F. J. Mol. Bi ol. 157 (1) : 105- 132, 1982)。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の 二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子 (例えば、酵素、基質、レセプ ター、 DNA、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水 性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは:イソロイシン（ +4. 5)；バリン（+4. 2)；ロイシン（ + 3. 8)；フエ-ルァラニン（ + 2. 8)；システィン Zシスチン（ + 2. 5)；メチォニン（ + 1. 9)；ァラニン（ + 1. 8)；グリシン（一0. 4)；スレ ォニン（一 0. 7) ;セリン（一0. 8)；トリプトファン（一0. 9) ;チロシン（一1. 3) ;プロリン (— 1. 6) ;ヒスチジン（一3. 2)；グノレタミン酸（一 3. 5)；グノレタミン（一3. 5) ;ァスパラ ギン酸（一3. 5)；ァスパラギン（一3. 5) ;リジン（一3. 9)；およびアルギニン（一4. 5) )である。
[0096] あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依 然として同様の生物学的機能を有するタンパク質 (例えば、酵素活性において等価 なタンパク質)を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換に おいて、疎水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好まし ぐおよび ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなァミノ 酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
[0097] 親水性指数もまたアミノ酸配列の改変の際に考慮することができる。米国特許第 4, 554, 101号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられ ている：アルギニン（ + 3. 0)；リジン（ + 3. 0)；ァスパラギン酸（ + 3. 0± 1)；グルタミ ン酸（ + 3. 0± 1)；セリン（ + 0. 3)；ァスパラギン（ + 0. 2) ;グルタミン（ + 0. 2) ;グリ シン（0)；スレオニン（一0. 4)；プロリン（一0. 5± 1)；ァラニン（一0. 5)；ヒスチジン（ —0. 5)；システィン（一1. 0)；メチォニン（一1. 3)；バリン（一 1. 5)；ロイシン（一1. 8 ) ;イソロイシン（一 1. 8) ;チロシン（一2. 3)；フエ-ルァラニン（一2. 5) ;およびトリプ トフアン（一 3. 4)。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価 体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換にお いて、親水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好ましく 、および ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。
[0098] (キット）
本明細書において「キット」とは、通常 2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部 分 (例えば、試薬、粒子など）が提供されるュ ノトをいう。本発明では、例えば、遺伝 子カセットなどがキット形態で製品として供給されるか、あるいは、細胞などがライブラ リーとして提供される。細胞がキットとして提供される場合は、凍結などの保存方法に より保存された状態で提供され得る。混合されて提供されるべきでなぐ使用直前に 混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキット の形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分 (例えば、試薬、 粒子など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えて 、ることが有利であ る。このような説明書は、どのような媒体であってもよぐ例えば、そのような媒体として は、紙媒体、伝送媒体、記録媒体などが挙げられるがそれらに限定されない。伝送 媒体としては、例えば、インターネット、イントラネット、ェクストラネット、 LANなどが挙 げられるがそれらに限定されない。記録媒体としては、 CD— ROM、 CD-R,フレキ シブルディスク、 DVD— ROM、 MD、ミニディスク、 MO、メモリースティックなどが挙 げられるがそれらに限定されない。
[0099] (トランスジエニック生物）
トランスジェニックマウスを作製するための一般的な技術は、例えば、国際公開 WO 01/13150 (Ludwig Inst. Cancer Res. )に記載されている。米国特許第 4, 87 3, 191号 (Wagner et al . )は、哺乳動物接合体への DNAのマイクロインジェクシ ヨンによって得られた、外因性 DNAを有する哺乳動物を教示している。これらの技術 において、レコンビナーゼを利用した本発明を応用することができる。
[0100] このほかにもまた、トランスジエニック生物を作り出すための様々な方法は、例えば、 M. Markkulaら、 Rev. Reprod. , 1, 97—106 (1996)； R. T. Wallら J. Dairy S ci. , 80, 2213- 2224 (1997)； J. C. Dalton、ら、 Adv. Exp. Med. Biol. , 411 , 419— 428 (1997)；および H.： Lubonら、 Transfus. Med. Rev. , 10, 131— 1 43 (1996)などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの文献の各々は、本明 細書において参考として援用される。
[0101] そのような中、最近遺伝子機能の解析を目的として、胚性幹 (ES)細胞の相同組換 えを介したトランスジエニック (ノックアウト、ノックインを含む)動物の解析が重要な手 段となってきている。
[0102] 高等生物では、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いる陽性選択および HSVの チミジンキナーゼ遺伝子またはジフテリア毒素遺伝子を用いる陰性選択により組換え 体の効率的な選別が行われて 、る。 PCRまたはサザンプロット法により相同組換え 体の選択が行われる。すなわち、標的遺伝子の一部を陽性選択用のネオマイシン耐 性遺伝子等で置換し、その末端に陰性選択用の HSVTK遺伝子等を連結したター ゲティングベクターを作成し、エレクト口ポレーシヨンにより ES細胞に導入し、 G418お よびガンシクロビルの存在下で選択して、生じたコロニーを単離し、さらに PCRまたは サザンブロットにより相同組換え体を選択する。
[0103] このように、内在する標的遺伝子を置換または破壊して、機能が喪失した力または 変更された変異を有するトランスジエニック (標的遺伝子組換え)マウスを作製する方 法は、標的とした遺伝子だけに変異が導入されるので、その遺伝子機能の解析に有 用である。
[0104] 所望の相同組換え体を選択した後、得られた組換え ES細胞を胚盤注入法または 集合キメラ法により正常な胚と混合して ES細胞と宿主胚とのキメラマウスを作製する。 胚盤注入法では、 ES細胞を胚盤胞にガラスピペットで注入する。集合キメラ法では、 ES細胞の塊と透明帯を除去した 8細胞期の胚とを接着させる。 ES細胞を導入した胚 盤胞を偽妊娠させた代理母の子宮に移植してキメラマウスを得る。 ES細胞は、全能 性を有するので、生体内では、生殖細胞を含め、あらゆる種類の細胞に分ィ匕すること ができる。 ES細胞由来の生殖細胞を有するキメラマウスと正常マウスを交配させると ES細胞の染色体をへテロに有するマウスが得られ、このマウス同士を交配すると ES 細胞の改変染色体をホモに有するトランスジヱニックマウスが得られる。得られたキメ ラマウスから改変染色体をホモに有するトランスジエニックマウスを得るには、雄性キメ ラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、 Fl世代のへテロ接合体マウスを産出させ 、生まれた雄性および雌性のへテロ接合体マウスを交配して、 F2世代のホモ接合体 マウスを選択する。 F1および F2の各世代において所望の遺伝子変異が導入されて いるか否かは、組換え ES細胞のアツセィと同様に、サザンブロッテイング、 PCR、塩 基配列の解読など当該分野において慣用される方法を用いて分析され得る。
[0105] 本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において 用いられる、 Cre酵素の一過的発現、染色体上での DNAマッピングなどは、細胞ェ 学別冊実験プロトコールシリーズ「FISH実験プロトコール ヒト 'ゲノム解析力 染色 体 ·遺伝子診断まで」松原謙一、吉川 寛 監修 秀潤社 (東京)などに記載されるよ うに、当該分野において周知である。
[0106] そのため、多様な遺伝子機能を選択的に解析することができないという問題を克服 する次世代技術として、 Creレコンビナーゼの細胞種特異的発現と Cre— loxPの部 位特異的組み換えを併用する技術が注目されて 、る。 Cre— loxPを用いるトランスジ エニックマウスは、標的遺伝子の発現を阻害しな ヽ位置にネオマイシン耐性遺伝子を 導入し、後に削除するェキソンをはさむようにして loxP配列を挿入したターゲティング ベクターを ES細胞に導入し、その後相同組換え体を単離する。この単離したクロー ンカゝらキメラマウスを得、遺伝子改変マウスが作製される。次に、大腸菌の P1ファー ジ由来の部位特異的組換え酵素 Creを組織特異的に発現するトランスジェニックマウ スとこのマウスを交配させると、 Creを発現する組織中でのみ遺伝子が破壊される（こ こでは、 Creは、 loxP配列（約 34bp)を特異的に認識して、 2つの loxP配列にはさま れた配列で組換えを起こさせ、これが破壊される)。臓器特異的なプロモーターに連 結した Cre遺伝子を有するトランスジエニックマウスと交配させるカゝ、または Cre遺伝 子を有するウィルスベクターを使用して、成体で Creを発現させることができる。
[0107] 本明細書にぉ 、て、「レコンビナーゼ」とは、組み換え酵素とも!、 、、 DNA上の特 定配列（例えば、 Creレコンビナーゼの場合、 loxPという配列）を認識し、その部分の 組み換えを促進させる酵素をいう。レコンビナーゼとしては、例えば、 Creレコンビナ ーゼなどを挙げることができる。このほかに、使用され得るレコンビナーゼとしては、例 えば、、 ϋ31 (ACCESSION NC 001978 ;GI :40807285)を挙げ、ること力 Sでき るがこれらに限定されない。
[0108] 本明細書において「レコンビナーゼ認識配列」とは、少なくとも 1つのレコンビナーゼ によって認識される配列をいい、そのような配列は、レコンビナーゼに通常特異的で ある。そのような認識配列は、以下のようにして決定することができる：サザンハイプリ ダイゼーシヨン解析、 PCR産物の DNA塩基配列などが挙げられる。そのような認識 配列としては、例えば、 ΙοχΡ配列、 FRT部位、 attB配列， attP配列および res部位 配列を挙げることができるがそれらに限定されない。そのような認識配列の具体的配 列は以下の通りである：
LoxP配列
FRT部位 attB配列
rCGAGT
CTGGCACCCGCA (配列番号 5)
attP配列
TTGGGGCACG (配列番号 6)。
[0109] このようなレコンビナーゼ認識配列は、上記配列のすべてを含んでいてもよぐレコ ンビナーゼに認識される限り、これらの配列に対して、 1または複数の置換、付加およ び Zまたは欠失を含んでいても良い。あるいは、レコンビナーゼと一定の条件下で任 意の配列のライブラリーを用いてスクリーニングすることによって別のレコンビナーゼ 認識配列を作製することも可能である。
[0110] 本明細書において「逆方向」とは、レコンビナーゼ認識配列について用いられるとき 、あるレコンビナーゼ認識配列が二本鎖 DNAの一方に配置されているとき、他方の 鎖にレコンビナーゼ認識配列が配置されていることをいう。好ましくは、実質的に相同 な配列が、一方の鎖に 5'から 3'向きに、他方の鎖に 5'から 3'向きに配置されている 。より好ましくは、同一の配列が一方の鎖に 5'から 3'向きに、他方の鎖に 5'から 3' 向きに配置されている。
[0111] 従来、レコンビナーゼ認識配列は、レコンビナーゼの活性を発揮させ、その結果、 組み換えが起こるためには、同一方向に 2つ以上必要であると考えられてきた力 本 発明により、逆方向に複数または 1つのみのレコンビナーゼ認識配列を使用すること によって、所望の染色体の欠失を起こすことができることが見出された。特に、染色体 の欠失が起こった後も、細胞が再生能力を有することは、予想外の発見であった。
[0112] 特定の遺伝子を解析する方法としてジーントラップ (遺伝子トラップ)法が注目され ている。ジーントラップ法では、プロモーターを有しないレポーター遺伝子が細胞に 導入され、その遺伝子が偶発的にゲノム上に挿入されると、レポーター遺伝子が発 現することを利用して、新規な遺伝子を単離 (トラップ)される。ジーントラップ法は、マ ウス初期胚操作法，胚性幹細胞培養法，相同組換えによる遺伝子ターゲティング法 に基づぐ効率的な挿入変異と未知遺伝子同定のための方法である（Stanford W L. , et al. , Nature Genetics 2 : 756— 768 (2001) )。ジーントラップ法では、 遺伝子の導入ならびに挿入変異体の選択およびその表現型解析が比較的に容易 である。
[0113] ジーントラップ法では、例えば、スプライシング Zァクセプター配列とポリ A付加シグ ナルとの間に lacZと neoとの融合遺伝子である β—geoを連結したジーントラップべ クタ一を ES細胞に導入し、 G418で選択すると、 ES細胞で発現している遺伝子を偶 然にトラップしたクローンだけが選択される。
[0114] このようにして得られたクローン力 キメラ胚を作製すると、トラップした遺伝子の発 現パターンにより、さまざまな X— galの染色パターンを示す。このようにして、ジーント ラップ法では、未知の遺伝子が単離され、その遺伝子発現パターンが解析され、また その遺伝子が破壊される。
[0115] 本発明においては、所望のトランスジエニック生物をプレスクリーニングし得る。プレ スクリーニングの方法としては、例えばジーントラップ法を用いることができる（Zambr owicz et al . ； Nature, 392 : 608 - 611 (1998)； Gossler et al. ； Science, 2 44 : 463 -465 (1989)； Skal lnes, WC. et al. ； Genes Dev. 6 : 903 - 918 (1 992)； Friedrich, G. et al. ； Genes Dev. 5 : 1513— 1523 (1991) )。このように 、プレスクリーニングを行うことにより遺伝子機能の解明に有望な.トランスジエニック 生物を予め選抜してその後 2世代以上の交配あるいはその他適宜の手段により、 1 対の染色体の両遺伝子が変異したトランスジエニック生物を得ることができる。
[0116] 本発明によれば、染色体レベルで除去導入することが可能である。本発明によれ ば、本発明の新規な生物またはその一部は、染色体レベルでの遺伝子機能解明の ための便利なモデルシステムを提供する。本発明のこの実施態様は、生きた動物モ デルにぉ 、て遺伝性疾患の研究のための疾患モデルシステムを提供し得る。該シス テムにおいて、動物モデルにおいて対象となり得る疾患遺伝子としては、ヒト疾患原 因遺伝子、または生物におけるその相同遺伝子が cDNAの遺伝子全長、 cDNAの 遺伝子断片、ゲノム DNAの遺伝子全長、あるいはゲノム DNAの遺伝子断片である ものが挙げられる。疾患原因遺伝子は、生物に導入して、得られたトランスジエニック 生物をヒト疾患モデル動物として研究に供し得るものであることが好ましぐ特に限定 されな 、が、ヒト疾患原因遺伝子であるのが好ま 、。
[0117] 本明細書において「マーカー遺伝子」とは、形質転換が行われた力どうかを視認な どの明示的な方法によって確認させることができるような遺伝子産物をコードする任 意の遺伝子をいう。そのようなマーカー遺伝子としては、グリーン蛍光タンパク質 (GF P)、イェロー蛍光タンパク質 (YFP)、シアン蛍光タンパク質（CFP)やレッド蛍光タン ノ ク質 (dsRED)等を挙げることができるがそれらに限定されない。グリーン蛍光タン ノ ク質の配列は、例えば、配列番号 7に示した配列が挙げられる。
[0118] 本明細書において「選択配列」とは、その配列を含む核酸を細胞に導入したときに 、導入していない細胞と導入した細胞との選別を可能にする配列をいい、例えば、抗 生物質耐性付与遺伝子などを挙げることができる。そのような選択配列の例としては 、例えば、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、ピューロマイシン抵抗性付与遺伝子、ネ ォマイシン抵抗性付与遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性付与遺伝子、ブラストサイジ ン抵抗性付与遺伝子、ゼォシン抵抗性付与遺伝子、 HAT抵抗性付与遺伝子、ジフ テリアトキシン抵抗性付与遺伝子およびフルォロウラシル抵抗性付与遺伝子を挙げ ることができるがそれらに限定されな 、。ピューロマイシン抵抗性付与遺伝子をコード する遺伝子としては、例えば、配列番号 9を挙げることができる。 [0119] 本明細書にぉ 、て「IRES配列」または「内部リボソーム進入部位 (internal ribos omal entry site)配列」とは、交換可能に用いられ、ポリシストロンとも呼ばれ、 CA P構造費依存的な翻訳機構に介在する配列をいう。そのような IRES配列は、種々知 られており、データベース化もされている。例えば、以下
http://www.rangueil.inserm.fr/IRESdatabase/
を参照のこと。
[0120] 本明細書において「CAG配列」とは、 CAGが繰り返される配列をいい、通常 10〜3 0に反復が見られる。好ましくは、コードする配列にグルタミンの反復があることが好ま しい。 CAGの繰り返し配列を持つ mRNAを認識するタンパク質が存在し、このタンパ ク質は、 CAGの繰り返しが多ければ多いほど、強く mRNAに結合し、他のタンパク質 の発現を調節すると考えられて 、る。
[0121] 本発明では、本発明のトランスジヱニック生物を臓器提供用ドナーとして使用するこ とができる。例えば、ヒトへの異種間臓器移植のドナーとして考えられる臓器として、 具体的には神経細胞、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、角膜、皮膚などが挙げられる。 この場合、導入される遺伝子は、例えば異種間での臓器移植に拒絶反応を低減する 機能を有する遺伝子あるいは生着率の上昇を期待し得る機能を有する遺伝子が好 ましい。
[0122] トランスジエニック生物の作製についてはまた、米国特許第 5, 464, 764号公報； 米国特許第 5, 487, 992号公報;米国特許第 5, 627, 059号公報;特開 2001— 5 4337号公報； Gossler, A. et al. (1989) , Science 244, 463— 465 ;Wurst, W. et al. (1995) , Genetics 139, 889 - 899 ;Zambrowicz, B. P. et al. (1 998) , Nature 392, 608— 611Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, 8932 - 8935, 1989 ; Nature, Vol. 342, 435—438, 1989 ;村松正實、山本雅編集、 『実験医学別冊 新訂 遺伝子工学ハンドブック 改訂第 3版』（1999年、羊土社発 行）中特に 239から 256頁;相沢慎一（1995)実験医学別冊「ジーンターゲティング ES細胞を用いた変異マウスの作製」などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0123] 本明細書において、「ノックアウト」とは、遺伝子について言及されるとき、その遺伝 子を破壊 (欠損)または機能不全にさせることをいう。従って、ノックアウトの概念は、ト ランスジエニックの中に含まれる。
[0124] 本明細書にぉ 、て、「ノックアウト生物」とは、ある遺伝子がノックアウトされた生物（ 例えば、マウス）をいう。従って、ノックアウト生物の概念は、トランスジエニック生物の 中に含まれる。
[0125] 本明細書にぉ 、てトランスジエニックの対象とされる「生物」は、トランスポゾンが作 用し、そのような系が機能し得る任意の生物が含まれる。このような生物には、動物、 植物、細菌などが含まれるがそれらに限定されない。
[0126] 本明細書において、「動物」は、核酸配列 (好ましくは遺伝子をコードする外来配列 )の導入を目的とすることができるものであればどのような動物であってもよい。従って 、動物には、脊椎動物および無脊椎動物が包含される。動物としては、哺乳動物 (例 えば、マウス、ィヌ、ネコ、ラット、サル、ブタ、ゥシ、ヒッジ、ゥサギ、ィルカ、クジラ、ャ ギ、ゥマなど）、鳥類 (例えば、 -ヮトリ、ゥズラなど）、両生類 (例えば、力エルなど）、 爬虫類、昆虫（例えば、ショウジヨウバエなど)などが挙げられる。好ましくは、動物は、 哺乳動物であり得、より好ましくは、ノックアウトを作製することが容易な動物（例えば、 マウス)であり得る。別の好ましい形態では、動物は、ヒトのモデル動物として適切で あることが判明している動物（例えば、サル)であり得る。ある実施形態では、動物は、 非ヒト動物または非ヒト哺乳動物であり得るが、それに限定されない。例えば、ブタ、 サル'ゥシ 'ゥマ ·ャギ、ヒッジ、ネコ、ィヌ、ゥサギ、マウス、ラット、またはハムスター等 であり、より好ましくは、マウスまたはラットである。ここで本発明の生物には、特に言 及しない限り、哺乳動物個体だけでなく個体の一部および個体の有する臓器、器官 も包含される。これらはヒト疾患モデルとして、また臓器移植用ドナーとして有用であ る。
[0127] 上述の生物において、遺伝子の導入技術はマイクロインジェクション、核酸フラグメ ントと陽イオン脂質小胞体または DNA凝縮試薬との組合せ；ならびに核酸フラグメン トをウィルスベクターに導入し、そしてこのウィルスベクターを細胞と接触させること、 ならびに粒子ボンバードメントおよびエレクト口ポレーシヨン力も成る群より選ばれる方 法を含む。
[0128] 本明細書において使用され得るウィルスベクターは、レンチウィルスベクター、レト ロウィルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルぺスウィルスまたはアデノ関連ウイ ルスベクター力もなる群より選ばれるものが挙げられるがそれらに限定されない。
[0129] 本明細書にぉ 、て「レトロウイルス」とは、 RNAの形で遺伝情報を有し、逆転写酵素 によって RNAの情報から DNAを合成するウィルスをいう。したがって、「レトロウィル スベクター」とは、レトロウイルスを遺伝子の担 、手 (ベクター）として使用した形態を ヽ う。本発明において使用される「レトロウイルスベクター」としては、例えば、 Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV)、 Murine Stem Cell Virus (MSCV) にもとづいたレトロウイルス型発現ベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない
[0130] 好ましくは、レトロウイルスベクターとしては、 pGen―、 pMSCVなどが挙げられるが それらに限定されない。
[0131] 本明細書において使用される場合「ジーントラップ (法)」とは、 目的の細胞に、例え ば、プロモーターを欠いたレポーター遺伝子を導入し、染色体上で活性化されてい るプロモーターの下流に挿入された場合にのみレポーター活性が検出できること利 用した遺伝子の同定方法をいう。このようなジーントラップは、「ジーントラップベクタ 一」を、真核生物の宿主染色体中に導入して、宿主遺伝子を破壊することにより達成 される。レポーター遺伝子が挿入された遺伝子は、レポーターとの複合タンパク質を 発現するため、そのタンパク質をモニターすることによって遺伝子を同定することが可 能である。したがって、相同組換えと同様に本来の遺伝子座にレポーター遺伝子が 組み込まれるため、転写調節が完全なレポーター系を作ることができる。この手法を 用いることによって、遺伝子破壊によって変異体を単離する手法では、得られなかつ た遺伝子の同定を行うことができる。したがって、本発明では、このようなジーントラッ プ法もまた利用することができる。
[0132] 本明細書において「ジーントラップベクター」とは、真核生物遺伝子の mRNAが成 熟 mRNAとなる過程にぉ 、てスプライシングを受ける現象を利用して、遺伝子中へ 挿入されたベクターを選択するためのベクターである。ジーントラップベクターとして は、（1)プロモーターを有さないレポーター遺伝子のコード領域、およびスプライスァ クセプター部位を含む DNA配列を含むベクター、または（2)プロモーターを有する レポーター遺伝子のコード領域、およびスプライスドナー部位を含む DNA配列を含 むベクター、ならびに（3)これら（1)および（2)の両方の DNA配列を含むベクターが 挙げられるがこれらに限定されな!ヽ。
[0133] 上述のようなスプライスァクセプター配列を含むジーントラップベクターは、必要に 応じて、ポリ A付加シグナルを含んでもよい。スプライスドナー配列を含むジーントラッ プベクターは、必要に応じて、ェンノヽンサ一領域、および Zまたは mRNA不安定ィ匕 領域を含んでもよい。ポリ A付加シグナルとしては、「AATAAA」が挙げられる力 こ れに限定されない。
[0134] 本発明において使用するプロモーターとしては、 MC1プロモーター、 RNA pol I Iプロモーターなどが挙げられるがそれらに限定されない。
[0135] 本発明において使用されるェンハンサ一としては、ポリオ一マウィルスェンハンサ 一（PYF441)などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0136] 本発明において使用されるスプライスドナー配列としては、マウス hprt遺伝子ェキ ソン 8スプライスドナーが挙げられるがそれらに限定されない。
[0137] 本発明において使用されるスプライスァクセプター配列としては、ヒト bcl— 2遺伝子 ェキソン 3スプライスァクセプターが挙げられるがそれらに限定されない。
[0138] 本明細書にぉ 、て使用される「レポーター」分子または「レポーター」遺伝子とは、 細胞内において遺伝子発現の指標として使用することのできる分子 (例えば、ポリべ プチド)または遺伝子をいう。そのような分子としては、公知のレポータータンパク質を 用いることができ、例えば、クロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ（CAT)、 βーグルクロ-ダーゼ（GUS)、 β D—ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グリーン 蛍光タンパク質 (GFP)、またはェクオリンなどが挙げられる。ここで、遺伝子の導入方 法自体は、当該分野にお!、て公知の技術をもち!/、て所望の材料を用いて行うことが できる。そのような場合、例えば、 目的とする胚性幹細胞に、例えば、プロモーターを 欠いたレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光遺伝子、 β ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ)、アルカリホスファターゼ遺伝子、 Creレコンビナー ゼ遺伝子など）を導入し、染色体上で活性ィ匕されているプロモーターの下流に挿入さ れた場合にのみレポーター活性が検出する。使用されるベクターはこのレポーター 遺伝子のほか、選択マーカー遺伝子 (例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマ イシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、レスキューマーカー遺伝子 (例え ば、アンピシリン耐性遺伝子 +コリシン E1複製開始起点）などを含んでいてもよい。こ こで、選択マーカー遺伝子は、ベクターが入った宿主を選択するために使用される。 レスキューマーカー遺伝子は、ベクターをレスキューするために使用される （Joyner , A. L. ed. Gene Targeting, 2n edition (Oxford University Press, 20 00)を参照のこと)。上述のような技術を用いることによって、胚性幹細胞が生成され る。この改変胚性幹細胞は、遺伝子がトラップされている。ここで、トラップされている とは、ゲノムへのトラップベクターの挿入により内在性遺伝子が破壊され、同時にその ベクターによって破壊された遺伝子がマーキングされた状態を 、う。
[0139] 特定の配列を有するオリゴヌクレオチドの調製は、当該分野において周知の技術を 用いて行うことができ、例えば、 Joyner, A. L. ed. "Gene Targeting, 2nd editio n" (Oxford University Press, 2000)に記載される方法で行うことができる。オリ ゴヌクレオチドは、必要に応じて、蛍光、放射能などで標識することができる。そのよう な標識方法は当該分野において周知であり、本明細書において引用される文献に 記載されている。
[0140] (スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、 目的とするある特定の性質をもつ生物ま たは物質などの標的を、特定の操作 Z評価方法で多数を含む集団の中から選抜す ることをいう。スクリーニングのために、本発明の方法または生物を使用することがで きる。本発明では、種々のトランスジエニック生物が作製されることから、任意の核酸 分子およびその機能調節因子をスクリーニングすることができる。
[0141] 本発明では、任意の核酸分子を本発明の核酸分子、方法またはシステムを利用す ることによってスクリーニングすることができる。本発明はまた、そのようなスクリーニン グによって同定されたィ匕学物質またはその組み合わせを包含することが企図される。
[0142] 本発明のシステムは種々の分野に応用できる。例えば、生命体の成長、維持、調 節および発育に関わる遺伝子の同定、単離および特性を決定することができる (例え は、 Kaiserら、 1995「Eukervotic transposable, elements as tools to stu dy gene structure and functionj Mobile Genetic Elements, IRL Pre ss, pp. 69- 100)；生命体の成長、維持、調節および発育を調節する転写調節配 列の同定、単離およびを同定することができる（例えば、 Andersonら、 1996, Mol. Mar. Biol. Biotech. , 5, 105— 113)。
[0143] (発明を実施するために好まし!/、形態）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であ り、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべ きである。
[0144] (遺伝子カセット）
1つの局面において、本発明は、レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2 つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子力 セットを提供する。この遺伝子カセットは、レコンビナーゼを用いた組み換え系におい て使用することができることが明らかになった。特に、レコンビナーゼを用いて、再生 可能な (すなわち、次世代を生産することができる）細胞 (特に、幹細胞)から、所望の 染色体を除去したものを作製することができることは予想されていな力つたことから、 本願発明は、予想外に優れた効果を提供することになる。
[0145] 本発明の遺伝子カセットでは、従来の方法とは異なり、レコンビナーゼ認識配列を 2 つ同じ向きに配置するのではなぐ 2つの逆向きまたは 1つのみを配置することによつ て、予想外に、レコンビナーゼを用いて、再生可能な (すなわち、次世代を生産する ことができる)細胞 (特に、幹細胞)から、所望の染色体を除去したものを作製すること ができることが見出された。従来の方法では、再生可能でない細胞が作製され、ある いは、所望の染色体除去の効率が良くなかったことから、本発明な顕著な効果を有 するといえる。これまでの染色体除去は、 Hprt (—）細胞の染色体に Hprt遺伝子等 を導入し 6TG (6 チォグァニン)で薬剤選択することで、 Hprt導入染色体が突然変 異により欠損した細胞をスクリーニングする方法がとられていた。この方法では、染色 体除去は 10_6以下の確率でし力観察されない。一方本法では、染色体除去カセット を導入することで突然変異の 100倍以上の高率で染色体除去を行うことができる。ま た、複数の染色体を除去することが容易に可能である点でも、本発明の方法は優れ ている。
[0146] 本発明において使用されるレコンビナーゼ認識配列は、使用されるレコンビナーゼ を認識することができる限り、任意の配列を使用することができ、レコンビナーゼ技術 の当業者は、そのようなレコンビナーゼ認識配列を容易に設計することができる。本 明細書においては、そのようなレコンビナーゼ認識配列が、レコンビナーゼ認識配列 であるかどうかは、レコンビナーゼ酵素の処理により、 2つのレコンビナーゼ配列間で DNAの組み換えが起こり結果として、レコンビナーゼ配列が一つに統合され、レコン ピナーゼ配列間の DNAが欠損、または結合することによって容易に同定することが 可能である。そのような配列としては、たとえば、 ΙοχΡ配列、 FRT部位、 attB配列， at tP配列および res部位配列などを挙げることができるがそれらに限定されない。このよ うなレコンビナーゼ認識配列は、配列番号 1に記載される配列 (ΙοχΡ配列）を含む。
[0147] 本発明において使用されマーカー遺伝子は、細胞中に遺伝子導入された場合に その細胞の識別を可能にすることができる遺伝子であれば、どのようなものであっても 使用することができる。このようなマーカー遺伝子としては、例えば、 GFP遺伝子、（E GFP遺伝子も含む）、 CFP遺伝子、 YFP遺伝子、 dsRED遺伝子などを挙げることが できる。
[0148] 好ま 、実施形態では、本発明の遺伝子カセットは、選択配列をさらに有して ヽて も良い。本発明において使用される選択配列としては、例えば、遺伝子導入した後に 、特定の条件下で、導入された細胞を選別することができるような配列である限り、ど のような配列を使用しても良いが、例えば、抗生物質耐性付与遺伝子 (例えば、チミ ジンキナーゼ (TK)遺伝子、ピューロマイシン抵抗性付与遺伝子、ネオマイシン抵抗 性付与遺伝子、ネオマイシン抵抗性付与遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性付与遺伝 子、ブラストサイジン抵抗性付与遺伝子、ゼォシン抵抗性付与遺伝子、ジフテリアトキ シン抵抗性付与遺伝子、フルォロウラシル抵抗性付与遺伝子など）、 HAT抵抗性付 与遺伝子などを挙げることができるがそれらに限定されない。
[0149] 好ま 、実施形態では、本発明の遺伝子カセットは、 IRES配列（配列番号 2)を含 み得る。本発明において使用される IRES配列は、 IRES活性を有する配列であれば 、どのような配列を用いても良い。このような IRES配列は、配列番号 2に記載される 配列またはその機能的等価物 (例えば、 1または数個の置換、付加または欠失を含 む）を含む。
[0150] 本発明の好ましい実施形態において、本発明の遺伝子カセットは、さらに、 CAG配 列（配列番号 3)を含み得る。本発明において使用される CAG配列は、 CAG配列が 通常を有する活性を有する配列であれば、どのような配列を用いても良い。このような CAG配列には、配列番号 3に記載される配列またはその機能的等価物（例えば、 1 または数個の置換、付加または欠失を含む)を含まれる。
[0151] 従って、本発明の好ましい実施形態では、本発明の遺伝子カセットにおいて、レコ ンビナーゼ認識配列は、逆方向に 2つ含まれ、該レコンビナーゼ認識配列の間に、 C AG、マーカー配列、 IRES配列、および選択配列を含む。別の好ましい実施形態で は、 Pgk、選択配列、（IRES配列）、マーカー配列を含む。前者はランダムに導入す る際に、後者は相同組み換えで標的染色体に導入する際に用いた配列である。後 者は、高濃度 G418による CECホモ ES細胞を選択する際に用いられ得る。
[0152] (所望の染色体を除去するための糸且成物）
別の局面において、本発明は、レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ 含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセ ットを含む、所望の染色体または染色体群を除去するための組成物を提供する。ここ に含まれる遺伝子カセットは、上記 (遺伝子カセット）に記載された任意の形態を採用 することができることが理解される。
[0153] ここで、所望の染色体を除去する対象細胞としては、任意の細胞が挙げられる。そ のような細胞としては、例えば、 ES細胞、 EG細胞、糸且織幹細胞などの幹細胞、体細 胞、または、体細胞と幹細胞との融合細胞（国際公開 WO03Z027278号を参照）、 再プログラム化された幹細胞（国際公開 WO03Z027277号、国際公開 WO03Z0 27278号などを参照）、などを挙げることができる。
[0154] 除去され得る染色体としては、任意の染色体を挙げることができ、好ましくは、 X染 色体、 Y染色体以外の任意の常染色体が対象であり得る。そのような染色体例として は、例えば、 46本の染色体を有するヒトでは、 1番染色体〜 22番染色体、特に 5番染 色体、 9番染色体、 11番染色体、 13番染色体、 18番染色体、 21番染色体等を挙げ ることができる。マウスでは、 1番染色体 19番染色体、特に 2、 7および 11番染色体等 を挙げることができる。特に、 MHCまたは HLAを有する染色体 (それぞれ、マウスの 17番染色体、およびヒトの 6番染色体)を除去することが好ましい。除去された細胞に おいて、免疫拒絶反応を取り除くことができる力もである。
[0155] 染色体は、染色体は二つの染色分体力 なる。染色分体同士が接合する場所はセ ントロメァという。核***のときにはここに微小管が結合し、両極へ牽引する。セント口 メァを挟んで長い側を長腕、短い側を短腕という。染色体の末端部はテロメァと呼ば れる特有の構造がある。有糸***の最初のステージでは、クロマチン鎖が次第に凝 縮して!/、く。この過程で染色体は遺伝物質として機能する形態から移動可能なコン パクトな形態に変化する。やがて、 2つの対応する染色分体 (凝縮したクロマチン鎖） は、セントロメァで結合した染色体になる。細胞の両極力 伸びた長い微小管（紡錘 糸）はセントロメァに結合する。核***の間、紡錘糸は各染色分体を細胞の両極に向 けて引き離し、最終的に各娘細胞は 1セットの染色分体を受け継ぐ。染色体の本数は 種ごとに一定である。無性生殖で増殖する種の細胞は染色体を 1セットしか持たず、 その生物の全細胞についてそれが言える。有性生殖を行う種は、二倍体 [2x]かまた は多倍体 [Nx]の体細胞と、半数体の配偶子 [n=xの整数倍]を持つ。二倍体は 2セ ットの染色体で、 1セットが父親など由来でもう 1セットが母親などの別の個体由来で ある。多倍体は 3セット以上の染色体を持ち、 1倍体は 1セットしか持たない。哺乳類 では、受精において雄と雌の配偶子が融合すると、その時点ではまだ二倍体の卵細 胞が減数***を起こし、受精卵の成熟化がおこる。減数***の過程で、母親と父親 の対応する染色体同士は交叉を起こしてぉ互 ヽの部分を交換する。融合により作製 された幹細胞と体細胞との融合細胞は、 4倍体をしている。この場合は、レコンビナー ゼの働きにより、 DNA複製後の姉妹染色分体が CEC間で相同組み換えを起こすこ とで、セントロメァとテロメァで混乱し、染色体が除去されるようになる。一倍体は単相 、二倍体は複相とも呼ばれる。本発明の染色体除去を行うための模式図は、図 3にも 例示される。
[0156] 1.分化細胞で染色体除去を行った場合、遺伝子量補償機構のため染色体が除去 された細胞を得ることが困難である。ところが、未分化細胞では遺伝子量補償に関し て寛容性のあることが X染色体の不活性ィ匕ゃゲノムインプリングイングに関する本発 明者らの発明から明らかになつている。これらの発見を元に、未分化細胞である胚性 幹 (ES)細胞で染色体除去を行うことで、遺伝子量補償の問題を解決した点に独創 '性がある。
[0157] 2.これまでの染色体工学実験では、性染色体である Y染色体の除去は報告されて いるが、常染色体の丸ごと 1本除去された 2倍体細胞の例はない。常染色体では、相 同染色体間での組み換えや、非相同染色体間での組み換えの報告があるが得られ る頻度は著しく低い。我々は、 DNA 複製後である細胞*** G2期における姉妹染 色分体間での相同組み換えの機構を応用して、染色体異常を強制的に誘発するこ とで相対的に高頻度での染色体除去をもたらした点が独創的である。
[0158] 3.姉妹染色分体間での組み換え効率の向上、つまり染色体除去効率の向上を目 的に LoxP等の相同組み換え配列（レコンビナーゼ配列）を逆方向に 2個 1ペア一と して導入した染色体除去カセットを構築した点に独創性がある。
[0159] 1つの実施形態では、本発明の組成物が目的とする細胞において、除去されるべ き染色体は、多能性関連遺伝子を含み得る。ここで多能性関連遺伝子としては、例 えば、 Nanog、 Oct3Z4、他の特異的抗原などを挙げることができる。
[0160] 別の実施形態では、本発明の組成物が目的とする細胞において、除去されるべき 染色体は両方のコピーであり得る。
[0161] (キット）
本発明は、 A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセ ットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、 B)該レコ ンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を 含む核酸分子と、を備える、所望の染色体を除去するためのキットを提供する。ここで 、遺伝子カセットとしては、上記 (遺伝子カセット）に記載された任意の形態を利用す ることができることが理解される。また、ここで使用されるレコンビナーゼまたは核酸分 子としては、適切なレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列であれば、どの ようなものでもよい。そのような適切なレコンビナーゼは、含まれるレコンビナーゼ認識 配列に応じて当業者が適宜選択することができる。この場合、以下の対応が例示さ れる：
loxP配列 Creレコンビナーゼ
FRT(Flprecognitiontarget)部位： Flp インテグラーゼ
attB配列： φ C31インテグラーゼ
attP配列： φ C31インテグラーゼ
res (resolution)部位配列： Intllインテグラーゼ。
[0162] 別の局面において、本発明は、 A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子 カセットと、 B)該レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコ ードする核酸配列を含む核酸分子と、 C)幹細胞と、を備える、幹細胞から所望の染 色体を除去するためのキットを提供する。ここで、幹細胞としては、所望の染色体を除 くことを目的とする任意の幹細胞を提供することができる。本発明は、幹細胞のような 多分化能を有する細胞から、その多分ィ匕能を保持しながら染色体を除去することが できる技術を提供したという点で、顕著な効果を奏する。使用される幹細胞は、生の ままで提供されてもよぐ保存状態で提供されても良い。そのような保存は、 ES細胞 などの幹細胞は、凍結保存されることが頻繁に行われている力 従来行われている 緩慢冷却法（例えば、 Freshney R. I. , Culture of Animal Cells : A Man ual of Basic Technique, Wiley- Lis s, Inc. , pp. 255— 265、 1994)、より 最近になって開発されたガラス化法という方法 (Reubinoff BE, Para MF, Va jta G, Trounson AO. , Hum Reprod. 2001 Oct; 16 (10) : 2187- 94) (この方法は、効率が緩慢冷却法よりも高ぐし力も、簡便である)などを利用すること ができる。
[0163] 別の局面において、本発明は、 A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子 カセットと、 B)該レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコ ードする核酸配列を含む核酸分子と、 C)幹細胞と、 D)所望のゲノムを有する細胞と 、を備える、所望のゲノムを有する細胞から所望の染色体を除去し、該細胞に多分化 能を付与するためのキットを提供する。ここで、幹細胞と、所望のゲノムを有する細胞 とを提供することにより、その後所望のティラーメイド幹細胞を作製することができる。 融合細胞の製造方法は、 WO03Z027278号に記載されており、その記載は、本明 細書においてその全体を参考として援用する。例えば、幹細胞 (たとえば、 ES細胞） と体細胞とを融合させる方法は、幹細胞と体細胞とが接触により融合し、融合細胞を 形成するような方法であれば特に限定されない。例えば、実施例に記載されるように ES細胞と体細胞とを、一定の割合、例えば ES細胞と胸腺細胞との融合細胞を作る 場合には 1 : 5の割合で混合し、洗浄する。細胞をマン-トール緩衝液等の適当な緩 衝液中に懸濁し、電気融合させることにより作製することができる。このような電気刺 激による細胞膜の構造変化を利用した高電圧パルス細胞融合法 (エレクトポレーショ ン） [例えば、 EMBO J. 1 : 841— 845 (1982) ]の他に、センダイウイノレス、リゾレシ チン、グリセロール、ォレイン酸エステル、ポリエチレングリセロール等の化学的な細 胞融合促進物質を用いた細胞融合法も使用され得る。いかなる融合方法であれ、幹 細胞と体細胞の融合により形成された細胞が、融合細胞として安定に増殖させること ができ、体細胞由来の核が多分化能を有する未分化細胞様に変化することができれ ば特に限定されない。
[0164] 本明細書において細胞の「融合」または「細胞融合」とは、互換可能に用いられ、複 数の細胞が融合して細胞の多核化がおこる現象を 、う。生殖細胞の受精時など自然 においてもおこる力 細胞工学上の手段の 1つとしても用いられる。融合させるには、 2種の相異なる細胞をィ匕学的または物理的に融合させ、融合細胞だけを増殖させる 選択培地を用いて培養する。たとえば、紫外線で感染力を失活させたウィルス (たと えば、 HVJ (センダイウィルス）、パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウィル スといったパラミクソウィルスなど）を用いると、細胞融合が誘導される。化学物質によ つても細胞融合は可能で、たとえば、リゾレシチン、ポリエチレングリコール (PEG) 60 00、グリセロールォレイン酸エステルなどが用いられる。物理的手法としては，電気 刺激を利用した細胞融合 (電気融合)が行なわれている。化学物質による細胞融合 は、ウィルスに対する特異性に非依存性であるので好ま 、。
[0165] (方法）
別の局面において、本発明は、所望のゲノムを有する細胞力 所望の染色体を除 去し、該細胞に多分ィ匕能を付与するための方法であって、 A)レコンビナーゼ認識配 列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコード する配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、 B)該遺伝子カセットを幹細胞に 導入する工程と、 C)該幹細胞と所望のゲノムを有する細胞とを融合する工程と、 D) 該融合された細胞に、該レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼまたは それをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、 E)再構成が生じる条 件に該融合された細胞を曝す工程と、 F)融合された細胞のマーカー遺伝子に由来 するシグナルを観察して所望の染色体が除去された細胞を選択する工程と、を包含 する、方法を提供する。
[0166] 別の局面において、本発明は、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細 胞カも所望の染色体を除去するための方法であって、 A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする 配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、 B)該遺伝子カセットを細胞に導入す る工程と、 C)該細胞と所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞とを融合 する工程と、 D)該融合された細胞に、該レコンビナーゼ認識配列を認識するレコン ピナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、 E)再 構成が生じる条件に該融合された細胞を曝す工程と、 F)融合された細胞のマーカー 遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色体が除去された細胞を選択する 工程と、を包含する、方法を提供する。
[0167] 他の局面において、本発明は、染色体交換細胞を生産するための方法であって、
A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって 、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、 B)該 遺伝子カセットを第 1の細胞に導入する工程と、 C)所望の染色体を有する第 2の細 胞の細胞質と、第 1の細胞とを融合させる工程; D)該第 2の細胞の所望の染色体に 対応する該第 1の細胞の染色体を、該第 1の細胞の該染色体の除去を可能にするよ うに、該レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼまたはそれをコードする 核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、 E)再構成が生じる条件に該融合され た細胞を曝す工程と、 F)融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを 観察して所望の染色体が除去された細胞を選択する工程と、を包含する、方法を提 供する。
[0168] ここで、使用されるレコンビナーゼ認識配列、遺伝子カセット、マーカー遺伝子など は、本明細書において (遺伝子カセット）において説明されている任意の形態を用い ることができることが理解される。
[0169] 本発明の方法において用いられる幹細胞、および所望のゲノムを有する細胞として は、融合され得る限り、任意の細胞を用いることができることが理解される。
[0170] 本発明において、使用される融合技術およびレコンビナーゼまたはそれをコードす る核酸分子については、本明細書において (キット）中で説明されている任意の形態 を用いることが理解される。
[0171] 本発明において、「染色体の除去を可能にするよう」な条件は、本明細書において 説明される任意の条件を用いることができる。ここでは、再構成が生じる条件を用い ても良い。
[0172] 本発明において、「再構成が生じる条件」は、組み換えが起きる任意の条件をいい 、そのような条件は、当業者が容易に選択することができる。そのような再構成が生じ る条件は、例えば、 1.細胞が***を行っている； 2.細胞が未分化状態を維持してい るなどを挙げることができる。
[0173] 本発明の方法において、マーカー遺伝子に由来するシグナルの観察は、そのマー カー遺伝子が発するシグナルに応じて当業者が適宜選択した手段によっておこなう ことができる。例えば、グリーン蛍光タンパク質であれば、蛍光を観察する手段、例え ば、蛍光顕微鏡などを用いることによって実施することができる。
[0174] 別の局面において、本発明は、所望のゲノムを有する細胞力 所望の染色体を除 去するための方法であって、 A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ 含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセ ットを提供する工程と、 B)該遺伝子カセットを細胞に導入する工程と、 C)該細胞に、 該レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配 列を含む核酸分子を提供する工程と、 D)再構成が生じる条件に該細胞を曝す工程 と、 E)細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色体が除去 された細胞を選択する工程と、を包含する、方法を提供する。
[0175] (細胞など）
別の局面において、本発明はまた、所望の染色体が除去された細胞 (例えば、 ES 細胞などの幹細胞）を提供する。このような細胞は、例えば、本発明の方法によって 作製することができる。好ましい実施形態では、この細胞では、 MHCを含む染色体 が除去されている。このような染色体除去細胞は、従来効率よくは得ることには成功 していな;^つた。
[0176] 別の局面では、本発明は、本発明の方法によって得られた細胞を提供する。
[0177] 1つの実施形態では、本発明は、 ES細胞と、所望のゲノムを有する細胞との融合細 胞であって、該融合細胞から、所望の染色体が除去され、多分化能を有する、融合 細胞を提供する。
[0178] 別の好ましい実施形態では、本発明は、 ES細胞と、所望のゲノムを有する細胞との 融合細胞であって、該融合細胞から、該 ES細胞の主要組織適合 (抗原遺伝子)複合 体 (MHC)をコードする配列を含む染色体が除去されており、多分化能を有する、融 合細胞を提供する。このような MHCまたはそれに対応する遺伝子としては、マウスの H 2抗原 (第 17番染色体)、ヒトの HLA抗原 (第 6染色体)を挙げることができる。
[0179] 1つの実施形態では、 ES細胞と、所望のゲノムを有する細胞との融合細胞であって 、上記所望の染色体は、該 ES細胞のマウスの第 6染色体、第 11染色体、第 12染色 体および第 17番染色体、ヒトの第 6番染色体 (マウスの第 17番染色体に対応する）か らなる群より選択される染色体または該染色体に対応する染色体の一方コピーまた は両コピーであり、これらの 1つまたは複数の染色体が除去された、多能性を有する 融合細胞が提供される。ここで、染色体間の対応 (シンテュー）は、例えば、 Nature 4 09, 860—921 (15 February 2001)、 http://bioportal.ddbj.nig.ac.jp/synteny/index.htm 1、 http://www— btls.jst.go.jp/ComparativeGenomics/index」. htmlなどを参酌して公知 技術を用いて決定することができる。本明細書では、「シンテュー」とは、異なる種の 染色体間で、遺伝子が同じ順番で配置されていること、もしくはその領域をさす。ゲノ ムの配列解読がなされる以前は、遺伝子地図や染色体マッピングなどによりシンテ- 一が確認されていた力 現在ではゲノムが詳細に解読されるに従って、配列レベル での解析が進み今では、ヒトとフグなどの染色体どうしも比較できる。
[0180] 1つの具体的な実施形態では、 ES細胞と、所望のゲノムを有する細胞との融合細 胞であって、上記所望の染色体は、 ES細胞の Nanog遺伝子を含む染色体であり、 これらの 1つまたは両コピーの染色体が除去された、多能性を有する細胞が提供され る。
[0181] 1つの実施形態では、 ES細胞と、所望のゲノムを有する細胞との融合細胞であって 、 ES細胞の染色体 1または 2以上の染色体 (例えば、全部）が除去された、多能性を 有する融合細胞が提供される。全部取り除かれることが好ましい。このような細胞は、 その ES細胞由来の疾患に関連する染色体または染色体群が実質的にすベて取り 除かれることからより好ましい。なぜなら、免疫拒絶を防ぐことができるからである。 2 以上の染色体の除去は、本発明にお 、て提供される 1つの染色体除去の技術を複 数回繰り返せばよい。そのような技術は当該分野において周知の技術を応用して、 具体的な染色体の配列情報をもとに実施することができる。染色体の数だけ繰り返す と、全部所望の染色体が除くことができる。例えば、 ES細胞と所望の細胞の融合細 胞から、 ES細胞由来の染色体をすベて抜くこともできる。
[0182] 1つの実施形態では、 ES細胞と、所望のゲノムを有する細胞との融合細胞におい て、所網のゲノムを有する細胞は、疾患に罹患した個体由来の細胞であり得る。この ような細胞は、その疾患の原因を調査するために使用され得る。
[0183] 別の実施形態では、 ES細胞と、所望のゲノムを有する細胞との融合細胞にお！、て 、所望のゲノムを有する細胞は、疾患に罹患した個体由来の細胞であり、 ES細胞の 染色体全部が除去された、多能性を有する融合細胞が提供される。このような細胞 は、その疾患の原因を調査するためにより好ましい。
[0184] 別の局面では、本発明は、所望の染色体または染色体群が交換された、染色体交 換細胞を提供する。ここでは、染色体交換は、例えば、体細胞の染色体（2コピーま たは 1コピー）をもつ細胞質を ES細胞と融合させ、入れた染色体と同じ ES細胞由来 染色体をカセットで抜くことができる。この細胞は、好ましくは、所望の染色体または 染色体群が交換された、染色体交換された幹細胞であり得るがそれに限定されない 。例えば、そのような幹細胞は、 ES細胞であってもよい。 [0185] 1つの具体的な実施形態では、本発明は、 ES細胞と、所望のゲノム、染色体または 染色体群を有する微小核との融合細胞であって、該融合細胞から ES細胞由来の所 望の染色体が除去され、多分化能を有する、染色体交換細胞を提供する。
[0186] 本発明はまた、本発明の技術によって生産された任意の細胞を提供する。
[0187] (使用）
別の局面において、本発明は、レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ 含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセ ットの、所望の染色体を除去するための使用を提供する。
[0188] 他の局面において、本発明は、レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ 含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセ ットの、所望の染色体を除去するための組成物の製造のための使用を提供する。
[0189] ここで、染色体除去などについての技術は、本明細書において他の場所に記載さ れる任意の技術を用いることができることが理解される。
[0190] (細胞ライブラリー）
別の局面において、本発明は、所望の染色体が除去された細胞を複数種類含む、 細胞ライブラリーを提供する。このようなライブラリ一は、目的とする染色体を除去する ための遺伝子カセットを、上記 (遺伝子カセット）に記載される本発明の遺伝子カセッ トを用いることによって作製し、種々の染色体が除去された細胞を作製することによつ て提供することができる。所望の染色体を除去するための遺伝子カセットの設計方法 は以下の通りである：
1番染色体上のユニークな DNA配列、多くの場合は 1番染色体上の特定の遺伝子 のゲノム DNA配列を同定する。同定された DNA配列に上記遺伝子カセットを挿入 する。この際、用いる DNA配列は 5kb以上の長さを利用し、挿入遺伝子カセットの両 側が均等な長さになる（片側 2. 5kb)なることが望ま 、。
[0191] 1番染色体上の DNA配列に挟まれた遺伝子カセットを ES細胞に遺伝子導入する と、 DNA相同領域の組み換えが起こることで、遺伝子カセットが目的の 1番染色体上 に挿入される。 FISH法により遺伝子カセットの 1番染色体上への挿入が確認できる。
[0192] 本発明は、従来不可能または効率が悪力つた、染色体ごとの欠失を、好ましくは再 生能または多分ィ匕能を保持させながら簡便に行うことができるようになったという点で 従来に比して予想外の効果を達成する。
[0193] 本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、そ の全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援 用される。
[0194] 以上、本発明を、理解の容易のために好まし!/ヽ実施形態を示して説明してきた。以 下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は 、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従つ て、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限 定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
実施例
[0195] 以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限 定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬などは、例外を除き、 Sigma (St. Louis, USA)、和光純薬（大阪、 日本）、などから市販されるものを用い た。動物の取り扱いは、京都大学において規定される規準を遵守して行った。以下 において、本発明を、具体例を挙げて説明する。なお、このような例で用いられる出 発プラスミド、プロモーター等の構成要素を同等のもので置き換えて実施することは 当業者にとって容易である。
[0196] (実施例 1 染色体除去カセット （CEC ; Chromosome Elimination Cassett e)の有効性の検定）
1. CECの =fンス卜ラタシヨン
実験の第一段階としてデザインした CECによって特定の染色体の除去が可能かを 確認し、 CECの機能を確認し後、第二段階として相同組み換えにより特定の染色体 への CECの導入を試みた。
[0197] CECは、 LoxP→CAG— GFP— IRES— Puro LoxPからなり（配列番号 11)逆 方向に導入された LoxP配列により相同染色分体間で組換えが起こった。相同組換 えの組み合わせによりある頻度で、 2動原体染色体や無動原体染色体が形成された 。これらの以上染色体は細胞***を通じて細胞から除去された。この結果、 CECが 導入された染色体のみを欠損した細胞が作製された。
[0198] その結果を、図 1 (特に、図 1Eおよび図 1F)および図 2に示す。マウスにおける 1実 施形態の細胞の核型分析による欠失染色体の分布が示されている。ここで、 11番染 色体が見事に除去されて ヽることが理解される。
[0199] 2. ES細胞への染色体除去カセットの導入
CECを、 Hprt遺伝子を欠損した雄 ES細胞株、 HM— 1 (Selfridge, J. , Pow, A . M. , McWhir, J. , Magin, T. M. and Melton, D. W. (1992) Gene targe ting using a mouse HPRT minigene/ HPRT― deficient embryonic s tern cell system： inactivation of the mouse ERCC― 1 gene. Somat Cell Mol Genet 18, 325— 36.に記載されている。本実施例では、 Dr. Mart in J. Evans, in School of Biosciences, Cardiff University, Cardiff, Wa les, UK.力 使用許可を得て入手した (分与 ·使用許可取得済)。）に導入した。 H M— 1を実験に用いることにより、 Hprt ( + )の全ての正常体細胞との融合細胞を HA T培地により選択することが可能となった。 HM— 1への遺伝子導入はエレクトロボレ ーシヨン法により行うことで、 CECのシングルコピーの導入を促した。 250VZ500 μ Fの条件下で 1 X 10個の細胞に 50— 100 μ gの pCEC DNAを導入した。ピュー口 マイシンで薬剤選択した後、顕微鏡下で GFP陽性細胞を選択クローニングした。得 られたクローン力も DNAを抽出し、 PCRにより導入遺伝子の再確認を、サザンハイ プリダイゼーシヨン法により導入 CECコピー数を確認した。シングルコピーが導入され 、 GFP高発現のクローンを細胞融合実験に用いた。その結果を図 4に示す。図 4は、 染色体除去カセットの ES細胞への導入および導入カセットの FISH解析である。図 3 に示される本発明の染色体除去のメカニズムを説明する模式図で説明されるように、 種々のメカニズムが起こって 、る可能性が考えられる。
[0200] 3.改変 ES細胞と体細胞との細胞融合
CEC ES細胞と 129Rosa26由来の胸腺細胞を電気的に融合した。 ECM2001 ( BTX)装置 (既存)を用いて、 ES細胞と胸腺細胞（1： 5)の細胞混合液を 10V (AC) Ζ905— 250ν(ϋ Ζΐ0/ζ sの条件で処理し、細胞融合した。処理後の細胞は、 Η AT選択培地での培養により ES—胸腺細胞融合細胞のみが生存が可能となった。 融合細胞での GFPの発現、正常核型を確認した。その結果を図 5に示す。模式図は 、図 8に例示する。
[0201] 4.融合細胞からの染色体除去誘導
融合細胞に pCMV— Creをリポフエクシヨン導入し、一過的に Cre酵素を発現させ、 48 - 96時間培養し CEC導入染色体での組換えを誘導させた。
[0202] 5.染色体除去済み融合細胞の選別
Cre酵素で処理した融合細胞クローンをセルソーターで、 GFP陽性細胞と GFP 陰性細胞とに分け、 GFP陰性細胞を分取する。 GFP陰性細胞の染色体核型を G— バンド解析し、細胞間で共通に欠損した染色体を同定した。この操作を、クローンで 繰り返した。
[0203] 6.染色体除去の確認
細胞融合前の CEC— HM— 1 ES細胞に対して、 pCECをプローブに染色体 FIS H (Fluorescence in situ hybiridization) 解析を行い、 CECが導入された 染色体を同定した。 CEC染色体が 5.で同定された染色体と同じ染色体であれば、 CECにより染色体が選択的に除去されたことを意味する。染色体同定には G—バン ド解析の他に、染色体特異的繰り返し配列をもち!ヽた FISH解析をも並行して用い、 同定染色体を確認した。その結果を図 4 6に示す。
[0204] 同様の実験を、染色体除去カセットがマウス ES細胞の 5番染色体または 12番染色 体に導入する例を用いて行った。図 7に示されるように、染色体上の除去カセット挿 入部位を FISH法により解析したところ、効率よく染色体が除去されていた。
[0205] (実施例 2 染色体除去ライブラリーの作製）
1.任意染色体の除去
CECを ES細胞の他の染色体上に導入し、 ES—体細胞融合細胞から任意の染色 体を除去できる事を、それぞれ異なった染色体を用いて証明した。方法は 1—6の実 験を、他の染色体で繰り返す形で行った。
[0206] 2. CECネオマイシン選択コンストラクトの作製
CECの選択にピューロマイシンの代わりにネオマイシンを用いるコンストラクト pLox P→Pgk - Neo -IRES- GFP LoxPを作製し、任意の染色体除去に用 、た。 [0207] 3. CECカセットホモ接合体の作製
pLoxP→Pgk - Neo - IRES - GFP LoxP CECカセットを任意の染色体上に 載せた。高濃度（8mgZml)のネオマイシン処理により、 CECをホモ接合にもつ ES 細胞を得た。
[0208] 4.染色体除去ライブラリーの作製
CECを特定の染色体にホモもつ ESライブラリーと体細胞を融合し、融合細胞の Cr e酵素処理による ES細胞由来の染色体除去により、特定の染色体セットが体細胞か らのみ由来する融合細胞を自由に作製できるシステムを構築した。
[0209] 体細胞に疾患マウスや特質な遺伝的多型等をもつマウスを用いることで、ティラー メイド創薬等への応用が可能になった。これにより、同様のシステムをヒト ES細胞に 導入することで、より効果的な解析が可能になる。
[0210] (実施例 3 相同組み換えを応用した特定染色体の除去）
1.マウス 17番染色体の除去
ティラーメイド幹細胞作製の第一段階として、マウス第 17番染色体を除去すること を目的に、コンストラタシヨンを行う。マウス第 17番染色体上には免疫拒絶反応に関 わる MHC (主要組織適合性抗原)遺伝子群が存在する。 ES細胞由来の第 17番染 色体を選択的に除去することにより、融合細胞からの MHC発現力 体細胞由来のも ののみになる。結果として、融合細胞由来の分化細胞への拒絶反応の大幅な減少が 観察されること〖こなる。
[0211] 2.相同組み換え配列
マウスゲノムライブラリーまたはゲノム力も PCRにより直接、第 17番染色体上の H2 b遺伝子のゲノム DNAをクローユングする。相同組換えに必要なゲノム断片 (右側 アーム（RA)と左側アーム（LA) )を CECにつなぎ合わせ pRA—LoxP→CAG— G FP - IRES - Puro LoxP - LAプラスミドおよび pRA - LoxP→CAG - dsRed - IRES - hygro^LoxP - LAを構築した。その模式図を図 3左上に示す。
[0212] 3.相同組み換え
HM - 1 ES細胞を用 ヽて相同組換えにより pRA - LoxP→CAG - GFP - IRES — Puro LoxP— LAを第 17番染色体上に載せる。続いて、 pRA— LoxP→CAG - dsRed - IRES - hygro LoxP - LAを用 、てセカンド遺伝子座上に載せる。 H 2— b遺伝子の両遺伝座に CECが導入された ES細胞を得た。
[0213] 4. FISH解析
CECをぞれぞれの染色体にもつ ES細胞を同定し、ライブラリーを作製した。
[0214] マウス 17番染色体の H2— b遺伝子座にホモに CECが導入された ES細胞と体細 胞を融合した。融合細胞を pCMV— Creで処理し、 ES細胞由来の 17番染色体が除 去されたクローンを得た。この遺伝子操作 ES細胞を in vivoや in vitroで様々な組 織に分ィ匕誘導し、移植実験を行うことで拒絶反応の有無および程度を検定した。
[0215] (実施例 4 相同組み換えを応用した HLA関連遺伝子が乗った染色体の除去） 実施例 3と同様の手法を用いて、 HLA関連遺伝子が入っている染色体の除去を行 う。 HLA関連遺伝子は、ヒト 6番染色体に入っていることから、上記手順において、ヒ ト 6番染色体に特異的な手順を用いた以外は、上記実施例に準じて実験を行う。す ると、ヒト 6番染色体もまた、同様に効率よく除去されることが分かる。
[0216] (実施例 5 違うレコンビナーゼの例）
LoxP配列の代わりに FRT配列を用いて染色体除去を行う。 FRT部位としては、 G インテグラーゼとして Flpインテグラーゼを用いて、上記実施例に基づいて、除去実 験を行う。例えば、マウス 17番染色体を標的に染色体除去実験を行うと、同様に標 的染色体が効率よく除去されることが分かる。
[0217] (実施例 6 違う細胞の例）
ES細胞の代わりに EG (Embryonic Germ) (生殖性幹）細胞を用いて融合細胞 を作製し、染色除去を行うことが可能である。ここで、 EG細胞は、 Reprod Fertil D ev. 2001 ; 13 (7-8) : 661—4などに基づ!/、て作製すること力できる。
[0218] EG細胞でも、同様に、染色体除去が効率よく起こることが理解される。
[0219] (実施例 7 違う動物種細胞の例）
サル ES細胞を用いて同様の実験を行う。実験手順は、上記実施例に従う。
[0220] その結果、サル ES細胞でも、同様に、染色体除去が効率よく起こることが理解され る。 [0221] (実施例 8 :Nan0g遺伝子の除去例）
(方法）
(染色体除去カセット）
ΙοχΡ2カセットベクター（pBS246 (Gibco— BRL) )のインサートを PCR増幅し、 pG EM— T Easy (Promega)中にサブクローユングした。 ΙοχΡ部位を、逆方向に再ク ローニングした（pGEM— CEC)。 CAG-gfp/lRES (内部リボゾーム侵入部位） . puro— pAフラグメントをこの pGEM— CEC中に組み込み、ランダム挿入のため、 pC EC - C AG - gf p/lRES . puro— p Aを作製した（図 9a)。第 6番染色体除去のため 、 pGEM— CECを pBS— SK ( + ) (Stratagene)にサブクローユングした（pBS— C EC)。 Pgk— neo/lRES. gfp— pAフラグメントを pBS— CECに組み込み、 pCEC — Pgk— neo/lRES. gfp pAを作製した。 Gt (ROSA) 26Sor座における相同組 み換えのため、 CEC— Pgk— neo/lRES. gfp— pAを pROSA26— pAに組み込 ん 7こ、 pROSA26—し EC) (srmivas, S.り、し re reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus , BMC Dev Biol 1, 4 (2001) ) (図 l la)。
[0222] 安定な形質転換体を得るため、 Sealで直鎖状にした pCEC— CAG—gfpZlRES . puro-pA DN Aを、 Gene Pulser II (BioRad)を用いて HMl ES細胞にエレ タトロポレーシヨンした。 Cre発現ベクター、 pBS185 (pCMV— Cre) (Gibco -BRL )を、一過性に発現させるため、リポフエクタミン 2000 (Invitrogen)を用いてハイブリ ッド細胞にトランスフエタトした。 Gt (ROSA) 26Sor遺伝子座への相同組み換えのた め、 Pvulで直鎖状にした pROSA— CECプラスミド DNAを、 HMl ES細胞にエレ タトロポレーシヨンした。
[0223] (細胞融合）
Hprt遺伝子に関して欠損のある HMl ES細胞（129Z〇la : Mus musculus domesticus)を、 ES培地中で、初代胚性線維芽フィーダ一細胞上で培養した (Ta da, . ら、 Pluripotency oi re programmed somatic genomes m embry onic stem hybrid cells. Dev Dyn 227, 504— 10 (2003) )。 CEC—トランス ジェニック HMl ES細胞を、雌 129ROSA26 (M m. domesticus)もしく ¾JF1 ( M m. molossinus)マウスから集めた胸腺細胞と電気的に融合した（Tada, M.ら 、 Pluripotency of re programmed somatic genomes m embryonic ste m hybrid cells. Dev Dyn 227, 504— 10 (2003) )。ハイブリッド細胞クローン を、 HAT培地で選別した。
[0224] (G418 高濃度薬剤耐性クローンの選択 (ホモ細胞選択用プロトコール)）
Pgk— neoカセットを導入したトランスジエニック ES細胞を、 250 /z gZml G418で 選択する。
2. G418而性 ES細胞（5xl06個）を直径 3cmの培養デイシュ（6— well plate)に 播き、 5- 10 mg/ml の高濃度 G418存在下で 3日間培養する。この間、毎日選 択培地の交換を行う。
選択培養後 3日目に、 3cm培養デイシュ 3枚にサブカルチャーし、 5- 10 mg/ml の高濃度 G418存在下で 4— 7日間培養する。この間、毎日選択培地の交換を行う。
4. 約 40個ほどの高濃度 G418耐性 ES細胞のコロニーが出現する。
5. それぞれのコロニーから DNAを抽出し、ゲノム PCR法またはサザンハイブリダィ ゼーシヨン法により Pgk—neoカセットをホモに持つクローンを選択する。
[0225] (FACS分類）
ノ、イブリツド細胞を、 2%ゥシ胎仔血清および 2 gZml ヨウ化プロビジゥム（Sigm a)を含む PBS中【こ懸淘した。約 10, 000〜500, 000糸田胞を定量分析【こ供し、 100 〜1, 000個の GFPネガティブハイブリッド細胞を F ACS Vantage (Becton Dicki nson)で収集した。
[0226] (FISH分析）
標準 Gバンド形成手順（standard G— banding procedure)に従って、染色体 分析を行った（Tada, M. , Tada, T. , Lefebvre, L. , Baton, S. C.および Sura ni, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. EMBO J. 16, 6510— 20 (1997) )。マ ッビングのため、染色体調製物を、 CECベクター特異的プローブもしくは動原体主要 サァフイト特異的プロ ~~フ (centromere major satellite specific probe) (Leh nertz, B.ら、 Suv39h— mediated histone H3 lysine 9 methylation dire cts DNA methylation to major satellite repeats at pericentric hete rochromatin. Curr Biol 13, 1192— 200 (2003) )【こノヽイブリダィズさせて、検 出した (Lawrence, J . B. , Singer, R. H.および Marselle, L. M. Highly local ized tracks of specific transcripts within interphase nuclei visualize d by in situ hybridization. Cell 57, 493— 502 (1989)を参照）。染色体ぺ インティングのため、染色体調製物を、染色体ペインティングプロトコルに従って、第 6番染色体、第 11番染色体、第 12番染色体および第 17番染色体に特異的な STA R FISHプローブ（Cambio)にハイブリダィズさせて、検出した。
(ゲノム PCRおよび RT—PCR)
ゲノム PCR産物を、 35サイクルの間、アニーリング温度 60°Cで増幅した。 D6Mitl 83、 D6Mitl02および D6Mitl4を、 129^JF1との間の DNA配列多型を検出する ための、マウス第 6番染色体特異的マーカーとして使用した： D6Mitl83 (129 ; 94b p、および JF1； 190bp)、プライマー 1 ; 5， - TTCTC AATG AAC ACTAG AAC A TTCG- 3' (配列番号 12)、およびプライマー 2 ; 5， - AAAAC AC AGGTAG AA A AC ATAC ATAC A - 3 ' (配列番号 13)； D6Mitl02 (129 ; 177bp、および JFI; 125bp)、プライマー 1 ; 5， - CCATGTGGATATCTTCCCTTG - 3 ' (配列番号 14)およびプライマー 2； 5，— GTATACCCAGTTGTAAATCTTGTGTG— 3，（ 配列番号 15) ;D6Mitl4 (129 ; 155bp、および JFI ; 147bp)、プライマー 1 ; 5，— A TGC AGAAAC ATGAGTGGGG - 3 ' (配列番号 16)およびプライマー 2 ; 5，一 C ACAAGGCCTGATGACCTCT— 3，（配列番号 17)。 GFP DNAを、以下のプ ライマーセットを用いて PCR増幅した： GFPF； 5，一 CGTAAACGGCCACAAGT TCA- 3' (配列番号 18)および GFPR; 5， - CGCTTTACTTGTACAGCTCGT —3，（配列番号 19)。 Nanogおよび Stella/PGC7の RT— PCRのため、 ES細胞、 Creハイブリッド細胞および Cre処理ハイブリッド細胞から抽出された DNasel処理 R NA力ら、オリゴ dTプライマーを用いて、 cDNAを合成した。 RT—PCR産物を、 30 サイクルの間、アニーリング温度 60°Cで、以下の特異的プライマーを用いて増幅した ： Nanog F 1； 5 ' - GCGCATTTTAGCACCCCACA - 3 ' (配列番号 20)および Rl ; 5， - GTTCTAAGTCCTAGGTTTGC - 3 ' (配列番号 21)； Stella/PGC7 F； 5， - AC AG ACTG ACTGCTAATTGG - 3，（配列番号 22)および R； 5 '— G GAAATTAGAACGTACATACTCC - 3 ' (配列番号 23)。 G3pdhを、以下のプ ライマーを用!ヽて増幅した； F； 5， -TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC - 3' (配列番号 24)および R; 5， - CATGTAGGCCATGAGGTCCAC - 3 ' (配 列番号 25)。
[0228] (サザンブロットハイブリダィゼーシヨン）
相同組み換え現象を検出するため、ゲノム DNAを GFPポジティブクローンカも抽 出し、 EcoRVで消化し 1. 0%ァガロースゲルで分離し、そしてアルカリブロッテイング によって Hybond N +膜へ移送した。この膜を予備ハイブリダィズし、次いで Mega prime DNA標識システム（Amersham)を用 、て32 P - dCTPで標識した pROSA 2 S ノフス^ト (srmivas, S.ら、 Cre reporter strains produced by targ eted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus, BMC Dev Biol 1, 4 (2001) ) (図 11a)と、 42°Cでー晚ハイブリダィズさせ、続いて、 65 Cで、 2 X SSPEZ0, 1% SDSおよび 0. 1 X SSPE/0. 1%によって洗浄した。
[0229] (ウェスタンブロットハイブリダィゼーシヨン）
全細胞抽出物を、 12%SDSポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分離し た。これらのタンパク質を、 PVDF膜 (Millipore)上に移送した。この膜を、 3%スキム ミルク（Difco)と、 PBS中で室温で 1時間、予備ハイブリダィズさせ、次いで、抗 NAN OG抗体（1： 1000希釈） (Abeam)および抗ヒストン H3抗体（1： 3000希釈） (Abea m)とともに、 4°Cでー晚インキュベートした。 ECLウェスタンブロッテイング検出キット（ Amersham)を用いてバンドを検出した。
[0230] (蛍光免疫組織化学）
Cre処理ハイブリッド細胞を、 4%ホルムアルデヒドで 10分間固定した。ブロッキング 溶液（2%スキムミルク）による 1時間の前処理に続いて、細胞を抗 NANOGポリクロ ーナル抗体（ゥサギ IgG) (1： 500) (Abeam)および抗 OCT4モノクローナル抗体（マ ウス IgG) (1： 100) (Santa Cruz)とともに、 4°Cでー晚インキュベートした。サンプル を、リンスした後、 Alexa 546—結合抗ゥサギ IgG抗体（1 : 500) (Molecular Pro 1½5)ぉょび？11^結合抗マゥス 0 (1 : 1000) (Zymed)とともに、 1時間インキュべ ートした。
[0231] (結果および検証）
この仮説を試験するため、 GFPレポーターおよび puro耐性遺伝子を含む CEC (p CEC - CAG - gf p/lRES . puro— pA)を、 Hprt欠損 HM— 1 ES細胞にエレクト 口ポレーシヨンした。 57個の puro而'性、 GFPポジティブクローンのうち、 2つを無作為 に取り出し、 CEC特異的プローブを用いた蛍光インサイチュハイブリダィゼーシヨン（ FISH)によって分析した。両クローンとも、正常な核型（2N = 40、 XY)を保持してい た。一方のクローンでは、 CECは、第 11番染色体の遠位領域に組み込まれていた（ CEC11) (図 9b)。二番目のクローンでは、 CECは、第 12番染色体の近位上にあつ た（CEC12) (図 9c)。両クローンを、遍在性に発現する neoZlacZ遺伝子（Friedric h, G.お び Soriano, P. Promoter traps m embryonic stem cells： a ge netic screen to identify and mutate developmental genes in mice. Genes & Dev. 5, 1513— 23 (1991) )を有する雌 ROSA26マウス由来の胸腺 細胞と細胞融合し、 HAT (ヒポキサチン、アミノプテリン、チミジン)で選別した。 CEC 11ハイブリッド細胞および CEC12ハイブリッド細胞の両方とも、染色体の完全なセッ ト（4N = 80、XXXY)を有した（図 9d、 e)。
[0232] CEC11ハイブリッド細胞および CEC12ハイブリッド細胞に、一過性 Cre発現とその 後の pCMV— Creリポフエクシヨンによって、 CEC媒介性姉妹染色分体内組み換え を誘導した。選別することなく 3〜4回継代培養して 10日間さらに培養した後、約 5. 0 X 104〜2. 5 X 105細胞を FACS分類した（図 9f)。 Cre処理なしでは、 GFPネガティ ブ集団は、 CEC11ハイブリッド細胞および CEC12ハイブリッド細胞において、それ ぞれ 0. 8%および 3. 3%であった。しかし Cre処理後では、上記集団は、それぞれ 2 . 2%および 10. 1%に上昇した。このことと一致して、 Cre処理なしでは、全ノヽイブリ ッド細胞は GFPポジティブであり、一方 Cre処理、 FACS分類された GFPネガティブ ハイブリッド細胞は、 GFPネガティブコロニーを生じた（図 9g)。
[0233] CEC11ハイブリッド細胞 (もしくは CEC12ハイブリッド細胞）からの第 11番（第 12番 )染色体の選択的除去を、特定のプローブによる染色体ペインティング分析によって 確認した。 Cre処理なしでは、核を分析された各 CEC 11ハイブリッド細胞は、 4つの 第 11番染色体および 4つの第 17番染色体を含んでいた（図 10a)。 Cre処理後、各 場合において、 1本の第 11番染色体が除去され得、一方 4つの第 17番染色体は保 持された（図 10b、 e) 0 CECハイブリッド細胞における第 12番染色体除去において、 同様の状況が見出された（図 10c、 d、 f)。 Cre処理 FACS分類ノヽイブリツド細胞 DN A由来の gfp特異的産物を増幅する試みは、ネガティブであり、このことは、 CECの 消失を明らかに示した。標的を絞った除去の特異性および非標的染色体の組み込 みをさらに調べるため、 Cre処理された CEC11ハイブリッド細胞および CEC12ハイ ブリツド細胞を核型決定した。 2つの別個に単離した CEC 11ハイブリッドクローンは、 79、 XXXY、—11の核型を有し、他の染色体への有害な影響をほとんど有さないか 、全く有さなかった（図 10e)。一方、分析された CEC12ハイブリッドクローンは、 79、 XXXY、 一 12、 +マーカーの核型を有した（図 10f)。このマーカーは、主要なサテラ イト特異的プローブを用いた FISH分析で示されるように、微小動原体反復を含む染 色体であった（図 10g)。まとめると、本発明者らの分析は、個別の常染色体力 ¾S X 体細胞ハイブリッド核力 有効に除去され得ることを、明らかに示す。興味深いことに 、染色体除去頻度は、 2つの組み込み部位の間で、第 11番染色体の消失を示す CE C11ハイブリッド細胞では 26. 1%、および第 12番染色体の消失を示す CEC 12ハイ ブリツド細胞では 88. 4%と、大きく異なった (表 1)。
[表 1]
表 1 CEC含有 ES細胞を有する体細胞ハイブリッド細胞における Cre媒介染色体除去
CEC1 1ハイブリッドにおける CEC1 2ハイプリッ卜 'における 第 11染色体の数 第 1 2染色体の数
中期
の数 1 2 3 4 5 の数 1 2 3 4 5 cre前 GFP(+) 63 0 0 0 63 0 66 0 0 1 64 1 細胞 剛 (1.5%) (97.0%) (1.5%) cre後 GFP(-) 69 0 0 18 51 0 95 0 1 84 10 0 [0235] このことはおそらぐ CECが Cre分子へ接触する可能性に対する組み込み部位の 影響を反映する。これに関係なぐ本発明者らの分析は、任意の染色体もしくは所望 の染色体群を標的とした除去に対するこの方法の広範な可能性、およびこの方法が 全 ESゲノムに適用可能であり得ることを明らかに示した。
[0236] 体細胞ゲノムの再プログラム力 ES細胞ゲノムの非存在下において安定した幹細 胞特性を与えるのに十分である力否かの解明を始めるため、本発明者らは、次に、 第 6番染色体の両 ES細胞コピーを標的とした。このコピーは、多能性特異性遺伝子 (Nanog遺伝子を含む）の集団（cluster)および Gt (ROSA) 26Sor座を含む（図 11 a、 f)。このアプローチを通じて、本発明者らはまた、以下を調べることができた：（i)標 的を絞った相同組み換えによる CECタグィ匕染色体の有効性、および (ii)同じ核から 一度に 1つ以上の染色体を除去することの影響。 Nanogの発現は、 ES細胞および 初期胚性細胞において再生可能な多能性状態を維持するために必須であり（Hata no, S.ら、 Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity. Mech Dev 122, 67— 79 (2005) ; Mitsui, K.ら、 The Homeoprot ein Nanog Is Required for Maintenance of Pluripotency in Mouse Epiblast and ES Cells. Cell 113, 631—42. (2003) )、そして Nanogの体 細胞のサイレントコピーが核移植および細胞融合によって再活性ィ匕されることが以前 に されている (Hatano, S.ら、 Pluripotential competence of cells associ ated with Nanog activity. Mech Dev 122, 67— 79 (2005) )。 Gt (ROSA ) 26Sor座は、 Nanogの上流のドメインであり、ここで、相同組み換えが効率的に生じ ることが知られている。 pROSA26— pAにサブクローユングされた Pgk— neo/lRE S. gfp遺伝子を含む CECを有する標的ベクター（図 11a)を、 HM1 ES細胞にエレ タトロポレーシヨンした。試験した 18個の G418耐性クローンのうち、 2つが正確に標 的とされて（CEC6tgZ + )、 2. 3kbのノックイン特異的 EcoRVフラグメントを産生す ることを、サザンプロット分析によって見出し（図 l ib)、そして FISH分析によって確 認した（図 1 If)。これらのクローンを、 G418濃度を上昇した状態（8mgZml)で、さら に 10日間***増殖させた。これらの条件力も試験した 5つのクローンのうち全てが、 サザンプロット分析における 1 lkbの野生型特異的バンドの消失によって示されるよう に（図 l lb)、 CECに関するホモ接合 (CEC6tgZtg)であることを見出した。正常な 核型を有する CEC6tg,tg ES細胞を、贿 F1マウスから収集した成体胸腺細胞と ハイブリッド形成させ、そして GFPポジティブノヽイブリツドクローンを HAT培地で選択 した。 Cre処理の 3日後、全ノヽイブリツド細胞の染色体ペインティング分析は、 2. 2% (5Z227)の細胞力 第 6番染色体を 2つのみ有したことを示した。このことは、 ES細 胞由来の CECタグ化第 6番染色体の両方の除去を示す（図 l lc)。しかし、 Cre処理 の 7日後、 GFPネガティブ細胞を F ACS分類して、単一細胞由来のクローンへと増幅 した。染色体ペインティングによって分析された 20個のクローンのうち、 19個は、 3つ の第 6番染色体を各々の核に有した（図 l id)。明らかに一つのクローンは、中部動 原体染色体を有し、このことは、第 6番染色体の重複による同腕染色体ロバートソン 転座の形成を示す（図 l ie)。実際、 Cre処理後 3日とは異なり、 2つの第 6番染色体 を有するハイブリッドクローンは、この段階では検出されな力つた。このことは、第 6番 染色体を 2つのみ有する四倍体細胞の遺伝子量の遺伝的不均衡が細胞生存および 細胞増殖を妨げたのであろうことを示唆する。 3つの第 6番染色体は、近位 D6Mitl 83、中心 D6Mitl02、および遠位 D6Mitl l4における、 129個の JF1非特異的 DN A配列多型の PCR分析によって決定されるように、体細胞 CFF1)由来である（図 l lf ゝ g)。
このことを確認するため、 ES由来の両第 6番染色体を除去し、 Nanog転写物を Rt — PCRで増幅した。ェキソン特異的配列多型は、 Foklによる消化に抵抗性の ES由 来産物を与える一方、 JF1体細胞由来の産物は、感受性である (Hatano, S.ら、 P1 uripotential competence of cells associated with J anog activity. M ech Dev 122, 67— 79 (2005) )。 Cre処理前、 ES由来の 570bpノ ンドと体糸田胞 由来の 326bpおよび 244bpのバンドとの両方が検出され得、一方 Cre処理後、体細 胞由来のバンドのみが見られる（図 l lh)。同様の状況が、 StellaZPGC7遺伝子 (E S細胞および初代生殖細胞において発現され、やはり第 6番染色体に位置する）に ついて見られた。体細胞由来 StellaZPGC7遺伝子 RT— PCR産物のみを、 141 bp、 136bp、および 33bpの Hinfl消化フラグメントを生成する、 Cre処理ハイブリッド 細胞 RNAから検出し得た（図 l lh)。したがって、 ES由来の第 6番染色体の両方とも 、ノ、イブリツド細胞核力も選択的に除去された。 Cre処理ハイブリッド細胞において、 第 3の第 6番染色体が JF1体細胞性第 6番染色体の重複、または動原体領域近くで の体細胞由来第 6番染色体と ES細胞由来第 6番染色体との間の***組み換えから 得られる力否かは明らかではない。
[0238] 重要なことに、 ES由来第 6番染色体に関して欠損した GFPネガティブハイブリッド 細胞は、未分ィ匕の状態で生存する能力があり、抗 NANOG抗体および抗 OCT4抗 体による免疫組織ィ匕学染色がポジティブであることによって確認された（図 l li)。実 際、ウェスタンブロットハイブリダィゼーシヨン分析は、 3つの別個の Cre処理ハイブリ ッドクローンにおける相対的な NANOG発現レベルが、 ES細胞におけるレベルの約 1. 5倍であったことを示した（図 l lj)。さらに、 ES融合誘導性の体細胞由来の Nano g遺伝子の後成的な再プログラム化は、 ES由来 Nanogの寄与なしで、ハイブリッド細 胞の未分化状態を維持するために十分であることが確認された。
[0239] この CEC法は、標的を絞った染色体の除去を通じて、ハイブリッド細胞ゲノム成分 の大規模な変化を誘発するために、新規に開発されたアプローチである。再生医療 において、 MHC適合、個人化した幹細胞は、免疫拒絶の可能性が低下した移植組 織を生成するための供給源として、強く待望されている。 MHCクラス Iおよびクラス II 遺伝子のほとんどは、ヒト第 6番染色体およびマウス第 17番染色体上に集団を形成 している。第一の例においては、 ES由来の MHC遺伝子を含む染色体の、 ES X体 細胞ハイブリッド細胞力 の選択的な除去は、治療上のクローユングを必要とすること なぐ個別化された MHC適合ハイブリッド細胞の供給源を提供し得る。二倍体 MHC 個人化多能性幹細胞を作製するため、 ES由来 MHC染色体の両コピーは、本発明 者らの標的を絞った染色体除去技術と微小核体媒介性染色体移送とを組み合わせ て、 ES核中の体細胞由来の MHC染色体を置き換えられ得る。最終的に、本発明者 らは、本発明者らの CEC法が、全 ES由来染色体の除去を通じて、個体自身の体細 胞からの個体として同系の多能性幹細胞の作製を可能にすることを予測する。明ら かに、標的を絞った染色体の除去は、種々の生物医学的研究に適用可能である。患 者からの遺伝的変異を有するヒト ES細胞の作製は、ヒト疾患の原因を理解し、そして また変異 ES由来細胞を使用した薬学的評価に従って適切な薬物を開発する方法を もたらす。
[0240] (まとめ）
本発明によりヒトおよびマウスの胚性幹細胞 (ES細胞）は、 ES体細胞ハイブリッド細 胞において成体体細胞核に対して多能性を付与することができる。これは、胚の材 料を使用せずに、体細胞力 再プログラム化多能性幹細胞を作出するための強力な ツールである。これにより、ハイブリッド細胞から標的の染色体が除去され、医学の進 歩に多大な寄与をすることになる。
[0241] この目的に向けて、本発明者らは、ユニバーサル染色体除去カセット（CEC)を作 製した。本実施例では、 Nanogを含む重要な多能性関連遺伝子を有するノ、イブリツ ド細胞から、 ES起源の染色体 6の両方のコピーの標的化除去のための CECの使用 を開示する。ハイブリッド細胞がその後も多能性を保持していたことから、再プロダラ ム化された体細胞核力もの Nanogの発現が機能して 、ることが証明された。本発明 者らの発明によって、 ESに由来する MHC染色体がハイブリッド細胞から除去される 力 または ESに由来する MHC染色体を体細胞に由来する染色体に置換することに よって、幹細胞療法において使用するための個人特定の多能性幹細胞を生産するこ とが可能となった。究極的には、すべての ES由来の染色体カ 、イブリツド細胞から除 去され得る。また、正常な ES染色体の標的化除去によって、種々の変異を有する患 者由来の多能性幹細胞を生産してヒト疾患の原因および治癒を調査することができ るという点においても重要である。
[0242] ES細胞は、核の再プログラム化能力を有する。再プログラム化能力とは、マウスお よびヒトの療法において、細胞融合技術により体細胞由来に対して多能性を付与す る能力である。このアプローチは、 ES細胞由来の染色体力 ハイブリッド細胞から除 くことができ、非常に有用である。
[0243] テトラソミーが見出された染色体については、当該分野において公知の任意の方 法を用いて正常体へと復旧させることができる。これには、 Cre— lox系も含まれる。
[0244] (実施例 9：染色体の複数および全部除去）
実施例 1〜8に記載された例に準じて、他の染色体についても除去することができ る。これを繰り返して、複数の染色体を除去することができる。 [0245] さらに、これらを繰り返すと、除くべき染色体を全部（例えば、 ES細胞由来の染色体 全部)を除くことができる。
[0246] これらの除去は、除くべき ES細胞の染色体の情報が分かれば、当業者は周知技 術に鑑み本願明細書に記載に基づいて具体的に設計することができる。具体的には 以下のように行う。
1. 当該 CECまたは基本原理と基本設計は当該 CECを応用した改変型 CECを、 融合前の ES細胞の全ての染色体に導入する。導入はザザンブロット解析または FIS H解析により確認する。
2. 患者の体細胞には、ウィルスベクターにより GFPまたは他のマーカー遺伝子（M )を導入する（M—体細胞)。
3. 該 CEC ES細胞と M—体細胞を細胞融合する。融合細胞を体細胞由来のマ 一力一遺伝子より選択する。
4. 該融合細胞を Cre (または他の相同組み換え誘導酵素）により処理する。
5. ES細胞に導入した CECが全て除去された、融合細胞を選択する。
6. 核型解析および ES細胞の各染色体に特異的なゲノム配列の多型を用いてゲノ ム PCR解析やサザンプロット解析により、 ES細胞由来の全染色体の除去を確認する
7. 作出された個人対応型幹細胞（2倍体)を、患者の必要な細胞に分化誘導し移 植治療に用いる。
[0247] 以上のようにして、所望の染色体全部が除去された細胞を生産することができ、こ れを医療応用することができる。
[0248] (実施例 10 :ヒトでの染色体除去）
実施例 8と同様の実験をヒト細胞において行うことができる。そのプロトコールを如何 に記載する。
[0249] [試薬]
•G418 (10mg/ml) 溶液： G418 (Geneticin, 860— 1811U, GIBCO) lgを 100 μ Μの HEPESを含む無血清培養液（DMEM) 100mlに溶解させ、 pH7. 1に 調整後、 0. 22 mフィルターで濾過滅菌後— 20°Cに保存する。選択培養液を作製 するときに希釈して用いる。
•PEG (1 : 1. 4)溶液（用事調整）： 5gのポリエチレングリコール（PEG— 1000, U2 18 -07, BAKER)を無血清培養液（DMEM) 6mlに溶解させ、最後にジメチルス ルホキシド（DMSO)を lml加え、 0. 22 mフィルターで濾過滅菌する。
• PEG (1 : 3)溶液（用事調整）： 5gのポリエチレングリコール（PEG— 1000)を無血 清培養液 (DMEM) 15mlに溶解させ、 0. 22 mフィルターで濾過滅菌する。
•ゥヮバイン（1 X 10_3M)溶液： 36. 4mgのゥヮバイン 8水和物をあらかじめ温めてお Vヽた無血清培養液（DMEM) 50mlに溶解させ、 0. 22 μ mフィルターで濾過滅菌後 分注し、— 20°Cに保存する。選択培養液を作製するときに希釈 (最終濃度 I X 10_5 M)して用いる。
•コルセミド（lmgZml)溶液：コルセミド（DEMECOLCINE, D— 7385, SIGM
A) lmgを蒸留水 lmlに溶解させ、 4°Cで保存する。この溶液を希釈して、コルセミド（
0. 05 μ g/ml)を含む培養液（20%FBS, DMEM)を調整する。
•サイトカラシン B ( 10 g/ml)溶液：サイトカラシン B (c -6762, SIGMA) 10mg を DMSO lmlに溶解させ、無血清培養液（DMEM) 1000mlに溶力し、 0. 22 m フィルタ一により滅菌後、 4°Cで保存する。なお、この溶液は反復使用することができ る。
•PHA—P (lmg/ml)溶液： Phytohemagglutinin—P (311056, DIFCO) 10m gを蒸留水 10mlに溶解させ、 0. 22 mフィルタ一により滅菌後— 20°Cに保存する。 この溶液を希釈して、 PHA— P (50 μ g/ml)を含む無血清培養液 (DMEM)を用 意する。
[0250] (細胞）
'正常ヒト線維芽細胞（NTI— 4, JCRB0220および MRC— 5, ATCCCCL171 )： 10%FBSを含む DMEMにより培養する。
•疾患に罹患した個体由来のヒト細胞：同様に、 10%FBSを含む DMEMにより培養 するか、他の適切な培地にて培養する。
[0251] (ES細胞）
•ヒト ES細胞：下記のように榭立した細胞を用いることができる。 [0252] ES細胞株の榭立は、フィーダ一細胞を用いて行われる。通常、 ES細胞は、胚盤胞 力 分離した内部細胞塊 (ICM)をフィーダ一細胞上で培養することによって榭立さ れる。通常フィーダ一細胞としては、マウス胎仔繊維芽細胞あるいはそれ由来の細胞 株 STOが用いられている。
[0253] ヒト ES細胞の調製は、提供者の合意を得た上で、情報が完全に守られる形で行う。
具体的には、本明細書において別の場所において記載されるように、慎重に、かつ、 認証された機関で行う。以下に示す実験は京都大学再生医科学研究所において、 行われる。
[0254] まず、その一般的手順は以下のとおりである。 ES細胞のソースとなる胚を取得し、 凍結する。その後、凍結胚を解凍し、胚盤胞期まで培養する。次に、内部細胞塊を 分離し、細胞株を榭立する。幹細胞マーカー発現の有無および染色体検定により、 幹細胞であること、特に ES細胞であることを確認する。 ES細胞であることを確認する ために、幹細胞マーカー（アルカリ性フォスファターゼ活性、特異的抗原、 Oct3Z4、 Nanogなど)の検出を行なう。また核型解析を行なって染色体数や形態が正常かどう かを検定する。その後、分化能を検定する。培養下での分化能を検定するために、 培養条件の変更や細胞凝集塊作成による細胞分化の誘導と各種機能細胞への分 化能の解析を行なう。また免疫不全動物などへの移植を行なってテラトーマ形成によ る組織分ィ匕能の解析を行なう。
[0255] 具体的には以下のように行う。
[0256] (ES細胞用培養液）
培地組成： (本明細書にぉ 、て CMK培地とも!、う）
DMEM/F12 (Sigma D— 6421) 80ml
非必須アミノ酸 (Gibco) 0. 8ml
200mM L—グルタミン lml
KSR (Gibco) 20ml
2—メルカプトエタノール 0. 8 ^ 1
ヒト白血病阻害因子 (huLIF) (lO ^ g/ml) 100 l (lOngZml) 塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF) (lmg/ml) 0. 4 μ \ (4ng/ml)。 [0257] (細胞解離液）
0. 25% トリプシン (リン酸緩衝ィ匕生理食塩水（PBS) )
ImM CaCl
2
20%KSR。
[0258] (ディッシュ）
フィーダ一をつくる培養ディッシュは予めゼラチンコートしておく。 0. 1%ゼラチン溶 液（swine skin, Type A: Sigma社製）で覆い、 37°Cで 1 時間以上インキュベー トする。培養ディッシュのゼラチン溶液を除き、細胞の懸濁液を加える。数時間経て ばフィーダ一細胞として使用可能である。
[0259] フィーダ一細胞を用いた ES細胞の榭立は、以下のように行った。
[0260] 1.フィーダ一細胞の培養液を ES細胞用の培養液に交換した。
[0261] 2.免疫手術法もしくは機械的操作により胚盤胞カゝら内部細胞塊を分離した。免疫 手術法は、簡単に述べると、以下のとおりである。
[0262] 酵素処理などにより透明帯を取り除き、表面抗原に反応する抗体溶液内でインキュ ペートした。次に補体溶液内でインキュベートすることによって最外層の細胞である 栄養外胚葉が取り除かれ、内部細胞塊が分離された。
[0263] ヒト ES細胞の場合、ヒトの細胞表面抗原に反応する抗体溶液を用いることに留意し て上記手順を行う。
[0264] 3.分離した内部細胞塊をフィーダ一細胞上で培養した。
[0265] 4.翌日内部細胞塊がフィーダ一細胞に接着して 、ることを確認して、培養液を交 換した。以後毎日培地交換した。
[0266] 5. 5— 10日後に内部細胞塊力も増殖してくる ES細胞様の細胞が認められるように なった。細胞塊が 100から 200 mになったら継代を行った。
[0267] 6.培養液をのぞき細胞解離液を入れた。
[0268] 7. 5から 10分間処理すると ES細胞様細胞が培養ディッシュよりはがれてくるので、 これを細く弓 I V、たガラス管で拾 、上げ数回出し入れすることで細胞塊を数個に分け た。
[0269] 8.培養液中で細胞解離液を洗浄して除き、新しいフィーダ一上に細胞塊を移した [0270] 9.翌日、培養液を交換した。以後毎日培地交換した。
[0271] 10.フィーダ一上で個々の細胞塊が 100— 200 m程度に増殖するのを確認した 後、同様の操作で継代を行った。
[0272] 11.細胞が十分増殖するようになれば（35mm培養ディッシュ 1枚に増えるぐらい） サル ES細胞の通常の継代操作と同様に継代ができるようになった。この段階に達す れば以後安定した培養が可能であることが確認される。
[0273] この実施例で榭立された細胞は、幹細胞であることが確認される。
[0274] 本実施例では、基本培地に DMEMZF12を例示するが、 DMEMまたは他の基 本培地でも問題なく使用できることが示される。
[0275] (マーカーによる染色）
次に、榭立した細胞の未分化状態を、特異的マーカーによる染色により調べた。 E S細胞を、 4% PFAで固定し標準的な培養細胞の免疫染色法 (Willingham, M. C. et. al. , 1985. An Atlas of Immunofluorescence m Cultured Cell , Academic Press, Orlando, FL, pp. 1— 13. )【こ従!/、免疫染色を行う。 ブロッキングは 0. 1% Triton XZPBSZ2%スキムミルクを用い室温で一時間、 洗いは 0. 1% TritonXZPBSを用い室温で 5分を 4回行う。一次抗体は SSEA—4 、 TRA- 1 - 60のモノクローナル抗体をそれぞれ 200 μ g/ml (CLONTECH)を 1 Z100希釈したものを、二次抗体は FITC標識 goat 抗— mouse IgG (H + L) (ZY MED LABORATORIES, INC)を 1Z200希釈したものを使用した。二次抗体の 反応後はローダミンファロイデイン (rhodamine phalloidin) (Molecular Probe) 、 DAPI (SIGMA)の順に染色を行 、シグナルを検出する。
[0276] ALP (アルカリホスファターゼ)の組織ィ匕学的染色は、以下のように行った。培養デ イツシュをダルベッコの PBS (—）で 2回洗浄した後、 4°Cの 95%冷エタノールで 30分 以上固定し、次いで 4°Cの無水エタノールで 30分以脱水する。固定液を除き、デイツ シュを室温で 0. 1M Tris— HCl (pH9. 0〜9. 5)にて 5分間 3回洗浄した後、 1. 5 〜2mlの染色液（ナフトール AS— BIホスフェート（シグマ社、カタログ番号 N— 2125 ) 2. 5mgと、ファースト赤 TR塩（Sigma) 15mg [またはファースト紫 B塩 6mg (Sigma )、ファースト青 BB塩 12. 5mg (Sigma) ]とを 0. 1M Tris— HC1緩衝液 25mlに加 え、遮光下で 3〜5分間撹拌して溶解し、次いで濾過する）を各ディッシュに加え、遮 光下で室温にて ALPを 15〜30分間染色する。 PBS (—）で 2回洗浄した後グリセ口 ールを加え位相差立体顕微鏡で赤褐色に染まった ES細胞コロニーを検鏡する。
[0277] このようにして、榭立した幹細胞は通常どおり多分ィ匕能を保持していることが確認さ れる。
[機器、器具]
•高速冷却遠心器（日立 SCR20B)
'ローター（日立 RPR9— 2)
•ゴム製アダプター (曰立 300A500)
'遠心用フラスコ（コースター 3025)
•アクリル製遠心用容器 (特注品，池本理化）
'微小核細胞精製用フィルター： Swinnex 25mm MILLIPORE製のホルダーに フィルター（8 /z m, 5 μ ηι, 3 μ ηι ; SN110614, SN— 110613, SN11061 2, NUCLEPORE)をそれぞれセットし、オートクレーブ滅菌する。
[0278] 3. 操作
1)正常ヒト線維芽細胞へのプラスミド DNAトランスフエクシヨンおよび、 G418耐性ク ローンの分離
(1)トランスフエクシヨン 2日前にトリプシン処理により分散した正常ヒト線維芽細胞（2 . 5 X 105cells/flask)を 4個の培養用フラスコ（25cm2)に植え込む。
(2)トランスフエクシヨンの 4時間前に新しい培養液（10%FBS, DMEM)に交換す る。
(3)実施例 1にお!/、て調製されるような染色体除去カセット NA (25 μ gDNA)を含む リン酸カルシウム— DNA沈殿液（2. 5ml)を作製し、ピペッティングにより均一にした 沈殿液 0. 5πι1 (5 ^ 8 DNA)を培養用フラスコにカ卩え、緩やかに広げて COインキ
2 ュベータ一内で 4時間培養する。
(4)無血清培養液（DMEM)で細胞表面を洗い、 1. 5mlの 15%グリセロール ZHB S溶液で 1分間慮理する。 (5)無血清培養液 (DMEM)で細胞表面を洗!、、通常の培養液（10%FBS, DM EM)で 2日間培養する。
(6)トリプシン処理により細胞を分散し、 Ο418 (400 /^ ·πι1)を含む選択培養液（10 %FBS, DMEM)に懸濁した細胞（1 X 105cells/plate)をプラスチックシャーレ（ 直径 100mm) 60枚に植え込み、約 3週間選択培養する（2〜3日おきに培養液を交 換する)。
(7)各シャーレに出現した G418耐性細胞力もなるコロニーをクローユングする。
2) G418耐性ヒト細胞とマウス A9細胞との細胞融合および雑種細胞の分離
(1)トリプシン処理により細胞を分散し、培養液（10%FBS, DMEM)懸濁したそ れぞれの細胞（1 X 106cells/each)を培養用フラスコ（25cm2)に同時に植え込み 、 1日間培養する。
(2) PBS溶液で細胞表面を 2回洗った後、 3mlの PEG (1 : 1. 4)溶液で 1分間処理し 、さらに、 3mlの PEG (1 : 3)溶液に換え 1分間処理する。
(3) PEG溶液を吸い取り、無血清培養液 (DMEM)で 3回洗った後、通常の培養液 ( 10%FBS, DMEM)で 1日間培養する。
(4)トリプシン処理により細胞を分散し、ゥヮバイン（1 X 10_5M)および G418 (800 μ g/ml)を含む二重選択培養液（10%FBS, DMEM)に懸濁した細胞（2 X 105 cells/plate)をプラスチックシャーレ（直径 100mm)に植え込み、約 3週間選択培 養する（2〜3日おきに培養液を交換する）。
(5)各組み合わせ (NTI— 4細胞ある 、は MRC— 5細胞）より少なくとも 1個の雑種細 胞クローンを分離する。
3)雑種細胞からの微小核細胞分離
(1)微小核を分離する細胞を培養用フラスコ（75cm2)で 80%〜90%飽和の状態ま で培養する。
(2)トリプシン処理により細胞を分散し、 Ο418 (800
Figure imgf000091_0001
を含む選択培養液（1 0%FBS, DMEM) 7mlに懸濁させ、遠心用フラスコ（25cm2) 6個に細胞懸濁液 1 mlずつを分配し、 4ml選択培養液を加え、 2日間培養する。なお、コルセミド処理を する前の細胞密度は 70〜80%飽和程度が望ましい、従って 2日間の培養を必ずし も必要としない場合もある。
(3)コルセミド（0. 05 μ gZml)を含む培養液（20%FBS, DMEM)に交換し、さら に 2日間培養 (微小核を形成させる）する。
(4)培養液を除去し、あら力じめ保温（37°C)してお 、たサイトカラシン B ( 10 μ g/ml )溶液を遠心用フラスコに、ほぼ 、つぱいに満たす。
(5)アクリル製遠心用容器に遠心用フラスコを挿入し、温湯（34°C)注入後（遠心用フ ラスコ中の水面を超えない程度）、ゴム製のアダプターを装着し、 34°C、 8000rpm、
1時間の遠心分離を行う。
(6)遠心分離後のサイトカラシン B溶液を除去し、遠心用フラスコの隅に位置する微 小核細胞を lmlの無血清培養液 (DMEM)に懸濁した後回収し、さらに、 1mlの無 血清培養液で洗 、、最初の微小核細胞懸濁液に合わせる（合計約 12ml)。
(7)懸濁液を 8 m, 5 m, 3 μ mの順にフィルターを通し、微小核細胞を精製す る。通常、 8 μ mのフィルターを 1個、 5 μ mは 2個、 3 μ mは 1個を使用する。
4)微小核細胞と別種細胞との微小核雑種細胞形成
( 1)別種細胞 (例えば、 ES細胞以外の細胞）を培養用フラスコ（25cm2)で 80%飽和 の状態まで培養する。
(2)精製した微小核細胞懸濁液を 1 , 500rpm, 5分間の遠心分離後、 PHA— P (5 0 μ g/ml)を含む無血清培養液（DMEM) 2mlに再懸濁する。
(3)遠心分離の間に、細胞表面を無血清培養液 (DMEM)で 2回洗浄後、再懸濁し た微小細胞を静かに播き、 15分間（37°C) COインキュベーター内に静置する。
2
(4)微小核細胞懸濁液を吸い取り、 PEG ( 1 : 1. 4)溶液 3mlをカ卩ぇ正確に 1分間処 理する。 PEGは細胞に対して毒性が強いため、ここでの処理時間は正確に行う必要 がある。
(5) PEG溶液を除去し、無血清培養液 (DMEM)で少なくとも 3回洗い、通常培養液 ( 10%FBS, DMEM)で 1日間培養する。
(6)トリプシン処理により細胞を分散し、 Ο418 (800
Figure imgf000092_0001
を含む選択培養液 (D MEM)に懸濁した細胞をプラスチックシャーレ（直径 100mm) 3枚に植え込み、約 3 週間選択培養する（2〜3日おきに培養液を交換する)。 (7)シャーレに出現した G418耐性別種細胞力もなるコロニーをクローユングする。 5)微小核雑種細胞のヒト染色体同定:キナクリン'へキスト併用染色法により染色体 解析を行 、、選択した G418耐性別種細胞クローンに正常ヒト染色体が含まれて 、る ことを確認する。また、染色体 in situノヽイブリダィゼーシヨン法を行い、存在するヒト 染色体上の染色体除去カセットの標識部位を同定する。
[0280] (染色体除去）
染色体除去カセットを導入した ES細胞を用 V、て相同組換えによりを所望の染色体 上に載せる。続いて、染色体除去カセットを用いてセカンド遺伝子座上に載せる。所 望の遺伝子の両遺伝座に CECが導入された ES細胞を得る。
[0281] 4. FISH解析
CECをぞれぞれの染色体にもつ ES細胞を同定し、ライブラリーを作製する。
[0282] 所望の染色体の所望の遺伝子座にホモに CECが導入された ES細胞と体細胞を 融合する。融合細胞を pCMV— Creで処理し、 ES細胞由来の所望の染色体が除去 されたクローンを得る。この遺伝子操作 ES細胞を in vivoや in vitroで様々な組織 に分ィ匕誘導し、移植実験を行うことで拒絶反応の有無および程度を検定する。
[0283] (G418 高濃度薬剤耐性クローンの選択 (ホモ細胞選択用プロトコール)）
Pgk— neoカセットを導入したトランスジエニック ES細胞を、 250 /z gZml G4で選択 する。
2. G418而性 ES細胞（5xl06個）を直径 3cmの培養デイシュ（6— well plate)に 播き、 5- 10 mg/ml の高濃度 G418存在下で 3日間培養する。この間、毎日選 択培地の交換を行う。
選択培養後 3日目に、 3cm培養デイシュ 3枚にサブカルチャーし、 5- 10 mg/ml の高濃度 G418存在下で 4— 7日間培養する。この間、毎日選択培地の交換を行う。
4. 約 40個ほどの高濃度 G418耐性 ES細胞のコロニーが出現する。
5. それぞれのコロニーから DNAを抽出し、ゲノム PCR法またはサザンハイブリダィ ゼーシヨン法により Pgk—neoカセットをホモに持つクローンを選択する。
[0284] (4.結果および考察）
ヒト細胞における場合は、上記のようにかなり複雑な手順ではある力 注意深く細胞 の状態を観察しつつ行えば、融合細胞および染色体導入は比較的容易である。しか し、この実験方法にとって 4つのポイントがある。（1)融合に用いるポリエチレングリコ ールは製造元あるいはロットによりその毒性が異なるため、ロットチェックを行い、毒性 の少ないものを使用する。（2)細胞により phytohemagglutinin— P (PHA— P)に 対する感受性が異なることから、 PHA—P濃度を減少させるあるいは全く用いな 、な ど、必要に応じて調節する。（3)微小核細胞の精製に用いるフィルターにもれが生じ 、親細胞が混入することがある。従って、精製した微小核細胞の一部をプレートにま き親細胞の混入の有無を確かめる。（4)必ずしも染色体が完全な状態で導入されて V、るとは限らな 、ため、染色体解析が必須である。
[0285] 実際には、前述した実験をくり返し行い、最終的に充分数の細胞を分離する。染色 体解析によりヒト染色体の存在を検索することによって、クローンにお!/、て正常ヒト染 色体がそれぞれ 1本含まれていることが確認することができる。上述のように、選択培 養にあたっては受容細胞が 100%死滅する最低濃度を用いる。さらに、得られた G4 18耐性細胞クローンにつ 、て染色体解析は必須である力 ヒト染色体特異的 DNA プローブを用いた RFLP解析、あるいは染色体 in situハイブリダィゼーシヨン法など によっても、導入染色体の存在を確認することができる。
[0286] このようにして、所望の染色体が一方または両方のコピーで除去された ES細胞と、 所望の細胞との融合細胞を得ることができる。
[0287] (実施例 11：染色体交換の例）
実施例 1〜10に記載された実験手順を応用して染色体交換細胞を作製することが できる。その具体的手順を以下に示す。
[0288] その手順は、体細胞の染色体（2コピーまたは 1コピー）をもつ細胞質を ES細胞と融 合させ、入れた染色体と同じ ES細胞由来染色体をカセットで抜くと!、うものである。 以下に具体的な手順を示す。
1.体細胞由来の MHC染色体 2本 (父性および母性）にそれぞれ異なる薬剤抵抗性 遺伝子を導入する。
2. 該体細胞と A9細胞を細胞融合する。融合細胞を上記微小核作製法を応用する ことで、 MHC染色体のみを含む微小核を作製する。 3. ES細胞は、 MHC染色体 2本に CEC (GFPまたは HSV—TK遺伝子をマーカ 一に含 む)導入された、 MHC— CEC ES細胞を作製する。
4. MHC-CEC ES細胞と体細胞由来の MHC微小核を細胞融合する。薬剤選 択により、体細胞由来の MHC染色体が導入された微小核融合 MHC— CEC ES 細胞を選択する。
5. 体細胞由来の MHC染色体が導入された微小核融合 MHC— CEC ES細胞を Cre処理する。 GFP陰性細胞を FACSソーティングまたはガンシクロビル抵抗性細胞 を薬剤選択することで、 ES細胞由来の MHC染色体が除去され、体細胞由来の MH C染色体をもつ、 MHC個人対応型 2倍体 ES細胞を選び出す (MHC染色体交換幹 細胞）。
[0289]
6. 作出された MHC個人対応型幹細胞（2倍体)を、患者の必要な細胞に分ィ匕誘 導し移植治療に用いる。
[0290] このようにして、染色体交換細胞を生産し、医療応用することができる。
[0291] (実施例 12 :再生治療の例）
上記実施例で得られる染色体除去後の融合細胞を神経細胞に分化誘導し、生体 脳に移植することが可能である。神経細胞への分ィ匕には、以下の条件を使用する。 この未分化細胞を、 3回無血清培地にて洗浄し、血清を完全に取り除いた。 ES細胞 培地にゥシ血清の代わりにノックアウト血清代替添カ卩物 KSR (Knockout Serum Replacement； GIBCO/lnvitrogen Cat. No. 10828— 028)を加えた培地を 用いて、 PA6フィーダ一細胞上で未分化細胞を 8— 11日間培養する（Kawasaki e t al. , 2000, Neuron 28 ; 31— 40、Tada et al. , 2003 ; Dev. Dyn . , 227 ; 504— 510.参照）。これにより、神経細胞に分ィ匕させることができる。
[0292] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきた力 本発 明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求 の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、 本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に 基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引 用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載さ れているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであるこ とが理解される。
産業上の利用可能性
所望の染色体を除去するための DNAキット、カセット（遺伝子工学ツールとして）、 所望の染色体が除去された細胞、およびそのライブラリー、所望の染色体 (特に、 M HC)を除去することにより、必要に応じて必要な遺伝子を導入することによりティラー メイド医療が可能になる。

Claims

請求の範囲
[1] レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって、 マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセット。
[2] 前記レコンビナーゼ認識配列は、 ΙοχΡ配列、 FRT部位、 attB配列， attP配列およ び res部位配列力 なる群より選択される配列を含む相同組み換え配列である、請求 項 1に記載の遺伝子カセット。
[3] 前記マーカー遺伝子は、グリーン蛍光タンパク質 (GFP)遺伝子、イェロー蛍光タン ノ ク質 (YFP)遺伝子、シアン蛍光タンパク質 (CFP)遺伝子およびレッド蛍光タンパ ク質 (dsRED)遺伝子からなる群より選択される遺伝子を含む、請求項 1に記載の遺 伝子カセット。
[4] さらに、選択配列を含む、請求項 1に記載の遺伝子カセット。
[5] 前記選択配列は、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、ピューロマイシン抵抗性付与遺 伝子、ネオマイシン抵抗性付与遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性付与遺伝子、ブラス トサイジン抵抗性付与遺伝子、ゼォシン抵抗性付与遺伝子、 HAT抵抗性付与遺伝 子、ジフテリアトキシン抵抗性付与遺伝子およびフルォロウラシル抵抗性付与遺伝子 からなる群より選択される遺伝子をコードする配列を含む、請求項 4に記載の遺伝子 カセット。
[6] 前記レコンビナーゼ認識配列は、配列番号 1に記載される配列 ATAACTTCGT ATAATGTATGCTATACGAAGTTATを含む、請求項 1に記載の遺伝子カセ ッ卜。
[7] さらに、配列番号 2に記載される IRES配列を含む、請求項 1に記載の遺伝子カセ ッ卜。
[8] さらに、配列番号 3に記載される CAG配列を含む、請求項 1に記載の遺伝子カセッ
[9] 前記レコンビナーゼ認識配列は、逆方向に 2つ含まれる、請求項 1に記載の遺伝子 カセット。
[10] 前記レコンビナーゼ認識配列は、逆方向に 2つ含まれ、該レコンビナーゼ認識配列 の間に、 CAG、マーカー配列、 IRES配列、および選択配列を含む、請求項 1に記 載の遺伝子カセット。
[11] レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって、 マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを含む、所望の染色体を除 去するための組成物。
[12] 前記染色体が、多能性関連遺伝子を含む、請求項 11に記載の組成物。
[13] 前記除去は、前記染色体の両コピーの除去を含む、請求項 11に記載の組成物。
[14] A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって
、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、
B)該レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする核 酸配列を含む核酸分子と、
を備える、所望の染色体を除去するためのキット。
[15] A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって
、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、
B)該レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする核 酸配列を含む核酸分子と、
C)幹細胞と、
を備える、幹細胞力も所望の染色体を除去するためのキット。
[16] A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって 、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、
B)該レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする核 酸配列を含む核酸分子と、
C)幹細胞と、
D)所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞と、
を備える、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞から所望の染色体を 除去し、該細胞に多分ィ匕能を付与するためのキット。
[17] 所望のゲノムを有する細胞力 所望の染色体または染色体群を除去し、該細胞に 多分ィ匕能を付与するための方法であって、
A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって 、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、
B)該遺伝子カセットを幹細胞に導入する工程と、
C)該幹細胞と所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞とを融合するェ 程と、
D)該融合された細胞に、該レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼま たはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、
E)再構成が生じる条件に該融合された細胞を曝す工程と、
F)融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色 体が除去された細胞を選択する工程と、
を包含する、方法。
[18] 請求項 17に記載の方法によって得られた細胞。
[19] 所望の染色体が除去された、細胞。
[20] 所望の染色体が除去された、幹細胞。
[21] 前記幹細胞は、 ES細胞である、請求項 20に記載の幹細胞。
[22] 前記染色体が MHCまたは対応する遺伝子をコードする配列を含む、請求項 19に記 載の細胞。
[23] 所望の染色体または染色体群が交換された、染色体交換細胞。
[24] 所望の染色体または染色体群が交換された、染色体交換された幹細胞。
[25] 前記幹細胞は、 ES細胞である、請求項 24に記載の幹細胞。
[26] ES細胞と、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する微小核との融合細胞であ つて、該融合細胞力 ES細胞由来の所望の染色体が除去され、多分化能を有する 、染色体交換細胞。
[27] ES細胞と、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞との融合細胞であつ て、該融合細胞から、所望の染色体が除去され、多分化能を有する、融合細胞。
[28] ES細胞と、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞との融合細胞であつ て、該融合細胞から、該 ES細胞の染色体が除去され、多分化能を有する、融合細胞
[29] 前記所望の染色体は、該 ES細胞の MHC、拒絶反応関連遺伝子またはそれに対応 する遺伝子をコードする配列を含む染色体である、融合細胞。
[30] 前記所望の染色体は、該 ES細胞のマウスの第 6染色体、第 11染色体、第 12染色体 および第 17染色体、ヒトの第 6染色体からなる群より選択される染色体または該染色 体に対応する染色体の一方コピーまたは両コピーを含む染色体である、融合細胞。
[31] 前記所望の染色体は、該 ES細胞の染色体のうち 1つまたは 2つ以上を含む染色体 である、融合細胞。
[32] 前記所望の染色体は、該 ES細胞の染色体全部である、融合細胞。
[33] 前記所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞は、疾患に罹患した個体由 来のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞である、融合細胞。
[34] 前記所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞は、疾患に罹患した個体由 来のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞であり、前記所望の染色体は、該 E
S細胞の染色体全部である、融合細胞。
[35] 所望の染色体が除去された細胞を複数種類含む、細胞ライブラリー。
[36] レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって、マ 一力一遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットの、所望の染色体を除去する ための使用。
[37] レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって、マ 一力一遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットの、所望の染色体を除去する ための組成物の製造のための使用。
[38] 所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞から所望の染色体を除去する ための方法であって、
A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって 、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、
B)該遺伝子カセットを細胞に導入する工程と、
C)該細胞と所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞とを融合する工程 と、
D)該融合された細胞に、該レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼま たはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、 E)再構成が生じる条件に該融合された細胞を曝す工程と、
F)融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色 体が除去された細胞を選択する工程と、
を包含する、方法。
[39] 染色体交換細胞を生産するための方法であって、
A)レコンビナーゼ認識配列を 1つまたは逆方向に 2つ含む遺伝子カセットであって 、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、
B)該遺伝子カセットを第 1の細胞に導入する工程と、
C)所望の染色体を有する第 2の細胞の細胞質と、第 1の細胞とを融合させる工程；
D)該第 2の細胞の所望の染色体に対応する該第 1の細胞の染色体を、該第 1の細 胞の該染色体の除去を可能にするように、該レコンビナーゼ認識配列を認識するレ コンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、
E)再構成が生じる条件に該融合された細胞を曝す工程と、
F)融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色 体が除去された細胞を選択する工程と、
を包含する、方法。
[40] 請求項 38または 39に記載の方法によって生産される細胞。
PCT/JP2006/300311 2005-01-13 2006-01-12 所望の染色体を除去する方法およびそれを利用したテイラーメイド医療 WO2006075671A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006552968A JPWO2006075671A1 (ja) 2005-01-13 2006-01-12 所望の染色体を除去する方法およびそれを利用したテイラーメイド医療
EP06702679A EP1842909A1 (en) 2005-01-13 2006-01-12 Method for removing desired chromosome and tailor-made medical treatment utilizing the same
CA002598022A CA2598022A1 (en) 2005-01-13 2006-01-12 Method for removing desired chromosome and tailor-made medical treatment utilizing the same
US11/813,930 US20090264312A1 (en) 2005-01-13 2006-01-12 Method for removing desired chromosome and tailor-made medical treatment utilizing the same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-006859 2005-01-13
JP2005006859 2005-01-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006075671A1 true WO2006075671A1 (ja) 2006-07-20

Family

ID=36677696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/300311 WO2006075671A1 (ja) 2005-01-13 2006-01-12 所望の染色体を除去する方法およびそれを利用したテイラーメイド医療

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20090264312A1 (ja)
EP (1) EP1842909A1 (ja)
JP (1) JPWO2006075671A1 (ja)
CA (1) CA2598022A1 (ja)
WO (1) WO2006075671A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024029253A1 (ja) * 2022-08-04 2024-02-08 株式会社豊田中央研究所 相同組換え方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230154075A (ko) * 2021-03-09 2023-11-07 아이벡스솔, 아이엔씨. 세포 및 유전자 치료를 위한 바이러스 벡터 생성자 세포를 생성하고 최적화하기 위한 조성물 및 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003512053A (ja) * 1999-10-16 2003-04-02 アルテミス・ファーマシューティカルズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 遺伝子破壊用条件付遺伝子トラッピング構築物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003512053A (ja) * 1999-10-16 2003-04-02 アルテミス・ファーマシューティカルズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 遺伝子破壊用条件付遺伝子トラッピング構築物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COUMOUL X. ET AL.: "Inducible suppression of Fgfr2 and Survivin in ES cells using a combination of the RNA interference (RNAi) and the Cre-LoxP system", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 32, no. 10, 2004, pages E85-1 - E85-7, XP002333061 *
MATSUMURA H. ET AL.: "ES-Taisaibo Yugo Saibokaku kara no Seinshokutai Jokyo Gijutsu no Kaihatsu", ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SCIENTY OF JAPAN KOEN YOSHISHU, DAI 28 KAI, 25 November 2005 (2005-11-25), pages 729, 3P-0989, XP003001301 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024029253A1 (ja) * 2022-08-04 2024-02-08 株式会社豊田中央研究所 相同組換え方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1842909A1 (en) 2007-10-10
CA2598022A1 (en) 2006-07-20
US20090264312A1 (en) 2009-10-22
JPWO2006075671A1 (ja) 2008-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12037596B2 (en) Targeted modification of rat genome
Zhang et al. Production of transgenic mice by random recombination of targeted genes in female germline stem cells
JP2018086017A (ja) 体細胞の再プログラミング
JPWO2003027278A1 (ja) テーラーメイド多能性幹細胞およびその利用
AU2002330465B2 (en) Screening method for a reprogramming agent, reprogramming agent screened by the method, method for using the reprogramming agent, method for differentiating an undifferentiated fusion cell, and production method of cells, tissues and organs.
WO2005080598A1 (ja) 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
Yamamoto et al. Derivation of rat embryonic stem cells and generation of protease-activated receptor-2 knockout rats
KR102599982B1 (ko) 이식용 세포 집단 및 그의 제조 방법
JP2000516463A (ja) 特定の遺伝的特性を有する哺乳動物を作製する方法
JP2015500637A (ja) 一倍体細胞
Yae et al. Sleeping beauty transposon-based phenotypic analysis of mice: lack of Arpc3 results in defective trophoblast outgrowth
Pan et al. Inactivation of Nxf2 causes defects in male meiosis and age-dependent depletion of spermatogonia
US20140370602A1 (en) Trophectodermal cell-specific gene transfer methods
JPWO2005003342A1 (ja) メチル化を利用したトランスジェニック生物を作製する方法およびシステム
JP2020520669A (ja) 孵化していない卵における鳥類胚の性決定方法およびその手段
JP7011228B2 (ja) ダウン症モデルラット及びその作製法
WO2006041910A2 (en) Stem cells derived from uniparental embryos and methods of use thereof
WO2006075671A1 (ja) 所望の染色体を除去する方法およびそれを利用したテイラーメイド医療
CN116536272A (zh) 用于体细胞重新编程和调整印记的组合物和方法
JP4118579B2 (ja) Ｅｃａｔ５ノックアウト細胞
EP4248743A1 (en) Method for preparing transgenic non-human animal having genome including humanized immunoglobulin gene locus
WO2003106651A2 (en) Spermatogonial cell line
WO2024163615A1 (en) Brain-derived neurotrophic factor-nano luciferase transgenic rodents and methods of use thereof
Gotow et al. Transposon-Based Sleeping Beauty
Messineo Development of a gene targeting strategy (Recombinase-Mediated CAssette Exchange) to generate cellular models of MYH9-related disease

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006552968

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006702679

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2598022

Country of ref document: CA

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006702679

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2006702679

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11813930

Country of ref document: US