WO2006075642A1 - 低酸素応答亢進剤 - Google Patents

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Naoyuki Fukuchi
Akiko Oonuki
Hiroshi Yamamoto
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Ajinomoto Co., Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a hypoxic response enhancer and a pharmaceutical composition containing the same, and in particular, the drug can be suitably used in the form of a pharmaceutical product and food, or in the form contained in food. I can do it.
  • HIF-1 hyperoxia inducible factor-1
  • HIF-1 ⁇ Non-patent Document 1
  • HRE hypooxia-response element
  • HIF-1a responds to hypoxia and loses its activity by ubiquitination in the presence of oxygen and further degradation by the proteosome. That is, biosynthesis of proteins using HIF-1 as a transcriptional regulator is actively performed under hypoxia. In a situation where the oxygen concentration is increased, HIF-1a is degraded and HIF-1 is regarded as a transcriptional promoter. Protein biosynthesis is reduced. Proteins that use HIF-1 as a transcription promoting factor include erythrobotin, VEGF (vascular endothelial cell growth factor), tyrosine hydroxylase that controls dopamine biosynthesis, phosphofructokinase related to glycolysis, and phosphoglycease.
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • tyrosine hydroxylase that controls dopamine biosynthesis
  • phosphofructokinase related to glycolysis
  • phosphoglycease phosphoglycease
  • Non-Patent Documents 2 and 3 Phosphate kinase I, lactate dehydrogenase A, aldolase, enolase I, glucose transporter (Glut-1), hemoxygenase 1, transferrin, inducible nitrogen monoxide synthase, etc. are known (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • HIF-1 activity enhances the biosynthesis of proteins that use HIF-1 as a transcriptional regulator.
  • HIF-1 a transcriptional regulator
  • Ivan et al. Found a compound characterized by the stability of HIF-1 ⁇ (non- Patent document 4) reports that the compound enhances the biosynthesis of erythropoietin, suggesting that it is effective in the treatment of anemia (Non-patent document 5).
  • Arginine has been reported to be involved in the production mechanism of erythropoietin (Non-patent Documents 6 and 7), but the relationship with HIF-1, which is a hypoxia-inducing factor, has not been known so far.
  • Diseases that occur with ischemia or hypoxia, such as kidney It is not clear whether it is effective for dysfunction, myocardial infarction, heart failure, cerebral infarction, diabetic vascular disorder, obstructive arteriosclerosis colitis, ulcer, spinal cord disorder, optic neuropathy, neuropathy, etc. When thinking about the treatment of such a disease state, the elucidation was needed.
  • Non-patent document 1 G. Shi Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5510-5514 (1995)
  • Non-patent document 2 Nagao et al., Protein Nucleic Acid Enzyme, Vol. 41, ⁇ .16, p2522-2531 (1996)
  • Non-Patent Document 3 Sogawa et al., Protein Nucleic Acid Enzyme, Vol.44, No.15, p2472-2477 (199 9)
  • Non-Patent Document 4 M. Ivan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 13459-13464 (2002)
  • Non-Patent Document 5 Q. Wang et al., J Am Soc Nephrol. 2004; Oct 15 : 773A
  • Non-Patent Document 6 S. Imagawa et.AL, blood, 96, 1716-1722 (2000)
  • Non-Patent Document 7 S. Imagawa et al "Kidney Int., 61, 396-404 (2002)
  • An object of the present invention is to provide a hypoxic response enhancer that enhances the action of HIF-1, which is a hypoxia-inducing factor, and enhances the hypoxic response.
  • Another object of the present invention is to provide a therapeutic agent for a disease caused by ischemia or hypoxia.
  • Another object of the present invention is to provide a food containing the above enhancer and an HIF-1 action enhancer.
  • the present invention provides a hypoxic response enhancer characterized by containing arginine as an active ingredient.
  • the present invention also provides a therapeutic agent for diseases caused by ischemia or hypoxia, characterized by containing a hypoxic response enhancer.
  • the present invention also provides a food characterized in that it is packaged in a package containing arginine and labeled to have a hypoxic response enhancing action.
  • the present invention also provides an enhanced HIF-1 action characterized by containing arginine as an active ingredient.
  • the drug containing arginine of the present invention has an arginine content of 100% to 0.1% by mass (hereinafter abbreviated as%) as long as the substantial effect of arginine contained in the drug is expressed. Preferably 100% to 5%.
  • the content of algin in the drug is preferably 0.001 to 20 g, more preferably 0.1 to 10 g.
  • Arginine contained as an active ingredient in the drug of the present invention may be in the form as it is, but may be various salts. Moreover, you may use the compound converted into arginine by biological reaction.
  • the salt include organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, citrate, malonic acid and malic acid, inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid and nitric acid, various amines and metal salts.
  • the L-form, D-form and DL-form may be used, but the L-form and DL-form are preferred.
  • Examples of compounds that are converted to arginine by in vivo reactions include, for example, citrulline, ornithine, arginosuccinic acid, peptides containing arginine, etc. Also included are compounds that can be converted to arginine by the above, compounds that produce arginine by proteases, esterases, transferases and the like.
  • the enhancement of hypoxic response which is a feature of the drug of the present invention, is the enhancement of the reaction carried out in vivo in an ischemia or hypoxic state (for example, oxygen concentration of 20 vol% or less, preferably 10% or less).
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • tyrosine hydroxylase that regulates donomin biosynthesis
  • phosphofructokinase involved in glycolysis phosphodarice mouth phosphate kinase I
  • lactate dehydrogenase A examples include aldolase, enolase I, or glucose transporter (Glut-1), hemoxygenase 1, transferrin, inducible nitric oxide synthase, and other proteins that are induced by hypoxia.
  • the disease that occurs with ischemia or hypoxia that is a treatment target using the drug of the present invention refers to a disease in which some ischemia or hypoxia occurs at the disease site, such as renal failure, myocardial infarction, Heart failure, cerebral infarction, diabetic vascular disorder, obstructive arteriosclerosis colitis, ulcer, spinal cord disorder, optic neuropathy, neuropathy, etc. Also good.
  • the drug characterized by enhancing the action of HIF-1 of the present invention means that the expression of the gene encoding the protein involved in HIF-1, more specifically, the pathological condition of HIF-1, in vivo is substantially Refers to a drug that is enhanced.
  • arginine has the same mechanism as a therapeutic agent for the above-mentioned diseases. Can be used in combination with drugs that do not enhance the action. Or, even if the same enhancement of HI F-1 action is possible, the action may be expressed additively, and as a therapeutic drug for the above diseases including arginine, the same mechanism of HIF-1 Can be used in combination with drugs that enhance the action.
  • Examples of methods used with such other drugs include renal failure, myocardial infarction, heart failure, cerebral infarction, diabetic vasculopathy, obstructive arteriosclerosis colitis, ulcer, spinal cord injury, etc.
  • a method of using a single agent or a plurality of agents for diseases associated with ischemia such as neuropathy or neuropathy and the agent is more preferably an agent that does not enhance the action of HIF-1.
  • the drug may be a drug that enhances the action of HIF-1.
  • the form of the preparation is any form such as injection, liquid, syrup tablet, granule, fine granule, powder, capsule, cream, ointment, suppository, etc.
  • all possible carriers such as lactose, glucose, starch, calcium carbonate, gelatin, cellulose, hydroxymethylcellulose, etc.
  • all possible solvents such as water, ethanol, olive oil, pharmaceuticals such as surfactants, stabilizers, etc. It may contain any possible components, seasonings such as sweeteners, fragrances, colorants and the like.
  • the food of the present invention contains any carrier, solvent, surfactant, stabilizer, sweetener, seasoning, flavor, colorant, etc. that can be used as a food in any form of solution, powder, and solid. May be. Moreover, you may mix with other foodstuffs and drinks.
  • Example 1 Enhancement of erythropoietin (EPO) secretion by arginine using HeD3B cells Using human fetal liver cell line Hep3B, changes in erythropoietin production due to changes in arginine (Arg) concentration in the medium were measured.
  • the medium used in the experiment was based on the D-MEM medium composition, a medium containing no amino acids (Zero medium), a medium containing all 20 amino acids in the amounts shown in Table 1 (Full medium), and Full Arginine-deficient medium ( ⁇ Arg medium) obtained by removing only arginine from the medium was used.
  • Hep3B cells were seeded in a 96-well culture dish at 5 X 10 4 cells / well, cultured for 24 hours, washed once with Zero medium, and arginine was added at a final concentration of 0-400 uM ⁇ Arg Incubate for 24 hours in normal oxygen (normoxia, 21% 0) and hypoxia (hypoxia, 3% 0).
  • Example 2 ⁇ ffl that targets erythropoietin promoter activity of arginine using HeD3B cells ( ⁇ HTF synthesis: WT, 3 ⁇ 4 HT HTF synthesis A HTFTF ffl)
  • arginine is a component necessary for erythropoietin (EPO) production under normal oxygen.
  • Oxygen sensitivity involved in the regulation of EPO gene expression The involvement of HIF-1, a transcription factor, was suggested.
  • HIF-1 is known to have a binding site in the enzyme region located downstream of the EPO gene.
  • a reporter assembly with an EPO promoter region and an enhancer region is used.
  • WT wild type EPO reporter vector
  • the construction of the wild type (WT) EPO reporter vector was performed as follows. From the human genomic DNA (Roche, 1691112), the promoter region of the EPO gene that introduced the restriction enzyme Sail and Hindlll sites (-118 to +26 of the transcription start point), and the enhancer that introduced the restriction enzymes BamHI and Sail site. The regions (120 to 245 bp downstream of the poly A addition signal) were cloned by PCR using the primers shown in Sequence Listings 1 and 2, 3 and 4, respectively.
  • the obtained PCR fragment obtained by amplifying the two promoter regions and the enhancer region was introduced into the Bglll-Hindlll site of the luciferase reporter vector pGL3-Enhancer (Promega, E1771) by three-party ligation, and the EPO gene We constructed a wild type (WT) EPO reporter vector with a promoter region and an enhancer region upstream.
  • WT wild type
  • a mutant (A HIF) EPO reporter vector to which HIF-1 cannot bind was constructed as follows. Based on the wild-type (WT) EPO reporter vector, the primers shown in Sequence Listing 5 and 6 were used to change the HIF-1 binding region (TACGTG CT) in the enhancer region to the QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit (: STRATAGENE 200517- In 5), V and 2 mutations (TACTTGCG) were introduced to construct a mutant ( ⁇ HIF) EPO reporter vector that could not bind HIF-1.
  • the wild type (WT / Enh) SV40 reporter vector and the mutant type ( ⁇ HIF / Enh) SV40 reporter vector for use as controls were constructed as follows.
  • a type ( ⁇ HIF) enhancer region was introduced to construct a wild type (WT / Enh) SV40 reporter vector and a mutant type ( ⁇ HIF / Enh) SV40 reporter vector.
  • Hep3B cells were seeded in a 96-well culture dish at 5 X 10 4 cells / well, cultured for 6 hours, and then replaced with a transfection solution containing each reporter vector (plasmid solution lmg / ml) (lOOul / well) and introduce gene.
  • a transfection solution containing each reporter vector (plasmid solution lmg / ml) (lOOul / well) and introduce gene.
  • Use Fugene6 Fugene6 (Roche) for transfection, add 1.8ul of Fugene6 to 50ul of OPTI-MEM to 1ml of medium, mix and let stand at room temperature for 5 minutes.
  • the cells were cultured with ypoxia, 3% 0) for 24 hours. After culturing, Dual-GloLuciferase Assay ki
  • HIF-1 a hypoxia-sensitive factor
  • HIF-1a a hypoxia-sensitive factor
  • HIF-1a HIF-1a is degraded in the ubiquitin Z proteasome system under normal oxygen, and It is known that under low oxygen, its decomposition is suppressed and stable HIF-1a moves into the nucleus and promotes transcription. Therefore, the increase in erythropoietin mediated by HIF-1 by arginine-added potassium may be involved in the stability of HIF-1 ⁇ .
  • arginine and the amount of HIF-1 ⁇ protein was examined the addition of arginine and the amount of HIF-1 ⁇ protein.
  • Hep3B cells were seeded at 9 ⁇ 10 5 cells / well in a 6-well culture dish, cultured for 24 hours, and then washed once with Zero medium! In FuU medium containing 20 amino acids and ⁇ Arg medium The cells were cultured under normal oxygen (normoxia, 21% 02) and hypoxia (hypoxia, 3% 02) for 24 hours.
  • RIPA Buffer 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholate ⁇ 50 mM Tris.HCl pH 7.4, 0.1% SDS ⁇ 50 mM ⁇ -glycerophosphate ⁇ 25mM NaF ⁇ 20mM EGTA, ImM DTT ⁇ ImM Na VO Protease
  • RIPA Buffer 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholate ⁇ 50 mM Tris.HCl pH 7.4, 0.1% SDS ⁇ 50 mM ⁇ -glycerophosphate ⁇ 25mM NaF ⁇ 20mM EGTA, ImM DTT ⁇ ImM Na VO Protease
  • the crude cell extract was collected with hibitor cocktail (Nacalai Testa, 25955-11)). The collected crude cell extract was centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes, and the supernatant protein was quantified. 20 ug of total protein in each sample was fractionated on 6-13% SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane, HIF-1 ⁇ protein was detected by Western method using HIF-1 ⁇ antibody (Becton Dickinson, 610958).
  • HIF-1 a protein was detected in Full medium under normal oxygen, but HIF-1 ⁇ protein disappeared in ⁇ Arg medium, which is an arginine-deficient medium, and HIF ⁇ 1 ⁇ protein was detected.
  • ⁇ Arg medium which is an arginine-deficient medium
  • HIF ⁇ 1 ⁇ protein was detected.
  • stable HIF-1 ⁇ protein was detected equally in both Full medium and ⁇ Arg medium. Therefore, it was confirmed that arginine is essential for the stabilization of HIF-1 ⁇ protein under normal oxygen, and that HIF-1 ⁇ protein becomes unstable and disappears due to arginine deficiency.
  • FIG. 1 shows the effect of arginine on wrinkle expression.
  • FIG. 2 shows the effect of arginine on the promoter activity of sputum.
  • Fig. 3 shows the effect of arginine at the HIF-1 binding site (EPO promoter activity) (3-
  • FIG.4 Shows the effect of arginine at the HIF-1 binding site (SV40 promoter activity) (4
  • FIG. 5 shows the effect of arginine on HIF_1 a protein.

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Abstract

　有効成分としてアルギニンを含有する低酸素応答亢進剤、及び該低酸素応答亢進剤を含有する虚血あるいは低酸素状態を伴って生じる疾患の治療薬を提供する。この低酸素応答亢進剤は、低酸素誘導因子であるHIF-1の作用を亢進させ、低酸素応答を亢進させることができる。

Description

低酸素応答亢進剤
技術分野
[0001] 本発明は、低酸素応答亢進剤、及びこれを含有する医薬組成物に関し、特に医薬 品および食品の形態で、或は食品に含まれた形態でこの薬剤を好適に使用すること が出来る。
[0002] (発明の背景）
HIF-1 (hypoxia inducible factor- 1)は 120KDaのサブユニット HIF- 1 aと、 91〜94KD aのサブユニット HIF-1 βよりなる蛋白質であり（非特許文献 1)、低酸素で発現が誘導 される DNAエレメント、 HRE (hypoxia- response element)に結合し、低酸素下での遺 伝子発現を誘導する。
このうち HIF-1 aは低酸素に応答し、酸素存在下においてはュビキチン化、さらに はプロテオソームにおいて分解されることにより、その活性を失う。すなわち、低酸素 下では HIF-1を転写制御因子とする蛋白質の生合成は活発に行われる、酸素濃度 が上昇した状況において、 HIF-1 aは分解を受け、 HIF-1を転写促進因子とする蛋 白質の生合成は低下する。 HIF-1を転写促進因子とする蛋白質としては、エリスロボ ェチン、 VEGF (vascular endothelial cell growth factor)をはじめ、ドーパミン生合成を 制御するチロシンヒドロキシラーゼ、解糖系に関わるホスホフルクトキナーゼ、ホスホ グリセ口リン酸キナーゼ I、乳酸脱水素酵素 A、アルドラーゼ 、エノラーゼ I、あるいは グルコース輸送担体 (Glut-1)、ヘムォキシゲナーゼ 1、トランスフェリン、誘導型一酸 化窒素合成酵素などが知られて 、る (非特許文献 2及び 3)。
HIF-1の活性を亢進する薬剤は、 HIF-1を転写制御因子とする蛋白質の生合成を 亢進するが、例えば Ivanらは HIF-1 αの安定ィ匕を特徴とする化合物を見出し (非特許 文献 4)、その化合物がエリスロポエチンの生合成を亢進することを報告し、貧血治療 に効果があること示唆して 、る（非特許文献 5)。
アルギニンは、エリスロポエチンの産生メカニズムに関与することが報告されている（ 非特許文献 6及び 7)が、低酸素誘導因子である HIF-1との関係はこれまで知られて おらず、さらにアルギニンが虚血あるいは低酸素状態を伴って生じる疾患、例えば腎 不全、心筋梗塞、心不全、脳梗塞、糖尿病性血管障害、閉塞性動脈硬化症大腸炎 、潰瘍、脊髄障害、視神経障害、神経障害等に対して有効であるかは全く明らかにさ れておらず、このような病態の治療を考えた場合その解明が必要とされていた。
[0003] 非特許文献 1 : G.し Wang et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5510-5514 (1995) 非特許文献 2 :永尾ら、蛋白質核酸酵素、 Vol.41, Νο.16、 p2522-2531 (1996) 非特許文献 3 :十川（Sogawa)ら、蛋白質核酸酵素、 Vol.44, No.15、 p2472-2477 (199 9)
非特許文献 4 : M. Ivan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 13459—13464 (2002) 非特許文献 5 : Q. Wang et al., J Am Soc Nephrol. 2004; Oct 15: 773A
非特許文献 6 : S. Imagawa et. AL, blood, 96, 1716-1722 (2000)
非特許文献 7 : S. Imagawa et al" Kidney Int., 61, 396-404 (2002)
発明の開示
[0004] 本発明は、低酸素誘導因子である HIF-1に対して作用を亢進させ、低酸素応答を 亢進させる低酸素応答亢進剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、虚血あるいは低酸素状態を伴って生じる疾患の治療薬を提供する ことを目的とする。
さらに本発明は、上記亢進剤を含有する食品及び HIF-1作用亢進剤を提供するこ とを目的とする。
[0005] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、アルギニンの低下 力 ¾IF-1 aの不安定化を引き起こし、アルギニンの添加によって HIF-1 aの安定性が 回復する現象を見出し、本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は、有効成分としてアルギニンを含有することを特徴とする低酸 素応答亢進剤を提供する。
本発明は、又、低酸素応答亢進剤を含有することを特徴とする虚血あるいは低酸 素状態を伴って生じる疾患の治療薬を提供する。
本発明は、又、アルギニンを含有し、低酸素応答亢進作用を有する旨の表示をした パッケージに包装されてなることを特徴とする食品を提供する。
本発明は、又、有効成分としてアルギニンを含有することを特徴とする HIF-1作用亢 進剤を提供する。
発明を実施するための最良の形態
[0006] 本発明のアルギニンを有効成分とする薬剤は、その薬剤に含有されるアルギニン の実質の効果が発現されれば良ぐアルギニンの含量率は 100%〜0.1質量％(以下、 %と略称する）であるのが良ぐ好ましくは 100%〜5%である。また、薬剤中のアルギ- ンの含量は 0.001〜20gであるのがよぐ好ましくは 0.1〜10gである。
本発明の薬剤に有効成分として含まれるアルギニンは、そのままの形でも良いが様 々な塩でも良い。又、生体反応でアルギニンに変換される化合物を用いても良い。塩 の例としては蟻酸、酢酸、プロピオン酸、クェン酸、マロン酸、リンゴ酸のような有機酸 、塩酸、硫酸、硝酸のような無機酸、あるいは種々のァミン、金属塩等が挙げられる。 また L-体、 D-体、 DL-体いずれの形でも良いが、好ましくは L-体、 DL-体がある。 生体内の反応でアルギニンに変換される化合物としては、例えば、シトルリン、オル 二チン、アルギノコハク酸あるいはアルギニンを含むペプチド等が挙げられる力 これ ら以外でも想定される代謝酵素による 1〜5段階の反応でアルギニンへと変換される 化合物、プロテアーゼ、エステラーゼ、トランスフェラーゼ等でアルギニンを生じる化 合物等も含まれる。
[0007] 本発明の薬剤の特徴である低酸素応答の亢進とは、生体内で虚血あるいは低酸 素状態 (例えば、酸素濃度 20vol%以下、好ましくは 10%以下）において行われる反応 の亢進を指し、具体的には VEGF (vascular endothelial cell growth factor)をはじめ、 ドーノ ミン生合成を制御するチロシンヒドロキシラーゼ、解糖系に関わるホスホフルク トキナーゼ、ホスホダリセ口リン酸キナーゼ I、乳酸脱水素酵素 A、アルドラーゼ 、エノ ラーゼ I、あるいはグルコース輸送担体（Glut-1)、ヘムォキシゲナーゼ 1、トランスフエ リン、誘導型一酸化窒素合成酵素等、低酸素で誘導される蛋白質の発現亢進等が 挙げられる。
本発明の薬剤を用いた治療対象とする虚血あるいは低酸素状態を伴って生じる疾 患とは、疾患部位に何らかの虚血あるいは低酸素状態が生じる疾患を指し、例えば、 腎不全、心筋梗塞、心不全、脳梗塞、糖尿病性血管障害、閉塞性動脈硬化症大腸 炎、潰瘍、脊髄障害、視神経障害、神経障害などが挙げられるが、その他の疾患で も良い。
本発明の HIF-1の作用を亢進することを特徴とする薬剤とは、生体内において HIF- 1、より具体的には HIF-1のその病態が関与する蛋白質をコードする遺伝子の発現を 実質的に亢進する薬剤を指す。
[0008] さらに、アルギニンによる HIF-1作用の亢進を介したエリスロポエチンの産生の上昇 作用を見出したことから、アルギニンを含む、上記疾患に対する治療薬として、同じメ 力-ズムである HIF-1の作用を亢進しない薬剤と併用することができる。又は、同じ HI F-1作用の亢進であっても、作用が相加的に発現する可能性があることから、アルギ ニンを含む、上記疾患に対する治療薬として、同じメカニズムである HIF-1の作用を 亢進する薬剤と併用することができる。
このような他の薬剤と共に用いる方法としては、腎不全、心筋梗塞、心不全、脳梗 塞、糖尿病性血管障害、閉塞性動脈硬化症大腸炎、潰瘍、脊髄障害、？見神経障害 、神経障害等の虚血を伴って生じる疾患に対する単一あるいは複数の薬剤と同時に 使用する方法が挙げられ、その薬剤が HIF-1の作用を亢進しない薬剤であることがよ り好ましいが、その薬剤が HIF-1の作用を亢進する薬剤であっても良い。
本発明の薬剤を医薬品として使用する場合、その製剤の形は注射剤、液剤、シロッ プ剤錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏剤、座剤などいか なる形態でも良ぐ乳糖、ブドウ糖、澱粉、炭酸カルシウム、ゼラチン、セルロース、ヒ ドロキシメチルセルロース、等の可能なあらゆる担体、水、エタノール、オリーブ油等 の可能なあらゆる溶剤、界面活性剤、安定化剤等の薬学的に可能ないかなる成分、 甘味料等の調味料、香料、着色剤等を含んでいても良い。
また本発明の食品は溶液、粉末、固体のいかなる形態でも良ぐ食品として使用可 能ないかなる担体、溶剤、界面活性剤、安定化剤、甘味料、調味料、香料、着色剤 等を含んでいても良い。また他の食品、飲料品と混合していても良い。
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。なお、以下の実施例は、本発明 を説明するものであって、本発明をこれに限定するものではない。
実施例
[0009] 実施例 1 HeD3B細朐を用いたアルギニンのエリスロポエチン (EPO)分泌亢進作用 ヒト胎児肝細胞株 Hep3Bを用い、培地中のアルギニン (Arg)濃度の変化によるエリ スロポェチン産生量の変化を測定した。実験時に用いた培地は、 D-MEM培地組成 を元に、アミノ酸を一切含まない培地 (Zero培地）、 20種類の全アミノ酸を表 1に示さ れる量で含有する培地（Full培地）、及び Full培地からアルギニンのみを除いたアル ギニン欠乏培地（ Δ Arg培地）を用いた。
表 1 FuU培地中のアミノ酸組成
Figure imgf000006_0001
[0011] Hep3B細胞を 96ゥエル培養シャーレに 5 X 104cells/wellで藩種し、 24時間培養後 Ze ro培地で 1回洗浄した後、アルギニンを最終濃度 0〜400uM添カ卩した Δ Arg培地で、 通常酸素下（normoxia、 21%0 )及び低酸素下（hypoxia、 3%0 )で 24時間培養を行な
2 2
つた。培養終了後、培地中に含まれているエリスロポエチン量を EPO ELISA kit (Roc h社、 1693417)にて定量を行なった。実験は N=2で行なった。
エリスロポエチンの分泌量は、通常酸素下（酸素濃度 21vol%)ではアルギニン欠乏 では全く分泌されないが、アルギニン添カ卩により濃度依存的に分泌量が増加すること が認められ、 200uMの添加でほぼ最大値を示した（図 1)。また、低酸素下でのエリス ロポェチン分泌量はアルギニン欠乏でも通常酸素下に比べ高 、値であつたが、アル ギニン 50uMの添カ卩で更に増加し、 50uMの添カ卩で最大値を示すことが確認された（図
[0012] 実施例 2 HeD3B細胞を用いたアルギニンのエリスロポエチンプロモーター活件に針 するィ乍 ffl ( 』HTF 合铕 :WT、 ¾ 』HTF 合铕 A HTFに するィ乍 ffl) 実施例 1にお 、て示されたように、アルギニンは通常酸素下ではエリスロポエチン（ EPO)産生に必要な成分である力 EPO遺伝子の発現制御に関与する酸素感受性 転写因子である HIF-1の関与が示唆された。 HIF-1は、 EPO遺伝子下流に位置する ェンノヽンサ一領域に結合サイトが存在することが知られており、 HIF-1の関与を検討 するために、 EPOプロモーター領域及びェンハンサー領域をもつレポーターアツセィ 系を構築し、 EPOプロモーター活性でアルギニンの効果と HIF-1の関与を検討した。 野生型（WT) EPOレポーターベクターの構築は、下記のように行った。 Human Geno mic DNA(Roche、 1691112)より、制限酵素 Sail及び Hindlllサイトを導入した EPO遺伝 子のプロモーター領域 (転写開始点の- 118〜+ 26)と、制限酵素 BamHI及び Sailサイ トを導入したェンハンサー領域（ポリ A付加シグナルの下流 120〜245bp)をそれぞれ 配列表 1と 2、 3と 4に示したプライマーを用い、 PCR法でクローユングを行った。
[0013] 得られた 2つのプロモーター領域及びェンハンサー領域を増幅した PCR断片を、ル シフェラーゼレポーターベクター pGL3- Enhancer (Promega、 E1771)の Bglll- Hindlllサ イトに 3者ライゲーシヨンで導入し、 EPO遺伝子のプロモーター領域とその上流にェン ハンサー領域をもつ野生型 (WT) EPOレポーターベクターを構築した。
また、 HIF-1が結合できない変異型（A HIF) EPOレポーターベクターの構築は、下 記のように行った。野生型 (WT) EPOレポーターベクターを元に配列表 5および 6に 示したプライマーを用いて、ェンハンサー領域に存在する HIF-1結合領域 (TACGTG CT)に QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit (： STRATAGENE 200517- 5)を用 V、て 2箇所変異 (TACTTGCG)を導入し、 HIF- 1が結合できな 、変異型（ Δ HIF) EPO レポーターベクターを構築した。
さらにコントロールとして用いるための、野生型（WT/Enh) SV40レポーターベクター 及び変異型（ Δ HIF/Enh) SV40レポーターベクターの構築は下記のように行った。細 胞内で恒常的に発現する SV40プロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子が導入さ れているレポーターベクター pGL3- Cont Promega、 E1741)の Sail- BamHIサイトに、ク ローニングした野生型 EPOェンノヽンサ一領域及び変異型（ Δ HIF)ェンハンサー領域 を導入し、野生型（WT/Enh) SV40レポーターベクター及び変異型（ Δ HIF/Enh) SV4 0レポーターベクターを構築した。
[0014] Hep3B細胞を 96ゥエル培養シャーレに 5 X 104cells/wellで藩種し、 6時間培養後、 各レポーターベクター（プラスミド溶液 lmg/ml)を含むトランスフエクシヨン溶液に置換 (lOOul/well)し、遺伝子導入する。トランスフエクシヨンには Fugene6 (Roche)を用い、 培地 lmlに対し、 OPTI-MEM 50ulに Fugene6 1.8ulを加え、混合し、室温で 5分静置 する。その後プラスミド溶液を 1.2ug (lmg/ml)を加え混合し、室温で 20分静置した溶 液に、培地を lml加えた溶液をトランスフエクシヨン溶液として用いた。
遺伝子導入 18時間後に 1 X Zero培地で 1回洗浄を行い、アルギニンを最終濃度 0u M〜300uM添カ卩した A Arg培地で、通常酸素下（normoxia、 21%0 )及び低酸素下（h
2
ypoxia, 3%0 )で 24時間培養を行なった。培養終了後、 Dual-GloLuciferase Assay ki
2
t(Promega、 E2920)でルシフェラーゼ活性を測定した。実験は N=3で行なった。
その結果、レポーターアツセィにおいても、 EPO蛋白発現量と同様に通常酸素下で はアルギニンの添カ卩により濃度依存的に EPOプロモーター活性が増加すること、また 低酸素下ではアルギニン 50uMで最大値を示した（図 2)。しかし、 HIF-1が結合できな V、変異型レポーターベクターを用いた評価では、アルギニン濃度依存的な EPOプロ モーター活性の増加は見られな力つた（図 3)。更に、恒常的に発現する SV40プロモ 一ターに HIF-1結合領域を含む EPOのェンハンサー領域を導入すると、アルギニン 濃度依存的にプロモーター活性が上昇すること、及び変異型（ Δ HIF)ェンハンサー 領域を導入するとアルギニン存在下でもプロモーター活性が上昇しないことが確認さ れ、アルギニンは HIF-1結合領域を含むェンハンサー領域に作用し、遺伝子発現を 増加することが確認された（図 4)。
実施例 3 Hep3B細胞を用いたアルギニンの HIF-1 αに対する作用
低酸素感受性因子である HIF- 1は、 HIF-1 aと HIF- 1 β (Arnt)のへテロダイマーか ら成り、 HIF-1 aが通常酸素下ではュビキチン Zプロテアソーム系で分解されること、 及び低酸素下ではその分解が抑制され安定ィ匕した HIF-1 aが核内へ移行し転写促 進に働くことが知られている。よってアルギニン添カ卩による HIF-1を介したエリスロポェ チン増加は、 HIF-1 αの安定ィ匕に関与している可能性があり、アルギニン添加と HIF- 1 α蛋白量について検討を行った。
Hep3B細胞を 6ゥエル培養シャーレに 9 X 105cells/wellで藩種し、 24時間培養後、 Ze ro培地で 1回洗浄を行!ゝ、 20種類のアミノ酸を含む FuU培地及び Δ Arg培地で通常酸 素下（normoxia、 21%02)及び低酸素下（hypoxia、 3%02)で 24時間培養を行なった。 培養終了後、 cold PBSで 1回洗浄後、氷上に 5分静置した後、 RIPA Buffer (150mM N aCl、 1% NP— 40、 0.5% deoxycholateゝ 50mM Tris.HCl pH 7.4、 0.1% SDSゝ 50mM β - glycerophosphateゝ 25mM NaFゝ 20mM EGTA、 ImM DTTゝ ImM Na VO Protease In
2 3、
hibitor cocktail (ナカライテスタ、 25955-11))で細胞粗抽出液を回収した。回収した 細胞粗抽出液を 15000 rpm 10分遠心した上清の蛋白定量を行ない、各サンプルの 総蛋白量 20ugを 6〜13%の SDS-PAGEで分画し、 PVDFメンブレンにトランスファーした 後、抗 HIF- 1 α抗体（BectonDickinson社、 610958)を用いた Western法により HIF-1 α蛋白の検出を行った。
[0016] その結果、通常酸素下の Full培地では HIF-1 a蛋白が検出されたが、アルギニン 欠乏培地である Δ Arg培地では HIF-1 α蛋白は消失し、アルギニン lOOuM添カ卩で HIF -1 α蛋白が検出された。一方、低酸素下では、 Full培地及び Δ Arg培地共に安定ィ匕 した HIF-1 α蛋白が同等に検出された。よって通常酸素下では、アルギニンは HIF-1 α蛋白の安定化に必須で、アルギニンの欠乏で HIF-1 α蛋白が不安定ィ匕し、消失す ることが確認された。
すなわち、本発明では、通常酸素下においてはアルギニン単独添加で、その濃度 依存的にエリスロポエチンの分泌上昇を誘導する作用が見られた。また、この作用は 低酸素感受性因子である HIF-1を介して!/、ることが示され、アルギニンの低下が HIF- 1 α蛋白の不安定化を引き起こすこと、及びアルギニンの添カ卩によって HIF-1 α蛋白 の安定性が回復することが示された。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1]ΕΡΟ発現におけるアルギニンの影響を示す。
[図 2]ΕΡΟプロモーター活性におけるアルギニンの影響を示す。
[図 3]HIF-1結合部位におけるアルギニンの影響を示す (EPOプロモーター活性) (3-
1:21% 02下（normoxia) ; 3—2:3% 02下（hypoxia) )。
[図 4]HIF-1結合部位におけるアルギニンの影響を示す（SV40プロモーター活性) (4
-1:21% 02下（normoxia) ; 4— 2:3% 02下（hypoxia) )。
[図 5]HIF_1 a蛋白質に対するアルギニンの影響を示す。

Claims

請求の範囲
[1] 有効成分としてアルギニンを含有することを特徴とする低酸素応答亢進剤。
[2] エリスロポエチンの分泌を亢進する請求項 1記載の低酸素応答亢進剤。
[3] HIF-1の作用を亢進する請求項 1又は 2記載の低酸素応答亢進剤。
[4] HIF-1 aの作用を亢進する請求項 1又は 2記載の低酸素応答亢進剤。
[5] 通常酸素下で亢進する請求項 2〜4に 、ずれか 1項記載の低酸素応答亢進剤。
[6] 請求項 1〜4の!ヽずれか 1項記載の低酸素応答亢進剤を含有することを特徴とする 虚血あるいは低酸素状態を伴って生じる疾患の治療薬。
[7] 虚血あるいは低酸素状態を伴って生じる疾患が、腎不全、心筋梗塞、心不全、脳 梗塞、糖尿病性血管障害、閉塞性動脈硬化症大腸炎、潰瘍、脊髄障害、？見神経障 害又は神経障害である請求項 6記載の治療薬。
[8] アルギニンを含有し、低酸素応答亢進作用を有する旨の表示をしたパッケージに 包装されてなることを特徴とする食品。
[9] 有効成分としてアルギニンを含有することを特徴とする HIF-1作用亢進剤。
[10] HIF-1 aの作用を亢進する請求項 9記載の HIF-1作用亢進剤。
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