WO2006036082A1 - Cosmetic agent and a method for the production thereof - Google Patents

Cosmetic agent and a method for the production thereof Download PDF

Info

Publication number
WO2006036082A1
WO2006036082A1 PCT/RU2004/000347 RU2004000347W WO2006036082A1 WO 2006036082 A1 WO2006036082 A1 WO 2006036082A1 RU 2004000347 W RU2004000347 W RU 2004000347W WO 2006036082 A1 WO2006036082 A1 WO 2006036082A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
telomeric
dna
sequence
complex
Prior art date
Application number
PCT/RU2004/000347
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Artur Vladimirovich Rybakin
Original Assignee
Obschestvo S Ogranichennoy Otvetstvennostyu 'sankt-Peterburgsky Institut Krasoty'
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Obschestvo S Ogranichennoy Otvetstvennostyu 'sankt-Peterburgsky Institut Krasoty' filed Critical Obschestvo S Ogranichennoy Otvetstvennostyu 'sankt-Peterburgsky Institut Krasoty'
Priority to PCT/RU2004/000347 priority Critical patent/WO2006036082A1/en
Publication of WO2006036082A1 publication Critical patent/WO2006036082A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A61K8/606—Nucleosides; Nucleotides; Nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the present invention relates to the field of cosmetology and relates to skin care products.
  • cosmetics are known to enhance the appearance of the skin.
  • cosmetics are known, the use of which allows you to accumulate and retain water in the skin, thereby eliminating or preventing dryness and loss of skin elasticity for some time.
  • antioxidants that bind free radicals formed in the skin or prevent the formation of new ones, thereby preventing the occurrence of reactions with their participation that adversely affect the normal functioning of the cell.
  • drugs are known that contain ascorbic acid or vitamin E as antioxidants (Holsk David E. E., Jon D. Na, Fasial skip reptiviop, Cyr Orip and Orthal 14: 249).
  • Known cosmetics containing substances include ascorbic acid or vitamin E as antioxidants (Holsk David E. E., Jon D. Na, Fasial skip reptiviop, Cyr Orip and Orthal 14: 249).
  • retinoids e.g. retinoids (Nolsk David EE, Joh D. D. ⁇ / q, Facial skip diet, Hypalpol 14: 248), which stimulate fibroblast activity and the synthesis of new collagen fibers in the dermis, as well as mitotic activity and cell renewal, leading to a decrease in the thickness of the stratum corneum, an increase in the thickness of the granular layer of the skin and an improvement in the structure of the skin.
  • retinoids Nolsk David EE, Joh D. D. ⁇ / q, Facial skip diet, Hypalpol 14: 248
  • a disadvantage of the known cosmetics is that they do not affect the aging process of the skin cells of the body, giving only a relatively small effect on improving its functions and appearance. Disclosure of invention
  • An object of the present invention is to provide a cosmetic product capable of preventing aging of skin cells, thereby improving skin function and appearance more effectively.
  • the proposed cosmetic product containing the active ingredient and the carrier in which, according to the invention, the active ingredient contains a complex that includes a telomeric DNA sequence and its associated peptide having a nuclear localization signal (NLS), and which is able to penetrate across the plasma membrane of the cell.
  • NLS nuclear localization signal
  • the telomeric DNA sequence contained in it penetrates the nucleus of the skin cell, leading to an increase in the number of divisions that the cell is able to carry out, i.e. slowing down the aging process of the cell, as a result of which the skin acquires a large number of young cells.
  • This ensures the acceleration of re-epithelialization of the skin, an increase in the density of its cells and counteraction to thinning of the skin in the epidermis, as well as an increase in the production of elastin fibers by fibroblasts in the dermis.
  • the result is a more effective improvement in the appearance of the skin, as well as its more efficient functioning.
  • said peptide contained in a cosmetic product of the invention may include a protein transduction domain (PTD).
  • PTD protein transduction domain
  • Such peptides may contain the amino acid sequences GRKKRRQRRRPPQKKKKKKV, RQIKIWFQNRRKKKKKKKKKKK OR
  • the indicated ability to penetrate the plasma membrane of a cell can also be achieved by using a complex including a liposome into which the indicated telomeric DNA sequence and the indicated peptide are introduced.
  • This problem is also solved by the fact that the proposed method of obtaining a cosmetic product, including the synthesis of the telomeric sequence of human DNA and the connection of the obtained telomeric sequence with a peptide having a nuclear localization signal, with the formation of a complex that can penetrate through the plasma membrane of the cell.
  • a peptide containing a protein transduction domain can be used.
  • the telomeric DNA sequence and the peptide associated with it are introduced into the liposome.
  • the telomeric sequence is synthesized based on the total genomic DNA used as a matrix, which is obtained from a blood sample or human tissue to which the cosmetic product is intended to be applied.
  • the proposed cosmetic product contains the active ingredient and a carrier.
  • the active ingredient is a complex that includes a telomeric DNA sequence and is able to penetrate the plasma membrane of the cell.
  • the complex also contains a peptide linked to a telomeric sequence b having a nuclear localization signal.
  • Telomeric regions, or telomeres, of DNA chromosomes are special terminal regions of linear chromosomal DNA, to which certain proteins are also associated. It is believed that telomeres, in particular, protect chromosomes from degradation and fusion with other chromosomes.
  • Telomeric DNA consists of repeatedly repeated short tandem nucleotide sequences, where one DNA strand is enriched in guanine (G), and its complementary strand is enriched in cytidine (C). In humans, like most eukaryotes, G-rich the telomeric DNA chain is constructed from TTAGGG blocks, and the C-rich chain contains CCCTAA blocks.
  • the proposed cosmetic product preferably includes telomeric sequences of human DNA containing from 100 to 300 p. However, sequences of a different length can also be used according to the present invention.
  • a nuclear localization signal refers to an amino acid sequence, also called NLS (from the English expression “nuclear losalysis sequence”), recognized by certain receptors on the cell’s nuclear membranes that carry the peptide containing it from the cytoplasm into the nucleus.
  • NLS sequences are described, for example, in Japs D. A. et al., Nisleart tarapetipa resorpShop: And kev soptrol poipt and postpaprrt? 2000, BioEssavs 22: 532-544.
  • NLS sequences include, in particular, the NLS sequence of the T-antigen (T-ant) of the SV-40 virus, consisting of PKKKRKV amino acids, which are recognized and associated with a number of receptors of the nuclear membranes of human cells involved in the transport of peptides into the nucleus, and some similar with it amino acid sequences.
  • T-ant T-antigen
  • PKKKRKV amino acids which are recognized and associated with a number of receptors of the nuclear membranes of human cells involved in the transport of peptides into the nucleus, and some similar with it amino acid sequences.
  • the peptides that make up this complex may contain other amino acid sequences.
  • Obtaining a complex capable of penetrating through the plasma membrane of a cell can be achieved by including in it any components giving this property.
  • protein sequences also known as PTDs (from the expression “protein truncation domain”), or “penetrating into the cell of the peptides. " The protein transduction domain gives peptides having such domains the ability to penetrate the plasma membrane of cells.
  • PTD amino acid sequences are known (see, for example, Kaboyridis PS, Biodisal arrlisatiop of prototype tripsol, TRENDS ip Biolav, vol. 21, No.11, Novetber 2003, 498-503).
  • HCV human immunodeficiency virus
  • PTD sequence is a peptide corresponding to amino acids 43-58 of the protein of the Antennapedia family of homeoboxic proteins (Apt), found in Dsorchil, and having the amino acid sequence RQIK1WFQNRRMKWKK
  • PTD amino acid sequences can be included in a peptide linked to a telomeric sequence and carrying NLS.
  • peptides that can be used in the complex contained in the cosmetic product of the invention are, for example,
  • GRKKRRQRRRPPQKKKKRKV which is a fusion protein containing PTD, which is a 13-amino acid sequence of TAT (48-60), and NLS, which is a sequence of 7 amino acids T-ag SV-40.
  • Another peptide that can be used to create this complex is RQIKIWFQNRRMKWKKKKKKRKV, which is a fusion protein containing 16-amino acid PTD Aptr (43-58) and 7-amino acid NLS T-ag SV-40.
  • MPG is a 27-amino acid peptide GALFLGFLGAAGGTMTGGWSQ ⁇ S ⁇ V, CONSIDERING OF HYDROPHOBIC
  • PTD domain which is the sequence of HIV-1 gp41, (amino acids 1-16), and the hydrophilic domain (amino acids 20-27), which is T-ag SV-40 (see also Morris MC, Chalip L Merv J Heitz. F apd Divita G. And then I finished the song strateav fore delivep / sipa and sipale reptide sargier, 1999. Nislés As Res. 27. 3510-3517).
  • telomeric sequences with a peptide in a complex contained in a cosmetic product according to the invention can be of a different nature.
  • Peptides containing NLS and PTD carry a positive charge and can directly bind to negatively charged DNA.
  • Chemical bonds between telomeric DNA and peptides can be formed with the participation of chemical groups both already present in these molecules and introduced into them by known modifications, for example, using the biotin-streptavidin system.
  • Other substances besides PTD can be used to allow the complex of the invention to enter the cell.
  • the complex of telomeric DNA and peptide having NLS contained in the cosmetic product of the invention further includes a liposome into which said telomeric DNA and said peptide are introduced.
  • Liposomes are vesicles having membranes that consist of lipid bilayers, mainly phospholipids, and which contain an internal aqueous phase. Liposomes are widely used in medicine and cosmetology to deliver the substances enclosed in them into cells.
  • a cosmetic product according to the invention may contain both single and multi-layer liposomes.
  • Liposomes useful in such a cosmetic product may contain traditional ingredients. So, lipids are mainly phospholipids and their derivatives. Commonly used lipids include, in particular, phosphatidylcholine, cholesterol, phosphatidylethanolamine, dioleylphosphatidylglycerol, dioleylphosphatidylethanolamine and others.
  • aqueous phase in the liposomes contained in the cosmetic product according to the invention in addition to the telomeric DNA bound peptides, can also contain auxiliary ingredients traditional for liposomes, for example buffers, antioxidants (for example sodium ascorbate) and chelating agents (for example ethylenediaminetetraacetic acid).
  • auxiliary ingredients traditional for liposomes for example buffers, antioxidants (for example sodium ascorbate) and chelating agents (for example ethylenediaminetetraacetic acid).
  • Carriers that can be used as part of the proposed cosmetic products are buffers, bases for ointments and creams, and other traditional carriers for cosmetic preparations. Carriers may contain buffering agents, gelling agents, preservatives, and other excipients used in the art.
  • the proposed method of obtaining a cosmetic product includes the synthesis of a telomeric sequence of human DNA and the connection of the obtained telomeric DNA sequence with a peptide having a nuclear localization signal, with the formation of a complex that can penetrate through the plasma membrane of the cell.
  • the telomeric sequence of human DNA can be obtained and amplified by polymerase chain reaction (PCR) using total genomic DNA isolated from human body tissues as a seed. For example, it is convenient to obtain DNA from human blood cells. Total genomic DNA is isolated from human tissue, in particular from blood leukocytes, by known methods, for example, by phenol-chloroform extraction. Selection of conditions for PCR is a routine procedure and is carried out by known methods. To generate telomeric DNA, the PCR product can be amplified again. From a pool of telomeric sequences obtained in PCR of different lengths, sequences of the desired length are isolated, for example, by gel electrophoresis followed by extraction DNA from the gel, while the selection of conditions for such isolation is also a routine for specialists.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Cloning in plasmids can also be used to generate additional numbers of telomeric DNA sequences and their storage.
  • Suitable plasmids include, for example, pCR 2.1. Cloning is conveniently performed using the TA-cloning kit (IPvitrodep).
  • Peptides containing NLS as well as peptides containing both NLS and PTD, for example, as described above, can be obtained, for example, by chemical synthesis.
  • telomeric DNA sequences with a peptide having NLS is carried out, for example, by introducing both components into a carrier, which is a buffer solution having a pH close to 7.0.
  • a carrier which is a buffer solution having a pH close to 7.0.
  • the preferred molar ratio of the peptide to telomeric sequences is 100: 1 and higher.
  • Electrophoresis in a 1% agarose gel followed by staining with ethidium bromide and UV light photography allows detection of a delay in the migration of DNA fragments in the gel, which indicates the formation of the complex.
  • the telomeric DNA sequence and peptide can be introduced into the liposome.
  • liposomes containing DNA associated with the peptide are carried out according to standard methods. Liposomes containing these active substances are obtained, for example, by dispersing lipids and DNA / peptide complexes in an aqueous medium, followed by mechanical stirring, sonication and / or extrusion through filters with a defined pore size. Liposomes can also be obtained by solubilization of lipids and active substances in organic solvents or detergents, mixing with an aqueous medium and subsequent removal of the solvent, as well as other known methods.
  • Example 1 Example 1
  • Total DNA was isolated from human blood leukocytes (0.5 ml whole blood) using the standard phenol-chloroform extraction method. The DNA yield after extraction was 40-50 ⁇ g.
  • Amplification of DNA repeats' telomere was performed by polymerase chain reaction (PCR) which is carried out in a 30 .mu.l reaction mixture containing 67 mM Tris-HCL (pH 8.8), 16.6 mM (NH4) 2SO4, 0.1% Tritop X-100, 2.0mM MgCI_2, 0.5% dimethyl sulfoxide (DMSO), 4% formamide, 3 ⁇ l 25 mM dNTP, 3 units of Taq DNA polymerase, 2 ⁇ g of isolated genomic DNA, 30 pmol of direct (Forward) primer (TTAGGG) 5 , 20 pmol of reverse (Reverse) , (AATCCC) 5 .
  • PCR polymerase chain reaction
  • Both primers were obtained according to the technique proposed by Lorite et al., J. of Finalit 2002: 93 (4).
  • PCR was performed on a thermocycler using a hot stagt. After initial denaturation at 94 ° C for 3 min with the Forward primer, Taq polymerase was introduced and incubated for an additional 7 min at the same temperature. Then, 10 amplification cycles were performed in the following mode: melting at 94 ° C for 1 min, annealing at 70 ° C for 1 min, synthesis of 72 ° C for 1 min. After completion of 10 cycles, a pause of 9O 0 C was established for 10 minutes, the Reverse primer was introduced. Then, 35 cycles of amplification were carried out in the same temperature-time regime as for the previous 10 cycles. After completing 35 amplification cycles, the final synthesis was performed at 72 ° C for 7 min.
  • Detection of the DNA-peptide complex was carried out by electrophoresis on a 1% agarose gel by staining with ethidium bromide and subsequent exposure to UV light. The delay (retardation) of migration of the DNA fragment in the gel indicated the formation of the complex.
  • the use of cosmetics can be carried out in various ways.
  • the specified cosmetic product can be presented, for example, in the form of creams, ointments, gels, etc., intended for application to the skin, or solutions intended both for application to the skin (for example, using patches), and for subcutaneous administration useful for acting on dermal cells, for example fibroblasts. It is known that normal human somatic cells are able to divide only a limited number of times (the so-called
  • Heiflik limit It has been proven that with each division of the somatic cell, as a result of the so-called “end-non-replication” problem, the length of telomeric DNA is reduced (Greider S. M., 1996, Appial Rev. Bioshet., 65, 337-365); when the telomere is shortened to a certain length, the cell ceases to divide, turning into a state senility, or senesensa, after which it ceases to function normally and dies.
  • telomeric DNA and the peptide associated with it penetrate into the cells due to the presence in the peptide of a component, such as PTD, which gives the complex containing DNA and peptide the ability to penetrate the cell membrane, or due to the liposome into which the DNA is introduced and a peptide and which is capable of transporting its contents across the cell membrane.
  • a component such as PTD
  • PTD protein peptide
  • the presence of a nuclear localization signal in the peptide allows the peptide-telomeric DNA complex to penetrate through the nuclear membrane into the cell nucleus.
  • the telomere DNA sequence Penetrated into the nucleus of the cell, the telomere DNA sequence, using the enzyme systems present in the cell, attaches to the ends of the chromosomes, attaching them.
  • the cell “rejuvenates”, i.e. becomes able to carry out more divisions.
  • the skin into which the cosmetic is introduced produces more young cells.
  • the epidermal re-epithelialization process is accelerated, which provides the skin surface with younger and denser cells.
  • the epidermis is effectively maintained.
  • the penetration of the telomeric DNA-peptide complex contained in the cosmetic product into the fibroblasts located in the dermis ensures the production of more young fibroblasts in it, which, unlike the old ones, produce more elastin fibers, which makes the skin more elastic.
  • Providing the skin surface with young and densely spaced cells, maintaining the thickness of the epidermis and increasing skin elasticity provide an effective improvement in the functions and appearance of the skin.
  • the transportation of the telomeric DNA sequence into a cell carried out using the proposed cosmetic product avoids undesirable ' immunological reactions, toxic response and possible mutations.
  • This invention can be used in various skin care products used in cosmetology to improve the appearance of human skin.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

The invention relates to a cosmetic agent for improving a skin appearance and containing an active ingredient and a carrier, wherein said active ingredient comprises a complex containing a DNA telomeric sequence and a peptide which is bound therewith, provided with a nuclear localisation signal and penetrates through a cell plasmatic membrane.

Description

КОСМЕТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ COSMETIC PRODUCT AND METHOD FOR ITS PRODUCTION
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к области косметологии и касается средств для ухода за кожей.The present invention relates to the field of cosmetology and relates to skin care products.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Известны многочисленные косметические средства, улучшающие внешний вид кожи. В частности, известны косметические средства, применение которых позволяет накапливать и удерживать в коже воду, тем самым на некоторое время устраняя или предупреждая сухость и потерю эластичности кожи.Numerous cosmetics are known to enhance the appearance of the skin. In particular, cosmetics are known, the use of which allows you to accumulate and retain water in the skin, thereby eliminating or preventing dryness and loss of skin elasticity for some time.
Известны косметические средства, содержащие антиоксиданты, которые связывают образующиеся в коже свободные радикалы или препятствуют образованию новых, тем самым предотвращая протекание реакций с их участием, неблагоприятно сказывающихся на нормальном функционировании клетки. Например, известны препараты, содержащие в качестве антиоксидантов аскорбиновую кислоту или витамин E (Ноlск Dаvid E. E., Jоhп D. Na, Fасiаl sкiп rеjиvепаtiоп, Сиrr Орiп iп Орhthаlтоl 14: 249). Известны косметические средства, содержащие веществаKnown cosmetics containing antioxidants that bind free radicals formed in the skin or prevent the formation of new ones, thereby preventing the occurrence of reactions with their participation that adversely affect the normal functioning of the cell. For example, drugs are known that contain ascorbic acid or vitamin E as antioxidants (Holsk David E. E., Jon D. Na, Fasial skip reptiviop, Cyr Orip and Orthal 14: 249). Known cosmetics containing substances
(например ретиноиды (Ноlск Dаvid E. E., Jоhп D. Λ/q, Fасiаl sкiп rеiиvепаtiоп, Сиrr Орiп iп Орhthаlтоl 14:248), которые стимулируют активность фибробластов и синтез новых коллагеновых волокон в дерме, а также митотическую активность и обновление клеток в эпидермисе, приводя к снижению толщины рогового слоя, увеличению толщины зернистого слоя кожи и улучшению структуры кожи.(e.g. retinoids (Nolsk David EE, Joh D. D. Λ / q, Facial skip diet, Hypalpol 14: 248), which stimulate fibroblast activity and the synthesis of new collagen fibers in the dermis, as well as mitotic activity and cell renewal, leading to a decrease in the thickness of the stratum corneum, an increase in the thickness of the granular layer of the skin and an improvement in the structure of the skin.
Недостатком известных косметических средств является то, что они не влияют на процесс старения клеток кожи организма, давая лишь относительно небольшой эффект по улучшению ее функций и внешнего вида. Раскрытие изобретенияA disadvantage of the known cosmetics is that they do not affect the aging process of the skin cells of the body, giving only a relatively small effect on improving its functions and appearance. Disclosure of invention
Задачей настоящего изобретения является создание косметического средства, способного препятствовать старению клеток кожи, тем самым более эффективно улучшая функции кожи и ее внешний вид.An object of the present invention is to provide a cosmetic product capable of preventing aging of skin cells, thereby improving skin function and appearance more effectively.
Указанная задача решается тем, что предложено косметическое средство, содержащее активный ингредиент и носитель, в котором, согласно изобретению, активный ингредиент содержит комплекс, который включает теломерную последовательность ДНК и связанный с ней пептид, имеющий сигнал ядерной локализации (NLS), и который способен проникать через плазматическую мембрану клетки.This problem is solved by the fact that the proposed cosmetic product containing the active ingredient and the carrier, in which, according to the invention, the active ingredient contains a complex that includes a telomeric DNA sequence and its associated peptide having a nuclear localization signal (NLS), and which is able to penetrate across the plasma membrane of the cell.
При применении предложенного косметического средства содержащаяся в нем теломерная последовательность ДНК проникает в ядро клетки кожи, приводя к увеличению числа делений, которые способна осуществить клетка, т.е. замедляя процесс старения клетки, в результате чего кожа приобретает большое количество молодых клеток. Тем самым обеспечивается ускорение реэпителизации кожи, увеличение плотности ее клеток и противодействие утончению кожи в эпидермисе, а также повышение выработки эластиновых волокон фибробластами в дерме. В результате достигается более эффективное улучшение внешнего вида кожи, а также более эффективное ее функционирование.When using the proposed cosmetic product, the telomeric DNA sequence contained in it penetrates the nucleus of the skin cell, leading to an increase in the number of divisions that the cell is able to carry out, i.e. slowing down the aging process of the cell, as a result of which the skin acquires a large number of young cells. This ensures the acceleration of re-epithelialization of the skin, an increase in the density of its cells and counteraction to thinning of the skin in the epidermis, as well as an increase in the production of elastin fibers by fibroblasts in the dermis. The result is a more effective improvement in the appearance of the skin, as well as its more efficient functioning.
Для образования комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки, указанный пептид, содержащийся в косметическом средстве по изобретению, может включать домен белковой трансдукции (PTD). Такие пептиды могут содержать аминокислотные последовательности GRККRRQRRRРРQРКККRКV, RQIКIWFQNRRМКWККРКККRКV ИЛИTo form a complex capable of penetrating the plasma membrane of a cell, said peptide contained in a cosmetic product of the invention may include a protein transduction domain (PTD). Such peptides may contain the amino acid sequences GRKKRRQRRRPPQKKKKKKV, RQIKIWFQNRRKKKKKKKKKKK OR
GАLFLGFLGААGSТМGАWSQРКSКRКV.GALFLGFLGААGSТМGАWSQРКSКRКV.
Указанную способность проникать через плазматическую мембрану клетки можно также обеспечить путем использования комплекса, включающего в себя липосому, в которую введены указанная теломерная последовательность ДНК и указанный пептид. Указанная задача решается также тем, что предложен способ получения косметического средства, включающий синтез теломерной последовательности ДНК человека и соединение полученной теломерной последовательности с пептидом, имеющим сигнал ядерной локализации, с образованием комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки.The indicated ability to penetrate the plasma membrane of a cell can also be achieved by using a complex including a liposome into which the indicated telomeric DNA sequence and the indicated peptide are introduced. This problem is also solved by the fact that the proposed method of obtaining a cosmetic product, including the synthesis of the telomeric sequence of human DNA and the connection of the obtained telomeric sequence with a peptide having a nuclear localization signal, with the formation of a complex that can penetrate through the plasma membrane of the cell.
Для образования комплекса можно использовать пептид, содержащий домен белковой трансдукции. В соответствии с другой формой осуществления изобретения, при образовании комплекса теломерную последовательность ДНК и связанный с ней пептид вводят в липосому.To form a complex, a peptide containing a protein transduction domain can be used. According to another embodiment of the invention, when the complex is formed, the telomeric DNA sequence and the peptide associated with it are introduced into the liposome.
В соответствии с еще одной формой осуществления изобретения, при получении косметического средства теломерную последовательность синтезируют на основе используемой в качестве матрицы тотальной геномной ДНК, которую получают из образца крови или ткани человека, к которому предполагается применить данное косметическое средство.According to another embodiment of the invention, upon receipt of a cosmetic product, the telomeric sequence is synthesized based on the total genomic DNA used as a matrix, which is obtained from a blood sample or human tissue to which the cosmetic product is intended to be applied.
Предложенное косметическое средство содержит активный ингредиент и носитель. Активный ингредиент представляет собой комплекс, включающий теломерную последовательность ДНК и способный проникать через плазматическую мембрану клетки. Комплекс содержит также пептид, связанный с теломерной последовательностью b имеющий сигнал ядерной локализации.The proposed cosmetic product contains the active ingredient and a carrier. The active ingredient is a complex that includes a telomeric DNA sequence and is able to penetrate the plasma membrane of the cell. The complex also contains a peptide linked to a telomeric sequence b having a nuclear localization signal.
Теломерные участки, или теломеры, ДНК хромосом представляют собой специальные концевые районы линейной хромосомной ДНК, с которыми также связаны определенные белки. Считается, что теломеры, в частности, защищают хромосомы от деградации и слияния с другими хромосомами. Теломерная ДНК состоит из многократно повторяющихся коротких тандемных нуклеотидных последовательностей, где одна цепь ДНК обогащена гуанином (G), а комплементарная ей цепь обогащена цитидином (С). У человека, как и у большинства эукариот, G-богатая цепь теломерной ДНК построена из блоков TTAGGG, а С-богатая цепь содержит блоки CCCTAA.Telomeric regions, or telomeres, of DNA chromosomes are special terminal regions of linear chromosomal DNA, to which certain proteins are also associated. It is believed that telomeres, in particular, protect chromosomes from degradation and fusion with other chromosomes. Telomeric DNA consists of repeatedly repeated short tandem nucleotide sequences, where one DNA strand is enriched in guanine (G), and its complementary strand is enriched in cytidine (C). In humans, like most eukaryotes, G-rich the telomeric DNA chain is constructed from TTAGGG blocks, and the C-rich chain contains CCCTAA blocks.
Предложенное косметическое средство предпочтительно включает в себя теломерные последовательности ДНК человека, содержащие от 100 до 300 п. н. Однако, последовательности иной длины также могут быть использованы согласно настоящему изобретению.The proposed cosmetic product preferably includes telomeric sequences of human DNA containing from 100 to 300 p. However, sequences of a different length can also be used according to the present invention.
Под сигналом ядерной локализации имеется ввиду аминокислотная последовательность, называемая также NLS (от англ. выражения «nuclear lосаlizаtiоп sequence»), узнаваемая определенными рецепторами ядерных мембран клеток, осуществляющими перенос содержащего ее пептида из цитоплазмы внутрь ядра. Последовательности NLS описаны, например, в Jапs D. А. еt аl., Nисlеаr tаraеtiпa siрпаl rесорпШоп: а кеv сопtrоl роiпt iп писlеаr trапsроrt? 2000, ВiоЕssаvs 22:532-544. К NLS последовательностям относится, в частности, последовательность NLS Т-антигена (Т-аg) вируса SV-40, состоящая из аминокислот PKKKRKV, которая узнается и связывается с рядом рецепторов ядерных мембран человеческих клеток, участвующих в транспорте пептидов внутрь ядра, и некоторые схожие с ним аминокислотные последовательности. (Jапs DA еt аl., Siqпаls теdiаtiпa писlеаr tаraеtiпa апd thеir rесιиlаtiоп: Аррliсаtiоп iп drиa dеlivеrу. Меd Rеs Rеv 1998; 18:189-223; Li S, Ku C-Y. Fаrтеr AA. Сопд Y-S. Сhеп C-F. Lее W-H. Idепtifiсаtiоп оf а поvеl суtорlаsтiс рrоtеiп thаt sресifiсаllу biпds tо писlеаr lосаlizаtiоп siaпаl тоtifs. J Вiоl Сhет 1998; 273: 6183-6189).A nuclear localization signal refers to an amino acid sequence, also called NLS (from the English expression “nuclear losalysis sequence”), recognized by certain receptors on the cell’s nuclear membranes that carry the peptide containing it from the cytoplasm into the nucleus. The NLS sequences are described, for example, in Japs D. A. et al., Nisleart tarapetipa resorpShop: And kev soptrol poipt and postpaprrt? 2000, BioEssavs 22: 532-544. NLS sequences include, in particular, the NLS sequence of the T-antigen (T-ant) of the SV-40 virus, consisting of PKKKRKV amino acids, which are recognized and associated with a number of receptors of the nuclear membranes of human cells involved in the transport of peptides into the nucleus, and some similar with it amino acid sequences. (Japs DA et al., Siqpalsi teparata apde thеir resiiliatiop: Arrlisatiip dría deléveru. Med Res Rév 1998; 18: 189-223; Li S, Ku CY. Fépert. Of course, I suturedlasstis roteip tаt sіrtifiсallu bіpds thаt wrote a losalizаtiop siаpal totifs. J Віl Сhet 1998; 273: 6183-6189).
Помимо последовательности NLS, пептиды, входящие в состав указанного комплекса, могут содержать и другие аминокислотные последовательности.In addition to the NLS sequence, the peptides that make up this complex may contain other amino acid sequences.
Получение комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки, может быть обеспечено путем включения в него любых придающих такое свойство компонентов. Так, например, могут быть использованы белковые последовательности, называемые доменами белковой трансдукции, известные также как PTD (от англ. выражения «protein trапsduсtiоп domain»), или «пpoникaющиe в клетку пeптиды». Домен белковой трансдукции придает пептидам, имеющим такие домены, способность проникать через плазматическую мембрану клеток. Известен ряд аминокислотных последовательностей PTD (см., например, Каbоиridis PS, Вiоlодiсаl аррliсаtiоп оf рrоtеiп trапsdисtiоп tесhпоlоav, TRENDS iп Вiоtесhпоlоav, vol.21, No.11, Nоvетbеr 2003, 498-503). К таким последовательностям PTD, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, относится, в частности, пептид, соответствующий аминокислотам 48-60 белка TAT вируса иммунодефицита человека (HIV), имеющий последовательность аминокислот GRККRRQRRRРРQ (GrеепМ апd Lоwепstеiп PM (1998) Аиtопотоиs fипсtiопаl dотаiпs оf сhетiсаllу sупthеtizеd hитап iттипоdеfiсiепсv virиs tаt trапs-асtivаtоr рrоtеiп. CeII 55, 1179-1188). Другой такой последовательностью PTD является пептид, соответствующий аминокислотам 43-58 белка семейства гомеобоксных белков Antennapedia (Апtр), обнаруженного у Dгоsорhilа, и имеющего аминокислотную последовательность RQIK1WFQNRRMKWKKObtaining a complex capable of penetrating through the plasma membrane of a cell can be achieved by including in it any components giving this property. So, for example, protein sequences called protein transduction domains, also known as PTDs (from the expression “protein truncation domain”), or “penetrating into the cell of the peptides. " The protein transduction domain gives peptides having such domains the ability to penetrate the plasma membrane of cells. A number of PTD amino acid sequences are known (see, for example, Kaboyridis PS, Biodisal arrlisatiop of prototype tripsol, TRENDS ip Biolav, vol. 21, No.11, Novetber 2003, 498-503). Such PTD sequences that can be used in accordance with the present invention include, in particular, a peptide corresponding to amino acids 48-60 of the TAT protein of human immunodeficiency virus (HIV), having the amino acid sequence GRKKRRQRRRPPQ (GreepM apd Lowepstep PM (1998) Automated dothaips of chetisallu suptétizéd hitap ittipodefíciepsv virís tat trips-activator roroteip. CeII 55, 1179-1188). Another such PTD sequence is a peptide corresponding to amino acids 43-58 of the protein of the Antennapedia family of homeoboxic proteins (Apt), found in Dsorchil, and having the amino acid sequence RQIK1WFQNRRMKWKK
(Каbоиridis, см. выше).(Kaboiridis, see above).
Такие аминокислотные последовательности PTD могут быть включены в состав пептида, связанного с теломерной последовательностью и несущего NLS. Так, пептидами, которые могут быть использованы в комплексе, содержащемся в косметическом средстве по изобретению, являются, например,Such PTD amino acid sequences can be included in a peptide linked to a telomeric sequence and carrying NLS. Thus, peptides that can be used in the complex contained in the cosmetic product of the invention are, for example,
GRККRRQRRRРРQРКККRКV, представляющий собой слитый белок, содержащий PTD, представляющий собой 13-aминoкиcлoтнyю последовательность TAT (48-60), и NLS, представляющий собой последовательность 7 аминокислот Т-аg SV-40. Другим пептидом, который можно использовать для создания указанного комплекса, является RQIКIWFQNRRМКWККРКККRКV, представляющий собой слитый белок, содержащий 16-aминoкиcлoтный PTD Апtр (43-58) и 7- аминокислотный NLS Т-аg SV-40. Еще одним таким пептидом является MPG, представляющий собой 27-aминoкиcлoтный пептид GАLFLGFLGААGSТМGАWSQРКSКRКV, СОСТОЯЩИЙ ИЗ гидрофобного РТD-домена, представляющего собой последовательность HIV-1 gp41 , (аминокислоты 1-16), и гидрофильный домен (аминокислоты 20-27), представляющий собой Т-аg SV-40 (см. также Моrris MC, Сhаlоiп L Меrv J Неitz. F апd Divitа G. А поvеl ооtепt strаtеav fоr aепе dеlivеп/ иsiпa а siпalе рерtidе vесtоrаs а саrгiеr, 1999. Nисlеiс Асid Rеs., 27. 3510-3517).GRKKRRQRRRPPQKKKKRKV, which is a fusion protein containing PTD, which is a 13-amino acid sequence of TAT (48-60), and NLS, which is a sequence of 7 amino acids T-ag SV-40. Another peptide that can be used to create this complex is RQIKIWFQNRRMKWKKKKKKRKV, which is a fusion protein containing 16-amino acid PTD Aptr (43-58) and 7-amino acid NLS T-ag SV-40. Another such peptide is MPG, which is a 27-amino acid peptide GALFLGFLGAAGGTMTGGWSQРКSКРКV, CONSIDERING OF HYDROPHOBIC The PTD domain, which is the sequence of HIV-1 gp41, (amino acids 1-16), and the hydrophilic domain (amino acids 20-27), which is T-ag SV-40 (see also Morris MC, Chalip L Merv J Heitz. F apd Divita G. And then I finished the song strateav fore delivep / sipa and sipale reptide sargier, 1999. Nislés As Res. 27. 3510-3517).
Связь теломерных последовательностей с пептидом в содержащемся в косметическом средстве по изобретению комплексе может иметь разную природу. Пептиды, содержащие NLS и PTD, несут положительный заряд и могут прямо связываться с отрицательно заряженной ДНК. Химические связи между теломерными ДНК и пептидами могут быть образованы с участием химических группировок как уже присутствующих в этих молекулах, так и введенных в них путем известных модификаций, например с использованием системы биотин- стрептавидин. Для обеспечения проникновения комплекса по изобретению в клетку можно использовать и другие вещества, помимо PTD. Так, в еще одном воплощении настоящего изобретения содержащийся в косметическом средстве по изобретению комплекс теломерной ДНК и пептида, имеющего NLS, дополнительно включает в себя липосому, в которую введены указанная теломерная ДНК и указанный пептид.The association of telomeric sequences with a peptide in a complex contained in a cosmetic product according to the invention can be of a different nature. Peptides containing NLS and PTD carry a positive charge and can directly bind to negatively charged DNA. Chemical bonds between telomeric DNA and peptides can be formed with the participation of chemical groups both already present in these molecules and introduced into them by known modifications, for example, using the biotin-streptavidin system. Other substances besides PTD can be used to allow the complex of the invention to enter the cell. Thus, in another embodiment of the present invention, the complex of telomeric DNA and peptide having NLS contained in the cosmetic product of the invention further includes a liposome into which said telomeric DNA and said peptide are introduced.
Липосомы представляют собой везикулы, имеющие мембраны, которые состоят из бислоев липидов, преимущественно фосфолипидов, и содержащие внутреннюю водную фазу. Липосомы широко применяются в медицине и косметологии для доставки заключенных в них веществ в клетки.Liposomes are vesicles having membranes that consist of lipid bilayers, mainly phospholipids, and which contain an internal aqueous phase. Liposomes are widely used in medicine and cosmetology to deliver the substances enclosed in them into cells.
Косметическое средство по изобретению может содержать как однослойные, так и многослойные липосомы. Липосомы, полезные в таком косметическом средстве, могут содержать традиционные ингредиенты. Так, липиды представляют собой преимущественно фосфолипиды и их производные. К широко применяемым липидам относятся, в частности, фосфатидилхолин, холестерин, фосфатидилэтаноламин, диолеилфосфатидилглицерин, диолеилфосфатидилэтаноламин и другие. Водная фаза в липосомах, содержащихся в косметическом средстве по изобретению, помимо связанных с пептидами теломерных ДНК может также содержать вспомогательные ингредиенты, традиционные для липосом, например буферы, антиоксиданты (например аскорбат натрия) и хелатирующие агенты (например этилендиаминтетраукскусную кислоту).A cosmetic product according to the invention may contain both single and multi-layer liposomes. Liposomes useful in such a cosmetic product may contain traditional ingredients. So, lipids are mainly phospholipids and their derivatives. Commonly used lipids include, in particular, phosphatidylcholine, cholesterol, phosphatidylethanolamine, dioleylphosphatidylglycerol, dioleylphosphatidylethanolamine and others. The aqueous phase in the liposomes contained in the cosmetic product according to the invention, in addition to the telomeric DNA bound peptides, can also contain auxiliary ingredients traditional for liposomes, for example buffers, antioxidants (for example sodium ascorbate) and chelating agents (for example ethylenediaminetetraacetic acid).
Носители, которые могут быть использованы в составе предложенного косметического средства, представляют собой буферные растворы, основы для мазей и кремов и другие традиционные носители для косметических препаратов. В носителях могут содержаться буферные агенты, желирующие агенты, консерванты и другие используемые в данной области экципиенты.Carriers that can be used as part of the proposed cosmetic products are buffers, bases for ointments and creams, and other traditional carriers for cosmetic preparations. Carriers may contain buffering agents, gelling agents, preservatives, and other excipients used in the art.
Предложенный способ получения косметического средства включает синтез теломерной последовательности ДНК человека и соединение полученной теломерной последовательности ДНК с пептидом, имеющим сигнал ядерной локализации, с образованием комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки.The proposed method of obtaining a cosmetic product includes the synthesis of a telomeric sequence of human DNA and the connection of the obtained telomeric DNA sequence with a peptide having a nuclear localization signal, with the formation of a complex that can penetrate through the plasma membrane of the cell.
Теломерную последовательность ДНК человека можно получать и амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве затравки тотальной геномной ДНК, выделенной из тканей организма человека. Например, удобно получать ДНК из клеток крови человека. Тотальную геномную ДНК выделяют из полученной у человека ткани, в частности из лейкоцитов крови, известными способами, например, методом фенол-хлороформной экстракции. Подбор условий для ПЦР является рутинной процедурой и проводится известными методами. Для наработки количества теломерной ДНК ПЦР-продукт можно подвергать повторной амплификации. Из полученного в ПЦР пула теломерных последовательностей разной длины последовательности желаемой длины выделяют, например, с помощью гель-электрофореза с последующей экстракцией ДНК из геля, при этом подбор условий для проведения такого выделения также является рутинной процедурой для специалистов.The telomeric sequence of human DNA can be obtained and amplified by polymerase chain reaction (PCR) using total genomic DNA isolated from human body tissues as a seed. For example, it is convenient to obtain DNA from human blood cells. Total genomic DNA is isolated from human tissue, in particular from blood leukocytes, by known methods, for example, by phenol-chloroform extraction. Selection of conditions for PCR is a routine procedure and is carried out by known methods. To generate telomeric DNA, the PCR product can be amplified again. From a pool of telomeric sequences obtained in PCR of different lengths, sequences of the desired length are isolated, for example, by gel electrophoresis followed by extraction DNA from the gel, while the selection of conditions for such isolation is also a routine for specialists.
Клонирование в плазмидах также можно использовать для наработки дополнительного количества теломерных последовательностей ДНК и их храйения. К подходящим плазмидам относится, например, рСR 2.1. Клонирование удобно проводить с использованием наборов «TA-cloning kit» (Iпvitrодеп).Cloning in plasmids can also be used to generate additional numbers of telomeric DNA sequences and their storage. Suitable plasmids include, for example, pCR 2.1. Cloning is conveniently performed using the TA-cloning kit (IPvitrodep).
Пептиды, содержащие NLS, а также пептиды, содержащие как NLS, так и PTD, например такие, как описано выше, можно получить, например, химическим синтезом.Peptides containing NLS, as well as peptides containing both NLS and PTD, for example, as described above, can be obtained, for example, by chemical synthesis.
Образование комплекса теломерных последовательностей ДНК с пептидом, имеющим NLS, осуществляют, например, путем внесения обоих компонентов в носитель, представляющий собой буферный раствор, имеющий значение рН, близкое к 7,0. Предпочтительное молярное соотношение пептида и теломерных последовательностей составляет 100:1 и выше. Электрофорез в 1 % агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и съемкой в УФ-свете позволяет детектировать задержку миграции фрагментов ДНК в геле, что свидетельствует об образовании комплекса. Для получения косметического средства, в соответствии с изобретением, при образовании указанного комплекса теломерную последовательность ДНК и пептид можно вводить в липосому. Образование липосом, содержащих ДНК, связанную с пептидом, осуществляют по стандартным методикам. Липосомы, содержащие указанные активные вещества, получают, например, диспергированием липидов и комплексов ДНК/пептид в водной среде с последующим механическим перемешиванием, обработкой ультразвуком и/или экструзией через фильтры с определенным размером пор. Липосомы также можно получать солюбилизацией липидов и активных веществ в органических растворителях или детергентах, смешиванием с водной средой и последующим удалением растворителя, а также другими известными методами. ПримерThe formation of a complex of telomeric DNA sequences with a peptide having NLS is carried out, for example, by introducing both components into a carrier, which is a buffer solution having a pH close to 7.0. The preferred molar ratio of the peptide to telomeric sequences is 100: 1 and higher. Electrophoresis in a 1% agarose gel followed by staining with ethidium bromide and UV light photography allows detection of a delay in the migration of DNA fragments in the gel, which indicates the formation of the complex. In order to obtain a cosmetic product in accordance with the invention, when the complex is formed, the telomeric DNA sequence and peptide can be introduced into the liposome. The formation of liposomes containing DNA associated with the peptide is carried out according to standard methods. Liposomes containing these active substances are obtained, for example, by dispersing lipids and DNA / peptide complexes in an aqueous medium, followed by mechanical stirring, sonication and / or extrusion through filters with a defined pore size. Liposomes can also be obtained by solubilization of lipids and active substances in organic solvents or detergents, mixing with an aqueous medium and subsequent removal of the solvent, as well as other known methods. Example
Тотальную ДНК выделяли из лейкоцитов крови человека (0,5 мл цельной крови), стандартным методом фенол-хлороформной экстракции. Выход ДНК после экстракции составлял 40-50 мкг. Амплификацию ДНК-повторов 'теломер осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Тris-НСL (рН 8.8), 16.6 мМ (NH4)2SO4, 0.1% Тritоп X-100, 2.0мM MgCI_2, 0.5% диметилсульфоксид (DMSO), 4% формамид, 3 мкл 25 мМ dNТР, 3 ед Таq ДНК полимеразы, 2 мкг выделенной геномной ДНК, 30 пкмоль прямого (Fоrwаrd) праймера (TTAGGG)5, 20 пкмоль обратного (Rеvеrsе) праймера, (AATCCC)5. Оба праймера были получены согласно методике, предложенной в работе Lоritе еt аl., J. оf Неrеditу 2002:93(4). ПЦР проводили на τермоциклере, используя hоt-stагt. После первоначальной денатурации при 94°C в течении 3 мин с праймером Fоrwаrd, вносили Таq полимеразу и инкубировали дополнительно 7 мин при этой же температуре. Далее проводили 10 циклов амплификации в следующем режиме: плавление 94°C в течение 1 мин., отжиг 70°C в течение 1 мин., синтез 72°C в течение 1 мин. После завершения 10 циклов, устанавливали паузу 9O0C - 10 мин., вносили праймер Rеvеrsе. Затем проводили 35 циклов амплификации в таком же температурно-временном режиме, как для предыдущих 10 циклов. После завершения 35 циклов амплификации проводили заключительный синтез при 72°C в течение 7 мин.Total DNA was isolated from human blood leukocytes (0.5 ml whole blood) using the standard phenol-chloroform extraction method. The DNA yield after extraction was 40-50 μg. Amplification of DNA repeats' telomere was performed by polymerase chain reaction (PCR) which is carried out in a 30 .mu.l reaction mixture containing 67 mM Tris-HCL (pH 8.8), 16.6 mM (NH4) 2SO4, 0.1% Tritop X-100, 2.0mM MgCI_2, 0.5% dimethyl sulfoxide (DMSO), 4% formamide, 3 μl 25 mM dNTP, 3 units of Taq DNA polymerase, 2 μg of isolated genomic DNA, 30 pmol of direct (Forward) primer (TTAGGG) 5 , 20 pmol of reverse (Reverse) , (AATCCC) 5 . Both primers were obtained according to the technique proposed by Lorite et al., J. of Finalit 2002: 93 (4). PCR was performed on a thermocycler using a hot stagt. After initial denaturation at 94 ° C for 3 min with the Forward primer, Taq polymerase was introduced and incubated for an additional 7 min at the same temperature. Then, 10 amplification cycles were performed in the following mode: melting at 94 ° C for 1 min, annealing at 70 ° C for 1 min, synthesis of 72 ° C for 1 min. After completion of 10 cycles, a pause of 9O 0 C was established for 10 minutes, the Reverse primer was introduced. Then, 35 cycles of amplification were carried out in the same temperature-time regime as for the previous 10 cycles. After completing 35 amplification cycles, the final synthesis was performed at 72 ° C for 7 min.
Отбирали 1 мкл полученного ПЦР продукта, разводили водой в соотношении 1/100 и добавляли 1 мкл полученного раствора в реакционную смесь для новой ПЦР, которую осуществляли в условиях и режиме, описанных выше.1 μl of the obtained PCR product was taken, diluted with water in a ratio of 1/100, and 1 μl of the resulting solution was added to the reaction mixture for new PCR, which was carried out under the conditions and conditions described above.
20 мкг ПЦР-продукта, полученного после реамплификации реакционной смеси подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, содержащем TAE (Трис-ацетатный буфер, 40мM Тris-bаsе, 20 мМ уксусная кислота, 1 мM EDTA) при градиенте 8V/cм. После окончания электрофореза гель окрашивали этидийбромидом и фотографировали в УФ-свеτе. В качестве маркеров молекулярного веса использовали наборы фирмы Strаtаgеп (США).20 μg of the PCR product obtained after reamplification of the reaction mixture was subjected to electrophoresis in 1% agarose gel containing TAE (Tris-acetate buffer, 40 mM Tris-base, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA) at a gradient of 8 V / cm. After electrophoresis, the gel was stained with ethidium bromide and photographed in UV light. As markers of molecular weight, kits of the company Stratagep (USA) were used.
Полоски агарозного геля, соответствующие фрагментам теломерной ДНК 100-300 п.н., вырезали из геля и выделение из них ДНК проводили с использованием набора 'Qiаgеп (Qiаgеп) в соответствии с инструкциями производителя. Получали 20 мкл раствора, содержащегоStrips of the agarose gel corresponding to fragments of telomeric DNA 100-300 bp was excised from the gel and isolation of DNA from them was carried out using a set of 'Qiagep (Qiagep) according to the manufacturer's instructions. Received 20 μl of a solution containing
100 нг теломерных последовательностей ДНК.100 ng of telomeric DNA sequences.
Далее образовывали комплекс теломерных ДНК с пептидомThen formed a complex of telomeric DNA with a peptide
GRККRRQRRRРРQРКККRКV (описан выше), производства Института Особо Чистых Препаратов (Санкт-Петербург), путем внесения в 25 мклGRKKRRQRRRRPQRKKKRKV (described above), produced by the Institute for Extra Pure Drugs (St. Petersburg), by adding 25 μl
0,05M фосфатного буфера (рН 7.0), используемого в качестве носителя,0.05M phosphate buffer (pH 7.0) used as a carrier,
20 нг полученных теломерных последовательностей ДНК и указанного пептида в молярном соотношении пeптид:ДHK 100:1 и выше.20 ng of the obtained telomeric DNA sequences and the indicated peptide in a molar ratio of peptides: DNK 100: 1 and higher.
Детектирование комплекса ДНК-пептид проводили при электрофорезе в 1 % агарозном геле окрашиванием бромистым этидием и последующей съемкой в УФ-свете. Задержка (ретардация) миграции фрагмента ДНК в геле свидетельствовала об образовании комплекса.Detection of the DNA-peptide complex was carried out by electrophoresis on a 1% agarose gel by staining with ethidium bromide and subsequent exposure to UV light. The delay (retardation) of migration of the DNA fragment in the gel indicated the formation of the complex.
Применение косметического средства можно осуществлять разными путями. Указанное косметическое средство может быть представлено, например, в форме кремов, мазей, гелей и т.п., предназначенных для нанесения на кожу, либо растворов, предназначенных как для нанесения на кожу (например, с помощью пластырей), так и для подкожного введения, полезного для воздействия на клетки дермы, например на фибробласты. Известно, что нормальные соматические клетки человека способны делиться лишь ограниченное число раз (так называемыйThe use of cosmetics can be carried out in various ways. The specified cosmetic product can be presented, for example, in the form of creams, ointments, gels, etc., intended for application to the skin, or solutions intended both for application to the skin (for example, using patches), and for subcutaneous administration useful for acting on dermal cells, for example fibroblasts. It is known that normal human somatic cells are able to divide only a limited number of times (the so-called
«лимит Xeйфликa»). Доказано, что с каждым делением соматической клетки в результате так называемой проблемы «кoнцeвoй нeдopeпликaции» длина теломерной ДНК сокращается (Grеidеr С. M., 1996, Аппиаl Rеv. Вiосhет., 65, 337-365); при укорачивании теломер до определенной длины клетка перестает делится, переходя в состояние одряхления, или сенесенса, после чего она перестает нормально функционировать и гибнет."Heiflik limit"). It has been proven that with each division of the somatic cell, as a result of the so-called “end-non-replication” problem, the length of telomeric DNA is reduced (Greider S. M., 1996, Appial Rev. Bioshet., 65, 337-365); when the telomere is shortened to a certain length, the cell ceases to divide, turning into a state senility, or senesensa, after which it ceases to function normally and dies.
При введении в кожу предложенного косметического средства, теломерная ДНК и связанный с ней пептид проникают в клетки благодаря наличию в пептиде компонента, такого как PTD, придающего комплексу, содержащему ДНК и пептид, способность проникать через мембрану клетки, или благодаря липосоме, в которую введены ДНК и пептид и которая способна транспортировать ее содержимое через клеточную мембрану. Наличие в составе пептида сигнала ядерной локализации позволяет комплексу пептид-теломерная ДНК проникать через ядерную мембрану в ядро клетки. Проникнувшая в ядро клетки теломерная последовательность ДНК с помощью ферментных систем, присутствующих в клетке, присоединяется к концам хромосом, надстраивая их. В результате удлинения теломерных участков хромосом клетка «oмoлaживaeтcя», т.е. становится способной осуществлять большее число делений.When the proposed cosmetic product is introduced into the skin, telomeric DNA and the peptide associated with it penetrate into the cells due to the presence in the peptide of a component, such as PTD, which gives the complex containing DNA and peptide the ability to penetrate the cell membrane, or due to the liposome into which the DNA is introduced and a peptide and which is capable of transporting its contents across the cell membrane. The presence of a nuclear localization signal in the peptide allows the peptide-telomeric DNA complex to penetrate through the nuclear membrane into the cell nucleus. Penetrated into the nucleus of the cell, the telomere DNA sequence, using the enzyme systems present in the cell, attaches to the ends of the chromosomes, attaching them. As a result of lengthening of the telomeric regions of the chromosomes, the cell “rejuvenates”, i.e. becomes able to carry out more divisions.
Таким образом, кожа, в которую введено косметическое средство, производит большее количество молодых клеток. В результате ускоряется процесс реэпителизации эпидермиса, что обеспечивает поверхность кожи более молодыми и плотно расположенными клетками. Кроме того, благодаря производству большого количества молодых клеток, обеспечивается эффективное поддержание толщины эпидермиса. Наконец, проникновение комплекса теломерная ДНК- пептид, содержащегося в косметическом средстве, в фибробласты, находящиеся в дерме, обеспечивает производство в ней большего количества молодых фибробластов, которые, в отличие от старых, вырабатывают больше эластиновых волокон, что придает коже большую эластичность. Обеспечение поверхности кожи молодыми и плотно расположенными клетками, поддержание толщины эпидермиса и повышение эластичности кожи обеспечивают эффективное улучшение функций и внешнего вида кожи. По сравнению с часто применяемым переносом молекул ДНК векторами на основе вирусов транспортировка теломерной последовательности ДНК в клетку, осуществляемая при использовании предложенного косметического средства позволяет избежать нежелательных' иммунологических реакций, токсического ответа и возможных мутаций.Thus, the skin into which the cosmetic is introduced produces more young cells. As a result, the epidermal re-epithelialization process is accelerated, which provides the skin surface with younger and denser cells. In addition, due to the production of a large number of young cells, the epidermis is effectively maintained. Finally, the penetration of the telomeric DNA-peptide complex contained in the cosmetic product into the fibroblasts located in the dermis ensures the production of more young fibroblasts in it, which, unlike the old ones, produce more elastin fibers, which makes the skin more elastic. Providing the skin surface with young and densely spaced cells, maintaining the thickness of the epidermis and increasing skin elasticity provide an effective improvement in the functions and appearance of the skin. Compared to the frequently used transfer of DNA molecules by virus-based vectors, the transportation of the telomeric DNA sequence into a cell carried out using the proposed cosmetic product avoids undesirable ' immunological reactions, toxic response and possible mutations.
Промышленная применимостьIndustrial applicability
Данное изобретение может быть использовано в различных средствах ухода за кожей, применяемых в косметологии для улучшения внешнего вида кожи человека. This invention can be used in various skin care products used in cosmetology to improve the appearance of human skin.

Claims

Формула изобретения Claim
1. Косметическое средство, содержащее активный ингредиент и носитель, отличающееся тем, что активный ингредиент содержит комплекс, который включает теломерную последовательность ДНК и связанный с ней пептид, имеющий сигнал ядерной локализации, и который способен проникать через плазматическую мембрану клетки.1. A cosmetic product containing an active ingredient and a carrier, characterized in that the active ingredient contains a complex that includes a telomeric DNA sequence and its associated peptide having a nuclear localization signal, and which is able to penetrate through the plasma membrane of the cell.
2. Средство по п.1 , отличающееся тем, что указанный пептид содержит домен белковой трансдукции. 2. The tool according to claim 1, characterized in that said peptide contains a protein transduction domain.
3. Средство по п.2, отличающееся тем, что указанный пептид содержит последовательность аминокислот3. The tool according to claim 2, characterized in that said peptide contains an amino acid sequence
GRККRRQRRRРРQРКККRКV.GRKKRRQRRRPPQRKKKRKV.
4. Средство по п.2, отличающееся тем, что указанный пептид содержит последовательность аминокислот RQIКIWFQNRRМКWККРКККRКV.4. The tool according to claim 2, characterized in that said peptide contains the amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKKRCKKKRKV.
5. Способ по п.2, отличающееся тем, что указанный пептид содержит последовательность аминокислот GАLFLGFLGААGSТМGАWSQРКSКRКV.5. The method according to claim 2, characterized in that said peptide contains the amino acid sequence GALFLGFLGААGSТМGАWSQРКSКRКV.
6. Средство по п.1 , отличающееся тем, что указанный комплекс дополнительно включает в себя липосому, в которую введены указанная теломерная последовательность ДНК и указанный пептид.6. The tool according to claim 1, characterized in that said complex further includes a liposome into which said telomeric DNA sequence and said peptide are introduced.
7. Способ получения косметического средства, отличающийся тем, что7. A method of obtaining a cosmetic product, characterized in that
- синтезируют теломерную последовательность ДНК человека и - полученную теломерную последовательность ДНК соединяют с пептидом, имеющим сигнал ядерной локализации, с образованием комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки.- synthesize the telomeric sequence of human DNA and - the resulting telomeric DNA sequence is combined with a peptide having a nuclear localization signal, with the formation of a complex capable of penetrating through the plasma membrane of the cell.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанный пептид содержит домен белковой трансдукции. 8. The method according to claim 7, characterized in that said peptide contains a protein transduction domain.
9. Способ по п.7, отличающийся тем, что при образовании указанного комплекса теломерную последовательность ДНК и связанный с ней пептид вводят в липосому.9. The method according to claim 7, characterized in that when the complex is formed, the telomeric DNA sequence and the peptide associated with it are introduced into the liposome.
10. Способ по п.7, отличающийся тем, что берут образец крови или ткани у человека, к которому предполагается применить данное косметическое средство, получают из него тотальную геномную ДНК и на ее основе в качестве матрицы синтезируют указанную теломерную последовательность. 10. The method according to claim 7, characterized in that a blood or tissue sample is taken from the person to whom the cosmetic product is to be applied, a total genomic DNA is obtained from it, and the specified telomeric sequence is synthesized as a matrix on its basis.
PCT/RU2004/000347 2004-09-06 2004-09-06 Cosmetic agent and a method for the production thereof WO2006036082A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2004/000347 WO2006036082A1 (en) 2004-09-06 2004-09-06 Cosmetic agent and a method for the production thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2004/000347 WO2006036082A1 (en) 2004-09-06 2004-09-06 Cosmetic agent and a method for the production thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006036082A1 true WO2006036082A1 (en) 2006-04-06

Family

ID=36119167

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2004/000347 WO2006036082A1 (en) 2004-09-06 2004-09-06 Cosmetic agent and a method for the production thereof

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2006036082A1 (en)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5194253A (en) * 1988-09-09 1993-03-16 Pier Auge (Societe Anonyme) Aqueous gel, usable in cosmetics, based on hyaluronic acid and deoxyribonucleic acid, and a preparation process
US5547684A (en) * 1993-02-10 1996-08-20 Pharmec Company Cosmetic composition containing a DNA-sodium salt and methods of making and using the same
RU2117474C1 (en) * 1995-02-23 1998-08-20 Закрытое акционерное общество "Фаркавер" Liposome pharmaceutical preparation and treatment-and-prophylactic cream on its base
US6372717B1 (en) * 1996-08-23 2002-04-16 Sederma S.A. Synthetic peptides and their use in cosmetic or dermopharmaceutical compositions
FR2849376A1 (en) * 2002-12-30 2004-07-02 Jean Noel Thorel Cosmetic or dermatological skin-treatment composition, useful e.g. as a slimming lotion, comprises a complex of specific peptides with a nucleotide or nucleic acid
FR2849377A1 (en) * 2002-12-30 2004-07-02 Jean Noel Thorel Cosmetic or dermatological skin-treatment composition, useful e.g. for regulating the skin flora, comprises a complex of a specific peptide or protein with a nucleotide or nucleic acid

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5194253A (en) * 1988-09-09 1993-03-16 Pier Auge (Societe Anonyme) Aqueous gel, usable in cosmetics, based on hyaluronic acid and deoxyribonucleic acid, and a preparation process
US5547684A (en) * 1993-02-10 1996-08-20 Pharmec Company Cosmetic composition containing a DNA-sodium salt and methods of making and using the same
RU2117474C1 (en) * 1995-02-23 1998-08-20 Закрытое акционерное общество "Фаркавер" Liposome pharmaceutical preparation and treatment-and-prophylactic cream on its base
US6372717B1 (en) * 1996-08-23 2002-04-16 Sederma S.A. Synthetic peptides and their use in cosmetic or dermopharmaceutical compositions
FR2849376A1 (en) * 2002-12-30 2004-07-02 Jean Noel Thorel Cosmetic or dermatological skin-treatment composition, useful e.g. as a slimming lotion, comprises a complex of specific peptides with a nucleotide or nucleic acid
FR2849377A1 (en) * 2002-12-30 2004-07-02 Jean Noel Thorel Cosmetic or dermatological skin-treatment composition, useful e.g. for regulating the skin flora, comprises a complex of a specific peptide or protein with a nucleotide or nucleic acid

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0581848B1 (en) Closed sense and antisense oligonucleotides and uses thereof
JP2022501367A (en) Preparation of lipid nanoparticles and method for administration thereof
KR20210135494A (en) Method for preparing lipid nanoparticles
JP7027303B2 (en) RNA complex that suppresses melanin production
KR20220133957A (en) Method for preparing lipid nanoparticles
US20130324586A1 (en) Inhibition of Hairless Protein mRNA
DE69837274D1 (en) METHOD FOR THE SECULATION OF NUCLEIC ACIDS IN LIPID DOUBLE LAYERS
US20060270621A1 (en) Inhibition of hair growth with RNAi targeting desmoglein 4 and nude mRNAs
JP2022522768A (en) Polyribonucleotides and their cosmetic uses
KR20210027389A (en) Compositions and methods for genome editing by insertion of donor polynucleotides
WO1994023026A1 (en) Staple and semi-staple oligonucleotides, method of preparation and applications
US20170166894A1 (en) Aptamers for topical delivery
WO2019209956A1 (en) Artificial exosome composition and related methods
Gaillard et al. Identity of the RNA-binding protein K of hnRNP particles with protein H16, a sequence-specific single strand DNAbinding protein
WO2001032220A1 (en) Gene therapy for diabetic ischemic disease
KR101813560B1 (en) Topical formulation with Skin Physiological Activity Composed of Cell Permeable Growth Factors
KR20190137894A (en) P-ethoxy Nucleic Acids for IGF-1R Inhibition
KR20200021453A (en) P-ethoxy Nucleic Acids for IGF-1R Inhibition
WO2006036082A1 (en) Cosmetic agent and a method for the production thereof
RU2407509C2 (en) Cosmetic preparation and method for making thereof
RU2766701C2 (en) Antisense oligonucleotides for snap25
ZAMECNIK Background of the antisense oligonucleotide approach to chemotherapy
EP1399570A2 (en) Peptides for use as translocation factors
FR2733913A1 (en) DNA SEQUENCE AS A MEDICAMENT, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING SAME
AU2023274159A1 (en) COMPOSITION FOR IN-VIVO DELIVERING mRNA CONTAINING MODIFIED NUCLEOTIDE

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007112836

Country of ref document: RU

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase