PROCEDE ET DISPOSITIF D'ANALYSE DE PETITS VOLUMES DE
LIQUIDE
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE ET ART ANTERIEUR
L'invention concerne le domaine de la détection optique, en particulier dans de très petits volumes de liquide tels que des gouttes.
La détection de fluorescence en milieu liquide se fait généralement à l'aide d'un ou plusieurs lasers traversant le liquide contenu dans une cuvette. La détection se fait souvent par photomultiplicateur.
Une autre possibilité consiste à utiliser un microscope de fluorescence (epi-illumination) pour illuminer une ou plusieurs cuvettes contenant un ou plusieurs liquides. La lecture se fait alors à l'aide d'une caméra, puis par moyenne des niveaux de gris de l'image sur des régions d'intérêt correspondant à l'intérieur des cuvettes. La séparation entre les longueurs d'onde d'excitation et d'émission s'effectue à l'aide d'un filtre dichroïque.
La détection peut également s'effectuer en transmission. Dans ce cas, les chaînes d'excitation et de détection sont diamétralement opposées. Un tel dispositif offre l'avantage de ne pas nécessiter de filtre dichroïque, mais présente l'inconvénient de rendre le filtrage de l'émission plus délicat.
On peut aussi rencontrer des systèmes coudés pour lesquels les axes d'excitation et d'émission forment un angle égal ou proche de 90°. Les
sources de lumière peuvent être des lasers, des LEDs, des lampes à fluorescence à décharge, à arc. Les détecteurs peuvent être des photomultiplicateurs, des caméras CCD ou CMOS, des photodiodes. Ce genre de système n'est guère aisé à mettre en œuvre pour de très petits volumes de liquide. Il faut en effet alors disposer d'une cuvette d'un volume aussi petit que le volume de liquide à mesurer.
En outre, se pose un problème d'optimisation du signal à mesurer.
Un volume de liquide très faible, de l'ordre de quelques microlitre, ou même parfois de l'ordre du nanolitre, implique des signaux eux aussi très faibles. Les méthodes traditionnelles sont donc très difficiles à mettre en œuvre.
Le document de J-C Roulet et al. intitulé
« Performance of an Integrated Microoptical System for
Fluorescence Détection in Microfluidic System », Analytical Chemistry, Vol.74, No.14, p.3400-3407, 2002 décrit une puce pour des mesures de fluorescence.
Cependant il se pose le problème de trouver un procédé de mise en oeuvre moins complexe.
De préférence, un tel procédé et un tel dispositif doivent permettre de réaliser divers types de mesures, tels que des mesures de fluorescence ou de spectrométrie (absorption notamment) ou de colorimétrie.
EXPOSE DE I/ INVENTION
L'invention concerne d'abord un procédé d'analyse optique d'une goutte d'un milieu liquide comportant : - la mise en contact d'une goutte de liquide avec une surface hydrophobe,
- la déformation de la goutte sur cette surface par électromouillage, afin de la déformer sur le trajet d'un faisceau optique. Selon l'invention, on utilise un procédé d' électromouillage pour déformer ou étirer ou allonger, ou éventuellement positionner ou déplacer, une goutte de liquide dans une direction, de manière à accroître le trajet optique de la lumière dans cette goutte. Par exemple, dans le cadre d'un laboratoire sur puce, lorsque la goutte, éventuellement après un déplacement, est sur une zone de détection, une ou plusieurs électrodes, sous la couche hydrophobe, peuvent être activées pour donner à la goutte une géométrie optimale pour la détection.
La forme de la goutte peut être donnée par une matrice ou par une rangée d'électrodes de tailles identiques .
Dans ce cas, c'est l'activation de certaines électrodes et la désactivation des autres qui donne à la goutte la forme qui optimise les conditions pour la détection.
Selon une variante, sa forme peut être donnée à la goutte par une seule électrode activée dont la forme est optimale pour la détection.
Dans le cas d'une excitation par faisceau collimaté (laser ou fibre lentillée par exemple) , la forme optimale de la goutte pourrait être la plus proche possible de celle d'un cylindre. L'allongement ou la déformation de la goutte peut s'appliquer à toute forme de détection optique, à la colorimétrie, ou à la spectrométrie, ou à la fluorescence.
Cette dernière peut être observée par tout moyen, tel qu'un photomultiplicateur ou une photodiode ou une caméra ou un microscope.
La goutte peut être confinée, au moins lors de sa déformation, entre ladite surface hydrophobe et un substrat supérieur. La goutte peut, avant déformation, n'être pas confinée par le substrat supérieur. Il s'agit alors d'un système mixte, dans lequel la goutte est initialement non confinée, puis est confinée.
Elle peut aussi être avant déformation, déjà confinée par le substrat supérieur.
L'invention concerne également un dispositif d'analyse optique d'une goutte d'un milieu liquide comportant :
- un premier substrat comportant une surface hydrophobe,
- des moyens de génération d'un rayonnement pour engendrer un faisceau lumineux parallèlement à la surface hydrophobe,
- des moyens pour déformer une goutte, sur cette surface, par électromouillage, afin de la
déformer sur le trajet d'un faisceau lumineux engendré par les moyens de génération de rayonnement.
Un tel dispositif peut en outre comporter un deuxième substrat, disposé en regard de la surface hydrophobe.
Un tel deuxième substrat permet un confinement de la goutte.
Ce deuxième substrat peut lui-même comporter, en outre, une couche hydrophobe superficielle, et/ou une électrode.
Les moyens pour déformer une goutte, sur la surface hydrophobe du premier substrat peuvent comporter une pluralité d'électrodes sous la surface hydrophobe. Ces électrodes peuvent être toutes de tailles identiques, ou bien l'une au moins des électrodes peut être de forme allongée.
Un dispositif selon l'invention peut comporter, en outre, des moyens pour réfléchir le faisceau lumineux après traversée d'une goutte de liquide positionnée sur la surface hydrophobe, ce qui permet d'accroître encore le trajet du faisceau dans la goutte.
La goutte peut en outre être déplacée sur la surface hydrophobe, le dispositif pouvant comporter des moyens pour déplacer la goutte, ce sont par exemple les moyens pour déformer la goutte qui peuvent être utilisés pour la déplacer.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
- Les figures IA - IC représentent une réalisation d'un dispositif selon l'invention, en système ouvert, - la figure 2 représente une déformation d'une goutte, sur le trajet d'un faisceau optique, en système ouvert,
- les figures 3A et 3B représentent des vues de dessus d'un dispositif et d'une goutte, avant et pendant une mesure selon l'invention,
- la figure 4 représente un dispositif mis en œuvre dans le cadre de l'invention, en système fermé,
- les figures 5A et 5B représentent une mise en œuvre de l'invention, en système mixte ouvert et fermé,
- la figure 6 représente un dispositif mis en œuvre dans le cadre de l'invention en système fermé avec capot conducteur. - les figures 7A et 7B représentent un dispositif mis en œuvre dans le cadre de l'invention, en système mixte avec capot conducteur.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
Un premier mode de réalisation de l'invention, en système ouvert, est illustré sur les figures IA - IC.
Ce mode de réalisation met en œuvre un dispositif de déplacement ou de manipulation de gouttes de liquide reposant sur le principe de 1' électromouillage sur un diélectrique.
Des exemples de tels dispositifs sont décrits dans l'article de M.G. Pollack, A.D. Shendorov,
R.B. Fair, intitulé « Electro-wetting-based actuation of droplets for integrated microfluidics », Lab Chip 2 (1) (2002) 96-101.
Les forces utilisées pour le déplacement de gouttes de liquide sont alors des forces électrostatiques .
Le document FR 2 841 063 décrit un dispositif mettant en œuvre, en outre, un caténaire en regard des électrodes activées pour le déplacement.
Le principe de ce type de déplacement est synthétisé sur les figures IA - IC.
Une goutte 2 repose sur un réseau 4 d'électrodes, dont elle est isolée par une couche diélectrique 6 et une couche hydrophobe 8 (figure IA) .
Le caractère hydrophobe de cette couche signifie que la goutte a un angle de contact, sur cette couche, supérieur à 90°. Les électrodes 4 sont elles-mêmes formées en surface d'un substrat 1.
Lorsque l'électrode 4-1 située à proximité de la goutte 2 est activée, à l'aide de moyens 14 de commutation, dont la fermeture établit un contact entre cette électrode et une source de tension 13 via un conducteur commun 16, la couche diélectrique 6 et la couche hydrophobe 8 entre cette électrode activée et la goutte sous tension agissent comme une capacité.
La contre-électrode 10 permet un éventuel déplacement par électromouillage à la surface de la surface hydrophobe; elle maintient un contact
électrique avec la goutte pendant un tel déplacement. Cette contre-électrode peut être soit un caténaire comme dans FR - 2 841 063, soit un fil enterré soit une électrode planaire dans le capot d'un système confiné (un tel système confiné est décrit plus loin) .
En système ouvert, si il n'y a pas de déplacement, il est possible d'étaler la goutte sur la surface hydrophobe, sans contre-électrode. C'est par exemple le cas si la goutte peut être amenée sur la surface hydrophobe par un système de dispense classique, les électrodes 4-1, 4-2 servant uniquement à étaler ou déformer la goutte à l'endroit où elle a été déposée.
La goutte peut ainsi être éventuellement déplacée de proche en proche (figure IC) , sur la surface hydrophobe 8, par activation successive des électrodes 4-1, 4-2,... etc, le long du caténaire 10.
Il est donc possible de déplacer des liquides, mais aussi de les mélanger (en faisant s'approcher des gouttes de liquides différents), et de réaliser des protocoles complexes.
Les documents cités ci-dessus donnent des exemples de mises en œuvre de séries d'électrodes adjacentes pour la manipulation d'une goutte dans un plan, les électrodes pouvant en effet être disposées de manière linéaire, mais aussi en deux dimensions, définissant ainsi un plan de déplacement des gouttes.
Comme illustré sur la figure 2, 1' activation simultanée de plusieurs électrodes, désignées sur cette figure par les références 4-1, 4-2, 4-3, va permettre, qu'il y ait eu déplacement de la
goutte ou pas, d'allonger la goutte 2 suivant la direction voulue, cette direction étant en fait déterminée par les électrodes 4-1, 4-2, 4-3 sélectionnées . Les figures 3A et 3B représentent une vue de dessus du système, dans laquelle les électrodes 4 sont schématisées par des carrés, la goutte étant toujours désignée par la référence 2.
Avant activation des électrodes, celle-ci repose sur l'une d'entre elles ; après activation des électrodes 4-1, 4-2, 4-3, 4-4, la goutte est étirée et positionnée au dessus de ces quatre mêmes électrodes. La figure 2 représente le cas où seules trois électrodes sont sélectionnées, étirant ainsi la goutte sur ces 3 électrodes.
La goutte est alors dans un état dans lequel sa longueur L (voir figure 2), mesurée parallèlement à la surface hydrophobe 8, est supérieure à sa hauteur h, par exemple dans un rapport L/h de l'ordre de 2 à 4 ou plus.
Un faisceau lumineux 50, de longueur d'onde adaptée à la mesure souhaitée (absorption ou fluorescence ou colorimétrie ou spectrométrie) voit donc son trajet dans la goutte notablement augmenté du fait de l'allongement de celle-ci.
Le signal de mesure s'en trouve amplifié. Ceci est particulièrement avantageux lorsque le volume de liquide examiné est de l'ordre, au maximum, de quelques microlitres, et peut même atteindre de très faibles valeurs, par exemple de l'ordre du nanolitre.
De manière pratique, on positionnera des moyens 52 émetteurs de lumière, de manière à diriger un faisceau 50 le long du substrat ou parallèlement au substrat. Ces moyens peuvent être par exemple un microlaser ou une diode.
Un détecteur détectera le signal optique résultant .
L'activation des électrodes 4 permettra, éventuellement d'abord, éventuellement, de déplacer ou de positionner, puis d'allonger et d'étaler ou de déformer la goutte 2 le long du faisceau 50, comme expliqué ci-dessus.
La figure 4 représente un autre mode de réalisation de l'invention, en système fermé ou confiné.
Sur cette figure, des références numériques identiques à celles des figures IA - 2 y désignent des mêmes éléments.
Ce dispositif comporte en outre un substrat supérieur 100, de préférence également recouvert d'une couche hydrophobe 108. Cet ensemble peut être éventuellement transparent, permettant une observation par le haut .
Là encore, un faisceau lumineux peut être dirigé entre les deux substrats, parallèlement à ceux- ci.
De manière pratique, on positionnera des moyens émetteurs de lumière, analogues aux moyens 52 de la figure 2, de manière à diriger un faisceau 50 le long du substrat.
La sélection d'électrodes 4 du substrat inférieur permet d'abord de déplacer ou de positionner, puis d'allonger et d'étaler ou de déformer la goutte 2 le long du faisceau 50. Les figures 5A et 5B, sur lesquelles des références numériques identiques à celles de la figure 4 y désignent des éléments identiques ou similaires, représentent un système mixte, dans lequel une goutte 2 est initialement en milieu ouvert (figure 5A) , l'activation d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 permettant un alignement et un aplatissement de la goutte (figure 5B) , en système fermé, dans une zone où le système est muni d'un capot, comme illustré ci-dessus en liaison avec la figure 4. La figure 6 représente une variante du système fermé, avec un capot conducteur 100, comportant une électrode ou un réseau d'électrodes 112, ainsi qu'une couche isolante 106 et une couche hydrophobe 108. Le caténaire 10 des figures précédentes est remplacé, dans ce mode de réalisation, par l'électrode 112. L'activation de cette électrode 112 et des électrodes 4 permet de déplacer la goutte dans la position voulue puis de l'étirer ou de la déformer, pour l'amener sur le trajet d'un faisceau lumineux 50.
Les figures 7A et 7B, sur lesquelles des références numériques identiques à celles de la figure 6 y désignent des éléments identiques ou similaires, représentent un système mixte, dans lequel une goutte 2 est initialement en milieu ouvert (figure 7A) , l'activation d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 permettant un
alignement et un aplatissement de la goutte (figure 7B) , en système fermé, dans une zone où le système est muni d'un capot, comme illustré ci-dessus en liaison avec la figure 6. Dans les modes de réalisation décrits ci-dessus, plusieurs électrodes 4 sont activées pour déformer la goutte. Il est également possible de prévoir une électrode de forme allongée dont l'activation permettrait d'aplatir la goutte, encore par effet d' électromouillage.
Un dispositif selon l'invention peut en outre comporter des moyens qui vont permettre de commander ou d'activer les électrodes 4, par exemple un ordinateur type PC et un système de relais connectés au dispositif ou à la puce, tels les relais 14 de la figure IA, ces relais étant pilotés par les moyens de type PC.
Typiquement, la distance entre un éventuel conducteur 10 (figures IA - 5B) d'une part et la surface hydrophobe 8 d'autre part est par exemple comprise entre 1 μm et 100 μm ou 500 μm.
Ce conducteur 10 peut se présenter par exemple sous la forme d'un fil de diamètre compris entre 10 μm et quelques centaines de μm, par exemple 200 μm. Ce fil peut être un fil d'or ou d'aluminium ou de tungstène ou d'autres matériaux conducteurs.
Lorsque deux substrats 1, 100 sont utilisés (figures 6 - 7B), ils sont distants d'une distance comprise entre, par exemple, 10 μm et 100 μm ou 500 μm. Quel que soit le mode de réalisation considéré, une goutte de liquide 2 aura un volume
compris entre, par exemple, 1 nanolitre et quelques microlitres, par exemple entre 1 ni et 5 μl ou 10 μl.
En outre chacune des électrodes 4 aura par exemple une surface de l'ordre de quelques dizaines de μm2 (par exemple 10 μm2) jusqu'à 1 mm2, selon la taille des gouttes à transporter, l'espacement entre électrodes voisines étant par exemple compris entre 1 μm et 10 μm.
La structuration des électrodes 4 peut être obtenue par des méthodes classiques des micro¬ technologies, par exemple par photolithographie.
Des procédés de réalisation de puces incorporant un dispositif selon l'invention peuvent être directement dérivés des procédés décrits dans le document FR - 2 841 063.
Des conducteurs, et notamment des conducteurs 110 peuvent être réalisés par dépôt d'une couche conductrice et gravure de cette couche suivant le motif approprié de conducteurs, avant dépôt de la couche hydrophobe 108.
Les électrodes peuvent être réalisées par dépôts d'une couche métallique (par exemple en un métal choisi parmi Au, Al, ITO, Pt, Cr, Cu) par photolithographie. Le substrat est ensuite recouvert d'une couche diélectrique en Si3N4 ou SiO2. Enfin un dépôt d'une couche hydrophobe est effectué, comme par exemple un dépôt de téflon réalisé à la tournette.
Un système selon l'invention présente de nombreux avantages : • ce système accroît le trajet optique de la lumière d'excitation 50. On peut l'améliorer encore
en ajoutant un dispositif réfléchissant, par exemple un micro-miroir, à l'extrémité du trajet optique, ce dispositif renvoyant le faisceau dans la goutte ; un cube séparateur peut permettre, dans certains cas, et notamment en spectroscopie d'absorption, de séparer le faisceau réfléchi ;
• la lumière d'excitation est en outre mieux conservée dans la goutte. Lorsque la goutte est étirée, les rayons frappent en effet l'interface au niveau de la périphérie de la goutte avec un angle d'incidence plus faible que dans le cas d'une goutte sphérique (ceci est très net sur la figure 2) . Les rayons réfléchis à l'intérieur de la goutte sont d'intensité plus forts. On assiste donc à un guidage optique de la lumière d'excitation dans la goutte.
• les rayons issus de l'excitation transmise
(ceux qui sortent de la goutte) sont plus faibles, puisque davantage de lumière est absorbée dans la goutte. Le filtrage optique est ainsi rendu plus facile.
• dans le cas d'une goutte déformée en forme de cylindre ou de demi-cylindre (ce qui est en particulier le cas pour un système ouvert ou non confiné), la lumière d'excitation est répartie de manière plus homogène. Cela rend la détection moins bruitée par de possibles variations locales de concentration de marqueurs dans le liquide de la goutte.
• la lumière d'excitation ainsi guidée ne vient pas en contact avec le support ou le capot, empêchant ainsi toute fluorescence parasite. Elle ne
vient également pas en contact avec le détecteur (toute la lumière peut être dirigée à travers la goutte) , simplifiant ainsi le filtrage.
• la possibilité, en système confiné, de former des gouttes carrées ou en forme de rectangle permet d'améliorer le trajet optique en réalisant presque une cuve liquide.