WO2005093070A1

WO2005093070A1 - 組み換えヘルペスウイルス及びその利用

Info

Publication number: WO2005093070A1
Application number: PCT/JP2005/004585
Authority: WO
Inventors: Takashi Okuda; Shuji Saitoh; Sakiko Saeki
Original assignee: Zeon Corporation
Priority date: 2004-03-29
Filing date: 2005-03-09
Publication date: 2005-10-06
Also published as: ES2369142T3; EP1731612A1; ATE520776T1; US7538201B2; US20070212377A1; EP1731612B1; EP1731612A4; JPWO2005093070A1

Abstract

伝染性喉頭気管炎ウイルスのgB遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ末端側のアミノ酸429個からなるポリペプチド、又は、その1つ或いは複数個のアミノ酸が欠失、付加、又は置換されたポリペプチドをコードするDNAを有する組み換えヘルペスウイルス(但し、伝染性喉頭気管炎ウイルスを除く)。

Description

明細書組み換えへルぺスウィルス及びその利用技術分野

本発明は、伝染性喉頭気管炎ウィルス（Infec t ious Laryngo trach e i t i s Vi rus；以下、 ILTVということがある）の gB遺伝子をコードする DNAを有する組み換えへルぺスウィルスと、その利用に関し、詳しくは、組み換え体中で安定して存在できる ILTVの gB遺伝子の部分配列を有する組み換えへルぺスウィルス、及び抗伝染性喉頭気管炎ウィルス用ワクチンに関する。背景技術

伝染性喉頭気管炎は、 ILTVの感染により発症する。 ILTVは、ニヮトリ、キジ、クジャク、シチメンチョゥ等の鳥類に感染する。ニヮトリにおける発症の特徴としては、呼吸器症状、体温上昇、食欲減退等があらわれ、強い咳や痰の喀出が挙げられる。また、産卵鶏が発症すると、発症後 4日程度から産卵率が低下し、正常な産卵に戻るまで約 1ヶ月を要する。さらに、 ILTVと他の病原体との混合感染による死亡率の上昇等も報告されており、伝染性喉頭気管炎は養鶏産業に多大な経済的損失を与えている。

伝染性喉頭気管炎の予防には、従来より、弱毒化したワクチン株による乾燥生ヮクチンゃ凍結生ヮクチンが用いられている。しかし、その免疫効果は飼育環境、飼育密度、接種方法等により一様ではない。さらに、ワクチン接種により、呼吸器系に若干の症状を起こさせることや、用法 · 接種量を誤ると発病する危険性もある。また、ある地域ではヮクチン株の病原性復帰による発症の報告もあり、安全かつ有効なワクチンの開発が望まれていた。

最近は、この問題点を克服するために、組み換え技術を利用した組み換えウィルスべクターを有効成分とするワクチンが開発されている。 ILTVに関しては、ウィルスベクターとしてファウルボックスウィルス（以下 FPVという）を用いることが検討され、実際に米国では市販もされている（BI0MUNE社、製品名 VECTORMUNE FP-LT(+AE)；)。

ILTVは、伝染性喉頭気管炎の原因ウィルスである。 ILTVはへルぺス属ウィルスの一種で、ウィルスゲノムは約 16万塩基対の二本鎖 DN Aからなる。チミジンキナーゼ遺伝子（Griffinら、 J. Gen. Virol.、 7 1、 841、 1990)、 gp60遺伝子（Kongsu蘭ら、 Virus Genes, 7:297-30 3、 1993)、力プシド p40遺伝子（Griff inら、 Nucl. Acids Res.、 18: 366、 1990)、糖タンパク質 B(gB)遺伝子（Poulsenら、 Virus Genes, 5:335-347, 1991 ;Griff inら、 J. Gen. Virol.、 72:393 - 398、 1991; 米国特許第 5，443，831号公報）、糖タンパク質 C(gC)遺伝子（Kingsley ら、 Virology, 203:336-343、 1994)、 RR2遺伝子（Griff inら、 J. ofG eneral Virol.、 70:3085-3089、 1989)、 UL32遺伝子（国際公開画 8/ 07866号公報）などが知られている。

これら ILTVの gB遺伝子は、オープンリーディングフレーム全長が 2613bp(873ァミノ酸）であり、この全長遺伝子を揷入した組み換え F PVが、ワクチンとして効果を示すことは、米国特許第 5，443，831号公報などに報告されている。

ところで、 FPVなどのボックスウィルスは、宿主体内で急激に増殖して、抗原タンパク質を発現した後、宿主の免疫系によりほぼ完全に駆逐される。しかし、ウィルス駆逐後も、免疫がメモリーされたり、ブーストされる点で、ボックスウィルスはワクチン用の宿主として好適であるといわれている。一方、七面鳥へルぺスウィルス (以下、 HVTと言うことがある）などのへルぺスゥィルスは、宿主体内で急激に増殖はせず、潜伏感染状態が長期間続く。そしてこの潜伏期間中、ヘルぺスウィルスは宿主免疫系を刺激し続けるという特徴がある。こうした特徴を生かした組み換え HVTのヮクチンべクターとしての利用が検討されている。

特表平 4-501658号公報（EP434721 )では、 ILTVの抗原遺伝子を HVT に組み込んだ組み換え HVTが構築し得る旨の記载はあるが、実際に組み換え体を得てはいない。

また、特開 2001- 000188号公報においては、 ILTVの gB遺伝子全長と UL32遺伝子の 2つの遺伝子を揷入した組み換え HVTを構築している。そして、免疫蛍光抗体法を用いてこの組み換え HVTがインビトロで揷入した遺伝子に対応するタンパク質を発現することを確認しているが、ワクチンとしての効果は確認されていない。発明の開示

かかる従来技術のもと、本発明者らは、 ILTVの gB遺伝子全長の上流にプロモータを連結した DNA分子をへルぺスウィルスゲノムに揷入した組み換えへルぺスウィルスについて、継代培養による純化を試みたが、 ILTVの gB遺伝子の脱落が生じ、純化が不可能であることを確認した。 gB遺伝子が脱落してしまうと、組み換えへルぺスウイルスが、抗 ILTV用ワクチンとして機能しない。また、 ILTVと HVTは、どちらもヘルぺスウィルスであり、 HVT自体にも必須遺伝子である gB遺伝子が存在する。

そこで、本発明者らは、ウィルス粒子形成時に、 gB遺伝子どうしが競合するおそれがあるため、 ILTVの gB遺伝子産物の膜アンカー部分及び細胞質ドメィンを欠損させて、 I LTVの _gBタンパク質を膜タンパク質ではなく分泌タンパク質にすることにより、競合を回避しつつ抗原性を保持させることが重要と考えた。この知見に基づき、本発明者らは継代培養にも安定な組み換えへルぺスウィルスを得るべく鋭意検討した結果、単に膜アンカー部分と細胞質ドメインとを欠損させるだけでなく、さらに gB遺伝子を所定の長さに切り縮めることにより、ヮクチン効果が得られること、そして、この切り縮めた gB遺伝子に特定の付加配列を連結させると、より高いワクチン効果が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

かくして本発明によれば、伝染性喉頭気管炎ウィルスの gB遺伝子によってコードされるタンパク質のァミノ末端側のアミノ酸 429個からなるポリペプチド、又は、その 1つ或いは複数個のアミノ酸が欠失、付加、又は置換されたポリペプチドをコードする DNAを有する組み換えへルぺスウィルス（但し、伝染性喉頭気管炎ウィルスを除く）が提供される。更に、当該組み換えへルぺスウィルスを有効成分とする抗伝染性喉頭気管炎ウィルス用ヮクチンが提供される。図面の簡単な説明

図 1は、 FW050と元のホモロジーベクターとの比較を示す図である。

図 2は、ホモロジ一ベクターの模式図である。発明の実施するための最良の態様

以下に、本発明を詳述する。

( DNA )

本発明に用いる DNAは、 I LTVの gB遺伝子によってコードされるタンパク質（以下、 gBタンパク質という）の、ァミノ末端側の 429アミノ酸からなる部分ペプチドをコードするもの（以下、部分 gB遺伝子ということがある）である。また、この部分ペプチドのアミノ酸配列は、 1つ或いは複数個のアミノ酸が欠失、付加、或いは置換されていてもよい。

本発明に用いる DNAの具体例としては、配列番号 2記載の 429個のァミノ酸配列をコードする DNAが挙げられ、具体例としては配列番号 3記載の塩基配列の DNAが挙げられる。

gB遺伝子の起源となる ILTVとしては、例えば、 NS - 175株（家畜衛生菌株目録の菌株番号 VA0204、社団法人動物用生物学的製剤協会）、 CE株（幸田、麻布獣医科大学研究報告、 31、 133-202、 1976 )、 SA- 2株（Johnsonら、 Arch. Viro l .、 119、 181-198、 1991 )、強毒野外分離株 632株（Kee l erら、 Avian Di s eases , 35、 920-929、 1991 )、 USDA チャレンジ株（Poul s enら、 J. General . Viro l .、 78、 2945-2951， 1 997 )が挙げられる。

gB遺伝子は限定されず、 ILTV由来の gBタンパク質をコードするものであれば使用可能で、たとえば、強毒野外分離株 632株由来の gB 遺伝子（GeneBank ACC. No. X56093 )、 SA 2株由来の gB遺伝子（GeneBan k AC No. M64927 )などが挙げられる。

また、配列番号 4記載のアミノ酸配列をコードする DNA (以下、付加 DNAということがある）を、上述した部分 gB遺伝子の 3 '末端側にィンフレームで連結させることにより、ワクチン効果を向上させることができる。配列番号 4記载のァミノ酸配列の 1つ又は複数個のァミノ酸が欠失、付加、或いは置換されていてもよい。

付加 DNAを部分 _gB遺伝子に、インフレームで連結することが、ヮクチン効果を向上させる点で重要であり好ましい。

配列番号 4記载のァミノ酸配列は、既知のなんらかの機能を有する配列、又は、なんらかの機能を有すると推定される配列をもっているものではない。配列番号 4記载のァミノ酸配列をコードする核酸配列 120bp (終始コドン含まず）（配列番号 5 )のうち、 87bpは SV40ポリアデニレーシヨンシグナル由来、 I6bpは HVTの UL45由来、 13bpは人工的に導入された Sfil配列由来のものであり、 4bpはフランキング配列である。

部分 gB遺伝子と付加 DNAとをインフレームで連結する方法に格別な制限はなく、遺伝子組み換えの教科書（Sambrook J、 Russel D. W .編 Molecular Clonings ihird Ed.、 Cold Spring Harbor Loborato ry Pressなど）に記載されている一般的な方法を用いることができる。一般的な方法とは、制限酵素切断面同士で連結する方法が挙げられる。制限酵素認識部位がない場合は、 PCR (ポリメラーゼチエーンリアクション）ゃィンビトロ突然変異を用いることにより制限酵素認識部位を導入すればよい。

(糸且み換えへノレぺスゥイノレス）

本発明の組み換えへルぺスウィルスは、親ウィルスとして、 ILTV 以外のへノレぺスゥイノレスを用いるものでなければならない。親ウイルスであるへルぺスウィルスは、ほ乳類や鳥類に感染するいかなるヘルぺスウィルスでもよい。しかし、組み込んだ遺伝子が安定して ILTV内に存在できないため、 ILTVを親ウィルスとして使用することはできない。鳥類用ワクチンを得る場合、親ウィルスであるへルぺスウィルスとして、マレックウィルスを選択するのが望ましい。マレックウィルスは、 1、 2及び 3型の 3種類があるが、本発明においてはどの型のものを選択しても良い。これらのマレックウィルスは、天然に得ることができるほか、 ATCCなどから有償又は無償で入手できるものが挙げられ、特に非病原性のものが好ましい。このようなウィルスとしては、例えば、マレックウィルス 1型であれば、 CVI98 8(Rispens)株など、マレックウィルス 2型であれば SB- 1株など、マレックウィルス 3型（HVT)であれば、 FC126(ATCC VR-584B), PB-THVl 、 H_2、 YT-7、及び HPRS - 26などが例示できる。組み換えへルぺスウィルスを構築する方法に格別な制限はなく、上述した部分 gB遺伝子と必要に応じて連結された付加 DNAとを有する組み換え用プラスミドを用い、相同組み換えによって、親ウィルスであるへルぺスウィルスに挿入すれば良い。もちろん、このとき部分 gB遺伝子は、外来又は内因のプロモータの支配を受ける位置に配置する。

組み換え用プラスミド（以下、ホモロジ一ベクターという）として用いるプラスミドとしては、一般に用いられるものを用いることができ、例えば、 pBR322、 pBR325、 pBR327、 pBR328、 pUC8、 pUC18、 p UC19などが例示される。

ホモロジ一ベクターの構築は、ベクターの有する制限酵素サイトを利用して、常法に従って行えば良い。

ホモロジ一ベクターは、上述した部分 gB遺伝子に、通常はプロモータとポリ Aシグナルを付加したものを、組み換えへルぺスウィルスの増殖に非必須な領域中に挿入したプラスミドである。

以下、本発明のホモロジ一ベクターの構築方法について、説明する。

組み換えへルぺスウイルスに DNAを組み込む場合、高い発現量を得るため、通常、制御遺伝子（プロモータ）の制御下に、本発明の DN A分子が配置されるように組み込む。プロモータは、真核細胞で機能する一般的なものでよく、真核細胞由来でもウィルス由来のものでも構わない。プロモータの具体的な例としては、ヘルぺスウィルスのチミジンキナーゼプロモータ（Rossら J. Gen. Virol.、 74:371- 377、 1993)、七面鳥へルぺスウィルス（HVT)及びマレックウィルス（ MDV)1型の gBタンパク質プロモータ（Rossら、 J. Gen. Virol.、 74:3 71 - 377、 1993)、ヒトサイトメガロウィルス（HCMV)の IEプ口モータ（ Stinskiら、 J. Virol.、 55:431-441, 1985)、 SV40プロモータ（Gunn ingら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S丄、 84:4831-4835, 1987)、ヒト /3ァクチンプロモータ（Gunningら Proc. Natl. Acad. Sci. U. S . A.、 84:4831-4835, 1987)、ニヮトリ ]3ァクチンプロモータ（Kost ら、 Nucleic Acids Res.、 11:8287-8301、 1983)、ラウス肉腫ウイルス（RSV)の LTRプロモータ（Greuelら、 Virology 177:33-43、 1990) 、 Pecプロモータ（特開 2001- 000188号公報）などが例示される。

プロモータに加えて、転写を活性化する因子であるェンハンサーを加えることにより、さらに効率的な発現が予想される（Stinskiら、 J. Virol.、 55:431 - 441、 1985)。ェンハンサ一は、サイトメガロウィルス由来プロモータの一部などが例示され、挿入遺伝子との位置的関係は通常限定されない。このタイプのプロモータとして、特開 2001- 000188号公報において示されている Pecプロモータなどが例示される。

このほか、更に、付加 DNAの下流に、ポリアデニレーシヨンシグナルを付加すると、特に高い発現量が得られることが期待される。ポリアデ二レーションシグナルとしては、 SV40などの PolyAシグナノレ（Gunningら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、 84:4831-4835 、 1987)やマレックウイノレス（MDV)l型の UL46h、 UL47h, UL49hの Poly Aシグナノレ（Yanagidaら J. Gen. Virol.、 74:1837—1845、 1993)力 Sィ列示される。

ヘルぺスウィルスの増殖に非必須な遺伝子領域は、例えばマレックウィルス（MDV)l型、 2型、及び 3型（3型は七面鳥へルぺスウィルスである）を例にとると、 TK領域（Rossら、 16th International Herpe s Workshop, 1991)、 US10領域（Sakaguchiら Vaccine、 12:953 - 957、 1994)、 US2領域（Sondermeijer. P. J. ら、 Vaccine, 11:349 - 358、 199 3)、及び特開平 11- 192093に記載の UL44と 45の間の領域や UL45と 46 の間の領域などを例示することができる。本発明の DNAの一例である部分 gB遺伝子や付加 DNAなどの外来遺伝子を、この非必須領域中に挿入して、ホモロジ一ベクターを構築する。本発明の DNAなどの外来遺伝子を挿入するための非必須領域の長さは特に限定されないが、外来遺伝子挿入部位の前後に 10bp以上、好ましくは lOObp以上、より好ましくは 500bp以上の非必須領域由来の塩基があればよい。

上述のホモ口ジ一べクターと親ウィルスとなるへノレぺスウィルスとの間に相同組み換えを起こさせて、組み換えへルぺスウィルスを得る。

組み換えへルぺスウィルスを作製する具体的な方法としては、以下に説明する方法が挙げられる。

ホモロジ一ベクターをへノレぺスゥイノレス感染細胞に、エレクトロポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リポフエクチンを用いた方法、遺伝子銃を用いた方法などで導入する。たとえば親ウィルスが鳥類へルぺスウィルスの場合、ヘルぺスウィルスを感染させる細胞は、鳥類由来の細胞が望ましく、たとえば CEF (ニヮトリ胚繊維芽細胞）、発育鶏卵、鶏腎臓細胞などが挙げられる。感染細胞の培養は、通常行われる培養法でよい。ホモロジ一ベクターを感染細胞に導入する方法は、高い導入効率が得られる点から、エレクト口ポレーシヨンやリボフェクチンを用いた方法を採用することが望ましい。導入するホモロジ一ベクター（プラスミド等）の量を 0. 1〜1000 gの範囲とすると、へノレぺスウィルスのゲノム DNAとホモロジ一べクタ一の相同領域との間での組み換えへルぺスウィルスの発生率が高くなる。このようなホモ口ジーベクターを導入した組み換えへルぺスウィルスのみを選択して得る方法としては、 BPA( Black Plaque As s ay)法を用いることができる。 BPA法とは、外来遺伝子に対する抗体を用いて、免疫反応を行い、外来抗原を発現したプラークを可視化する方法で、外来遺伝子に対する抗体を用い、次に酵素標識をした二次抗体を用いて、最後に対応する基質を用いて可視化する。この方法により、外来遺伝子を発現した組み換えへルぺスウィルスを選択する。また、これら組み換えへルぺスウィルスを作製する場合、外来遺伝子として ]8 -ガラクトシダーゼなどのマーカー遺伝子を組み込む検出が容易であるという利点がある。 ]3 -ガラクトシダーゼ遺伝子を用いた場合、 Bluo- Gal (ィンビトロジェン社製）などを用いて、簡単に発現をモニターしながら組み換え体を単離することができる。それ以外ではプラークハイブリダィゼーシヨンなどの方法により目的とする組み換えへルぺスウィルスを単離する。これら操作を繰り返すことによって、組み換えへルぺスウィルスを純化する。 (抗伝染性喉頭気管炎ウィルス用ヮクチン）

本発明の抗伝染性喉頭気管炎ウィルス用ヮクチンは、上述した本発明の組み換えへルぺスウィルスを有効成分とする鳥類用のヮクチンである。

ワクチンの調製方法に格別な制限はなく、例えば以下の方法により調製することができる。

本発明の組み換えへルぺスウィルスの感染細胞を当該ウィルスが生育できる細胞（以下、宿主細胞という）に感染させ、増殖させた後、細胞をスクレーパー又はトリプシンではがし、遠心分離によって感染細胞と上清とに分離する。たとえば親ウィルスが鳥類へルぺスウィルスの場合、宿主細胞としては、鳥類由来の細胞が好ましく、 CEF (ニヮトリ胚繊維芽細胞）、鶏腎臓細胞などを好適に使用することができる。得られた感染細胞は、 10%のジメチルスルフォキシド（ DMS0 )を含む培養用培地に懸濁し、液体窒素下で凍結保存する。ヮクチンとして使用する時は、適量のリン酸緩衝液や生理食塩水などにこの凍結保存品を溶かして使用する。液体窒素下で上記感染細胞を保存するための安定剤やその他の成分は、ウィルス感染細胞が安定的に生存でき、かつレシピエントにとつて薬理学的に問題のない成分であれば特に限定されない。

このようにして作製した組み換えへルぺスウィルスを主成分とするワクチンの鳥への投与方法は特に限定されない。例えば、鳥個体の皮下に注射する方法や、発育卵に穴をあけて接種する方法など、現行のへルぺスウィルスワクチンと同じ方法が挙げられる。

接種量や接種時期も現行のワクチンと同様でよい。例えば、孵化当日の鳥の背部皮下に 10²〜： L0⁵ PFU又は 10²〜10⁴ TC ID₅。のドーズを 2 0G以上の針を用いて接種することにより、ワクチンとしての効果が期待される。また発生後 18〜： 19日目の発育卵に穴をあけて上記と同様のドーズを接種してもよい。換種方法は、鳥に対して針で接種する方法以外に、 Inovoj ec t ( Embr ex社）などの in ovo接種装置を用いて接種する方法が挙げられる。

上記のようにして得られた組み換えへルぺスウィルスは、 ILTVに対するワクチンとしてばかりでなく、親ウィルスとなったヘルぺスウィルスに対するワクチンとしても機能する。

実施例

実施例 1. ILTVgB遺伝子全長をもつ組み換え用プラスミド（ホモロジ一べクター）の構築米国公開 2003-0059799号公報記載の pGHMCSpo lyASfiの Bgl l切断 12 5bp断片を国際公開 99/18215号公報（EP1026246 )記載の _PNZ45/46Sfi の Sfi l断片に揷入して、 p45/46匪 CSpo lyASfiを構築した。国際公開 99/18215号公報（EP1026246 )記載の _PUC18Xlacをテンプレートとして、配列番号 6のプライマー M13 ( - 21 )と配列番号 7のプライマー lac3，K pnRで PCRを行い、 3205bpの断片を得た。尚、 PCRは、 Pfu Po lymeras e ( St ratagene社）と、 PerkinElmer社の DNA Thermal Cyc l er480を用いて、通常の条件（変性反応を 95°C 1 分、ァニール温度を 60°C又は 55°C 2分、伸長反応を 72°C 3分）で 30サィクル行った。また、全実施例において特に断りがないかぎりこの条件で行った。

この PCRで増幅した 3205bpの断片を BamHIと Kpnlとで切断して得られた 3149bp断片と、 p45/46HMCSpolyASfiを BamHIと Kpnlとで切断して得られた 5573bp断片とをライゲーションして pNZ45/46Hlacpo lyAS fiを構築した。

一方、 pBK- CMV ( Stratagene社）をテンプレートとして、配列番号 6 のプライマー M13 ( - 21 )と配列番号 8のプライマー pCMV- 1とを用いて P CRを行い、 953bpの断片を得て、これを Ps t lと Nhe lとで切断して得られた 599bp断片と、 pNZ45/46HlacpolyASfiを Ps t lと Sphlとで切断して得られた 382bp断片と、 pNZ45/46Hlacpo lyASfiを Sphlと Xba lとで切断して得られた 8332bp断片とを 3断片ライゲーションして pNZ45 /46HCMVlacを構築した。

ILTVgB遺伝子内の Bgl l切断部位を、コードするアミノ酸を変えさせることなく、欠失させる目的で、特開平 10- 807866号公報（EP9536 42 )記載の pGTPs/ ILgBをテンプレートにして、配列番号 9記載のブラィマー ILgB-5と配列番号 10記載のプライマー ILgB - BglRとで PCR増幅をして得られた 1132bp断片と、配列番号 11記載のプライマー ILgB - B glと配列番号 12記載のプライマー ILgB-3+Κρηとで PCR増幅をして得られた 1564bp断片の 2断片を得た。この 2断片をテンプレートとして、配列番号 9記載のプライマー ILgB-5と配列番号 12記載のプライマ一 ILgB-3+KpnとでPCRを行ぃ、 2648bp断片を得た。この 2648bp断片を BamHIと Kpnlとで切断して得られた 2638bp断片を、特開 2001-0001 88号公報記載の pGIPecを BamHIと Kpnlとで切断して得られた 3280bp 断片とライゲーションして pGIPecILgBを構築した。

この pGIPecILgBを BamHIと Kpnlとで切断した 2638bpの断片と、ョ一口ッパ特許第 1298139号公報に記載の pGIBacpAを BamHIと Kpnlとで切断して得られた 4479bp断片とをライゲーションして、 pGIBAcgBpA を構築した。

この pGIBAcgBpAを Bgllで切断して得られた 4464bp断片を、前述の pNZ45/46HCMVlacの Sfil部位に揷入することによって、プロモータとして CMV—IEを有するホモ口ジ一べクター p45/46HCMVlacBacgB2nd を構築した。

次に CMVプ口モータ内の Bgll切断部位を欠失させる目的で、特開 2 00卜000188号公報記載の pGIPecをテンプレートとして、配列番号 8 記載のプライマー pCMV- 1と配列番号 13記載のプライマー pPeclRとで PCR増幅をした 293bpの断片を得た。 pBK- CMV(Stratagene社）をテンプレートとして配列番号 14のプライマー pCMV- olと配列番号 15のプライマー pCMV - R1とで PCR増幅をした 341bp断片を得た。これら 2断片をテンプレートとして、配列番号 8記載のプライマー pCMV- 1と配列番号 15記載のプライマー pCMV-Rlとで PCR増幅をし、 604bp断片を得た。この 604bp断片を Pstlと Xbalとで切断して得られた 589bp断片と、特開 2001-000188号公報記載の pGIPecを Pstlと Xbalとで切断して得られた 2765bp断片とをライゲーションして pGICMV (-)を構築したこの pGICMV (-)を BamHIと Xholとで切断して得られた 2137bp断片と、前述の pGIBAcgBpAを BamHIと Xholとで切断して得られた 4054bp断片をライゲーシヨンし、 pCMV-ILgBを構築した。この pCMV- ILgBを Bg IIで切断して得られた 3338bp断片を、 pNZ45/46RSVlac- Tの Sfil部位に揷入することによって、プロモータとして CMV-IEを有するホモ口ジーベクタ一 p45/46CMVILgBlacを構築した。特開2001-000188号公報記载の 61?60を83111111と 1101とで切断して得られた 2103bp断片と、前述の pGIBAcgBpAを BamHIと Xholとで切断して得られた 4054bp断片とをライゲーションして pGIPecILgB2を構築した。

この pGIPecILgB2を Bgllで切断して得られた 3504bp断片を、特開平 1ト192093号公報（EP1026246)記載の pNZ45/46RSVlac - Tの Sfil部位に挿入することによって、プロモータとして Pecプロモータを有するホモロジ一べクタ一 p45/46PecILgBlacを構築した。

同様に、前述の pGIPecILgB2を Bgllで切断して得られた 3504bp断片を、特開平 11- 192093号公報（EP1026246)記載の pNZ45/46Sfiの Sfi I部位に揷入することによって、プロモータとして Pecプロモータを有するホモ口ジ一べクタ一 p45/46PecILgBを構築した。

実施例 2. ILTVgB遺伝子全長をもつ組み換え HVTの構築と純化

実施例 1で構築した 4つのホモ口ジーベタタ一（p45/46HCMVlacBacg B2nd、 p45/46CMVILgBlac, p45/46Pec ILgBlac, p45/46Pec I B )を用いて組み換え HVTを構築し、その純化を行った。

具体的には以下の通りに行った。

まず、 Morganら（Avian Dis.、 Vol.34、 345 - 351、 1990)の方法に従って、 HVTの DNAを回収した。つまり、約 1 X10⁵PFUの HVT、 FC126 株（ATCC VR-584B)又は、 FC126株（Witter博士より分与されたオリジナル株）を約 3X10⁷個の CEFに感染させ、 2〜3日培養した後、 lysis Buffer(0.5%SDS、 10mM Tris(pH8.0)、 lOOmM NaCl、 ImM EDTA、 200 μ g/ml ProteinaseK)を 4ml力 Pえて、 37°Cで 4時間ィンキュベートした後、フエノール抽出、エタノール沈殿を行って、 HVT-DNAを回収した。

ホモロジ一ベクターは、制限酵素を用いて、相同部位や外来遺伝子を含まない部分で、切断し、直鎖状にした。トリプシンを用いて回収した、約 3X10⁶個の CEFを Saline G(0.14 M NaCl、 0.2mM KC1、 l. lmMリン酸水素ニナトリウム、 1.5mMリン酸水素一カリウム、 0.5mM塩化マグネシウム · 6水和物、 0.011%ダルコース）に懸濁し、先述の HVT- DNA 10~30μ gと、直鎖状にした組み換え用ホモ口ジ一べクター 10〜30 μ gをそれぞれ室温においてジーンパルサー（Bio- Rad社製）を用いて、 0.5KVcnT 0.4msecの条件下でエレクトロポレーションした。この細胞懸濁液を直径 6cmの培養皿に播き、生育培地を加えて、 5〜7日間培養した。培養後、培養液から組み換え HVTを含むウィルスを回収した。次いで、限界希釈法により、組み換え HVTの純化を行った。

純化の具体的な方法は以下の通りであった。

lacZ遺伝子を含まないホモロジ一べクタ一 p45/46PecILgBにつレヽては、約 2X10⁶個の CEFと共に段階希釈したウィルス液と共に、 96w ell plateに播いた。 3〜5日培養して、プラークが出現後、レプリ力を作製した。このうちの 1つのプレートに対して、次の通り BPA(B lack Plaque Assay)法によりスクリーユングを行った。

ILTV - タンパク質を大腸菌で発現させたタンパク質をゥサギに免疫して得た抗血清（抗 ILTV-gB抗血清）を通常細胞培養に用いられるマグネシウムを含まないダルベッコ（Dulbecco's)リン酸バッファ一（大日本製薬社製；以下、 PBS (-)という）で約 500倍に希釈したものを、 22〜25°Cで 2時間、プラークと反応させた。 3%Non- fat dried m ilk in PBS (-)で 3度洗浄した後、ビォチン化抗ゥサギ抗体（ヒッジ、 Biosource社）で 22〜25°C、 2時間、プラークと反応させた。反応後の抗体を PBS (-)で洗浄した後、アビジン -ピオチン-アル力リフォスフオターゼ Complex(Vector laboratories)で反応させた。未反応のァビジン-ビォチン-ァノレ力リフォスフオターゼ Complexを PBS (-）でリンスすることによって洗い流した後、アル力リフォスフォターゼの基質である BC IP/NBT (口シュ社製）を用いて、濃紺から黒色に呈色させた。

BPA法は、こうして発生した陽性のプラークに対応する懸濁ウイルス液を再度、 CEFに感染させることによって、さらに同様の操作を 3〜4回繰り返して全てのプラークが BPAにより陽性となるまで行い、通常は、組み換え HVTの純化構築を完了するものである。

しかし、 p45/46Pec I LgBを組み込んだ組み換え HVTについては、 10 0%純化された組み換え HVTを得ることはできなかった。

lacZを含むホモ口ジ一べクタ一 _P45/46HCMVlacBacgB2nd、 p45/46C MVILgBlac , 及び p45/46Pec ILgBlacを用いた組み換え HVT構築は、以下の手順によって行った。

即ち、約 2 X 10⁶個の CEFと共に段階希釈したウィルス液と共に、培養用平底 96ウェルマルチプレートに播いた。 3〜5日培養して、プラークが出現後、レプリカを作製した。このうちの 1つのプレートに対して、 β -ガラクトシダーゼの発色基質であるブルォガル（Blu

0 - _gal : GIBC0社製）を 100 μ g/mlを 100 μ 1/we l lずつ加え、 37°Cにおいて約 4時間インキュベートした。 lacZを発現するプラークは青変するので、青変プラークを含むゥエルに対応するもう一つのプレートのゥエルより細胞を回収することによりウィルス液とした。このゥィルス液を上記と同様に約 2 X 10⁶個の CEFと共に培養用平底 96ゥェルマルチプレート播いた。培養養用平底 96ウェルマルチプレートから培養用平底 96ゥエルマルチプレートに一回継代する行程を一回のスクリーユングとした。スクリーニングを全ゥエルが青プラークになるまで繰り返し、ブルォガルを加えたときに全プラークが青変するまで（通常、だいたい 5〜 10回のスクリ一二ング）純化を行った。その結果、ホモロジーベクター p45/46Pec ILgBlacからのみ、 1クローンの組み換え HVTの純化に成功し、これを FW050と名づけた。 _P45/46HCMVlacBacgB2ndと p45/46CMVILgBlacを用レヽた場合については、 100%純化された組み換え HVTが得られなかった。

実施例 3. 組み換え HVT FW050の構造とワクチン効果

実施例 2で得られた組み換え HVTである FW050のダイレクトシークエンスを行った。その結果、 FW050は、 PolyAシグナルを含む 1542bp が欠失していて、その代わりに由来不明の 3塩基（GCG)が挟まれていることが判明した（配列番号 22)。その結果、 ILTVgB遺伝子本来の OR Fのァミノ末端側にある 429個のアミノ酸と、終止コドンがでるまで PolyAシグナル部分がコードすることになつた 40個のァミノ酸とからなる 469個のァミノ酸で構成されたキメラタンパク質を発現するであろうことが予測された（図 1及び配列番号 1参照）。

この FW050について、ワクチン効果を調べる動物実験を行ったところ、表 1のような結果となった。

動物実験は、米国農務省 Animal and Plant Heal th Inspec t ion S ervic e (APHI S )が定めた規定（9CFR)に準じて行った。

強毒 ILTVチャレンジについては、 9CFR Ch. 1 113. 328に記載されている方法を用いて行った。つまり、各群 10羽以上の試験用 SPF鶏（ LineM :日本生物科学研究所）に、組み換え HVTを接種した（実験 1でのみ、 FW050については接種後、事故死のために、接種鶏数は 9となつている）。陰性対照群（コントロール）は非接種とした。

試験用 SPF鶏が孵化したとき、組み換え HVT FW050を鶏の背部皮下に 1 X 10⁴ PFUとなるように 26Gの注射針を使って接種した。 4週齢で、強毒 ILTV、 NS-175株 1 X 10³ ' ° EID_{5 Q} /0. lmlを眼窩下洞に接種して攻撃した。接種後 10日間、毎日臨床症状を観察して、感染防御したか否かを判断した。

結果を表 1に示す。

表 1から判るとおり、 FW050については、 I LTV強毒株に対する防御効果が認められた。

(表 1)

実施例 4. ILTVの gB遺伝子を切り縮めた断片をもつ組み換え体の構築

ILTVの gB遺伝子 0RFを一部欠失させた変異体 gB遺伝子産物をもつホモロジ一ベクターを以下の通り構築した。

(1) ILTVの gB遺伝子 0RFでダイマー形成領域を含まないであろうァミノ末端から 623アミノ酸 gB- aをコードする DNAを含むホモロジ一べクタ一： p45/46PecILgBa*3よ D^p45/46PecILgBalac

実施例 1で構築した pGIPecILgB2をテンプレートとして用いて、配列番号 16記載のプライマー P-BglIIと配列番号 17記載のプライマー A- Rとを用いて、前述の常法で PCRを行い、 1205bpの断片を増幅した。これを Bglllと Kpnlとで切断して得られた 1198bp断片と、実施例 1 で構築した _P45/46PecILgBを Bglllと Kpnlとで切断して得られた 7057 bp断片とをライゲーションすることにより、ホモ口ジ一べクタ一 p4 5/46PecILgBaを構築した。

_P45/46PecILgBaを Bglllと Xholとで切断して得られた 6373bp断片と、実施例 1で構築した p45/46PecILgBlacを Bglllと Xholとで切断して得られた 5923bp断片とをライゲーシヨンして、ホモロジ一べクタ一 p45/46PecIし gBalacを構築した。

(2)膜貫通領域の直前まで、カルボキシ末端を欠失させた 691アミノ酸 gB-bをコードする DNAを含むホモロジーベクター： p45/46PecILg Bb*5よび p45/46PecIし gBblac

実施例 1で構築した pGIPecIL_gB2をテンプレートとして用いて、配列番号 16記載のプライマー P-BglIIと配列番号 18記載のプライマー B - Rを用いて、前述の常法で PCRを行い、 1409bpの断片を増幅した。これを Bglllと Kpnlとで切断して得られた 1402bp断片と、実施例 1で構築した p45/46PecILgBを Bglllと Kpnlとで切断して得られた 7057bp 断片とをライゲーションすることにより、ホモロジ一べクタ一 p45/ 46PecILgBbを構築した。

_P45/46PecILgBbを Bglllと Xholとで切断して得られた 6577bp断片と、実施例 1で構築した _P45/46PecILgBlacを Bglllと Xholとで切断して得られた 5923bp断片とをライゲーシヨンして、ホモロジ一べクタ一 _P45/46PecILgBblacを構築した。

(3)膜貫通領域のみを欠失させた 803ァミノ酸 gB-cをコ一ドする DNA を含むホモ口ジ一べクタ一： 45/46PecILgBc*3よび p45/46PecILgBcl ac

実施例 1で構築した pGIPecILgB2をテンプレートとして用いて、配列番号 16記載のプライマー P- Bglllと配列番号 19記載のプライマー C-Rを用いて、前述の常法で PCRを行い、 1409bpの断片を増幅した。また、同様に _PGIPecILgB2をテンプレートとして、配列番号 20記载のプライマー C-Fと配列番号 21記載のプライマー CDE- Rを用いて、常法で PCRを行い、 357bpの断片を増幅した。 1409bpと 357bpの 2つの断片をテンプレートとして、配列番号 16記載のプライマー P-BglIIと配列番号 21記載のプライマー CDE-Rを用いて、常法で PCRを行い、 17 45bpの断片を増幅した。これを Bgl 11と Kpnlとで切断して得られた 1 738bp断片と、実施例 1で構築した _P45/46PecILgBを Bglllと Kpnlとで切断して得られた 7057bp断片とをライゲーシヨンすることにより、ホモロジ一べクタ一 p45/46PecILgBcを構築した。

p45/46PecILgBcを Bglllと Xholとで切断して得られた 6913bp断片と、実施例 1で構築した p45/46PecILgBlacを Bglllと Xholとで切断して得られた 5923bp断片とをライゲーションして、ホモロジ一べクタ一 _P45/46Pec ILgBc lacを構築した。

これらホモロジ一ベクターの模式図を図 2に示す。

以上に述ぺたように構築した 6つのホモロジ一ベクターを用いて、実施例 2と同様に組み換え HVTの純化を行ったが、ホモロジ一べクターと同じ構造の組み換え体を得られなかった。

以上のように、プロモータに続けて、 gBタンパク質のカルボキシ末端から切り縮めた複数のホモロジ一べクターを構築し、組み換え HVTの純化構築を試みたが、ホモロジ一ベクターと同じ ILTVgB遺伝子の長さをもつ組み換え HVTは得られなかった。この結果より、プ口モータと共に組みこんだ gB遺伝子を組み換え HVTで発現させようとした場合、長い 0RFのものは純化が不可能であることが判つた。また、仮に組み換え HVTを純化することができたとしても選択圧により、得られる組み換え HVT中の gB遺伝子の 0RFが短くなってしまうことが考えられた。即ちプロモータと共に gB遺伝子を組み込んだ場合、安定な組み換え HVTとして存在できる ILTVの gB遺伝子 0RFの長さは 623ァミノ酸をコードするもの程度か、これよりも短かいであろうと予想された。

実施例 5. 欠失ク口一ン FW050を元にした改変とその組み換え HVTのヮクチン効果

ILTVの gBタンパク質のァミノ末端側 429ァミノ酸とポリ A由来の 40 アミノ酸とを融合したタンパク質を発現するであろう、実施例 3でヮクチン効果が確認された組み換え HVT FW050から、発現するタンパク質のポリ A由来の 40アミノ酸を欠失させたタンパク質を発現させるべく、ホモ口ジ一べクタ一 p45/46CMVILgBfを構築した。

具体的には、特開 2004- 000111号公報記載の pGIBacpAを EcoRIと Kp nlとで切断して得られた 303bp断片と、実施例 1で構築した pG IPec IL gB2を EcoRIと Kpnlで切断して得られた 5854bp断片とをライゲーションして、 pGIPecILgB3を構築した。この pGIPec ILgB3を Bgl IIと Sf i I とで切断して得られた 2245bp断片と、実施例 1で構築した p45/46Pec ILgBを Bglllと Sfilとで切断して得られた 6759bp断片とをライゲーションして _P45/46PecILgB2を構築した。

次に、 pGIPecILgB2をテンプレートとして、配列番号 16の P- B_gl 11 と配列番号 23の F - Rとで PCRを行って 623bpの断片を得た。これを Bgl IIと Kpnlとで切断して得られた 616b_P断片と、 p45/46Pec ILgB2を Bgl Πと Kpnlとで切断して得られた 7057bp断片とをライゲーションして、 p45/46PecILgBfを構築した。

この p45/46PecILgBfを Xbalで完全切断した後、 Pstlで部分切断して得られた 7102bp断片と、実施例 1で構築した pGICMV (-)を Pstlと Xb alとで切断して得られた 589bp断片とをライゲーションすることによりホモロジ一べクタ一 p45/46CMVILgBfの構築を完了した。

このホモ口ジーべクター _P45/46CMVILgBfを用いて、組み換え HVT である FW063を構築し純化した。組み換え HVT FW063の挿入遺伝子部分がホモロジ一ベクターの塩基配列と同一であり、変異されていないことを確認した。

さらに、 FW050より逆にクローニングして、ホモロジ一ベクター p 45/46PecILgBdellacを、以下の手順で構築した。

このクローニング時に用いた PCRのテンプレートは、 FW050を-ヮトリに接種し回収したウィルス DNAであり、プライマーは、配列番号 16の P- Bglllと配列番号 24の 45/46F(K)の 2つのプライマーにより増幅して得られた 944bp断片を Bglllと Sfilとで切断して得られた 70 7bp断片と、 _P45/46PecILgBlacを Bglllと Sfilとで切断して得られた 10809bp断片とをライゲーシヨンして、ホモロジ一べクタ一 p45/46P ecILgBdellacを構築した。このホモ口ジ一べクタ一 p45/46Pec ILgBd ellacを用いて、組み換え HVT FW069の純化構築に成功した。

上記 FW050と同様に、ポリ A部分は全く変えずに、 gBタンパク質のァミノ末端側 429ァミノ酸の 0RFが終了した箇所にターミネーションを入れたホモロジ一べクタ一 _P45/46PecILgBdellac+STPを、以下の手順で構築した。

まず配列番号 16のプライマー P-Bglllと配列番号 25のプライマー g BdelSTP-Rとを用いて増幅した 637bp断片と、配列番号 26のプライマ一 gBdelSTP - Fと配列番号 27のプライマー 45/46F(B)とを用いて増幅した 673bp断片とをテンプレートとして、プライマー P - Bglllとブラィマー 45/46F(B)とで PCRを行うことにより、 1263bpの断片を得て、これを Bglllと Sfilとで切断して得られた 707bp断片と、 p45/46PecI LgBlacの Bglllと Sfilとで切断して得られた 10809bp断片とをライゲーションすることにより、ホモロジ一べクタ一 _P45/46PecILgBdella c+STPを構築した。

このホモ口ジーベタター _P45/46PecILgBdellac+STPを用レヽて、組み換え HVT FW070の純化構築に成功した。

このように、実施例 3に示された FW050と同じく gB遺伝子の 0RFが 4 29アミノ酸である FW063、 FW069及び FW070は、問題なく純化できた。このことから、配列番号 2記載のアミノ酸配列のァミノ末端側 429 アミノ酸をコードする gB遺伝子由来の DNAを、プロモータと共に組み込んだ組み換え HVTで発現しようとした場合、純化が可能であること力 S 力つた。

こうして純化された組み換え HVTである FW063、 FW069、及び実施例 3で純化された FW050を用いて、実施例 3と同様に、ニヮトリに対するチャレンジ実験を行い、ワクチン効果を調べた。結果を表 2に示す。 (表 2 )

この結果から、付加配列のない FW063にもヮクチン効果は認められ、付加配列のある FW069及び FW050は、より優れたワクチン効果を示すことが判った。

Claims

請求の範囲

1 . 伝染性喉頭気管炎ウィルスの gB遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ末端側のァミノ酸 429個からなるポリペプチド

、又はその 1つ或いは複数個のアミノ酸が欠失、付加、又は置換されたポリぺプチドをコ一ドする DNAを有する組み換えへルぺスウイルス（但し、伝染性喉頭気管炎ウィルスを除く）。

2 . 前記 DNAの 3，末端に、インフレームで配列番号 4記載のアミノ酸配列、又は、その 1つ或いは複数個のアミノ酸が欠失、付加、又は置換されたァミノ酸配列をコードする DNAが連結している請求項 1 記載の組み換えへルぺスウィルス（但し、伝染性喉頭気管炎ウィルスを除く）。

3 . ヘルぺスウィルスが鳥類に感染するウィルス（但し、伝染性喉頭気管炎ウィルスを除く）である請求項 1又は 2記載の組み換えへノレぺスゥイノレス。

4 . 鳥類に感染するへルぺスウィルスが、マレック病ゥイノレス 1 、 2又は 3型である請求項 3記載の組み換えへルぺスウィルス。

5 . 請求項 1〜4のいずれかに記載の組み換えへルぺスウィルスを有効成分とする抗伝染性喉頭気管炎ウィルス用ヮクチン。