WO2005093063A1

WO2005093063A1 - 固形癌診断キット及び固形癌治療用医薬

Info

Publication number: WO2005093063A1
Application number: PCT/JP2005/006222
Authority: WO
Inventors: Hideaki Shimada; Takeshi Tomonaga; Takaki Hiwasa; Kazuyuki Matsushita; Takenori Ochiai; Fumio Nomura; Masaki Takiguchi
Original assignee: Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.
Priority date: 2004-03-29
Filing date: 2005-03-24
Publication date: 2005-10-06
Also published as: US20100330554A1; US20080219981A1; JPWO2005093063A1; EP1739173A1

Abstract

　本発明は、新規な固形癌抗原タンパク質、並びに該抗原タンパク質に基づく固形癌診断キット及び固形癌治療剤を提供する。より具体的には、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４８、５０、５２、５４、５６、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３及び７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するヒト固形癌抗原ポリペプチドを提供する。

Description

固形癌診断キット及ぴ固形癌治療用医薬

5 技術分野

本発明は、固形癌診断キット及ぴ固形癌の予防又は治療用医薬に関する。

背景技術明

食道癌、胃癌、肺癌、腎癌、甲状腺癌、耳下腺癌、頭頸部癌、骨，軟部肉腫、田

10 尿管癌、膀胱癌、子宮癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、 .卵管癌等の固形癌はいずれも悪性の腫瘍であり、特に進行性の固形癌は治療が囪難で多くの場合に致命的となる。従って、固形癌に対する対策としては癌腫の早期発見が最も重要な課題である。上記の固形癌の診断及び予後の観察には、従来から腫瘍マーカーとして C E A、

CA 1 9— 9等が報告され、用いられている。しかしながら、いずれも陽性率は

15 20〜 30%程度にすぎず、特に早期癌においてはほとんどのマーカーが陰性を示す。また、上述のように進行した固形癌は治療成績が不良であり、早期発見が最も大きな効果をもたらすことから、新規かつ有用な腫瘍マーカーを発見することが期待されている。

なお、抗原タンパク質マーカーを用いた分子生物学的診断方法としては、例え

20 ば特開平.7 - 5 1 065号公報、再表 00 Z.060ひ 73号公報 ¾び特表 200

. 0 - 5 1 1 53 6号公報が知られている。また、担癌患者の腫瘍細胞の mRN A から作製したタンパク質を患者の自己血清でスクリ一ユングする S EREX法

(serological identification of antigens by recombinant expression cloning)

' が報告され（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11810-11813， 1995 及ぴ米国特許

25 第 5， 698.， 3 96号）、悪性黒色腫、腎癌、食道癌、大腸癌、肺癌等において

- I g G抗体が認識する癌抗原を、上記 SEREX法により単離した報告もなされている（Int. J. Cancer 72： 965 - 971， 1997； Cancer Res. 58:1034-1041， 1998；

Int. - J. Cancer 29:652-658, 1998； Int...J,- Oncol. 14： 703-708, 1999； Cancer Res.

56：'4766-4772^ 1996； Hum. Mol. . Genet 6:33 - 39; 1997)。さらに、特開 2 0 0 1 - 33 3 7 82号公報には、 S E REX法によって特定した悪性黒色腫抗原タンパク質とそれをコードする DN A配列、並びにこれらを使用した悪性黒色腫の診断方法が開示されている。しかしながら、固形癌の診断精度をさらに向上させるためには、抗原性の高いタンパク質マーカーをより多く準備し、それらを組み合わせて使用することが不可欠である。 ^r

一方、固形癌の治療方法としては、癌組織の外科的な切除や全身性の抗癌剤投与等が行われている。しかしながら、前記のとおり、進行性に移行した固形癌の場合にはこれらの治療法も効果は少なく、また早期に発見した場合であっても、これらの治療法は患者に大きな身体的負担を負わせるという問題を有している。発明の開示

上述したように、固形癌の早期診断のための方法として、癌組織特異的な抗原タンパク質マーカ^を用いた分子生物学的診断方法の有効性が指摘されており、そのための新しい抗原タンパク質マーカーも幾つか提案されている。しかしながら、その診断精度をさらに向上させるためには、抗原性の高いタンパク質マ一力一をより多く準備し、それらを組み合わせて使用することが不可欠である。また、それらの抗原タンパク質マーカーは固形癌組織で優勢に発現するため、癌組織のみを標的とする治療法への応用も期待される。

従って、本発明は、新規な固形癌抗原タンパク質、並びに該抗原タンパク質に基づく固形癌診断キット及ぴ固形癌治療剤を提供するこどを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ヒト固形癌に特異的な新規な抗原ポリべプチドを見出し、この抗原ポリぺプチドの発現を利用することによって、固形癌を診断し、また固形癌の予防及び治療を行うことができるという知見を得、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1

8、 2 0、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 4 2、 44、 48、 50、 52、 54、 5 6、 59、 6 1、 63、 6 5、 6 7、 6

9、 7 1、 73及び 75からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するヒト固形癌抗原ポリペプチドである。また本発明は、上記ヒト固形癌抗原ポ.リペプチドをコードするポリヌクレオチドである。

, 本発明はまた、配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 23、 25、 27、 29、 31、 3 3、 3 5、 3 7、 3 9、 41、 43、 45、 46、 47、 49、 5 1、 53、 5 5、 5 7、 58、 60、 62、 64、 66、 68、 7.0、 72及ぴ 74からなる群より選択される'塩基配列を有するポリヌクレオチドである。

さらに本発明は、被験者に由来するサンプル中の 1種以上のヒト固形癌抗原ポリペプチドの発現を検出するための手段を含む固形癌診断キットにおいて、該ヒト固形癌抗原ポリペプチドが配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 14、 1 6、. 1.8、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 3 2、 34、 36、 38、 40、' 42、 44、 48、 50、 5 2、 54、 5 6、 5 9、 6 1、 6 3、 65、 6 7、 6 9、 71、 73及ぴ 75からなる群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする固形癌診断キットである。.

また本発明は、被験者に由来するサンプル中の 1種以上のヒト固形癌抗原ポリペプチドの発現を検出するための手段を含む固形癌診断キットにおいて、該ヒト固形癌抗原ポリペプチドが配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 2 3、 25、 2 7、 29、 3 1、 33、 35、 3 7、 39 , 4 1、 43、 45、 46、 47、 49、 5 1、 5 3、 5 5、 5 7、 58、 60、 6 2、 6.4、 '6 6.、 6 8、 7.0、 7 2及ぴ 74からなる群より.選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコ一ドされることを特徴とする固形癌診断キットである。

上記ヒト固形癌抗原ポリペプチドの発現を検出するための手段としては、該固形癌抗原ポリぺプチド又はその部分ぺプチド、該固形癌抗原ポリぺプチドに対する抗体、及ぴ該固形癌抗原ポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの全部若しくは一部の配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマー又はプローブが挙げられる。 . . また、上記ヒト固形癌抗原ポリペプチド 'の ^現.を検出するための手段は、..固相上に固定化さ"れていてもよいし、及び Z又ば標識されていてもよい。 ' 上記固形癌としては、大腸癌、食道癌、胃癌及び乳癌が含まれる。また上記サンプルは、例えば血清、血液、血液細胞及び組織が含まれる。

本発明はまた、 1種以上のヒト固形癌抗原ポリペプチドの機能又は発現を抑制するための手段を含む固形癌の予防又は治療用医薬において、該ヒト固形癌抗原ポリぺプチドが配列番号 2、 4、 6、 8、 .1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 3 6、 38、 40、 42、 44、 48、 50、 52、 54、 56、 59、 6 1、 6 3、 6 5、 6 7、 69、 7 1、

73及び 7 5からなる群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする固形癌の予防又は治療用医薬である。

また本発明は、 1種以上のヒト固形癌抗原ポリペプチドの機能又は発現を抑制するための手段を含む固形癌の予防又は治療用医薬において、該ヒト固形癌抗原ポリペプチドが配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 3 3、 3 5、 3 7、 3 9、 41、 43、 45、 46、 47、 49、 5 1、 53、 5 5、 5 7、 58、 6 0、 62、 64、 66、 68、 70、 72及ぴ 74からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされることを特徴とする固形癌の予防又は治療用医薬である。

上記ヒト固形癌抗原ポリべプチドの機能又は発現を抑制するための手段としては、該固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体、該固形癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の転写を抑制可能な手段、及び該固形癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳を抑制可能な手段が挙げられる。

さらに本発明は、固形癌治療薬又は固形癌治療薬をコードする遺伝子とヒト固形癌にターグティングする手段とを含む、固形癌の予防又は治療用医薬である。上記ヒト固形癌にターゲティングする手段としては、固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体、及ぴ固形癌抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現制御領域の塩基配列が挙げられる。図面の簡単な説明

図 1 Aは、大腸癌患者の癌組織及び正常組織における抗原タンパク質の特異的発現の比較を示す。 .

図 1 Bは、大腸癌患者の癌組織及び正常組織における抗原タンパク質の特異的発現の比較を示す。 .

図 2は、配列番号 4 1に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポ . 5 リペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロット分析の結果である。

図 3は、配列番号 4 3に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンブロット分析の結果である。 '

10 図 4は、配列番号 4 5に塩基配列を示したポリ.ヌクレオチドが発現する抗原ポリペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロット分析の ' · 結果である。

図 5は、配列番号 4 6に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロット分析の 15 結果である。

図 6は、配列番号 4 7に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンブロット分析の結果である。

図 7は、配列番号 4 9に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポ 20 リぺプチ.ド、患者血清中の抗体とめ反応性を示したウェスタンブロット分析の • 結果である。 - '

図 8は、配列番号 5 1に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリぺプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンブロット分析の · ' 結果である。

25 図 9は、配列番号 5 3に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロ.ット分析の

' 結罘である。 .

図 1 0は、配列番号 5 5に塩基配 ¾を示した' 'ポリヌ'クレ.ォチドが発現する抗原ポリ -ペプチド"と'、患者血清中の抗体との反応性を示したウスタンプロット分析の結果である。

図 1 1は、配列番号 5 7に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリべプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロット分析の結果である。

図 1 2は、配列番号 5 8に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリぺプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロット分析の結果である。

図 1 3は、配列番号 6 0に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロット分析の結果である。

図 1 4は、配列番号 6 2に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンブロット分析の結果である。

図 1 5は、配列番号 6 4に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロット分析の結果である。 '

図 1 6は、配列番号 6 6に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリべプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロット分析' の結果である。

図 1 7は、配列番号 6 8に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロット分析の結果である。

図 1 8は、配列番号 7 0に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリぺプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロット分析の結果である。

図 1 9は、配列番号 7 2に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロット分析の結果である。

図 2 0は、配列番号 7 4に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ポリぺプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロット分析の結果である。 ■ ' 発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。本願は、 2 0 0 4年 3月 2 9日に出願された日本国特許出願第 2 0 0 4 - 9 5 7 3 2号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び Z又は図面に記載される内容を包含する。

1 . 新規なヒト固形癌抗原ポリぺプチド

本発明は、ヒト固形癌に異的な新規抗原ポリペプチドに基づくものである。. 本発明者らは、大腸癌患^¹の手術標本の正常部と癌部から患者本人の了解を得て · タンパク質を抽出し、二次元電気泳動法（例えば、 Electrophoresis 22 : 3019-3025， 2001) により解析することによって、固形癌細胞において特異的に発現し、従来は腫瘍マーカーとしての機能が知られていなかった 2 0種の抗原ポリべプチド (表 1の 1〜2 0番に示す）を見出した（実施例 1参照）。また食道癌、胃癌、大腸癌及ぴ乳癌患者の了解を得て採取した血清を S E R E X法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 11810 - 11813， 1995；米国特許第 5， 6 9 8 , 3 9 6号）によって解析し、食道癌、胃癌、大腸癌友び乳癌患者の血清中にのみ存在する 1 9種の特異的抗体に対する抗原ポリペプチド（表 1の 2 1〜3 9番に示す）を見出した（実施例 2参照）。.. れら'の固形癌抗原ポリペプチドを表 1に示す _ώ · · · ■

表 1

名称塩基配列アミノ酸配列クローン名リンゴ酸デヒドロゲナ一ゼ 2 NP.005909, 1 2

NM一 005918

トロポミオシン 4 NP— 003281, 3 4

NM一 003290

FK506結合タンパク質 4' NP— 002005, 5 6

NM一 002014

シャぺロニン含有 TCP1, サブユニット 6A NP— 001753, 7 8

NM— 001762

セリンプロテアーゼインヒビター，クレード H, NP.001226, 9 10

コラーゲン結合タンパク質 1 ' NM— 001235

硫化物デヒドロゲナーゼ様 NP— 067022, 11 12

NM-021199

ヒドロキシステロイド (17 - β )デヒドロゲナーゼ 4 NP— 000405' 13 14

NM— 000414

ストレス誘導性リンタンパク質 1 NP一 006810, 15 16

NM— 006819

異種核リボ核タンパク質 L NP.001524, 17 18

NM一 001533

異種核リボ核タンパク質 U NP— 004492， 19 20

亂 004501

マトリン 3 NP— 061322, 21 22

NM— 018834

ァネキシン A3 NP— 005130, 23 24

NM.005139

PTK9Lタンパク質チロシンキ^ "一ゼ 9様 NP.009215, 25 26

NM— 007284

スプライシング因'子,アルギニン/セリンリッチ 1 NP— 008855， 27 28

NM_006924

チォ硫酸スルフルトランスフェラーゼ NP一 003303, 29 30

NM一 003312

S -アデノシルホモシスティンヒドロラーゼ NP— 000678, 31 32

NM— 000687

GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ NP.001491, 33 34

亂 001500

ヒドロキシァシルデヒドロゲナーゼ， NP— 000173' 35 36

サブユニット A · 觀ー 000182

プロリル- 4-ヒドロキシラーゼ β サブユニット NP— 000909， 37 38

NM— 000918

ぺノレオキシレドキシン 5 NP_036226, 39 40

雇一 012094

プロゲステロン受容体膜コンポーネント 2 NM— 006320 41 42 K35-1-1

MAPキナーゼ結合セリン/トレォニン NM— 199054 43 44 K30-1-1 キナーゼ 2

EST: 601191782F1 BE264462 45 12N3-1

EST: 602301679F1 BG032310 46 1201-1 25 付加的性櫛類似 1 ' NM.015338 47 48 14A1-1-1

26 フォークヘッドボックス A1 ΝΜ一 004496 49 50 ' 18G3-1

27 レチノイン酸誘導 16 . ΝΜ一 022749 51 52 19C1-1

28 リケン cDNA 5730528L13類似遺伝子 ' ΝΜ.080655 - 53 54 19F1-1

29 リシン tRNA合成酵素 ' BC004132 55 56 19F1-2

30 EST: AGENCOURT— 15657942 CF597227 57 6BD3-1

31 KDEL .小胞体タンパク質保持受容体 1 ΝΜ— 006801 58 59 14H1-2-1

32 リソソーム結合タンパク質膜貫通 4ベータ NM_018407 60 61 18B2-1

33 タンパク質ホスファターゼ 1， ΝΜ一 002708 62 63 18G1-1 触媒サブユニット、 αァイソフォーム

34 ぺノレォキシレドキシン 3 ΝΜ_006793 64 65 20J4-1

35 アルドケトレダクターゼファミリー 1, ΝΜ一 003739 66 67 19M2 メンノ一 C3

36 ュビキチン結合酵素 Ε2Ι BC000744 68 69 10Q3-1

37 ホファチジン酸ホスファタ一ゼ、タイプ 2C ΝΜ— 003712 70 71 14A1-1-2

38 ベータカテニン相互作用タンパク質 1 ΝΜ一 020248 72 73 14B1-2-1

39 ソーティングネキシン 15 · NMJ47777 74 75 14H2-1-1 なお、本発明において、「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味し、タンパク質及ぴペプチドを含む。「ポリヌクレオチド」とは、プリン又はピリミジンが糖に一 Ν—グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（A T P 、 G T P 、 C T P 、 U T P ;又は d A T P 、 d G T P 、 d C T P 、 d T T P ) が結合した分子をいう。

また、表 1にそれぞれ示した塩基配列及びアミノ酸配列については、 1若しくは数個の塩基の付加、欠失、他の塩基への置換、あるいはこれらの塩基変異に ¾ づく 1若しぐほ数個のアミノ酸残基の付加、欠失及ぴ他のアミノ酸への置換をも' 包含する。

さらに、「血清中抗体」とは、固形癌患者の血清中に存在し、固形癌抗原ポリぺプチドと結合する抗体 I g Gを意味する。また、「抗体」は、固形癌抗原ポリぺプチド又はその部分断片を免疫原として作製されたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を意味する。

本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。また本発明を実施するために使用する ¾々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の'文献等に基づいて当業者であれば容易 W 200 かつ確実に実施可能である。例えば、本発明に係る医薬を調製するための薬剤の調は Remington s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ea. A. Gennaro, Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990 に、遺伝子工学及び分子生物学的技術は Sambrook and Maniatis, Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 ; Ausubel, F. M. et al. , Current Protocols i Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y， 1995等に記載されている。

固形癌抗原ポリぺプチドとは、表 1に示した 3 9種の遺伝子又は E S T (Expressed Sequence Tag) が発現するポリペプチドである。これらの遺伝子産物については様々な機能が知られているが、固形癌における特異的発現は知られていない。なお、本発明においては、 E S Tの発現産物は「配列番号 4 5、 4 6 又は 5 7に示した塩基配列からなるポリヌクレオチドがコ一ドするポリべプチド」と定義する。

なお、実施例に示したように、配列番号 1〜 4 0に示した遺伝子及びべプチドは二次元電気泳動法によって、配列番号 4 1〜 7 5の遺伝子、 E S T及ぴぺプチドは S E R E X法によって特定されたものである。

2 . 固形癌診断キット

上述の通り、表 1に示す固形癌抗原ポリペプチドほ、ヒト固形癌において特異的に発現する。従って、被験者由来のサンプルにおいてこの固形癌抗原ポリぺプチドの発現を検出することによって、被験者をヒト固形癌について診断することが可能となる。

本発明に係る.固形癌診断キット（以下、「本固形癌診断キット」ともいう）は、被験者に由来するサンプル中の 1種以上のヒト固形癌抗原ポリぺプチドの発現を検出するための手段を含むものである。

本固形癌診断キットは、固形癌の診断を行うための試薬キットである。このようなキットは、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、本固形癌診断キットも、ヒト固形癌抗原ポリペプチドの発現を検出するための手段（固形癌抗原ポリペプチド、抗体、プライマー、プローブなど）を用いることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。

また、本固形癌診断キットにより固形癌、例えば限定するものではないが、大腸癌、食道癌、胃癌、肺癌、腎癌、甲状腺癌、耳下腺癌、頭頸部癌、骨 .軟部肉腫、尿管癌、膀胱癌、子宮癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、卵管癌等について被験者を診断することが可能である。好ましくは、大腸癌、食道癌、胃癌及び乳癌の診断のために用いることができる。

ここで固形癌抗原ポリペプチドの発現、タンパク質発現、及ぴその抗体発現、並びにその遺伝子の発現を検出する手段としては、

( 1 ) 固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体

( 2 ) 固形癌抗原ポリペプチド

( 3 ) 固形癌抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに基づいて設計さ' れたプロープ又はプライマー

が挙げられる。以下、これらの手段について詳述する。 ( 1 ) 固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体

固形癌抗原ポリべプチドに対する抗体は、癌において発現された固形癌抗原ポリペプチドと結合することができるため、該抗体を用いてサンプル中の固形癌抗原ポリべプチドどの反応を検出することによって、該サンプルが癌患者又はハイリスク者に由来するか否かを診断することができる。

固形癌抗原ポ.リぺプチドに対する抗体は、ポリクローナル抗体.又はモノクロ— ナル抗体であり、それぞれ固形癌抗原ポリペプチドのェピトプに結合することができる全体分子、及び F a b、 F ( a b ' ) ₂、 F vフラグメント等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、抗原ポリぺプチドやその一部断片を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、'動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ニヮトリなどが用いられる。' また、モノクローナル抗体は、公卸のモノ-ク' —ナ'ル.抗体作製法（「単クローン抗体」、'長宗眷明、 · 寺田弘共著、廣川書店、 ·1 9 ^:9 0年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academi c Press, 1996) に従い作製することができる。

また固形癌抗原ポリべプチドに対する抗体には、標識物質によって標識化された抗体も含まれる。そのような標識化抗体の詳細については、上記を参照されたい。 ' '

固形癌抗原ポリぺプチドに対する抗体を用いて被験者由来のサンプル中の固形癌抗原ポリペプチドの発現を検出し、ヒト固形癌を診断する場合には、被験者のサンプル中に、固形癌抗原ポリべプチドに対する抗体又はその標識化抗体と結合する抗原ポリべプチドが存在するか否かを試験し、サンプル中にその抗原ポリべプチドが存在する被験者を固形癌患者又はそのハイリスク者と判定する。すなわち、ここで使用する抗体又は標識化抗体は、固形癌細胞で発現している抗原ポリぺプチドと特異的に結合する抗体であるから、この抗体と結合する抗原ポリぺプチドを含むサンプルを、固形癌患者又はそのハイリスク患者の試料として判定することができる。なおその際に、好ましくは 2種類以上、好ましくは 5種類以上、さらに好ましくは 1 0種類以上、最も好ましくは 1 5 — 3 9種類の抗体についてサンプル中の抗原ポリペプチドとの結合を判定する。また、サンプルとしては、固形癌抗原ポリぺプチドが発現されるサンプルであれば特に限定されるものではなく、血液や血液細胞（単核球等）、組織を対象とすることができる。

また別の態様は、抗体と抗原ポリぺプチドとの結合を液相系において行う方法である。例えば、標識化抗体とサンプルとを接触させて標識化抗体と抗原ポリべプチドを結合させ、この結合体を上記と同様の方法で分離し、標識シグナルを同様の方法で検出する。

液相系での診断の別の方法は、固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体（一次抗体）とサンプルとを接触させて一次抗体と抗原ポリペプチドを結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体 +抗原ポリぺプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビォチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、！；次抗体の一部領域（例えば、 F c領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は上記と同様とすることができる。

また別の態様は、抗体と抗原ポリべプチドとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量の抗原ポリペプチド検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体（一次抗体）を固相（樹脂プレート、メンブレン、ビーズ等）に固定化し、この固定化抗体に抗原ポリペプチドを結合させ、非結合べプチドを洗浄除去した後、プレート上に残った抗体 +抗原ポリべプチド結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この二次抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカ一として酵素を用いる場合には、「E L I S A (enzyme l inked immunosorbent assay) J として広く用いられている方法である。一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は上記と同様とすることができる。

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( 2 ) 固形癌抗原ポリペプチド - 固形癌抗原ポリペプチドは、癌細胞が発現するポリペプチドであるため、癌を有する患者の血清中には、発現された固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体（血 · 清中抗体）が存在する。従って、固形癌抗原ポリペプチドを使用して血清中抗体との反応を調べることによって、被験者における固形癌抗原ポリペプチドの発現を検出することができる。この固形癌抗原ポリペプチドとしては、表 1に示す抗原ポリべプチド又はその部分ぺプチドを用いることができる。本明細書中、「抗原ポリ.ペプチド」には、表 1 ·に示す抗ポ. ペプチドのほか、表 1に示す抗原ポリペプチドの "ち少なくとも 6個以上のアミノ酸、 :·好ましくは 6〜 5 0 0、より好ましくは 8〜50アミノ酸からなる部分べプチドも含まれる。

これらの抗原ポリペプチドは、例えば、表 1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターからインビトロ転写によって RNAを調製し、これを錶型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロでペプチドを発現させることにより調製することができる。また組換え発現ベクターを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞に導入して形質転換細胞を作製すれば、この形質転換細胞からポリペプチドを発現させることができる。

抗原ポリべプチドをィンビトロ翻訳で発現させる場合には、抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、 RNAポリメラーゼプロモーターを有するベクタ一に挿入して組換え発現ベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応する RNAポリメラーゼを含むゥサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、抗原ポリぺプチドをインビトロで生産することができる。 RNAポリメラーゼプロモーターとしては、 T 7、 T 3、 S P 6などが例示できる。これらの RN Aポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、 pKAl、 p CDM8、 p T 3/Τ 7 1 8、 ρ Τ 7/ 3 1 9、 ρ Β 1 u e s c r i ρ t I Iなどが例示できる。

抗原ポリペプチドを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能な複製起点、プロモーター、リボソーム結合部位、 DNAクローニング部位、ターミネータ一等を有するベクターにポリヌクレオチドを連結した発現べクタ一を作製し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、そのポリヌクレオチドがコードしている抗原ポリべプチドを微生物から発現させることができる。この際、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、 pUC 系、 p B l u e s c r i p t I I、 p E T発現系、 p G E X発現系などが例示でさる。

抗原ポリペプチドを、真核細胞で発現させる場合には、抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（A) 付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、真核細胞内に導入すれば、抗原ポリぺプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターどしては、 pKAl、 p CDM8、 p SVK 3、 M S G、 p SVL、 p BK— CMV、 p B -R S V, EBVベクター、 p RS、 p c DNA3、 pMSG、 p YE S 2などが例示できる。また、 I ND/V5 一 H i s、 p FLAG— CMV— 2、 p EGF P— N l、 p EGFP— C Iなどを発現ベクターとして用いれば、 H i sタグ、 F LAGタグ、 my cタグ、 HA タグ、. GF Pなど各種タグを付加した融合タンパク質として抗原ポリペプチドを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞 COS 7、チヤィニーズムスター卵巣細胞 CHOなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、 ***酵母、カイコ細胞、アフリカッメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、抗原ポリべプチドを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 D EAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。 '

抗原ポリぺプチドを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的の抗原ポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うこ.とができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析ゃ溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、 SD S— PAGE, 等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ァフイエティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。 . . . ' ... ' ' · · · . ' · なお、以上の方法によって得られる組換え抗原ポリペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチオン一 S—トランスフエラーゼ（GST) や緑色蛍光蛋白質（GF P) との融合蛋白質などが例示' できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、'翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたペプチドも抗原ポリべプチドとして用いることができる。このような翻訳後修飾としては、. N末端メチォニンの脱離、 N末端ァセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、. ミリストイル化、イソプレニル匕.、..リ.ン酸化 ¾どが例示できる。

固形癌抗璩ポリぺプチドを用いて、'被験者由来のサンプルにおける园形癌抗原 • · · .. - 15- . ポリペプチドの発現を検出するためには、被験者のサンプル（血清）中に、固形癌抗原ポリペプチドと結合する血清中抗体が 1種類以上存在するか否かを試験する。そして血清中にその抗体が存在する被験者を固形癌患者又は固形癌ハイリスク者と判定する。すなわち、固形癌抗原ポリペプチドは、固形癌患者に由来する血清中抗体（I g G )' と結合するポリペプチドであるから、被験者の血清と反応させた結果、サンプルがこれらの抗原ポリぺプチドと結合する血清中抗体を含む場合には、固形癌患者又はそのハイリスク患者のサンプルとして判定することができる。なおその際に、 2種類以上、好ましくは 5種類以上、さらに好ましくは 1 0種類以上、最も好ましくは 1 5〜 3 9種類の抗原ポリペプチドについて抗体との結合を判定する。またさらに、すでに知られている他の固形癌マーカ一（例えば、 C E A、 C y f r a、 3〇〇ー _§など）を併用することもできる。また、サンプルとしては、血清中抗体が含まれるサンプル、すなわち血清を対象とすることができる。

本固形癌診断キットを用いた具体的な診断は、例えば固形癌診断キットに含まれる固形癌抗原ポリペプチドに被験者血清を接触させ、該固形癌抗原ポリぺプチドと被験者血清中の I g G抗体とを液相中において反応させることにより行う。さらに血清中の I g G抗体と特異的に結合する標識化 I g G抗体を反応させて、標識化 I g G抗体のシグナルを検出すればよい。標識化抗体に使用する標識としては、酵素、放射性同位体又は蛍光色素を使用することができる。酵素は、代謝回転数が大きいこと、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常の酵素免疫アツセィ（E I A) に用いられる酵素、例えば、ペルォキシダーゼ、 |3—ガラクトシダーゼ、アル力リフォスファターゼ、グノレコースォキシダーゼ、ァセチ /レコリンェステラーゼ、グルコース一 6—リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によつて行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルォキシダーゼを使用する場合には、 3， 3 ' , 5 , 5 ' —テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラ-トロフエノール等を用いることができる。

酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、檫準値との比較から抗体量が算出される。

放射性同位体としては、¹²⁵ Iや³ H等の通常のラジオィ Λノアッセィ（R I A) で用いられているものを使用することができる。放射性同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンタ一等により測定する。蛍光色素としては、フルォレツセンスイソチオシァネート（F I TC) ゃテトラメチルローダミンイソチオシァネート (TR I TC) 等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。

さらにまた、標識化抗体には、マンガンや鉄等金属を結合させたものも含まれる。このような金属結合抗体を体内に投与し、 MR I等によって金属を測定す. ることによって、血清中抗体の存在、すなわち固形癌抗原ポリペプチドの発現を検出することができる。

シグナルの検出は、例えば、ウェスタンプロット分析を採用することができる。あるいは、抗原ポリペプチド +血清中抗体 +標識化 I gG抗体の結合体を、公知の分離手段（クロマト法、塩析法、アルコール沈殿法、酵素法、固相法等）によつて分離し'、 .標.識化 I g Q抗体のシグナルを検出するよ.うにしてもよレ、。 ■ また、抗原ポリペプチドの 1種類以上を固相（プレート、メシブレン、ビーズ等）上に固定化し、この固相上において被験者血清の抗体との結合を試験することもできる。抗原ポリペプチドを固相上に固定化することによって、未結合の標' 識化結合分子を容易に除去することができる。また特に、数十種類の抗原ポリべプチドを固定化したメンプレンを用いるプロテインアレイ法では、 0. O i m l 程度の被験者血清を用いて多種類の抗体の発現を短時間で解析することができる。

(3) プライマー又はプロ.ープ ...·.. · ." ·' ' . .'

本固形癍該断甩キットは、表 1に示す固形癌抗原ポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの全部若しくは一部の配列又はその相補配列を含むプライマー又はプローブを含むものであってもよい。該プライマー又はプローブは、被験者由来のサンプル中に発現している抗原ポリぺプチドの mRNA又は mRNAから合成した c DNAと特異的に結合して、サンプル中の抗原ポリぺプチドをコ一ドする遺伝子の発現、すなわち抗原ポリぺプチドの発現を検出することが可能である。プライマー及ぴプロープは、当業者に公知の手法に従って、抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1

5、 1 7、 1 9、 2 1、 23、 25、 27、 29、 3 1、 33、 35、 3 7、 3

9、 41、 43、 45、 46、 47、 49、 5 1、 5 3、 55、 5 7、 5 8、 6 0、 62、 64、 6 6、 68、 70、 72及ぴ 74の各塩基配列に基づき設計することができる。プライマー及ぴプローブ設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。

プライマーとして実質的な機能を有する長さとしては、 1 0塩基以上が好ましく、さらに好ましくは 1 6〜 50塩基であり、さらに好ましくは 20〜 30塩基である。またプローブとして実質的な機能を有する長さとしては、 1 0塩基以上が好ましく、さらに好ましくは 1 6〜50塩基であり、さらに好ましくは 20〜

30塩基である。

また設計の際には、プライマー又はプローブの融解温度（Tm) を確認することが好ましい。 Tmとは、任意のポリヌクレオチド鎖の 5 0%がその相補鎖とハイブリツドを形成する温度を意味し、铸型 DNA又は RNAとプライマー又はプロープとが二本鎖を形成してァニーリング又はハイプリダイズするためには、ァニーリング又はハイプリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しょうとするプライマー又はプローブの Tmは、増幅反応又はハイブリダィゼーシヨンを行う上で重要な因子である。 Tmの確認には、公知のプライマー又はプローブ設計用ソフトウェアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウェアとしては、例えば O 1 i g o TM [National

Bioscience Inc. (米国）製]、 GENETYX [ソフトウェア開発（株）（日本）製] 等が挙げられる。また Tmの確認は、ソフトウェアを使わず、自ら計算することによつても行うこ.とができる。その場合にほ、最近接塩基対法（Nearest Neighbor Method) , W a 1 1 a n c e法、 G C %法等に基づく計算式を利用することができる。本発明では、.■ 平均 T mが約 4 5〜5 5 °Cであることが好ましい。プライマー又はプローブとして特異的なアニーリング又はハイプリダイズが可能な条件としては、その他にも G C含量などがあり、そのような条件は当業者に周知である。

上逑のように設計したプライマー及びプローブは、当業者に公知の方法に従つて調製することができる。さらに、当業者には周知のように、プライマー又はプロープには、アニーリング又はハイブリダィズする部分以外の配列、例えばタグ配列などの付加配列が含まれていてもよく、上述したプライマ.一又はプローブにそのような付加配列が付加されたものも本発明の範囲内に含まれるものとする。' 被験者由来のサンプルにおける固形癌抗原ポリべプチドの発現を検出するためには、上記プライマー及び/又はプローブをそれぞれ増幅反応又はハイプリダイゼーシヨン反応において用い、その増幅産物又はハイブリッド産物を検出する。サンプルとしては、便や血液、血液細胞（単核球等）を対象とすることができる。また増幅反応又はハイプリダイゼーシヨン反応を行う場合には、通常は、被験者由来のサンプルから被検核酸を調製する。被検核酸は、.核酸であれば D N A 又は R N Aのいずれでもよレ、。 D N A又は R N.Aは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、 D N Aを抽出する場合には、フエノール.抽出及ぴエタノール沈殿を行う ^法、ガラスビーズを用いる方法など、また R N Aを抽出する場合には、グァ-ジン一塩化セシウム超遠心法、ホットフエノール法、又はチォシアン酸グアジ-ゥムーフエノールーク口口ホルム (A.G P C ) 法などを利用することができる。以上のように調製したサンプル又は被検核 · 酸を用いて、以下に示す増幅反応及ぴ Z又はハイブリダィゼーション反応を行う。プライマーを用いて被検核酸を铸型とした増幅反応を行い、その特異的増幅反応を検出することにより、サンプル中の固形癌抗原ポリべプチドの発現の検出を行うことができる。 . · 増幅手法としては、特に限定されいが、ポリメラーゼ連鎖反応（P C R ) 法の原理を利した公知の方法を挙げることができる。 .例えば、 P C R法、 L AM P (Loop-mediated isothermal AMPlif ication) 法、 I CAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法、 RCA (Rolling Circle Amplification) 法、 L C R (Ligase Chain Reaction) 法、 S D A (Strand Displacement Amplification) 法等を挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。

例えば、 PCR法は、被検核酸である DNAを鏺型として、 DNAポリメラーゼにより、一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。 PCR法によれば、変性、アニーリング及ぴ合成からなるサイクルを繰り返すことによって、増幅断片を指数関数的に増幅させることができる。 PCRの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。

また RT— PCR法では、まず、被検核酸である RN Aを錄型として、逆転写酵素反応により c DNAを作製し、その後、作製した c DNAを鑤型として一対のプライマーを用いて P CR法を行うものである。

なお、増幅手法として競合 PC R法ゃリアルタイム P CR法等の定量的 PC R 法などを採用することにより、定量的な検出が可能となる。

上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、ァガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。

あるいは、増幅反応の過程で取り込まれる dNTPに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、 ³²P、 ¹²⁵ I、 ³⁵Sなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（F I TC)、スルホローダミン（S R)、テトラメチルローダミン（TR I TC) などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。

これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。標識した d N T Pを取り込んだ増幅産物を臀察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、 γ —カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。

以上のようにじて特異的な增幅反応が検出された場合には、サンプル中に固形癌抗原ポリぺプチドをコードする遺伝子が発現している、すなわち固形癌抗原ポリぺプチドが発現していることとなる。従って、サンプル中に抗原ポリぺプチドが発現している被験者を固形癌患者又はハイリスク者と診断する。 .

.·また、プローブを用いてサンプル又は被検核酸に対するハイブリダィゼーション反応を行い、その特異的結合（ハイブリッド）を検出することにより、固形癌抗原ポリべプチドの発現を検出することもできる。

ハイブリダィゼーション反応は、プローブが固形癌抗原ポリペプチドに由来するポリヌクレオチドのみと特異的に結合するような条件、すなわちストリンジ工ントな条件下で行う必要がある。そのようなストリンジェントな条件は当技術分野で周知であり、特に限定されない。ストリンジェントな条件としては、例えばナトリゥム濃度が、 1 0〜 3 0 0 mM、好ましくは 2 0〜 L O O mMであり、温度が 2. 5〜7 0 °C、好ましくは 4 2〜 5 5 °Cにおける条件が挙げられる。

ハイ.'ブリ'ダイ.ゼーション行う場合には、プローブに蛍光標鹎（フルォレセィン、ローダミンなど）、放射性標識（³² Pなど）、酵素標識（アルカリホスファターゼ、西洋ヮサビパーォキシダーゼ等）、ビォチン標識等の適当な標識を付加することができる。従って、本固形癌診断用キットには、上記のような標識を付加レたプローブも含まれる。

標識化プローブを用いた検出は、サンプル又はそれから調製した被検核酸とプロープとをハイプリダイズ可能なように接触させることを含む。「ハイプリダイズ可能なように」とは、上述したストリンジェントな条件下にて特異的な結合が起こる環境（温度、塩濃度）において.、.： .という' ίとである。.具体的には、サンプル又は被検核鹼をスライドグラス、. メンプラン、マイクロタイタープレート等の適当な固相に固定化し、標識を付加したプローブを添加することにより、プローブとサンプル又は被検核酸とを接触させてハイブリダィゼーション反応を行い、ハイブリダイズしなかったプローブを除去した後、サンプル又は被検核酸とハイブリダィズしているプローブの標識を検出する。標識が検出された場合には、サンプル中に固形癌抗原ホ°リペプチドが発現していることとなる。従って、サンプル中に抗原ポリべプチドが発現している被験者を固形癌患者又はハイリスク者と診断する。

また、標識の濃度を指標とすることにより、定量的な検出も可能となる。標識化プローブを用いた検出方法の例としては、 'サザンハイプリダイゼーシヨン法、ノ一ザンノ、ィブリダイゼーション法、 F I S H (蛍光 i n s i t uハイプリダイゼーシヨン）法等を挙げることができる。

また、本固形癌診断キットを用いて診断を行う場合には、被験者に由来するサンプル中の固形癌抗原ポリぺプチドの発現量を測定し、 1種以上の固形癌抗原ポリぺプチドの発現が健常者のそれらと比較して多い被験者を固形癌患者又はそのハイリスク者と判定する。具体的な判定基準としては、被験者の固形癌抗原ポリペプチド発現量が健常者のそれと比較して、 1 0 %以上、好ましくは 3 0 %以上、さらに好ましくは 7 0 %以上、最も好ましくは 1 0 0 %以上である場合である。

3 . 固形癌の予防又は治療用医薬

3 . 1 . 固形癌抗原ポリぺプチドの機能又は発現抑制

固形癌抗原ポリぺプチドは、固形癌において特異的に発現するものであるため、その発現が細胞の癌化の原因となっている可能性が高い。そのため、固形癌抗原ポリぺプチドの機能又は発現を抑制すれば、細胞の癌化やその進行に対する治療効果が期待される。

従って、上記の 1種以上のヒト固形癌抗原ポリペプチドの機能及び発現を抑制するための手段は、固形癌の予防及びノ又は治療用医薬として有効である。

かかるヒト固形癌抗原ポリぺプチドの機能又は発現を抑制するための手段としては、

( 1 ) 固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体 (2) 固形癌抗原ポリべプチ 'ド:をコードする遺伝子の転写を抑制可能な手段

(3) 固形癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳を抑制可能な手段が挙げられる。 ' (1) 固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体

固形癌抗原ポリぺプチドに対する抗体は、被験者における '固形癌抗原ポリぺプチドと特異的に結合することにより、該抗原ポリぺプチドの活性を抑制することができる。従って、固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体を含む医薬は、固形癌の治療又は予防に有効である。

(2) 固形癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の転写を抑制可能な手段 · ' 固形癌抗原ポリべプチドをコ一ドする遺伝子の転写を抑制する手段としては、対象となる被験者における当該遺伝子の転写プ口モータ一領域を転写抑制型プロモーターと置換するために用いることが可能な発現ベクターが挙げられる。また、固形癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の転写を抑制する手段としては、当該遺伝子の転写に関わる領域に転写抑制活性のある塩基配列を揷入するための発現べクタを用いてもよい。上記のような発現ベクターの設計及び調製は当業者には周知である。'' , (3) 固形癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳を抑制可能な手段 . また、固形癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳を抑制する手段としては、いわゆるアンチセンス RN Aを用いる方法が挙げられる。すなわち、当該遺伝子の mRNAに対するアンチセンス RNAを転写する遺伝子を、プラスミド. として導入するか又は被験者のゲノムに組み込み、当該アンチセンス RN Aを過剰発現させることで、固形癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の mRN Aの翻訳が抑制される。アンチセンス RN Aに関する技術は、例えば哺乳動物を宿主とした場合でも知られている（Han et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.USA,

88， 4313 - 4317; Hackett et- al. (2000) .Plant' Physiol: 1.24, 1079—86)。 ..

ま 'た、''固形 ^:癌抗原ポリぺプチドをコ一ドする遺伝子.の翻訳を抑制するために、 RNA干渉（RNA i n t e r f e r e n c e) を利用することも可能である。具体的には、標的とする固形癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列に相補的な二本鎖 RNAを細胞内に導入すると、固形癌抗原ポリべプチドをコ一ドする内在性遺伝子の mRNAが分解されて、結果としてその細胞での遺伝子発現が特異的に抑制されることとなる。この手法は、哺乳動物細胞などにおいても確認されている (Hannon, GJ. , Nature (2002) 418, 244-251 (review) ；特表 20 02- 5 1 6062号公報；特表平 8— 506734号公報）。

3. 2. 固形癌に対するターゲティング

固形癌抗原ポリぺプチドは、固形癌において特異的に発現するものであるため、この特異的発現を利用して固形癌にターゲティングする手段を用いることによつて、固形癌治療薬を癌部位で有効に作用させることが可能となる。

従って、上記の固形癌にターゲティングする手段もまた、固形癌の予防及び/ 又は治療用医薬として有効であり、本発明に係る固形癌の予防又は治療用医薬は、固形癌予防薬又は固形癌治療薬をコードする遺伝子とヒト固形癌にターゲティングする手段とを含むものである。

かかるヒト固形癌にターゲティングする手段としては、

(1) 固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体

( 2 ) 固形癌抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現制御領域の塩基配列

が挙げられる。

(1) 固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体

固形癌抗原ポリぺプチドに対する抗体は、癌細胞で特異的に発現する抗原ポリペプチドに結合するため、この抗体に公知の固形癌治療薬（例えば抗癌剤や免疫増強剤）を結合させて患者体内に投与することによって、固形癌治療薬を癌細胞特異的に作用させることができる。

(2) 固形癌抗原ポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの発現制御領域の塩基配列

固形癌抗原ポリぺプチドをコ一ド.するポリヌクレオチドの発現制御領域（以下、「プロモーター配列」と記載する）は、固形癌細胞で特異的に発現する遺伝子の発現制御領域であるため、このプロモーター配列に固形癌治療薬をコードするポリヌクレオチドを連結して治療用遺伝子を作製し、これを体内に投与すれば、治療用遺伝子を癌細胞特異的に発現させることが可能となる。'抗癌作用を有する物質又は抗癌作用を有する物質の前駆物質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば ρ 5 3、単純へルぺスウイノレスチミジンキナーゼ、ィンターロイキン一 2、一 1 2.、一 1 7、一 1 8、シトシンデァミナーゼ、ゥラシルホスホリボシルトランスフエラーゼ等をコードする遺伝子 D N Aやその c D N A等を利用することができる。また、 'このプロモーター配列は、アデノウイルスやへルぺスウィルを' 癌細胞特異的に増殖させて癌細胞を融解させる治療法に使用することもできる。すなわち、例えばアデノウイルスの E 1 A領域の前にプロモーター配列を挿入することによって、このアデノウイルスは癌細胞においてのみ特異的に増殖し、癌. 細胞を融解させる。

3 . 3 . ·医薬の適用対象及ぴ投与

本発明の医薬め適用対象となる固形癌は、大腸癌、食道癌、胃癌、肺癌、腎癌、甲状腺癌、耳下腺癌、頭頸部癌、骨，軟部肉腫、尿管'癌、膀胱癌、.子宮癌、肝癌、乳癌、 .'卵巣癌.、 .卵管癌等が挙げられ、特に限定はされないが、大腸'癌、食道癌、 . 胃癌及ぴ乳癌である。 · '

本発明の医薬は、上記固形癌の発症を予防することを目的として、あるいは上記固形癌患者又.は固形癌のリスクが高いと診断された患者に対しては症状の悪化の防止又は症状の軽減などを目的として投与することができる。

上記の手段を固形癌の治療及び Z又は予防のための医薬として用いる場合には、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。このときの有効成分の担体に対する割合は、 1〜 9 0 %の間で適宜調整すればよい。本発明の医薬の投与形態としては.、通常の静、動脈内等の全身投与のほか、癌原病巣にして又は癌腫に対応した予想転移部位に対して局所注射の局所投与を行うことが好ましい。

本発明医薬の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤形によつて異なり、これらは当業者又は医師が適宜調整すればよい。以下、実施例を用いて本方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例 1〕二次元電気泳動による大腸癌抗原ポリぺプチドの同定

[ 1 ] 材料と方法

患者（6例）の了解のもと、大腸癌摘出直後の癌部及ぴ非癌部組織のそれぞれから凍結標本を採取し、一 8 0°Cに保存した。この凍結標本の適量を 9. 5M U r e a、 2 % CHAP S、 1 % DTT、プロテアーゼインヒビターコンプリ一ト（ロッシュ）溶液中でホモジニナィズした後、超高速遠心器（日立）で 1 0 0, 0 0 0 gにて遠心し、上清（タンパク質溶液）を抽出し、吸光度によりタンパク質濃度を同定した。

癌部及び非癌部組織から得られたタンパク質それぞれ 4 0 0 μ gを一次元目はァガロース等電点電気泳動で、二次元目は 1 2%又は 6〜 1 0 %T r i s /G 1 y c i n e S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。分離されたタンパク質をクーマシーブリリアントブルー R 2 5 0で染色し、非癌部組織に比較して癌部組織で発現量が増大しているスポットを検出した。このスポットからゲルを切り出し、ゲル中に含まれているタンパク質をトリプシン（ロッシュ）により消化し、得られたペプチドを回収し、イオントラップ型質量分析器（サーモクェスト社 LCQ DECA XP) によりアミノ酸配列を決定した。

[2] 結果

結果を図 1 A及ぴ Bに示す。 6例の大腸癌患者の癌組織（tumor)及び正常組織

(Normal) を比較したところ、 6例中 4例以上の癌組織において、配列番号 2、

4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 2 0、 2 2、 2 4、 2 6、 2 8、

3 0、 3 2、 3 4、 3 6、 3 8及ぴ 4 0に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の特異的発現が確認された。図 1 A及び B中、丸で囲んだタンパク質を示している番号は、表 1の 1〜 20の各抗原ポリぺプチドに対応する。

これらのタンパク質をコドする塩基配列は、それぞれ配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 23、 25、 2 7、 29、 3 1、 33、 35、 3 7及ぴ 3 9に示され、それぞれの遺伝子は表 1に示したとおりでめ

〔実施例 2〕 S E R E X法による固形癌抗原ポリぺプチドの特定

[1] c DNAライブラリーの作製

ヒト食道癌由来の細胞株 T. Tnを、カナマイシン（1 00 / g/m l ) を添加した 1 0 %のゥシ胎児血清を含む D M E M培地で培養した。これらの培養細胞からグァニジゥム一チオシァネート―フエノ一ル―グ口口ホルム抽出法により 'ト

—タル RNA ( 2 5 0 μ g ) を単離し、 o 1 i g o— d T (Oligotex - dT30 super, TAKARA社）を用いたポリ（A) セレクションを 2回行い、 mRNAを精製した。この得られた mRNA (5. 7-μ g) を用いて各細胞の c D N Aライブラリーを構築した。一本鎖 c DN Aは、 Xh o I リンカープライマーと 5—メチル d.CTPを用いて合成した。この一本鎖 c DNAから T4 DNAポリメラーゼにより平滑末端を有する二本鎖 c DNAを合成し、この二本鎖 c DNAの両端に制限酵素サイト（£ c o R I /λ Z A'P I I ) を含むリンカ一を付加した。 c DN Aフラグメントをバタテリオファージ（Stratagene社）に挿入し、それぞれの癌細胞について、.約 1. 8 X 1 0⁶個のクローンからなる c DN Aライブラリ—を作製した。 ·

[2] c DNA.ライブラリーのスクリーニング

上記で作製した各癌細胞の c DNAライブラリ一の各ファージベクターを大腸菌 X L 1— B 1 u eに感染させ、 N Z Yァガロースプレート上でプラーグを形成させた。各感染大腸菌に対して、 1 OmMの I PTG処理により発現誘導し、各 c DNAがコードするぺプチドを発現させた。このぺプチドをニトロセノレロース . 膜 ·（N i t r o B i n d ： Osmonic .:社）.に転. 'レ、 T.B S [ 0. 5 %の T w e e . n 20を'含む TB S ( 1 0 mM.の T r i s-— H.'C 1、 1 5.0. mMの N a C 1 ; p

.. · —— .· -27- H7. 5)] で膜を洗浄して吸着したバタテリオファージを除去した後、 1%のァプミンを含む TB S-Tw e e nにて非特異反応を抑制した。このフィルターを食道癌、胃癌、大腸癌及ぴ乳癌患者血清と室温でそれぞれ 2時間反応させた。血清は、患者から単離した後、一 80°Cで保存し、使用直前に 1重量％のアルブミンを含む TB S—Tw e e n (0. 5 %のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ一トを含む TB S— Tw e e n) 溶液で 500倍に最終的に希釈したものを用いた。この希釈した血清を、大腸菌のライセートと 1： 5の割合で混合し、 4°Cで 8時間放置後、 1 5, 000回転にて 20分間遠心し、上清を回収したものを用いた。また、必要に応じて無処理の血清を 2000倍に希釈して用いた。血清と、上記の発現ペプチドをブロットしたニトロセルロース膜とを室温で 1 0〜20時間反応させて血清中の抗体が反応したポリペプチドを特定した。すなわち、二次抗体として 5000倍に希釈したアル力リフォスファターゼ標識抗ヒト I g G— F (a b ') ₂ャギ抗体（Jachson社）を用いて反応させ、ニトロブルーテトラゾリゥム（Wako社）と 5—プロモー 4一クロロー 3—ィンドリノレホスフート（Wako社）を用いた酵素発色反応により標識シグナルを検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをァガロースプレート上から採取し、 S M緩衝液（ 1 0 OmMの N a C 1、 1 OmMのMg S〇₄、 5 OmMの T r i s -HC 1 ； p H7. 5) に溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、 5名の患者の血清中の I g Gと反応するファージクローンをスクリーニングして、陽性クローンを単離した。

[3] 新規抗原の特定

得られた陽性クローンから、 P CR法によりインサート DNAを複製し、得られた産物を、 Big Dye DNA Sequencing Kit (ABI社）と ABI Prism (Perkin Elmer 社）とを用いて配列決定した。既存データベースを用いて検索した結果、既知の癌関連遺伝子の発現産物である抗原ポリペプチドを除き、さらに複数の患者の血清中抗体と反応する 1 9種の新規抗原ポリペプチドを特定した。この新規抗原ポリぺプチドの抗体陽性率を表 2に示す。表 2

これら 1 9種の新規抗原ポリペプチドのアミノ酸をコードするポリヌクレオチド ( c DNA) 配列は、それぞれ配列番号 41、 43、 45、 46、 47、 49、 5 1、 53、 5 5、 5 7、 58、 60、 6 2、 64、 66、 6 8、 70、 7 2及ぴ 74に示される各塩基配列を有している。また、配列番号 4 1、 43、 4.7、 49、 5 1、 5 3、 5 5、 58、 60、 6 2、 64、 66、 6 8、 70、 72及ぴ 74に示される各塩基配列は、それぞれ配列番号 4.2、 44、 48、 50、 5 2、..54、. 5,· 6、· 5 9、 6 1、 6 3、' 65.、 · 6.7、 6ノ 9、 71、 73及ぴ 75のアミノ酸配列を有している。

図 2〜2 0は、これら 1 9種の新規抗原ポリぺプチドと各患者血清中の抗体との結合反応を調べたウェスタンプロット分析の結果である。この図 2〜2 0において、矢印は患者血清中の抗体と特異的に反応したポリペプチドを示す。 I P T G処理した大腸菌抽出液において検出され、無処理の大腸菌抽出液には検出されないことから導入した c D N A由来のポリぺプチドであると確認できる。本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。産業上の利用可能性

本発明に係る固形癌診断キットにより、固形癌を高精度で診断することができ、固形癌の早期診断に有用である。また、本発明に係る固形癌の予防用医薬又は治療用医薬により、固形癌のみを標的とする治療を行うことが可能となる。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 20、 22、 2 4、 26、 28、 3 0、 32、 34、 3 6、 38、 40、 42、 44、 48、 50、 52、 54、 56、 5 9、 61、 63、 6 5、 67、 69、 71、 73 及ぴ 75からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するヒト固形癌抗原ポリペプチド。

2. 請求項 1に記載のヒト固形癌抗原ポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、。 - 3. 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 23、 . 25、 2 7、 29、 3 1、 3 3、. 35、 3 7、 39、 41、 43、 45、 46 ' 47、 49、 5 1、 53、 5 5、 5 7、 58、 60、 62、 64、 6 6、 68、 70、 72及び 74からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチド。 ·

4. 被験者に由来するサンプル中の 1種以上のヒト固形癌抗原ポリペプチドの発現を検出するための手段を含む固形癌診断キットにおいて、該ヒト固形癌抗原ポリペプチドが配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、. 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 2 0、 22、 24、 26、 28、 30、 3 2、 34、 3 6、 38、 40、 42、

44、 48、 50、 52、 54、 56、 5 9、 6 1、 63、 6 5、 6 7、 69、 71.、' 73及ぴ 75からなる群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする固形癌診断キット。 - 5. 被験者に由来するサンプル中の 1種以上のヒト固形癌抗原ポリペプチドの発現を検出するための手段を含む固形癌診断キットにおいて、該ヒト固形癌抗原ポリぺプチドが配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 23、 25、 2 7、 29、 3 1、 3 3、 3 5、 3 7、 3 9、 4 1、 43、

45、 46、 47、 49、 5 1、 53、 5 5、 5 7、 58、 6 0、 6 2、 64、

.66、 68、 70、 72及ぴ 74からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードざれること l特徴'とする固形癌診断キッ.ト。 ." ヒ 'ト'阖形癌抗原ポリペプチドの発現を検出するための手段が該固形癌抗原ポリぺプチド又はその部分べプチドである、請求項 4又は 5記載の固形癌診断キッ卜。

7. ヒト固形癌抗原ポリペプチドの発現を検出するための手段が該固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体である、請求項 4又は 5記載の固形癌診断キット。 8. ヒト固形癌抗^ポリペプチドの発現を検出するための手段が、該固形癌抗原ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドの全部若しくは一部の配列又はその相捕配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマー又はプローブである、請求項 4又は 5記載の固形癌診断キット。

9. ヒト固形癌抗原ポリペプチドの発現を検出するための手段が固相上に固定化されている、請求項 4〜 8のいずれか 1項に記載の固形癌診断キット。

1 0. ヒト固形癌抗原ポリペプチドの発現を検出するための手段が標識されている、.請求項 4〜 9のいずれか 1項に記載の固形癌診断キット。

1 1. 固形癌が、大腸癌、食道癌、胃癌及ぴ乳癌からなる群より選択されるものである、請求項 4〜1 0のいずれか 1項に記載の固形癌診断キット。

1 2. サンプルが、血清、血液、血液細胞及ぴ組織からなる群より選択されるものである、請求項 4〜1 1のいずれか 1項に記載の固形癌診断キット。

1 3. 1種以上のヒト固形癌抗原ポリペプチドの機能又は発現を抑制するための手段を含む固形癌の予防又は治療用医薬において、該ヒト固形癌抗原ポリぺプチドが配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 3 6、 3 8、 40、 42、 44、 48、 5 0、 5 2、 54、 56、 5 9、 61、 63、 6 5、 6 7、 6 9、 71、 73 及ぴ 7 5からなる群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする固形癌の予防又は治療用医薬。

14. 1種以上のヒト固形癌抗原ポリペプチドの機能又は発現を抑制するための手段を含む固形癌の予防又は治療用医薬において、該ヒト固形癌抗原ポリぺプチドが配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、

23、 2 5、 2 7、 29、 3 1、 33、 3 5、 3 7、 3 9、 4 1、 43、 45、

46、 4 7、 49、 5 1、 5 3、 5 5、 5 7、 5 8、 60、 62、 64、 66、

68、 70、 7 2及び 74からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードきれることを特徴とする固形癌の予防又は治療用医

1 5 . ヒ固形癌抗原ポリペプチドの機能又は発現を抑制するための手段が該固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体である、請求項 1 3又は 1 4記載の医薬。 5 1 6 . ヒト固形癌抗凉ポリペプチドの機能又は発現を抑制するための手段が該固形癌抗原ポリべプチドをコ一ドする遺伝子の転写を抑制可能な手段である、請求項 1 3又は 1 4記載の医薬。

1 7 . ヒト固形癌抗原ポリペプチドの機能又は発現を抑制するための手段が該固形癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳を抑制可能な手段である、請 10 求項 1 3又は.1 4記載の医薬。

' 1 8 . 固形癌予防薬又は固形癌治療薬をコードする遺伝子とヒト固形癌にターゲティングする手段とを含む、固形瘁の予防又は治療用医薬。

1 9 . ヒト固形癌にターゲティングする手段が固形癌抗原ポリペプチドに対する抗体である、請求項 1 8記載の医薬。'

15 2 0 . ヒト固形癌にターゲティングする手段が固形癌抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現制御領域の塩基配列である、請求項 1 8記載の医薬。