立体規則性の高いリボヌクレオチド類縁体及びデォキシリボヌクレオチド類縁 体の製造法 技術分野 Method for producing ribonucleotide analogs and deoxyribonucleotide analogs with high stereoregularity
本発明は、 立体規則性の高いリボヌクレオチド類縁体及びォリゴデォキシリ ボヌクレオチド類縁体の製造法に関するものである。 背景技術 The present invention relates to a method for producing a ribonucleotide analog having high stereoregularity and an oligodoxyribonucleotide analog. Background art
リン酸部位修飾ジヌクレオチドは、 近年、 重要なアンチセンス薬 (アンチセ ンス法) として注目されており、 更 I.こ多くの病気についても臨床試験が行われ ている。 アンチセンス法とは、 標的となる mRNAと相補的な塩基配列をもつ核 酸を用いて、 mRNAと選択的に結合させ、 タンパク質の翻訳を阻害する手法であ る。 アンチセンス分子として必要な性質として、 主に、 (1)標的となる mRNAの 塩基配列を認識し、 特異的に結合できること、 (2)安定な二重鎖を形成できる こと、 (3)ヌクレア一ゼ耐性が高いこと、 (4)細胞膜透過性が高いことなどが挙 げられる。 Phosphate-site modified dinucleotides have recently attracted attention as an important antisense drug (antisense method), and I. Clinical trials are also being conducted on many diseases. The antisense method is a method in which a nucleic acid having a nucleotide sequence complementary to a target mRNA is selectively bound to the mRNA to inhibit protein translation. The properties required as an antisense molecule include (1) the ability to recognize and specifically bind to the base sequence of the target mRNA, (2) the ability to form a stable duplex, and (3) the nuclease. (4) high cell membrane permeability.
リン酸部位修飾ジヌクレオチドは、 リン原子上に不斉中心を有しており、 そ の絶対立体配置の相違によりアンチセンス効果が異なる。 また、 近年の i n v i tro研究では、 リン酸部位修飾ジヌクレオチドの性質として、 例えば DNA、 RNAとの二重鎖形成能ゃヌクレアーゼ耐性、 R N ase H活性などはリン原子上の キラリティ一に影響されることが報告されており (Med. Chem. Lett. Phosphate moiety-modified dinucleotides have an asymmetric center on the phosphorus atom and differ in their antisense effects due to differences in their absolute configuration. In recent studies in vitro, the properties of phosphate-modified dinucleotides, such as their ability to form duplexes with DNA and RNA, nuclease resistance, and RNase H activity, are affected by chirality on the phosphorus atom. (Med. Chem. Lett.
2000, 8, 275-284) 、 リン原子上の立体を制御したリン酸部位修飾ォリゴヌクレ ォチドの効率的な製造法が求められている。 2000, 8, 275-284), there is a need for an efficient method for producing phosphate-modified oligonucleotides with controlled stereochemistry on the phosphorus atom.
し力、し、 従来、 リン酸部位修飾ジヌクレオチドは、 ホスホロアミダイ ト法等 により製造されており (Beaucage, Conventionally, phosphate site-modified dinucleotides have been produced by the phosphoramidite method or the like (Beaucage,
S丄.; I yer, R. P. Tetrahedron, 1992, 48, 2223- 2311 ) 、 これらの製造法では、 リ
ン原子上の立体制御を行うことは困難であったため、 製造されたリン酸部位修 飾オリゴヌクレオチドは、 R体と S体のジァステレオマーの混合物であった。 また、 アンチセンス分子として天然型 DNAを用いた場合、 ヌクレアーゼによ リ加水分解されやすく、 また細胞膜透過性が低いというアンチセンス分子とし ては致命的な問題がある。 そこで、 天然型 DMA に種々の修飾を施すことにより、 これらの問題を克服する試みが行われてきた。 その中で、 天然型 DMAのインタ ーヌクレオチドの、 リン原子上の 2つの非架橋酸素原子を様々に置換した DNA 類縁体、 即ちインタ一ヌクレオチド修飾型類縁体は、 ヌクレアーゼ耐性、 及び 細胞膜透過性がともに高まることが知られている (Lev i n, A. A. B i ochem. S 丄.; Iyer, RP Tetrahedron, 1992, 48, 2223- 2311). Since it was difficult to control the stereochemistry on the thiol atom, the produced phosphate-modified oligonucleotide was a mixture of R and S diastereomers. In addition, when natural type DNA is used as an antisense molecule, it is easily hydrolyzed by nucleases and has a fatal problem as an antisense molecule having low cell membrane permeability. Attempts have been made to overcome these problems by making various modifications to the native DMA. Among them, DNA analogs in which two non-bridging oxygen atoms on the phosphorus atom of natural DMA internucleotides are variously substituted, that is, inter-nucleotide modified analogs, have both nuclease resistance and cell membrane permeability. It is known to increase (Lev in, AA B i ochem.
B i ophys. Acta. , 1 999, 1489 (1 ) , 69-84. ) 。 Biophys. Acta., 1 999, 1489 (1), 69-84.).
しかしながら、 導入された置換基がそれぞれ異なる場合、 その DNA類縁体は リン原子上にキラリティを有することになる。 これらの DNA類縁休はそのキラ リティにより、 物性や機能が異なることが知られている (Yu, D.; Kanduma l l a, E. R.; Rosky, A.; Zhao, Q.; Chen, J.; Agrawa l , S. B i oorg. Med. Ghem. , 2000, 8, 275-284. ) 。 例えば、 2つの非架橋酸素原子のうち 1つを硫黄原子 に置換したインターヌクレオチド修飾型 DNA類縁体であるホスホロチォエート DNAは、 それと相補的な RNAと形成する二重鎖の構造、 ヌクレア一ゼ加水分解 に対する耐性などが Sp体のォリゴマーと Rp体のォリゴマ一との間で異なるこ とが知られている (前記文献参照) 。 このことから、 薬としても効能を高める うえで、 リン原子の立体を制御したィンタ一ヌクレオチド修飾型 DNA類縁体を 得ることは極めて重要である。 However, if the introduced substituents are different, the DNA analog will have chirality on the phosphorus atom. It is known that the properties and functions of these DNA relatives differ depending on the chirality (Yu, D .; Kanduma lla, ER; Rosky, A .; Zhao, Q .; Chen, J .; Agrawal , S. Bioorg. Med. Ghem., 2000, 8, 275-284.)). For example, phosphorothioate DNA, an internucleotide-modified DNA analog in which one of two non-bridging oxygen atoms has been replaced with a sulfur atom, has a double-stranded structure that forms with complementary RNA, a nuclease. It is known that the resistance to ze hydrolysis differs between the Sp-oligomers and the Rp-oligomers (see the above literature). For this reason, it is extremely important to obtain an internucleotide-modified DNA analog with a controlled steric phosphorus atom in order to enhance its efficacy as a drug.
H-ホスホネ一卜 DNAは、 天然型 DNAのィンタ一ヌクレオチドのリン原子上の 2つの非架橋酸素原子のうち、 1つの酸素原子を水素原子に置換した DNA類縁 体であり、 リン原子上にキラリティを有する。 また、 立体特異的な変換反応に より、 種々のインタ一ヌクレオチド修飾型 DMA類縁体へと変換可能である。 よ つて、 立体化学的に純粋な H-ホスホネート DNAが得られれば、 それを用いてそ のまま立体が制御されたィンターヌクレオチド修飾型 DMA類縁体を得ることが 可能となる。 このように、 H-ホスホネー卜 DNAは、 様々な立体の制御されたィ
ンタ一ヌクレオチド修飾型 DNA類縁体へと変換可能な有用な合成中間体である。 現在までのところ、 立体化学的に純粋な H -ホスホネ一ト DMAを得る方法は、 そのジァステレオマ一をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一によリ光学分割 する方法以外にない。 したがって、 立体化学的に純粋な H-ホスホネート DMAは、 二量体レベルで得た例の報告があるのみである ((a) See la, F.; Kretschner, U. J. Org. Chem. 1991, 56, 3861-3869. (b) Loshmer, T.; Engels, J. W. Nucleic Acids Res. 1990, 18, 5143) 。 しかも、 H -ホスホネート DNAの二量 体を光学分割する場合であっても、 H-ホスホネ一ト DNAはシリカゲルカラムク ロマトグラフィ一上で不安定であり、 かつその 2つのジァステレオマー間に極 性の大きな違いはないため、 その光学分割は極めて非効率的なものである。 立 体化学的に純粋な H-ホスホネ一ト DNAを核酸医薬への応用が可能な合成中間体 として考えた場合、 オリゴマーレベルで立体の制御された H-ホスホネ一ト DNA が必要となる。 その場合、 ジァステレオマーの数は指数関数的に増大するため、 H-ホスホネ一ト DMAオリゴマーの光学分割は事実上不可能なものとなる。 そこ で、 H-ホスホネート DMAの立体選択的合成反応を開発できれば、 オリゴマーレ ベルで立体の制御された H -ホスホネート DMAを得ることが可能となる。 H-phosphonate DNA is a DNA analog in which one of the two non-bridging oxygen atoms on the phosphorus atom of the internucleotide of natural DNA is replaced with a hydrogen atom. Having. In addition, it can be converted into various inter-nucleotide-modified DMA analogs by a stereospecific conversion reaction. Thus, if stereochemically pure H-phosphonate DNA is obtained, it will be possible to obtain an internucleotide-modified DMA analog whose stereochemistry is controlled as it is, using the DNA as it is. As described above, H-phosphonate DNA has various three-dimensionally controlled proteins. It is a useful synthetic intermediate that can be converted into a single nucleotide modified DNA analog. To date, there has been no other method of obtaining stereochemically pure H-phosphonate DMA except by optically resolving the diastereomer by silica gel column chromatography. Therefore, stereochemically pure H-phosphonate DMA has only been reported at the dimer level ((a) See la, F .; Kretschner, UJ Org. Chem. 1991, 56, 3861-3869. (B) Loshmer, T .; Engels, JW Nucleic Acids Res. 1990, 18, 5143). Moreover, even when the dimer of H-phosphonate DNA is optically resolved, H-phosphonate DNA is unstable on silica gel column chromatography, and there is a polar difference between the two diastereomers. Since there is no significant difference, the optical division is extremely inefficient. Considering stereochemically pure H-phosphonate DNA as a synthetic intermediate that can be applied to nucleic acid medicine, H-phosphonate DNA with a steric control at the oligomer level is required. In that case, the number of diastereomers increases exponentially, making optical resolution of H-phosphonate DMA oligomers virtually impossible. Therefore, if a stereoselective synthesis reaction of H-phosphonate DMA can be developed, it will be possible to obtain H-phosphonate DMA with steric control at the oligomer level.
RNAi は 1998年、 Fireと Mel loらにより線虫を用いた研究で初めて報告され た (Fire, A.; Xu, S.; Montgomery, Μ. Κ.; Kostas, S. A.; Driver, S. E.; Mel lo, C. G. Nature. 1998, 391, 806- 811. )のをきつかけに、 昆虫、 植物、 · 菌類などの様々な生物種間に従来備わった遺伝子抑制システムであることが明 らかにされている。 また、 2001年 Tuschl らによって RNAi は哺乳動物細胞にお いても適用可能であることが示された (Elbashir, S. M.; Harborth, J.; Lendeckel, .; Yale in, A.; Weber, K.; Tuschl, T. Nature. 2001, 411, 494-498. ) 。 これにより、 RNAiは遺伝子抑制効果の高い優れた遺伝子抑制法と して、 遺伝子治療や遺伝子機能解析などを行なうための有力な手段として注目 されるようになった。 RNAiの特徴は、 正確に目的の遺伝子をノックアウトでき る配列特異性と元来生体に備わった遺伝子抑制機構を用いていることである。 このことによって、 RNAi は副作用の少ない新しい遺伝子治療法として期待され
ている。 しかしながら、 s iRNAのような 21塩基程度の RNA鎖は生体内のヌクレ ァーゼによって徐々に分解されてしまうため、 今のところ RNAiの効果は長時 間持続させることができない。 発明の開示 RNAi was first reported in 1998 in a study using nematodes by Fire and Mel lo (Fire, A .; Xu, S .; Montgomery, Μ. Κ .; Kostas, SA; Driver, SE; Mel lo , CG Nature. 1998, 391, 806-811.), It has been revealed that it is a gene silencing system that is conventionally provided among various species such as insects, plants, and fungi. . In 2001, Tuschl et al. Showed that RNAi was applicable to mammalian cells (Elbashir, SM; Harborth, J .; Lendeckel,.; Yale in, A .; Weber, K .; Tuschl, T. Nature. 2001, 411, 494-498.). As a result, RNAi has been attracting attention as a powerful method for gene therapy and gene function analysis, as an excellent gene suppression method with high gene suppression effect. RNAi is characterized by its sequence specificity, which can knock out the target gene accurately, and the use of gene silencing mechanisms inherent in living organisms. This makes RNAi a promising new gene therapy with fewer side effects. ing. However, the effect of RNAi cannot be maintained for a long time at present, because RNA strands of about 21 bases such as siRNA are gradually degraded by nucleases in the living body. Disclosure of the invention
本発明の課題は、 アンチセンス法や RNA干渉に使用することができ、 リン原 子上の立体を制御した、 立体規則性の高いリボヌクレオチド類縁体及びデォキ シリポヌクレオチド類縁体の製造法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for producing a ribonucleotide analog and a deoxysilipnucleotide analog having a high stereoregularity, which can be used for the antisense method or RNA interference and has a controlled stereo structure on a phosphorus atom. Is to do.
本発明は、 課題の解決手段として、 一般式 ( I ) The present invention provides a compound represented by the following general formula (I):
[式中、 R 1及び R ' は、 同一又は異なっていてもよい、 水素原子、 炭素数 1 〜 3のアルキル基又は炭素数 6 ~ 1 4のァリール基を示し、 [Wherein, R 1 and R ′ may be the same or different and represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or an aryl group having 6 to 14 carbon atoms,
R2及び R " は、 同一又は異なっていてもよい、 水素原子、 炭素数 1 〜 3の アルキル基又は炭素数 6 〜 1 4のァリール基を示し、 R 2 and R "may be the same or different and represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or an aryl group having 6 to 14 carbon atoms;
R3は炭素数 1 〜 3のアルキル基を示し、 R 3 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms,
R4は水酸基の保護基、 は一 O R 5 (ここで R5は水酸基の保護基) 、 水酸 基又は水素原子を示し、 R 4 is a hydroxyl-protecting group, is OR 5 (where R 5 is a hydroxyl-protecting group), a hydroxyl group or a hydrogen atom,
B sは、 次式 B s is
ΟΟ
で表されるゥラシル、 アデニン、 シトシン、 グァニン、 チミンあるいはそれら の誘導体から誘導される基を示す。 但し、 R2及び R3は、 窒素原子と共にモノ シクロ構造又はビシクロ構造を形成していてもよい。 ] Represents a group derived from peracyl, adenine, cytosine, guanine, thymine or a derivative thereof represented by. However, R 2 and R 3 may form a monocyclo structure or a bicyclo structure together with the nitrogen atom. ]
で表される光学活性なヌクレオシド 3' —ホスホロアミダイ 卜と、 An optically active nucleoside 3'-phosphoramidite represented by
一般式 (II) General formula (II)
[式中、 Re、 及び B sは前記と同じ意味を示す。 ] [Wherein, R e and B s have the same meaning as described above. ]
で表されるヌクレオシドとを、 And a nucleoside represented by
一般式 (III) General formula (III)
[式中、 X—は B F4—、 P F6—、 T f O— (T f は C F3S 02—を示す。 以下同じ) 、 T f 2N\ A s F6—又は S b F6—を示す。 また、 環状構造 Aは窒素原子と共に形 成する炭素数 3〜 1 6のモノシクロ又はビシクロ構造を示す。 ] [Wherein, X— is BF 4 —, PF 6 —, T f O— (T f is CF 3 S 0 2 —; the same applies hereinafter), T f 2 N \ A s F 6 — or S b F 6 — is indicated. The cyclic structure A represents a monocyclo or bicyclo structure having 3 to 16 carbon atoms formed together with a nitrogen atom. ]
で表される活性化剤を用いて縮合した後、 求電子試薬との反応及び脱保護を行 うことを特徴とする、 式 (IV) 又は (V) で表される立体規則性の高いリボヌ クレオチド類縁体の製造法、 及び立体規則性の高いォリゴリボヌクレオチド類 縁体及びォリゴデォキシリボヌクレオチド類縁体の製造法を提供する。
After condensation with an activator represented by the formula (1), followed by reaction with an electrophile and deprotection, characterized by high stereoregularity represented by the formula (IV) or (V): A method for producing a nucleotide analog, and a method for producing an oligoribonucleotide analog and an oligodoxyribonucleotide analog having high stereoregularity are provided.
[各式中、 Yは炭素数 1〜 1 0の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、 炭素数 1〜 1 0の'直鎖又は分岐鎖のアルコキシ基、 炭素数 1〜 1 0の直鎖又は分岐鎖のヒド ロキシアルキル基、 炭素数 6 ~ 1 4のァリール基、 炭素数 1 ~ 1 0のアルキル チォ基、 炭素数 1〜 1 0のァシル基、 アミノ基、 炭素数 1〜 1 0のアルキルァ ミノ基、 炭素数 1 ~ 1 0のジアルキルアミノ基、 又は Υ=Υ' Ζ+を示す (Υ' は S一、 S e―、 B H 3—を、 Z+はアンモニゥムイオン、 第 1級〜第 4級の低級アルキ ルアンモニゥムイオン又は 1価の金属イオンを示す) 。 B sは、 前記と同じ意 味を示し、 各式中の 2個の B sは、 同一でも異なっていてもよい。 D2及び E2 は水酸基又は水素原子を示す。 ] 発明の詳細な説明 [In each formula, Y is a straight-chain or branched-chain alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, a straight-chain or branched-chain alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms, a straight-chain or branched-chain alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms, Branched hydroxyalkyl group, aryl group having 6 to 14 carbon atoms, alkylthio group having 1 to 10 carbon atoms, acyl group having 1 to 10 carbon atoms, amino group, alkyler having 1 to 10 carbon atoms amino group, a dialkylamino group having 1 to 1 0 carbon atoms, or Upsilon = Upsilon 'shows the Zeta + (Upsilon' is S one, S e-, BH 3 - a, Z + is ammonium Niu-ion, primary, secondary Represents quaternary lower alkyl ammonium ions or monovalent metal ions). B s has the same meaning as described above, and two B s in each formula may be the same or different. D 2 and E 2 represent a hydroxyl group or a hydrogen atom. Detailed description of the invention
以下、 本発明の製造法を、 縮合反応 (第 1反応工程) と、 求電子試薬との反 応及び脱保護反応 (第 2反応工程) に分けて説明する。 第 1及び第 2の分け方 は説明の便宜のためだけのものであり、 これに限定されるものではなく、 また ら
必要に応じて精製処理等の公知の処理工程を付加することもできる。 Hereinafter, the production method of the present invention will be described by dividing into a condensation reaction (first reaction step), a reaction with an electrophile and a deprotection reaction (second reaction step). The first and second divisions are for convenience of explanation only and are not limiting. If necessary, known processing steps such as purification processing can be added.
〔第 1反応工程〕 (First reaction step)
一般式 (I) で表される光学活性なヌクレオシド 3' —ホスホロアミダイ ト 〔以下 「ホスホロアミダイ 卜 (I) 」 という〕 と、 一般式 (II) で表されるヌ クレオシド 〔以下 「ヌクレオシド (II) 」 という〕 とを、 一般式 (III) で表 される活性化剤 〔以下 「活性化剤 (III) 」 という〕 の存在下で縮合反応させ る。 An optically active nucleoside 3'-phosphoramidite represented by the general formula (I) [hereinafter referred to as "phosphoramidite (I)"] and a nucleoside represented by the general formula (II) [hereinafter referred to as "nucleoside (II)"] Is condensed in the presence of an activating agent represented by the general formula (III) [hereinafter referred to as “activating agent (III)”].
ホスホロアミダイト (I) は、 下記のとおり、 適当な 1 , 2—アミノアルコ —ルから公知の方法で製造することができる (例えば Tetrahedron: Asy謹 etry 1995, 6, 1051- 1054参照) 。 The phosphoramidite (I) can be produced from an appropriate 1,2-amino alcohol by a known method as described below (for example, see Tetrahedron: Asy et al. 1995, 6, 1051-1054).
即ち、 一般式 (VI) で表される光学活性な 1 , 2—ァミノアルコール 〔以下 「アミノアルコール (VI) 」 という〕 と、 三塩化リンを反応させて得られる一 般式 (VII) で表される光学活性なホスフイチル化剤 〔以下 「ホスフイチル化 剤 (VII) J という〕 と、 一般式 (VIII) で表されるヌクレオシドを反応させ て得ることができる。 That is, the general formula (VII) obtained by reacting an optically active 1,2-amino alcohol (hereinafter referred to as “amino alcohol (VI)”) represented by the general formula (VI) with phosphorus trichloride is used. It can be obtained by reacting the optically active phosphitylating agent represented by [hereinafter referred to as “phosphitylating agent (VII) J”] with the nucleoside represented by the general formula (VIII).
〔式中、 R1、 R2、 R3、 R D,及び B sは、 一般式 (1 ) と同じ意味を示 す。 〕
ァミノアルコール (VI) としては、 (S) —及ぴ (R) —2—メチルァミノ — 1一フエニルエタノール、 (1 R, 2S) —エフェドリン、 (1 R, 2 S) 一 2—メチルアミノー 1 , 2—ジフ Xニルエタノール等が挙げられる。 [In the formula, R 1 , R 2 , R 3 , RD, and B s have the same meaning as in the general formula (1). ] The amino alcohols (VI) include (S)-and (R) -2-methylamino-1-phenylethanol, (1R, 2S) -ephedrine, (1R, 2S) 1-2-methylamino-1 , 2-diph Xnylethanol and the like.
その他にも、 プロリノール誘導体、 例えば、 (Of R, 2S) — 一(ピロリ ジン一 2—ィル) ベンジルアルコール、 (aS, 2 R)— 一 (ピロリジン一 2—ィル) ベンジルアルコールが挙げられ、 H-ホスホネートに誘導可能なアミ ノアルコール類、 例えば、 ( S) —a, of—ジフエニル (ピロリジン一 2— ィル) メタノール、 (2S) — 一メチル (ピロリジン一 2—ィル) ェタノ一 ル、 (2 R) —び一メチル (ピロリジン一 2—ィル) エタノール、 (oiR, 2 S) — 一メチル (ピロリジン一 2—ィル) ベンジルアルコール、 ( S, 2 R)— 一メチル (ピロリジン一 2—ィル) ベンジルアルコールが挙げられる ヌクレオシド (VIII) において、 Bsはゥラシル、 アデニン、 シ卜シン、 グ ァニン又はチミンあるいはそれらの誘導体から誘導される基を示すが、 誘導体 としては、 アデニン、 シトシン及びグァニンのアミノ基を保護基で保護したも の等が挙げられ、 具体的には、 下記式で表される化合物が挙げられる。 In addition, prolinol derivatives, for example, (Of R, 2S)-(pyrrolidine-12-yl) benzyl alcohol, (aS, 2R)-(pyrrolidine-12-yl) benzyl alcohol Amino alcohols that can be converted to H-phosphonates, such as (S) -a, of-diphenyl (pyrrolidine-1-yl) methanol and (2S) -monomethyl (pyrrolidine-l-2-yl) ethanol Ethyl, (2R) -bimethyl (pyrrolidine-1-yl) ethanol, (oiR, 2S)-monomethyl (pyrrolidine-12-yl) benzyl alcohol, (S, 2R)-monomethyl (Pyrrolidine-1-yl) In nucleosides (VIII) including benzyl alcohol, Bs represents a group derived from peracyl, adenine, cytosine, guanine or thymine or a derivative thereof. The body, adenine, also, and the like of protected with a protecting group to the amino group of cytosine and Guanin, and specific examples thereof include compounds represented by the following formula.
〔式中、 R7は上記と同じ意味を示し、 R8は炭素数 1〜 1 5のアルキル基、 ァ リール基、 ァラルキル基、 ァリールォキシアルキル基を示し、 中でもメチル基、 イソプロピル基、 フエニル基、 ベンジル基、 フエノキシメチル基が好ましく、 特にフエニル基が好ましい。 また、 R9及び R1C)は、 それぞれ炭素数 1〜4のァ ルキル基を示し、 特にメチル基が好ましい。 R"は、 グァニン 06位の保護基を 示し、 2 -シァノエチル基、 p -ニトロフエニルェチル基、 フエニルスルホニルェ チル基、 ベンジル基、 2-トリメチルシリルェチル基等が好ましい。 [Wherein, R 7 has the same meaning as above, and R 8 represents an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, an aryl group, an aralkyl group, an aryloxyalkyl group, among which a methyl group, an isopropyl group, A phenyl group, a benzyl group and a phenoxymethyl group are preferred, and a phenyl group is particularly preferred. R 9 and R 1C) each represent an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and a methyl group is particularly preferable. R "represents a protecting group at position 06 of guanine, preferably 2-cyanoethyl group, p-nitrophenylethyl group, phenylsulfonylethyl group, benzyl group, 2-trimethylsilylethyl group or the like.
ヌクレオシド (VIII) は、 ゥラシル、 アデノシン、 シチジン、 グアノシン、 チミン又はそれらの誘導体の 5' 位の水酸基を保護したもので、 保護基 (R4) としては、 tert -ブチルジフエニルシリル基 (TBDPS) 、 tert -ブチルジメ チルシリル基 (TBDMS) 等のアルキルシリル基、 4, 4' ージメ トキシト リチル基 (DMT r ) 、 4—メ トキシトリチル基 (MMT r ) 等のトリチル基、 次式で表される保護基等が挙げられる。 Nucleoside (VIII) is Urashiru, adenosine, which was protected cytidine, guanosine, the hydroxyl group of thymine or 5 'position of their derivatives, the protecting group (R 4), tert - butyl diphenyl silyl group (TBDPS) Alkylsilyl groups such as tert-butyldimethylsilyl group (TBDMS), trityl groups such as 4,4'-dimethyoxytrityl group (DMT r) and 4-methoxytrityl group (MMT r), and a protecting group represented by the following formula: And the like.
ヌクレオシド (VIII) の が水素原子のとき、 B sはチミン又はその誘導 -体が好ましい。 チミン又はその誘導体以外のヌクレオシドを用いる場合、 塩基 部への副反応が危惧されるため、 塩基部に保護基を導入することが望ましく、
アデニンとグァニンにはフエノキシァセチル (Pac)基、 シトシンにはイソプチ ル(iBu)基を用いることができる。 When is in the nucleoside (VIII) is a hydrogen atom, Bs is preferably thymine or a derivative thereof. When using a nucleoside other than thymine or a derivative thereof, it is desirable to introduce a protecting group into the base, since side reactions to the base may be feared. Adenine and guanine can use the phenoxyacetyl (Pac) group, and cytosine can use the isobutyl (iBu) group.
ホスホロアミダイ ト ( I ) において、 R1、 R, 、 R2、 R" の意味は上記し たとおりである。 In the phosphoramidite (I), the meanings of R 1 , R,, R 2 and R "are as described above.
R1及び R2としては、 R1及び R2のいずれか一方が水素原子で他方がフエ二 ル基、 R1及び R2のいずれか一方がメチル基で他方がフエニル基、 あるいは R1 及び R2が共にフエニル基の組み合わせが好ましく、 R1がフ: L二ル基、 R2が水 素原子の組み合わせが更に好ましい。 R3はメチル基が好ましい。 また、 R1が フエニル基、 R2及び R3が窒素原子と共にピロリジン骨格を形成していること が好ましい。 R4及び がー OR5のときの R5は TBDP S、 T B D M Sが好 ましく、 T BD PSが更に好ましい。 As R 1 and R 2 , one of R 1 and R 2 is a hydrogen atom and the other is a phenyl group, one of R 1 and R 2 is a methyl group and the other is a phenyl group, or R 1 and R 2 R 2 is preferably a combination of phenyl groups, R 1 is a phenyl group, and R 2 is more preferably a combination of hydrogen atoms. R 3 is preferably a methyl group. Further, it is preferable that R 1 forms a phenyl group and R 2 and R 3 form a pyrrolidine skeleton together with a nitrogen atom. When R 4 and R 5 are OR 5 , R 5 is preferably TBDP S or TBDMS, and more preferably TBD PS.
R1及び R2が上記の組み合わせであるとき、 R' 及び R" は、 水素原子、 炭 素数 1〜 3のアルキル基又は炭素数 6〜 1 4のァリール基から選択できる。 本発明の一般式 ( I ) で表される光学活性なヌクレオシド 3' —ホスホロア ミダイ トにおいては、 R1と R' は、 同一又は異なっていてもよい、 炭素数 1 〜 3のアルキル基又は炭素数 6〜 14のァリール基である化合物が好ましい。 また、 H-ホスホネート (一般式 (XII) において Y二 H) を得る場合は、 R1と R, の両方が水素原子ではなく (即ち、 R1と R' が結合する炭素原子が第 3 級炭素であり) 、 かつ前記第 3級炭素の置換基がァリール基を含まない組み合 わせにする。 When R 1 and R 2 are the above combination, R ′ and R ″ can be selected from a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or an aryl group having 6 to 14 carbon atoms. In the optically active nucleoside 3′-phosphoroamidite represented by (I), R 1 and R ′ may be the same or different and each may be an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or an alkyl group having 6 to 14 carbon atoms. When an H-phosphonate (Y-H in the general formula (XII)) is obtained, both R 1 and R, are not hydrogen atoms (that is, R 1 and R ′ are The carbon atom to be bonded is a tertiary carbon), and the substituent of the tertiary carbon does not include an aryl group.
ヌクレオシド (II) は、 ゥリジン、 アデノシン、 シチジン、 グアノシン又は それらの誘導体の 2位と 3位の水酸基を保護したものであり、 B sで示される ゥラシル、 アデニン、 シトシン、 グァニン、 チミン又はそれらの誘導体から誘 導される基は、 ヌクレオシド (VIII) で例示したものが挙げられる。 Nucleoside (II) protects the hydroxyl groups at the 2- and 3-positions of peridine, adenosine, cytidine, guanosine or their derivatives, and peracyl, adenine, cytosine, guanine, thymine or their derivatives represented by Bs The group derived from is exemplified by the nucleoside (VIII).
ヌクレオシド (II) とヌクレオシド (VIリ) の B sは、 同一でも異なってい ても良い。 The Bs of the nucleoside (II) and the nucleoside (VI) may be the same or different.
R6は上記と同じものであり、 E,が一 0 R7のときの R7で示される水酸基の 保護基としては、 TBDPS、 TBDMS、 ァセチル基 (A c) 、 フエノキシ
ァセチル基 (PA c) 、 ベンジル基 (B z ) 、 DMT r、 MM丁 r等が挙げら れ、 R6、 R7は PA cが好ましい。 R 6 is the same as above, and when E, is 10 R 7 , the protecting group for the hydroxyl group represented by R 7 is TBDPS, TBDMS, acetyl group (Ac), phenoxy Asechiru group (PA c), benzyl group (B z), DMT r, MM Ding r etc. mentioned et been, R 6, R 7 is PA c is preferred.
活性化剤 (III) は、 ホスホロアミダイ 卜 ( I ) の窒素原子に対するプロ ト ン供給能力を有し、 求核試薬としては働かないものである。 The activator (III) has a capability of supplying a proton to the nitrogen atom of the phosphoramidite (I) and does not act as a nucleophile.
活性化剤 (III) 中、 X—としては、 BF4-、 P F6—、 T f O—、 T f 2N—が好ま しい。 また、 環状構造 Aは、 窒素原子と共に形成する炭素数 3〜1 6のモノシ クロ又はビシクロ構造を示し、 特に式 (IU-1) で表されるモノシクロ構造を 有するものが好ましい。 In the activator (III), X— is preferably BF 4 —, PF 6 —, T f O—, or T f 2 N—. The cyclic structure A represents a monocyclo or bicyclo structure having 3 to 16 carbon atoms formed with a nitrogen atom, and particularly preferably has a monocyclo structure represented by the formula (IU-1).
(式中、 X—は前記と同じ意味を示す。 nは 3〜 7の数を示し、 4又は 5が好ま しい。 ) (Wherein, X— has the same meaning as described above. N represents a number of 3 to 7, preferably 4 or 5.)
活性化剤 (III) は、 式 (IX) The activator (III) has the formula (IX)
(式中、 環状構造 Aは前記と同じ意味を示す。 ) (In the formula, the cyclic structure A has the same meaning as described above.)
で表されるァミンと、 次式 (X) : And the following formula (X):
HX (X) (式中、 Xは前記の意味を示す。 ) HX (X) (wherein, X has the above meaning.)
で表される化合物とを反応させることにより容易に得ることができる。 Can be easily obtained by reacting with the compound represented by
活性化剤 (III) は、 特にァセトニトリルに良い溶解性を示すので、 ホスホ 口アミダイ 卜 ( I ) とヌクレオシド (M) の反応は、 ァセトニトリル等の溶媒 中で行うことが好ましい。 Since the activator (III) exhibits particularly good solubility in acetonitrile, the reaction between the phosphoamidite (I) and the nucleoside (M) is preferably carried out in a solvent such as acetonitrile.
ホスホロアミダイ ト ( I ) とヌクレオシド (||) とは、 ホスホロアミダイ ト ( I ) に対し、 ヌクレオシド (II) を◦. 5〜 1. 0当量倍の割合で反応させ
ることが好ましい。 活性化剤 (III) は、 ホスホロアミダイ ト ( I ) に対し、Phosphoramidite (I) and nucleoside (||) are reacted with nucleoside (II) at a ratio of 5 to 1.0 equivalent times to phosphoramidite (I). Preferably. Activator (III) reacts with phosphoramidite (I)
1〜 5当量倍の割合で用いることが好ましい。 反応温度は 0〜40°Cが好まし く、 反応圧力は 1気圧が好ましい。 It is preferable to use 1 to 5 equivalent times. The reaction temperature is preferably 0 to 40 ° C, and the reaction pressure is preferably 1 atm.
以上の第 1反応工程により、 下記一般式' (XI) By the above first reaction step, the following general formula (XI)
[式中、 R R2、 R3、 R R6、 D,, E 及び B sは前記と同じ意味を示 す。 ] [Wherein, RR 2 , R 3 , RR 6 , D ,, E and B s have the same meaning as described above. ]
で表されるホスフアイ 卜 〔以下 「ホスフアイト (XI) 」 という〕 を得る。 [Hereinafter referred to as “phosphite (XI)”].
〔第 2反応工程〕 (Second reaction step)
まず、 第 1反応工程で得られたホスフアイ 卜 (XI) を、 無水酢酸、 無水トリ フルォロ酢酸等でァシル化した後、 硫化剤、 セレノ化剤、 ボラノ化剤等の求電 子試薬と反応させ、 その後、 一般式 (XII) の化合物の不斉補助基を 1 , 8— ジァザビシクロ [5. 4. 0] ゥンデカー 7—ェン (DB U) 等で処理して除 き、 一般式 (XII) First, the phosphite (XI) obtained in the first reaction step is acylated with acetic anhydride, trifluoroacetic anhydride or the like, and then reacted with an electrophilic reagent such as a sulfurizing agent, a selenating agent, or a boranolating agent. Then, the asymmetric auxiliary group of the compound of the general formula (XII) is treated with 1,8-diazabicyclo [5.4.0] pendecar 7-ene (DBU) and the like to remove the compound.
E1¾ B s及び Yは前記と同じ意味を示す。 ]
で表される保護されたジリン酸部位修飾ジヌクレオチドを得る。 なお、 使用す る求電子試薬の種類により (例えば、 硫化剤として 1, 2, 4—ジチアゾリジン 一 3, 5—ジオン、 3—エトキシ一 1, 2, 4—ジチアゾリンー 5—オン、 3— メチル一1 , 2, 4—ジチアゾリン一 5—オン等を用いた場合) 、 前段のァシル 化工程を省略してもよい。 E 1¾ B s and Y have the same meaning as described above. ] To obtain a protected diphosphate site-modified dinucleotide represented by Depending on the type of electrophile used (for example, 1,2,4-dithiazolidine-1,3,5-dione, 3-ethoxy-1,2,4-dithiazoline-5-one, 3-methyl In the case of using 1,2,4-dithiazoline-15-one or the like), the preceding acylation step may be omitted.
最後に、 水酸基の保護基を、 (CH3CH2) 3N ■ 3 H F等で除き、 一般式 (IV) 又は (V) で表される立体規則性の高いリポヌクレオチド類縁体を得る ことができる。 Finally, it is possible to obtain a highly stereoregular liponucleotide analog represented by the general formula (IV) or (V) by removing the hydroxyl-protecting group with (CH 3 CH 2 ) 3 N 3 HF or the like. it can.
また、 本発明においては、 上記した第 1反応工程と第 2反応工程を繰り返す ことにより、 一般式 (XI I I) で表されるオリゴマー 〔以下 「オリゴマー Further, in the present invention, by repeating the first reaction step and the second reaction step, an oligomer represented by the general formula (XIII) [hereinafter referred to as “oligomer”
(XI I I) 」 という〕 を製造することができる。 (XI I I) ").
一般式 (I) で表されるモノマーの R1が罈合する炭素が第 3級炭素であり (R1と R' の両方が水素原子ではない) 、 かつ前記第 3級炭素の置換基がァ リール基を含まない場合、 第 1反応工程で得られたホスファイ ト (XI) を、 無 水酢酸、 無水トリフルォロ酢酸等でァシル化した後、 1 %トリフルォロ酢酸ジ クロ口メタン溶液等の酸で処理すると、 不斉補助基が脱離して、 対応する H-ホ スホネート (XIし Y=H) が得られる。 前記第 3級炭素の置換基のうち、 1っ以 上がァリール基の場合は、 第 2反応工程においてァシル化の工程を省略するこ とができるが、 生成するカルボカチオンを還元するために、 トリェチルシラン やボラン■ ピリジン錯体などの還元剤を添加する必要がある。 The carbon to which R 1 of the monomer represented by the general formula (I) is bonded is a tertiary carbon (both R 1 and R ′ are not hydrogen atoms), and the substituent of the tertiary carbon is When the phosphite (XI) obtained in the first reaction step does not contain an aryl group, the phosphite (XI) obtained in the first reaction step is acylated with anhydrous acetic acid, trifluoroacetic anhydride, or the like, and then is acidified with an acid such as a 1% trifluoroacetic acid dichloromethane solution of methane. Upon treatment, the chiral auxiliary is removed to give the corresponding H-phosphonate (XI then Y = H). When one or more of the tertiary carbon substituents is an aryl group, the acylation step can be omitted in the second reaction step, but in order to reduce the carbocation formed, It is necessary to add a reducing agent such as triethylsilane or borane-pyridine complex.
この方法で 2量体を合成する場合、 得られた H -ホスホネート (XIし Y=H) に 硫化剤を反応させれば、 ホスホロチォェ一卜 (XIし Y=S") が得られ、 ァミンの 四塩化炭素溶液を反応させれば、 ホスホロアミデート (XIし Y=NR2) が得られ る。 When a dimer is synthesized by this method, a phosphorothioate (XI and Y = S ") is obtained by reacting the obtained H-phosphonate (XI and Y = H) with a sulfurizing agent. By reacting the carbon tetrachloride solution, phosphoramidate (XI then Y = NR 2 ) can be obtained.
この方法でオリゴマーを合成する場合、 5' 水酸基の保護基として DMTr基 を有するモノマーを用い、 上記の方法によって得られたホスフアイ ト中間体を 酸処理することで不斉補助基と 5' 水酸基の保護基である DMTr基を同時に除 去し、 得られた 5' 位に水酸基を有する 2量体に対してモノマーを縮合し、 上
記工程を繰り返すことにより、 H -ホスホネート結合を有するオリゴマーを合成 できる。 When an oligomer is synthesized by this method, a monomer having a DMTr group as a protecting group for the 5 ′ hydroxyl group is used, and the phosphite intermediate obtained by the above method is subjected to an acid treatment to form an asymmetric auxiliary group and a 5 ′ hydroxyl group. The protecting group, DMTr, is removed at the same time, and the resulting dimer having a hydroxyl group at the 5'-position is condensed with a monomer. By repeating the above steps, an oligomer having a 3 H-phosphonate bond can be synthesized.
次に、 H-ホスホネ一卜結合を有するオリゴマーを 2量体の場合と同様に変換 反応を行い、 望みのリン原子修飾 DNAに導いた後に脱保護を行うことで、 目的 とする核酸類縁体を得ることができる。 Next, an oligomer having an H-phosphonate bond is subjected to a conversion reaction in the same manner as in the case of a dimer, and is guided to a desired phosphorus atom-modified DNA, followed by deprotection, whereby a target nucleic acid analog is obtained. Obtainable.
—般式 (XIII) 中、 nは 1〜 1 50の整数を示し、 好ましい範囲は 5〜 50 であり、 より好ましい範囲は 1 0〜30、 更に好ましい範囲は 1 5〜22であ る。 D2及び E 2は水酸基又は水素原子を示す。 In the general formula (XIII), n represents an integer of 1 to 150, a preferred range is 5 to 50, a more preferred range is 10 to 30, and a still more preferred range is 15 to 22. D 2 and E 2 represent a hydroxyl group or a hydrogen atom.
オリゴマー (XII I) は、 固相法によるオリゴマー合成法を適用して製造する ことができ、 具体的には市販の自動合成機 (Expedite, ABI社製, 又は ABI Model 394, DNA/RNA Synthesizer ABI社製) などを用いて合成するか、 グラ スフィルターのついた固相合成容器を用いた手動法で合成することができる。 固相法で用いる固相担体としては、 アミノアルキル化され、 孔径が制御され た多孔性ガラス (control led pore glass: CPG) 、 アミノアルキル化された高 架橋ポリスチレン (highly cross-l inked polystyrene: HCP) といった公矢!]の 高分子担体であって, できるだけ膨潤性がな 過剰に用いた試薬を洗浄によ つて簡単に除去できるものが好ましい。 The oligomer (XII I) can be produced by applying an oligomer synthesis method by a solid phase method. Specifically, a commercially available automatic synthesizer (Expedite, manufactured by ABI, or ABI Model 394, DNA / RNA Synthesizer ABI) Or a manual method using a solid-phase synthesis vessel equipped with a glass filter. Solid-phase carriers used in the solid-phase method include aminoalkylated porous glass (control led pore glass: CPG) and aminoalkylated highly cross-linked polystyrene (HCP). ) Is preferred, and a polymer carrier that is as swellable as possible and can easily remove excess reagents by washing.
固相担体とリボヌクレオシドの 3' 又は 2' 水酸基のいずれかは、 コハク酸 エステル、 シユウ酸エステル、 フタル酸エステル等のリンカ一を介して結合し
ても良い。 固相担体が結合していない 2' 又は 3' 水酸基の保護基としては、 ァセチル基、 ベンゾィル基、 2- (シァノエトキシ) ェチル基、 t-ブチルジメチ ルシリル基等の RNA合成及び DNA合成で一般的に用いられる保護基を挙げるこ とができる。 Either the 3 'or 2' hydroxyl groups of the ribonucleoside and the solid support are bound via a linker such as succinate, oxalate, or phthalate. May be. Protecting groups for 2 'or 3' hydroxyl groups to which the solid phase carrier is not bound include acetyl, benzoyl, 2- (cyanoethoxy) ethyl, t-butyldimethylsilyl, and other RNA and DNA synthesis groups. The protecting groups used can be mentioned.
本発明の製造法により得られる立体規則性の高いリボヌクレオチド類縁体及 びデォキシリボヌクレオチド誘導体は、 遺伝子治療の分野で注目されている手 法の一つであるアンチセンス法や RNA干渉に使用することができる。 The highly stereoregular ribonucleotide analogs and deoxyribonucleotide derivatives obtained by the production method of the present invention can be used for antisense and RNA interference, which are one of the methods that have attracted attention in the field of gene therapy. Can be used.
本発明によれば、 アンチセンス分子として有効な立体規則性の高いリボヌク レオチド類縁体及びデォキシリボヌクレオチド類縁体を高い収率で得ることが できる。 実施例 According to the present invention, ribonucleotide analogs and deoxyribonucleotide analogs having high stereoregularity and effective as antisense molecules can be obtained in high yield. Example
例中の%は特記しない限リ質量%である。 The percentages in the examples are mass% unless otherwise specified.
式および表中、 dr, d.にはジァステレオマ一比を、 rtは室温を、 equiv, eq は当量を、 TFAはトリフルォロ酢酸を、 Pyはピリジンを示す。 In the formulas and tables, dr and d. Indicate diastereomeric ratios, rt indicates room temperature, equiv and eq indicate equivalents, TFA indicates trifluoroacetic acid, and Py indicates pyridine.
<活性化剤 (III) の製造例 > <Production example of activator (III)>
製造例 1-1 : N—シァノメチルピロリジニゥムテトラフルォロボレイ 卜の製 造 Production Example 1-1: Production of N-cyanomethylpyrrolidinium tetrafluoroborate
アルゴン雰囲気下、 N—シァノメチルピロリジン 0. 551 g (5·. 00 mmol) のェチルエーテル (5. OOml) 溶液を一 78 °Cに冷却し、 攪拌しつつ 54%四フッ化硼素酸ェチルエーテル溶液 0. 689ml (5. 0 Ommol) を滴 下した。 溶液を室温に戻した後、 減圧下濃縮、 乾燥し、 残渣にェチルェ一テル Under an argon atmosphere, a solution of 0.551 g (5.00 mmol) of N-cyanomethylpyrrolidine in ethyl ether (5.OO ml) was cooled to 178 ° C and stirred while stirring to give a 54% ethyl ether solution of boron tetrafluoride. 0.689 ml (5.0 Ommol) was added dropwise. After returning the solution to room temperature, it was concentrated under reduced pressure and dried.
(5ml) を加えて激しく攪拌し、 シリンジを用いて溶媒を除去した。 この洗浄 操作を 5回繰り返した後、 真空乾燥し、 目的物 〔一般式 (III) において、 n =4、 X— =B F4—の活性化剤〕 0. 990 g (5. 00圆 ol) を得た。 収率定 量的。 白色粉末。 潮解性大。 (5 ml) was added and stirred vigorously, and the solvent was removed using a syringe. After repeating this washing operation 5 times, vacuum drying is carried out, and the target substance [activator of general formula (III), n = 4, X— = BF 4 —] 0.990 g (5.00 ol) Got. Yield quantitative. White powder. Large deliquescence.
-融点: 1 1 3. 0〜 1 14. 0°C -Melting point: 1 13.0 ~ 11.4 ° C
, I R (KB r ) x : 2988, 2950, 2825, 2527, 2445, 1451, 1407, 1374,
1298, 1119, 929 cm"1 , IR (KB r) x : 2988, 2950, 2825, 2527, 2445, 1451, 1407, 1374, 1298, 1119, 929 cm " 1
^H— NMR (300MHz, CD3CN) δ : 7.17(br, 1H), 4.30(s,2H), 3.51 (br,4H), 2.13〜2.08(m, 4H) ^ H—NMR (300MHz, CD 3 CN) δ: 7.17 (br, 1H), 4.30 (s, 2H), 3.51 (br, 4H), 2.13 to 2.08 (m, 4H)
■ 13C— NMR (75 MHz, C D3CN) δ: 112.0, 55.9, 41.8, 23.2。 ■ 13 C—NMR (75 MHz, CD 3 CN) δ: 112.0, 55.9, 41.8, 23.2.
製造例 1 - 2: Ν—シァノメチルピロリジニゥムへキサフルォロホスフエ一ト の製造 Production Example 1-2: Production of Ν-cyanomethylpyrrolidinium hexafluorophosphate
6 1 %へキサフルォロリン酸水溶液 1. 20 g (5. O Ommol) に水 5. 0 Oml を加え、 攪拌しつつ N—シァノメチルピロリジン 0. 55 1 g (5. 00 画 ol) を滴下した後、 溶液を凍結乾燥した。 残渣にェチルエーテル (1 Oml) を加え、 激し〈攪拌し、 シリンジを用いて溶媒を除去した。 この洗浄操作を 3 回繰り返した後、 真空乾燥し、 目的物 〔一般式 (III) において、 n = 4、 X一 二 P F6—の活性化剤〕 1. 28 g (5. O Ommol) を得た。 収率定量的。 白色 粉末。 潮解性大。 6 To 1% hexafluorophosphoric acid aqueous solution (1.20 g, 5.0 O mmol) was added 5.0 Oml of water, and while stirring, 0.51 g (5.00 ol) of N-cyanomethylpyrrolidine was added dropwise. Later, the solution was lyophilized. Ethyl ether (1 Oml) was added to the residue, vigorously <stirred, and the solvent was removed using a syringe. After repeating this washing operation three times, the product is dried under vacuum, and the desired product (in the general formula (III), n = 4, an activator of X-12 PF 6 —) 1.28 g (5. Obtained. Yield quantitative. White powder. Large deliquescence.
•融点: 56. 0〜5フ. 0°C • Melting point: 56.0-5 ° C
- I R (KB r ) : 2988, 2828, 2532, 2448, 1626, 1457, 1296, 1082, 987, 834 cm-1 -IR (KBr): 2988, 2828, 2532, 2448, 1626, 1457, 1296, 1082, 987, 834 cm- 1
' 1Η— NMR (300MHz, CD3CN) δ : ,8.27 (br,1H), 4.24(s,2H), 3.48 (br,4H), 2.12〜2.08(m, 4H) ' 1 Η— NMR (300MHz, CD 3 CN) δ:, 8.27 (br, 1H), 4.24 (s, 2H), 3.48 (br, 4H), 2.12〜2.08 (m, 4H)
■ 13C— NMR (7 5 MHz, CD3CN) δ: 112.1, 56.0, 42.1, 23.5■ 13 C—NMR (75 MHz, CD 3 CN) δ: 112.1, 56.0, 42.1, 23.5
■ 31 P - N M R ( 1 2 1 MHz, C D3C N) δ: -146.0 (septet, 1 J PF=707Hz) 0 製造例 1 - 3: N—シァノメチルピロリジニゥムトリフルォロメタンスルホネ 一卜の製造 ■ 31 P-NMR (121 MHz, CD 3 CN) δ: -146.0 (septet, 1 J PF = 707 Hz) 0 Production example 1-3: N-cyanomethylpyrrolidinium trifluoromethanesulfone Production of birds
N—シァノメチルピロリジン 0. 55 1 g (5. 0 Omtnol) のジクロ口メタ ン (5. 0 Oml) 溶液を 0°Cに冷却し、 攪拌しつつトリフルォロメタンスルホ ン酸 0. 442ml (5. O Ommol) を滴下した後、 ェチルエーテル (1 0ml) を加えた。 生じた固体を吸引ろ過によって集め、 ェチルエーテル (1ml X 3) で洗浄した後、 減圧下乾燥して、 目的物 〔一般式 (III) において、 n = 4、 X-=T f O—の活性化剤〕 1. 1 1 g (4. 27mmol) を得た。 収率 85。ノ0。
白色粉末。 潮解性小。 A solution of 0.51 g (5.0 Omtnol) of N-cyanomethylpyrrolidine in 5.0 ml of dichloromethane is cooled to 0 ° C, and 0.442 ml of trifluoromethanesulphonic acid is added with stirring. 5. O 2 mmol) was added dropwise, and then ethyl ether (10 ml) was added. The resulting solid was collected by suction filtration, washed with ethyl ether (1 ml X 3), dried under reduced pressure, and the target compound (in general formula (III), n = 4, X- = T f O— activation Agent] 1.1 1 g (4.27 mmol) was obtained. Yield 85. Roh 0. White powder. Deliquescence small.
-融点: 67. 0〜67. 5°C -Melting point: 67.0 ~ 67.5 ° C
■ I R (KB r ) : 2996, 2841, 2651, 2477, 2347, 2282, 1637, 1462, 1437, 1269, 1228, 1168, 1033, 985, 911, 849, 761, 641 cm—1 ■ IR (KBr): 2996, 2841, 2651, 2477, 2347, 2282, 1637, 1462, 1437, 1269, 1228, 1168, 1033, 985, 911, 849, 761, 641 cm— 1
■ 1H-NMR (300MHz, C D3CN) δ : 8.16(br, 1H), 4.30(s,2H), 3.50(br,4H), 2.14〜2· 09 (m, 4H) ■ 1 H-NMR (300 MHz, CD 3 CN) δ: 8.16 (br, 1H), 4.30 (s, 2H), 3.50 (br, 4H), 2.14 to 209 (m, 4H)
■ 13C— NMR (75 MHz, CD3CN) δ : 121.2(q, 1JCF=320Hz) , 55.9, 42.0, 23.5。 ■ 13 C—NMR (75 MHz, CD 3 CN) δ: 121.2 (q, 1 J CF = 320 Hz), 55.9, 42.0, 23.5.
製造例 1 - 4: Ν—シァノメチルビペリジニゥムテトラフルォロボレ一卜の製 造 Production Examples 1-4: Production of Ν-cyanomethylbiperidinium tetrafluoroborate
Ν—シァノメチルビペリジン 1. 24 g (1 0. Ommol) のジクロロメタン (1 0. Oml) 溶液に対し、 攪拌しつつ 54%四フッ化硼素酸ェチルエーテル 溶液 1. 38ml (1 0. Ommol) を滴下した。 溶液をェチルエーテル (20 ml) で希釈し、 生じた固体を吸引ろ過によって集め、 ェチルエーテル (1 0 mi x 2) で洗浄した後、 減圧下乾燥して、 目的物 〔一般式 (I I I) において、 n = 5、 X— =B F4—の活性化剤〕 2. 0 1 g (9. 48mmol) を得た。 収率 9 5%。 白色粉末。 潮解性なし。. To a solution of 1.24 g (10.Ommol) of Ν-cyanomethylbiperidine in dichloromethane (10.Oml), with stirring, a 54% solution of ethyl tetrafluoroboronate ether solution 1.38ml (10.Ommol) ) Was added dropwise. The solution was diluted with ethyl ether (20 ml), and the resulting solid was collected by suction filtration, washed with ethyl ether (10 mix 2), dried under reduced pressure, and dried under reduced pressure. = 5, X— = BF 4 —activator] 2.01 g (9.48 mmol) was obtained. Yield 95%. White powder. No deliquescence. .
'融点: 1 03. 0〜 1 03. 5°C 'Melting point: 103.0 ~ 103.5 ° C
■ I R (KB r ) ymx 3149, 2997, 2952, .2876, 2591, 2570, 2491, 2372, 1457, 1422, 1296, 1074, 980, 935, 850, 641 cm"1 ■ IR (KB r) y mx 3149, 2997, 2952, .2876, 2591, 2570, 2491, 2372, 1457, 1422, 1296, 1074, 980, 935, 850, 641 cm " 1
- 1H— NMR (300MHz, CD3CN) δ 6.74(br, 1H), 4.22(s,2H), 3.58(br,2H), 3.15(br,2H), 1.97〜1.51 (m, 6H) -1 H-NMR (300MHz, CD 3 CN) δ 6.74 (br, 1H), 4.22 (s, 2H), 3.58 (br, 2H), 3.15 (br, 2H), 1.97 ~ 1.51 (m, 6H)
- 13C-NMR (75 MHz, CD3CN) δ : 111.2, 54.6, 44.0, 23.0, 20.5。 製造例 1 - 5: Ν—シァノメチルビペリジニゥムへキサフルォロホスフエ一ト の製造 - 13 C-NMR (75 MHz , CD 3 CN) δ: 111.2, 54.6, 44.0, 23.0, 20.5. Production Examples 1-5: Production of di-cyanomethylbiperidinium hexafluorophosphate
6 1 %へキサフルォロリン酸水溶液 1 · 20 g (5. 0 Ommol) に水 5. 0 Oml を加え、 攪袢しつつ N—シァノメチルビペリジン 0. 62 1 g (5. 00 画 ol) を滴下した後、 溶液を凍結乾燥した。 残渣にジクロロメタン (5mi) 、
ェチルエーテル (1 0ml) を加え、 一 78°Cに冷却し、 激しく攪拌すると固体 が生じたので、 室温に昇温した後、 シリンジを用いて溶媒を除去した。 残渣に ェチルエーテル (5ml) を加え、 激しく攪拌した後、 シリンジを用いて溶媒を 除去した。 この洗浄操作を 3回繰り返した後、 真空乾燥し、 目的物 〔一般式6 Add 1 5.20 g (5.0 Ommol) of 1% aqueous solution of hexafluorophosphoric acid to 5.0 Oml of water, and add 0.621 g of N-cyanomethylbiperidine (5.00 ol) with stirring. After dropwise addition, the solution was freeze-dried. Dichloromethane (5mi) Ethyl ether (10 ml) was added, and the mixture was cooled to 178 ° C and vigorously stirred to produce a solid. After the temperature was raised to room temperature, the solvent was removed using a syringe. Ethyl ether (5 ml) was added to the residue, stirred vigorously, and the solvent was removed using a syringe. After repeating this washing operation three times, vacuum drying is performed, and the target substance (general formula
(III) において、 n = 5、 X— =P F6—の活性化剤〕 1. 31 g (4. 85 mmol) を得た。 収率 97%。 白色粉末。 潮解性大。 (III), n = 5, X— = PF 6 —Activator] 1.31 g (4.85 mmol) was obtained. 97% yield. White powder. Large deliquescence.
•爾虫点: 54. 0〜55. 0°C • Insect point: 54.0-55.0 ° C
- I R (KB r ) vmm: 2997, 2953, 2876, 2589, 2570, 2490, 2372, 1655, 1455, 1422, 1297, 1192. 1142, 1084, 1037, 981, 953, 837, 746 cm-1 -IR (KBr) v mm : 2997, 2953, 2876, 2589, 2570, 2490, 2372, 1655, 1455, 1422, 1297, 1192. 1142, 1084, 1037, 981, 953, 837, 746 cm -1
- 1H-NMR (30 OMHz, CD3CN) δ : 7.94 (br, 1H), 4.15(s,2H), 3.31 (br,4H), 1.92〜1.83 (m, 4H) , 1.63(br,2H) -1 H-NMR (30 OMHz, CD 3 CN) δ: 7.94 (br, 1H), 4.15 (s, 2H), 3.31 (br, 4H), 1.92 to 1.83 (m, 4H), 1.63 (br, 2H )
- 13C— NMR (75MHz, CD3CN) δ 111.5, 54.5, 44.2, 23.1, 20.8 - 13 C- NMR (75MHz, CD 3 CN) δ 111.5, 54.5, 44.2, 23.1, 20.8
■ 31 P - N M R (1 21 MHz, CD3CN) δ : -145.9 (septet, 1JPF=707Hz)。 製造例 1 - 6: N—シァノメチルビペリジニゥム卜リフルォロメタンスルホネ■ 31 P-NMR (121 MHz, CD 3 CN) δ: -145.9 (septet, 1 J PF = 707 Hz). Production Examples 1-6: N-Cyanomethylbiperidinium trifluoromethanesulfone
—卜の製造 — Production of birds
N—シァノメチルビペリジン 0. 621 g (5. 00圆 ol) のジクロ口メタ ン (5. 0 Oml) 溶液を 0°Cに冷却し、 攪拌しつつトリフルォロメタンスルホ ン酸 0. 442ml (5. 0 Ommol) を滴下した。 溶液を室温に昇温し、 ェチル エーテル (1 Oml) を加えた後、 固体を吸引ろ過によって集め、 ェチルェ一テ ル (1ml x 3) で洗浄した後、 減圧下乾燥して、 目的物 〔一般式 (III) にお いて、 n = 5、 X— =T f O—の活性化剤〕 T. 37 g (5. 0 Ommol) を得た。 収率定量的。 白色粉末。 潮解性小。 A solution of 0.621 g (5.0 圆 ol) of N-cyanomethylbiperidine in dichloromethane (5.0 Oml) was cooled to 0 ° C and stirred with 0.1 ml of trifluoromethanesulfonate. 442 ml (5.0 O mmol) were added dropwise. After the solution was warmed to room temperature, ethyl ether (1 Oml) was added, the solid was collected by suction filtration, washed with ethyl ether (1 ml x 3), dried under reduced pressure, and dried under reduced pressure. In the formula (III), n = 5, X— = T f O—activator] T. 37 g (5.0 O mmol) was obtained. Yield quantitative. White powder. Deliquescence small.
-融点: 1 1 0. 0~ 1 1 0. 5°C -Melting point: 1 10.0 ~ 1 10.5 ° C
■ I R (KB r ) vmx: 2999, 2723, 1460, 1289, 1226, 1168, 1083, 1027, 978, 936, 762, 641 cm一1 ■ IR (KB r) v mx : 2999, 2723, 1460, 1289, 1226, 1168, 1083, 1027, 978, 936, 762, 641 cm one 1
' 1Η— NMR (300MHz, C D3C N) δ 8.12(br, 1H), 4.19(s,2H), 3.58(br,2H), 3.09(br,2H), 2.21(br,4H), 1.50(br, 1H) ' 1 Η-NMR (300MHz, CD 3 CN) δ 8.12 (br, 1H), 4.19 (s, 2H), 3.58 (br, 2H), 3.09 (br, 2H), 2.21 (br, 4H), 1.50 ( br, 1H)
, 13C— NMR (75 MHz, CD3CN) 6 : 120.9 (q, 1JCF=319Hz), 111.4,
54.5, 44.2, 23.0, 20.7。 , 13 C—NMR (75 MHz, CD 3 CN) 6: 120.9 (q, 1 J CF = 319 Hz), 111.4, 54.5, 44.2, 23.0, 20.7.
<ホスフイチル化剤 (VII) の製造 > <Production of phosphitylating agent (VII)>
製造例 2 - 1 : (5S) —2—クロロー 3—メチル一5—フエ二ルー 1, 3, 2—ォキサァザホスホリジンの製造 Preparation Example 2-1: Preparation of (5S) —2-chloro-3-methyl-5-phenyl-1,3,2-oxazaphospholidine
(S) —2—メチルアミノー 1—フエニルエタノール 3. 02 g (1 5. 0 mmol) 、 トリェチルァミン 5. 58ml (40. Ommol) のテトラヒドロフラン (TH F) (20. Oml) 溶液を 0°Cに冷却した三塩化リン 1. 75ml (20. Ommol) の T H F (20. Oml) 溶液に対して、 攪拌しつつ滴下し、 温度を室 温にして 30分間攪拌した。 生じた塩を、 グラスフィルタ一でアルゴン雰囲気 下ろ過し、 塩を TH F ( 1 Oml X 3) で洗浄した。 A solution of 3.02 g (15.0 mmol) of (S) -2-methylamino-1-phenylethanol and 5.58 ml of triethylamine (40.Ommol) in tetrahydrofuran (THF) (20.Oml) was brought to 0 ° C. To a cooled solution of 1.75 ml (20. Ommol) of phosphorus trichloride in THF (20. Oml) was added dropwise with stirring, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The resulting salt was filtered through a glass filter under an argon atmosphere, and the salt was washed with THF (1 Oml X 3).
ろ液を濃縮し、 残渣を減圧下蒸留することにより、 目的物 〔一般式 (VII) において、 R1-フエニル基、 R2=H、 R3=メチル基である化合物の 5 S体〕 2. 59 g (1 2. Ommol) を得た。 収率 60%。 89〜90°CZ0. 2画 H go 無色透明液体。 The filtrate is concentrated, and the residue is distilled under reduced pressure to give the desired product [5S-form compound of the general formula (VII) in which R 1 -phenyl group, R 2 = H, R 3 = methyl group] 2 59 g (1 2. Ommol) were obtained. Yield 60%. 89 ~ 90 ° CZ0.2 stroke H go Colorless transparent liquid.
■ 1H-NMR (300MHz, CDC I 3) δ : 7.54〜7.34 (m, 5Η), 5.83, ■ 1 H-NMR (300 MHz, CDC I 3 ) δ: 7.54-7.34 (m, 5Η), 5.83,
5.44 (br.br, 1H), 3.60〜3,42(m, 1H), 3.22〜3· 12(m, 1H) ,5.44 (br.br, 1H), 3.60-3,42 (m, 1H), 3.22-312 (m, 1H),
• 31 P - N M R (1 21 MHz, CDC I 3) δ ■■ 172.4(br), 171.3(br)。 • 31 P-NMR (121 MHz, CDC I 3 ) δ ■■ 172.4 (br), 171.3 (br).
製造例 2 - 2 : (5 R) —2—クロ口一 3—メチル一5—フエニル一 1 , 3, 2—ォキサァザホスホリジンの製造 Production Example 2-2: Production of (5 R) —2-chloro-1--3-methyl-1-phenyl-1,1,3,2-oxazaphospholidine
(R) —2—メチルアミノー 1—フエニルエタノール 2. 27 g (1 5. 0 國 ol) を用い、 製造例 2-1 と同様の手法により目的物 〔一般式 (VII) におい て、 R1 フエニル基、 R2=H、 R3=メチル基である化合物の 5 R体〕 を製造 した。 収率 65%。 81〜82°CZ0. 2mmHg。 無色透明液体。 (R)-2-methylamino-1-phenylpropyl ethanol 2. using 27 g (1 5. 0 kingdom ol), the desired product in the same manner as in Production Example 2-1 [Te general formula (VII) smell, R 1 5R form of a compound having a phenyl group, R 2 = H and R 3 = methyl group] was produced. Yield 65%. 81-82 ° CZ 0.2mmHg. Colorless transparent liquid.
' 1H— NMR (300MHz, CDC I 3) δ : 7· 55〜7.35 (m, 5Η), 5.84, ' 1 H-NMR (300 MHz, CDC I 3 ) δ: 7 · 55 to 7.35 (m, 5Η), 5.84,
5.46 (br.br, 1Η), 5.46 (br.br, 1Η),
3.58〜3.43(m, 1Η), 3· 22〜3· 13 (m, 1H) , 2.78 (d, 3JHP=16.5Hz, 3Η) 3.58 to 3.43 (m, 1Η), 3.22 to 13 (m, 1H), 2.78 (d, 3 J HP = 16.5Hz, 3Η)
■ 31 P - N M R (1 21 MHz, CDC I 3) δ : 172.4(br), 171.4(br)
製造例 2-3 : (2 R, 4 S, 5 R) —2—クロ口一 3—メチル一4, 5—ジ フエ二ルー 1 , 3, 2—ォキサァザホスホリジンの製造 ■ 31 P-NMR (1 21 MHz, CDC I 3 ) δ: 172.4 (br), 171.4 (br) Production Example 2-3: Production of (2R, 4S, 5R) —2-chloro-1,3-methyl-1,4,5-diphenyl 1,3,2-oxazazaphospholidine
( 1 R, 2 S) —2—メチルアミノー 1 , 2—ジフエニルエタノール 2. 2 7 g (1 0. Ommol) 、 卜リエチルァミン 2. 79ml (20. Ommol) の TH F (1 0. Oml) 溶液を、 0°Cに冷却した三塩化リン 0. 872ml (1 0. 0 mmol) の TH F (1 0. Oml) 溶液に対して、 攪拌レつつ滴下した後、 1時間 加熱環流した。 (1R, 2S) -2-Methylamino-1,2-diphenylethanol 2.27 g (10. Ommol), triethylamine 2.79ml (20. Ommol) solution in THF (10. Oml) Was added dropwise to a THF (10. Oml) solution of 0.872 ml (10.0 mmol) of phosphorus trichloride cooled to 0 ° C, and the mixture was refluxed with heating for 1 hour.
溶液を室温まで放冷し、 生じた塩を、 グラスフィルタ一でアルゴン雰囲気下 ろ過し、 塩を TH F (1 Oml X 2) で洗浄した後、 ろ液を減圧下濃縮して、 目 的物 〔一般式 (VII) において、 R1-フエニル基、 R2=フエニル基、 R3=メチ ル基である化合物の 2 R, 4 S, 5 R体〕 3. 1 7 g (1 0. Ommol) を得た。 収率定量的 (純度 92%) 。 乳白色固体。 The solution was allowed to cool to room temperature, and the resulting salt was filtered through a glass filter under an argon atmosphere.The salt was washed with THF (1 Oml X 2), and the filtrate was concentrated under reduced pressure. [2R, 4S, 5R form of a compound of the general formula (VII) wherein R 1 -phenyl group, R 2 = phenyl group, R 3 = methyl group] 3.17 g (10. ). Yield quantitative (purity 92%). Milky white solid.
■ 1H-NMR (30 O Hz, CDC I 3) δ 7.08〜7, 05 (m, 6Η) , 6.91- 6.81 (m, 4H) , 6.15 (d, 3J=8.3Hz, 1H), 4.64 (dd, 3JHH=8.3Hz, 3JHP=4.2Hz, 1 H) ' ■ 1 H-NMR (30 O Hz, CDC I 3 ) δ 7.08-7, 05 (m, 6Η), 6.91-6.81 (m, 4H), 6.15 (d, 3 J = 8.3 Hz, 1H), 4.64 ( dd, 3 J HH = 8.3Hz, 3 J HP = 4.2Hz, 1 H) '
2.64(d,3JHP=15.3Hz,3H) 2.64 (d, 3 J HP = 15.3Hz, 3H)
■ 31 P - N M R (1 21 MHz, CDC I 3) δ 171.70 ■ 31 P - NMR (1 21 MHz, CDC I 3) δ 171.7 0
<ホスホロアミダイ 卜 ( I ) の製造 > <Production of phosphoramidite (I)>
製造例 3-1 Production Example 3-1
5' - 0 - 〔ビス (4-メ トキシフエ二ル) フエニルメチル〕 -3' - 0 - 〔 (2S, 5S) -3 -メチル -5-フエニル- 1,3, 2-才キサザホスホリジン- 2-ィル〕 - 2' - 0- (tert -プチルジメチルシリル) ゥリジン [(Sp)- 19b]の製造 5'-0- [Bis (4-methoxyphenyl) phenylmethyl] -3'-0-[(2S, 5S) -3-Methyl-5-phenyl-1,3,2-year-old xazaphospholidine- 2-yl]-Production of 2'-0- (tert-butyldimethylsilyl) peridine [(Sp) -19b]
5' -0- 〔ビス (4 -メ トキシフエ二ル) フエニルメチル〕 -2' -0- (tert -プチ ルジメチルシリル) ゥリジン(4) (0.820 g, 1.5mmol) を、 ピリジン、 トルェ ンと繰り返し共沸することによって乾燥し、 THF (7.50 ml) 溶液とした。 5'-0- [Bis (4-methoxyphenyl) phenylmethyl] -2'-0- (tert-butyldimethylsilyl) pyridine (4) (0.820 g, 1.5 mmol) is repeated with pyridine and toluene. Dried by azeotrope to give a THF (7.50 ml) solution.
これにトリェチルァミン (1.05ml, 7.5画 I) を加え、 -78。 G に冷却した後、 アルゴン雰囲気下、 下記式及び表 1に示す(5S)-18bの 0.22M THF溶液を滴下し た。 反応混合物を室温で 30分間撹拌した後、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (75 ml) 及びクロ口ホルム (75 ml) を加えた。 有機相を分離後、 飽和炭酸水
素ナトリウム水溶液で洗浄 (75 mlx2) し、 集めた洗液をクロ口ホルム (75 ml 2) で抽出した。 To this was added triethylamine (1.05 ml, 7.5 I), and -78. After cooling to G, a 0.22 M THF solution of (5S) -18b shown in the following formula and in Table 1 was added dropwise under an argon atmosphere. After the reaction mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate (75 ml) and chloroform (75 ml) were added. After separating the organic phase, saturated carbonated water After washing with aqueous sodium hydrogen chloride solution (75 ml × 2), the collected washings were extracted with black form (75 ml 2).
集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 ろ過し、 減圧下濃縮した。 残 渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー 〔2.5x14cm, シリカゲル 40g, トル ェンー酢酸ェチルートリエチルァミン (10:1:0.2, v/v/v) 〕 で分離精製した。 目的物を含むフラクションを集め、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (100 ml) で洗浄後、 無水硫酸ナトリウムで乾燥、 ろ過し、 減圧下濃縮乾燥して、 下 記式及び表 1に示す (Sp)- 19b を収率 70%で得た。 無色非晶質。 The collected organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. The residue was separated and purified by silica gel column chromatography [2.5 × 14 cm, silica gel 40 g, toluene-ethyl acetate triethylamine (10: 1: 0.2, v / v / v)]. The fraction containing the target compound is collected, washed with a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate (100 ml), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to dryness. (Sp) -19b shown in the following formula and Table 1 Was obtained in a yield of 70%. Colorless amorphous.
1H NMR (300 MHz, CDC I 3) <5 8.80 (br, 1H), 8.20 (d, 3JHH = 8.1Hz, 1H), 7.42-7.18 (m, 13H), 6.84 (m, 4H), 5.80 (s, 1H), 5.58 (t, 3JHH = 6.6Hz 1H), 4.60 (m, 1H), 4.18 (br, 2H), 3.80 (s, 6H), 3.40 ( m, 2H), 1.40- 1.00 (m, 6H), 0.91 (t, 3JHH = 13.5Hz 9H), 2.22 (d, 3JHH = 13.5Hz 6H). 1H NMR (300 MHz, CDC I 3 ) <5 8.80 (br, 1H), 8.20 (d, 3 J HH = 8.1Hz, 1H), 7.42-7.18 (m, 13H), 6.84 (m, 4H), 5.80 (s, 1H), 5.58 (t, 3 J HH = 6.6Hz 1H), 4.60 (m, 1H), 4.18 (br, 2H), 3.80 (s, 6H), 3.40 (m, 2H), 1.40- 1.00 (m, 6H), 0.91 (t, 3 J HH = 13.5Hz 9H), 2.22 (d, 3 J HH = 13.5Hz 6H).
製造例 4 - 2 Production Example 4-2
5' -0-〔ビス (4-メチルフエニル) フエニルメチル〕 -3' -0 - 〔 (2R.4S.5R) 一 5—フエ二ル―テトラヒドロー 1H.3H -ピロ口 〔1,2-G〕 - 1,3,2 -才 キサザホスホリジン- 2-ィル〕 -2' -0- (tert-プチルジメチルシリル) ゥリジ ン [(Sp)-19d]の製造 5'-0- [Bis (4-methylphenyl) phenylmethyl] -3'-0-[(2R.4S.5R) 1-5-phenyl-tetrahydro-1H.3H-pyro mouth [1,2-G]- 1,3,2-year-old oxazaphospholidine-2-yl] -2'-0- (tert-butyldimethylsilyl) peridine [(Sp) -19d]
5' -0-〔ビス (4-メ トキシフエ二ル) フエニルメチル〕 -2' -0- (tert-プチ ルジメチルシリル)ゥリジン(4) (0.820g, 1.5mmo I ) を、 ピリジン、 トルエン と繰り返し共沸することによって乾燥し、 THF (7.50ml) 溶液とした。 5'-0- [Bis (4-methoxyphenyl) phenylmethyl] -2'-0- (tert-butyldimethylsilyl) peridine (4) (0.820 g, 1.5 mmo I) is repeated with pyridine and toluene Dried by azeotrope to give a THF (7.50 ml) solution.
これにトリェチルァミン (1.05 ml,7.5inmol) を加え、 一78° Gに冷却した後、 アルゴン雰囲気下、 下記式及び表 1に示す(5S)- 18dの 0.22 M THF溶液を滴下 した。 反応混合物を室温で 30分間撹拌した後、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶 液 (75ml) 及びク t]口ホルム (75ml) を加えた。 Triethylamine (1.05 ml, 7.5 inmol) was added to the mixture, and the mixture was cooled to 78 ° G. Then, under an argon atmosphere, a 0.22 M THF solution of (5S) -18d shown in the following formula and Table 1 was added dropwise. After the reaction mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate (75 ml) and chloroform (75 ml) were added.
有機相を分離後、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄 (75ml x2) し、 集 めた洗液をクロ口ホルム (75ml x2) で抽出した。 集めた有機相を無水硫酸ナ トリウムで乾燥後、 ろ過し、 減圧下濃縮した。 残渣をシリカゲルカラムクロマ トグラフィ一 〔2.5 x14cm, シリカゲル 40g, トルエン一酢酸ェチルートリエチ
ルァミン (10:1:0.2, v/v/v) 〕 で分離精製した。 After separating the organic phase, it was washed with a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate (75 ml x 2), and the collected washings were extracted with black hole form (75 ml x 2). The collected organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (2.5 x 14 cm, silica gel 40 g, toluene monoacetate ethyl acetate). Lumin (10: 1: 0.2, v / v / v)].
目的物を含むフラクションを集め、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 Collect the fractions containing the desired product and use a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution
(100ml) で洗浄後、 無水硫酸ナトリウムで乾燥、 ろ過し、 減圧下濃縮乾燥し て、 下記式及び表 1に示す(Sp)- 19d を収率 46%で得た。 無色非晶質。 (100 ml), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain (Sp) -19d shown in the following formula and Table 1 in a yield of 46%. Colorless amorphous.
1H NMR (300 MHz, C D C \ ζ) δ 9.82 (br, 1Η), 8.17 (d, 3JHH = 8.1Hz, 1H), 7.42-7.18 (m, 14H), 6.81 (m, 4H), 5.88 (s, 1H), 5.71 (d, 3JHH = 6.6Hz, 1H), 5.18 (d, 3JHH = 8.1Hz, 1H), 2.62 (br, 1H), 4.40 (s, 1H), 4.28 (d, 1H), 3.83 (br, 1H), 3. 8 (s, 6H), 3.60 (m, 3H), 3.20 (br, 1H), 2.39 (s 1H),' 2.64 (br, 2H), 1.21 (br, 1H),0.97 (s, 9H), 0.24 (s, 6H). 1H NMR (300 MHz, CDC \ ζ ) δ 9.82 (br, 1Η), 8.17 (d, 3 J HH = 8.1Hz, 1H), 7.42-7.18 (m, 14H), 6.81 (m, 4H), 5.88 ( s, 1H), 5.71 (d, 3 J HH = 6.6 Hz, 1H), 5.18 (d, 3 J HH = 8.1 Hz, 1H), 2.62 (br, 1H), 4.40 (s, 1H), 4.28 (d , 1H), 3.83 (br, 1H), 3.8 (s, 6H), 3.60 (m, 3H), 3.20 (br, 1H), 2.39 (s 1H), '2.64 (br, 2H), 1.21 ( br, 1H), 0.97 (s, 9H), 0.24 (s, 6H).
表 1 table 1
卜 Bird
R3 R4 R5 19a-da trans: cis R 3 R 4 R 5 19a-d a trans: cis
1 18a iPr H P 19a 87 ·· 13 1 18a iPr H P 19a 8713
2 18b CH3 H Ph 19b 94: 6 2 18b CH 3 H Ph 19b 94: 6
3 18c (CH2)3 H 19c 3 18c (CH2) 3 H 19c
4 18d (CH2)3 Ph 19d >99: 1 a : 3ュ? NMRで測定されたジァステレオマー比率 4 18d (CH 2 ) 3 Ph 19d> 99: 1 a: 3 ? Diastereomeric ratio measured by NMR
実施例 1 Example 1
下記反応式により、 ホスホロアミダイ ト (I) と、 ヌクレオシド (II) とを、 活性化剤 (III) を用いて縮合した後、 硫化反応を行った。
Pyridine(1°eqUiV) According to the following reaction formula, a phosphoramidite (I) and a nucleoside (II) were condensed using an activator (III), and then a sulfuration reaction was performed. Pyridine (1 ° eqUiV)
Ac20 ( 2 equi )
Ac 2 0 (2 equi)
(Sp . (Sp.
d.r. > 99:1* d.r.> 99: 1 *
(Sp)-7 (Sp)-9 d.r. > 99:1' d. >99:1* d.r. > 99:1* (Sp) -7 (Sp) -9 d.r.> 99: 1 'd.> 99: 1 * d.r.> 99: 1 *
* 31 P NMRによって測定されたジァステレオマ一比
Jiasutereoma one ratio measured by the * 31 P NMR
その後、 下記反応式により、 脱保護を行い 目的とするリボヌクレオチド類 縁体を得た。 Thereafter, deprotection was performed according to the following reaction formula to obtain a target ribonucleotide analog.
(Sp)-11 (fip)-11 (Sp) -11 (fip) -11
Sp:flp = >99:1 Sp:Rp = >1:99 Sp: flp => 99: 1 Sp: Rp => 1:99
逆相 HPLCにより測定。 逆相 HPLCにより測定。 Measured by reversed phase HPLC. Measured by reversed phase HPLC.
(flp)-3cから 37%, 6工程 (Sp)-3cから 32%, 6工程 上記反応における詳細な反応操作は、 以下のとおりである。 なお、 縮合反応 の反応追跡ならびに生成物のジァステレ'ォマ一比の測定は全て以下の要領で行 つた。 剛 Rサンプルチューブ中、 trans - 19b (50jumol)と 2' ,·3' -0 -フエノキ シァセチルゥリジン (50 mol) を、 P205上で 12時間真空乾燥し、 MS 3Aで 8 時間乾燥した N - (シァノメチル) ピロロリジニゥム トリフルォロロンメタン スルホネート(27a) (400 1, 100 mol) の 0.25Mァセトニトリル溶液と (flp) -3c to 37%, 6 steps (Sp) -3c to 32%, 6 steps The detailed reaction operation in the above reaction is as follows. The reaction tracking of the condensation reaction and the measurement of the diastereomer ratio of the product were all performed in the following manner. During Tsuyoshi R sample tube, trans - 19b (50jumol) and 2 ', - 3' -0 - Fuenoki Xia cetyl © lysine (50 mol), and vacuum-dried for 12 hours over P 2 0 5, 8 hours MS 3A 0.25 M solution of N- (cyanomethyl) pyrrolidinium trifluorofluorone methanesulfonate (27a) (400 1, 100 mol) in acetonitrile
CD3CN(100ju I) をアルゴン雰囲気下加えた。 その 3分後、 NMRによる積算を開 始し、 反応のジァステレオマ一比は NMRシグナルの積分比によって決定した。 CD 3 CN (100ju I) was added under an argon atmosphere. Three minutes later, NMR integration was started and the diastereomeric ratio of the reaction was determined by the integral ratio of the NMR signals.
(化合物 3→6) (Compound 3 → 6)
NMRサンプルチューブ中、 trans- 19b (0.0520 g , 50 mo I ) と 2' ,3' - 0-フ エノキシァセチルゥリジン (0.0256£,50^υηιοΙ) を Ρ205上で 12時間真空乾燥し. MS 3Αで 8時間乾燥した Ν— (シァノメチル) ピロロリジニゥム トリフロロ口
メタンスルホネート(27a) (400 1, 100 mol) の 0.25Mァセトニトリル溶液と CD3CN (100 ju I) をアルゴン雰囲気下加えた。 During NMR sample tube, trans- 19b (0.0520 g, 50 mo I) and 2 ', 3' - 0 - off enoki Xia cetyl © lysine (0.0256 £, 50 ^ υηιοΙ) 12 hours in a vacuum drying at [rho 2 0 5 on Α— (cyanomethyl) pyrrolidinium trifluorofluoroester dried for 8 hours with MS 3Α A 0.25 M solution of methanesulfonate (27a) (400, 100 mol) in acetonitrile and CD 3 CN (100 ju I) were added under an argon atmosphere.
(化合物 6→7) (Compound 6 → 7)
これを 15分間良くかき混ぜた後に、 ピリジン (43 I, 0.5瞧 01 ) と無水酢酸 (10jU I, 0.1國 ol) をマイクロシリンジで加えて、 化合物 6を 7ベと変換した。 After stirring this well for 15 minutes, pyridine (43 I, 0.5 瞧 01) and acetic anhydride (10 jU I, 0.1 country ol) were added with a microsyringe to convert compound 6 to 7.
(化合物 7→8) (Compound 7 → 8)
更にこの溶液中に Beaucage reagent (0.0120g, 0.06mmo I ) を加え、 化合物 7の硫化を行った。 Further, Beaucage reagent (0.0120 g, 0.06 mmo I) was added to this solution to sulfide the compound 7.
(化合物 8→9) (Compound 8 → 9)
ここで、 NMRサンプル管から 50ml細口のナスフラスコに反応溶液を移し変え、 3ml のピリジンで洗いこみを行った後、 これにアンモニア水一エタノール (3:1, v/v) 混合溶液 20m I を加え、 密栓をして 60°Cで 4時閩加熱処理を行った。 Here, the reaction solution was transferred from the NMR sample tube to a 50 ml narrow-necked eggplant flask, washed with 3 ml of pyridine, and then added with 20 ml of a mixed solution of ammonia water / ethanol (3: 1, v / v). In addition, it was sealed and heat-treated at 60 ° C for 4 hours.
加熱後に、 溶媒を減圧下留去し、 0.1M TEAAバッファ一 5ml とジクロ口メタ ン 5ml を加え、 化合物 9を有機相へ回収し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥、 ろ過 し、 減圧下濃縮乾燥を行った。 After heating, the solvent was distilled off under reduced pressure, and 5 ml of 0.1 M TEAA buffer and 5 ml of dichloromethane were added.Compound 9 was recovered in the organic phase, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated and dried under reduced pressure. Was.
(化合物 9→10) (Compound 9 → 10)
十分乾燥させた化合物 9に対し、 3HF- ξ1:3Ι\Ι 1.5ml を neatで加え、 2時間撹 拌した後に、 0.1M AAバッファ一 3ml とメタノール 3ml を加え、 エーテル 3ml を用いて洗浄したのち、 水相を回収し減圧下濃縮乾燥を行い、 更に凍結乾燥を 繰り返すことにより、 脱塩を行った。 To thoroughly dried Compound 9, 3HF- ξ1: added neat to 3 iota \ iota 1.5 ml, after 2 hours撹拌added 0.1 M AA buffer one 3ml of methanol 3ml, washed with ether 3ml Thereafter, the aqueous phase was collected, concentrated and dried under reduced pressure, and further freeze-dried to desalinate.
(化合物 10→11) (Compound 10 → 11)
凍結乾燥を行った後の化合物 10に 80%酢酸水溶液 20ml を加え、 30分間室 温で撹拌した後、 減圧下濃縮乾燥を行った。 80%酢酸を留去した後、 ジェチル エーテル 3ml を用いて洗浄した後、 蒸留水を用いて抽出を行った。 回収した水 相を減圧下濃縮乾燥し、 更に凍結乾燥を繰り返し、 脱塩を行った後、 逆相 HPLG 及び UVによる分析を行った。 その結果、 (Sp)-11 を、 縮合からのトータル収 率 37%で得た。 To the compound 10 after freeze-drying, 20 ml of an 80% aqueous acetic acid solution was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, and then concentrated and dried under reduced pressure. After 80% acetic acid was distilled off, the residue was washed with 3 ml of getyl ether, and extracted with distilled water. The collected aqueous phase was concentrated and dried under reduced pressure, freeze-dried repeatedly, desalted, and analyzed by reversed-phase HPLG and UV. As a result, (Sp) -11 was obtained with a total yield of 37% from the condensation.
実施例 2
下記の各反応工程 (1 ) 〜 (4) 及び (5) の反応 (下記反応式) により、 オリゴマー (XIII) を製造した。 Example 2 Oligomer (XIII) was produced by the following reactions (1) to (4) and (5) (the following reaction formula).
( 1 ) 縮合反応 (1) Condensation reaction
固相担体 [highly cross- linked polystyrene (HCP)] に結合したリボヌクレ 才シド 〔一般式 ( I ) 〕 immol に対して 20当量のモノマ一ユニット 〔一般式 (II) 、 (III) のュニット〕 (0.2 Ml) 、 50当量の活性化剤 (N -シァノメチル アンモニゥ厶塩, 0.5 M) をァセトニトリル中で 90秒間反応させた。 反応終了 後、 ァセトニトリルで洗浄した。 Ribonucleic acid side bound to solid support [highly cross-linked polystyrene (HCP)] [General formula (I)] 20 equivalents of monomer per immol [Unit of general formula (II), (III)] ( 0.2 Ml) and 50 equivalents of an activator (N-cyanomethylammonium salt, 0.5 M) were reacted in acetonitrile for 90 seconds. After the completion of the reaction, the resultant was washed with acetonitrile.
(2) キャップ化反応 (ァセチル化反応) (2) Capping reaction (acetylation reaction)
固相担体に結合したリボヌクレオチドを無水酢酸: N -メチルイミダゾ一ル: THF=1 : 2 : 7の混合溶液で 60秒間処理し, 未反応の 5' 水酸基及び遊離した 不斉補助基のアミノ基をァセチル化した。 応終了後, ァセトニトリルで洗浄 した。 The ribonucleotide bound to the solid support is treated with a mixed solution of acetic anhydride: N-methylimidazole: THF = 1: 2: 7 for 60 seconds, and the unreacted 5 ′ hydroxyl group and the amino group of the released asymmetric auxiliary group are treated. The group was acetylated. After completion of the reaction, it was washed with acetonitrile.
(3) 硫化反応 (3) Sulfidation reaction
固相担体に結合したリボヌクレオチドを 50当量の Beaucage試薬 (0.5 M) のァセトニトリル溶液で 60秒間処理し, ホスファイ ト中間体を硫化した。 反 応終了後, ァセトニトリルで洗浄した。 The ribonucleotide bound to the solid support was treated with 50 equivalents of Beaucage reagent (0.5 M) in acetonitrile solution for 60 seconds to sulfide the phosphite intermediate. After the reaction was completed, the substrate was washed with acetonitrile.
(4) 脱トリチル化反応 (4) Detritylation reaction
固相担体に結合したリボヌクレオチドを 3 ¾トリクロ口酢酸のジクロロメタ — ン溶液で 60秒間処理し, 5' 末端の DMTr基を除去した。 反応終了後、 ジクロ ロメタン、 次にァセトニトリルで洗浄した。 The ribonucleotide bound to the solid support was treated with a solution of trichloromouth acetate in dichloromethane for 60 seconds to remove the DMTr group at the 5 'end. After the completion of the reaction, the resultant was washed with dichloromethane and then with acetonitrile.
(5) 鎖延長反応と、 脱保護反応及び精製 (5) Chain extension reaction, deprotection reaction and purification
上記の (1 ) から (4) の反応操作を繰り返し、 オリゴリボヌクレオチド鎖 を固相担体上で延長した。 The above-mentioned reaction operations (1) to (4) were repeated to extend the oligoribonucleotide chain on the solid support.
目的とする鎖長のオリゴリボヌクレオチド誘導体が固相担体上に合成できた ら、 固相担体を 25%アンモニア水:エタノール (3:1, v/v) で 60 ° Cで 15時 間反応させて, 塩基部及びリン酸部位の保護基を除去した。 このとき, 3' 末 端の水酸基の保護基と固相担体からのオリゴマーの切り出しも同時に進行した。
固相担体を濾過して除き、 濾液を減圧下濃縮乾燥後、 Et3N ' 3HF (100当量) を加え、 室温で 2時間反応させて 2' 水酸基の保護基である TBDMS基を除去し た。 反応終了後、 減圧下 Et3M ' 3HF を留去して乾燥後、 水 (1ml) に溶解して. エーテル (1 mi x 3回) で洗浄した。 水層を減圧下で濃縮乾燥した後に、 水 After the oligoribonucleotide derivative of the desired chain length has been synthesized on the solid support, the solid support is reacted with 25% aqueous ammonia: ethanol (3: 1, v / v) at 60 ° C for 15 hours. Thus, the protecting groups at the base moiety and the phosphate moiety were removed. At this time, the 3'-terminal hydroxyl-protecting group and the extraction of the oligomer from the solid support also proceeded at the same time. The solid phase carrier was removed by filtration, the filtrate was concentrated and dried under reduced pressure, Et 3 N ′ 3HF (100 equivalents) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours to remove the TBDMS group which is a protecting group for the 2 ′ hydroxyl group. . After completion of the reaction, Et 3 M ′ 3HF was distilled off under reduced pressure, dried, dissolved in water (1 ml), and washed with ether (1 mix × 3 times). After concentrating and drying the aqueous layer under reduced pressure,
( 1ml) に溶解し、 逆相 HPLGによって精製して、 収率 20— 70%の範囲で目的 物を得た。 (1 ml) and purified by reversed-phase HPLG to obtain the desired product in a yield of 20-70%.
実施例 3 Example 3
〔スキーム 1 :キラル不斉補助基としての 1,2—ァミノアルコールの合成〕 [Scheme 1: Synthesis of 1,2-amino amino alcohol as chiral chiral auxiliary]
3a (R = Ph) 88% 4a (R = Ph) 60% 3b (R = Me) 98% 4b (R = Me) 88% 3a (R = Ph) 88% 4a (R = Ph) 60% 3b (R = Me) 98% 4b (R = Me) 88%
(S) -プロリン- N-ェチルカルバメート(1)の合成 Synthesis of (S) -proline-N-ethyl carbamate (1)
10規定の NaOH水溶液 (50 ml)に S- proline (5.75 g, 49.9 画 ol)を加え、 0 °Cに冷却し、 攪拌しつつ 40分間かけて chloroformic acid ethyl esther (5.75 ml, 60.4 剛 o I)を、 pH 9 - 10に保ちつつ、 滴下した。 室温で 3.5時間攪 拌した後、 ジクロロメタン (30 ml)を加え、 1規定の HGI水溶液 (360 ml)を加 えて pH 1にしたのち、 ジクロロメタン (300 ml X 10)で抽出し、 無水硫酸ナト リウ厶で乾燥し、 濾過レ、 減圧下濃縮して 1 (9.19 g, 98%)を得た。 無色透明 液体。 S-proline (5.75 g, 49.9 fractions) was added to a 10N aqueous NaOH solution (50 ml), cooled to 0 ° C, and stirred with chloroformic acid ethyl esther (5.75 ml, 60.4 g o I) for 40 minutes. ) Was added dropwise while maintaining the pH at 9-10. After stirring at room temperature for 3.5 hours, dichloromethane (30 ml) was added, and a 1N aqueous HGI solution (360 ml) was added to adjust the pH to 1, followed by extraction with dichloromethane (300 ml × 10) and anhydrous sodium sulfate. The residue was filtered and concentrated under reduced pressure to give 1 (9.19 g, 98%). Colorless transparent liquid.
1H NMR (CDGIg) δ 10.85 - 10.42 (br, 1H), 4.41 - 4.30 (m, 1H), 4.22 - 4.15 (m, 2H), 3.60 - 3.37 (in, 2Η), 2.32一 2.20 (m, 1H), 2.17 - 2.05 (m, 1H), 1.98 - 1.90 (m, 2H), 1.31- 1.19 (m, 3H); IR (NaCI, cm-1) 3459 (一 C00H) , 1724 (-C00H) , 1682 (N- C=0)。 1 H NMR (CDGIg) δ 10.85-10.42 (br, 1H), 4.41-4.30 (m, 1H), 4.22-4.15 (m, 2H), 3.60-3.37 (in, 2Η), 2.32-2.20 (m, 1H ), 2.17-2.05 (m, 1H), 1.98-1.90 (m, 2H), 1.31-1.19 (m, 3H); IR (NaCI, cm- 1 ) 3459 (one C00H), 1724 (-C00H), 1682 (N-C = 0).
(S) -プロリン- N -ェチルカルバメ一トメチルエステル(2)の合成 Synthesis of (S) -proline-N-ethyl carbamethyl methyl ester (2)
Ar雰囲気下、 S-prol ine-N-ethyl carbamate 1 (9.19 g, 49.1 瞻 I)にメタ ノール (150 ml)を加え、 0 °Cに冷却し、 攪拌しつつ thionyl chloride (5.40 ml, 74.3 raiol)を加えた。 室温で 5時間攪拌したのち、 減圧下、 メタノールを 留去し、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(100 ml)を加え、 クロ口ホルム(100 ml x3)で抽出し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 濾過し、 減圧下濃縮して 2 (9.80 g, 99%)を得た。 無色透明液体。 Under Ar atmosphere, add methanol (150 ml) to S-proline-N-ethyl carbamate 1 (9.19 g, 49.1 Cheom I), cool to 0 ° C, and stir with thionyl chloride (5.40 ml, 74.3 raiol). ) Was added. After stirring at room temperature for 5 hours, methanol was distilled off under reduced pressure, a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate (100 ml) was added, and the mixture was extracted with chloroform (100 ml x 3), dried over anhydrous sodium sulfate, and filtered. Concentration under reduced pressure gave 2 (9.80 g, 99%). Colorless transparent liquid.
1H NMR (CDC 13) δ 4.29 - 4.20 (m, 1H), 4.08 - 3,98 (m, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.56 - 3.35 (m, 2H) , 2.21 - 2.09 (m, 1H), 1.94 - 1.82 (m, 3H), 1.21 - 1.10 (m, 3H); IR (NaCI, cm"1) 1751 (COOMe), 1702 (N-C=0) 0 1 H NMR (CDC 1 3) δ 4.29 - 4.20 (m, 1H), 4.08 - 3,98 (m, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.56 - 3.35 (m, 2H), 2.21 - 2.09 (m , 1H), 1.94-1.82 (m, 3H), 1.21-1.10 (m, 3H); IR (NaCI, cm " 1 ) 1751 (COOMe), 1702 (NC = 0) 0
N-ェチルカルバメート-(2S)- , a-ジフエニル (ピロリジン- 2-ィル) メタ
ノール(3a)の合成 N-ethyl carbamate- (2S)-, a-diphenyl (pyrrolidine-2-yl) meta Synthesis of knol (3a)
(S) - Pro l ine - N - ethyl carbamate methyl esther 2 (5.03 g, 25.0 瞻1)を トルエンで繰り返し共沸を行い、 THF (50 ml)に溶かし、 0 °Cに冷却した。 攪 拌しつつ、 THF (96.2 ml)に溶かした PhMgBr (18.0 ml, 100.0 議 ol)を加え、 0 °Cで 3時間攪拌した。 飽和塩化アンモニゥム水溶液 (50 ml), 飽和塩化ナト リウム水溶液(50 ml)を加え、 クロ口ホルム(50 mi x 3)で抽出し、 無水硫酸ナ トリウムで乾燥し、 濾過し、 減圧下濃縮したのち、 へキサン 30 ml を加え、 激 しく攪拌し、 吸引濾過し、 真空乾燥して 3a (7.22 g, 88%)を得た。 無色非晶質。 ^ NMR (CDCI3) δ 7.40 - 7.12 (m, 10H), 4.94 — 4.87 (m, 1H), 4.19 - 3.98 (m, 2H), 3.45 - 3.35 (m, 2H), 2.17 - 2.02 (m, 1H), 1.99 - 1.88 (m, 1H), 1.55 - 1.42 (m, 1H), 1.25一 1.22 (t, J = 7.2 Hz, 3H); IR (NaCI, cm"1) 3375 (-OH), 1680 (N-G=0)。 (S) -Proline-N-ethyl carbamate methyl esther 2 (5.03 g, 25.0 chemo 1) was repeatedly azeotroped with toluene, dissolved in THF (50 ml), and cooled to 0 ° C. PhMgBr (18.0 ml, 100.0 ml) dissolved in THF (96.2 ml) was added with stirring, and the mixture was stirred at 0 ° C for 3 hours. A saturated aqueous solution of ammonium chloride (50 ml) and a saturated aqueous solution of sodium chloride (50 ml) were added, and the mixture was extracted with chloroform (50 mix 3), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. Then, 30 ml of hexane was added, and the mixture was vigorously stirred, filtered by suction, and dried in vacuo to obtain 3a (7.22 g, 88%). Colorless amorphous. ^ NMR (CDCI 3 ) δ 7.40-7.12 (m, 10H), 4.94-4.87 (m, 1H), 4.19-3.98 (m, 2H), 3.45-3.35 (m, 2H), 2.17-2.02 (m, 1H ), 1.99-1.88 (m, 1H), 1.55-1.42 (m, 1H), 1.25-1.22 (t, J = 7.2 Hz, 3H); IR (NaCI, cm " 1 ) 3375 (-OH), 1680 ( NG = 0).
N -ェチルカルバメート-(2S)- -メチル (ピロリジン - 2 -ィル) エタノール (3b) の合成 Synthesis of N-ethyl carbamate- (2S) -methyl (pyrrolidine-2-yl) ethanol (3b)
Ar雰囲気下、 マグネシウム(4.80 g, 197.3 mmol)にエーテル (100 ml)を加 え、 0 °Cに冷却し、 攪拌しつつ、 methyl iodide (12.5 ml, 200.7 園 ol)を溶 かしたエーテル (50 ml)を加えた。 室温で 45 分攪拌したのち、 0 °Cに冷却し、 攪拌しつつ、 (S)-Prol ine- N-ethyl carbamate methyl esther 2 (9.80 g, ' 48.7 mmol)を溶かしたエーテル (50 ml)を加えた。 0 °Cで 1.5時間攪拌したの ち、 飽和塩化アンモニゥム水溶液 (75 ml), 飽和塩化ナトリウム水溶液 (75 ml) を加え、 ジクロロメタン(150 ml x3)で抽出し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 濾過し、 減圧下濃縮して 3b (9.60 g, 98%)を得た。 黄色透明液体。 Under an Ar atmosphere, add ether (100 ml) to magnesium (4.80 g, 197.3 mmol), cool to 0 ° C, and stir while dissolving methyl iodide (12.5 ml, 200.7 sol) in ether (50 ml). ml) was added. After stirring at room temperature for 45 minutes, the mixture was cooled to 0 ° C, and with stirring, ether (50 ml) in which (S) -Proline-N-ethyl carbamate methyl esther 2 (9.80 g, '48 .7 mmol) was dissolved was added. added. After stirring at 0 ° C for 1.5 hours, a saturated aqueous solution of ammonium chloride (75 ml) and a saturated aqueous solution of sodium chloride (75 ml) were added, extracted with dichloromethane (150 ml x 3), dried over anhydrous sodium sulfate, and filtered. After concentration under reduced pressure, 3b (9.60 g, 98%) was obtained. Yellow transparent liquid.
1H NMR (CDCI3) δ 5.72 - 5.66 (br, 1H), 4.09 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 3.84 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 3.72一 3.62 (m, 1H), 3.20 - 3.11 (m, 1H), 2.03 - 1.94 (m, 1H), 1.84 - 1.76 (m, 1H), 1.69 - 1.51 (m, 2H), 1.24 - 1.20 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.11 (s, 3H), 1.03 (s, 3H); IR (NaCI, cm"1) 3391 (- OH), 1670 (N - G=0)。 1H NMR (CDCI 3 ) δ 5.72-5.66 (br, 1H), 4.09 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 3.84 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 3.72-3.62 (m, 1H), 3.20 -3.11 (m, 1H), 2.03-1.94 (m, 1H), 1.84-1.76 (m, 1H), 1.69-1.51 (m, 2H), 1.24-1.20 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.11 (s, 3H), 1.03 (s, 3H); IR (NaCI, cm " 1 ) 3391 (-OH), 1670 (N-G = 0).
(2S)- of, ひ-ジフエニル (ピロリジン- 2 -ィル) メタノール (4a) の合成
N - ethyl carbamate- (2S)- a, a -di phenyl (pyrrol i d i η-2-y I ) methano I 3a (6.51 g, 20.0 raiol)にメタノール (40 ml)を加え、 攪拌しつつ、 水酸化カリ ゥム (11.2 g, 200.0 画 ol)を加えた。 昇温し、 攪拌しつつ 4時間加熱還流し たのち、 減圧下、 メタノールを留去し、 水 50 ml を加え、 ジクロロメタン (50 ml 2)で抽出し、 飽和食塩水 (100ml X 2)で洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで 乾燥し、 濾過し、 減圧下濃縮した。 得られた結晶にへキサン (50 ml)を加え、 激しく攪拌したのち、 吸引濾過を行い、 白色粉末を得た。 得られた白色粉末を、 1H N R (GDGI3)で測定したところ、 ケミカルシフトが文献記載のものと異なる こと、 13C剛 R (CDGI3)で測定したところ、 炭素数が 14であること、 さらに得ら れた白色粉末 (5 mg)をマンデル酸 (3 mg)との塩を形成させ、 1H NMR (CDGI3) で測定したところ、 シグナルがシフトしなかったことから、 得られた白色粉末 !ま目的物 4aではなく、 ォキサゾリジノン環を形成していると判断した。 そこ で、 全て回収し、 同様の条件で 6時間反応をおこなった。 精製も同様に行い、 4a (2.99 g, 60%)を得た。 無色非晶質。 Synthesis of (2S) -of, H-diphenyl (pyrrolidine-2-yl) methanol (4a) N-ethyl carbamate- (2S)-a, a-diphenyl (pyrrol idi η-2-y I) methano I 3a (6.51 g, 20.0 raiol) Potassium (11.2 g, 200.0 ol) was added. After heating and refluxing for 4 hours while stirring, methanol was distilled off under reduced pressure, 50 ml of water was added, extracted with dichloromethane (50 ml 2), and washed with saturated saline (100 ml x 2). The mixture was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. Hexane (50 ml) was added to the obtained crystals, and the mixture was vigorously stirred, followed by suction filtration to obtain a white powder. When the obtained white powder was measured with 1 HNR (GDGI 3 ), the chemical shift was different from that described in the literature.When measured with 13 C rigid R (CDGI 3 ), the carbon number was 14, Further, the obtained white powder (5 mg) was allowed to form a salt with mandelic acid (3 mg), and measured by 1 H NMR (CDGI 3 ). Powder! In addition, it was determined that an oxazolidinone ring was formed instead of the target product 4a. There, they were all recovered and reacted under the same conditions for 6 hours. Purification was performed in the same manner to obtain 4a (2.99 g, 60%). Colorless amorphous.
1H NMR (CDCI3) δ 7.57 - 7.11 (m, 10H), 4.26 — 4.21 (m, 1H), 3.06 - 2,89 (m, 2H), 1.78 - 1.52 (m, 4H); IR (KBr, cm -1) 3350 (- OH, NH)。 1 H NMR (CDCI 3 ) δ 7.57-7.11 (m, 10H), 4.26 — 4.21 (m, 1H), 3.06-2,89 (m, 2H), 1.78-1.52 (m, 4H); IR (KBr, cm- 1 ) 3350 (-OH, NH).
(2S)—ひ-メチル (ピロリジン- 2 -ィル) エタノール (4b) の合成 Synthesis of (2S) -Hymethyl (pyrrolidine-2-yl) ethanol (4b)
N-ethy I carbamate- (2S)- a? -methyl (pyrrol i d i η-2-y I ) ethano I 3b (9.60 g, 48.7 mmol)にメタノール (50 ml)を加え、 0 °Cに冷却し、 攪拌しつつ、 水酸化 カリウム (27.0 g, 481.1 mmol)を加えた。 昇温し、 攪拌しつつ 4時間加熱還 流したのち、 減圧下、 メタノールを留去し、 水 50 ml を加え、 pHlになるまで 濃塩酸を加え、 エーテル (100 ml x2)で洗浄し、 生じた沈殿物もともに水相を 回収した。 pH 12になるまで水酸化カリウムを加え、 沈殿物を吸引濾過により 取リ除いたのち、 ジクロロメタン(200 ml X 6)で抽出し、 無水硫酸ナトリゥム で乾燥し、 濾過し、 減圧下濃縮して 4b (5.54 g, 88%)を得た。 黄色針状結晶。 1H 剛 R (CDCI3) δ 3.03 - 2.87 (m, 3H), 2.66 - 2.48 (br, 2H), 1.80 - 1.58 (in, 4Η), 1.16 (s, 3H), 1.13 (s, 3H); IR (KBr, cm—1) 3376 (-0H, NH) 0 〔スキーム 2 :ホスフイチル化剤の合成〕
N-ethy I carbamate- (2S)-a? -Methyl (pyrrol idi η-2-y I) ethano I 3b (9.60 g, 48.7 mmol), add methanol (50 ml), cool to 0 ° C, With stirring, potassium hydroxide (27.0 g, 481.1 mmol) was added. After heating and refluxing for 4 hours while stirring, methanol was distilled off under reduced pressure, 50 ml of water was added, concentrated hydrochloric acid was added until the pH became 1 and the mixture was washed with ether (100 ml x 2) to produce The aqueous phase was recovered from the precipitate. Potassium hydroxide was added until pH 12, the precipitate was removed by suction filtration, extracted with dichloromethane (200 ml x 6), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. (5.54 g, 88%). Yellow needle crystals. 1 H Go R (CDCI 3 ) δ 3.03-2.87 (m, 3H), 2.66-2.48 (br, 2H), 1.80-1.58 (in, 4Η), 1.16 (s, 3H), 1.13 (s, 3H); IR (KBr, cm- 1 ) 3376 (-0H, NH) 0 [Scheme 2: Synthesis of phosphitylating agent]
5a ( 5a (
5b ( 5b (
(4S) -2-クロロテトラヒドロ- 1H, 3H -ピロ口 [1 , 2 - G]- 5, 5 -ジフェ二ルー 1 , 3, 2- ォキサァザホスホリジン (5a) の合成 Synthesis of (4S) -2-chlorotetrahydro-1H, 3H-pyrro [1, 2-G] -5,5-diphenyl-1,3,2-oxazaphospholidine (5a)
(2S) - , - di phenyl (pyrrol id in - 2 - yl) methanol 4a (1.27 g, 5 mmol) ¾: 卜 ルェンを用いて共沸乾燥し、 トルエン 2.5 ml に溶かした。 溶液に N- methylmorphol ine (1.1 ml, 10.0 画 ol)を加え、 この混合溶液を Ar 雰囲気下、 phosphorus trichloride (0.44 ml, 5.0 mmol)のトルエン溶液に対し、 攪拌し つつ 0 °Cで滴下した。 反応混合物を室温で 30分攪袢したのち、 生じた塩を Ar 雰囲気下、 - 78°Cで濾別し、 Ar雰囲気下、 濾液を減圧濃縮し、 5a (1.79 g, crude)を得た。 (2S)-,-diphenyl (pyrrol id in-2-yl) methanol 4a (1.27 g, 5 mmol) ¾: The residue was azeotropically dried with toluene and dissolved in 2.5 ml of toluene. N-methylmorpholine (1.1 ml, 10.0 fractions) was added to the solution, and this mixed solution was added dropwise to a toluene solution of phosphorus trichloride (0.44 ml, 5.0 mmol) at 0 ° C. with stirring under an Ar atmosphere. After stirring the reaction mixture at room temperature for 30 minutes, the resulting salt was filtered off at -78 ° C under an Ar atmosphere, and the filtrate was concentrated under reduced pressure under an Ar atmosphere to obtain 5a (1.79 g, crude).
1H NMR (CDGI3) δ 7.57 - 7.01 (m, 10H), 4.68 — 4.51 (m, 1H), 3.44 - 1 H NMR (CDGI 3 ) δ 7.57-7.01 (m, 10H), 4.68 — 4.51 (m, 1H), 3.44-
3.35 (m, 1H), 3.17一 3,07 (m, 1H), 2.06一 1.89 (m, 2H), 1.67一 1.24 (m,3.35 (m, 1H), 3.17-3,07 (m, 1H), 2.06-1.89 (m, 2H), 1.67-1.24 (m,
2H) ; 31P NMR (121 MHz, CDCI3) δ 158.2 · (71%) , 173.6 (29%) 0 2H); 31 P NMR (121 MHz, CDCI 3 ) δ 158.2 · (71%), 173.6 (29%) 0
(4S)-2 -クロロテトラヒドロ- 1H, 3H -ピロ口 [1, 2-c] - 5, 5-ジメチルー 1, 3, 2-2- ォキサァザホスホリジン (5b) の合成 Synthesis of (4S) -2-chlorotetrahydro-1H, 3H-pyro [1,2-c] -5,5-dimethyl-1,3,2-2-oxazaphospholidine (5b)
(2S)-oi -methyl (pyrrol idin-2-yl)ethanol 4b (1.95 g, 15.1 mmol)をトル ェンを用いて共沸乾燥し、 トルエン 5.0 ml に溶かした。 溶液に N - methylmorphol ine (3.3 ml, 29.8 mmol)を加え、 この混合溶液を Ar 雰囲気下、 phosphorus trichloride (1.4 ml, 16.0 mmol)のトルエン溶液に対し、 攪拌し つつ 0 °Cで滴下した。 反応混合物を室温で 30分攪拌したのち、 生じた塩を Ar 雰囲気下、 - 78°Cで濾別し、 Ar雰囲気下、 濾液を減圧濃縮した。 減圧蒸留 (bp. 55 。C/ 0.2 mmHg)により精製を試みたが単離にはいたらず、 5b (0.85 g,
crude)を得た。 無色透明液体。 · (2S) -oi-methyl (pyrrol idin-2-yl) ethanol 4b (1.95 g, 15.1 mmol) was azeotropically dried using toluene and dissolved in 5.0 ml of toluene. N-methylmorpholine (3.3 ml, 29.8 mmol) was added to the solution, and this mixed solution was added dropwise to a toluene solution of phosphorus trichloride (1.4 ml, 16.0 mmol) at 0 ° C. with stirring under an Ar atmosphere. After stirring the reaction mixture at room temperature for 30 minutes, the resulting salt was filtered off at -78 ° C under an Ar atmosphere, and the filtrate was concentrated under reduced pressure under an Ar atmosphere. Purification was attempted by vacuum distillation (bp. 55; C / 0.2 mmHg). crude). Colorless transparent liquid. ·
1H NMR (CDCIg) δ 3.70 - 3.61 (m, 1H), 3.53 - 3.40 (m, 1H), 3.19 - 3.05 (m, 1H), 2.21 - 2.04 (m, 2H), 1.84 - 1.71 (m, 2H), 1.53 (s, 3H), 1.37 (s, 3H); 31P NMR (121 MHz, CDGI3) δ 171.0 (35%) , 164.5 (26%), 161.6 (39%)。 1 H NMR (CDCIg) δ 3.70-3.61 (m, 1H), 3.53-3.40 (m, 1H), 3.19-3.05 (m, 1H), 2.21-2.04 (m, 2H), 1.84-1.71 (m, 2H ), 1.53 (s, 3H), 1.37 (s, 3H); 31 P NMR (121 MHz, CDGI 3 ) δ 171.0 (35%), 164.5 (26%), 161.6 (39%).
〔スキーム 3 :ォキサァザホスホリジン誘導体の合成〕 [Scheme 3: Synthesis of oxazaphospholidine derivative]
5 temp., time 収率 5 temp., Time yield
(Sp)-7: (flP)-7* (Sp) -7: (flP) -7 *
7a (R = Ph) 3.3 equiv reflux 15 h >99: 1 70% 7a (R = Ph) 3.3 equiv reflux 15 h> 99: 1 70%
7b (R = Wle) 2.4 equiv Π2 h 98: 2 36% 7b (R = Wle) 2.4 equiv Π2 h 98: 2 36%
*31P MRにより測定 * Measured by 31 P MR
5' - 0- (tert -プチルジフエニルシリル)- 3' - 0- [(2S, 5R)- 5, 5-ジフエ二ル-テ トラヒドロ- 1H, 3H-ピロ口 [1,2-c]-1,3, 2- 2-才キサァザホスホリジン- 2 -ィル] チミジン (7a) の合成 5'-0- (tert-butyldiphenylsilyl) -3'-0-[(2S, 5R) -5,5-diphenyl-tetrahydro-1H, 3H-pyrro [1,2-c] Synthesis of [1,3,2-2-Year-Oxazaphospholidine-2-yl] thymidine (7a)
5' -0- (tert-Buty I d i pheny I s i I y I ) thym i d i ne 6 (722.3 mg, 1.5 mmol)をピ リジン、 トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、 THF溶液とした。 これに Et3N (1, 1 ml, 7.9 mmol)を加え、 - 78°Cに冷却したのち、 Ar雰囲気下 (4S) - 2 - ch I orotetrahydro-1 H, 3H-Pyr ro [1 , 2 - c] - 5, 5-d i pheny 1-1 , 3, 2- oxazaphosphol idine 5aの 0.22 THF溶液 22.5 ml (5.0 mmol)を滴下した。 反応混合物を室温で 3時間攪拌したところ、 反応が完了していなかったので、 終夜で加熱還流を行った。 反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (75
ml)及びクロ口ホルム (75 ml)を加えた。 有機相を分離後、 飽和炭酸水素ナト リウム水溶液で洗浄(75 ml x2)し、 集めた洗液をクロ口ホルム(75 ml x 2)で 抽出した。 集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 濾過し、 減圧下濃縮 した。 残渣を酢酸ェチルに溶かし、 へキサンに滴下して目的化合物を再沈殿さ せた。 吸引濾過で固体を回収し、 へキサンで洗浄して 7a (801.6 mg, crude)を 得た。 無色非晶質。 5′-0- (tert-ButyIdiphenyIsiIyI) thymidine 6 (722.3 mg, 1.5 mmol) was repeatedly azeotroped with pyridine and toluene to obtain a THF solution. After adding Et 3 N (1, 1 ml, 7.9 mmol) and cooling to -78 ° C, under Ar atmosphere (4S)-2-ch I orotetrahydro-1 H, 3H-Pyr ro [1, 2 -c] -5,5-Dipheny 1-1,3,2-oxazaphosphol idine 5a in 0.22 THF (22.5 ml, 5.0 mmol) was added dropwise. The reaction mixture was stirred at room temperature for 3 hours. Since the reaction was not completed, the mixture was heated and refluxed overnight. A saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (75 ml) and black mouth form (75 ml) were added. After separating the organic phase, it was washed with a saturated aqueous sodium hydrogencarbonate solution (75 ml × 2), and the collected washings were extracted with a black hole form (75 ml × 2). The collected organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate and added dropwise to hexane to reprecipitate the target compound. The solid was collected by suction filtration and washed with hexane to give 7a (801.6 mg, crude). Colorless amorphous.
1H R (CDGI3) δ 7.65 - 7.12 (m, 11H), 6.13 (dd, 3JHH = 7.8, 7.8 Hz, 1H), 4.65一 4.57 (m, 1H), 4.55 ― 4.49 (m, 1H), 3.79 (dd, 2JHH = 11.3 Hz, 3JHH = 2.4 Hz, 1H), 3.84 (dd, 2JHH = 11.7 Hz, 3JHH = 2.4 Hz, 1H), 3.57 一 3.48 (m, 1H), 3.45 ― 3.44 (m, 1H), 3.17 一 3.07 (m, 1H), 2.33 - 2.25 (m 1H), 1.92 - 1.82 (m, 1H), 1.81 - 1.50 (m, 4H), 1.49 (s, 3H), 1.06 (s, 9H); IR (KBr, cm"1) 3423, 2930, 1688, 1466, 1448, 1278, 1113, 1066, 958, 1 HR (CDGI 3 ) δ 7.65-7.12 (m, 11H), 6.13 (dd, 3 J HH = 7.8, 7.8 Hz, 1H), 4.65-4.57 (m, 1H), 4.55-4.49 (m, 1H), 3.79 (dd, 2 J HH = 11.3 Hz, 3 J HH = 2.4 Hz, 1H), 3.84 (dd, 2 J HH = 11.7 Hz, 3 J HH = 2.4 Hz, 1H), 3.57-3.48 (m, 1H) , 3.45-3.44 (m, 1H), 3.17-3.07 (m, 1H), 2.33-2.25 (m 1H), 1.92-1.82 (m, 1H), 1.81-1.50 (m, 4H), 1.49 (s, 3H) ), 1.06 (s, 9H); IR (KBr, cm " 1 ) 3423, 2930, 1688, 1466, 1448, 1278, 1113, 1066, 958,
5' - 0-(tert -プチルジフエニルシリル) - 3' - 0 - [(2S, 5R)-5, 5-ジメチル-テ卜 ラヒドロ- 1H,3H-ピロ口 [1,2- G] - 1,3, 2 - 2 -ォキサァザホスホリジン - 2 -ィル]チ ミジン (7b) の合成 5 '-0- (tert-butyldiphenylsilyl)-3'-0-[(2S, 5R) -5, 5-dimethyl-tetrahydro-1H, 3H-pyrro [1,2-G]- Synthesis of 1,3,2-2-oxazaphospholidine-2-yl] thymidine (7b)
5' -0- (tert-Buty I d i pheny I s i I y I ) thym i d i ne 6 (1.31 , 2.72 mmol)をピリ ジン、 トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、 THF溶液 (7.50 ml) とした。 これに Et3N (1.9 ml, 13.6圆 ol)を加え、 - 78°Cに冷却したのち、 Ar 雰囲気下(4S)- 2- chloro tetrahydro - 1H, 3H-Pyrro[1, 2-c]-5, 5-d i methyl - 1,3, 2-oxazaphosphol idine 5bの 0.38 M THF溶液 (10.0 ml, 3.81 mmol)を滴 下した。 反応混合物を室温で 30分攪拌したのち、 飽和炭酸水素ナトリウム水 溶液 (100 ml)及びクロ口ホルム (100 ml)を加えた。 有機相を分離後、 飽和炭 酸水素ナトリウム水溶液で洗浄(100 ml X 2)し、 集めた洗液をクロ口ホルム (200 mlxl)で抽出した。 集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 濾過 し、 減圧下濃縮した。 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ [4x16 cm, 100 g of silica gel , hexan-ethy I acetate - tri ethyl amine (50:50:5, 5 '-0- (tert-Buty I dipheny I si Iy I) thymidine 6 (1.31, 2.72 mmol) was dried by repeated azeotropes with pyridine and toluene, and the THF solution (7.50 ml) was added. did. After adding Et 3 N (1.9 ml, 13.6 1 ol) to the mixture and cooling to -78 ° C, under Ar atmosphere (4S) -2- 2-chlorotetrahydro-1H, 3H-Pyrro [1,2-c]- A 0.38 M THF solution of 5, 5-dimethyl-1,3,2-oxazaphospholidine 5b (10.0 ml, 3.81 mmol) was added dropwise. After the reaction mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate (100 ml) and chloroform (100 ml) were added. After separating the organic phase, the organic phase was washed with a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate (100 ml × 2), and the collected washings were extracted with chloroform (200 mlxl). The collected organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. The residue was subjected to silica gel column chromatography [4x16 cm, 100 g of silica gel, hexan-ethy I acetate-triethyl amine (50: 50: 5,
v/v/v) → hexan-ethy I acetate- tr i ethyl amine (50:50:2, v/v/v)]で分離精 製した。 7bを含むフラクションを集め、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (100
ml x 1)で洗浄後、 無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 濾過し、 減圧下濃縮して 7b (614.8 mg, 36%)を得た。 蕪色非晶質。 v / v / v) → Hexan-ethy I acetate-triethylamine (50: 50: 2, v / v / v)]. Fractions containing 7b are collected and saturated aqueous sodium bicarbonate solution (100 After washing with 1 ml × 1), it was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to obtain 7b (614.8 mg, 36%). Light brown amorphous.
1H MR (CDCI3) δ 9.83— 9.63 (br, 1Η), フ.68— 7, 34 (m, 11H), 6.42 (dd, 3JHH = 8.1, 8.1 Hz, 1H), 4.90 - 4.85 (m, 1H), 4.09 - 4.08 (m, 1H), 3.99 (dd, 2JHH = 11.7 Hz, 3JHH = 2.1 Hz, 1H), 3.84 (dd, 2JHH = 11.1 Hz, 3JHH = 2.1 Hz, 1H), 3.53一 3.47 (m, 2H), 3.09一 2.09 (m, 1H), 2.53一 2,46 (m, 1H), .2.24一 2.15 (m, 1H), 1.85一 1.65 (m, 4H), 1.58 (s, 3H), 1.47 (s, 3H), 1.20 (s, 3H), 1.11 (s, 9H) ; 31P NMR (121 MHz, CDCI3) δ 152.2 (98%) , 142.9 (2D; IR (KBr, cm—1) 3423, 2963, 1689, 1467, 1428, 1273, 1113, 1074, 956。 ' 1 H MR (CDCI 3 ) δ 9.83-- 9.63 (br, 1Η), f. 68-- 7, 34 (m, 11H), 6.42 (dd, 3 J HH = 8.1, 8.1 Hz, 1H), 4.90-4.85 ( m, 1H), 4.09-4.08 (m, 1H), 3.99 (dd, 2 J HH = 11.7 Hz, 3 J HH = 2.1 Hz, 1H), 3.84 (dd, 2 J HH = 11.1 Hz, 3 J HH = 2.1 Hz, 1H), 3.53-3.47 (m, 2H), 3.09-2.09 (m, 1H), 2.53-2,46 (m, 1H), 2.24-2.15 (m, 1H), 1.85-1.65 (m , 4H), 1.58 (s, 3H), 1.47 (s, 3H), 1.20 (s, 3H), 1.11 (s, 9H); 31 P NMR (121 MHz, CDCI 3 ) δ 152.2 (98%), 142.9 (2D; IR (KBr, cm— 1 ) 3423, 2963, 1689, 1467, 1428, 1273, 1113, 1074, 956. '
〔スキーム 4 : 7と 9の縮合〕 [Scheme 4: Condensation of 7 and 9]
e e
(Sp)-7: tim (Sp) -7: tim
(Rp)-7* (Rp)-10: (Sp)-10: (Rp) -7 * (Rp) -10: (Sp) -10 :
7a (R= Ph) > 99 : 1 20 min 87: 13 7a (R = Ph)> 99: 1 20 min 87: 13
7b {R = Me) 98 :2 < 5 min 97 :3 7b (R = Me) 98: 2 <5 min 97: 3
99: 1 < 5 min 98 :2 99: 1 <5 min 98: 2
*31P Rにより測定。 * 31 Measured by PR.
31P NMR分光分析法による 8の存在下における 7と 9の縮合のモニタリング。 8の存在下における 7a - bと 9の縮合の代表的モニタリング Monitoring condensation of 7 and 9 in the presence of 8 by 31 P NMR spectroscopy. Representative monitoring of the condensation of 7a-b and 9 in the presence of 8
刚 Rサンプルチューブ中、 7a (41.9 mg, 55 mol)と 9 (17.8 mg, 50
03812 刚 7a (41.9 mg, 55 mol) and 9 (17.8 mg, 50 03812
mol)を P205上で 12時間真空乾燥し、 MS 3Aで 8時間乾燥した 8 (ΑΟΟμ I, 100 mo I)の 0.25 Μァセトニトリル溶液と GD3GN (100 i I)を Ar雰囲気下加え た。 その 3分後、 關 Rによる積算を開始し、 反応のジァステレオマー比を NMR シグナルの積分比によって決定した。 The mol) was vacuum-dried for 12 hours over P 2 0 5, 8 and dried for 8 hours (ΑΟΟμ I, 100 mo I) of 0.25 Micromax Asetonitoriru solution and GD 3 GN (100 i I) was added under an Ar atmosphere MS 3A Was. Three minutes later, the integration by R was started, and the diastereomer ratio of the reaction was determined by the integration ratio of the NMR signal.
NMRサンプルチューブ中、 7b (35.1 mg, 55 jumol)と 9 (17.8 mg, 50 〃mol)を P205上で 12時間真空乾燥し、 MS 3Aで 8時間乾燥した 8 (400 i l, 1O0〃mol)の 0.25 Mァセトニトリル溶液と CD3CN (100jw I)を Ar雰囲気下加え た。 NMR sample tube, 7b (35.1 mg, 55 jumol ) and 9 (17.8 mg, 50 〃Mol) was vacuum-dried for 12 hours over P 2 0 5, 8 and dried for 8 hours at MS 3A (400 il, 1O0〃 mol) of 0.25 M acetonitrile and CD 3 CN (100 jw I) were added under an Ar atmosphere.
スキーム 5 Scheme 5
(flp): (Sp) = 97:3 (flp): (Sp) = 97: 3
5' - 0-(tert-ブチルジフエニルシリル)チミジン -3' -yl 3' - 0- (tert -プチ ルジメチルシリル)チミジン - 5' -ィル M -ァセチル -(2S)-び-メチル(ピロリジ ン- 2-ィル)エタノィル フォスファイト (12b) の合成 5'-0- (tert-butyldiphenylsilyl) thymidine -3'-yl 3'-0- (tert-butyldimethylsilyl) thymidine-5'-yl M-acetyl- (2S) -bi-methyl Synthesis of (pyrrolidin-2-yl) ethanoyl phosphite (12b)
NMRサンプルチューブ中、 7b (35.1 mg, 55〃mol)と 9 (17.8 mg, 50 /mol) を P205上で 12時間真空乾燥し、 MS 3Aで 8時間乾燥した 8 (400〃 I, During NMR sample tube, 7b (35.1 mg, 55〃Mol) and 9 (17.8 mg, 50 / mol ) was vacuum-dried for 12 hours over P 2 0 5, 8 and dried for 8 hours at MS 3A (400〃 I,
100 imol)の 0.25 Mァセ卜二トリル溶液と GD3GM (100 I)を Ar雰囲気下加え
た。 5分後、 ピリジン (40.1 1 , 500〃mol)と無水酢酸 (9.5 I, 100 ol)を 加えた。 3分後、 クロ口ホルム (30 ml)を加え、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶 液 (15 ml x2)で洗浄し、 集めた洗液をクロ口ホルム (30 ml x1)で抽出した。 集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 濾過し、 減圧下濃縮し、 トルェ ンと共沸することで 12b (86.9 mg, crude)を得た。 (100 imol) in 0.25 M acetate nitrile solution and GD 3 GM (100 I) under Ar atmosphere It was. Five minutes later, pyridine (40.11, 500 mol) and acetic anhydride (9.5 I, 100 ol) were added. Three minutes later, black-mouthed form (30 ml) was added, washed with a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate (15 ml × 2), and the collected washings were extracted with black-mouthed form (30 ml × 1). The collected organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, concentrated under reduced pressure, and azeotroped with toluene to obtain 12b (86.9 mg, crude).
]W NMR (CDC 13) δ 9.73 (br, 2H), 7.63 - 7.61 (m, 4H), 7.46 ― 7.36 (m, 7H), 6,39 (dd, 3JHH = 6.6, 3 Hz, 1H), 6.23 (t, 6.0 Hz) , 4.89 (m, 1H), 4.30 (m, 2H), 4.08一 3.80 (m, 6H), 3.58一 3.38 (m, 2H), 2.45 (m, 1H), 2.34 - 2.23 (m, 3H) , 2.23 - 1.98 (m, 4H), 1.89 (s, 3H), 1.60 (s, 3H) , 1.46 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 1.10 (s, 9H), 0.87 (s, 9H), 0.05 (6H); 31P NMR (121 MHz, CDCI3) δ 137.2 (79%) , 137.0 (7%) , 136.7 (8%) , 135.7 (1%), 135.2 (5%); IR (KBr, cm—1) 3430, 2930, 1742, 1694, 1471, 1274, 1112,. 1034, 966, 835。 ] W NMR (CDC 1 3) δ 9.73 (br, 2H), 7.63 - 7.61 (m, 4H), 7.46 - 7.36 (m, 7H), 6,39 (dd, 3 J HH = 6.6, 3 Hz, 1H ), 6.23 (t, 6.0 Hz), 4.89 (m, 1H), 4.30 (m, 2H), 4.08--1.80 (m, 6H), 3.58--1.38 (m, 2H), 2.45 (m, 1H), 2.34 -2.23 (m, 3H), 2.23-1.98 (m, 4H), 1.89 (s, 3H), 1.60 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 1.10 (s, 9H ), 0.87 (s, 9H), 0.05 (6H); 31 P NMR (121 MHz, CDCI 3 ) δ 137.2 (79%), 137.0 (7%), 136.7 (8%), 135.7 (1%), 135.2 (5%); IR (KBr, cm- 1 ) 3430, 2930, 1742, 1694, 1471, 1274, 1112 ,. 1034, 966, 835.
(Rp) - 5' —0 -(tert-ブチルジフエニルシリル)チミジン- 3' -ィル 3' - 0 - (tert-プチルジメチルシリル) チミジン- 5' -yl H-ホスフォネート [(Rp)- 11] の合成 (Rp) -5'-0- (tert-butyldiphenylsilyl) thymidine-3'-yl 3'-0- (tert-butyldimethylsilyl) thymidine-5'-yl H-phosphonate [(Rp)- 11]
フォーム状にして 5時間真空乾燥させた 12b (86.9 mg, crude)に、 At'雰囲 気下、 蒸留した TFA (2 ml)を溶かした CH2GI2 (20 ml)を加えた。 0 °Cで 2分攪 拌したのち、 ジクロロメタン (100 ml)を加え、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶 液 (50 ml X 2)で洗浄し、 集めた洗液をジクロロメタン (100 ml 1)で抽 出した。 集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 濾過し、 減圧下濃縮し た。 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ [4x16 cm, 100 g of si I ica gel , hexan - ethyl acetate (1:1, v/v) → hexan-ethy I acetate (1:2, v/v) -→ hexan-ethy I acetate (1:3, v/v) → hexan-ethy I acetate (1:4, v/v)] で分離精製した。 (Rp) - 11を含むフラクションを集め、 減圧下濃縮し、 クロ口 ホルム (50 ml)を加え、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (50 mlxl)で洗浄後、 洗液をクロ口ホルム (50 ml XI)で抽出し、 集めた有機相を無水硫酸ナ卜リウ ムで乾燥し、 濾過し、 減圧下濃縮して 11b (43.4 mg, 84% (purity 93%))を得
た。 無色非晶質。 CH 2 GI 2 (20 ml) in which distilled TFA (2 ml) was dissolved was added to 12b (86.9 mg, crude) which had been made into a foam and dried under vacuum for 5 hours under an atmosphere of At ′. After stirring at 0 ° C for 2 minutes, dichloromethane (100 ml) was added, and the mixture was washed with a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate (50 ml x 2), and the collected washings were extracted with dichloromethane (100 ml 1). . The collected organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. The residue was subjected to silica gel column chromatography [4x16 cm, 100 g of si I ica gel, hexan-ethyl acetate (1: 1, v / v) → hexan-ethy I acetate (1: 2, v / v)-→ hexan-ethy I acetate (1: 3, v / v) → hexan-ethy I acetate (1: 4, v / v)]. The fractions containing (Rp) -11 were collected, concentrated under reduced pressure, added with chloroform (50 ml), washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate (50 mlxl), and washed with chloroform (50 ml XI) The collected organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to obtain 11b (43.4 mg, 84% (purity 93%)). It was. Colorless amorphous.
】H NMR (CDGI3) «59.45 - 9.33 (br, 2H), 7.64― 7.60 (m, 4H), 7.47― 7.37 (m, 8H), 6.90 (d, JPH = 715.0 Hz, 1H) 6.39 (dd, 3JHH = 6.0, 6.0 Hz, 1H), 6.14 (t, 3JHH = 7.2 Hz, 1H), 5.23— 5,22 (m, 1H), 4.46— 4.40 (m, 1H), 4.35 - 4.19 (m, 2H), 4.18 (s, 1H), 3.99一 3.78 (m, 3H), 2.65― 2.55 (m 1H), 2.33— 2.28 (m, 3H), 1.91 (s, 3H), 1.57 (s, 3H), 1.06 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 0.10 (s, 6H); 31P NMR (121 MHz, GDCI3) δ 9.3 (3% for (Sp)-11), 7.8 (97% for (Rp)- 11); IR (KBr, cm—1) 3448, 2930, 1695, 1471, 1276, 1114, 1035, 971, 837。 H NMR (CDGI3) «59.45-9.33 (br, 2H), 7.64-7.60 (m, 4H), 7.47-7.37 (m, 8H), 6.90 (d, J PH = 715.0 Hz, 1H) 6.39 (dd, 3 J HH = 6.0, 6.0 Hz, 1H), 6.14 (t, 3 J HH = 7.2 Hz, 1H), 5.23— 5,22 (m, 1H), 4.46— 4.40 (m, 1H), 4.35-4.19 ( m, 2H), 4.18 (s, 1H), 3.99-3.78 (m, 3H), 2.65-2.55 (m 1H), 2.33-2.28 (m, 3H), 1.91 (s, 3H), 1.57 (s, 3H ), 1.06 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 0.10 (s, 6H); 31 P NMR (121 MHz, GDCI 3 ) δ 9.3 (3% for (Sp) -11), 7.8 (97% for (Rp) -11); IR (KBr, cm- 1 ) 3448, 2930, 1695, 1471, 1276, 1114, 1035, 971, 837.
〔スキーム 6〕 (Scheme 6)
表 4
(Sp)-13: (flp)-13 (Sp)-18: (fip)-18 18の収率 Table 4 (Sp) -13: (flp) -13 (Sp) -18: (fip) -18 Yield of 18
98.1: 1.9 98.6: 1.4 98.1: 1.9 98.6: 1.4
1.9: 98.1 1.9: 98.1 手動固相合成の代表的手順 1.9: 98.1 1.9: 98.1 Typical procedure for manual solid-phase synthesis
(1) 3% DCA in CH2CI2; 15-20 sx4 (1) 3% DCA in CH 2 CI 2 ; 15-20 sx4
(2)洗浄 (GH2CI2 fol lowed by CH3CN) (2) Washing (GH 2 CI 2 fol lowed by CH 3 CN)
(3)カップリング (0.2 Mモノマー 13 and 1.0 M 8 in CH3CN; 3 min)(3) Coupling (0.2 M monomer 13 and 1.0 M 8 in CH 3 CN; 3 min)
(4)保護 020-1^-11161 1 !1^0|3∑0|6-丁 (1 : 2 : 7, v/v/v); 30 s](4) Protection 0 2 0-1 ^ -11161 1! 1 ^ 0 | 3∑0 | 6-chome (1: 2: 7, v / v / v); 30 s]
(5) 1% TFA in CH2CI2; 15-20 sx4 (5) 1% TFA in CH 2 CI 2 ; 15-20 sx4
(6)硫化 [10% S8 in CS2-Py-Et3N (35 : 35 : 1, v/v/v); 3 h](6) Sulfide [10% S 8 in CS 2 -Py-Et 3 N (35: 35: 1, v / v / v); 3 h]
(7)洗浄 [GS2 - Py- Et3N (35 : 35 : 1, v/v/v) fol lowed by Py](7) Cleaning [GS 2 -Py-Et 3 N (35: 35: 1, v / v / v) fol lowed by Py]
(8) 25% NH3 aq. (5.0 ml; 1h) (8) 25% NH 3 aq. (5.0 ml; 1h)
(9)吸引濾過, 洗浄 (H20; 1.0 ml x 5) (9) suction filtration, washed (H 2 0; 1.0 ml x 5)
(10)溶媒の減圧留去 (10) Evaporation of solvent under reduced pressure
(11)希釈 (H20; 5.0 ml) (11) Dilution (H 2 0; 5.0 ml)
(12)洗浄(Et20; 5.0 ml x 3) (12) Washing (Et 20 ; 5.0 ml x 3)
(13)溶媒の減圧留去 (13) Evaporation of solvent under reduced pressure
(14)凍結乾燥 (14) Freeze drying
集めた残渣を水 (0.2 ml)に溶かして逆相 HPLCにより分析した。 The collected residue was dissolved in water (0.2 ml) and analyzed by reverse phase HPLC.
〔スキーム 7〕 (Scheme 7)
(Sp)-13: (flp)-13 (Sp)-19: (fip)-19 19の収率 (Sp) -13: (flp) -13 (Sp) -19: Yield of (fip) -19 19
98.1: 1.9 96.5: 3.5 97,5 1.9: 98.1 4.2: 95.8 97.6 手動固相合成の代表的手順 98.1: 1.9 96.5: 3.5 97,5 1.9: 98.1 4.2: 95.8 97.6 Typical procedure for manual solid-phase synthesis
(1) 1% TFA in CH2CI2; 15-20 sx4 (1) 1% TFA in CH 2 CI 2 ; 15-20 sx4
(2)洗浄(CH2CI2 fol lowed by CH3CN) (2) cleaning (CH 2 CI 2 fol lowed by CH 3 CN)
(3)カップリング (0.2 モノマ一 13 and 1.0 M 8 in CH3CN; 3 min)(3) Coupling (0.2 monomer 13 and 1.0 M 8 in CH 3 CN; 3 min)
(4)保護 [Ac20-N- methyl imidazole - THF (1 : 2 : 7, v/v/v); 30 s](4) protected [Ac 2 0-N- methyl imidazole - THF (1: 2: 7, v / v / v); 30 s]
(5) 1% TFA in CH2GI2; 15-20 sx4 (5) 1% TFA in CH 2 GI 2 ; 15-20 sx4
(6)酸化的ァミノ化 (飽和 NH3 in CG 14 - dioxane (4 : 1, v/v); 0°C, 30 min) (6) oxidative Amino reduction (saturated NH 3 in CG 1 4 - dioxane (4: 1, v / v); 0 ° C, 30 min)
(7)吸引濾過,洗浄 (dioxane ;1.0 mi x 2) (7) Suction filtration and washing (dioxane; 1.0 mix 2)
(8)溶媒の減圧留去 (8) Evaporation of solvent under reduced pressure
(9)希釈 (H20; 5.0 ml) (9) Dilution (H 2 0; 5.0 ml)
(10)溶媒の減圧留去 (10) Evaporation of solvent under reduced pressure
(11)凍結乾燥 (11) Freeze drying
集めた残渣を水 (0.2 ml)に溶かして逆相 HPLGにより分析した。
The collected residue was dissolved in water (0.2 ml) and analyzed by reverse phase HPLG.