WO2005063989A1 - Sequences nucleotidiques promotrices inductibles par infection par les pathogenes. - Google Patents

Sequences nucleotidiques promotrices inductibles par infection par les pathogenes. Download PDF

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WO2005063989A1
WO2005063989A1 PCT/FR2004/003366 FR2004003366W WO2005063989A1 WO 2005063989 A1 WO2005063989 A1 WO 2005063989A1 FR 2004003366 W FR2004003366 W FR 2004003366W WO 2005063989 A1 WO2005063989 A1 WO 2005063989A1
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WO
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plant
promoter
expression cassette
infection
sequence
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PCT/FR2004/003366
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Bruno Favery
Pierre Abad
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Genoplante-Valor
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/8239—Externally regulated expression systems pathogen inducible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • PROMOTER NUCLEOTIDE SEQUENCES INDUCTIBLE BY PATHOGENIC INFECTION.
  • the invention relates to the isolation and characterization of promoters inducible by pathogens, more particularly by nematodes, and more specifically directing expression in the nourishing sites of said nematodes after infection.
  • the non-segmented nematodes or "roundworms" form a zoological group characterized by its richness in species (20,000 are currently described), a simple body structure and a uniform organization. This group, present in almost all natural environments, includes parasites of vertebrates, insects and plants, as well as free bacteriophage-saprophagous species or predators. Nematodes are the simplest of organized animals.
  • the mobile nematode penetrates inside the root and migrates to the region of the vascular tissues, where it establishes a permanent nourishing site.
  • the nourishing sites ⁇ are syncital structures or giant cells resulting from the modification by the nematode of cells of the host plant.
  • the nematode which has become sedentary, undergoes three successive moults until the adult stage.
  • the males go through a temporary immobile stage, then the third moult gives birth to a mobile stage; it is at this stage that the males leave the root.
  • the adult stage is entirely immobile.
  • Egg production (hundreds per female) begins, depending on the species and environmental conditions, 3 to 6 weeks after the initial infection.
  • the cyst nematode (genus Heterodera or Globodera) penetrates the root at the level of the epidermis and migrates through the cortex by piercing and destroying the cells using its stylus. The cells are damaged and root necrosis may appear. After reaching the endoderm, the nematode pierces the membrane of a procambial cell near the primary xylem (conductive bundle of raw sap) and injects secretions through the salivary glands. Quickly, the procambial cell becomes metabolically very active and begins to grow by successive fusion with the neighboring cells.
  • the syncytium formed can incorporate more than 200 cells and is then characterized by large nuclei, a dense cytoplasm and invaginations of the cellulosic wall, which make it possible to increase the surface in contact with the vascular tissues.
  • the gall nematode (of the genus Meloidogyne), after a recognition phase on the surface of the root, penetrates to the level of the elongation zone near the root apex. Generally, the nematode then migrates passing between the cells, at the end of the root, then goes up in the central cylinder until the zone of differentiation.
  • the nematode stings, with its stylus, 5 to 7 cells and induces their transformation into giant cells by multiple mitoses without wall formation.
  • the giant cells thus activated have the same characteristics as the syncytium formed by the cyst nematode: dense cytoplasm, thickened walls and presence of invaginations, numerous (> 100) and large nuclei in each cell.
  • the increase in volume of cortical cells leads to the formation of a gall typical of Meloidogyne infection.
  • To the direct damage caused by nematodes by the action of their buccal stylus can be added indirect effects which aggravate the stress inflicted on the plant (invasion by other telluric pathogens or virus transmission).
  • the cruciferous Arabidopsis thaliana is a host plant for many species of gall and cyst nematodes, which has the distinction of having fine and transparent roots, which is particularly suitable for microscopic studies.
  • Arabidopsis thaliana is suitable for molecular studies, due to the small size of its fully sequenced genome and its short life cycle.
  • Arabidopsis thaliana allows the identification of plant genes involved in the formation of feeder sites and the evaluation of the effect of their inactivation on the development of the plant and the nematode.
  • genes coding for compounds unfavorable to the metabolism of the nematode can be tested in Arabidopsis thaliana.
  • this plant has been an important tool in research on nematode / plant-host interactions. Complete biological cycles were obtained in vitro for the following parasites: Heterodera schachtii, H. trifolii, H. cajani (cyst nematodes), Meloidogyne incognita and M.
  • This promoter must also be as specific as possible to the nourishing site, in order to avoid the expression of the cytotoxic gene in the other tissues of the plant.
  • French application FR 2 779 737 describes the involvement of the D-ribulose-5-phosphate-3-epimerase (RPE) gene in the early stages of development of nematode-induced feeder cells.
  • Application WO 97/46692 describes nucleotide sequences of A. thaliana capable of directing the expression of a sequence of interest, in particular a sequence coding for a cytotoxic substance, in the roots following infection by nematodes with galls or cysts.
  • this expression is not very specific, and requires, in order to avoid undesirable general phytotoxic effects, to use in addition a chimeric construct expressing in the other tissues of the plant a gene coding for a neutralizer of the toxin used.
  • Application WO 98/31822 relates to promoters which are inducible following infection by a pathogen, in particular by nematodes.
  • the ARM1 line (line Att001 in the article by BARTHELS et al. (Plant Cell., Vol.9 (12), p.2119-34, 1997) shows expression in the feeding sites after infection with Meloidogyne and Heterodera detected 2 at 4 days after infection and weaker at 14 days During development of the plant, expression is detected at the sites of initiation of the lateral roots but also in all the vessels of the leaves and roots. observes a response from the promoter after application of plant hormones (auxin).
  • promoters inducible by nematodes It appears desirable to have other promoters inducible by nematodes, and the expression of which is as specific as possible to the nourishing tissues.
  • the inventors have shown that the promoters genes of the formins AtFH6 or AtFH1 or AtFHIO of Arabidopsis thaliana were capable of inducing the expression of a sequence of interest in the nourishing sites of the roots of the plant after infection by a nema tode, gall or cyst.
  • the expression outside the feeding sites observed during the development of the plant presents a level less important than that induced by nematodes and is limited to certain tissues, in particular, in the case of AtFH ⁇ , the root apex and the zones of early differentiation (sites of initiation of the lateral roots) of the root vessels, as well as the air tissue vessels of very young seedlings and stipules.
  • the promoters of formins are not inducible by plant hormones.
  • Formins are proteins involved in cytokinesis and cell polarity, in yeasts and Drosophila. They have been highlighted recently in plants: BANNO and CHUA (Plant Cell Physiology, vol.41 (5), p.617-626, 2000) describe the identification of a complete cDNA coding for AFH1 (Arabidopsis Formin Homology protein 1) and obtaining complementary sequences by homology in tobacco, CYRCKOVA (Genome Biology, vol.1 (1), April 27, 2000) discloses the use of the sequences of the conserved regions FH1 and FH2 as probes to identify sequences potentially coding for formins; DEEKS et al.
  • said promoter is chosen from promoters of the formin genes AtFH ⁇ , AtFH1, or AtFHIO from Arabidopsis thaliana, or from promoters of orthologous genes from other plant species.
  • the subject of the present invention is in particular an isolated polynucleotide constituting a promoter inducible in a plant by infection by a nematode, characterized in that it comprises the regulatory sequences of a promoter chosen from: - the promoter of the gene formin AtFH ⁇ from Arabidopsis thaliana, represented by the sequence SEQ ID NO: 1; - the promoter of the formin gene AtFH1 of Arabidopsis thaliana, represented by the sequence SEQ ID NO: 2; - the promoter of the formin AIFH10 gene from Arabidopsis thaliana, represented by the sequence SEQ ID NO: 3;
  • the term “regulatory sequences” designates the sequences recognized by transcription factors which are only active in certain specific cell types, or in response to a specific stimulus.
  • the regulatory sequences of the promoters of the AtFH ⁇ , AtFH1 or AtFHIO genes are the regions of these promoters specifically involved in the response to infection by a nematode, and / or in preferential expression in feeder sites.
  • Those skilled in the art can, from the promoters defined by the sequences SEQ ID NO: 1, 2, or 3, identify these regulatory sequences, by techniques known in themselves of dissection of the promoters, for example by measuring the inducibility by infection with a nematode and the specificity of the promoter activity of deletion mutants of this polynucleotide, and / or by techniques such as those of DNA fingerprints, by incubating the polynucleotides of sequence SEQ ID NO: 1, 2, or 3, or portions thereof, with nuclear extracts from cells of the feeder sites, as well as with nuclear extracts from cells of tissues in which the promoters of the AtFH ⁇ , AtFH1 or AtFHIO are inactive.
  • a polynucleotide of the present invention comprises a sequence having at least 80%, preferably at least 85%, advantageously at least 90%, and most preferably at least 95% of with one of the sequences SEQ ID No. 1, 2 or 3.
  • a polynucleotide of the present invention can also be a chimeric promoter, containing a minimal promoter functional in a plant cell, associated with the regulatory sequences of one promoters of the AtFH ⁇ , AtFH1 or AtFHIO genes.
  • a minimal promoter comprises at least the sequences allowing the binding of RNA polymerase and the initiation of transcription.
  • a minimal promoter for transcription by RNA polymerase II generally comprises, in addition to a transcription initiation site, at least one TATA box generally located approximately 20 to 40 bp upstream of the initiation site of the transcription.
  • upstream promoter elements upstream promoter elements or UPEs
  • the present invention also relates to any sub-fragment of at least 15, preferably at least 20, very preferably at least 30, and advantageously at least 50 consecutive bases of one of the sequences SEQ ID NO: 1, 2, or 3, or its complement, as well as any polynucleotide of at least 20, very preferably at least 30, and advantageously at least 50 bp capable of hybridizing under conditions of high stringency with any of the sequences SEQ ID NO: 1, 2, or 3, or with its complement.
  • isolated within the meaning of the present invention designates a biological material which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located). For example, a polynucleotide found naturally in a plant is not isolated.
  • a polynucleotide may be included in a vector and / or such a polynucleotide may be included in a composition and nevertheless remain in an isolated state since the vector or the composition does not constitute its natural environment.
  • the term "% identity" means the percentage of identical nucleotides which can be calculated by a person skilled in the art using a computer program for comparing sequences such as, for example, those of the BLAST suite ( ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., Vol.25, p.3389-3402, 1997), or the FastDB program with the following parameters: “Mistmatch penalty: 1.00; Gap penalty: 1.00; Gap Size Penalty: 0.33; joining penalty: 30.0 ".
  • polynucleotides according to the invention can also be defined by their selective hybridization properties with one of the polynucleotides defined by the sequences SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3 under strong conditions. stringency as defined in SAMBROOK et al., Molecular Cloning A
  • high stringency conditions for a given polynucleotide can be obtained by operating at a temperature 5 to 10 ° C below the melting temperature of the duplex constituted by said polynucleotide and its complement, in a medium of given composition.
  • high stringency hybridization conditions which can be used in a large number of cases, the following conditions will be indicated:
  • 5X SSPE 0.9 M NaCI, 50 mM sodium phosphate pH 7.7, 5 mM EDTA
  • nucleotide differences which a nucleic acid according to the invention may include with respect to the nucleotide sequences SEQ ID N ° 1 or SEQ ID N ° 2 or SEQ ID N ° 3 may result as substitutions, deletions or additions of one or more consecutive or non-consecutive nucleotides.
  • Preferred embodiments of promoters in accordance with the invention are represented by the polynucleotides defined by the sequences SEQ ID N ° 1 or SEQ ID N ° 2 or SEQ ID N ° 3 are represented by the polynucleotides defined by the sequences SEQ
  • polynucleotide defined by SEQ ID NO: 4, which consists of a sequence of 1129 bp upstream of the ATG of the AtFH6 gene and which comprises, in addition to the sequence SEQ ID No. 1, a 5'UTR sequence of 122 bp (underlined in the sequence represented below):
  • the invention also relates to a recornbinating expression cassette, characterized in that it comprises: - a promoter constituted by a polynucleotide in accordance with the invention; - A heterologous sequence of interest placed under transcriptional control of said promoter, or one or more restriction site (s) allowing the insertion of a sequence of interest under transcriptional control of said promoter.
  • a sequence of interest expressed in an expression cassette according to the invention may in particular be a sequence expressing an RNA, a protein or a polypeptide which protects the plant against infection by nematodes, in the sense which improves the resistance of the plant to infection until it confers complete resistance and more particularly a gene coding for a compound which is toxic for nematodes or for cells at feeder sites.
  • This compound can have the direct effect of the death of nematodes (these are for example nematicidal toxins, lectins, collagenases, protease inhibitors, antibodies, etc.), or have the effect of rendering the nematodes to perform an important stage in their development or reproduction, eventually causing their elimination.
  • nematodes these are for example nematicidal toxins, lectins, collagenases, protease inhibitors, antibodies, etc.
  • There are many examples of such toxic substances for example the endotoxin from Bacillus thuriengiensis (EP 0 352 052).
  • the toxic compounds can also be directed not towards the nematodes but towards the plant cells of their nourishing sites, in order to disturb the formation and / or the functioning of these nourishing structures.
  • the toxic compounds can in particular be chosen from DNAses, RNAses, cell death inducers, combinations of products of a resistance gene and of an avirulence gene, anti-sense RNAs.
  • Said sequence of interest can also be associated with other regulatory elements such as activators and transcription termination sequences (terminators).
  • Other elements such as introns, enhancers, polyadenylation sequences and their derivatives known from the state of the art may also be present in the nucleic sequence of interest to improve the expression or the functioning of the transforming gene.
  • regulatory nucleotide sequences which are not part of the promoter, and capable of modulating the expression of the sequence of interest, in particular: - leader sequences and enhancer sequences, which intervene at a post-transcriptional or translational level (in particular RNA stabilization and effect on translation), for example the leader EMCV (ELROY-STEIN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 86 (16), p. 6126-30, 1989) and the leader TMV (GALLIE et al., Plant Cell, vol. 1 (3), p. 301-11, 1989).
  • EMCV ELROY-STEIN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 86 (16), p. 6126-30, 1989
  • GALLIE et al., Plant Cell, vol. 1 (3), p. 301-11, 1989.
  • - regulatory boxes operating at a transcriptional level, capable of at least partially controlling the activity of a promoter; these latter regulation boxes can be inducible by a physiological factor or by the environment of the plant.
  • - transcription terminators by way of nonlimiting examples, there may be mentioned in particular: The terminator 3 'Nos, terminator of nopaline synthase which corresponds to the non-coding 3' region of the nopaline synthase gene originating from the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens nopaline strain ( DEPICKER et al., J. Mol. Genet Appl., Vol.
  • the expression cassette also comprises a gene coding for a selection agent (also called selection marker gene).
  • genes which confer resistance to a antibiotic such as hygromycin, kanamycin, bleomycin or streptomycin or herbicides (EP 242 246), such than glufosinate, glyphosate or bromoxynil.
  • a antibiotic such as hygromycin, kanamycin, bleomycin or streptomycin or herbicides (EP 242 246), such than glufosinate, glyphosate or bromoxynil.
  • said selection marker gene is chosen from the bar gene (WHITE et al., Nucl. Acid.
  • the excision system for eliminating the gene encoding a selection agent can be a transposition system, such as in particular the Ac / Ds system of corn (WO 02 101061), or a recombination system, such as in particular the Cre / system bacteriophage P1 lox, the yeast FLP / FRT system (LYZRIK and HODGES, Nucl. Acid.
  • the phage Mu recombinase E the Pin recombinase from E coli or the R / RS system of the plasmid pSR1.
  • a co-transformation system (KOMARI et al., Plant J., vol.10, p.165-174, 1996) can also be used.
  • the system used will be the Ac / Ds system of corn.
  • said gene is included inside the transposable element Ds (also called dissociating element or mobilizable sequence of a transposon).
  • the Ds transposon used is described in the publication by YODER et al.
  • the invention relates to a recombinant vector, for expression or for cloning, comprising at least one polynucleotide according to the invention.
  • said vector is an expression vector containing an expression cassette according to the invention.
  • vectors which can be used for obtaining recombinant vectors in accordance with the invention
  • the following vectors may be mentioned: vector pBIN19 (BEVAN et al., Nucleic Acids Research, vol.12, p.8711- 8721, 1984, sold by the company CLONTECH, USA), vector 101 pBI221, and pBI121 (JEFFERSON, Plant molecular Biology Reporter, vol.5, p.387-405, 1987, sold by the company CLONTECH, USA).
  • the invention also relates to a host cell transformed with a polynucleotide, an expression cassette or a recombinant vector according to the invention.
  • the preferred host cells are either of bacterial or vegetable origin.
  • cells can in particular be used bacteria of different strains of E. coli or Agrobacterium tumefaciens or rhizobium.
  • Plant host cells can be derived in particular from dicotyledonous or monocotyledonous plants; by way of nonlimiting examples, mention may in particular be made of Arabidopsis, rapeseed, tobacco, corn, tomato, wheat, barley, sunflower, potato, beetroot and rice.
  • the invention also relates to the tissues or parts of plants, plants, or seeds transformed with a polynucleotide, an expression cassette or a recombinant vector according to the invention.
  • plant tissue refers to any tissue of a plant, in a plant or in a crop.
  • the invention further relates to a transgenic plant or part of a transgenic plant containing at least one copy of a transgene comprising a polynucleotide or an expression cassette according to the invention.
  • Said transgenic plants have the property, following infection by a pathogen and in particular by a nematode, to express preferentially in the root nourishing sites the gene of interest inserted in said expression cassette.
  • Transgenic plants according to the invention can in particular be generated from transformed plant cells according to the invention.
  • the techniques for cultivating and regenerating whole plants from transformed cells or tissues are known to those skilled in the art, cf. for example HANSEN and WRIGHT (Trends Plant Sci., vol.4 (6), p.226-231, 1999) or KOMARI et al. (Curr. Opin. Plant. Biol., Vol.1 (2), p.161-5, 1998).
  • a transgenic plant according to the invention can be obtained from any plant which it is desired to be able to protect against infection by nematodes. It may be, by way of nonlimiting examples, rapeseed, wheat, barley, sunflower, tobacco, corn, or even Arabidopsis thaliana.
  • the invention also encompasses any process for obtaining transgenic plants in accordance with the invention.
  • any plant transgenesis technique suitable for the type of plant that one wishes to protect can be used.
  • plant cells isolated, in the form of protoplasts, or in the form of a plant tissue or organ
  • whole plants are regenerated from the transformed cells.
  • the transformation in question can be carried out either directly or indirectly, using a vector comprising an expression cassette in accordance with the invention.
  • direct transformation any transformation of a plant cell carried out directly by a vector according to techniques known to those skilled in the art such as by means of a micropipette for ensuring the mechanical transfer of DNA, to the using polyethylene glycol, by high-speed biolistic penetration by means of small particles containing either inside or on their surface the nucleic acid to be penetrated into the plant cell, by fusion of protoplasts with other entities, cells, lysosomes, or other body with lipid surfaces capable of fusing, or by electroporation.
  • the transformation of plant cells can also be carried out by inserting the nucleic sequence of interest within a recombinant plasmid, for example of bacterial origin, into which the genome of a viral DNA such as that has previously been inserted.
  • a transformation consisting for example of transforming a microorganism such as Agrobacterium tumefaciens by means of the above nucleic sequence, said microorganism then being used to transform the cells of plants.
  • it comprises the following steps: a) obtaining a transformed plant cell according to the invention; b) regeneration, from said cell, of a whole plant containing in its genome at least one copy of an expression cassette in accordance with the invention.
  • a process in accordance with the invention may also comprise a step of crossing transgenic plants obtained, and a step of selecting, from the plants resulting from this crossing, those which comprise at least one copy of a cassette of expression in accordance with the invention.
  • the subject of the invention is also the seeds obtained from a transgenic plant according to the invention.
  • the invention also relates to the use of at least one expression cassette according to the invention for obtaining a plant resistant to infection by nematodes.
  • the invention also relates to a method for protecting a plant from infection by a nematode comprising the steps of transforming plants with an expression cassette according to the invention and the selection of plants having integrated the nucleotide sequence of interest.
  • the invention also relates to a method for identifying a promoter specific for feeder sites comprising the steps of identifying the homologs of the for genes in species other than Arabidopsis thaliana such as for example wheat and / or corn by comparison of sequences of said species with the sequences of the formin genes of Arabidopsis thaliana, and the identification of the promoters of the homologous sequences resulting from this comparison by the usual techniques known to those skilled in the art.
  • the invention also relates to a plant transformation kit comprising an expression cassette according to the invention or a cloning and / or expression vector according to the invention.
  • the invention relates to any use of a promoter nucleotide sequence according to the invention for expressing a gene in a plant infected with nematodes, at the nourishing sites of said nematodes.
  • the present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to non-limiting examples illustrating inducibility and expression profile of promoters of the AtFH6, AtFH1 and
  • RT-PCR using mRNA isolated from uninfected roots, non-meristematic fragments of uninfected roots, 5 day old seedlings, aerial parts and leaves isolated from 10 day old plants, and galls 7 and 14 days after infection with M. incognita.
  • Single-stranded cDNAs were prepared from 500 ng of poly (A) + RNA using “Superscript II reverse transcriptase” (Invitrogen) with the oligo primer (dT).
  • PCR reactions were carried out with the primers AtFH6 F3for (5'-AGA TCG AGC CAC TGT TTG GG-3 ', SEQ ID NO: 7) and AtFH6 3R with 200 ⁇ M dNTP, 1X PCR buffer, 0.5 U Taq DNA polymerase (Qbiogene) following the following temperature conditions, 3 min denaturation at 94 ° C and 35 cycles of 40 s at 94 °, 40 s at 55 ° C, 1 min at 72 ° C.
  • Figure 1 illustrates the results of the RT-PCR analysis of the expression profile of AtFH ⁇ in A. thaliana.
  • the RNAs were isolated from galls 7 and 14 days after infection with M.
  • Plant Sci., Vol.7 (5), p.193-5, 2002 was used for the analysis of the functionality of the promoters of the AtFH1, AtFH ⁇ and AtFHIO genes in A. thaliana.
  • This binary vector carries the spectinomycin resistance gene and a T-DNA which will be transferred to the genome of the plant.
  • the T-DNA carries the gene conferring resistance to kanamycin under the control of the constitutive promoter and the terminator of the nopaline synthase gene as well as the coding sequence of the fused enhanced Green Fluorescent Protein (Clontech) gene. to the GUS gene with the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S terminator.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • the promoters and the 5'UTR part of the AtFH1, AtFH ⁇ and AtFHIO genes were amplified by PCR from genomic DNA A.. thaliana WS ecotype using specific primers Gwp5AFH6 (5'-AAA AAG CAG GCT TCG TCT TTT GAA GTT TGG AAT TGT TGG C-3 ', SEQ ID NO: 8) and Gwp3AFH6 (5'-AGA AAG CTG GGT GGG CGA ATC GTG ATA AAC TAT TTT AC- 3 ', SEQ ID NO: 9) for the promoter of AtFH ⁇ ; Gwp5AFH1 (5'-AAA AAG CAG GCT J ⁇ T GTC GGT GGT TTC CTG ATA CT-3 ', SEQ ID NO: 10) and Gwp3AFH1 ( ⁇ '-AGA AAG CTG GGT GTG TGT TAT CTT CTT CTT TCT TCT TC-3', SEQ ID NO: 11) for the promoter
  • PCR reactions were performed with 50 ng of genomic DNA, 200 ⁇ M dNTP, 1X PCR buffer, 0.5 U Pwo DNA polymerase following the following temperature conditions, 3 min denaturation at 94 ° C and 10 cycles of 40 s at 94 °, 40s at 55 ° C, 1 min at 72 ° C.
  • the underlined sequences allow a re-amplification of the PCR product and the creation of the GATEWAY adapter using the primers adapter_attB1 (5'-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CT-3 ', SEQ ID NO: 14) and adapter_attB2 (5'-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3 ', SEQ ID NO: 15). These PCR reactions were carried out under the conditions indicated above for 20 cycles.
  • the PCR fragments obtained were sequenced and then cloned into the GATEWAY input vector pDON207 and then introduced into the vector pKGWFS7 at the attR1-attR2 recombination site located upstream of the eGFP-GUS fusion in accordance with the indications of the manufacturer of the GATEWAY system ( Invitrogen).
  • the constructs produced in the binary vectors were transferred to the GV3101 strain of Agrobacterium tumefaciens by electroporation. This strain is resistant to rifampicin and chloramphenicol.
  • the cultures of A. tumefaciens were performed at 28 ° C in LB medium containing the appropriate antibiotics.
  • Example 3 Functional analysis of the promoters of AtFH ⁇ , AtFH1 and AtFHIO Expression of the reporter gene GUS under control of the promoters AtFH1, AtFH ⁇ and AtFHIO.
  • the promoter regions (approximately 1 kb upstream of the transcription +1) of the AtFH6, AtFH1 and AtFHIO genes were cloned in fusion with the reporter genes GUS and GFP, and used to carry out stable transformations of A. thaliana as described in Example 2 above.
  • the selected transformants were inoculated with larvae of Meloidogyne incognita or Heterodera schachtii.
  • AtFH ⁇ promoter The GUS expression was observed from the 3rd day after infection in 3 independent transformants expressing this gene under control of AtFH6 promoter ( Figure 2). In the case of Meloidogyne incognita this expression is localized in the galls containing the parasite ( Figure 2A). The section of a gall examined under dark field microscopy (FIG. 2B) shows that the expression GUS is limited to giant cells ( * ) and to the cells surrounding the giant cells and the nematode (n). In the case of Heterodera schachtii, the expression GUS is also limited to the syncytium and to the cells surrounding this syncytium. The expression GUS during the development of the plant was also observed in the same transformants (Figure 3). A weak expression is observed at the root apex (A and

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Abstract

L'invention concerne l'isolement et la caractérisation d'un nouveau promoteur inductible par les pathogènes, plus particulièrement inductible suite à l'infection par les nématodes d'une plante transformée avec ledit promoteur et caractérisé en ce que la séquence promotrice isolée dirige l'expression spécifiquement dans les sites nourriciers après l'infection. L'invention se rapporte également aux séquences comprenant la séquence promotrice selon l'invention fusionnée à un gène d'intérêt ainsi qu'aux plantes transgéniques transformées par ladite construction.

Description

SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES PROMOTRICES INDUCTIBLES PAR INFECTION PAR LES PATHOGENES. L'invention concerne l'isolement et la caractérisation de promoteurs inductibles par les pathogènes, plus particulièrement par les nematodes, et dirigeant plus spécifiquement l'expression dans les sites nourriciers desdits nematodes après l'infection. Les nematodes ou « vers ronds » non segmentés forment un groupe zoologique caractérisé par sa richesse en espèces (20000 sont actuellement décrites), une structure corporelle simple et une organisation uniforme. Ce groupe, présent dans presque tous les milieux naturels, comprend des parasites de vertébrés, d'insectes et de plantes, ainsi que des espèces libres bactériophages- saprophages ou des prédateurs. Les nematodes sont les plus simples des animaux organisés. Présents dans la grande majorité des sols, depuis la zone équatoriale jusqu'aux régions tempérées froides, les nematodes phytophages constituent des parasites très importants à l'échelle mondiale. La diversité des stratégies parasitaires développées (des espèces ectoparasites jusqu'aux endoparasites sédentaires), la variabilité des exigences trophiques (spécificité d'hôte stricte ou polyphagie), ainsi que le potentiel reproducteur de ces organismes, sont à l'origine de dépréciations quantitatives et qualitatives des récoltes pouvant empêcher dans certaines conditions extrêmes, toute culture économiquement viable. Les nematodes à galles et à kystes passent l'essentiel de leur vie à l'intérieur des racines de leur plante-hôte. Leur cycle biologique comprend 4 stades juvéniles (J1 à J4), séparés par des mues, et un stade adulte. C'est au stade J2 qu'a lieu l'infection de la plante. A ce stade, le nématode, mobile, pénètre à l'intérieur de la racine et migre vers la région des tissus vasculaires, où il établit un site nourricier permanent. Les sites nourriciersτ sont des structures syncitiales ou des cellules géantes résultant de la modification par le nématode de cellules de la plante-hôte. Après le démarrage du comportement de nutrition, le nématode, devenu sédentaire, subit trois mues successives jusqu'au stade adulte. Les mâles passent par un stade immobile temporaire, puis la troisième mue donne naissance à un stade mobile; c'est à ce stade que les mâles quittent la racine. Chez la femelle, le stade adulte est entièrement immobile. La production d'œufs (des centaines par femelle) débute, selon les espèces et les conditions environnementales, 3 à 6 semaines après l'infection initiale. Le nématode à kystes (genre Heterodera ou Globodera) pénètre dans la racine au niveau de l'épiderme et migre à travers le cortex en perçant et détruisant les cellules à l'aide de son stylet. Les cellules sont endommagées et des nécroses racinaires peuvent apparaître. Après avoir atteint l'endoderme, le nématode perce la membrane d'une cellule procambiale près du xylème primaire (faisceau conducteur de la sève brute) et injecte des sécrétions grâce aux glandes salivaires. Rapidement, la cellule procambiale devient métaboliquement très active et se met à grossir par fusion successive avec les cellules voisines. Le syncytium formé peut incorporer plus de 200 cellules et se caractérise alors par des noyaux volumineux, un cytoplasme dense et des invaginations de la paroi cellulosique, qui permettent d'augmenter la surface en contact avec les tissus vasculaires. Le nématode à galles (du genre Meloidogyne), après une phase de reconnaissance à la surface de la racine, pénètre au niveau de la zone d'élongation proche de l'apex racinaire. Généralement, le nématode migre ensuite en passant entre les cellules, à l'extrémité de la racine, puis remonte dans le cylindre central jusqu'à la zone de différentiation. A cet endroit, le nématode pique, avec son stylet, 5 à 7 cellules et induit leur transformation en cellules géantes par de multiples mitoses sans formation de paroi. Les cellules géantes ainsi activées présentent les mêmes caractéristiques que le syncytium formé par le nématode à kystes : cytoplasme dense, parois épaissies et présence d'invaginations, nombreux (>100) et volumineux noyaux dans chaque cellule. L'augmentation de volume des cellules corticales conduit à la formation d'une galle typique de l'infection par Meloidogyne. Aux dégâts directs que provoquent les nematodes par l'action de leur stylet buccal peuvent s'adjoindre des effets indirects qui aggravent le stress infligé à la plante (envahissement par d'autres agents pathogènes telluriques ou transmission de virus). Parmi les nematodes phytoparasites, les formes endoparasites obligatoires sédentaires représentées par les nematodes à kystes des genres Heterodera et Globodera et les nematodes à galles du genre Meloidogyne sont responsables des dégâts les plus importants au niveau mondial. La crucifère Arabidopsis thaliana est une plante-hôte pour de nombreuses espèces de nematodes à galles et à kystes, qui a la particularité de posséder des racines fines et transparentes, se prêtant particulièrement bien à des études microscopiques. De plus, Arabidopsis thaliana est adaptée à des études moléculaires, du fait de la petite taille de son génome, entièrement séquence, et de son cycle biologique court. L'utilisation d' 'Arabidopsis thaliana permet l'identification de gènes de la plante impliqués dans la formation des sites nourriciers et l'évaluation de l'effet de leur inactivation sur le développement de la plante et du nématode. De plus, on peut tester chez Arabidopsis thaliana des gènes codant pour des composés défavorables au métabolisme du nématode. Ainsi, cette plante a été un outil important de la recherche sur les interactions nématode/plante-hôte. Des cycles biologiques complets ont été obtenus in vitro pour les parasites suivants: Heterodera schachtii, H. trifolii, H. cajani (nematodes à kystes), Meloidogyne incognita et M. arenaria (nematodes à galles) ainsi que le migrateur Pratylenchus penetrans. Un grand nombre d'écotypes d'Arabidopsis ont été séparés en différents groupes, selon leur sensibilité à H. schachtii. Cependant, aucune résistance aux nematodes n'a encore été montrée chez Arabidopsis. Une des stratégies pour rendre une plante résistante aux nematodes est la destruction du site nourricier. Cela peut être réalisé par l'expression locale d'un gène cytotoxique, par exemple le gène de la barnase (HARLEY et al., J. Mol. Biol., vol.202(4), p.913-5, 1988) sous le contrôle d'un promoteur de plante inductible par les nematodes et actif dans le site nourricier. Il faut également que ce promoteur soit le plus spécifique possible du site nourricier, afin d'éviter l'expression du gène cytotoxique dans les autres tissus de la plante. Quelques promoteurs dont l'expression est inductible par une infection par les nematodes ont été décrits dans l'art antérieur. Des promoteurs induits par l'infection par les nematodes ont été décrits chez Arabidopsis par GODDIJN et al. (Plant J., vol.4(5), p.863-73, 1993). Cinq promoteurs inductibles par les nematodes (ARM1 , 1164, 728, 25 et Lemmi9) et quatre promoteurs inhibés (CaMV35S, promoteur de la nopaline synthase, et les promoteurs RolC et RolD) ont été fusionnés à un gène reporter GUS et introduits dans les racines de la betterave à sucre par transformation avec Agrobacterium rhizogenes pour évaluer leur profil d'expression. (VAN POUCKE et al., Meded Rijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol Wet, vol.66(2b), p.591-8, 2001 ). La demande française FR 2 779 737 décrit l'implication du gène de la D-ribulose-5-phosphate-3-épimérase (RPE) dans les stades précoces de développement de cellules nourricières induites par les nematodes. La demande WO 97/46692 décrit des séquences nucléotidiques d' A. thaliana capables de diriger l'expression d'une séquence d'intérêt, notamment une séquence codant pour une substance cytotoxique, dans les racines suite à l'infection par des nematodes à galles ou à kystes. Cependant, cette expression n'est que peu spécifique, et nécessite pour éviter des effets phytotoxiques généraux indésirables, d'utiliser en complément une construction chimérique exprimant dans les autres tissus de la plante un gène codant pour un neutralisant de la toxine utilisée. La demande WO 98/31822 se rapporte à des promoteurs inductibles suite à l'infection par un pathogène, notamment par les nematodes. La lignée ARM1 (lignée Att001 dans l'article de BARTHELS et al. (Plant Cell., vol.9(12), p.2119-34, 1997) présente une expression dans les sites nourriciers après infection par Meloidogyne et Heterodera détectée 2 à 4 jours après infection et plus faible à 14 jours. Au cours du développement de la plante, l'expression est détectée au niveau des sites d'initiation des racines latérales mais également dans tous les vaisseaux des feuilles et des racines. De plus on observe une réponse du promoteur après application d'hormones végétales (auxine). II apparaît souhaitable de disposer d'autres promoteurs inductibles par les nematodes, et dont l'expression est la plus spécifique possible des tissus nourriciers. Les inventeurs ont montré que les promoteurs des gènes des formines AtFH6 ou AtFH1 ou AtFHIO dArabidopsis thaliana étaient capables d'induire l'expression d'une séquence d'intérêt dans les sites nourriciers des racines de la plante après infection par un nématode, à galles ou à kystes. D'autre part l'expression en dehors des sites nourriciers observée au cours du développement de la plante présente un niveau moins important que celle induite par les nematodes et est limitée à certains tissus, notamment, dans le cas d'AtFHβ, l'apex racinaire et les zones de differentiation précoce (sites d'initiation des racines latérales) des vaisseaux racinaires, ainsi que les vaisseaux des tissus aériens des très jeunes plantules et stipules. En outre, contrairement à ce qui a été observé pour certains autres promoteurs inductibles par les nematodes, comme par exemple celui décrit par BARTHELS et al. (1997, précité), les promoteurs des formines ne sont pas inductibles par les hormones végétales. Les formines sont des protéines impliquées dans la cytokinèse et la polarité cellulaire, chez les levures et la drosophile. Elles ont été mises en évidence récemment chez les végétaux : BANNO et CHUA (Plant Cell Physiology, vol.41(5), p.617-626, 2000) décrivent l'identification d'un ADNc complet codant pour AFH1 (Arabidopsis Formin Homology protein 1) et l'obtention de séquences complémentaires par homologie chez le tabac, CYRCKOVA (Génome Biology, vol.1(1 ), 27 avril 2000) divulgue l'utilisation des séquences des régions conservées FH1 et FH2 comme sondes pour identifier des séquences codant potentiellement pour des formines ; DEEKS et al. (Trends in Plant Science, vol.7(11), p.492-498, 2002) présentent l'identification par analyse bioinformatique de 21 gènes de la famille des protéines FH chez Arabidopsis arabidopsis et discutent de leur rôle putatif comme intermédiaires dans la cascade de signalisation affectant la réorganisation du cytosquelette chez les plantes. Aucune relation entre l'expression des formines chez les plantes et l'infection par des nematodes n'a été rapportée dans l'art antérieur. La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation du promoteur d'un gène de formine pour exprimer préférentiellement un gène d'intérêt, en réponse à l'infection par un nématode, dans les sites nourriciers formés par ledit nématode. Selon un mode de mise en œuvre préféré de la présente invention, ledit promoteur est choisi parmi les promoteurs des gènes de formine AtFHβ, AtFH1, ou AtFHIO dArabidopsis thaliana, ou parmi les promoteurs des gènes orthologues d'autres espèces végétales. La présente invention a en particulier pour objet un polynucléotide isolé constituant un promoteur inductible chez une plante par l'infection par un nématode, caractérisé en ce qu'il comprend les séquences de régulation d'un promoteur choisi parmi : - le promoteur du gène de formine AtFHβ d'Arabidopsis thaliana, représenté par la séquence SEQ ID NO: 1 ; - le promoteur du gène de formine AtFH1 d'Arabidopsis thaliana, représenté par la séquence SEQ ID NO: 2 ; - le promoteur du gène de formine AIFH10 d'Arabidopsis thaliana, représenté par la séquence SEQ ID NO: 3 ; Dans un promoteur, on désigne sous le nom de « séquences de régulation » les séquences reconnues par des facteurs de transcription qui ne sont actifs que dans certains types cellulaires particuliers, ou en réponse à un stimulus spécifique. Dans le cas présent, les séquences de régulation des promoteurs des gènes AtFHβ, AtFH1 ou AtFHIO sont les régions de ces promoteurs spécifiquement impliquées dans la réponse à l'infection par un nématode, et/ou dans l'expression préférentielle dans les sites nourriciers. L'homme du métier peut, à partir des promoteurs définis par les séquences SEQ ID NO: 1 , 2, ou 3, identifier ces séquences de régulation, par des techniques connues en elles-mêmes de dissection des promoteurs, par exemple en mesurant l'inductibilité par l'infection par un nématode et la spécificité de l'activité promotrice de mutants de délétion de ce polynucléotide, et/ou par des techniques telles que celles des empreintes sur l'ADN (footprints), en incubant les polynucléotides de séquence SEQ ID NO: 1 , 2, ou 3, ou des portions de ceux-ci, avec des extraits nucléaires de cellules des sites nourriciers, ainsi qu'avec des extraits nucléaires de cellules de tissus dans lesquels les promoteurs des gènes AtFHβ, AtFH1 ou AtFHIO sont inactifs. Selon un mode de réalisation préféré d'un polynucléotide de la présente invention, il comprend une séquence ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, avantageusement au moins 90%, et de manière tout a fait préférée au moins 95% d'identité avec l'une des séquences SEQ ID N° 1 , 2 ou 3. Un polynucléotide de la présente invention peut également être un promoteur chimérique, contenant un promoteur minimal fonctionnel dans une cellule végétale, associé aux séquences de régulation de l'un des promoteurs des gènes AtFHβ, AtFH1 ou AtFHIO. Un promoteur minimal comprend au moins les séquences permettant la fixation de l'ARN polymérase et l'initiation de la transcription. Par exemple, un promoteur minimal pour la transcription par l'ARN polymérase II comprend généralement, outre un site d'initiation de la transcription, au moins une boite TATA située en général à environ 20 à 40pb en amont du site d'initiation de la transcription, et/ou au moins un élément INR (INitiatoR) localisé au niveau du site d'initiation de la transcription ; il peut comprendre en outre, pour un niveau d'expression plus élevé, des séquences dénommées « éléments promoteurs amont » (upstream promoter éléments ou UPEs), telles que la boîte CCAAT, et/ou les séquences riches en GC qui sont reconnues par différents facteurs de transcription exprimés constitutivement dans tous les types cellulaires. La présente invention a également pour objet tout sous-fragment d'au moins 15, de préférence au moins 20, de manière tout à fait préférée d'au moins 30, et avantageusement d'au moins 50 bases consécutives de l'une des séquences SEQ ID NO: 1 , 2, ou 3, ou de son complémentaire, ainsi que tout polynucléotide d'au moins 20, de manière tout à fait préférée au moins 30, et avantageusement au moins 50 pb capable de s'hybrider dans des conditions de forte stringence avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO: 1 , 2, ou 3, ou avec son complémentaire. Le terme « isolé » au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante n'est pas isolé. Un polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel. Selon la présente invention, on entend par « % d'identité » le pourcentage de nucléotides identiques qui peut être calculé par l'homme du métier en utilisant un programme informatique de comparaison de séquences tel que, par exemple, ceux de la suite BLAST (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., vol.25, p.3389-3402, 1997), ou le programme FastDB avec les paramètres suivants : « Mistmatch penalty : 1.00 ; Gap penalty : 1.00 ; Gap Size Penalty : 0.33 ; joining penalty : 30.0 ». Ces algorithmes sont présentés dans Current Methods in Sequencing and synthesis Methods and Applications, pages 127-149, 1988, Ala. R. Liss, Inc, incorporé dans la description par référence. Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité indiqués dans le cadre de l'exposé de la présente invention sont ceux obtenus en utilisant les programmes BLAST avec les paramètres par défaut, et sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence SEQ ID NO: # indiquée comme séquence de référence. On peut également définir des polynucléotides selon l'invention par leurs propriétés d'hybridation sélective avec l'un des polynucléotides définis par les séquences SEQ ID n°1 ou SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 dans des conditions de forte stringence telles que définies dans SAMBROOK et al., Molecular Cloning A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) aux paragraphes 11.1 à 11.61. En général, des conditions de forte stringence, pour un polynucléotide donné peuvent être obtenues en opérant à une température inférieure de 5 à 10°C à la température de fusion du duplex constitué par ledit polynucléotide et son complémentaire, dans un milieu de composition donnée. A titre d'exemple de conditions d'hybridation de forte stringence utilisables dans un grand nombre de cas, on indiquera les conditions suivantes:
Préhvbridation : Même conditions que pour l'hybridation
Durée : 1 nuit.
Hybridation :
5X SSPE (0.9 M NaCI, 50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM EDTA)
5X Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB) 0.1% SDS
Durée: 1 nuit.
Lavages:
2X SSC, 0.1% SDS 10 min 65°C
1X SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C 0.5X SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C
0.1X SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C Les différences nucléotidiques que peut comprendre un acide nucléique selon l'invention par rapport aux séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2 ou encore SEQ ID N°3 peut résulter en des substitutions, délétions ou additions d'un ou plusieurs nucléotides consécutifs ou non. Des modes de réalisation préférés de promoteurs conformes à l'invention sont représentés par les polynucléotides définis par les séquences SEQ
ID N°1 ou SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3, ainsi que par les polynucléotides suivants : - le polynucléotide défini par la SEQ ID NO: 4, qui est constitué par une séquence de 1129 pb en amont de l'ATG du gène AtFH6 et qui comprend, outre la séquence SEQ ID N°1 , une séquence 5'UTR de 122 pb (soulignée dans la séquence représentée ci-après) :
GTCTTTTGAAGTTTGGAATTGTTGGCCCATATTATGTTGTAGGTAATATGGAATCAGCCGGT ACACTGGACCACAGAGGATTGTCTTTCCGTCTACAGTCTACAGAATCAGCCGGACTAGTTTT GTAACTTTTGTTTAAAAGAGCTATTTATTATTTGTAATCTTAGTTTTTAAGTTTTAACTAAA AGAATGAAGAAAATGTAGACAAAATCGAAAAGTCGATGGTGGAGGTATGTACGTGTCTTTTT CCTTTGTCCGTCTTGAAACCAACGAAACAAAATCGGAAATTGTCTACGTTAAAGGACAATCA CATTCTTAGTTAATTAATACTCCATACCAAGGGACATTTACGTCTTTAAGCACCAAAACCAT AGTATTGGATTGGCGAATCTCACGTGGCGAAAATTTCCAAATTTCCAAAGCAACAAGACCAT GAGAGTCCATCCATAATCATTTTTATTATAAACTTAATAGTCAATTTCCATGAAGCTGGACT TGAATAGTTAGGCTGTCTATTCTTCGTTTTTATGTCTTTTACGTGAACAACTCGTAATTCTT TATCTGTTTTTCTGAACATATGTTTGTTGTCGCACACGTATAATACAATTATACAAATACAT TTGTTTTTAGTCTAAAACCATCTACATTGGGATATTTTATAAGAGTTTTTTACAATAAAAAA AATAAAAATAATAAAAATGAAAGAAAGAAAGTGAATAATTAAATTATAATATAATATTAATA TTTTTTTTGTTTGAAAAACTTTGTGGGTTTCTGTCCTAAGTTATTTTTTTAATCATTTTATT AAGTACTGGTAATTACTAATTAACGGATAGTTTAAAATAAGCAGATTAAACGATCCCGGAAT GCTGACGTCAGCATCATAAATCTCAGATCTCGATACGAAACGAATTTCTCACTGCAGCAGCT ATTACTTTCCCTTTTTCACCTTTTTTTTCCTTTCTTTTTCTTTCTTTTTTCCATTTCTTAAT TTTTTCTTCCCATTGAAGATTACTCTACGATCTGACGAACAAGGCAACCAAAAAAAGGGCAA AGAACAGAGAGAGAGCAAAAAGCAGAAGAAGATGAATTTAGACGAGAATTGTAAAATAGTTT ATCACGATTCGCC - le polynucléotide défini par la SEQ ID NO: 5, qui est constitué par une séquence de 1221 pb en amont de l'ATG du gène AtFH1 et qui comprend, outre la séquence SEQ ID N°2, une séquence 5'UTR de 32 pb (soulignée dans la séquence représentée ci-après) ;
TGTCGGTGGTTTCCTGATACTCTTGTACTCTTACATTTTCAGTAGCTTTCCCACGTGACCAA TTATTTTACTCCCTTTCTTAGTCCAATTATGGTTTTCTAGCACCTCTTTTTATTTGAACTTT TATATGAACTATTAATAGTTCACTTTATAGTTTTTCTTAACATTCACAGGCCCACAAATTTT ACAAGAATCAGACATTATTTGCTTTAAATTTGATAAATTTTGCAGTCCTAGTCCTGGTAAAT TCAGTATTTCTGTCATATTCAATACCATCAATTTCTAGTGCCATTTTTATGATTGCAAAATC CAACAAAAACAAACAAAACCATGTTGTGGTCTAATGTTTGTTGCCCCAAAACAGAAAGAGGA TTCACACAGTCGACATTTGCATAAGACGCAGGAAGTATAACTGGCTTATTAAGAAGATTTAA GGGACGCATTTAGAGATATGGTTATTGCATGAACCATGATGTAGCCATTTAAAAGTTTATGG TTAACTTTACTATTTGCAACGATCGATATTTTATCAAACGATGCTACTGTATAAATTTCTCA TCATATGTCCTAATTCCTCCTTATTATCTACACCAGTTAGACCTGTCCTCCAATTTTATGCT TTGCACATACAGCATTCGGCGAAAGCACATGAACCGACCATTTACACATCCTGAGACAGTGT CGGTCAAAATAAAGTAAAGAACTCAGCACAATACACCCACTACCACTTCCTCCTCCTCAAAC ATTAACACACCATTATTTTATGTTTTCTTTATTACAGACGTCGTCAAACCGCCGTAATAACT TTTTAATAAAATAAAAATCCACTCGCATTTTTATTTTCAACATTGTGCGTACGGTGCAATTC AATGAACAGTGTTTACTTTCAGTGTGTACACTTCTGCGGACTATTACAAAGTCCACGTCTTA TCCTACGTGTTATAATCTCATATGTTACTGTCTGAAATGGACCCCACTACGTAAAAATAAAA TTAAGAATCAACCACTCTTCTTCCATCACCTCTTTTGGCTTTCTCTCTACTCTCTCTACTCT CTCTACTACTCTCTCACCATCACTGAGTTAAGAGAACAAACCAAAAACAAAATTATCAAACC ATCACCAGCAGAATCTTAGCTGGATTCATCACTCTATTCAAAAAGTTTCTCTCTTCTCTTTT CTCAGATCTTGAACTCTTGAAGAAGAAAGAAGAAGATAACACA - le polynucléotide défini par la SEQ ID NO: 6, qui est constitué par une séquence de 1238 pb en amont de l'ATG du gène AtFH1 et qui comprend, outre la séquence SEQ ID N°3, une séquence 5'UTR de 78 pb (soulignée dans la séquence représentée ci-après) :
CCTATATATGTTGCCCACCCACGAGATAAAAACAATTATTTAGTAATTAGTGTCTCCTTGGA TGTTGTGAAGAAGTTGGACTTTTGCATATTAATTCTCCCGCCAGTGTCGCAACAAAGTCTTC ATGCTCAGAGTATCAGTTCACATTCGAAACCTGATCTTTCTTACTAGTCTATTGTTATGAGA TTGGTTTTTTGGAGTGAAAATGAGCTTCGTGGAACTCTCATCAACCTCGTGAGAACATAACT TCGTGATTGTGTTCTTTGACAAGAAAAGTTGAGCTGTAGTTTTTTTTTAACAAGGTTTTGGG ATGACCAGTAGTAAATCAATTGTTGTAATAATTTGGTTGGTAAATATAACATTTGTTTTCTA CTAAACATCCAAAAATGGAGGTACGTGAATGAACACATGGTGTGTTGTAACAATTAATCTCA ATATGGCCAAACCAAGTCTTCTCCATTTCTAGTCCTTGTCTCTACAACGAAGCTATTGCGCT ATTTGTTTTGTTTGTGCAGTACGCTTCCTTCTTCTTATTGCCTTTCTTCTTAGGCGTCATAT GACTCTCTTGCATCCTCAAAAACTATGCTGATTAATTTATGCCACACCACCATTTCTCATTG AAAGCTAAATCGAAATTCAAATAAAGTCCCAAAAACATGCAAAAGTTTAATTGACCAAAAAG CTGAAAAGCTTGATGGCGTTTCAAACTAATGCACTAGTTAATTCAATTTCCATAATTACGTA GTAGTTTTTTTGGAGATTATATATTTATTATTCACGAAAAATGTGGATAAGACAAATAAAAG ACAAAGCATGCTGCATTGCTTGTTCTACTTTTTCTTTTTCTTTTTCAGACATTTTAGCCCAA CTATATACTACTCTTGATTAATTTGAATAGGATTACATAGTATTCCATAACACGAGACAAAA TAACAATATTTGGCAAATAGAAATGTTGTCTAGTTGTTTTCCTCGTAGATAAAGATAGTAGT CTCGACTTTAATAATTGGTTTGCATAGAAAAGAGAAGATAGTGTTTTGTATAGTACTAGGCA AAAGTCAAAAAGATTCTTTTGAAAGAGAGGACCCAAATTTACTTGACGTAATTATTGCATTT CATATACGTTCTTCTTCTCTCCCTACTTGATTTTTATTCAAAAACACTAGCATTAAGTCACT CTTTCGTCCTCAGATAGTGCGCATTGCAGAACACAAAATCTCTACAAGAAAACCCCAAAA Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être préparées par les techniques usuelles connues de l'homme du métier telle que définie par exemple dans SAMBROOK et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd éd., vol. 1-3, éd. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, éd. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York, 1987; et INNIS et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Académie Press: SanDiego,1990, ou encore par des méthodes incluant par exemple la synthèse chimique et des méthode mixtes comme la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage des banques d'ADN. L'invention se rapporte également à une cassette d'expression recornbinante, caractérisée en ce qu'elle comporte : - un promoteur constitué par un polynucléotide conforme à l'invention ; - une séquence hétérologue d'intérêt placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, ou un ou plusieurs site(s) de restriction permettant l'insertion d'une séquence d'intérêt sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur. Une séquence d'intérêt exprimée dans une cassette d'expression selon l'invention peut être notamment une séquence exprimant un ARN, une protéine ou un polypeptide qui protège la plante contre l'infection par les nematodes, dans le sens qui améliore la résistance de la plante à l'infection jusqu'à conférer une résistance complète et plus particulièrement un gène codant pour un composé toxique pour les nematodes ou pour les cellules des sites nourriciers. Ce composé peut avoir pour effet direct la mort des nematodes (il s'agit par exemple de toxines nématicides, de lectines, de collagénases, d'inhibiteurs de protéases, d'anticorps...), ou avoir pour effet de rendre incapable les nematodes d'effectuer une étape importante dans leur développement ou leur reproduction, provoquant à terme leur élimination. Il existe de nombreux exemples de telles substances toxiques, par exemple l'endotoxine de Bacillus thuriengiensis (EP 0 352 052). Les composés toxiques peuvent également être dirigés non pas vers les nematodes mais vers les cellules végétales de leurs sites nourriciers, afin de perturber la formation et/ou le fonctionnement de ces structures nourricières. Dans ce cas, les composés toxiques peuvent notamment être choisis parmi les DNAses, RNAses, les inducteurs de mort cellulaire, les associations de produits d'un gène de résistance et d'un gène d'avirulence, les ARN anti-sens. A titre d'exemple non- limitatif, on citera notamment la barnase, mentionnée ci-dessus. Ladite séquence d'intérêt peut être également associée à d'autres éléments de régulation tels que des activateurs et des séquences de terminaison de transcription (terminateurs). D'autres éléments tels que les introns, enhancers, séquences de polyadenylation et leurs dérivées connues de l'état de l'art peuvent également être présents dans la séquence nucléique d'intérêt pour améliorer l'expression ou le fonctionnement du gène transformant. On pourra également associer à une cassette d'expression conforme à l'invention des séquences nucléotidiques régulatrices, ne faisant pas partie du promoteur, et susceptibles de moduler l'expression de la séquence d'intérêt, en particulier : - des séquences leaders et des séquences enhancers, qui interviennent à un niveau post-transcriptionnel ou traductionnel (notamment stabilisation d'ARN et effet sur la traduction), par exemple le leader EMCV (ELROY- STEIN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol.86(16), p.6126-30, 1989) et le leader TMV (GALLIE ét al., Plant Cell, vol.1(3), p.301-11 , 1989). - des boîtes de régulation intervenant à un niveau transcriptionnel, capables de commander au moins partiellement l'activité d'un promoteur ; ces dernières boites de régulation peuvent être inductibles par un facteur physiologique ou de l'environnement de la plante. - des terminateurs de transcription ; à titre d'exemples non limitatifs on citera notamment : Le terminateur 3' Nos, terminateur de la nopaline synthase qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase provenant du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline (DEPICKER et al., J. Mol. Appl. Genêt, vol.1 , p.561-573, 1982), et le terminateur 3' CaMV, correspondant à la région 3' non codante de la séquence du virus à ADN bicaténaire circulaire de la mosaïque du chou-fleur produisant le transcrit 35S (FRANCK et al., Cell, vol.21 , p.285-294, 1980 ; Gène Bank n° V 00141 ).De plus, le gène d'intérêt peut être placé en orientation sens ou antisens selon les besoins de l'invention. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, la cassette d'expression comprend également un gène codant pour un agent de sélection (également appelé gène marqueur de sélection). Parmi ceux pouvant être utilisés, on citera notamment des gènes qui confèrent une résistance à un antibiotique (HERRERA-ESTRELLA et al, EMBO d., vol.2, p.987-995, 1983), tel que l'hygromycine, la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine ou à des herbicides (EP 242 246), tels que le glufosinate, le glyphosate ou le bromoxynil. Préférentiellement, ledit gène marqueur de sélection est choisi parmi le gène bar (WHITE et al., Nucl. Acid. Res., vol.18, p.1062, 1990 ; Gène Bank n° X 17220) qui confère la résistance à l'herbicide Basta® (glufosinate) et le gène NPTII qui confère la résistance à la kanamycine. Le système d'excision pour éliminer le gène codant un agent de sélection peut être un système de transposition, tel que notamment le système Ac/Ds du maïs (WO 02 101061), ou un système de recombinaison, tel que notamment le système Cre/lox du bacteriophage P1 , le système FLP/FRT de la levure (LYZRIK et HODGES, Nucl. Acid. Res., vol.44, p.123-132, 1997), la recombinase Gin du phage Mu, la recombinase Pin de E. coli ou le système R/RS du plasmide pSR1. Un système de co-transformation (KOMARI et al., Plant J., vol.10, p.165-174, 1996) peut également être utilisé. Préférentiellement, le système utilisé sera le système Ac/Ds du maïs. Selon un mode préféré, ledit gène est compris à l'intérieur de l'élément transposable Ds (également appelé élément dissociant ou séquence mobilisable d'un transposon). Le transposon Ds utilisé est décrit dans la publication de YODER et al. (Bio/Technology, vol.12, p.263-292, 1993). Selon un autre aspect, l'invention concerne un vecteur recombinant, d'expression ou de clonage, comprenant au moins un polynucléotide selon l'invention. Avantageusement, ledit vecteur est un vecteur d'expression contenant une cassette d'expression selon l'invention. A titre d'exemples non limitatifs de vecteurs pouvant être utilisés pour l'obtention de vecteurs recombinants conformes à l'invention on citera les vecteurs suivants : vecteur pBIN19 (BEVAN et al., Nucleic Acids Research, vol.12, p.8711- 8721 , 1984, commercialisé par la société CLONTECH, USA), vecteur 101 pBI221 , et pBI121 (JEFFERSON, Plant molecular Biology Reporter, vol.5, p.387-405, 1987, commercialisé par la société CLONTECH, USA). L'invention a également pour objet une cellule hôte transformée par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur recombinant selon l'invention. Les cellules hôtes préférées sont indifféremment d'origine bactérienne ou végétale. Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules bactériennes de différentes souches d'E. coli ou encore dAgrobacterium tumefaciens ou rhizobium. Les cellules hôtes végétales peuvent être issues en particulier de plantes dicotylédones ou monocotylédones ; à titre d'exemples non limitatifs, on citera notamment Arabidopsis, Colza, tabac, maïs, tomate, blé, orge, tournesol, pomme de terre, betterave et de riz. L'invention concerne également les tissus ou parties de plantes, plantes, ou graines transformés par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur recombinant selon l'invention. Le terme "tissu de plante" fait référence à n'importe quel tissu d'une plante, dans une plante ou dans une culture. Ce terme inclut des plantes entières, des cellules de plantes, des organes de plantes, des graines de plantes, des protoplastes, des cals, des cultures de cellules et toutes autres cellules de plantes organisées en tant qu'unité fonctionnelle et/ou structurelle. Des parties de plantes régénérées telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules, bois et analogues sont également dans le cadre de l'invention. L'invention concerne en outre une plante transgénique ou partie d'une plante transgénique contenant au moins une copie d'un transgène comprenant un polynucléotide ou une cassette d'expression selon l'invention. Lesdites plantes transgéniques ont la propriété, suite à une infection par un pathogène et notamment par un nématode, d'exprimer préférentiellement dans les sites nourriciers des racines le gène d'intérêt inséré dans ladite cassette d'expression. Des plantes transgéniques selon l'invention peuvent notamment être générées à partir des cellules végétales transformées conformes à l'invention. Les techniques pour cultiver et régénérer des plantes entières à partir de cellules ou tissus transformés sont connues de l'homme du métier, cf. par exemple HANSEN et WRIGHT (Trends Plant Sci., vol.4(6), p.226-231 , 1999) ou KOMARI et al. (Curr. Opin. Plant. Biol., vol.1(2), p.161-5, 1998). Une plante transgénique selon l'invention peut être obtenue à partir de toute plante que l'on souhaite pouvoir protéger contre une infection par des nematodes. Il peut s'agir, à titre d'exemples non-limitatifs, du Colza, du blé, de l'orge, du tournesol, du tabac, du maïs, ou encore d'Arabidopsis thaliana. L'invention englobe également tout procédé d'obtention de plantes transgéniques conformes à l'invention. Pour la mise en œuvre d'un procédé conforme à l'invention on peut utiliser toute technique de transgenèse végétale convenant au type de plante que l'on souhaite protéger. Généralement, on transforme des cellules de plantes (isolées, sous forme de protoplastes, ou sous forme d'un tissu ou organe végétal) par une cassette d'expression conforme à l'invention, et on régénère des plantes entières à partir des cellules transformées. La transformation en question peut se faire soit directement, soit indirectement, au moyen d'un vecteur comprenant une cassette d'expression conforme à l'invention. Par transformation directe, on entend toute transformation d'une cellule de plante réalisée directement par un vecteur selon les techniques connues de l'homme du métier telles qu'au moyen d'une micropipette pour assurer le transfert mécanique de l'ADN, à l'aide du polyéthylène glycol, par pénétration biolistique à haute vitesse au moyen de petites particules contenant soit à l'intérieur soit à leur surface l'acide nucléique à faire pénétrer dans la cellule de plante, par fusion de protoplastes avec d'autres entités, cellules, lysosomes, ou autre corps de surfaces lipidiques susceptible de fusionner, ou par électroporation. La transformation de cellules de plantes peut également être réalisée par l'insertion de la séquence nucléique d'intérêt au sein d'un plasmide recombinant par exemple d'origine bactérienne dans lequel a été préalablement inséré le génome d'un ADN viral tel que celui du virus de la mosaïque du chou-fleur, le plasmide résultant étant utilisé pour transformer les cellules de plantes. Par transformation indirecte, on entend une transformation consistant par exemple à transformer un microorganisme tel q 'Agrobacterium tumefaciens au moyen de la susdite séquence nucléique, ledit microorganisme étant ensuite utilisé pour transformer les cellules de plantes. Selon un mode de mise en œuvre d'un procédé conforme à l'invention, il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une cellule végétale transformée conforme à l'invention ; b) régénération, à partir de ladite cellule, d'une plante entière contenant dans son génome au moins une copie d'une cassette d'expression conforme à l'invention. Selon un autre mode de mise en œuvre d'un procédé conforme à l'invention, il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une cellule transformée d'Agrobacterium tumefaciens conforme à l'invention, b) transformation d'une plante d'intérêt par infection avec la cellule transformée d'Agrobacterium tumefaciens obtenue à l'étape a). Avantageusement, un procédé conforme à l'invention peut en outre comporter une étape de croisement de plantes transgéniques obtenues, et une étape de sélection, parmi les plantes issues de ce croisement, de celles qui comprennent au moins une copie d'une cassette d'expression conforme à l'invention. L'invention a également pour objet les graines ou semences obtenues à partir d'une plante transgénique selon l'invention. L'invention porte aussi sur l'utilisation d'au moins une cassette d'expression selon l'invention pour obtenir une plante résistante à l'infection par les nematodes. L'invention porte également sur une méthode pour protéger une plante d'une infection par un nématode comprenant les étapes de transformation de plantes avec une cassette d'expression selon l'invention et la sélection des plantes ayant intégré la séquence nucléotidique d'intérêt. L'invention a également trait à une méthode pour identifier un promoteur spécifique des sites nourriciers comprenant les étapes d'identification des homologues des gènes de for ine dans les espèces autre qu' Arabidopsis thaliana comme par exemple le blé et/ou le maïs par comparaison de séquences desdites espèces avec les séquences des gènes de formine d'Arabidopsis thaliana, et l'identification des promoteurs des séquences homologues issues de cette comparaison par les techniques usuelles connues de l'homme du métier. De plus l'invention a également pour objet un kit de transformation de plantes comprenant une cassette d'expression selon l'invention ou un vecteur de clonage et/ou d'expression selon l'invention. Enfin l'invention concerne toute utilisation d'une séquence nucléotidique promotrice selon l'invention pour exprimer un gène dans une plante infectée par des nematodes, au niveau des sites nourriciers desdits nematodes. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'inductibilité et le profil d'expression des promoteurs des gènes AtFH6, AtFH1 et
AtFHIO.
EXEMPLES
Exemple 1 : Profil d'expression du gène AtFHβ chez A. thaliana Le profil d'expression de AtFHβ chez A. thaliana a été analysé par
RT-PCR, à partir d'ARNm isolé de racines non infectées, de fragments non- méristématiques de racines non infectées, de plantules âgées de 5 jours, de parties aériennes et de feuilles isolées de plantes âgées de 10 jours, et de galles 7 et 14 jours après infection par M. incognita. Des ADNc simples brins ont été préparés à partir de 500 ng d'ARN poly(A)+ en utilisant la «Superscript II reverse transcriptase » (Invitrogen) avec l'amorce oligo(dT). Les réactions PCR ont été réalisées avec les amorces AtFH6 F3for (5'-AGA TCG AGC CAC TGT TTG GG-3', SEQ ID NO :7) et AtFH6 3R avec 200 μM dNTP, 1X tampon PCR, 0,5 U Taq DNA polymérase (Qbiogene) en suivant les conditions de température suivante, 3 min dénaturation à 94°C et 35 cycles de 40 s à 94°, 40s à 55°C, 1 min à 72°C. La Figure 1 illustre les résultats de l'analyse par RT-PCR du profil d'expression de AtFHβ chez A. thaliana. Les ARNs ont été isolés de galles 7 et 14 jours après infection par M. incognita (G7 and G 14), racines non infectées (Ro), fragments non-méristématiques de racines non infectées (RnM), plantules âgées de 5 jours (Se), partie aérienne (Ap) et feuilles isolées (Le) de plantes âgées de 10 jours.
Exemple 2 : Construction des fusions promoteur GFP-GUS/GFP et transformation des plants d'Arabidopsis Le vecteur pKGWFS7 compatible GATEWAY (KARIMI et al., Trends
Plant Sci., vol.7(5), p.193-5, 2002) a été utilisé pour l'analyse de la fonctionnalité des promoteurs des gènes AtFH1, AtFHβ et AtFHIO chez A. thaliana. Ce vecteur binaire porte le gène de résistance à la spectinomycine et un ADN-T qui sera transféré au génome de la plante. L'ADN-T porte le gène conférant la résistance à la kanamycine sous contrôle du promoteur constitutif et du terminateur du gène de la nopaline synthase ainsi que la séquence codante du gène de l'eGFP (« enhanced Green Fluorescent Protein » ; Clontech) fusionné au gène GUS avec le terminateur 35S du virus de la mosaïque du chou fleur (CaMV). Les promoteurs et la partie 5'UTR des gènes AtFH1, AtFHβ et AtFHIO ont été amplifiés par PCR à partir d'ADN génomique d'A. thaliana écotype WS à l'aide des amorces spécifiques Gwp5AFH6 (5'-AAA AAG CAG GCT TCG TCT TTT GAA GTT TGG AAT TGT TGG C-3', SEQ ID NO :8) et Gwp3AFH6 (5'-AGA AAG CTG GGT GGG CGA ATC GTG ATA AAC TAT TTT AC- 3', SEQ ID NO :9) pour le promoteur de AtFHβ ; Gwp5AFH1 (5'-AAA AAG CAG GCT JÇT GTC GGT GGT TTC CTG ATA CT-3', SEQ ID NO :10) et Gwp3AFH1 (δ'-AGA AAG CTG GGT GTG TGT TAT CTT CTT CTT TCT TCT TC-3', SEQ ID NO :11) pour le promoteur de AtFH1 ; Gwp5AFH10 (5'-AAA AAG CAG GCT TCC CTA TAT ATG TTG CCC ACC CAC G-3', SEQ ID NO :12) et Gwp3AFH10 (5'-AGA AAG CTG GGT GTT TTG GGG TTT TCT TGT AGA GAT TTT G-3', SEQ ID NO :13) pour le promoteur de AtFHIO. Les réactions PCR ont été réalisées avec 50 ng d'ADN génomique, 200 μM dNTP, 1X tampon PCR, 0,5 U Pwo DNA polymérase en suivant les conditions de température suivante, 3 min dénaturation à 94°C et 10 cycles de 40 s à 94°, 40s à 55°C, 1 min à 72°C. Les séquences soulignées permettent une réamplification du produit PCR et la création de l'adaptateur GATEWAY à l'aide des amorces adaptateur_attB1 (5'-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CT-3', SEQ ID NO :14) et adaptateur_attB2 (5'-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3', SEQ ID NO :15). Ces réactions PCR ont été réalisées en suivant les conditions indiquées ci-dessus durant 20 cycles. Les fragments PCR obtenus ont été séquences puis clones dans le vecteur d'entrée GATEWAY pDON207 puis introduit dans le vecteur pKGWFS7 au niveau du site de recombinaison attR1-attR2 situé en amont de la fusion eGFP-GUS conformément aux indications du fabricant du système GATEWAY (InVitrogen). Les constructions réalisées dans les vecteurs binaires ont été transférées à la souche GV3101 d'Agrobacterium tumefaciens par électroporation. Cette souche est résistante à la rifampicine et au chloramphénicol. Les cultures d'A. tumefaciens ont été effectuées à 28°C dans un milieu LB contenant les antibiotiques appropriés. Les plants d'Arabidopsis cultivés en chambre climatisée, âgés d'environ 4 à 6 semaines (premières siliques développées), ont été transformés par trempage des fleurs dans la suspension d'A. tumefaciens selon la méthode décrite par CLOUGH et BENT (Plant d., vol.16(6), p.735-43, 1998). Après traitement, les plantes (T0) ont été repiquées dans du terreau et recouvertes d'une mini-serre pendant deux à trois jours afin d'éviter la déshydratation des plants et favoriser l'enracinement. Après 4 à 6 semaines de culture, la descendance de ces plantes (T1) a été récoltée. Les transformants ont été sélectionnés in vitro puis transférés en terre. Les semences (T2) issues de l'autofecondation des plantes T1 ont été utilisées pour les analyses histologiques. Exemple 3 : Analyse fonctionnelle des promoteurs de AtFHβ, AtFH1 et AtFHIO Expression du gène rapporteur GUS sous contrôle des promoteurs AtFH1, AtFHβet AtFHIO. Les régions promotrices (environ 1 kb en amont du +1 de transcription) des gènes AtFH6, AtFH1 et AtFHIO ont été clonées en fusion avec les gènes rapporteurs GUS et GFP, et utilisées pour réaliser des transformations stables d'A. thaliana comme décrit à l'exemple 2 ci-dessus. Les transformants sélectionnés ont été inoculés avec des larves de Meloidogyne incognita ou Heterodera schachtii. Promoteur AtFHβ L'expression GUS a été observée dès le 3eme jour après infection, chez 3 transformants indépendants exprimant ce gène sous contrôle du promoteur AtFH6 (Figure 2). Dans le cas de Meloidogyne incognita cette expression est localisée au niveau des galles contenant le parasite (figure 2A). La coupe d'une galle examinée en microscopie à fond noir (figure 2B) montre que l'expression GUS est limitée aux cellules géantes (*) et aux cellules entourant les cellules géantes et le nématode (n). Dans le cas de Heterodera schachtii, l'expression GUS est également limitée au syncytium et aux cellules entourant ce syncytium. L'expression GUS au cours du développement de la plante a également été observée chez les mêmes transformants (Figure 3). On observe une expression faible au niveau de l'apex racinaire (A et
B), ainsi qu'aux sites d'initiation des racines latérales (C et D). Dans les jeunes plantules, on observe une expression GUS (flèche) à la base des feuilles émergentes 4 jours (E) et 6 jours (F et G) après germination. Dans les jeunes plantules cultivées 7 jours à l'obscurité, l'expression GUS est observée au niveau du cylindre vasculaire (H et I). Promoteurs AtFHL et AtFHIO. L'expression du gène rapporteur GUS a été observée 7 jours après infection par Meloidogyne incognita, chez 2 transformants indépendants exprimant ce gène sous contrôle du promoteur AtFH1 et 2 transformants indépendants exprimant ce gène sous contrôle du promoteur AtFHIO (Figure 4). L'expression GUS est observable dans les galles (figure 4A et 4D) mais également - pour AtFH1 dans le cylindre vasculaire et les bourgeons floraux
(figure 4B et 4C). - pour AtFHIO dans le cylindre vasculaire (figure 4E) Ces résultats sont en accord avec les expériences de RT-PCR indiquant, pour AtFH1 et AtFHIO, l'expression au niveau des racines dans les zones non méristématiques et dans les galles. Analyse par PCR quantitative L'activation transcriptionnelle des gènes AtFH1 AtFHβ et AtFHIO a été également étudiée par PCR quantitative. Les résultats obtenus confirment les observations concernant l'expression du gène rapporteur GUS. L'ensemble de ces résultats est résumé dans le Tableau I ci-après. TABLEAU I
Figure imgf000022_0001

Claims

REVENDICATIONS 1. Polynucléotide isolé constituant un promoteur inductible chez une plante par l'infection par un nématode, caractérisé en ce qu'il comprend les séquences de régulation du promoteur du gène de formine AtFHβ d'Arabidopsis thaliana, représenté par la séquence SEQ ID NO: 1.
2. Polynucléotide selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polynucléotide défini par la séquence SEQ ID N° 1 , ou la séquence SEQ ID NO: 4 ; b) un polynucléotide comprenant une séquence présentant au moins
80 % d'identité avec la séquence SEQ ID N° 1.
3. Cassette d'expression recombinante, caractérisée en ce qu'elle comporte : - un promoteur constitué par un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2 ; - une séquence hétérologue d'intérêt placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, ou un ou plusieurs site(s) de restriction permettant l'insertion d'une séquence d'intérêt sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.
4. Cassette d'expression selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite séquence d'intérêt exprime un ARN, une protéine ou un polypeptide qui protège la plante contre l'infection par les nematodes.
5. Vecteur recombinant comprenant au moins une cassette d'expression selon l'une des revendications 3 ou 4.
6. Cellule hôte transformée par une cassette d'expression selon l'une des revendications 3 ou 4.
7. Cellule transformée selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule végétale.
8. Plante transgénique ou partie d'une plante transgénique contenant au moins une copie d'un transgène comprenant une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4.
9. Plante transgénique selon la revendication 7 ou 8 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les plantes des espèces suivantes : Arabidopsis thaliana, Colza, tabac, maïs, blé, orge, tournesol.
10. Procédé d'obtention d'une plante transgénique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Obtention d'une cellule végétale transformée selon la revendication 7, b) régénération, à partir de ladite cellule, d'une plante entière contenant dans son génome au moins une copie d'une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 3 ou 4.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de croisement de plantes transgéniques obtenues à l'étape b), et une étape de sélection, parmi les plantes issues de ce croisement, de celles qui comprennent au moins une copie d'une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 3 ou 4.
12. Graine obtenue à partir d'une plante transgénique selon la revendication 8.
13. Méthode pour protéger une plante d'une infection par un nématode caractérisée en ce qu'elle comprend la transformation de ladite plante avec une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4.
14. Méthode pour identifier un promoteur spécifique des sites nourriciers de nematodes comprenant les étapes suivantes : a) Identification des homologues des gènes de formine dans les espèces autres qu'Arabidopsis thaliana par comparaison de séquences desdites espèces avec celles des gènes de formine. b) Identification des promoteurs des gènes homologues identifiés à l'étape a).
15. Utilisation d'au moins un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 pour exprimer un gène dans les sites nourriciers de nematodes.
16. Utilisation d'au moins un polynucléotide selon l'une des revendications 1 ou 2 pour obtenir une plante résistante à l'infection par les nematodes.
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