WO2005050188A9 - 同位体標識化内部標準物質を用いる定量方法、該定量方法を実行する解析システムおよび該解析のためのプログラム - Google Patents

同位体標識化内部標準物質を用いる定量方法、該定量方法を実行する解析システムおよび該解析のためのプログラム

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Yasushi Ishihama
Tsuyoshi Tabata
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Yoshiya Oda
Yasushi Ishihama
Tsuyoshi Tabata
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
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    • Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry

Definitions

  • Quantification method using isotope-labeled internal standard substance analysis system for executing the quantification method, and program for the analysis
  • the present invention adds an internal standard substance, which is a metabolically isotopically labeled biomolecule, or a cell containing an alternatively isotopically labeled biomolecule, an internal standard substance to a sample.
  • the present invention relates to a method for quantifying one or more biomolecules in a sample by measuring with a mass spectrometer.
  • the present invention relates to a biomolecule quantitative analysis method, and more particularly, the present invention relates to an analysis method using an isotope-labeled biomolecule and a program for the analysis. .
  • the genome is the total DNA contained in one cell, including all genes and intergenic regions of the organism, and the life we know is determined by the genome.
  • human base sequences have already been read and the number of genes is being predicted.
  • base sequence information alone is not sufficient.
  • the entire genome such as E. coli, yeast, nematode, and Drosophila has been revealed. All gene functions of these model organisms Is not clear.
  • Proteomics is one of the important items in the post-genomic era, but this technology is attracting attention for functional analysis of genes.
  • proteome technology mass analyzers and databases, and the search engines that connect them, protein identification has been dramatically facilitated, allowing specific protein mixtures (eg, a certain protein complex) to be identified. Extensive identification has become possible (for example, see Non-Patent Documents 1-4).
  • this in vivo labeling method can be applied to all cells in principle as long as it is a cultured cell, but in practice, the growth rate of the cell greatly changes by changing the culture conditions. Cultivation in a medium containing stable isotopes is often difficult. In other words, it can be performed only with limited cells that are not affected by the culture conditions. Furthermore, tissues such as animals and humans cannot be cultured easily and cannot be measured by this method.
  • the following method has been found as a method for exhaustively quantifying proteins in tissues.
  • the cysteine residues of the protein contained in the sample are labeled by adding an isotopically labeled cysteine residue reaction reagent and an unisotopically labeled cysteine residue reaction reagent to the two types of samples to be compared.
  • protein quantification was made possible by purifying the protein with a column, analyzing it with a mass spectrometer, and comparing the intensity of the paired peaks (see, for example, Non-Patent Document 14-19).
  • proteins that do not contain cysteine residues cannot be quantified, and it is not possible to compensate for fluctuations in the quantified value from experiment to experiment at the pretreatment stage such as purification.
  • Peptide fragments obtained by enzymatic digestion of proteins contained in two types of samples to be compared are isotopically labeled with isotopically labeled molecules such as C-terminal, N-terminal, glutamic acid residue, and aspartic acid residue. Proteins can be quantified by labeling each with a small molecule, analyzing with a mass spectrometer, and comparing the intensity of the paired peaks (for example, see Non-Patent Documents 20-23).
  • the conventional quantitative proteome analysis methods directly compare the internal standard substance and the analyte, and it is necessary to change the internal standard substance to be labeled when the measurement target changes. On the other hand, it is not easy to quantify the biomolecule of the internal standard substance.
  • proteome analysis refers to an analysis for clarifying the relationship between genetic information and various proteins that interact in a complex manner in cells (for example, see Non-patent Document 24).
  • proteome analysis is a method that comprehensively analyzes all the proteins that make up cells.
  • two-dimensional electrophoresis it is possible to comprehensively identify the type of an expressed protein by gel-developing and cutting out a spot corresponding to the target protein. For this reason, two-dimensional electrophoresis is a useful qualitative analysis tool in proteome analysis.
  • mass spectrometry is used as another important protein analysis technique.
  • This method is a method for analyzing the accurate mass of proteins and peptides using a mass spectrometer.
  • This mass spectrometer is generally composed of a device that ionizes proteins and peptides, and a mass spectrometer that includes a mass separation unit that separates the protein and peptide according to their mass and analyzes the mass.
  • protein identification is dramatically facilitated by mass spectrometers and protein databases, and a search system that connects them. Therefore, it is possible to comprehensively identify a specific protein group (for example, a protein group forming a certain complex).
  • Non-Patent Document 1 “Nature Genetics” No. 20, September 1998, p. 46-50
  • Non-Patent Document 2 “Journal 'Ob' Cell 'Biology” No. 14 1st, No. 4, May 18, 1 year, p. 967-977
  • Non-Patent Document 3 "Current Opinion in Cell Biology” 15th, No. 2, April 2003, p. 199-205
  • Non-Patent Document 4 “Current Opinion in Chemical Biology” Vol. 7, No. 1, February 2003, p. 21-27
  • Non-Patent Document 5 ⁇ Surgery Today '' No. 23, No. 3, 1993, p.
  • Non-Patent Document 6 “Rapid 'Communications' in 'Mass' Spectrometry, Vol. 8, No. 5, 1994, p. 377-380
  • Non-Patent Document 7 'Chromatography I' Oournal of
  • Non-Patent Document 8 “Analytical Biochemistry” No.231, No.1, Oct. 1995, p. 141-150
  • Non-Patent Document 9 "Journal of Ob 'Chromatography ⁇ ⁇ ⁇ B (Journal of
  • Non-Patent Document 10 "Proceedings of the National Academv of Sciences of the United States” Proceedings of the National Academv of Sciences of the United States of America) No. 100, No. 12, 2003 June, p. 6940-6945
  • Non-Patent Document 11 “Current Opinion in Chemical Biology” Vol. 7, No. 1, February 2003, p. 70-77
  • Non-Patent Document 12 “Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States” (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States) of America) '' No. 96, No. 12, June 1999, p. 6591-6596
  • Non-Patent Document 13 “Methods” No. 29, No. 2, February 2003, p. 124-130
  • Non-patent Reference 14 “Nature Biotechnology” No. 17, No. No. 10, October 1999, p. 994-999
  • Non-Patent Document 15 "Analytical Chemistry,” No. 70, No. 24, December 1998, p. 5150-5158
  • Non-Patent Document 16 “Rapid Communications in Mass Spectrometry ⁇ 16, No. 15, 2002, p. 1416—142 4
  • Non-Patent Literature 17 "Journal ⁇ Ob ⁇ The ⁇ American 'Society ⁇ Mass ⁇ Speterometry
  • Non-Patent Document 18 “Nature Biotechnology” No. 19, No. 19
  • Non-Patent Document 19 “Molecular and Cellular Proteomics” No. 1, No. 1, January 2002, p. 19-29
  • Non-Patent Document 20 “Analytical Chemistry”, Vol. 73, No. 13, July 2001, p. 2836-2842
  • Non-Patent Document 21 “Rapid Communications in Mass Spectrometry ⁇ 15, 14, 2001, p. 1214-122
  • Non-Patent Document 22 “ Nichiyaichi ”Bio Technology (Nature Biotechnology) No. 20, No. 2, February 2002, p. 163-170
  • Non-Patent Document 23 “Nature Biotechnology” No. 20, No. 5, May 2002, p. 512-515
  • Non-Patent Document 24 Karn, P. Science 270, pp. 369-370, 1995
  • Non-Patent Document 25 “Proteome Analysis Method” Yodosha Published July 10, 2000 pp. 111-122 Patent Document 1: USP 6391649
  • Patent Document 2 WO2003 016861
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and the problem to be solved is a sample that cannot be metabolically labeled (for example, a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, The precise quantification of one or more biomolecules in a protein complex, etc., and the absolute quantification.
  • a sample that cannot be metabolically labeled (for example, a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, The precise quantification of one or more biomolecules in a protein complex, etc., and the absolute quantification.
  • the present invention provides an analysis system and an analysis method that enable a quantitative analysis of a mass spectrometry spectrum even when the mass spectrometry spectrum of a plurality of different biomolecular forces contributes to the mass spectrometry spectrum. Is to provide. Furthermore, the present invention provides an analysis system and an analysis method for adding quantitative analysis and functional information on biomolecules that work.
  • the present inventors have prepared biomolecules that are pre-isotopically labeled in mass spectrometry for biomolecules, and added to each sample. Accurately measure one or more biomolecules in a sample that cannot be metabolically labeled by measuring with a mass spectrometer (eg, tissue, biological fluids, cells, cell organs, protein complexes, etc.) I found out. Also, comprehensive absolute quantification of biomolecules can be achieved by quantifying previously prepared isotope-labeled biomolecules. As a result, the present invention has been completed. In addition, in the mass spectrometry of biomolecules, we have found that more accurate quantitative analysis of biomolecule expression is possible by applying waveform separation processing to the mass spectrometry spectrum together with the isotope labeling method. It came to complete invention.
  • a mass spectrometer eg, tissue, biological fluids, cells, cell organs, protein complexes, etc.
  • An internal standard substance which is a metabolically isotopically labeled biomolecule, or a cell containing an internal standard substance, which is a metabolically isotopically labeled biomolecule, is added to a sample.
  • a method for quantifying biomolecules in a sample using a mass spectrometer is added to a sample.
  • a method for quantifying one or more biomolecules in a sample comprising:
  • a method for quantifying biomolecules comprising:
  • a method for quantifying one or more biomolecules in a sample comprising:
  • a method for quantifying one or more biomolecules in a sample comprising:
  • a method for absolute quantification of one or more biomolecules in a sample, the biomolecule in an internal standard being a metabolically isotopically labeled biomolecule, or metabolically isotopically labeled The method according to any one of [6] to [9], wherein the biomolecule in the cell containing an internal standard substance that is a biomolecule is a known amount,
  • An isotope-unlabeled synthetic peptide is applied to a cell containing an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule or an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule. Adding step;
  • the biomolecule is a molecule selected from the group force consisting of proteins, lipids, sugar chains and nucleic acids, and combinations thereof. [1] None of [1] and [14] the method of,
  • the sample is selected from the group consisting of tissues, biological fluids, cells, cell organs, and protein complexes. The method described in
  • the isotope is any isotope selected from the group force consisting of 2 H, 13 C, 15 N, 17 0, 18 0, 33 P and 34 S, and combinations thereof [1] ] To the method according to any one of [18],
  • a cell comprising an internal standard substance which is a metabolically isotope-labeled biomolecule used in the method according to any one of [1] to [20],
  • a program for absolute quantification of one or more biomolecules in a sample The biomolecule in the internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule or in the cell that contains the internal standard substance that is metabolically isotope labeled is a known amount.
  • the program described in any one of [29] is provided.
  • An analysis system a mass spectrometer for performing mass analysis of the first and second biomolecules, and a control unit having a data input / output unit for receiving data related to mass spectrometry of the biomolecules from the mass spectrometer
  • the control unit includes: a first m / z value for the biomolecule for which the arrangement of the biomolecule constituents is determined; and the second m / z value for which the arrangement of the biomolecule constituents is determined.
  • Mass spectrometry spectrum for the value of and mass spectrometry vector for time A processing unit for extracting data including a mask mouth matogram) from data relating to mass analysis obtained by the mass spectrometer, and mass analysis with respect to time at the first and second m / z values from the processing unit.
  • a processing unit for extracting data including a mask mouth matogram A processing unit for extracting data including a mask mouth matogram) from data relating to mass analysis obtained by the mass spectrometer, and mass analysis with respect to time at the first and second m / z values from the processing unit.
  • An analysis system comprising a waveform processing unit that receives a spectrum (mask mouth matogram) and separates a mass analysis spectrum (mask mouth matogram) with respect to the above time. According to such a configuration, mass spectrometry spectra derived from unique biomolecules can be obtained, enabling more quantitative analysis.
  • the first and second m / z values are determined by the arrangement of the constituent components of the biomolecule. From the first m / z value of the first biomolecule, based on the number of isotope unlabeled components of the first biomolecule and information on the charge of the first biomolecule, Determining the second m / z value of the second biomolecule, or from the second m / z value of the second biomolecule from which the sequence of the constituents of the biomolecule was determined, The first m / z value of the first biomolecule is determined based on the number of isotope-labeled components of the second biomolecule and information on the charge of the second biomolecule.
  • control unit is a unique biomolecule obtained by waveform separation processing from the waveform separation processing unit.
  • the waveform area derived from the first m / z value is calculated, and the first waveform area value derived from the first m / z value and the second m / z value unique biomolecule.
  • an arithmetic unit for calculating a ratio of (the first waveform area) / (the second waveform area) from the value of the second waveform area derived from the above. According to the strong configuration, the protein expression can be quantitatively analyzed by comparison with one of the proteins.
  • control unit may include a component of the biomolecule after waveform separation.
  • An information adding unit is further provided that classifies each sequence, collates the sequence with a database having biomolecule function information, and associates the sequence with the function based on the collation result. According to such a configuration, it is possible to associate the arrangement of the constituent components of the biomolecule separated in waveform with the function information.
  • control unit in the analysis system according to any one of [31] to [34], [35] is configured to detect a biomolecule from an array of components of the biomolecule. And an arithmetic unit that obtains an average value from the quantitative values of the constituent components of each biomolecule constituting the biomolecule and sets it as a representative quantitative value of the biomolecule. According to the configuration, it is possible to obtain a representative quantitative value of the constituent component of the biological molecule, and to correlate with the functional information by comparing with a database described later.
  • control unit may convert the arrangement of components of the biomolecule to a biomolecule.
  • An information adding unit that collates with a database having the functional information and obtains functional information of the biomolecule is further provided. According to such a configuration, it is possible to obtain knowledge about the relationship between representative quantitative values of constituent components and functional information.
  • Mass spectrometry is performed in the presence of an internal standard substance, and the waveform processing unit receives a mass spectrometry spectrum (mask mouth matogram) with respect to time at the m / z value of the internal standard substance.
  • the calculation unit calculates a waveform area specific to the internal standard substance from the waveform processing unit, and 1 waveform area) / (waveform area specific to the internal standard) and / or (second waveform area) / (waveform area specific to the internal standard) Calculate further.
  • the configuration if the amount of biomolecule in the internal standard substance is a known amount, absolute quantification is possible.
  • [38] Analysis of data on mass spectrometry of the first and second biomolecules with an internal standard substance that is an isotope-labeled biomolecule
  • a mass spectrometer that performs mass spectrometry of the first and second biomolecules and the isotope-labeled biomolecule, and receives data relating to mass spectrometry of the biomolecule from the mass spectrometer
  • a control unit having a data input / output unit, and the control unit includes first and second m / z values for the biomolecule for which the arrangement of the components of the biomolecule is determined, and the configuration of the biomolecule.
  • the first and second biomolecules and the front The data including the mass spectrometry spectrum with respect to the m / z value of the biomolecule of the internal standard substance and the mass spectrometry spectrum with respect to time (mask mouthmatogram) are extracted from the mass spectrometry data obtained by the mass spectrometer.
  • An analysis system includes a waveform processing unit that performs waveform separation processing on a mouth matogram). According to the powerful configuration, even if the biomolecule is unisotopically labeled, a mass spectrometry spectrum derived from the biomolecule unique to the biomolecule can be obtained in comparison with the isotope-labeled internal standard substance. , Enabling more quantitative analysis.
  • the determination of the m / z value of the first and second and internal standard substances is a component of a biomolecule. From the first and second m / z values of the first and second biomolecules for which the minute sequence has been determined, the number of isotopically unlabeled components of the first and second biomolecules and Said Based on the charge information of the first and second biomolecules, the value of m / z of the internal standard substance of the internal standard substance is determined, or the arrangement of the constituents of the biomolecule is determined Based on the m / z value of the internal standard substance biomolecule of the internal standard substance, based on the number of isotope-labeled components of the internal standard biomolecule and the charge of the biomolecule of the internal standard substance And determining the first and second m / z values of the first and second biomolecules.
  • control unit is a unique unit obtained by waveform separation processing from the waveform separation processing unit.
  • the area of the waveform derived from the biomolecule is calculated, and the first and second waveform area values derived from the specific biomolecule in the first and second m / z values and the internal standard substance are calculated.
  • a calculation unit for calculating a ratio of (second waveform area) / (waveform area specific to the internal standard substance) is further provided.
  • control unit may be a component of the biomolecule after waveform separation.
  • An information adding unit is further provided that classifies each sequence, collates the sequence with a database having biomolecule function information, and associates the sequence with the function based on the collation result.
  • control unit extracts a biomolecule from an array of components of the biomolecule.
  • a calculation unit is further provided that specifies the average value from the quantitative values of the constituent components of each biomolecule that constitutes the biomolecule and sets it as a representative quantitative value of the biomolecule.
  • control unit may convert the arrangement of the components of the biomolecule into a biomolecule.
  • An information adding unit that collates with a database having the functional information and obtains functional information of the biomolecule is further provided.
  • the analysis scenario according to any one of [31] to [43] above.
  • the isotopes used for the isotope labeling are: “C, 15 N, 170 , 180 , 33 P and 34 S, and a combination force thereof. It is a rank.
  • the sequence of the constituent components is determined between the data obtained by the MS / MS processing and the biomolecule database.
  • the arrangement of the constituent components is determined by collation.
  • the biomolecule in the analysis system according to any one of [31] to [46], [47] is a biomolecule in which the sample force is separated over time. It is.
  • the analysis system according to any one of [31] to [47] above, [48] the biomolecule includes a protein, a lipid, a sugar chain, a nucleic acid, and These combined forces are the group forces that are selected.
  • [49] Analysis of data on mass spectrometry of the first biomolecule and the second biomolecule isotopically labeled with respect to the first biomolecule.
  • a first m / z value of the first biomolecule for which the arrangement of the constituent components of the biomolecule is determined among the data relating to mass spectrometry of the biomolecule measured by a mass spectrometer Determining the second m / z value of the second biomolecule from which the sequence of the constituents of the biomolecule has been determined; and from the first and second m / z values, Extracting data including mass spectrometry spectrum for the m / z value of one biomolecule and the second biomolecule and mass spectrometry spectrum (mask mouth matogram) for time with respect to the mass spectrometry, and Mass spectrometry of first and second biomolecules over time A waveform separation process of a spectrum (mask mouth matogram), and an analysis method,
  • the first and second m / z values are determined from the first m / z value of the first biomolecule from which the sequence of the components of the biomolecule is determined.
  • the second m / z value of the second biomolecule is determined, or the biomolecule From the second m / z value of the second biomolecule for which the arrangement of the constituents of the second biomolecule is determined, the number of isotopically labeled constituents of the second biomolecule and the second biomolecule.
  • the step of calculating the analysis method according to [49] or [50] further comprising:
  • the method further includes the step of collating the arrangement of the constituents of the biomolecule with a database having biomolecule function information to obtain the function information of the biomolecule, [49] ] Of the analysis method described in
  • the analysis method according to any one of [49] to [54], further including a step of calculating a ratio of a waveform area specific to the substance),
  • the first and second m / z values of the first and second biomolecules for which the arrangement of the biomolecule constituents was determined, and the constituents of the biomolecules Determining the value of m / z of the internal standard substance of the biomolecule of the internal standard substance whose sequence has been determined, and from the value of m / z of the first and second and internal standard substances, the first and second Extract data from the data relating to the mass spectrometry, including the mass spectrometry spectrum for the second biomolecule and the m / z value of the biomolecule of the internal standard substance and the mass spectrometry spectrum (mask mouthmatogram) for the time.
  • the determination of the m / z values of the first and second and internal standard substances is performed by determining the first and second biomolecules of the first and second biomolecules in which the sequence of the constituents of the biomolecule is determined. From the value of m / z, based on the number of isotopically unlabeled components of the first and second biomolecules and the charge information of the first and second biomolecules, the internal standard substance The m / z value of the internal standard substance of the biomolecule is determined, or from the m / z value of the internal standard substance of the biomolecule of the internal standard substance in which the arrangement of the components of the biomolecule is determined, the internal standard The first and second m / z of the first and second biomolecules based on the number of isotope-labeled components of the biomolecule of the substance and the information on the charge of the biomolecule of the internal standard substance.
  • the analysis method according to [56] which is executed by determining a value of
  • the method further includes the step of collating the arrangement of the constituents of the biomolecule with a database having biomolecule functional information to obtain the functional information of the biomolecule, [56] ] Of the analysis method described in
  • the isotope used for the isotope labeling is 2 H, 13 C, 15 N, 17 0, 18 0, 33 P and 34 S and any isotope for which a group force including a combination force thereof is also selected.
  • the biomolecule is any one of the above-mentioned [49] to [65], wherein the biomolecule is any molecule for which protein, lipid, sugar chain, and nucleic acid and their combined force are also selected.
  • the analysis method described in is provided.
  • the quality of the first biomolecule obtained in the mass spectrometer and the second biomolecule isotopically labeled with respect to the first biomolecule is obtained.
  • a program for causing a computer that receives data related to quantitative analysis to analyze the data, and among the data related to mass analysis of the biomolecule measured by the mass spectrometer, the component of the biomolecule The first m / z value of the first biomolecule from which the sequence of the second biomolecule was determined and the second m / z value of the second biomolecule from which the sequence of the constituents of the biomolecule was determined From the first and second m / z values, the mass spectrometry spectrum for the m / z values of the first biomolecule and the second biomolecule and the mass with respect to time.
  • the first and second m / z values are determined based on the first m / z value of the first biomolecule from which the sequence of the components of the biomolecule is determined.
  • the second m / z value of the second biomolecule is determined based on the number of unlabeled components of the biomolecule and the charge information of the first biomolecule! Or the second m / z value of the second biomolecule from which the arrangement of the components of the biomolecule is determined, and the number of isotope-labeled components of the second biomolecule and the
  • the program according to [67] which is executed by determining a value of the first m / z of the first biomolecule based on information on a charge of the second biomolecule.
  • the method further includes the step of collating the arrangement of the components of the biomolecule with a database having the biomolecule function information to obtain the function information of the biomolecule [67] , And [71]!
  • a program that executes a step of extracting from the data relating to mass spectrometry, and a step of performing waveform separation processing of a mass spectrometry spectrum (mask mouth matogram) with respect to time of the biomolecules of the first and second and internal standard substances,
  • the determination of the m / z value of the first and second and internal standard substances is a biomolecule. From the first and second m / z values of the first and second biomolecules for which the component sequences of the first and second biomolecules were determined, the isotopic unlabeled components of the first and second biomolecules Based on the information on the number and the charge of the first and second biomolecules, the value of m / z of the internal standard substance of the biomolecule of the internal standard substance is determined, or the arrangement of the components of the biomolecule is From the determined value of m / z of the internal standard substance biomolecule of the internal standard substance, the number of isotope-labeled components of the biomolecule of the internal standard substance and the charge of the biomolecule of the internal standard substance
  • the program according to [74] which is executed by determining the first and second m / z values of the first and second biomolecules based on the information of
  • the method further includes the step of collating the arrangement of the constituent components of the biomolecule with a database having the biomolecule functional information to obtain the functional information of the biomolecule [74]! , And [78]!
  • the isotopes used for the isotope labeling are 2 H, 13 C, 15 N, 17 0, 18 0, 33 P and 34 S. Each of these combined forces is also selected as a group force, which is an isotope of the above, [
  • the biomolecule is any one of the above [67] to [83], wherein the biomolecule is any molecule selected from proteins, lipids, sugar chains, and nucleic acids, and their combined force. Provide the described program.
  • [85] there is provided a data analysis method for mass spectrometry of an internal standard substance that is an isotope-labeled biomolecule for the first and second biomolecules.
  • the first and second biomolecules of the first and second biomolecules for which the arrangement of the constituent components of the biomolecule has been determined are provided.
  • the step of determining the m / z value of the internal standard substance of the biomolecule of the internal standard substance in which the arrangement of the constituent components of the biomolecule was determined, and the obtained sequence data An analysis method including a step of collating against a database having functional information of biomolecules and acquiring functional information of the biomolecules,
  • the determination of the m / z values of the first and second and internal standard substances is performed by determining the first and second biomolecules of the first and second biomolecules in which the sequence of the constituents of the biomolecule is determined. From the value of m / z, the individual isotope-unlabeled components of the first and second biomolecules Based on the information on the number and the charge of the first and second biomolecules, determine the m / z value of the internal standard substance of the internal standard substance, or determine the arrangement of the components of the biomolecule From the m / z value of the internal standard substance of the biomolecule of the internal standard substance, the number of isotope-labeled components of the biomolecule of the internal standard substance and the charge of the biomolecule of the internal standard substance.
  • the analysis method according to [85] or [86] which is performed by determining first and second m / z values of the first and second biomolecules based on information,
  • the isotope used for the isotope labeling is 2 H, 13 C, 15 N, 170 , 18 0, 33 P and 34 S, and any isotope for which a group force including a combination force thereof is also selected.
  • the biomolecule is a biomolecule separated by sample force over time, 85] to [93], the analysis method according to any one of
  • biomolecule is a protein, lipid, sugar chain, nucleic acid, or a combination thereof;
  • [96] relates to mass spectrometry of the first and second biomolecules obtained in the mass spectrometer and an internal standard substance that is a biomolecule isotope-labeled with respect to the first and second biomolecules
  • a program for analyzing the data on a computer that receives the data, and the sequence of the constituents of the biomolecule is determined from the data related to the mass analysis of the biomolecule measured by the mass spectrometer.
  • the first and second m / z values of the first and second biomolecules and the arrangement of the constituent components of the biomolecule were determined.
  • the determination of the value of m / z of the first and second and internal standard substances is determined by the first and second of the first and second biomolecules for which the sequence of the constituents of the biomolecule has been determined. From the value of m / z, based on the number of isotopically unlabeled components of the first and second biomolecules and the charge information of the first and second biomolecules, the internal standard substance The m / z value of the internal standard substance of the biomolecule is determined, or from the m / z value of the internal standard substance of the biomolecule of the internal standard substance in which the arrangement of the components of the biomolecule is determined, the internal standard The first and second m / z of the first and second biomolecules based on the number of isotope-labeled components of the biomolecule of the substance and the information on the charge of the biomolecule of the internal standard substance
  • the isotope used for the isotope labeling is selected from 2 H, 13 C, 15 N, 170 , 180 , 33 P and 34 S, and a combination force of them.
  • the biomolecule is a molecule selected from the group force consisting of proteins, lipids, sugar chains and nucleic acids, and combinations thereof.
  • the program described in any one of them is provided.
  • a computer that receives data relating to mass spectrometry of one or more biomolecules in a sample obtained in a mass spectrometer is provided in one or more of the samples.
  • a program for quantifying biomolecules Therefore, among the data relating to the mass analysis of the biomolecule measured by the mass spectrometer, the first m / z value of the first biomolecule in which the arrangement of the constituent components of the biomolecule is determined, Determining the second m / z value of the second biomolecule from which the sequence of the constituents of the molecule has been determined; and from the first and second m / z values, Extracting data including a mass spectrometry spectrum with respect to a value of m / z of the molecule and the second biomolecule and a mass spectrometry spectrum with respect to time (mask mouthmatogram) from the data relating to the mass spectrometry; A step of performing waveform separation processing on a mass spectrometry spectrum (mask
  • the first and second m / z values are determined based on the first m / z value of the first biomolecule from which the arrangement of the components of the biomolecule is determined.
  • the second m / z value of the second biomolecule is determined based on the number of unlabeled components of the biomolecule and the charge information of the first biomolecule! Or the second m / z value of the second biomolecule from which the arrangement of the components of the biomolecule is determined, and the number of isotope-labeled components of the second biomolecule and the
  • the program according to [107] which is executed by determining a first m / z value of the first biomolecule based on information on a charge of the second biomolecule.
  • the ratio of (the first waveform area) / (the second waveform area) from the value and the value of the second waveform area derived from the unique biomolecule at the second m / z value The program according to [107] or [108], wherein the program is further executed.
  • the isotopes used for the isotope labeling are 2 H, 13 C, 15 N, 170 , 180 , 33 P and 34 S, and any isotope for which a group force including a combination force thereof is selected.
  • the program according to any one of [107] to [112] above,
  • the sequence of the component is determined by comparing the data obtained by the MS / MS process with a database on biomolecules.
  • the biomolecule is a molecule selected from proteins, lipids, sugar chains, nucleic acids, and a group force that combines these biomolecules. [107] None [116] The program described in Kaichi is provided.
  • the conventional in vivo labeling method can be performed only on a limited number of cells that are not affected by the culture conditions.
  • it is a metabolically isotopically labeled biomolecule.
  • Samples that cannot be metabolically labeled e.g., tissue, not limited to cells that can be cultured
  • cells containing internal standards or internal standards that are metabolically isotopically labeled biomolecules are added to the sample. It is now possible to quantify one or more biomolecules in biological fluids, cells, cell organs, protein complexes, etc.).
  • the conventional in vitro labeling method cannot compensate for fluctuations in the quantitative value for each experiment in the pretreatment stage such as sample crushing, extraction, disinfection, fractionation, and purification.
  • an internal standard substance or a metabolically isotope-labeled biomolecule that is a metabolically isotope-labeled biomolecule prior to sample disruption, extraction, digestion, fractionation, purification, etc. Since cells containing an internal standard were added, it was possible to accurately quantify one or more biomolecules in the sample.
  • the present invention facilitated comparison between three or more samples.
  • the conventional quantitative proteome analysis methods directly compare the internal standard substance and the analyte, and thus it is necessary to prepare a sample for each measurement.
  • the internal standard to be labeled also changes as the measurement target changes, it is necessary to examine the conditions for the label each time.Also, comparison between experiments was not possible.
  • the concentration of a biomolecule in a cell containing an internal standard that is a biomolecule that has been metabolically isotope-labeled in advance or an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule is determined.
  • absolute quantification of biomolecules became possible.
  • By transferring or lending cells containing an internal standard that is an isotopically labeled biomolecule or an internal standard that is a metabolically isotopically labeled biomolecule Data sharing is possible.
  • the absolute amount of a biomolecule in a cell containing an internal standard substance which is a biomolecule labeled once metabolically isotope or an internal standard substance which is a biomolecule labeled metabolically isotope can be obtained. It can be applied to various experiments afterwards without the need to quantify each experiment.
  • the analysis apparatus and the analysis method of the present invention the inherent biomolecule The derived mass spectrometry spectrum can be obtained, and it becomes possible to quantitatively analyze the expression level of the biomolecule that changes every moment in the cells in the living body.
  • the analysis method can be realized by a computer by the program according to the present invention.
  • functional information can be added to the quantitative analysis results by collating the quantitative analysis results with a database such as NCBInr.
  • Peptides that can be quantified can be quantified not only for peptides having the same sequence as the synthetic peptide, but also for other peptides derived from the protein constituted by the peptide. Therefore, since a single protein is quantified by multiple peptides, accurate and highly reproducible quantitative values can be obtained without greatly affecting the protein quantitative values due to errors in the measurement results of individual peptides. It became possible.
  • Sarako uses a 10-fold excess of reagent in the peptide synthesizer, and the force and the synthesis scale are in milligram units. Therefore, synthesis of isotope-labeled peptides is very expensive, and comprehensive quantification by conventional methods is difficult in terms of cost.
  • isotope labeling of a biomolecule is performed by cell culture, it can be efficiently generated even in a very small amount.
  • Synthetic peptides for quantifying biomolecules in cells containing internal standards that are metabolically isotope-labeled biomolecules or internal standards that are metabolically isotope-labeled biomolecules are: Since isotopes are not required and can be handled by ordinary peptide synthesis, it is suitable as a comprehensive quantitative method.
  • sample refers to a measurement object containing a biomolecule, and preferably refers to a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, or a protein complex.
  • tissues include the brain and brain parts (for example, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, hypothalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary gland, stomach, spleen, and kidney.
  • biological fluid include blood (including plasma and serum), urine, feces, saliva, tear fluid, infiltrating fluid (including ascites and tissue fluid), and the like.
  • cells examples include hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, spleen j8 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, Fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (e.g.
  • macrophages T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes
  • macrophages examples thereof include megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, stromal cells or precursor cells thereof, stem cells, cancer cells and the like.
  • cell organs include nuclei, organelles (nuclear bodies, nuclear membranes, cell membranes, mitochondria, lysosomes, ribosomes, peroxinomes, endoplasmic reticulum (rough endoplasmic reticulum, smooth endoplasmic reticulum, sarcoplasmic reticulum, etc.), Golgi Body, microtubule, centrosome, actin filament, etc.), cytosol, synapse, base
  • Examples include membranes and cell-cell adhesion devices.
  • a protein complex is one in which two or more proteins are physically bound. The examples given here are specific examples, and the present invention is not limited to these examples.
  • biomolecule used in the present invention refers to a protein, lipid, sugar chain, nucleic acid or a combination thereof, preferably a protein. It goes without saying that biomolecules include those that have undergone physiological modification (for example, phosphoric acid protein).
  • protein used in the present invention includes a peptide in which two or more amino acids are bound by a peptide bond.
  • metabolic isotope-labeled biomolecule used in the present invention refers to a metabolic molecule that is metabolically labeled by adding a precursor of the biomolecule labeled with an isotope.
  • metabolic refers to a physiological condition through an enzyme reaction or the like, and is preferably a metabolic reaction in cultured cells.
  • the term "precursor" used in the present invention refers to a molecule that can be a constituent of a biomolecule.
  • the precursor is preferably an amino acid, more preferably an essential amino acid, such as leucine, isoleucine, tryptophan, methionine, lysine, phenylalanine, parin, threonine, particularly preferably leucine.
  • the molecule is a lipid, for example, if it is a sphingolipid, if serine is the preferred sugar, if it is a nucleic acid that prefers dulose, then aspartate, glutamine, and glycine are also biosynthesized with purine nucleotides. However, these are preferable, but not limited thereto. In other words, the type of precursor is not limited as long as it is incorporated into a biomolecule.
  • the term "internal standard substance" used in the present invention means that when a measurement substance is quantified with a mass spectrometer, a fixed amount is used in the sample in order to compensate mainly for fluctuations in the quantification value for each experiment. The substances that can be raised.
  • the term "internal standard substance which is a metabolically isotopically labeled biomolecule" used in the present invention refers to an internal standard substance containing one or more metabolically isotopically labeled biomolecules.
  • the term "cell containing an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule” as used in the present invention means an internal standard containing one or more metabolically isotopically labeled biomolecules. Cell containing substance.
  • quantitative used in the present invention broadly includes absolute quantification and relative quantification.
  • absolute quantification used in the present invention is a quantification method for the purpose of obtaining a measurement result as a quantity or concentration, and “relative quantification” refers to a quantification method other than absolute quantification.
  • sample that cannot be metabolically labeled refers to a sample other than a sample that can be metabolically labeled.
  • a sample that can be metabolically labeled is a sample that can be metabolically labeled without being affected by the precursor of the biomolecule that has been isotopically labeled by culturing.
  • samples that cannot be labeled metabolically include, for example, samples that can be metabolically labeled while being affected by the precursors of the biomolecules that are isotopically labeled by culturing, administration to living bodies, tissue culture, etc. Samples that can be labeled by this method shall be included.
  • sample that cannot be labeled by cell culture refers to a sample in which cells cannot be cultured.
  • a sample that cannot be cultured and can be labeled by a method other than cell culture, tissue culture, or other cell culture shall be included in the “sample that cannot be labeled by cell culture”.
  • tissues, biological fluids, cell organs, or protein complexes can be mentioned.
  • the present invention relates to an internal standard substance which is a metabolically isotopically labeled biomolecule, a cell containing an internal standard substance which is a metabolically isotopically labeled biomolecule, a reagent containing the internal standard substance, Providing reagents containing cells containing internal standard substances
  • a cell containing an internal standard substance, which is a metabolically isotopically labeled biomolecule Although it is a cell which is easy to grow in a medium of the same species as the elephant sample, preferably derived from the same tissue, particularly preferably containing an isotope, it is not limited thereto.
  • a cell containing an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule is produced. can do. Any suitable culture conditions can be selected by cultivating the living cells in a liquid medium or solid medium.
  • a medium such as DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM, etc.
  • serum such as urinary fetal serum (FCS), amino acids, glucose, penicillin, or streptomycin as necessary.
  • Incubation can be performed for about 15 to 200 hours at a pH of about 6-8 and 30-40 ° C.
  • the medium can be changed, and aeration and agitation can be performed.
  • the isotope a radioactive isotope can be applied, but a stable isotope is preferably used.
  • the stable isotope is preferably a force using 2 H, 13 C, 15 N, 170 , 180 , 33 P or 34 S or a combination thereof, particularly preferably 13 C, but is not limited thereto.
  • the type of the isotope of the present invention is not limited as long as it is taken into a cell and can label a biomolecule.
  • 13 C-labeled ( 13 CX 6) leucine manufactured by Cambridge Isotope Labs (CIL), L-Leucine U- 13 C6, CLM-2262 Is mentioned.
  • Cells containing the internal standard substance which is a metabolically isotope-labeled biomolecule obtained as described above, can be used as it is, but can also be disrupted. How to granulated Blast, Dounce teflon kappa ⁇ homogenizer, a polytron, a Waring 'Brenda one, Potter type glass' homogenizer, sonicator, cell lysate (e.g., PIERCE Inc. M- PER:. Cat no 78501, T -PER: cat no. 78510 etc.) or a freeze-thaw method, and a method using a cell lysate is preferable. If necessary, the protein can be quantified.
  • Dounce teflon kappa ⁇ homogenizer e.g., Dounce teflon kappa ⁇ homogenizer, a polytron, a Waring 'Brenda one, Potter type glass' homogenizer, sonicator, cell
  • an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule can be prepared.
  • Cells containing these metabolically isotopically labeled biomolecule internal standards or metabolically isotopically labeled biomolecules are suitable conditions, preferably 20 ° C or lower, Especially good Preferably it can be stored below -80 ° C.
  • the present invention relates to a sample by a mass spectrometer, characterized in that an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule or a cell containing an internal standard substance that is the biomolecule is added to the sample.
  • an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule or a cell containing an internal standard substance that is the biomolecule is added to the sample.
  • a method for quantifying biomolecules is provided.
  • This quantification method includes adding a cell containing an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule or an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule to a sample; Extraction and fractionation of biomolecules from each sample, measurement with a mass spectrometer, and resultant force obtained with a mass spectrometer Determine the intensity ratio between the labeled peak and unlabeled peak of each biomolecule And quantifying the biomolecule.
  • the program according to the present invention causes each step of the quantification or analysis method according to the present invention to be executed on a computer.
  • the program according to the present invention can be installed or downloaded to a computer through various recording media such as a CD-ROM, a magnetic disk, and a semiconductor memory.
  • Each sample contains an internal standard that is a metabolically isotopically labeled biomolecule or an internal standard that is a metabolically isotopically labeled biomolecule, preferably a certain amount of metabolically isotope labeled
  • a cell containing an internal standard that is a biomolecule that has been labeled or a metabolically isotopically labeled biomolecule is added.
  • a sample to which an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule or a cell containing an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule is crushed, After extraction of the molecule, preferably protein, it can be fractionated. This is a fractionated sample.
  • the method of “disruption” extraction is as follows: Downs-type Teflon ⁇ homogenizer, polytron, Waring. Pender, potter-type glass. Homogenizer, ultrasonic crusher, cell lysate (eg Pierce ⁇ -PER: cat no. 78501, T -PER: cat no.
  • fractionation method examples include fractional centrifugation and sucrose density gradient centrifugation, preferably sucrose density. Gradient centrifugation.
  • the fractionated sample can be purified as necessary.
  • Purification methods include group-specific affinity column purification, cation exchange chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, immunoprecipitation, ammonium sulfate precipitation, and organic solvent precipitation. , Ultrafiltration, gel filtration, dialysis and the like, preferably group-specific affinity column purification. Crushing • Extraction, fractionation, and purification operations are not limited to these, and appropriate ones may be selected and combined according to the common general technical knowledge of those skilled in the art.
  • the purified sample can be separated and digested as required.
  • the separation method include two-dimensional electrophoresis, SDS PAGE, and various types of chromatography (for example, affinity chromatography, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, cation exchange chromatography, etc.).
  • the digestion method include enzyme digestion, chemical decomposition, and the like.
  • the digestion ability is not limited to this, and an appropriate one may be selected.
  • the enzyme used for enzymatic digestion include trypsin, chymotrypsin, Lys-C, Asp-N, and Glu-C, with trypsin being preferred.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • a measurement sample meaning a fractionated sample, a purified sample, a separated sample, a digested sample or a sample separated by HPLC
  • a mass spectrometer is mass spectrometers coupled to gas chromatographs, such as gas chromatography mass spectrometry (GC / MS) and liquid chromatography.
  • GC / MS gas chromatography mass spectrometry
  • a general-purpose apparatus such as liquid chromatography mass spectrometry (LC / MS), which is an apparatus coupled to a chromatograph, can be used.
  • the ionization method in the mass spectrometer can be appropriately selected depending on each device.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • ESI electrospray ionization
  • EI electro ionization
  • CI chemical ionization
  • APCI atmospheric pressure chemical ionization
  • FAB Fast atom bombardment method
  • LD FD
  • SIMS SIMS
  • TSP time-of-flight type
  • ion trap double-focusing type
  • quadrupole type or Fourier transform type.
  • the apparatus and method for mass spectrometry are not limited to those described here, and those commonly used for mass spectrometry can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Biomolecules preferably proteins
  • Biomolecules can be identified using data obtained as a result of measurement by mass spectrometry.
  • the obtained data is converted into commercially available software, for example,
  • the “labeled peak of biomolecule” is the m / z obtained from the mass spectrometry measurement result.
  • mass spectrometry spectrum for the values
  • mass spectrometry spectrum for time
  • mass mouth matogram in the mass spectrometry spectrum for time
  • signal intensity derived from biomolecules or the sum thereof can be understood by those skilled in the art) (hereinafter, sometimes simply referred to as labeled peak).
  • the "unlabeled peak of a biomolecule” refers to a biomolecule that is metabolically isotope-labeled by mass spectrometry and / or mask mouth matogram. This is the signal intensity derived from or the sum of the signal intensity (hereinafter sometimes simply referred to as unlabeled peak).
  • the intensity of the labeled peak derived from the internal standard substance, which is a metabolically isotopically labeled biomolecule, and the intensity of the unlabeled peak derived from the sample By calculating the ratio and comparing the peak intensity ratio values between samples, the biomolecules between samples can be relatively quantified. Metabolically isotope-labeled biomolecules are observed as paired peaks in mass spectrometry because the molecular weight increases by the amount of the isotope-labeled molecular weight compared to the biomolecule derived from the sample (see Figure 2).
  • the molecular weight of an isotope-labeled biomolecule can be determined by calculating the protein, lipid, sugar chain, or nucleic acid sequence force identified.
  • the unlabeled peak of each biomolecule in sample A is the labeled peak of the internal standard corresponding to the biomolecule.
  • the unlabeled peak / labeled peak (peak intensity ratio A) in the biomolecule is obtained.
  • the peak intensity ratio B the unlabeled peak / labeled peak
  • an internal standard substance that is a biological molecule labeled metabolically isotope or an internal standard substance that is a biological molecule labeled metabolically isotope is present in a sample.
  • Biomolecules that do not exist for example, proteins, etc.
  • Force S may exist.
  • the peak is derived from a nearby internal standard substance, preferably a peak with a short elution time in chromatography for LC / MS, or a peak with a close molecular weight for MALD ⁇ MS.
  • the peak intensity ratio can be obtained and quantified by comparing the peak intensity ratio between samples.
  • biomolecules eg proteins
  • biomolecule X may not exist in the internal standard substance
  • biomolecule Y may exist in the vicinity.
  • the vicinity is a peak derived from an internal standard substance, and if LC / MS is the peak with the same elution time as in chromatography, and if it is MALD to MS, it is the peak with a close molecular weight.
  • the present invention enables absolute quantification of one or more biomolecules, preferably proteins, used for mass spectrometry.
  • one or more biomolecules have known amounts of internal standard substances that are metabolically isotope-labeled biomolecules and one or more biomolecules have known amounts of metabolically isotopes.
  • Cells containing an internal standard that is a labeled biomolecule are provided.
  • each biomolecule preparation preferably a protein preparation
  • an internal standard substance which is a metabolically isotopically labeled biomolecule or a metabolically isotopically labeled biomolecule By obtaining the amount of the biomolecule present in the cell containing the internal standard substance, preferably the absolute amount of the protein, the absolute quantification of the biomolecule contained in the target sample, preferably the protein, is possible. Therefore, it is possible to perform absolute quantification that cannot be done with conventional quantitative proteome analysis.
  • the internal standard substance or the metabolically isotope-labeled biomolecule that is the isotope-labeled biomolecule is then used in various experiments. Since cells containing internal standard substances can be used, this method is very useful compared to the conventional method in which quantification was required for each experiment. [0096] Details are described below.
  • the absolute amount of a biomolecule present in a cell containing an internal standard that is a metabolically isotopically labeled biomolecule or an internal standard that is a metabolically isotopically labeled biomolecule is a known amount of biomolecule.
  • the absolute amount can be obtained by measuring with a mass spectrometer using a sample.
  • a chemically synthesized known amount of a biomolecule is an internal standard substance which is a metabolically isotope-labeled biomolecule or a metabolically isotope-labeled biomolecule.
  • the internal standard substance or metabolically isotopically labeled biomolecule, which is a metabolically isotope-labeled biomolecule is measured by comparing with a peak derived from a chemically synthesized biomolecule measured with a mass spectrometer. The absolute amount of the biomolecule present in the cell containing the internal standard substance, which is a biomolecule formed, is determined.
  • biomolecule is a protein
  • SDS-PAGE SDS-PAGE
  • EIA EIA
  • a certain amount of a cell containing an internal standard that is a metabolically isotopically labeled biomolecule or an internal standard that is a metabolically isotopically labeled biomolecule is suitably used.
  • the protein is extracted by crushing under appropriate conditions, preferably under the same conditions as those for preparing the measurement sample described above.
  • a method such as SDS-PAGE, EIA, ELISA, RIA, or Western plot, an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule or a metabolically isotope
  • the absolute amount of the biomolecule present in the cell containing the internal standard substance which is a body-labeled biomolecule is determined.
  • the specific activity (intensity of activity per protein amount) specific to the biomolecule is required.
  • the specific activity specific to the substance may be determined by measuring the reported activity or using it. Therefore, the aforementioned extraction By measuring the activity of proteins in the fluid, cells containing internal standard substances that are metabolically isotopically labeled biomolecules or metabolically isotopically labeled biomolecules can be detected. The absolute amount of the biomolecule present is determined.
  • the target of quantification is not limited to proteins. Quantification and identification are performed on all substances produced by the cells using nutrients in the medium, such as lipids, sugar chains or nucleic acids. It can be applied to the intended analysis.
  • a method for determining and comparing the intensity ratio between a labeled peak and a non-labeled peak of a biomolecule, and a method for quantifying a biomolecule contained in an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule A program according to the present invention for executing the above will be described later.
  • FIG. 3 shows a schematic overall scheme of a method for quantitative analysis of a protein as an example of a biomolecule according to the second embodiment of the present invention. As shown in Fig. 3, first prepare a measurement sample, and then perform mass spectrometry using a mass spectrometer. Next, the quantitative analysis method according to the present invention is executed.
  • the measurement sample preparation shown in step S 11 of FIG. 3 includes a step of isotopically labeling the sample and a step of extracting and fractionating biomolecules for each sample force.
  • Methods for isotopically labeling a sample include a method of culturing in a medium containing an isotopically labeled amino acid and a method of chemically or enzymatically isotopically labeling in vitro.
  • the method of culturing in a medium containing an isotope-labeled amino acid is an isotope-labeled amino acid in an isotope-unlabeled cell grown and / or cultured in an environment that does not contain an isotope-labeled amino acid.
  • the method of culturing in a medium containing an isotope-labeled amino acid has conditions suitable for culturing the cells in a liquid medium or a solid medium regardless of the culture conditions. You only have to set it. For example, it can be carried out in accordance with the method described in the first aspect of the present invention, and when animal cells are selected, a medium such as DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM is used, if necessary. Serum, amino acid, group Lucose, penicillin, streptomycin, etc. can be added and cultured at about pH 6-8, 30-40 ° C for about 15-200 hours.
  • the medium can be changed in the middle, or aeration and agitation can be performed.
  • the cells containing the isotope-labeled protein thus obtained can be used as they are, but can also be used after being disrupted.
  • the crushing method is as follows: Downs type Teflon 'homogenizer, polytron, Waring' blender, Potter type glass' homogenizer, ultrasonic crusher, cell lysate (eg Pierce M-PER: cat no. 78501, T-PER: cat no. 78510 etc.) or a freeze-thaw method, and a method using a cell lysate is preferable.
  • the isotope-labeled protein can also be prepared in vitro.
  • isotope labeling can be achieved by alkylating a cysteine residue in a protein with an isotope-labeled alkyl reagent (“Rabbit Communications in Mass Spectrum”). Rapid ommunications in Mass spectroscopy ”lb ⁇ , ⁇ 5, 2002,
  • isotope labeling can also be performed by piotination of a cysteine residue in a protein using an isotopically labeled biotin reagent.
  • peptide fragments obtained by digesting proteins can be labeled with isotope-labeled molecules such as C-terminal, N-terminal, glutamic acid residue, and aspartic acid residue.
  • isotope-labeled molecules such as C-terminal, N-terminal, glutamic acid residue, and aspartic acid residue.
  • water labeled with 180 is added to a buffer solution.
  • digestive enzymes chymotrypsin, trypsin, Asp-N, Lys-C, and Glu-C can be used.
  • Kimotoribushin when using the Asp-N is 18 0 Gertz be located at the C-terminus of peptides after hydrolysis, trypsin, Lys- C, when using Glu- C, the C-terminal carboxylic peptides after hydrolysis It is known that both oxygen atoms of the acid are 180 .
  • isotope labeling can also be performed by using these isotope-labeled reagents.
  • the isotope-labeled protein or the cell containing the isotope-labeled protein can be stored under appropriate conditions, preferably 20 ° C or less, particularly preferably 80 ° C or less.
  • the isotopically labeled protein thus obtained can also be used as an internal standard substance in the analysis described later.
  • the isotope-labeled amino acid used in the present invention a radioisotope can be applied, but a stable isotope having no radioactivity is particularly preferable because it is easy to handle.
  • Stable isotopes include, but are not limited to, 2 H, 13 C, 15 N, “0, 180 , 33 P or 34 S or combinations thereof, preferably 13
  • the isotope used in the present invention is not particularly limited as long as it is taken into a cell and can label a protein, specifically, as a precursor of an isotope-labeled protein, 13 c-labeled ( 13 Cx6) leucine (manufactured by Cambridge Isotope Labs (CIL), L-Leucine U-13C6, CLM-2262).
  • Fig. 4 shows the measurement sample preparation using the isotope labeling according to the present invention.
  • Figure 2 shows a scheme of one embodiment of the second embodiment. Prepare one sample containing isotope-labeled protein and one sample containing non-isotopically labeled protein. Then mix sample 1 and sample 2
  • the mixed sample is crushed and the protein is extracted. And the above-mentioned sample can be refine
  • Purification methods include group-specific affinity column purification, cation exchange chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, immunoprecipitation, ammonium sulfate precipitation, precipitation with organic solvents, Examples include ultrafiltration and dialysis.
  • Separation methods include, but are not limited to, two-dimensional electrophoresis, SDA PAGE, various chromatographic (eg, affinity chromatography, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, cation exchange) Chromatography) and the like.
  • digestion method include, but are not limited to, enzymatic digestion and chemical decomposition.
  • enzyme used for enzymatic digestion include trypsin, chymotrypsin, Lys-C, Asp-N, and Glu-C.
  • the sample product thus obtained can be separated by force HPLC, which can be measured as it is.
  • HPLC the column used for HPLC include, but are not limited to, a 1S-on exchange column or a cation exchange column.
  • Various HPLC conditions flow rate, detector, mobile phase are easily understood by those skilled in the art and can be selected as appropriate.
  • the sample prepared as described above is subjected to mass spectrometry in step S12 shown in FIG.
  • This mass spectrometry is performed by gas chromatography mass spectrometry (GC / MS), which is a mass spectrometer combined with a gas chromatograph, or by liquid chromatography mass spectrometry (LC), which is a mass spectrometer combined with a liquid chromatograph.
  • General-purpose equipment such as / MS
  • the ionization method in mass spectrometry can be appropriately selected according to each apparatus. Examples include MALDU ESI, EI, CI, APCI, FAB, LD, FD, SIMS, and TSP.
  • the analyzer can be appropriately selected according to each device. For example, TOF, ion trap, double-focusing type, quadrupole type, This can be performed using a general-purpose device such as a conversion type.
  • Proteins can be identified by using data obtained as a result of mass spectrometry.
  • Use commercially available software such as SonarMSMS (Genomic solution) and databases such as NCBInr (hhtp: //www.ncbi.nlm.nih.gov/), IPI, Sport, etc. Allows automatic identification of proteins. Identification of proteins using measurement data obtained by mass spectrometry can be easily understood by those skilled in the art (for example, Nat Genet. 1998: 20, 45-50; J Cell Biol. 1998: 141, 967-977). J Cell Biol. 200: 148, 635-651; Nature, 2002: 415,
  • an isotope-labeled protein-derived peak serving as an internal standard substance for each protein
  • a sample Intensity ratios of protein-derived peaks and more specifically, mask mouth matograms separated by waveforms derived from unique proteins, and compare these peak intensity ratio values and waveform areas between samples.
  • the present invention includes an internal standard that is a metabolically isotopically labeled biomolecule or an internal standard that is a metabolically isotopically labeled biomolecule
  • the step of adding cells and the step of extracting and fractionating biomolecules from each sample are performed in step S13 shown in FIG.
  • the biomolecule is measured with a mass spectrometer (see step S12 in FIG. 3).
  • the quantitative analysis shown in step S13 of FIG. 3 obtains the results obtained by the mass spectrometer, selects the labeled peak and the unlabeled peak of each biomolecule, and then calculates the intensity ratio of each peak.
  • the biomolecule can be quantified by obtaining.
  • FIG. 5 shows a scheme of a quantitative analysis method according to the present invention after mass analysis in a mass spectrometer.
  • the quantitative analysis method according to the present invention includes determination of an amino acid sequence by MS / MS processing of a mass spectrometry spectrum to be analyzed (step S111), and the mass spectrometry spectrum (first m / z ) Determination step (step S 112), the protein was isotopically labeled from the first m / z value of the protein whose amino acid sequence was determined Calculation of the second m / z value of the isotope-labeled protein (step S113), mass spectrometry spectrum with respect to time at the first and second m / z values (hereinafter also referred to as “mask mouth matogram”) A) extraction (step S114), waveform separation for the mask mouth matogram of each protein corresponding to the first and second m / z values (step S115), and the characteristic obtained by the waveform separation processing Of the waveform area
  • the analysis method has been described based on a method for obtaining a mass analysis spectrum of a corresponding isotope-labeled protein from a mass analysis spectrum of an isotope-unlabeled protein. It will be understood by those skilled in the art that the analysis method according to the present invention can be carried out by determining the mass spectrometry spectrum of an isotope-labeled protein and then obtaining the mass spectrometry spectrum of the corresponding isotope-unlabeled protein. Is easy to understand.
  • Fig. 6 shows a spectrum obtained by a typical mass spectrometer.
  • the types of spectra obtained include the spectrum showing the intensity axis with respect to m / z (mass spectrometry spectrum with respect to m / z) and the total amount of ions detected in terms of intensity for each time from any time axis point.
  • step S111 shown in FIG. 5 the amino acid sequence is determined from the mass spectrometry spectrum obtained by MS / MS processing power (step S111). Thereafter, the first m / z value of the protein to be analyzed is determined (step SI 12).
  • MS1 one of the ion species generated in the ionization chamber of the first mass separation unit.
  • MS2 This is a processing method that selects a precursor ion and detects a product ion generated by the decomposition of the precursor ion in the second mass separation section (MS2).
  • the amino acid sequence is analyzed based on the m / z value of the product ion, and those skilled in the art can easily understand the method for determining the amino acid sequence by MS / MS processing (for example, “ Post-genome 'mass spectrometry' 1993, pp 39-72 (See Toshimitsu Niwa, Chemistry Dojin).
  • the determination of amino acid sequences by MS / MS processing can be performed by collating with the NCBInr (hhtp: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov/) database via the Internet.
  • the second m / z of the isotope-labeled protein corresponding to the protein is determined from the value of the first m / z of the protein whose amino acid sequence has been determined. This is because when preparing a sample in step S11 shown in FIG. 3, a cell having a stable isotope known as an amino acid to be isotope-labeled, for example, 13 C-labeled ( 13 Cx6) leucine is used. Is cultured, the difference between the first m / z value and the second m / z value is 6 pieces of 12 C and 13 C, and the difference is 6. Then, the second m / z value can be calculated from the charge value of the protein in step S113.
  • first mass spectrometry spectrum with respect to time (hereinafter referred to as "first mass spectrometry spectrum with respect to time (hereinafter referred to as” first m / z ) in the first m / z and second m / z values, respectively.
  • second mass spectrometry spectrum over time (hereinafter sometimes referred to as the second mask mouth matogram;)))
  • Is extracted from the mass spectrometry spectrum obtained by the mass spectrometer (step S114).
  • FIG. 7 shows an example mask mouth matogram in which multiple peaks overlap at a single m / z value.
  • waveform separation processing is performed on the first mask mouth matogram and the second mask mouth matogram shown above (step S115), and the mask mouth matogram derived from a specific protein is separated.
  • the waveform separation process used in the present invention is a synthetic separation method based on a curve fitting method for complex waveforms. This first assumes that each peak component can be represented by a specific analytic function. Based on this assumption, several peak functions are generated and combined, and the parameters included in each peak function are adjusted to minimize the deviation from the observed waveform. This is done by decomposing and separating each peak waveform from the parameter at the minimum deviation point.
  • the waveform parameters used for the waveform separation process include the number of peaks, the shape of each peak, the peak position, the peak height, and the shape of the baseline.
  • FIG. 8 shows a mask mouth matogram obtained by separating the mask mouth matogram shown in FIG. 7 by the waveform separation processing according to the present invention.
  • waveform separation can be performed using a Gaussian function and a Lorentz function.
  • the actually measured mask mouth matogram shown by the solid line is divided into five by the mask mouth matogram represented by the dotted line or the like by the waveform separation processing according to the present invention.
  • the waveform separation process shown in Fig. 8 is executed with the isotope unlabeled protein and the corresponding isotope labeled protein.
  • the mask mouth matogram thus obtained is a mask mouth matogram derived from a unique protein.
  • the area of the mask mouth matogram is calculated for each of the isotope-unlabeled protein and the isotope-labeled protein, and these are defined as the first waveform area and the second waveform area (step S116).
  • step S117 a ratio of (second waveform area) / (first waveform area) can be obtained and used for quantitative analysis of protein variation. This always enables quantitative analysis by making comparisons with isotopically labeled proteins.
  • FIG. 9 shows an example of a functional block diagram of the configuration of the analysis system 10 to which the present invention is applied.
  • the portion related to the present invention is conceptually shown in the above configuration, and the microcomputer is configured.
  • the analysis system 10 generally includes an analysis unit 30 that analyzes mass analysis data obtained by the mass spectrometer 20, an external analysis program for determining amino acid sequences, and the like.
  • the external device unit 40 to be provided is configured to be communicably connected via the network 50.
  • the network 50 shown in FIG. 9 has a function of connecting the analysis device unit 30 and the external device unit 40 to each other, such as the Internet.
  • the mass spectrometer 20 used in the present invention is not particularly limited as long as it is a commercially available mass spectrometer.
  • the mass spectrometer 20 may include a data storage unit 25 that stores the results obtained by measurement using the apparatus. Further, the mass spectrometer 20 used in the present invention itself has a control unit for controlling the apparatus and an input / output. Even if it has a part.
  • the external device unit 40 shown in Fig. 9 is interconnected with the analysis device unit 30 for analyzing the mass spectrometry data via a network, and the external database about the amino acid sequence information etc. is homologous to the user. It has a function to provide a website for executing an external analysis program such as one search.
  • the external device unit 40 may be configured as a WEB server, an ASP server, or the like, and the hardware configuration thereof is an information processing device such as a generally sold workstation or personal computer, and an accessory device thereof. You may comprise by.
  • Each function of the external device unit 40 is realized by a CPU, a disk device, a memory device, an input device, an output device, a communication control device, etc. in the hardware configuration of the external device unit and a program for controlling them.
  • a database such as NCBInr can be used as the external device section.
  • Analyzing device section 30 shown in FIG. 9 is generally a control section 60 such as a CPU that controls the entire mass spectrometer 20, and a communication apparatus such as a router connected to a communication line or the like. (Not shown
  • Communication control interface unit 70 connected to), mass spectrometer 20, input / output control interface unit 80 connected to output device 90 such as a printer, and storage unit 100 for storing various databases. It is prepared for.
  • Each unit is communicably connected via an arbitrary communication path.
  • the analyzing device unit 30 according to the present invention is communicably connected to a network via a communication device such as a router and a wired or wireless communication line such as a dedicated line.
  • Various databases (mass spectrometry data, amino acid sequence database, etc.) stored in the storage unit 100 are storage means such as a fixed disk device, and store files, data, and the like.
  • the mass spectrometry database is a database obtained by the mass spectrometer 20.
  • the amino acid sequence database is an amino acid sequence database as an analysis result of a mass spectrometry spectrum obtained by a mass spectrometer or an external amino acid sequence database accessible via the Internet. Also good. Furthermore, it may be an in-house database created by copying these databases, storing original sequence information, or giving a unique identification number.
  • the control unit 60 is a device that stores a program for executing the analysis method according to the present invention, and controls the analysis device unit 30, and thus the entire analysis system 10.
  • the control unit 60 has a control program such as an OS (operating system), a program that defines various processing procedures, and an internal memory (not shown) for storing necessary data. Thus, information processing for executing various processes is performed.
  • the program for executing the analysis method according to the present invention may be stored in the storage unit 100.
  • FIG. 10 is a flowchart conceptually showing one program for executing the analysis method according to the present invention.
  • the control unit 60 acquires the mass analysis data obtained by the mass spectrometer 20.
  • the acquired mass spectrometry data is stored in the storage unit 100.
  • each mass analysis data is identified with a scan number and the like so as to facilitate data retrieval.
  • a number is assigned (step S201).
  • control is performed by MS / MS processing while matching with an external database, for example, NCBInr database, through the Internet 50 via the communication control interface unit.
  • the amino acid sequence at section 60 (step S202) from among o the mass spectrometry data, to determine the mass spectrum to be analyzed (see step S203).
  • the m / z of the mass spectrometry spectrum determined as described above is determined, and this is defined as the first m / z.
  • the first m / z value may be a mass spectrometry spectrum of an isotope-unlabeled protein or a mass spectrometry spectrum of an isotope-labeled protein. Such a determination can be easily made with the aforementioned scan number capabilities.
  • step S204 the second m / z value of the isotope-labeled protein corresponding to the protein is determined from the first m / z value of the protein whose amino acid sequence has been determined.
  • This determination step is easy based on the number of isotope atoms contained in the isotope-labeled amino acid used in the pre-culture in step S11 of FIG. 3 and the charge of the protein corresponding to the first m / z. Can be determined.
  • the mass chromatogram of the value is also extracted from the mass analysis data stored in the storage unit 100 (see step S205).
  • step S206 waveform separation processing is performed.
  • the mask mouth matogram derived from the unique protein is separated and stored in the storage unit 100.
  • the first waveform area and the second waveform area are calculated (step S207), and in step S208, (second waveform area) I (first waveform area) 1 waveform area).
  • the value of the ratio can be displayed or printed on an output device 90 such as a display or a printer as necessary.
  • the series of steps shown in Fig. 10 is performed in comparison with the mass spectrometry spectrum caused by the isotope-labeled protein, it is possible to quantitatively analyze changes in protein expression in the sample. . If necessary, the series of steps shown in Fig. 10 can be repeatedly executed for another mass spectrum to be analyzed. For example, it is possible to observe a difference in the expression pattern of a gene-deficient cell-derived protein from comparison with a normal cell-derived protein.
  • the isotope-unlabeled biomolecule and the isotope-labeled biomolecule are described, but in place of the isotope-labeled biomolecule, an isotope-labeled internal standard is used.
  • the waveform area ratio shown in step SS208 in FIG. 10 is calculated as the ratio of (waveform area of biomolecule) / (waveform area unique to internal standard substance).
  • FIG. 11 is a functional block diagram showing a detailed configuration of the control unit 60 used in the present invention.
  • the control unit 80 for executing the analysis method according to the present invention described in FIG. 10 transmits the mass analysis data obtained by the mass spectrometer 20 through the input control interface unit 80. Obtained at 80 data input / output units.
  • the amino acid sequence of the mass spectrometry data of the obtained protein is determined by the processing unit of the control unit 60 by MS / MS processing while collating with an external database such as the NCBInr database.
  • a mass spectrometry spectrum as an analysis target is determined based on a signal from an input means (not shown) connected to the mass spectrometer 20 or the control unit 80.
  • examples of the input means include a keyboard and a mouse connected to the control unit.
  • the first m / z value is determined by the determination, and the processing unit of the control unit 60 determines the second m / z value.
  • the determination of the second m / z value can be performed by step S113 in FIG.
  • the protein having the first m / z value and the second m / z value is in a relationship between an isotope unlabeled amino acid and a protein in which the same amino acid is isotopically labeled.
  • the mask mouth matograms at the first and second m / z values determined as described above are obtained from the mass analysis database of the storage unit 100 or the mass spectrometer 20 via the data input / output unit. Get it at the processing department.
  • the obtained mask mouth matogram at the first and second m / z values is subjected to waveform separation processing.
  • waveform separation processing the mask mouth matogram at the m / z value alone can be converted into a mask mouth matogram derived from a unique protein, even if it appears to be a single protein peak at first glance. Can be separated (see Figure 8)
  • the data separated into the mask mouth matogram derived from the unique protein is sent from the waveform processing unit to the calculation unit, the calculation of the waveform area separated by the calculation unit, and the isotope unlabeled In the isotope-labeled protein, calculation of the waveform area ratio between mask mouth matograms derived from the corresponding unique protein is performed.
  • each sample is an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled protein or a metabolically isotopically labeled protein.
  • the analysis method according to the present invention accompanied by the waveform separation process enables the quantitative analysis of the biomolecule.
  • the analysis method that makes money is, when the sample cannot be cultured, This method is useful when a sample can be cultured, but is affected by subculture, or when the sample cannot be prepared at the same laboratory at the same time.
  • the protein in the internal standard is a known amount, absolute quantification is possible.
  • FIG. 12 shows a process chart of a program for obtaining and comparing the intensity ratio in the first embodiment of the present invention.
  • step S300 shown in FIG. 12 mass analysis data of various measurement samples measured by the mass spectrometer 20 is acquired by the analyzer unit 30 of the analysis system 10 according to the present invention.
  • the sample includes a fractionated sample, a purified sample, a separated sample, a digested sample, or a sample separated by HPLC.
  • biomolecules that are not metabolically isotopically labeled and biomolecules that are not isotopically labeled are targeted.
  • step S301 the data on the measurement result of the mass spectrometry spectrum is collated with an external database, for example, the NCBInr database, via the communication control IF unit 70 of the analysis device unit 30, and the MS / By MS processing, the obtained mass spectrometric data, specifically identification of isotope-labeled and non-isotope-labeled proteins, that is, the amino acid sequence is identified by the processing unit of the control unit 60. Thereafter, the target isotope-labeled peak and isotope-unlabeled peak are identified (see step S302).
  • an external database for example, the NCBInr database
  • step S303 the peak intensity ratio between the isotope-labeled peak and the isotope-unlabeled peak in the molecule in which the amino acid sequence of the peptide is identified by the control unit 60 is calculated. calculate. By performing the above operation for a plurality of peptides obtained for each sample force, the peak intensity ratios can be compared between different peptides.
  • the present invention can provide a program for absolute quantification of the biomolecule by executing the step shown in FIG.
  • the mask mouth matogram that has been actually measured and waveform-separated is originally based on a sample to be analyzed by two-dimensional electrophoresis or the like. This is a mass analysis of the separated proteins.
  • the gel in the container is digested with an enzyme such as trypsin to collect fragments into peptides, and mass spectrometry is performed.
  • the peptide recovered in this way is derived from a band derived from the cleaved protein spot, but even if the band itself does not contain a single protein, the same protein may be sampled. It is customary for peptides to be cleaved during processing, so that they are present in multiple bands. Therefore, even if the mask mouth matogram is waveform-separated as described above, the same peptide is measured as a plurality of waveform-separated mask mouth matograms.
  • the ratio of (isotope unlabeled peptide peak) / (isotope labeled peptide peak) ratio or (isotope unlabeled peptide waveform area) I (isotope labeled peptide) (hereinafter collectively referred to as “quantitative value”) differs for each peak subjected to mass spectrometry, and there are a plurality of values.
  • the function information of the protein can be obtained by comparing the result of the mass spectrometry spectrum with a database such as LocusLink having the function information of the protein.
  • LocusLink provides “Locus IDJt, key link information to common keys and protein function information from key information in multiple databases such as NCBInr, IPI, Sport, etc. , NCBInr, IPI, Sport, etc.
  • LocusLink can be used to obtain Locus ID from key information, and from that Locus ID, Protein function information can be obtained, for example, key information “GiNo” is obtained from a peptide sequence using a database such as NCBInr. Next, use LocusLink to get the Locus ID from GiNo. From the Locus ID, protein function information can be obtained.
  • FIG. 13 shows a scheme related to acquisition of functional information using an external database used in the present invention.
  • the data are classified into peptides after waveform separation, and then accessed to a database having protein function information, such as NCBInr, IPI, Sport, etc. To do.
  • protein function information such as NCBInr, IPI, Sport, etc.
  • sequence patterns are verified using NCBI-BLAST.
  • GiNo which is the key information of the obtained array pattern force NCBInr, connect to LocusLink, a database with detailed function information, and obtain the Locus ID from GiNo. After that, those with the same Locus ID are grouped together, and Gene Symbol, Gene
  • each peptide comprises from the above-mentioned grouped Gene Symbols, and it is possible to calculate the measured value force of a plurality of peptides and the quantitative value of the protein. .
  • the association between the quantified protein value and biological information is realized.
  • peptide quantification values it is also possible to simply calculate the average quantification value. In that case, the peptide quantification values are easily affected by the maximum and minimum values.
  • the quantitative value of a protein if the standard deviation is calculated for the grouped functional proteins, the average is calculated again using only the data within the range of the standard deviation to obtain the quantitative value of the protein. Therefore, the relationship between the quantitative value of the protein and the biological information is more meaningful than the quantitative value of the peptide.
  • FIG. 14 shows a process chart for executing the method for adding functional information based on the determined peptide sequence result after waveform separation (step S400) in the present invention.
  • step S401 classification is performed for each selected peptide sequence, and a peptide sequence to be analyzed thereafter is specified.
  • an external database is accessed via the communication control interface in order to acquire function information.
  • specific examples of external databases include databases such as NCBInr (hhtp: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov/), IPI, and Sport. Then, the sequence pattern is searched from such a database, and information such as GiNo is acquired.
  • step S402 from the information such as the GiNo of the peptide, whether or not there is information on the protein that the peptide has constituted inspect.
  • it is grouped as a sequence sharing powerful information.
  • a quantitative value for the grouped protein is calculated (see step S403).
  • this information includes a mechanism such as Gene Symbol, GO (biological process) ⁇ uOi, cellular component) uO (molecular inction)? ⁇ You can do it manually.
  • the average value of the aforementioned quantitative values and the representative quantitative value of the peptide can be calculated by the calculation unit of the control unit 60 shown in FIG. 9 and FIG.
  • the MS / MS processing power is a database having functional information of the aforementioned protein without performing waveform separation processing after determining the amino acid sequence constituting the peptide from the obtained mass spectrometry spectrum.
  • NCBInr, etc. can also be accessed to find the relationship between quantitative values of peptides and biological data. This means that it is necessary to waveform-separate the mass spectrometry of the peptide whose amino acid sequence has been determined! It can also be applied to the case.
  • FIG. 15 shows the results of mass spectrometry spectra of peptides in the presence of an internal standard substance that is an isotope-labeled biomolecule without waveform separation, specifically based on the results of amino sequences.
  • FIG. 5 shows a process chart for executing a method for adding function information. Steps S500 to S502 shown in FIG. 15 are the same as steps S200 to S205 shown in FIG. In a preferred embodiment of the present invention, in step S503, a mask mouth matogram at m / z of the first and second and internal standard substances is extracted. After step S502, in step S504, access to an external database is performed via the communication control interface shown in FIG. 9 in order to obtain function information.
  • external databases include databases such as NCBInr (hhtp: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov/), IPI, and Sport. From this database, peptide sequence patterns are searched to obtain information such as GiNo. Thereafter, in step 505, the peptide is searched for the presence / absence of information on the protein from the information such as the GiNo of the peptide.
  • GO biological process
  • It can be associated with functional information such as GO (cellular component), GO (molecularmputation), and representative quantitative values. Note that the step diagram shown in FIG.
  • step S502 does not describe the step of obtaining the ratio of the waveform area of the isotope-unlabeled peptide to the isotope-labeled peptide performed in step S209 of FIG.
  • the waveform area of each peptide is obtained and (waveform area of the isotope-unlabeled peptide) / (waveform area of the isotope-labeled peptide) )
  • calculating the ratio, and performing steps S504 and S505 can also be related to the function information.
  • the peak intensity ratio obtained by using only the ratio of the waveform area it can also be related to the function information.
  • RPMI-1640 (Sigma, R-7130) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE, BATCH 32300102), 100U / ml penicillin G, 100 g / ml streptomycin (GIBCO, 15140-122) was used.
  • RPM 1640 is prepared by selecting a powder medium that does not contain L-glutamine, L-lysine, L-methionine, L-leucine, and sodium bicarbonate, and adding the missing components to the medium (L-Glute).
  • Lutamin (Sigma, G-8540), L-lysine (Sigma, L-9037), L-methionine (Sigma, M-5308), sodium bicarbonate (Wako Pure Chemicals, 191-01305) 0.3g / L, 0.04g / L, 0.015g / L, 2g / L, respectively, and 0.05g / L of stable isotope-labeled L-leucine (Cambridge Isotope Laboratories, CLM-2262) L added).
  • the cells were cultured at 37 ° C under 5% CO. Fine cells obtained by this culture
  • the vesicle was used in the following experiment as a cell containing an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule (Example 2-7).
  • the soluble fraction was prepared by centrifugation and centrifugation at 100,000 ⁇ gl hours. When the amount of protein in this soluble fraction was measured, the amount of protein was 39.4 mg per lg of wet brain weight.
  • Unbroken cells and nuclei were removed by centrifugation for 5 minutes. The supernatant was then centrifuged at 100,000 ⁇ g for 1 hour to prepare a soluble fraction.
  • an immobilized enzyme of E70700 In order to confirm that a certain protein in a sample can be quantified, an immobilized enzyme of E70700. Med. Chem. 42, 3789-99, 1999) known to have affinity with cytosolic malate dehydrogenase (cMDH). The following operations were performed using a fifty matrix (Anal. Chem. 75, 2159-2165, 2003). Soluble fraction O.lmL to 0.9mL After dilution with PBS and mixing with 0.1 mL of the E7070 fixed matrix, the supernatant was removed by centrifugation.
  • cMDH cytosolic malate dehydrogenase
  • cMDH was recovered by eluting the adsorbed protein with PBS-10 mM NADH solution (NADH is Sigma, N-8129). The collected fractions were concentrated by ultrafiltration and purified by SDS PAGE (ATTO, e-PAGEL, E-T520L). A band corresponding to cMDH was excised and trypsin (Promega, Cat. No. V5111). ) Digested in gel (Rapid Comm Mass Spectrom., 15, 1416-1421, 2001: Rapid Comm Mass Spectrom., 17, 1071-1078, 2003) to obtain a digested sample.
  • the digested sample was MALDI-MS (ABI4700, Applied Biosystems:
  • the average value 1.98293 of each of these peak intensity ratios 2.308743, 1.436341, 2.435703, 1.750933 was determined, and this was assigned to wild-type mice. CMDH-derived peak intensity ratio.
  • ⁇ of wild-type mouse (C57B6) was extracted and stored frozen. Weigh the brain and measure the protease inhibitor (Complete TM (Roche Diagnostics, product number 1 697 498) dissolved in 2 tablets per 50 mL of sample extract). Containing 10 mM HEPES- (pH7.4) -lmM DTT-lmM MgCl -ImM NaF-lmM
  • Homogenized in vanadate and the soluble fraction was prepared by centrifugation at 100,000 xg for 1 hour.
  • the protein concentration of the soluble fraction was adjusted to 3.7 mg / mL.
  • an immobilized enzyme of E70700 In order to confirm that a certain protein in a sample can be quantified, an immobilized enzyme of E70700. Med. Chem. 42, 3789-99, 1999) known to have affinity with cytosolic malate dehydrogenase (cMDH). The following operations were performed using a fifty matrix (Anal. Chem. 75, 2159-2165, 2003). 0.1 mL of the soluble fraction of the sample was diluted with 0.9 mL of PBS, mixed with 0.1 mL of an E7070-immobilized affinity matrix, and then the supernatant was removed by centrifugation.
  • cMDH cytosolic malate dehydrogenase
  • cMDH was recovered by eluting the adsorbed protein with PBS-lOmM NADH solution (NADH is Sigma, N-8129). The collected fraction was concentrated by ultrafiltration and purified by SDS PAGE (ATTO, e-PAGEL, E-T520L). A band corresponding to cMDH was cut out and trypsin (Promega, Cat. No. V5111). ) Digested in gel (Rapid Comm Mass Spectrom., 15, 1416-1421, 2001: Rapid Comm Mass Spectrom., 17, 1071-1078, 2003) to obtain a digested sample.
  • the digested sample was MALDI-MS (ABI4700, Applied Biosystems:
  • the protein concentration of the soluble fraction was adjusted to 3.7 mg / mL.
  • mice wild type mice (C57B6) and mice lacking the ADAM22 gene (strain, breeder) were prepared, and each ⁇ I was excised and stored frozen.
  • the brain was thawed, the wet brain weight was measured, and the amount of protein in the sample was calculated from the amount of protein per wet brain weight obtained in Example 1.
  • the number of cells containing the internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule obtained in Example 1 is adjusted so that the amount of protein is equal, and homogenized with a Teflon R homogenizer. Undisrupted cells and nuclei were removed by centrifugation at 500 ⁇ g for 5 minutes.
  • the supernatant was separated by centrifugation at 100,000 ⁇ g for 1 hour to prepare a soluble fraction.
  • the protein derived from wild-type mice was 3.02 mg / mL
  • the protein derived from mice deficient in the AD AM22 gene was 3.12 mg / mL. This was a fractionated sample.
  • the following operations were performed on each fractionated sample by 2 mL (two 1 mL tubes). Add urea (Bio-Rad Cat. No. 161-0731) to 8M, 0.5M Tris with 3mg dethiothreitol (Wako Pure Chemicals Cat. No.
  • DTT DTT per mL
  • a buffer solution pH 8.3, manufactured by Sigma (500 ⁇ L) was added to each fractionated sample, and the cysteine residues in the protein were reduced by incubation at 37 ° C. for 3 hours. Thereafter, urine was added to make 8 ⁇ g, and 500 ⁇ L of 0.5 M Tris buffer (pH 8.3) containing 8 mg of acrylamide (Catalog No. 161-0107 manufactured by Bio-Rad) was fractionated. Samples were incubated at room temperature for 3 hours to alkylate cysteine residues. Excess acrylamide was deactivated by adding 8 mg of DTT. Using a SnakeSkin with a molecular weight of 10,000 cut (Pierce, Cat. No.
  • V5111 per 0.3 mg of protein.
  • a digested sample was obtained here.
  • Each digested sample (a protein derived from a wild type mouse, a protein derived from a mouse deficient in the ADAM22 gene) is used for each one-on exchange column (Mini-Q PC 3.2 / 3: Amersham Biosciences Cat. No. 17- 0686-01) and a cation exchange column (Mini-S PC 3.2 / 3: Amersham Biosciences Cat. No. 17-0687-01), and fractionation was performed every minute.
  • the sample separated by HPLC is then diluted with 95 ⁇ L of 0.1% TFA water.
  • a flow-splitting method was adopted as the flow rate, and the column was adjusted to have a flow rate of about 12 L / min. Inject 50 ⁇ L of sample with CTC's autosampler PAL, and then install the sample into the sample loop of the injector capillary trap column (Michrom BioResource)
  • the mass spectrometer is equipped with a ThermoFinnigan LCQ Duo, which is specially ordered by AMR, does not use a seed gas, and is equipped with a sub-nano sprayer that can adjust the spray position arbitrarily with the XYZ stage.
  • -One dollar GL Sciences (catalog number 7820-59001) was directly connected to the C18 column and used.
  • ESI voltage was 2.6 kV.
  • 1 J ⁇ was Dvnamic Exclusion in Data Dependent mode. Repeat of 1 In order to increase the number of scans, the measurement was performed in a so-called double play mode with the Zoom Scan mode removed.
  • the mass spectrometry spectrum of the scan number is extracted, and the peak of the natural leucine peptide and the peak of the isotope peptide are used to determine the parent ion information when the MS / MS is measured (m / z value), the number of leucines in the peptide, and the number of charges
  • the search result power with SonarMSMS was also obtained, the paired peaks were searched, and the peak intensity ratio was automatically calculated.
  • protein identification and peak intensity ratio calculation were performed.
  • the peptide is identified.
  • the peak intensity ratio with the peptide peak derived from an internal standard substance, which is a metabolically isotope-labeled biomolecule, present at the same or near the same scan number as the mass spectrometry spectrum obtained was determined.
  • of mice deficient in the ADAM22 gene was calculated by comparing the previously obtained peak intensity ratios.
  • FIG. 19 and FIG. 22 show the identification results of the protein obtained in Example 5 according to the present invention.
  • a plurality of biomolecules for example, protein phosphatase 2a, myotrophin, heat shock protein 1, protein phosphatase PP2A, glyceraldehyde—3—phosphate dehydrogenase, ADP—ribosylation factor, cofilin, tubulin—beta, etc.
  • FIGS. 23 to 26 show the results of the ratio of the waveform areas derived from unique proteins, which have been subjected to the waveform separation processing according to the present invention, based on the aforementioned protein identification results.
  • proteome analysis will be described by taking a protein containing leucine as an example. From the results of mass spectrometry of the protein derived from protein phosphatase 2a shown in Fig. 19, we focused on the peak derived from the protein containing leucine not labeled with isotope with m / z value of 644.7 (in Fig. 19). Indicated by L). The fact that this peak is derived from leucine has also been found in the aforementioned MS / MS processing power. That is, in the above description, steps S200 to S203 shown in FIG. 10 have already been performed.
  • FIG. 23 is a diagram showing a mass spectrometry spectrum at time, that is, at a specific consecutive scan number. From the results shown in Fig. 23, it can be seen from the fluctuation of the peak height that the m / z value of 644.7 reaches its maximum in scan 2 and then decays.
  • FIG. 24 shows a mask mouth matgram of the result of connecting the required number of scan numbers shown in FIG. 23 in succession. Specifically, Fig. 24 shows the mask mouth created by connecting the mass spectrometry spectra up to scan numbers 975-1005 with the center at 644.7 (m / z value: 644.2—645.2). Shows the matogram.
  • FIG. 25 shows a mask mouth matgram that is the result of connecting the required number of scan numbers shown in FIG. 23 in succession. Specifically, Fig. 24 shows that the center is 646.7 (m / z value: 64 6.2-647.2), and the mass spectrometry spectra from scan numbers 975 to 1005 are connected. This shows the mask mouth matogram created.
  • waveform separation processing of the mass spectrometry spectrum obtained in FIGS. 24 and 25 is performed in step S206 of FIG. It went as follows. In other words, waveform separation processing was performed by a curve fitting method combining a Gaussian function and a Lorentz function.
  • FIG. 26 shows the result of the waveform separation process according to the present invention.
  • (A) in Fig. 26 is the result of the waveform separation processing of the mask chromatogram displayed by L of protein phosphatase 2a derived from wild-type mouse brain (Wild) shown in Fig. 19, while ( B) shows the results of the waveform separation processing of the mask mouth matogram displayed with H of isotope-labeled protein phosphatase 2a derived from the wild-type mouse brain (Wild) shown in FIG.
  • the observed L and H mask mouth matograms were each found to be a superposition of mask mouth matograms derived from five unique proteins.
  • the area of each waveform can be calculated by integration.
  • the area of each waveform can be calculated by integration in the waveform 6 to the waveform 10 after the waveform separation (step S207 in FIG. 10).
  • the analysis results obtained with the above explanation can be stored in the recording unit 100 shown in FIG.
  • the waveform area thus calculated is expressed in cells by observing the ratio of the waveform derived from a protein containing an isotopically labeled amino acid to the waveform derived from a protein containing an isotopically unlabeled amino acid.
  • FIG. 27 is a diagram showing the results obtained by the analysis method of the present invention.
  • Figure 27 shows peak intensities from wild-type mouse brain (Wild) and ADAM22 gene-deficient mouse brain (K / 0) versus peaks derived from metabolically isotopically labeled biomolecule internal standards.
  • the wild-type mouse brain was used when peaks of the same sequence derived from metabolically isotopically labeled biomolecule internal standards were used and when peaks of different sequences were used.
  • a comparison of peak intensity ratios derived from (Wild) -derived and ADAM22 gene-deficient mouse brain ( ⁇ / ⁇ ) is shown.
  • Hsp60 ELISA Kit Stressgen, EKS-600. Attach a cell containing an internal standard is metabolically isotope labeled biomolecule obtained in Example 1 PBS (Sigma Co., D-8537) and washed with cell 3.75Xl0 7 pieces of the Hsp60 ELISA Kit The lysate was dissolved in 3 mL of the lysate, and the centrifuged supernatant was used as the soluble fraction. Hereinafter, the quantitative operation was performed according to the instructions of the Hsp60 ELISA Kit.
  • the concentration of HSP60 in the soluble fraction was determined to be 480 ng / mL. Therefore, the 3.75Xl0 7 or cells containing an internal standard is metabolically isotope-labeled biomolecules issued calculated that there is HSP60 in 1440Ng.
  • HSP60 in wild-type mouse brain was quantified.
  • the protein mass extracted from the brain lg was 39.4 mg, and cells containing internal standards (12.1X10 7 cells), which are metabolically isotopically labeled biomolecules of the same protein amount, were added (Examples). 2)
  • CMDH used as a standard substance was prepared as follows.
  • the human cMDH gene was cloned and inserted with a FLAG tag at the N-terminal side into a baculovirus vector.
  • baculovirus having the vector was infected with S19 cells and cultured.
  • the cultured cells were collected by centrifugation, and the precipitate was frozen at ⁇ 80 ° C., re-thawed, and suspended in 25 mL of PBS to extract cMDH. After extraction, the insoluble fraction was removed by centrifugation, and the supernatant was used as a crude extract.
  • cMDH activity To measure cMDH activity, add 1 ⁇ L of cMDH solution to the following reaction solution, and measure the decrease in absorbance of 340 derived from NADH over time using a spectrophotometer (Amersham Biosciences, Ultrospec 4300 pro). The decrease in absorbance per minute was defined as cMDH activity. As a result, the decrease in absorbance was 0.068 / min when using 1 ⁇ L of cMDH concentration 0.02 mg / mL, and the decrease in absorbance was 0.057 / min when using 1 ⁇ L of soluble fraction. .
  • NADH (Sigma, Lot.l02K701) lOmM aqueous solution O.OlmL
  • the cMDH concentration in the wild-type mouse brain was quantified as follows.
  • the amount of protein in the soluble fraction is 6.2 mg / mL (Example 1).
  • HFSVEGQLEFR heat shock protein 90-beta
  • HLIPAANTGESK 14-3-3 epsilon
  • SYELPDGQVITIGNER mutant beta-actin (beta actnv
  • ELEAELEDER Myosin heavy chain, nonmuscle type B. 2 pmol of each of these synthetic peptides was added to the previous soluble fraction. 3 mL of a mixed solution of a soluble fraction (990 ng / mL) and a synthetic peptide (91 nmol / mL) was measured by LC / MSMS (QSTAR PULSAR i manufactured by Applied Ne earth). The measurement conditions are as follows. [0209] ⁇ LC condition>
  • HTS-PAL CTC Analytica
  • Reverse phase filler (ReproSil-Pur 120) 0mm, tip diameter 8 ⁇ m, no conductive material coating
  • Mass spectrometry conditions ESI interface: for nanoelectrospray (manufactured by Protana)
  • MSMS scan Up to 4 times per MS scan, 85-1400 amu, 1.5 seconds each, measurement time: 110 minutes
  • Protein Peptide Ratiodabe unlabel ProteinCfmoi / uL) MW (kD) ng / u Wt% heat shock 70kDa protein 8 isoforrr SQIHDIVLVGGSTR 1.36 123.64 70.97 8.77 0.88 heat shock protein 90-beta HFSVEGQLEF 1.65 150.00 83.42 12.51 1.26
  • Example 4 the peak intensity ratio between the protein derived from the wild-type mouse brain and the protein derived from the internal standard substance which is a metabolically isotopically labeled biomolecule is obtained. And it is a biomolecule metabolically isotope-labeled with the wild-type mouse brain Cells containing the internal standard were mixed and measured so that the amount of protein was the same (Example 4). The amount of protein per lg of mouse brain is 39.4 mg (Example 2). Therefore, the absolute amount contained in mouse brain lg could be calculated as shown in Table 4.
  • FIG. 28 is a diagram showing an array after waveform separation focused on in one embodiment of the present invention and a quantitative value of the array. Specifically, in this example, (1)
  • LC system autosampler, pump, UV detector, fraction collector, control outlet
  • LClOAvp manufactured by Shimadzu Corporation
  • MSMS scan Up to 4 times per MS scan, 85-1400 amu, 1.5 seconds each, Measurement time: 110 minutes
  • Example 4 the wild-type and ADAM22 knockout mouse brain-derived The peak intensity ratio between the protein and the protein derived from an internal standard that is a metabolically isotopically labeled biomolecule is determined.
  • Cells containing internal standards which are biomolecules that are metabolically isotope-labeled with the mouse brain, are mixed and measured so that the amount of protein is the same, and the weight mixing ratio is known. (Example 4). Therefore, the absolute amount contained in lmg of mouse brain could be calculated as shown in Table 8. Therefore, it was clarified that absolute quantification can be performed in the measurement by MS by using cells containing an internal standard substance which is a biomolecule labeled with this isotope.
  • a sample such as a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, or a protein complex, including a sample that cannot be metabolically labeled. It has become possible.
  • the conventional in vivo labeling method can be performed only on limited cells that are not affected by the culture conditions, but in the present invention, it is a metabolically isotope-labeled biomolecule.
  • the present invention comparison between three or more samples is facilitated.
  • the conventional quantitative proteome analysis methods directly compare the internal standard substance and the analyte, and thus it is necessary to prepare a sample for each measurement.
  • the internal standard to be labeled also changes as the measurement target changes, it is necessary to examine the conditions for the label each time.Also, comparison between experiments was not possible.
  • the concentration of a biomolecule in a cell containing an internal standard substance that is a biomolecule that has been metabolically isotope-labeled in advance or an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule is determined.
  • absolute quantification of biomolecules became possible.
  • Data between researchers can be transferred by transferring or lending cells that contain an internal standard that is an isotopically labeled biomolecule or an internal standard that is a metabolically isotopically labeled biomolecule. Sharing can be done.
  • a mass spectrometry spectrum derived from a specific biomolecule can be obtained, and the expression level of the biomolecule that changes from time to time in cells in the living body can be quantitatively determined. It becomes possible to analyze. Furthermore, the analysis method can be realized on a computer by the program according to the present invention.
  • Peptides that can be quantified can be quantified not only for peptides having the same sequence as the synthetic peptide, but also for other peptides derived from the protein constituted by the peptide. Therefore, since a single protein is quantified by multiple peptides, accurate and highly reproducible quantitative values can be obtained without greatly affecting the protein quantitative values due to errors in the measurement results of individual peptides. It became possible.
  • Sarako uses a 10-fold excess of reagent in the peptide synthesizer, and the force and the synthesis scale are in milligram units. Therefore, synthesis of isotope-labeled peptides is very expensive, and comprehensive quantification by conventional methods is difficult in terms of cost. On the other hand, in the method of the present invention, since isotope labeling of biomolecules is performed by cell culture, it can be efficiently produced even in a very small amount.
  • Synthetic peptides for quantifying biomolecules in cells containing internal standards that are metabolically isotope-labeled biomolecules or internal standards that are metabolically isotope-labeled biomolecules are: Since isotopes are not required and can be handled by ordinary peptide synthesis, it is suitable as a comprehensive quantitative method. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 Shows a conventional quantitative method.
  • FIG. 2 shows a quantitative method according to the present invention.
  • FIG. 3 shows a schematic overall scheme of a biomolecule quantitative analysis method according to the present invention.
  • FIG. 4 shows a scheme of one embodiment of measurement sample preparation using isotope labeling according to the present invention.
  • FIG. 5 shows a scheme of an analysis method according to the present invention after mass spectrometry.
  • FIG. 6 shows a mass spectrum obtained by a typical mass spectrometer.
  • V an example spectrum.
  • [8] A waveform spectrum obtained by separating the spectrum shown in FIG. 7 by the waveform separation process used in the present invention.
  • FIG. 12 shows a process diagram of a program for executing the method according to the first embodiment of the present invention.
  • ⁇ 13 Shows a scheme related to the acquisition of function information using an external database used in the present invention.
  • FIG. 14 is a process diagram for executing a method for adding functional information based on the results of the mask mouth matogram of a peptide after waveform separation in the present invention.
  • Figure 15 is based on the results of peptide mass spectrometry without waveform separation.
  • FIG. 3 shows a process diagram for executing a method for adding function information.
  • FIG. 16 shows the mass spectrum of cMDH derived from the wild-type mouse brain and from an internal standard substance, which is a metabolically isotopically labeled biomolecule.
  • cMDH the theoretical and actual measured ratios of the expression level from the wild-type mouse brain and the internal reference substance, which is a metabolically isotopically labeled biomolecule, by mass spectrometry. Is plotted.
  • FIG. 19 Mass spectrometry spectra of protein phosphatase 2a and myotrophin derived from wild-type mouse brain (Wild) and metabolically isotope-labeled internal standard (H), and ADAM22 gene-deficient mice Mass spectrometric spectra of the brain (K / 0) (L) and metabolically isotopically labeled biomolecule internal standard (H).
  • FIG. 20 Wild-type protein phosphatase PP2A and heat shock protein 1 Mass spectrometry spectrum of mouse brain (Wild) (L) and metabolically isotopically labeled internal standard substance (H) and ADAM22 gene-deficient mouse brain (K / 0)) and metabolic Shows the mass spectrometry spectrum of (H) derived from an internal standard substance, which is an isotope-labeled biomolecule.
  • FIG. 21 Giyceraldehyde-3-phosphate denydrogenase and ADP-ribosylation factor derived from wild-type mouse brain (Wild) (L) and metabolically isotopically labeled internal standard substance (H) The mass spectrometry spectrum and the mass spectrometry spectrum of ADAM22 gene-deficient mouse brain (K / 0)) and internal standard substance (H) which is a metabolically isotope-labeled biomolecule are shown.
  • FIG. 22 Mass spectrometry spectra of cofilin and tubulin-beta derived from wild-type mouse brain (Wild) (L) and from an internal standard substance that is an isotopically labeled biomolecule (H)
  • Wild wild-type mouse brain
  • H an isotopically labeled biomolecule
  • the brain of ADAM22 gene-deficient mouse derived from K / 0
  • the mass spectrometric spectrum derived from an internal standard substance (H) which is a metabolically isotope-labeled biomolecule are shown.
  • FIG. 23 is a diagram showing a mass spectrometry spectrum at time, that is, a specific consecutive scan number.
  • L refers to a peak derived from a protein containing leucine that is not isotopically labeled.
  • FIG. 24 is a diagram showing a mask mouth matogram at scan numbers 975-1005 at m / z values with a width of 644.2—645.2 with the center at 644.7.
  • FIG. 25 is a diagram showing a mask mouth matogram for scan numbers 975-1005 at an m / z value with a center of 646.7 and a width of 646.2-647.2.
  • H refers to a peak derived from a protein containing isotope-labeled leucine.
  • FIG. 26 shows the result of waveform separation processing according to the present invention.
  • (A) in FIG. 26 shows the result of the waveform separation processing of the mask mouth matogram displayed by L shown in FIG. 19, while (B) in FIG. 26 is displayed by H shown in FIG. ⁇ 27] Wild-type mouse brain (Wild) -derived and ADAM22 gene-deficient mouse brain with respect to peaks derived from metabolically isotope-labeled internal standards, which are biomolecules labeled metabolically.
  • FIG. 28 is a diagram showing an array after waveform separation focused on in one embodiment of the present invention and a quantified value of the array.
  • FIG. 29 is a diagram showing a list of GiNos of proteins identified for each sequence as a result of pattern search using HomoSapiens in the NCBInr database in one example of the present invention.
  • FIG. 30 it is a diagram showing an example of a result of analyzing mass spectrometry data after waveform separation using a database.

Abstract

　【課題】本発明の課題は、組織、生体液、細胞、細胞器官又はタンパク質複合体など、サンプル中の１若しくは複数の生体分子を精度よく定量すること、さらには、絶対定量することにある。 　【解決手段】代謝的に同位体標識された生体分子を内部標準物質として添加し、質量分析計で測定することにより、サンプル中の１若しくは複数の標的分子を精度よく定量することが可能となった。また、質量分析の解析に際し、波形分離処理を実行することで、質量分析の高精度な定量的解析法を提供する。  

Description

同位体標識化内部標準物質を用いる定量方法、該定量方法を実行する 解析システムおよび該解析のためのプログラム
技術分野
[0001] 本発明は、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又は代 謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を、サンプルに 添加し、質量分析計で測定することにより、サンプル中の 1又は複数の生体分子を定 量する方法に関する。
[0002] さらに、本発明は生体分子の定量的解析方法に係り、より詳細には、本発明は、同 位体標識ィ匕生体分子を利用した解析方法および該解析のためのプログラムに関す る。
背景技術
[0003] ゲノムとは、その生物の全ての遺伝子と遺伝子間領域を含む、一つの細胞に含ま れる全 DNAのことであり、我々が知る生命はゲノムによって決められている。現在、既 にヒトの塩基配列が読み終わり、遺伝子の数も予測されつつある。しかし、生命現象 を解明するためには、塩基配列情報だけでは不充分であり、実際に大腸菌、酵母、 線虫、ショウジヨウバエなど全ゲノムが明らかになった力 これらモデル生物の全ての 遺伝子機能が明らかになつたわけではない。
[0004] プロテオミクスはポスト'ゲノム時代の重要な項目の一つであるが、この技術が遺伝 子の機能解析を行う上で注目を集めつつある。現在のプロテオーム技術、つまり質 量分析装置とデータベース、そしてそれらを結ぶ検索エンジンによってタンパク質同 定が飛躍的に容易になったことによって、特定のタンパク質混合物（例えば、あるタン ノ^質複合体)を網羅的に同定できるようになった (たとえば、非特許文献 1-4参照） 。し力しながら、タンパク質を同定するだけでは、あるいは構成成分を明らかにするだ けでは、機能解析としては不十分である。なぜなら、プロテオームは動的なものであり 、その時々あるいは場所によって発現状態が変化している。よって個々のタンパク質 の変動解析を行ってこそ、プロテオミタスの利点が活力される答である。そこで、 DNA チップにおける Differential Displayと同様に、プロテオームにおいてもタンパク質レ ベルでの Differential Displayを作製し、個々のタンパク質レベルの変化を捉える種 々の試みが行われて 、る。
[0005] プロテオーム解析の手段として二次元電気泳動が汎用されている力 このようなゲ ル上で染色されたタンパク質のスポットを比べる方法では、比較すべき二つの試料に 存在する個々のタンパク質の存在量を正確に比較することは極めて難しい。なぜなら
1 ;細胞からの抽出の再現性や細胞分画'粗精製など前処理操作による再現性 2；二次元電気泳動などタンパク質の分離における再現性
3 ;ゲル染色の再現性
などに課題があり、さらに
4；一つのスポット'バンドに複数のタンパク質が混在して!/、る場合は個々のタンパク 質に対する定量性は失われる。
よって現状では、ゲル染色によるパターン比較では発現量が 10-100倍以上と劇的な 変化をする場合を除き、微小な変化を捉えることは難し 、。
[0006] また、このように劇的な変化を検知したとしても、ゲル上のスポットを比較するだけで は、そのスポットが対応するタンパク質が不明のままであり、ゲルから目的のスポットを 切り出し質量分析装置によってタンパク質の同定作業を行うことになる。
[0007] 質量分析装置による分析において、イオン化率の再現性が悪いため、定量的デー タを得るためには、必ず内部標準物質による補正が必要である。また、質量分析装 置で分析するまでの前処理操作 (抽出や誘導体化、分離など）により、実験ごとに定 量値を非常に変動させる。そこで、 目的の低分子物質又はタンパク質等を安定同位 体で標識した内部標準物質を、サンプルに予め添加することで、これらの全ての補正 が可能になり、定量精度が飛躍的に向上している。薬物、脂質およびタンパク質など において、安定同位体元素で標識した内部標準物質を用いて、定量分析が行われ ている（たとえば、非特許文献 5— 10参照)。
[0008] 上記の薬物や脂質のような低分子物質およびタンパク質の質量分析装置による定 量は、あくまでも目的とする物質が既知の場合に適用できる。一方、プロテオミタスで は未知かつ多数の目的物質を測定する必要がある。このため、近年、比較すべきサ ンプルに含まれるタンパク質全てを標識することにより、質量分析装置を使った定量 的プロテオームが可能になってきている。現在報告されている手法 (たとえば、非特 許文献 11参照)を大きく分けると、以下の 3通りに分類することが出来る（図 1参照)。
[0009] In vivo標識法
安定同位体と質量分析装置を組み合わせた定量的プロテオームとして、小田らの15 N で酵母のタンパク質を標識する方法がある (たとえば、特許文献 1および非特許文献 12 - 13参照)。比較する 2種類の細胞を、それぞれ同位体標識アミノ酸を含む培地と 同位体標識アミノ酸を含まない培地で培養し、培養された細胞を混合した後、タンパ ク質の抽出および分画をして、質量分析装置で分析し、同位体標識されたタンパク 質と同位体標識されてないタンパク質とのピーク強度を比較する。この方法では、分 祈における回収率の誤差があつたとしても、細胞間の相違を定量的に知ることができ 、また、スペクトルデータによりタンパク質の同定を同時に行うことが出来る。
[0010] しかしながら、この in vivo標識法は、培養細胞であるならば原理的に全ての細胞に 応用可能であるが、実際には培養条件を変えることで細胞の成長速度が大きく変わ るなど、安定同位体を含む培地での培養は困難なことが多い。つまり、培養条件に影 響を受けないような限られた細胞でしか実施できない。さらに、動物や人などの組織 は、容易に培養することができず、この方法によって測定することはできない。
[0011] 消化前の In vitro標識法
そこで、組織中のタンパク質を網羅的に定量する方法として、以下の方法が見出され た。すなわち、比較する 2種類のサンプルに対し、それぞれ同位体標識したシスティ ン残基反応試薬と同位体標識していないシスティン残基反応試薬を加えることにより サンプノレ中に含まれるタンパク質のシスティン残基を標識し、カラムによってタンパク 質を精製し、質量分析装置で分析し、ペアのピークの強度を比較することでタンパク 質定量が可能になった (たとえば、非特許文献 14-19参照)。しかしながら、この方 法では、システィン残基を含まないタンパク質は定量できず、また、精製など前処理 段階での実験ごとに定量値が変動することの補正はできない。
[0012] 消化後，消化中の in vitro標識法 システィン残基を含まな ヽタンパク質や精製の操作性を向上した方法カ^ヽくつか報 告されて!/、る。比較する 2種類のサンプルに含まれるタンパク質を酵素消化して得ら れたペプチド断片の C末、 N末、グルタミン酸残基、ァスパラギン酸残基などを、同位 体標識した分子と同位体標識して ヽな ヽ分子でそれぞれ標識し、質量分析装置で 分析し、ペアのピークの強度を比較することでタンパク質定量が可能になった (たとえ ば、非特許文献 20— 23参照)。
[0013] し力しながら、これらの方法では、サンプルに含まれるタンパク質の消化、分画、精 製など前処理段階での実験ごとに定量値が変動することの補正はできない。
[0014] 上述したように、現在の定量的プロテオーム解析法は、 in vivo標識法と in vitro標 識法に大別できる。前者は、標識が簡単であり、高い再現性データが期待できるが、 組織、生体液、細胞器官、タンパク質複合体、安定同位体を含む培地中で生育でき ない細胞などがサンプルの場合には、それらに含まれる安定同位体を取り込まない タンパク質には適応できない。後者は、あらゆるサンプルに応用できるが、標識する までのサンプルの破砕、抽出、消化、分画、精製など前処理段階での実験ごとに定 量値が変動することの補正はできない。また、標識反応自体が簡単でない場合が多 く実験者の経験の差が出やすい。
[0015] これまでの定量的プロテオーム解析法は、内部標準物質と被検体とを直接比較し ていたため、測定のたびにサンプル調製を行う必要があった。また、 3個以上のサン プルの比較を行うには単純ではなぐそれだけ精度も低下していた。さらに、測定対 象が変わると標識すべき内部標準物質も変わるため、その都度、標識についての条 件検討を行う必要があり、また、実験間の比較もできな力つた。
[0016] さらには、これまでの定量的プロテオーム解析法は、内部標準物質と被検体とを直 接比較しており、測定対象が変わると標識すべき内部標準物質も変える必要があつ た。一方、内部標準物質の生体分子を定量することは容易ではなぐしたがって、絶 対定量をすることが非常に困難であった。
[0017] これまで報告されて!、る定量的プロテオーム解析法のうち絶対定量する方法として は、 AQUA法がある（たとえば、特許文献 2参照)。これは、合成ペプチドの一部に安 定同位体を組込み、目的のタンパク質との比を求める方法である。しかし、この方法 では、実験ごとに常に同位体標識した合成ペプチドを用意し、さらに、実験毎に定量 する必要があるため、網羅的に定量するのは困難である。また、目的タンパク質の精 製過程における回収率の影響や、一般的に 30-50%と言われているゲル内消化効率 の影響も受け、正確に定量することは困難である。
[0018] 一方で、ポストゲノム時代をむかえて、生体内の生体分子として重要であるタンパク 質を分離同定し、さらに定量することが、ますます重要になってきている。特に、病気 の診断'治療技術の研究開発には、多数のタンパク質の機能を解明することが必要 である。
[0019] 従来、細胞が発現するタンパク質のプロテオーム解析には、二次元電気泳動が用 いられていた。ここで、用語「プロテオーム解析」とは、遺伝子情報と細胞内で複雑に 相互作用している多様なタンパク質との関係を明らかにする解析のこという（たとえば 、非特許文献 24参照)。つまり、プロテオーム解析は、細胞を構成するすべてのタン パク質を網羅的に解析する手法を ヽぅ。
[0020] 前述の二次元電気泳動では、発現したタンパク質をゲル展開し、対象とするタンパ ク質に対応したスポットの切り出しにより、その種類を総合的に同定することを可能に するものである。このため、二次元電気泳動はプロテオーム解析における有用な定 性的解析手段である。
[0021] しかし、展開されるタンパク質の量が僅少であり、分析時の回収率に誤差が生じ易 いことに起因して、二次元電気泳動ではタンパク質の定量的解析には不向きである ことが指摘されている。
[0022] 他方、もう一つの重要なタンパク質の解析技術として、質量分析法が利用されてい る。本方法は質量分析装置を用いたタンパク質やペプチドの正確な質量を分析する 方法である。この質量分析装置は、一般には、タンパク質及びペプチドをイオンィ匕す る装置と、その質量に応じて分離する質量分離部を備え、該質量を分析する質量分 析計とから構成されている。そして、質量分析計とタンパク質のデータベース、及びそ れらを結ぶ検索システムによって、今日ではタンパク質の同定は飛躍的に容易にな つたといえる。そのため、特定のタンパク群 (たとえば、ある複合体を形成するタンパク 群）を網羅的に同定することが可能である。 [0023] しかし、質量分析法によってタンパク質を同定する、あるいは構成成分を明らかに するだけでは、タンパク質の機能解析としては不十分である。なぜなら、プロテオーム による機能解析では、病態との比較や、薬物あるいはリガンドによる刺激、それに標 的遺伝子のノックアウトや過剰発現などの影響による個々のタンパク質の変動解析、 つまりは、タンパク質の発現量が比較可能である定量的データが必要になる。
[0024] 力かる背景のもと、質量分析装置を用いて、同位体標識を利用した定量的解析が 試みられて!/ヽる（たとえば、非特許文献 25参照)。
非特許文献 1：「ネィチャージエネテイクス（Nature Genetics)」第 20卷、 1998年 9月、 p. 46-50
非特許文献 2 :「ジャーナル'ォブ'セル'バイオロジー Oournal of Cell Biology)」第 14 1卷、第 4号、 1 年 5月 18日、 p. 967-977
非特許文献 3 :「カレント'オピニオン 'イン 'セル'バイオロジー（Current Opinion in Cell Biology)」第 15卷、第 2号、 2003年 4月、 p. 199—205
非特許文献 4 :「カレント'オピニオン 'イン 'ケミカル'バイオロジー（Current Opinion in Chemical Biology)」第 7巻、第 1号、 2003年 2月、 p. 21—27
非特許文献 5 :「サージエリー'トウディ (Surgery Today)」第 23卷、第 3号、 1993年、 p.
228-233
非特許文献 6 :「ラビッド 'コミュニケーションズ 'イン 'マス'スぺタトロメトリー (Rapid Communications in Mass Spectrometry) 第 8巻、第 5号、 1994年、 p. 377—380 非特許文献 7 :「ジャーナル'ォブ 'クロマトグラフィ一'エー Oournal of
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非特許文献 8 :「アナリティカル 'バイオケミストリー (Analytical Biochemistry)」第 231 卷、第 1号、 1995年 10月、 p. 141-150
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非特許文献 10：「プロシーディンダス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン スィズ ·ォブ ·ザ'ユナイテッド ·ステイツ ·ォブ 'アメリカ（Proceedings of the National Academv of Sciences of the United States of America)」第 100卷、第 12号、 2003年 6月、 p. 6940-6945
非特許文献 11 :「カレント 'オピニオン'イン 'ケミカル'バイオロジー（Current Opinion in Chemical Biology)」第 7巻、第 1号、 2003年 2月、 p. 70—77
非特許文献 12：「プロシーディンダス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン スィズ ·ォブ ·ザ'ユナイテッド ·ステイツ ·ォブ 'アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)」第 96卷、第 12号、 1999年 6 月、 p. 6591-6596
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非特許文献 24 : Karn, P. Science 270, pp. 369-370, 1995
非特許文献 25：「プロテオーム解析法」羊土社 2000年 7月 10日発行 pp. 111-122 特許文献 1 : USP 6391649
特許文献 2 :WO2003 016861
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0025] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しょうとする課題 は、代謝的に標識することができないサンプル (例えば、組織、生体液、細胞、細胞 器官、タンパク質複合体など）中の 1又は複数の生体分子を精度よく定量すること、さ らには、絶対定量することにある。
[0026] また、同位体標識を利用した解析において、一つの質量分析スペクトルピークに対 して、複数の異なる生体分子力もの質量スペクトルが寄与している場合もあり、生体 分子の定量的解析を困難にしている。そこで、本発明は、質量分析スペクトルに対し て複数の異なる生体分子力 の質量分析スペクトルが寄与している場合であっても、 質量分析スペクトルの定量的解析を可能とする解析システムおよび解析方法を提供 することである。さらに、本発明では、力かる生体分子に関する定量的解析と機能情 報を付加させる、解析システムおよび解析方法を提供する。
[0027] さらにまた、前記定量的解析方法をコンピュータに実行させるプログラムを提供する ことである。
課題を解決するための手段
[0028] 本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、生体分子に対 する質量分析法において、あらかじめ同位体標識された生体分子を調製し、各サン プルに加えて質量分析装置で測定することにより、代謝的に標識することができない サンプル (例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官、タンパク質複合体など）中の 1又 は複数の生体分子を精度よく定量することを見出した。また、あらかじめ調製した同 位体標識された生体分子を定量しておくことにより、生体分子の網羅的な絶対定量 をも可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。また、生体分子の質量分 析法において、同位体標識法とともに、質量分析スペクトルに波形分離処理を施すこ とにより、より高精度な生体分子発現の定量的解析が可能であることを見出し、本発 明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第一の態様では、
[1] サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又 は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を、加える ことを特徴とする質量分析計によるサンプル中の生体分子を定量する方法、
[2]サンプル中の 1又は複数の生体分子を定量する方法であって、
同位体標識された生体分子の前駆体を加えて培養し、代謝的に同位体標識された 生体分子である内部標準物質を、又は代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞を、サンプルに添加する工程と、
当該各サンプルから生体分子を抽出し分画する工程と、
当該分画した各生体分子を質量分析装置により分析する工程と、
質量分析の情報から当該生体分子を同定する工程と、
各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を定量 する工程と、
を含む、生体分子を定量する方法、
[3] 各サンプル間の該ピーク強度比を比較し、生体分子を相対定量する、前記 [1] または [2]のいずれか一に記載の方法、
[4] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の、又は代謝的 に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体分子が既知 量である、前記 [1]な 、し [3]の 、ずれか一に記載の方法、
[5] 定量が絶対定量である、前記 [1]ないし [4]のいずれか一に記載の方法、
[6] サンプル中の 1または複数の生体分子を定量する方法であって、
(1)サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、また は、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を、添カロ する工程と、 (2)当該サンプル中の各生体分子を質量分析する工程と、
(3)質量分析の情報から当該生体分子を同定する工程と、
(4)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 定量する工程と、
を含む、サンプル中の 1または複数の生体分子を定量する方法、
[7] サンプルから生体分子を抽出し分画する工程をさらに含む、前記 [6]に記載の 方法、
[8] 同位体標識された生体分子の前駆体を加えて培養し、生体分子を代謝的に 同位体標識する工程をさらに含む、前記 [6ほたは [7]に記載の方法、
[9] 複数のサンプルについて行い、各サンプル間の各生体分子のピーク強度比を 比較する工程をさらに含む、前記 [6]ないし [8]のいずれか一に記載の方法、
[10] サンプル中の 1または複数の生体分子を絶対定量する方法であって、 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の生体分子、または、 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体分 子が、既知量である、 [6]ないし [9]のいずれか一に記載の方法、
[11] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の生体分子を、 または、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の 生体分子を、絶対定量する工程をさらに含む、前記 [6]ないし [10]のいずれか一に記 載の方法、
[12] 前記 [11]に記載の工程が、
(a)同位体非標識の合成ペプチドを、代謝的に同位体標識された生体分子である内 部標準物質、または、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を 含む細胞に添加する工程と、
(b)当該代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質または代謝的に 同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞力 生体分子を抽出し 分画する工程と、
(c)当該分画した各生体分子を質量分析する工程と、
(d)質量分析の情報から当該生体分子を同定する工程と、 (e)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 絶対定量する工程と、
を含む、前記 [11]に記載の方法、
[13] サンプルが、代謝的に標識できないサンプルである、前記 [1]ないし [12]のい ずれか一に記載の方法、
[14] サンプルが、細胞培養によって標識できないサンプルである、前記 [1]ないし [ 13]の!、ずれか一に記載の方法、
[15] 生体分子がタンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ からなる群力も選択される 、ずれかの分子である、前記 [1]な 、し [14]の 、ずれか一 に記載の方法、
[16] 生体分子がタンパク質である、前記 [1]ないし [15]のいずれか一に記載の方 法、
[17] 生体分子がタンパク質であって、当該タンパク質を抽出し分画し、タンパク質 を消化する工程をさらに含む、前記 [1]ないし [16]のいずれか一に記載の方法、
[18] サンプルが、組織、生体液、細胞、細胞器官およびタンパク質複合体力ゝらな る群から選択される 、ずれかのサンプルである、前記 [1]な 、し [17]の!、ずれか一に 記載の方法、
[19] 同位体が、 2H、 13C、 15N、 170、 180、 33Pおよび34 S並びにこれらの組み合わせか らなる群力 選択されるいずれかの同位体である、前記 [1]ないし [18]のいずれか一 に記載の方法、
[20] 同位体が、 13Cである、前記 [1]ないし [19]のいずれか一に記載の方法、
[21] 前記 [1]ないし [20]のいずれか一に記載の方法に用いられる代謝的に同位 体標識された生体分子である内部標準物質、
[22] 前記 [1]ないし [20]のいずれか一に記載の方法に用いられる代謝的に同位 体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞、
[23] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含有する、前記 [1]な!、し [20]の!、ずれか一に記載の方法のための試薬、
[24] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を含 有する、前記 [1]ないし [20]のいずれか一に記載の方法のための試薬、
[25] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質の、 [1]ないし [20] のいずれか一に記載の方法のための使用、
[26] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞の、前 記 [1]な!、し [20]の!、ずれか一に記載の方法のための使用、
[27] 質量分析装置において得られた、サンプル中の 1または複数の生体分子の 質量分析に関するデータを受けるコンピュータに、前記サンプル中の 1又は複数の 生体分子の定量をさせるためのプログラムであって、
(1)サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又は 、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を添加し、 当該各サンプル中の各生体分子を質量分析装置により分析し、質量分析装置から 分析結果を受ける工程と、
(2)質量分析の分析結果から当該生体分子を同定する工程と、
(3)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 定量する工程と、を実行させるプログラム、
[28] 質量分析装置において得られた、サンプル中の 1または複数の生体分子の 質量分析に関するデータを受けるコンピュータに、前記サンプル中の 1又は複数の 生体分子の定量をさせるためのプログラムであって、
(1)サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又は 、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を添加し、 当該各サンプルから生体分子を抽出し分画し、当該分画した各生体分子を質量分 析装置により分析し、質量分析装置から分析結果を受ける工程と、
(2)質量分析の分析結果から当該生体分子を同定する工程と、
(3)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 定量する工程と、を実行させるプログラム、
[29] 複数のサンプルについて行い、各サンプル間の各生体分子のピーク強度比 を比較する工程をさらに実行させる、前記 [27]または [28]に記載のプログラム、
[30] サンプル中の 1又は複数の生体分子の絶対定量をするためのプログラムであ つて、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の、又は代謝的 に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体分子が既知 量である、前記 [27]ないし [29]のいずれか一に記載のプログラム等を提供する。
[0030] また、本発明の第二の態様では、 [31] 第一の生体分子と、前記第一の生体分子 に対して同位体標識された第二の生体分子との質量分析に関するデータの解析シ ステムであって、前記第一および第二の生体分子の質量分析を実行する質量分析 装置と、前記質量分析装置から、前記生体分子の質量分析に関するデータを受ける データ入出部を有する制御部と、を備え、前記制御部は、生体分子の構成成分の配 列が決定された前記生体分子に対する第一の m/zの値と、生体分子の構成成分の 配列が決定された前記第二の生体分子に対する第二の m/zの値とを決定するととも に、前記第一および第二の m/zの値から、前記第一の生体分子および前記第二の 生体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよび時間に対する質量分析ス ベクトル (マスク口マトグラム）を含むデータを、前記質量分析装置にて得られた質量 分析に関するデータから抽出する処理部と、前記処理部から前記第一および第二の m/zの値における時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を受け、前 記時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を波形分離処理する波形処 理部と、を備える解析システムを提供する。カゝかる構成によれば、固有の生体分子に 由来する質量分析スペクトルを入手でき、より定量的な解析を可能とする。
[0031] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]に記載の解析システムにおいて、 [32] 前 記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が決定された 前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体分子の同位体非標識 の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第二の生 体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列が決定さ れた前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子の同位体標 識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第 一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行される。力かる構成によれ ば、同位体非標識と同位体標識の構成成分を含む生体分子の発現変化を、一方の 生体分子に着目しながら追跡可能となる。 [0032] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]または [32]に解析システムにおいて、 [33] 前記制御部は、前記波形分離処理部からの波形分離処理により得られた固有の生 体分子に由来する波形の面積を算出し、前記第一の m/zの値における固有の生体 分子に由来する第一の波形面積の値と、前記第二の m/zの値における固有の生体 分子に由来する第二の波形面積の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記第二の 波形面積)の比を算出する演算部を、さらに備える。力かる構成によれば、一方のタ ンパク質との対比により、タンパク質の発現の定量的解析が可能となる。
[0033] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [33]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [34] 前記制御部は、波形分離後、前記生体分子の構成成分の配 列毎に分類し、前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し、そ の照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループィ匕する情報付加部を、さ らに備える。力かる構成によれば、波形分離された生体分子の構成成分の配列と機 能情報とを関連付けることが可能となる。
[0034] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [34]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにいて、 [35] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列から生体分子を特 定し、生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、 生体分子の代表定量値とする演算部を、さらに備える。力かる構成によれば、生体分 子の構成成分の代表的な定量値を求めることができ、後述するデータベースとの照 合により機能情報との関連付けをすることができる。
[0035] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [35]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [36] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列を、生体分子の 機能情報を有するデータベースに照合し、当該生体分子の機能情報を取得する情 報付加部を、さら〖こ備える。カゝかる構成によれば、構成成分の代表的定量値と機能 情報との関連性に関する知見を得ることができる。
[0036] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [36]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [37] 前記第一および第二の生体分子の質量分析を実行する際、 内部標準物質の存在下で質量分析を実行し、前記波形処理部は、前記内部標準物 質の m/zの値における時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を受け て、前記内部標準物質に固有の波形を得るために、さらに波形分離処理を行い、前 記演算部は、前記波形処理部からの内部標準物質に固有の波形面積を算出すると ともに、（前記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、およ び/または、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比を 、さらに算出する。力かる構成によれば、内部標準物質中の生体分子が既知量であ る場合には、絶対定量が可能となる。
[0037] また、本発明の第三の態様では、 [38] 第一および第二の生体分子に対して、同 位体標識された生体分子である内部標準物質との質量分析に関するデータの解析 システムであって、前記第一および第二の生体分子並びに同位体標識された生体 分子の質量分析を実行する質量分析装置と、前記質量分析装置から、前記生体分 子の質量分析に関するデータを受けるデータ入出部を有する制御部と、を備え、前 記制御部は、生体分子の構成成分の配列が決定された前記生体分子に対する第一 および第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記同位体標 識された生体分子に対する内部標準物質の m/zの値とを決定するとともに、前記第 一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記第一および第二の生体分 子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルお よび時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を含むデータを、前記質 量分析装置にて得られた質量分析に関するデータから抽出する処理部と、前記処理 部から前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値における時間に対する 質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を受け、前記時間に対する質量分析スぺタト ル (マスク口マトグラム）を波形分離処理する波形処理部と、を備える解析システムを 提供する。力かる構成によれば、生体分子が同位体非標識であっても、同位体標識 された内部標準物質との比較において、その生体分子に固有の生体分子に由来す る質量分析スペクトルを入手でき、より定量的な解析を可能とする。
[0038] 本発明の好ましい態様では、前記 [38]に記載の解析システムにおいて、 [39] 前 記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子の構成成 分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/zの 値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個数と前記 第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質の生体 分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列が 決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、前記内 部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標準物質 の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の第一およ び第二の m/zの値を決定することにより実行される。
[0039] 本発明の好ましい態様では、前記 [38]または [39]に記載の解析システムにおいて 、 [40] 前記制御部は、前記波形分離処理部からの波形分離処理により得られた固 有の生体分子に由来する波形の面積を算出し、前記第一および第二の m/zの値に おける固有の生体分子に由来する第一および第二の波形面積の値と、前記内部標 準物質の m/zの値における固有の生体分子に由来する内部標準物質の波形面積 の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比 、および Zまたは、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積） の比を算出する演算部を、さらに備える。
[0040] 本発明の好ましい態様では、前記 [38]ないし [40]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [41] 前記制御部は、波形分離後、前記生体分子の構成成分の配 列毎に分類し、前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し、そ の照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループィ匕する情報付加部を、さ らに備える。
[0041] 本発明の好ましい態様では、前記 [38]ないし [41]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [42] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列から生体分子を 特定し、生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて 、生体分子の代表定量値とする演算部を、さらに備える。
[0042] 本発明の好ましい態様では、前記 [38]ないし [42]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [43] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列を、生体分子の 機能情報を有するデータベースに照合し、当該生体分子の機能情報を取得する情 報付加部を、さらに備える。
[0043] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [43]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [44] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 、 "C、 15N、 170、 18 0、33Pおよび34 S並びにこれらの組み合わせ力 なる群力 選択されるいずれかの同 位体である。
[0044] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [44]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [45] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる
[0045] 本発明の好ましい態様では、前記 [45]に記載の解析システムにおいて、 [46] 前 記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分子に関する データベースとの照合により、前記構成成分の配列の決定が行われる。
[0046] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [46]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [47] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分 子である。
[0047] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [47]のうち何れか一に記載の解析シ ステムであって、 [48] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びに これらの組み合わせ力 なる群力 選択されるいずれかの分子である。
[0048] また、本発明の第四の態様では、 [49] 第一の生体分子と、前記第一の生体分子 に対して同位体標識された第二の生体分子の質量分析に関するデータの解析方法 であって、質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータ のうち、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第一の生体分子の第一の m/ zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値を決定する工程と、前記第一および第二の m/zの値から、前記第一の生体 分子および前記第二の生体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよび時 間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を含むデータを、前記質量分析 に関するデータ力 抽出する工程と、前記第一及び第二の生体分子の時間に対す る質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を波形分離処理する工程と、を含む、解析 方法、
[50] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が 決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体成分の同 位体非標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第二の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配 列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子 の同位体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ いて、前記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行される、前記 [49]に記載の解析方法、
[51] 前記波形分離処理工程により得られた固有の生体分子に由来する波形の面 積を算出する工程と、前記第一の m/zの値における固有の生体分子に由来する第 一の波形面積の値と、第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第二の 波形面積の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記第二の波形面積)の比を算出 する工程と、をさらに備える、前記 [49]または [50]に記載の解析方法、
[52] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、前 記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、前記照合 結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、をさらに含む、前 記 [49]な 、し [51]のうち何れか一に記載の解析方法、
[53] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を構 成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定量 値とする工程と、をさらに含む、前記 [49]ないし [52]のいずれか一に記載の解析方 法、
[54] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベース に照合して、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、をさらに含む、前記 [49] な!、し [53]の 、ずれか一に記載の解析方法、
[55] 前記第一および第二の生体分子とともに、内部標準物質の m/zの値の決定 する工程と、内部標準物質の時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム） を含むデータを抽出する工程と、前記内部標準物質の時間に対する質量分析スぺク トル (マスク口マトグラム）の波形分離処理する工程と、前記内部標準物質に固有の波 形の面積を算出する工程とを実行し、（前記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質 に固有の波形面積)の比、および/または、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準 物質に固有の波形面積)の比を、算出する工程を、さらに含む、前記 [49]ないし [54] のうち何れか一に記載の解析方法、
[56] 第一および第二の生体分子に対して、同位体標識された生体分子である内 部標準物質との質量分析に関するデータの解析方法であって、質量分析装置にて 測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのうち、生体分子の構成成分 の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/zの値 と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部 標準物質の m/zの値を決定する工程と、前記第一および第二並びに内部標準物質 の m/zの値から、前記第一および第二の生体分子並びに前記内部標準物質の生体 分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよび時間に対する質量分析スぺタト ル (マスク口マトグラム）を含むデータを、前記質量分析に関するデータから抽出する 工程と、前記第一および第二並びに内部標準物質の生体分子の時間に対する質量 分析スペクトル (マスク口マトグラム)を波形分離処理する工程と、を含む、解析方法、
[57] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子 の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二 の m/zの値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個 数と前記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の 配列が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、 前記内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標 準物質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の 第一および第二の m/zの値を決定することにより実行される、前記 [56]に記載の解 析方法、
[58] 前記波形分離処理工程により得られた固有の生体分子に由来する波形の面 積を算出する工程と、前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に 由来する第一および第二の波形面積の値と、前記内部標準物質の m/zの値におけ る固有の生体分子に由来する内部標準物質の波形面積の値とから、（前記第一の波 形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、および Zまたは、（前記第 二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比を算出する工程と、を さらに備える、前記 [56]または [57]に記載の解析方法、
[59] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、前 記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、前記照合 結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、をさらに含む、前 記 [56]ないし [58]のうち何れか一に記載の解析方法、
[60] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を構 成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定量 値とする工程と、をさらに含む、前記 [56]ないし [59]のいずれか一に記載の解析方 法、
[61] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベース に照合して、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、をさらに含む、前記 [56] な!、し [60]の 、ずれか一に記載の解析方法、
[62] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 170、 180、 33Pおよび34 S 並びにこれらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、前 記 [49]な 、し [61]のうち何れか一に記載の解析方法、
[63] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、前記 [49]ない し [62]のうち何れか一に記載の解析方法、
[64] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分 子に関するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、前記 [6 3]に記載の解析方法、
[65] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、前記 [ 49]ないし [64]のうち何れか一に記載の解析方法、
[66] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合 わせ力もなる群力も選択されるいずれかの分子である、前記 [49]ないし [65]のうち何 れか一に記載の解析方法等を提供する。
さらに、本発明の第五の態様では、 [67] 質量分析装置において得られた、第一の 生体分子と、前記第一の生体分子に対して同位体標識された第二の生体分子の質 量分析に関するデータを受けるコンピュータに、前記データの解析をさせるためのプ ログラムであって、前記質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関 するデータのうち、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第一の生体分子 の第一の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分 子の第二の m/zの値を決定する工程と、前記第一および第二の m/zの値から、前記 第一の生体分子および前記第二の生体分子の m/zの値に対する質量分析スぺタト ルおよび時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を含むデータを、前 記質量分析に関するデータから抽出する工程と、前記第一および第二の生体分子 の時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を波形分離処理する工程と 、を実行させるプログラム、
[68] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が 決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体分子の同 位体非標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第二の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配 列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子 の同位体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ いて、前記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行させる、前記 [67]に記載のプログラム、
[69] 前記波形分離処理により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積を 算出する工程と、前記第一の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一の 波形面積の値と、第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第二の波形 面積の値とから (前記第一の波形面積) I (前記第二の波形面積)の比を算出するェ 程と、をさらに実行させる、前記 [67]または [68]に記載のプログラム、
[70] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、前 記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、前記照合 結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、をさらに実行させ る、前記 [67]ないし 69のうち何れか一に記載のプログラム、
[71] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を構 成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定量 値とする工程と、をさらに実行させる、前記 [67]ないし [70]のいずれか一に記載のプ ログラム、
[72] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベース に照合して、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、をさらに含む、前記 [67] な！、し [71]の!、ずれか一に記載のプログラム、
[73] 前記質量分析装置において、前記第一および第二の生体分子とともに、内 部標準物質の質量分析に関するデータを得て、前記質量分析に関するデータから、 前記内部標準物質の時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を抽出 するとともに、前記内部標準物質の時間に対する質量分析スペクトル (マスクロマトグ ラム)を波形分離処理し、前記波形分離処理により得られた内部標準物質に固有の 波形面積を算出し、（前記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面 積)の比、および/または、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波 形面積）に比を算出する工程を、さらに実行させる、前記 [67]ないし [72]のうち何れ か一に記載のプログラム、
[74] 第一および第二の生体分子に対して、同位体標識された生体分子である内 部標準物質との質量分析に関するデータを受けるコンピュータに、前記データの解 析をさせるためのプログラムであって、質量分析装置にて測定された前記生体分子 の質量分析に関するデータのうち、生体分子の構成成分の配列が決定された前記 第一および第二の生体分子の第一および第二の m/zの値と、生体分子の構成成分 の配列が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値を 決定する工程と、前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記 第一および第二の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対 する質量分析スペクトルおよび時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム) を含むデータを、前記質量分析に関するデータから抽出する工程と、前記第一およ び第二並びに内部標準物質の生体分子の時間に対する質量分析スペクトル (マスク 口マトグラム)を波形分離処理する工程と、を実行するプログラム、
[75] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子 の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二 の m/zの値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個 数と前記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の 配列が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、 前記内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標 準物質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の 第一および第二の m/zの値を決定することにより実行される、前記 [74]に記載のプロ グラム。
[76] 前記波形分離処理工程により得られた固有の生体分子に由来する波形の面 積を算出する工程と、前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に 由来する第一および第二の波形面積の値と、前記内部標準物質の m/zの値におけ る固有の生体分子に由来する内部標準物質の波形面積の値とから、（前記第一の波 形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、および Zまたは、（前記第 二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比を算出する工程と、を さらに実行させる、前記 [74]または [75]に記載のプログラム、
[77] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、前 記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、前記照合 結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、をさらに実行させ る、前記 [74]ないし [76]のうち何れか一に記載のプログラム、
[78] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を構 成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定量 値とする工程と、をさらに実行させる、前記 [74]ないし [77]のいずれか一に記載のプ ログラム、
[79] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベース に照合して、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、をさらに含む、前記 [74] な！、し [78]の!、ずれか一に記載のプログラム、
[80] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 170、 180、 33Pよび34 S並 びにこれらの組み合わせ力もなる群力 選択される 、ずれかの同位体である、前記 [
69]ないし [90]のうち何れか一に記載のプログラム、
[81] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、前記 [69]ない し [80]のうち何れか一に記載のプログラム、
[82] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分 子に関するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、前記 [8 1]に記載のプログラム、
[83] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、前記 [ 67]ないし [82]のうち何れか一に記載のプログラム、
[84] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合 わせ力もなる群力も選択されるいずれかの分子である、前記 [67]ないし [83]のうち何 れかーに記載のプログラム等を提供する。
さらに、本発明の第六の態様では、 [85] 第一および第二の生体分子に対して、同 位体標識された生体分子である内部標準物質の質量分析に関するデータの解析方 法であって、質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデー タのうち、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分 子の第一および第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記 内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する工程と、得られた 配列データをもとに、生体分子の機能情報を有するデータベースに照合して、当該 生体分子の機能情報を取得する工程とを含む解析方法、
[86] 前記決定工程の後、前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値 から、前記第一および第二の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/z の値に対する質量分析スペクトルおよび時間に対する質量分析スペクトル (マスク口 マトグラム)を、前記質量分析に関するデータから抽出する工程と、さらに含む前記 [8 5]に記載の解析方法と、
[87] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子 の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二 の m/zの値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個 数と前記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の 配列が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、 前記内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標 準物質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の 第一および第二の m/zの値を決定することにより実行される、前記 [85]または [86]に 記載の解析方法、
[88] 前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一 および第二のピークの値と、前記内部標準物質の m/zの値における固有の生体分 子に由来する内部標準物質のピークの値とから、（前記第一のピーク)/ (前記内部標 準物質に固有のピーク)の比、および/または、（前記第二のピーク)/ (前記内部標準 物質に固有のピーク）の比を算出する工程とをさらに備える、前記 [85]なしひ [87]の うち何れか一に記載の解析方法、
[89] 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、 をさらに含む、前記 [85]ないし [88]のうち何れか一に記載の解析方法、
[90] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を構 成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定量 値とする工程と、をさらに含む、前記 [85]ないし [89]のいずれか一に記載の解析方 法、
[91] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 170、 180、 33Pおよび34 S 並びにこれらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、前 記 [85]な 、し [90]の 、ずれか一に記載の解析方法、
[92] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、前記 [85]ない し [91]のうち何れか一に記載の解析方法、
[93] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分 子に関するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、前記 [9 2]に記載の解析方法、
[94] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、前記 [ 85]ないし [93]のうち何れか一に記載の解析方法、
[95] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖もしくは核酸またはこれらの組み合 わせである、前記 [85]ないし [94]のうち何れか一に記載の解析方法、および、
[96] 質量分析装置において得られた、第一および第二の生体分子と、当該第一 および第二の生体分子に対して同位体標識された生体分子である内部標準物質と の質量分析に関するデータを受けるコンピュータに、前記データの解析をするための プログラムであって、質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関す るデータのうち、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生 体分子の第一および第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された 前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する工程と、得ら れた配列データをもとに、生体分子の機能情報を有するデータベースに照合して、 当該生体分子の機能情報を取得する工程と、を実行させるプログラム、
[97] 前記決定工程の後、前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの 値から、前記第一および第二の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m /zの値に対する質量分析スペクトルおよび時間に対する質量分析スペクトル (マスク 口マトグラム)を、前記質量分析に関するデータ力も抽出する工程と、をさらに実行さ せる前記 [96]に記載のプログラム、
[98] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子 の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二 の m/zの値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個 数と前記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の 配列が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、 前記内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標 準物質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の 第一および第二の m/zの値を決定することにより実行される、前記 [96]または [97]に 記載のプログラム、
[99] 前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一 および第二のピークの値と、前記内部標準物質の m/zの値における固有の生体分 子に由来する内部標準物質のピークの値とから、（前記第一のピーク) / (前記内部標 準物質に固有のピーク)の比、および Zまたは、（前記第二のピーク)/ (前記内部標準 物質に固有のピーク)の比を算出する工程と、をさらに実行させる、前記 [96]ないし [ 98]のうち何れか一に記載のプログラム、
[100] 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループィヒする工程と をさらに実行させる、前記 [96]ないし [99]のうち何れか一に記載のプログラム、
[101] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を 構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定 量値とする工程と、をさらに実行させる、前記 [96]ないし [100]の何れか一に記載の プログラム、
[102] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 170、 180、 33Pおよび 34S並びにこれらの組み合わせ力 なる群力 選択される 、ずれかの同位体である、 前記 [96]ないし [101]のうち何れか一に記載のプログラム、
[103] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、前記 [96]な いし [102]のうち何れか一に記載のプログラム、
[104] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られた生体分子に関 するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、前記 [103]に 記載のプログラム、
[105] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、前記 [96]ないし [104]のうち何れか一に記載のプログラム、
[106] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み 合わせであるからなる群力も選択される 、ずれかの分子である、前記 [96]な 、し [10 5]のうち何れか一に記載のプログラム等を提供する。
さらに、本発明の第七の態様では、 [107] 質量分析装置において得られた、サン プル中の 1または複数の生体分子の質量分析に関するデータを受けるコンピュータ に、前記サンプル中の 1または複数の生体分子の定量をさせるためのプログラムであ つて、質量分析装置にて測定された生体分子の質量分析に関するデータのうち、生 体分子の構成成分の配列が決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの値と、 生体分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値 を決定する工程と、前記第一および第二の m/zの値から、前記第一の生体分子およ び前記第二の生体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよび時間に対す る質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を含むデータを、前記質量分析に関する データから抽出する工程と、前記第一および第二の生体分子の時間に対する質量 分析スペクトル (マスク口マトグラム）を波形分離処理する工程と、を実行させるプログ ラム、
[108] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が 決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体分子の同 位体非標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第二の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配 列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子 の同位体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ いて、前記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行させる、前記 [107]に記載のプログラム、
[109] 前記波形分離処理により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積 を算出する工程と、前記第一の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一 の波形面積の値と、第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第二の波 形面積の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記第二の波形面積)の比を算出す る工程と、をさらに実行させる、前記 [107]または [108]に記載のプログラム、
[110] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、 前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、前記照 合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、をさらに実行さ せる、前記 [107]ないし [109]のうち何れか一に記載のプログラム、
[111] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を 構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定 量値とする工程と、をさらに実行させる前記 [107]ないし [110]の何れか一に記載の プログラム、
[112] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベース に照合して、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、をさらに実行させる、前記 [107]な!、し [111]の何れか一に記載のプログラム、
[113] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 170、 180、 33Pよび34 S 並びにこれらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、前 記 [107]ないし [112]のうち何れか一に記載のプログラム、
[114] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、前記 [107]な いし [113]のうち何れか一に記載のプログラム、
[115] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体 分子に関するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、前記 [
112]に記載のプログラム、
[116] 前記生体分子は、経時的にサンプルから分離された生体分子である、前記 [107]ないし [115]のうち何れか一に記載のプログラム、
[117] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み 合わせ力もなる群力も選択される 、ずれかの分子である、前記 [107]な 、し [116]のう ち何れか一に記載のプログラム等を提供する。
発明の効果
[0052] 本発明により、代謝的に標識することができないサンプル (例えば、組織、生体液、 細胞、細胞器官、タンパク質複合体など）中の 1若しくは複数の生体分子を精度よく 定量することが可能となった。
[0053] すなわち、従来の in vivo標識法では、培養条件に影響を受けないような限られた 細胞でしか実施できなかったが、本発明では、代謝的に同位体標識された生体分子 である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質 を含む細胞をサンプルに加えるため、培養できる細胞に限られることなぐ代謝的に 標識することができないサンプル (例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官、タンパク 質複合体など）中の 1若しくは複数の生体分子を定量することが可能となった。 [0054] また、従来の in vitro標識法では、サンプルの破砕、抽出、消ィ匕、分画、精製など 前処理段階での実験ごとに定量値が変動することの補正はできな力つたが、本発明 では、サンプルの破砕、抽出、消化、分画、精製などを行う前に代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子で ある内部標準物質を含む細胞を加えるため、サンプル中の 1若しくは複数の生体分 子を精度よく定量することが可能となった。
[0055] 本発明により、 3個以上のサンプル間の比較が容易になった。すなわち、これまで の定量的プロテオーム解析法は、内部標準物質と被検体とを直接比較して 、たため 、測定のたびにサンプル調製を行う必要があった。さらに、測定対象が変わると標識 すべき内部標準物質も変わるため、その都度、標識についての条件検討を行う必要 があり、また、実験間の比較もできな力つたが、本発明では、代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞を保存し、適宜、用いることにより、実験間のデータ比較、 例えばある実験データに対し、一定期間経過後（例えば、 1ヶ月後、 1年後等）に比較 データを得て解析することが可能となる。さらには、使用した代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞を譲渡又は貸し渡しすることにより、今まで不可能であった 研究者間のデータ比較が可能となる。
[0056] 本発明により、あらかじめ代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の 生体分子の濃度を算出しておくことにより、生体分子の絶対定量が可能となった。代 謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質を含む細胞を、譲渡又は貸し渡しすることにより、 研究者間のデータ共有ィ匕が可能となる。また、 1度代謝的に同位体標識された生体 分子である内部標準物質もしくは代謝的に同位体標識された生体分子である内部 標準物質を含む細胞中の生体分子の絶対量を求めておけば、実験ごとに定量する 必要がなぐその後各種実験に応用できる。
[0057] さらにまた、本発明による解析装置および解析方法によれば、固有の生体分子に 由来する質量分析スペクトルを得ることができ、生体内の細胞で時々刻々変化する 生体分子の発現量を定量的に解析することが可能となる。また、本発明によるプログ ラムにより、前記解析方法を、コンピュータに実現させることができる。くわえて、かか る定量的解析結果を、 NCBInr等のデータベースと照合することにより、定量的解析 結果に機能情報を付加させることもできる。
[0058] 従来の方法 (AQUA法)では、サンプルに対して、合成ペプチドを添加するため、分 画、抽出、精製、消化 (特にゲル内消ィ匕）の過程におけるタンパク質の回収率の低さ により、精度のよい定量値が得られな力つた。一方、本発明の方法では、サンプルに 対して、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質または代謝的に 同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を添加するため、分画、 抽出、精製、消化 (特にゲル内消化)の過程におけるタンパク質の回収率の影響を受 けず、精度よく再現性の高い定量値を得ることが可能となった。
[0059] また、従来の方法では、サンプルに対して、合成ペプチドを添加するため、定量で きるペプチドは、合成ペプチドと同一の配列を有するペプチドのみである。そのため 、当該ペプチドの測定結果の誤差により、タンパク質の定量値が大きく影響を受ける こととなる。一方、本発明の方法では、代謝的に同位体標識された生体分子である内 部標準物質または代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む 細胞中の生体分子を定量しておき、サンプルに対して、当該代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質または代謝的に同位体標識された生体分子であ る内部標準物質を含む細胞を添加するため、定量できるペプチドは、合成ペプチドと 同一の配列を有するペプチドのみならず、当該ペプチドが構成して 、たタンパク質 由来のその他のペプチドについても定量することができる。そのため、一つのタンパ ク質に対し、複数のペプチドによって定量するため、個々のペプチドの測定結果の 誤差により、タンパク質の定量値が大きく影響を受けることがなぐ精度よく再現性の 高い定量値を得ることが可能となった。
[0060] さら〖こは、ペプチド合成機は、 10倍過剰量の試薬を用い、し力も合成スケールがマ イクログラム力もミリグラム単位となる。そのため、同位体標識されたペプチドの合成は 、非常に高価となり、従来の方法で網羅的な定量することはコストの面で難しい。一 方、本発明の方法では、生体分子の同位体標識は、細胞培養によって行うので、ごく 微量でも効率がよく生成することができる。また、代謝的に同位体標識された生体分 子である内部標準物質または代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準 物質を含む細胞中の生体分子を定量するための合成ペプチドは、同位体を必要とし な 、通常のペプチド合成で対応できるので、網羅的な定量方法として適して 、る。 発明を実施するための最良の形態
[0061] 以下に本発明の実施の形態について、図面を参照しつつ詳細に説明する。以下 の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ 限定する趣旨ではない。本発明はその要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実 施することができる。なお、本明細書において引用した文献、公開公報、特許公報そ の他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
[0062] 本発明において用いる用語「サンプル」とは、生体分子を含む測定対象物を示し、 好ましくは、組織、生体液、細胞、細胞器官又はタンパク質複合体を指す。組織とし ては、例えば、脳、脳の各部位 (例えば、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、 視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、脾臓、腎臓、肝臓、生殖腺、 甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、十二指腸、小腸、大腸、血管、心臓、 胸腺、脾臓、顎下腺、耳下腺、舌下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、 骨、関節、骨格筋などがあげられる。生体液としては、例えば、血液 (血漿、血清を含 む）、尿、糞、唾液、涙液、浸潤液 (腹水、組織液を含む)などがあげられる。細胞とし ては、例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、脾臓 j8細胞、骨髄細胞、メ サンギゥム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平 滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞 (例えば、マクロフ ァージ、 T細胞、 B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好酸球、好塩基 球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞 、間質細胞もしくはこれらの前駆細胞、幹細胞、癌細胞などがあげられる。細胞器官 としては、例えば、核、細胞小器官 (核小体、核膜、細胞膜、ミトコンドリア、リソソーム 、リボソーム、ペルォキシノーム、小胞体 (粗面小胞体、滑面小胞体、筋小胞体など） 、ゴルジ体、微小管、中心体、ァクチンフィラメントなど）、サイトゾル、シナプス、基底 膜、細胞間接着装置などがあげられる。タンパク質複合体とは、二以上のタンパク質 が物理的に結合している状態のものをいう。ここにあげたものは具体例であって、これ らに限定されるものではない。
[0063] 本発明において用いる用語「生体分子」とは、タンパク質、脂質、糖鎖又は核酸若 しくはこれらの組み合わせを指し、好ましくはタンパク質である。また、生体分子には、 生理的な修飾を受けているもの（例えば、リン酸ィ匕タンパク質等)も含まれることは言う までもない。
[0064] 本発明において用いる用語「タンパク質」とは、 2以上のアミノ酸がペプチド結合に よって結合したペプチドを含む。
[0065] 本発明において用いる用語「代謝的に同位体標識された生体分子」とは、同位体 標識された当該生体分子の前駆体を加えることにより、代謝的に標識された生体分 子を指す。上記「代謝的に」とは、酵素反応などを介した生理的条件を示し、好ましく は培養細胞における代謝反応である。
[0066] 本発明において用いる用語「前駆体」とは、生体分子の構成成分になりうる分子を 指す。前駆体は、生体分子がタンパク質の場合には、好ましくはアミノ酸、より好ましく は必須アミノ酸、例えば、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチォニン、リジン、フ ェニルァラニン、パリン、スレオニン、特に好ましくはロイシンであり、生体分子が脂質 の場合には、例えばスフインゴ脂質であればセリンが好ましぐ糖の場合には、ダルコ ースが好ましぐ核酸の場合には、ァスパラギン酸、グルタミン、グリシン力もプリンヌク レオチドが生合成されるためこれらが好ましいが、これらに限定されるものではない。 つまり、前駆体は、生体分子に取り込まれるものであれば、その種類は限定されない
[0067] 本発明において用いる用語「内部標準物質」とは、質量分析装置にて測定物質を 定量するときに、主として実験ごとに定量値が変動することを補正するため、サンプル 中に一定量をカ卩えられる物質を 、う。
[0068] 本発明において用いる用語「代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準 物質」とは、代謝的に同位体標識された生体分子を 1又は複数含んだ内部標準物質 をいう。 [0069] 本発明において用いる用語「代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準 物質を含む細胞」とは、代謝的に同位体標識された生体分子を 1又は複数含んだ内 部標準物質を含む細胞を 、う。
[0070] 本発明において用いる用語「定量」とは、絶対定量及び相対定量を広く含むもので ある。本発明にお 、て用いる用語「絶対定量」とは測定結果を量又は濃度として得る ことを目的とする定量方法であり、「相対定量」とは絶対定量以外の定量方法を指す
[0071] 本発明において用いる用語「代謝的に標識できないサンプル」とは、代謝的に標識 できるサンプル以外のサンプルを指す。代謝的に標識できるサンプルとは、培養する ことによる同位体標識された当該生体分子の前駆体の影響を受けることなく代謝的 に標識できるサンプルをいう。「代謝的に標識できないサンプル」には、たとえば、培 養することによる同位体標識された当該生体分子の前駆体の影響を受けつつ代謝 的に標識できるサンプル及び生体への投与、組織培養、その他の方法により標識で きるサンプルが含まれるものとする。
[0072] 本発明にお 、て用いる用語「細胞培養によって標識できな 、サンプル」とは、細胞 を培養することができないサンプルを指す。つまり、細胞培養をできず、生体への投 与、組織培養、その他の細胞培養以外の方法により標識できるサンプルは、「細胞培 養によって標識できないサンプル」に含まれるものとする。例えば、組織、生体液、細 胞器官又はタンパク質複合体があげられる。
[0073] (本発明の第一の実施態様）
本発明は、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質、代謝的に 同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞、および前記内部標準 物質を含有する試薬と前記内部標準物質を含む細胞を含有する試薬等を提供する
[0074] 以下では、特に、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質および 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞の作製方法を 記載する。
[0075] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞は、測定対 象となるサンプルと同じ種の、好ましくは同じ組織由来の、特に好ましくは同位体を含 む培地中で生育が容易な細胞であるが、これに限定されるものではない。選択され た細胞を、同位体標識された当該生体分子の前駆体としての構成成分を含む培地 で培養することによって、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質 を含む細胞を作製することができる。培養条件はどのようなものであってもよぐ液体 培地あるいは固体培地に該生細胞を培養するのに好適な条件を選択すればょ ヽ。 例えば、動物細胞を選択した場合には、 DMEM、 MEM, RPMI1640、 IMDM等の培地 を用い、必要に応じゥシ胎児血清 (FCS)等の血清、アミノ酸、グルコース、ペニシリン 又はストレプトマイシンなどを添カ卩することができ、 pH約 6— 8、 30— 40°Cにおいて 15 一 200時間前後の培養を行うことができる。その他必要に応じ途中で培地の交換を行 つたり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。
[0076] 同位体は、放射性同位体を適用することもできるが、安定同位体を用いることが好 ましい。安定同位体には、好ましくは2 H、 13C、 15N、 170、 180、 33P又は34 S若しくはこれら の組み合わせ、特に好ましくは13 Cを用いる力 これに限定されるものではない。つま り、本発明の同位体は、細胞に取り込まれ、生体分子を標識しうるものであれば、そ の種類は限定されない。具体例としては、同位体標識された生体分子の前駆体とし て、 13 C標識（13C X 6個）ロイシン（Cambridge Isotope Labs (CIL)社製、 L- Leucine U-13C6, CLM-2262)が挙げられる。
[0077] 上述のようにして得られた代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質を含む細胞は、そのまま用いることができるが、破砕しておくことも可能である。破 砕する方法は、ダウンス型テフロン Κ·ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング'プレンダ 一、ポッター型ガラス'ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液 (例えば、 PIERCE社の M- PER: cat no. 78501, T- PER: cat no. 78510など）を用いる方法 又は凍結融解法があげられ、好ましくは細胞溶解液を用いる方法である。必要に応 じて、タンパク質を定量しておくことができる。このようにして、代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質を作製することができる。これらの代謝的に同位 体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分 子である内部標準物質を含む細胞は、適当な条件、好ましくは 20°C以下、特に好 ましくは- 80°C以下で保存することができる。
[0078] 本発明は、サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質 又は当該生体分子である内部標準物質を含む細胞を加えることを特徴とする質量分 析計によるサンプル中の生体分子の定量方法を提供する。
[0079] この定量方法は、サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標 準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を 加える工程と、各サンプルから生体分子を抽出、分画等する工程と、質量分析装置 で測定する工程と、質量分析装置で得られた結果力 各生体分子の標識ピークと非 標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を定量する工程とからなる。
[0080] また、本発明に係るプログラムは、後述するように、本発明による定量または解析方 法の各工程をコンピュータ上で実行させる。本発明に係るプログラムは、 CD— ROM 、磁気ディスク、半導体メモリなどの各種記録媒体を通じてコンピュータにインスト一 ルまたはダウンロードすることが可能である。
[0081] 以下に、詳細について記載する。
<質量分析による測定サンプルの調製方法 >
各サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝 的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞、好ましくは一定量 の代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体 標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を加える。
[0082] 続いて、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に 同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を加えたサンプルを破 砕し、生体分子、好ましくはタンパク質を抽出後、分画することができる。これを分画 したサンプルとする。破砕'抽出する方法は、ダウンス型テフロン κ·ホモジナイザー、 ポリトロン、ワーリング.プレンダー、ポッター型ガラス.ホモジナイザー、超音波破砕装 置、細胞溶解液（例えばピアス社の Μ- PER: cat no. 78501, T- PER: cat no. 78510など）を用いる方法又は凍結融解法があげられ、好ましくはダウンス型テフロン R •ホモジナイザー、ポッター型ガラス ·ホモジナイザーを用いる方法である。分画する 方法は、分画遠心法やショ糖密度勾配遠心法などがあげられ、好ましくはショ糖密度 勾配遠心法である。
[0083] 次に、必要に応じて、分画したサンプルを精製することができる。これを精製したサ ンプルとする。精製する方法は、群特異的ァフィユティーカラム精製、カチオン交換ク 口マトグラフィー、ァ-オン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを利用する 方法、免疫沈降法、硫安沈殿法、有機溶媒による沈殿法、限外ろ過法、ゲルろ過法 、透析法などがあげられ、好ましくは群特異的ァフィユティーカラム精製である。破砕 •抽出、分画、精製の各操作は、これらに限定されるものではなぐ当業者における技 術常識により、適当なものを選択し、また、組み合わせればよい。
[0084] その後、必要に応じて、精製したサンプルを分離および消化を行うことができる。こ れを分離したサンプルおよび消化したサンプルとする。分離方法は、二次元電気泳 動、 SDS PAGE,各種クロマトグラフィー（例えば、ァフィ-ティークロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、ァ-オン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフ ィーなど)等が考えられるが、これに限定されるものではなぐ適当なものを選択すれ ばよい。消化方法には、酵素消化、化学分解等があげられ、好ましくは酵素消化であ る力 これに限定されるものではなぐ適当なものを選択すればよい。酵素消化に用 いる酵素としては、トリプシン、キモトリブシン、 Lys-C, Asp-N, Glu-Cなどがあげら れ、好ましくはトリプシンである。
[0085] こうして得られた分画したサンプル、精製したサンプル、分離したサンプル又は消化 したサンプルは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC)により分離することができる。こ れを HPLCにより分離されたサンプルとする。 HPLCに用いるカラムは、当業者におけ る技術常識により、適当なものを選択すればよぐ好ましくはァニオン交換カラム又は カチオン交換カラムである。 HPLCの諸条件 (流速、検出器、移動相など）は、当業者 における技術常識により、適宜選択できる。
[0086] <質量分析装置による測定サンプルの測定方法 >
次に、上記の操作により得られた測定サンプル (分画したサンプル、精製したサンプ ル、分離したサンプル、消化したサンプル又は HPLCにより分離されたサンプルを意 味する)を質量分析装置で測定する。質量分析装置は、ガスクロマトグラフと結合され た質量分析装置であるガスクロマトグラフィーマススぺタトロメトリー (GC/MS)や液体 クロマトグラフと結合された装置である液体クロマトグラフィーマススぺタトロメトリー（ LC/MS)等の汎用の装置を用いて行うことができる。質量分析装置におけるイオンィ匕 方法は、各装置に応じて適宜選択できる。例えば、 MALDI (マトリックス支援レーザー 脱離イオン化法）、 ESI (エレクトロスプレーイオンィ匕法）、 EI (電子イオン化法）、 CI (ィ匕 学イオン化法)、 APCI (大気圧化学イオン化法)、 FAB (高速原子衝撃法)、 LD、 FD、 SIMS, TSP等があげられ、好ましくは MALDI又は ESIである。アナライザ一は、各装置 に応じて適宜選択できる。例えば、 TOF (飛行時間型）、イオントラップ、二重収束型 、四重極型、フーリエ変換型等の汎用の装置を用いて行うことができる。質量分析の 装置及び方法は、ここにあげたものに限定されるものではなぐ当業者において質量 分析に通常使用されるものを適宜選択すればよい。
[0087] <生体分子の同定方法 >
質量分析による測定の結果得られたデータを用いて、生体分子、好ましくはタンパク 質を同定することができる。得られたデータを市販のソフトフェア、例えば、
SonarMSMS (Genomic solution社）およびデータベース、例えば、
NCBInr(hhtp：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/)、 IPI、 Sport等のデータベースを使用すること により解析し、サンプル中のタンパク質の自動同定が可能である。質量分析による測 定データを用いて、タンパク質を同定することは当業者にとって容易である（Nat Genet. 1998: 20, 46-50; J Cell Biol. 1998: 141, 967-977; J Cell Biol. 2000: 148, 635-651; Nature. 2002: 415, 141-147; Nature. 2002: 415, 180-183; Curr Opin Cell Biol. 2003: 15, 199-205; Curr Opin Cell Biol. 2003: 7, 2ト 27)。
[0088] <生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて比較する方法 > 本発明において、「生体分子の標識ピーク」とは、質量分析の測定結果から得られる m/zの値に対する質量分析スペクトル (以下、単に「質量分析スペクトル」という。）お よび/または時間に対する質量分析スペクトル (以下、「マスク口マトグラム」と称する場 合がある）において、代謝的に同位体標識された生体分子に由来するシグナル強度 又はその総和（通常面積で表されることは当業者であれば理解できる）をいう（以下、 単に標識ピークと称する場合がある)。 [0089] 本発明にお 、て、「生体分子の非標識ピーク」とは、質量分析スペクトルおよび/ま たはマスク口マトグラムにぉ 、て、代謝的に同位体標識されて 、な 、生体分子に由 来するシグナル強度又はその総和をいう（以下、単に非標識ピークと称する場合があ る)。
[0090] 質量分析による測定の結果得られたデータを用いて、各生体分子について、代謝 的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来の標識ピークとサンプル 由来の非標識ピークの強度比を求めて、サンプル間で該ピーク強度比の値を比較す ることにより、サンプル間の生体分子を相対定量することができる。代謝的に同位体 標識された生体分子は、サンプル由来の生体分子に比べ、同位体標識されている 分子量の分、分子量が大きくなり質量分析においてペアのピークとして観測される ( 図 2参照)。同位体標識されている生体分子の分子量は、同定されたタンパク質、脂 質、糖鎖又は核酸配列力 計算によって求めることができる。
[0091] より具体的には、例えば、サンプル Aおよびサンプル Bに含まれる生体分子量を比 較する場合、サンプル Aにおける各生体分子の非標識ピークを該生体分子に対応 する内部標準物質の標識ピークで除することによって、該生体分子における非標識 ピーク/標識ピーク (ピーク強度比 A)を求める。一方、サンプル Bにおける各生体分 子の非標識ピークを該生体分子に対応する内部標準物質の標識ピークで除すること によって、該生体分子における非標識ピーク/標識ピーク (ピーク強度比 B)を求める 。次に、ピーク強度比 Aとピーク強度比 Bとを比較することで、サンプル Aおよびサン プル Bにおける生体分子を相対的に定量することができる。
[0092] なお、サンプル中では存在して ヽて、代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含 む細胞には存在していない生体分子 (例えば、タンパク質等）力 S存在することがある。 この場合には、質量分析装置で測定した際に、近傍の内部標準物質由来のピーク、 好ましくは LC/MSならクロマトグラフィーでの溶出時間が近いピーク、 MALD卜 MSなら 分子量が近 、ピークを対象としてピーク強度比を求めて、サンプル間で該ピーク強 度比を比較することによって定量することができる。したがって、サンプル中のすべて の生体分子 (例えば、タンパク質)を測定することが可能である。 [0093] より具体的には、サンプル Aおよびサンプル Bにおける生体分子 Xを比較する場合 、内部標準物質に生体分子 Xが存在せず、近傍に生体分子 Yが存在することがある 。ここで、近傍とは、内部標準物質由来のピークで、かつ、 LC/MSならクロマトグラフィ 一での溶出時間が近いピーク、 MALDト MSなら分子量が近いピークである。この場 合には、サンプル Aにおける生体分子 Xの非標識ピークを生体分子 Yに対応する内 部標準物質の標識ピークで除することによって、生体分子 Xにおける非標識ピーク/ 生体分子 Yにおける標識ピーク（ピーク強度比 C)を求める。一方、サンプル Bにおけ る生体分子 Xの非標識ピークを生体分子 Yに対応する内部標準物質の標識ピークで 除することによって、生体分子 Xにおける非標識ピーク/生体分子 Yにおける標識ピ ーク（ピーク強度比 D)を求める。次に、ピーク強度比 Cとピーク強度比 Dとを比較する ことで、サンプル Aおよびサンプル Bにおける生体分子を相対的に定量することがで きる。近傍の生体分子を複数選択することによって、測定の精度を上げることができ る。
[0094] 本発明によって、質量分析に用いた 1又は複数の生体分子、好ましくはタンパク質 の絶対定量が可能となる。また、これに伴い、 1又は複数の生体分子が既知量である 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質及び 1又は複数の生体分 子が既知量である代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む 細胞が提供される。
[0095] つまり、既知量の各々の生体分子標品、好ましくはタンパク質標品を使って、代謝 的に同位体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識され た生体分子である内部標準物質を含む細胞に存在する生体分子量、好ましくはタン ノ ク質の絶対量を求めておくことで、目的のサンプルに含まれる生体分子、好ましく はタンパク質の絶対定量が可能である。したがって、これまでの定量的プロテオーム 解析ではできな力つた絶対定量が可能となる。このようにして同位体標識された生体 分子の絶対量を求めておけば、その後、各種実験に当該同位体標識された生体分 子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質を含む細胞を使用できるため、実験ごとに定量を行うことを余儀なくされていた従 来の方法に比べて非常に有用である。 [0096] 以下に、詳細について記載する。
<代謝的に同位体標識された生体分子である、内部標準物質に含まれる生体分子 の定量方法 >
代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質を含む細胞に存在する生体分子の絶対量は 、既知量の生体分子標品を用いて質量分析装置で測定することにより絶対量を求め ることがでさる。
[0097] より具体的には、例えば、化学合成した既知量の生体分子を、代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子で ある内部標準物質を含む細胞に添加し、必要に応じて、上述の方法により、破砕、抽 出、分画、精製を行う。次に、質量分析装置で測定し、化学合成した生体分子由来 のピークと標識ピークとを比較することにより、代謝的に同位体標識された生体分子 である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質 を含む細胞に存在する当該生体分子の絶対量が求められる。
[0098] 生体分子がタンパク質である場合には、上記の方法に加え、 SDS-PAGE、 EIA、
ELISA、 RIA、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーにより測定できる。これらは例示 であり、これに限定されるものではなぐ当業者にとって最適と考えられる方法を用い ることがでさる。
[0099] より具体的には、一定量の代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を、適 当な条件下、好ましくは上述の測定サンプルの調製方法と同じ条件下で破砕し、タン パク質を抽出する。この抽出液中の目的のタンパク質を SDS-PAGE、 EIA、 ELISA、 RIA、ウェスタンプロットなどの方法で測定することにより、代謝的に同位体標識された 生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部 標準物質を含む細胞に存在する当該生体分子の絶対量が求められる。
[0100] また、生体分子が酵素などの活性を有するものであれば、その生体分子固有の比 活性 (タンパク質量あたりの活性の強さ）が求められている。物質固有の比活性は、 報告されている活性を用いてもよぐ測定して求めてもよい。したがって、前述の抽出 液中のタンパク質の持つ活性を測定することにより、代謝的に同位体標識された生 体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標 準物質を含む細胞に存在する当該生体分子の絶対量が求められる。
[0101] なお、本発明において定量の対象は、タンパク質に限ったものではなぐ細胞が培 地の栄養分を使って作り出す全ての物質、例えば、脂質、糖鎖又は核酸などに対し て定量および同定を目的とした分析に応用可能である。
[0102] なお、生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて比較する方法、お よび代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質に含まれる生体分子 の定量方法を実行するための、本発明に係るプログラムについて後述する。
[0103] (本発明の第二の実施態様）
図 3は、本発明の第二の実施態様による生体分子の一例としてのタンパク質の定量 的解析方法の概略的な全体スキームを示す。図 3に示すように、まず、測定サンプル 調製を行い、その後、質量分析装置を用いて質量分析を行う。次いで、本発明による 定量的解析方法を実行する。
[0104] 図 3の工程 S 11に示す測定サンプル調製には、サンプルを同位体標識する工程と 、各サンプル力も生体分子を抽出、分画等する工程とからなる。サンプルを同位体標 識する方法には、同位体標識されたアミノ酸を含む培地で培養する方法、 in vitroに おいて化学的または酵素的に同位体標識する方法などがある。
[0105] 同位体標識されたアミノ酸を含む培地で培養する方法は、同位体標識されたァミノ 酸を含まな 、環境で育成および/または培養された同位体非標識細胞に、同位体標 識アミノ酸の添加により生合成されるタンパク質が、同位体標識アミノ酸を代謝的に 取り込み、同位体標識アミノ酸を有する同位体標識タンパク質を作出する工程を含 む。
[0106] 同位体標識されたアミノ酸を含む培地で培養する方法は、培養条件はどのようなも のであってもよぐ液体培地あるいは固体培地に、該細胞を培養するのに好適な条 件を設定すればよい。たとえば、前述の本発明の第一の態様にて説明した方法に準 じて行うことができ、動物細胞を選択した場合には、 DMEM、 MEM, RPMI1640, IMDM等の培地を用い、必要に応じて、ゥシ胎児血清 (FCS)等の血清、アミノ酸、グ ルコース、ペニシリン又はストレプトマイシンなどを添カ卩することができ、 pH約 6— 8、 3 0— 40°Cにおいて、 15— 200時間前後の培養を行う。その他、必要に応じて、培地 を途中で交換したり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。このようにして得られ た同位体標識されたタンパク質を含む細胞は、そのまま用いることもできるが、破砕し て利用することも可能である。破砕する方法は、ダウンス型テフロン 'ホモジナイザー 、ポリトロン、ワーリング'プレンダー、ポッター型ガラス'ホモジナイザー、超音波破砕 装置、細胞溶解液（たとえば、ピアス社の M- PER : cat no. 78501, T- PER: cat no.78510など）を用いる方法又は凍結融解法が挙げられ、好ましくは細胞溶解液を 用いる方法である。
[0107] また、本発明の第二の実施態様において、同位体標識されたタンパク質は、 in vitroにおいても調製することができる。たとえば、タンパク質中のシスティン残基を同 位体標識されたアルキルィ匕試薬を用いてアルキルィ匕することにより、同位体標識する ことができる（「ラビッド.コミュケーシヨンズ.イン.マス.スぺクトノレメトリー（Rapid し ommunications in Mass spectroscopy)」第 lb卷、第丄 5 、 2002年、
pp.1416-1424参照)。さらに、タンパク質中のシスティン残基を同位体標識されたビ ォチンィ匕試薬を用いてピオチン化することにより、同位体標識することもできる。これ を、さらに、アビジンカラムを用いて、標識されたタンパク質のみを精製することが可 能である（「ネィチヤ一'バイオテクノロジー（Nature Biotechnology)」第 17卷、第 10 号、 1999年 10月、 pp.994- 999)。
[0108] さらにまた、タンパク質を消化して得られたペプチド断片の C末、 N末、グルタミン酸 残基、ァスパラギン酸残基などを同位体標識した分子で標識することができる。具体 的には、タンパク質を酵素で消化する際に、緩衝液中に 180で標識された水を加える 。消化酵素としては、キモトリブシン、トリプシン、 Asp-N、 Lys-C、 Glu-Cを用いること ができる。キモトリブシン、 Asp-Nを用いたときには、加水分解後のペプチドの C末側 に180がーつ、トリプシン、 Lys- C、 Glu- Cを用いたときには、加水分解後のペプチドの C末のカルボン酸の酸素原子が二つとも180になることが知られている。
[0109] くわえて、タンパク質を消化して得られたペプチド断片の C末、グルタミン酸残基、ァ スパラギン酸残基のカルボン酸をメチルエステルにする方法が知られており（ Goodlett DR, Keller A, Watts JD, Newitt R, Yi EC, Purvine S, Eng JK, von Haller P, Aebersold, Koller E. Differential stable isotope labeling of peptides for quantitation and de nove sequence derivation. Rapid Commun mass Spectrom. 2001: 15, pp.1214- 1221参照）、同位体標識されたメタノールを用 いてメチルイ匕することにより、同位体標識することも可能である。
[0110] また、タンパク質を消化して得られるペプチド断片の N末をニコチン酸誘導体化する 方法 (Munchbach M, Quadroni M, iotto u, James P. Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotropic N— terminal labeling of peptides with a fragmentation-directing moiety. Anal. Chem. 2000:72, pp.4047- 4057参照）や、ァセチル化する方法（Ji. J. Chakraborty A, Geng M, Zhang X, Amini A, Bina M, Regnier F. Strategy for quantitative and quantitative analysis in proteomics based on signature peptides. J
Chromatogr B Biomed Sci Appl. 2000:745, pp.197- 210参照）が知られている。 そのため、これらの同位体標識された試薬を用いることにより、同位体標識することも できる。
[0111] なお、同位体標識されたタンパク質または同位体標識されたタンパク質を含む細胞 は、適当な条件、好ましくは 20°C以下、特に好ましくは 80°C以下で保存すること ができる。そして、このようにして得られた同位体標識されたタンパク質は、後述する 解析において内部標準物質としても用いることができる。
[0112] 本発明で用いる同位体標識アミノ酸は、放射性同位体を適用することもできるが、 放射性を有さない安定同位体が、取り扱いが容易であることから、特に好ましい。安 定同位体には、以下に限定されるものではないが、 2H、 13C、 15N、 "0、 180、 33P若しく は34 S又はこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは13 Cである。本発明に利用され る同位体は、細胞に取り込まれ、タンパク質を標識し得るものであれば、その種類は 特に限定されない。具体的には、同位体標識タンパク質の前駆体として、 13c標識 (13 Cx6個）ロイシン（Cambridge Isotope Labs(CIL)社製、 L- Leucine U- 13C6, CLM-2262)を挙げることができる。
[0113] 図 4は、本発明による同位体標識を利用する測定サンプル調製について、本発明 の第二の態様の一つの態様のスキームを示す。測定対象のサンプルのうち、一方を 同位体標識されたタンパク質を含むサンプル 1、他方を同位体標識されていないタン パク質を含むサンプル 2を準備する。そして、サンプル 1およびサンプル 2を混合する
[0114] 次いで、混合後のサンプルを破砕し、タンパク質を抽出する。そして、必要に応じて 、前述のサンプルを精製することができる。精製方法は、群特異的ァフィユティーカラ ム精製、カチオン交換クロマトグラフィー、ァ-オン交換クロマトグラフィー、逆相クロ マトグラフィーを利用する方法、免疫沈澱法、硫安沈殿法、有機溶媒により沈殿法、 限界ろ過法、透析法などが挙げられる。
[0115] その後、さらに必要に応じて、各種分離や消化を行うことができる。分離方法には、 以下に限定されるものではないが、二次元電気泳動、 SDA PAGE,各種クロマトダラ フィー（たとえば、ァフィ-ティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ァ-オン 交換フロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーなど)等が考えられる。消化 方法には、以下に限定されるものではないが、酵素消化、化学分解等が挙げられる。 酵素消化に用いる酵素としては、たとえば、トリプシン、キモトリブシン、 Lys-C、 Asp-N 、 Glu-C等が挙げられる。
[0116] このようにして得られたサンプル生成物をそのまま測定することもできる力 HPLCに より分離することもできる。 HPLCに用いるカラムには、以下に限定されるものではない 1S ァ-オン交換カラム又はカチオン交換カラム等が挙げられる。 HPLCの諸条件（ 流速、検出器、移動相）は、当業者には容易に理解され、適宜選択できる。
[0117] 前述のように調製されたサンプルを、図 3に示す工程 S 12にて質量分析を行う。こ の質量分析は、ガスクロマトグラフと結合された質量分析装置であるガスクロマトダラ フィーマススぺタトロメトリー (GC/MS)や液体クロマトグラフと結合された質量分析装 置である液体クロマトグラフィーマススぺタトロメトリー (LC/MS)等の汎用の装置を利 用することができる。質量分析におけるイオンィ匕方法は、前述の本発明の第一の態 様で説明したように、各装置に応じて適宜選択できる。たとえば、 MALDU ESI、 EI、 CI 、 APCI、 FAB、 LD、 FD、 SIMS, TSP等が挙げられる。アナライザーには、各装置に応 じて適宜選択できる。たとえば、 TOF、イオントラップ、二重収束型、四重極型、フーリ ェ変換型等の汎用の装置を用いて行うことができる。
[0118] 質量分析による測定の結果力も得られたデータを用いて、タンパク質を同定するこ とができる。得られたデータを市販のソフトウェア、たとえば、 SonarMSMS(Genomic solution社)及びデータベース、たとえば、 NCBInr(hhtp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、 IPI、 Sport等のデータベースを使用することによりタンパク質の自動同定が可能である 。質量分析による測定データを用いて、タンパク質を同定することは、当業者には容 易に理解できる（たとえば、 Nat Genet. 1998:20, 45-50; J Cell Biol. 1998: 141, 967-977; J Cell Biol. 200: 148, 635—651; Nature, 2002: 415,
141-147; Nature. 2002: 415, 180-183; Curr Opin Cell Biol. 2003: 15, 199-205; Curr Opin Cell Biol. 2003: 7, 21-27)。
[0119] 本発明に係る解析方法では、概略的には、質量分析による測定の結果から得られ たデータを用いて、各タンパク質についての内部標準物質となる同位体標識タンパク 質由来ピークと、サンプル中のタンパク質由来ピークの強度比や、より詳細には、固 有のタンパク質に由来する波形分離したマスク口マトグラムを求めて、サンプル間でこ れらのピーク強度比の値や、波形面積を比較することにより、図 3の工程 S13に示す サンプル中のタンパク質の定量的解析を可能とする。たとえば、本発明による第一の 実施態様で説明したように、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質または代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を加 える工程と、各サンプルから生体分子を抽出、分画等する工程を、図 3に示す工程 S 13にて行う。次いで、前記生体分子を質量分析装置で測定する（図 3の工程 S12参 照)。その後、図 3の工程 S13に示す定量的解析にて、前記質量分析装置で得られ た結果を取得し、各生体分子の標識ピークと非標識ピークとを選択した上で各ピーク の強度比を求めて、当該生体分子を定量するができる。
[0120] 図 5は、質量分析装置における質量分析後に、本発明に係る定量的解析方法のス キームを示す。図 5に示すように、本発明による定量的解析方法は、被解析対象の質 量分析スペクトルの MS/MS処理によるアミノ酸配列の決定（工程 S111)、前記質量 分析スペクトル (第一の m/z)の決定工程 (工程 S 112)、前記アミノ酸配列が決定さ れたタンパク質の第一の m/zの値から、前記タンパク質に対して同位体標識された 同位体標識タンパク質の第二の m/zの値の算出（工程 S113)、前記第一及び第二 の m/zの値における時間に対する質量分析スペクトル（以下、「マスク口マトグラム」と 称する場合もあある。）の抽出（工程 S114)、前記第一及び第二の m/zの値に対応 する各タンパク質のマスク口マトグラムに対する波形分離（工程 S115)、前記波形分 離処理により得られた固有のタンパク質由来による波形面積の算出（工程 S116)、 前記第一の m/zに対応する第一の波形面積の値と、前記第二の m/zに対応する第 二の波形面積の値とから、（前記第二の波形面積) I (前記第一の波形面積)の比の 算出（工程 S117)を、含む。以下、各工程を詳述することにより、本発明に係る定量 的解析方法を説明する。
[0121] なお、前記解析方法は、同位体非標識タンパク質の質量分析スペクトルから、対応 する同位体標識されたタンパク質の質量分析スペクトルを求める方法に基づいて説 明したが、先に、解析対象として同位体標識タンパク質の質量分析スぺ外ルを決定 した後で、対応する同位体非標識タンパク質の質量分析スペクトルを求める方法でも 、本発明に係る解析方法は実施可能であることは、当業者には容易に理解できる。
[0122] 図 6は、典型的な質量分析装置にて得られるスペクトルを示す。得られるスペクトル の種類には、任意の時間軸点から、 m/zに対する強度軸を示すスペクトル (m/zに対 する質量分析スペクトル)や、検出された全イオン量を、各時間に対する強度で示す スペクトル（時間に対する質量分析スペクトル (以下、「マスク口マトグラム」と称する場 合もある。）がある。
[0123] 図 5に示す工程 S111では、 MS/MS処理力 得られた質量分析スペクトルにより、ァ ミノ酸配列を決定する（工程 S 111)。その後、解析対象とするタンパク質の第一の m/ zの値を定める（工程 SI 12)。
[0124] 前述した MS/MS処理とは、複数の質量分離部を用い、 1つ目の質量分離部（以下、 「MS1」という。 )のイオン化室で生成したイオン種のうちの一つを前駆イオンとして選 択し、 2つ目の質量分離部 (MS2)で、その前駆イオンの分解によって生じる生成ィォ ンを検出する処理法である。そして、生成イオンの m/zの値カゝらアミノ酸配列の解析 を行うものであり、当業者には、 MS/MS処理によりアミノ酸配列を決定する手法は容 易に理解される（たとえば、「ポストゲノム'マススぺタトロメトリー」 1993年、 pp 39-72 丹羽利充編 化学同人 参照)。この MS/MS処理によるアミノ酸配列の決定は、イン ターネットを介して NCBInr (hhtp：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/)データベースとの照合に より実行することが可能である。
[0125] その後、前記アミノ酸配列が決定されたタンパク質の第一の m/zの値から、そのタ ンパク質に対応する同位体標識タンパク質の第二の m/zを求める。これは、図 3に示 す工程 S 11にてサンプル調製する際、同位体標識させるアミノ酸として、安定同位体 が既知である試薬、たとえば、 13C標識 (13Cx6個）ロイシンを利用して細胞を培養させ れば、第一の m/zの値と第二の m/zの値の差は、 12Cと13 Cの 6個分であり、その差が 6 である。そして、タンパク質の電荷の値から、工程 S113にて第二の m/zの値を算出 することができる。
[0126] 前記第一の m/z及び前記第二の m/zの値における、時間に対する質量分析スぺク トル (以下、それぞれ、「時間に対する第一の質量分析スペクトル (以下、「第一のマス クロマトグラム」と称する場合がある。；)」という、「時間に対する第二の質量分析スぺク トル (以下、「第二のマスク口マトグラム」と称する場合がある。；)」という）を、質量分析 装置にて得られた質量分析スペクトルから抽出する（工程 S114)。
[0127] ところで、細胞中には複数のタンパク質が存在しており、その多くのタンパク質を一 度に質量分析すると、一つのマスク口マトグラムであっても、異なるタンパク質のピー クが重なる現象が観測される。図 7は、単一の m/zの値において、複数のピークが重 なって 、る一例のマスク口マトグラムを示す。
[0128] 力かる現象により、細胞中のタンパク質の発現量の定量的解析を困難にしている。
そこで、本発明では、前示の第一のマスク口マトグラム及び第二のマスク口マトグラム に対して、波形分離処理を行い（工程 S 115)、固有のタンパク質由来のマスク口マト グラムに分離する。
[0129] 本発明で用いる波形分離処理とは、複雑な波形に対する曲線適合法を基本とする 合成的分離法である。これは、最初に各ピーク成分が特定の解析関数で表現できる と仮定する。この仮定に基づき、いくつかのピーク関数を生成'合成し、各ピーク関数 に含まれるパラメータを調整して観測波形との偏差を最小化する。偏差の最小点に おけるパラメータより、各ピーク波形を分解'分離することにより行う。なお、本発明に よる波形分離処理に利用される波形パラメータには、ピークの個数、各ピークの形、 ピーク位置、ピーク高さ、ベースラインの形等が挙げられる。
[0130] 図 8は、図 7に示したマスク口マトグラムを、本発明による波形分離処理により分離し たマスク口マトグラムを示す。本発明では、たとえば、ガウシアン関数とローレンツ関数 とを利用して波形分離することができる。図 8から明らかなように、実線で示される、実 際に測定されたマスク口マトグラムは、本発明による波形分離処理により、点線等で 表されるマスク口マトグラムにより 5分割される。
[0131] 図 8に示す波形分離処理を、同位体非標識タンパク質とそれに対応する同位体標 識タンパク質とで実行する。このようにして得られたマスク口マトグラムは、固有のタン パク質に由来するマスク口マトグラムである。そして、そのマスク口マトグラムの面積を、 前記同位体非標識タンパク質及び同位体標識タンパク質のそれぞれについて算出 し、それぞれを、第一の波形面積及び第二の波形面積とする（工程 S116)。次いで 、工程 S117にて、（第二の波形面積)/ (第一の波形面積)の比を求め、タンパク質変 動の定量的解析に利用できる。これは、常に、同位体標識されたタンパク質との比較 を行うことで、定量的解析を可能にするものである。
[0132] 次に、本発明による定量的解析方法に係るプログラムを、コンピュータにて実行さ せる解析システムについて説明する。図 9は、本発明が適用される解析システム 10の 構成の機能ブロック図の一例を示す。なお、図 9では、前記構成のうち、本発明に関 係する部分のみを概念的に示し、マイクロコンピュータ力 構成される。
[0133] 本発明に係る解析システム 10は、概略的には、質量分析装置 20にて得られた質 量分析データを解析する解析装置部 30と、アミノ酸配列決定用の外部分析プロダラ ム等を提供する外部装置部 40とを、ネットワーク 50を介して通信可能に接続して構 成される。なお、図 9に示すネットワーク 50は、解析装置部 30と外部装置部 40とを相 互に接続する機能を有し、たとえば、インターネット等である。
[0134] 本発明にて用いられる質量分析装置 20は、特に限定されるものではなぐ市販の 質量分析装置であればよい。そして、前記質量分析装置 20は、それ自体に該装置 にて測定して得られた結果を保存するデータ保存部 25を備えていてもよい。また、本 発明に用いられる質量分析装置 20は、それ自体に装置を制御する制御部や入出力 部を備えるものであってもよ 、。
[0135] 図 9に示す外部装置部 40は、ネットワークを介して、質量分析データを解析する解 析装置部 30と相互に接続され、利用者に対してアミノ酸配列情報等に関する外部デ ータベースゃホモロジ一検索等の外部分析プログラムを実行するウエッブサイトを提 供する機能を具有する。
[0136] ここで、外部装置部 40は、 WEBサーバや ASPサーバ等として構成してもよく、その ハードウェア構成は、一般に巿販されるワークステーション、パーソナルコンピュータ 等の情報処理装置及びその付属装置により構成してもよい。また、外部装置部 40の 各機能は、外部装置部のハードウェア構成中の CPU、ディスク装置、メモリ装置、入 力装置、出力装置、通信制御装置等およびそれらを制御するプログラム等により実 現される。
[0137] 本発明では前記外部装置部として NCBInr等のデータベースを利用することができ る。
[0138] 図 9に示す解析装置部 30は、概略的には、質量分析装置 20の全体を統括的に制 御する CPU等の制御部 60、通信回線等に接続されるルータ等の通信装置 (不図示
)に接続される通信制御インターフェース部 70、質量分析装置 20、およびディスプレ ィゃプリンタ一等の出力装置 90に接続される入出力制御インターフェース部 80、お よび各種のデータベースを格納する記憶部 100を備えて構成される。各部は任意の 通信路を介して通信可能に接続される。さら〖こ、本発明による解析装置部 30は、ル ータ等の通信装置及び専用線等の有線又は無線の通信回線を介して、ネットワーク に通信可能に接続されて 、る。
[0139] 記憶部 100に格納される各種のデータベース (質量分析データやアミノ酸配列デ ータベース等）は、固定ディスク装置等のストレージ手段であり、ファイルやデータ等 を格納する。
[0140] 前記記憶部 100の各構成要素のうち、質量分析データベースは、質量分析装置 2 0にて得られたデータベースである。また、アミノ酸配列データベースは、質量分析装 置にて得られた質量分析スペクトルの解析結果としてのアミノ酸配列データベースや 、インターネットを経由してアクセス可能な外部のアミノ酸配列データベースであって もよい。さらに、これらのデータベースをコピーしたり、オリジナルの配列情報を格納し たり、さらに独自の識別番号を付与し作成したインハウスデータベースであってもよい
[0141] 制御部 60は、本発明に係る解析方法を実行するプログラムを格納し、前記解析装 置部 30を、ひいては解析システム 10の全体を制御する装置である。前記制御部 60 は、 OS (operating system)等の制御プログラム、各種の処理手順等を規定したプロ グラム、および所要データを格納するための内部メモリ（不図示）を有し、これらのプロ グラム等により、種々の処理を実行するための情報処理を行う。なお、本発明に係る 解析方法を実行するプログラムは、前記記憶部 100に格納されて ヽてもよ ヽ。
[0142] 図 10は、本発明に係る解析方法を実行する一のプログラムを、概念的に表すフロ 一チャートである。工程 S200にて、制御部 60は、質量分析装置 20にて得られた質 量分析データを取得する。そして、取得した質量分析データを記憶部 100に保存す るが、その際に、後述する解析の便宜のため、データ検索を容易にするように、各質 量分析データに、スキャン番号等の識別番号を付与する（工程 S201)。次に、図 5の 工程 S 111にて説明したのと同様に、通信制御インターフェース部を介したインター ネット 50を通じて、外部のデータベース、たとえば、 NCBInrデータベースと照合させ ながら、 MS/MS処理により、制御部 60にてアミノ酸配列を決定することができる（工程 S202) o前記質量分析データの中から、解析対象とする質量分析スペクトルを決定 する（工程 S203参照)。その際、前述のように決定した質量分析スペクトルの m/zを 定め、これを第一の m/zとする。この第一の m/zの値は、同位体非標識タンパク質の 質量分析スペクトル、または同位体標識タンパク質の質量分析スペクトルであっても よい。かかる決定は、前述のスキャン番号力 容易に行うことができる。
[0143] 工程 S204にて、前記アミノ酸配列が決定されたタンパク質の第一の m/zの値から 、そのタンパク質に対応する同位体標識タンパク質の第二の m/zの値を求める。この 決定工程は、図 3の工程 S11にて予め培養させる際に利用した同位体標識のァミノ 酸に含まれる同位体原子の数と、前記第一の m/zに対応するタンパク質の電荷から 容易に決定することができる。決定した第二の m/zの値から、その値のマスクロマトグ ラムを、記憶部 100に格納された質量分析データ力も抽出する（工程 S205参照)。 [0144] 次いで、第一の m/z及び第二の m/zの値における第一のマスク口マトグラムおよび 第二のマスク口マトグラムに対して、図 7及び図 8にて説明したように、工程 S206にて 波形分離処理を行う。本処理により、固有のタンパク質に由来するマスク口マトグラム を分離し、記憶部 100に格納する。このようにして得られたマスク口マトグラムの波形 面積として、第一の波形面積及び第二の波形面積を算出し (工程 S207)、工程 S20 8にて、（第二の波形面積) I (第一の波形面積)の比を求める。
[0145] その後、必要に応じ、前記比の値を、ディスプレイ若しくはプリンタ一等の出力装置 90に表示若しくは印字することができる。
[0146] 図 10に示す一連の工程を、同位体標識タンパク質に起因する質量分析スペクトル と比較しながら行うため、サンプル内のタンパク質発現量の変化を、定量的に解析す ることが可能となる。また、必要に応じて、解析対象とする別の質量分析スペクトルに 対して、図 10に示す一連の工程を繰り返し実行することも可能である。たとえば、正 常な細胞由来のタンパク質との比較から、遺伝子欠損した細胞由来のタンパク質の 発現パターンの相違を観測することも可能である。
[0147] さらに、図 10では、同位体非標識された生体分子と同位体標識された生体分子に て説明したが、同位体標識された生体分子に代えて、同位体標識された内部標準物 質である生体分子を利用することもでき、その場合、図 10の工程 SS208に示す波形 面積比は、（生体分子の波形面積)/ (内部標準物質に固有の波形面積)の比として 算出される。
[0148] 図 11は、本発明に用いる制御部 60の詳細な構成を示す機能ブロック図である。前 述のように、図 10で説明した本発明に係る解析方法を実行するための制御部 80は、 質量分析装置 20にて得られた質量分析データを、入力制御インターフェース部 80 を通じて、制御部 80のデータ入出力部にて入手する。外部のデータベース、たとえ ば、 NCBInrデータベースと照合させながら、 MS/MS処理により、入手したタンパク質 の質量分析データについてのアミノ酸配列を、制御部 60の処理部にて決定する。解 析対象としての質量分析スペクトルを、質量分析装置 20、または制御部 80と接続さ れた不図示の入力手段からの信号に基づき決定する。ここで、前記入力手段として は、たとえば、制御部に接続されたキーボードやマウス等が挙げられる。 [0149] 前記決定により第一の m/zの値が決まり、制御部 60の処理部にて第二の m/zの値 を決定する。第二の m/zの値の決定は、図 5の工程 S113により行うことができる。な お、第一の m/zの値と第二の m/zの値のタンパク質は、アミノ酸の同位体非標識と、 同じアミノ酸が同位体標識されたタンパク質の関係にある。
[0150] このように決定された第一及び第二の m/zの値におけるマスク口マトグラムを、デー タ入出力部を介して、記憶部 100の質量分析データベースや、質量分析装置 20か ら、処理部にて入手する。入手した第一および第二の m/zの値におけるマスク口マト グラムを、図 5の工程 S115や図 10の工程 S206にて説明したように、処理部にて波 形分離処理する。かかる波形分離処理により、 m/zの値におけるマスク口マトグラムの 結果力 だけでは、一見、単一のタンパク質のピークと観測されたものであっても、固 有のタンパク質に由来するマスク口マトグラムに分離することが可能となる（図 8参照）
[0151] 次いで、固有のタンパク質に由来するマスク口マトグラムに分離されたデータを、波 形処理部から演算部へ送り、前記演算部にて分離された波形面積の算出と、同位体 非標識と同位体標識されたタンパク質において、対応する固有のタンパク質に由来 するマスク口マトグラム間の波形面積比の算出と、を実行する。
[0152] このように、本発明に係る解析方法によれば、同位体非標識と同位体標識のァミノ 酸を含むタンパク質において、固有のタンパク質に由来する波形分離されたマスク口 マトグラム間の比較により、定量的解析を可能とする。
[0153] 次に、代謝的に同位体標識されたタンパク質である内部標準物質または代謝的に 同位体標識されたタンパク質である内部標準物質を含む細胞を利用した解析方法 について説明する。
[0154] 本発明の第一の実施態様において説明したように、各サンプルに、予め、代謝的 に同位体標識されたタンパク質である内部標準物質または代謝的に同位体標識さ れたタンパク質である内部標準物質を含む細胞をカ卩え、各サンプルからのタンパク質 を抽出、分画等し、質量分析装置に測定する。その後、図 5、図 9一図 11にて説明し たように、波形分離処理を伴う、本発明による解析方法を行うことにより、生体分子の 定量的解析を可能とする。なお、カゝかる解析方法は、サンプルが培養できない場合、 サンプルが培養できても、継代培養により影響を受ける場合、サンプルを同時期、同 研究所で準備できない場合に、有用な方法である。さらに、前記内部標準物質中の タンパク質が既知量であるならば、絶対定量を可能とする。
[0155] ここで、本発明の第一の実施態様における、生体分子の標識ピークと非標識ピーク との強度比を求めて比較する方法を実行するプログラムについて説明する。図 12は 、本発明の第一の態様における強度比を求め、比較するためのプログラムの工程図 を示す。図 12に示す工程 S300にて、質量分析装置 20にて測定された各種測定サ ンプルの質量分析データを、本発明に係る解析システム 10の解析装置部 30にて取 得する。前述のとおり、測定サンプルの調製方法に調製された、分画したサンプル、 精製サンプル、分離サンプル、消化したサンプル又は HPLCにより分離されたサンプ ルを含むものである。ここでは、特に、代謝的に同位体標識されていない生体分子と 、同位体非標識の生体分子を対象とする。
[0156] 次いで、工程 S301にて、前記質量分析スペクトルの測定結果に関するデータを、 解析装置部 30の通信制御 IF部 70を介して、外部のデータベース、たとえば、 NCBInrデータベースと照合させながら、 MS/MS処理により、入手した質量分析に関 するデータ、具体的には、同位体標識および同位体非標識のタンパク質の同定、つ まりはアミノ酸配列を制御部 60の処理部にて同定する。その後、対象とする同位体 標識ピークと同位体非標識ピークとを特定する（工程 S302参照)。
[0157] 以上の結果に基づき、工程 S303に示すように、制御部 60にて、ペプチドのァミノ 酸配列が同定された分子における、同位体標識ピークと同位体非標識ピークのピー ク強度比を算出する。以上の操作を、各サンプル力 得られた複数のペプチドにつ いて実行することにより、異なるペプチド間で、ピーク強度比の比較することができる
[0158] さらに、同位体標識された生体分子が既知量である場合には、図 12に示す工程を 実行すると、本発明では、生体分子を絶対定量するプログラムを提供することができ る。
[0159] ところで、波形分離されたマスク口マトグラムに関して、実際に測定され、波形分離さ れたマスク口マトグラムは、元来、解析対象であるサンプルを二次元電気泳動等によ り分離されたタンパク質を質量分析したものである。そのサンプル調製の際、ゲル上 のタンパク質スポットのバンドを切断し、容器に回収する。次いで、当該容器内のゲ ルを、トリプシン等の酵素で消化してペプチドに断片を回収して、質量分析を行う。
[0160] このように回収されたペプチドは、切断されたタンパク質スポットに由来するバンドか ら誘導されるものであるが、当該バンド自体が単一のタンパク質を含有するものでは なぐ同じタンパク質でも、サンプル処理過程でペプチドが切断され得ることにより、 複数のバンドに存在していることが通例である。そのため、前述のように波形分離さ れたマスク口マトグラムであっても、同一のペプチドは複数の波形分離されたマスク口 マトグラムとして測定される。よって、同一のペプチドであっても、（同位体非標識ぺプ チドのピーク) / (同位体標識ペプチドのピーク)の比や（同位体非標識ペプチドの波 形面積) I (同位体標識ペプチドの波形面積)の比の値 (以下、これらを総称して「定 量値」という。）は、質量分析したピーク毎に異なり、複数の値が存在することになる。
[0161] そこで、波形分離されたマスク口マトグラムの結果から、 1又は複数のペプチドに着 目して、当該ペプチドが構成するタンパク質が同定される力否かを検討することがで きる。たとえば、前記質量分析スペクトルの結果を、タンパク質の機能情報を有する LocusLink等のデータベースと照合して、タンパク質の機能情報を得ることができる。 ここで LocusLinkには、 NCBInr、 IPI、 Sport等の複数のデータベースにおけるキー情 報から「Locus IDJ t 、う共通のキーへのリンク情報およびタンパク質の機能情報が 提供されている。そこで、ペプチド配列から、 NCBInr、 IPI、 Sport等のデータベースを 使用して、各データベースにおけるキー情報を得る。次に、 LocusLinkを使用して、キ 一情報から Locus IDを得ることができる。そして、当該 Locus IDから、タンパク質の 機能情報を得ることができる。例えば、ペプチド配列から、 NCBInr等のデータベース を使用して、「GiNo」というキー情報を得る。次に、 LocusLinkを使用して、 GiNoから Locus IDを得る。そして、当該 Locus IDから、タンパク質の機能情報を得ることができ る。
[0162] 図 13は、本発明で用いる、外部データベースを利用した機能情報の取得に関する スキームを示す。図 13に示すように、波形分離後のペプチド毎に分類した上で、タン パク質の機能情報を有するデータベース、たとえば、 NCBInr、 IPI、 Sport等へァクセ スする。特に、 NCBI-BLASTを利用して配列パターンを照合する。得られた配列パタ ーン力 NCBInrのキー情報である GiNoを取得し、詳細な機能情報を有するデータべ ースである LocusLinkへ接続し、 GiNoから Locus IDを取得する。その後、同一の Locus IDを有するものをグループ化するとともに、かかる IDから Gene Symbol, Gene
Ontology(biological process八 Gene Ontology (cellular component)、 ene Ontology(molecular lunction),代表定量値の情報を入手することができる。なお、波 形分離前の工程は、図 5および図 10に示した工程と同様である。
[0163] さらに、前述のグループ化された Gene Symbolから各ペプチドが構成していたタン ノ ク質の情報も取得でき、複数のペプチドにおける測定値力もタンパク質の定量値を 算出することが可能となる。これにより、力かるタンパク質の定量値と生物学的情報と の関連付けが実現される。なお、ペプチドの定量値の場合、単にその平均の定量値 を算出することもできる力 その場合、ペプチドの定量値の極大値および極小値の影 響を受けやすい。一方で、タンパク質の定量値を算出するにあたり、グループィ匕され た機能タンパク質にて標準偏差を求め、その標準偏差の範囲内のデータのみで再 度平均を求めてそのタンパク質の定量値とすれば、ペプチドの定量値よりも、タンパ ク質の定量値とその生物学的情報との関係性に意義があるものとなる。
[0164] 前述の定量値と機能情報との付加の操作は、図 11に示した情報付加部により、外 部のデータベースを利用して行うことができる。なお、質量分析データに関する処理 は、図 9に示した手段等により、波形分離までの情報処理工程と同様である。
[0165] 図 14は、本発明において、波形分離後（工程 S400)、決定されたペプチドの配列 の結果に基づき、機能情報の付加を行う方法を実行するための工程図を示す。工程 S401にて、選択したペプチドの配列ごとに分類し、その後の解析の対象とするぺプ チド配列を特定する。次いで、図 9に示すように、通信制御インターフェースを介して 、外部のデータベースへ、機能情報を取得するためにアクセスする。ここで、外部の データベースの具体例としては、 NCBInr(hhtp：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/)、 IPI、 Sport 等のデータベースを挙げることができる。そして、かかるデータベースから、配列パタ ーンを検索し、 GiNo等の情報を取得する。その後、工程 S402において、ペプチドの GiNo等の情報から、当該ペプチドが構成していたタンパク質に関する情報の有無を 検査する。タンパク質の情報を有する場合には、力かる情報を共有する配列としてグ ループ化する。このグループィ匕されたタンパク質における定量値を算出する（工程 S 403参照）。さらに、この情報には、図 14に示すように、 Gene Symbol, GO(biological process) ^ uOi,cellular component) uO(molecular i nction)等の機會†青？ ^ 人手 することもできる。なお、前述の定量値の平均値を求め、当該ペプチドの代表定量値 を算出することは、図 9および図 11に示す制御部 60の演算部にて行うことができる。
[0166] このようにして、決定されたペプチドの配列の結果から、ペプチドが構成して ヽたタ ンパク質を検出し、そのタンパク質の定量値と機能情報、具体的には、 Gene
Ontology情報との関連を付けることができる。これは、タンパク質の定量値と生物学 的データとの関連性を示唆するものである。
[0167] また、本発明では、 MS/MS処理力 得られた質量分析スペクトルにより、ペプチドを 構成するアミノ酸配列を決定したのち、波形分離処理を施さずに、前述のタンパク質 の機能情報を有するデータベース (NCBInr等)へアクセスし、ペプチドの定量値と生 物学的データとの関連性を見出すこともできる。これは、アミノ酸配列の決定されたぺ プチドの質量分析スぺ外ル自体を波形分離する必要がな！ヽ場合にも、適用できる。
[0168] 図 15は、波形分離をせずに、同位体標識された生体分子である内部標準物質存 在下でのペプチドの質量分析スペクトルの結果、具体的にはァミノ配列の結果に基 づき、機能情報の付加を行う方法を実行するための工程図を示す。図 15に示すェ 程 S500— S502までは、図 10に示す工程 S200— S205と共通するため、その説明 は省略する。本発明の好ましい態様では、工程 S503にて第一および第二、並びに 内部標準物質の m/zにおけるマスク口マトグラムを抽出する。工程 S502後、工程 S5 04にて、図 9に示す通信制御インターフェースを介して、外部のデータベースへ機 能情報を取得するためにアクセスする。前述のように、外部のデータベースとしては、 NCBInr(hhtp：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/)、 IPI、 Sport等のデータベースを挙げることが できる。かかるデータベースから、ペプチドの配列パターンを検索し、 GiNo等の情報 を取得する。この後、工程 505にて、ペプチドの GiNo等の情報から、そのペプチドは 構成していたタンパク質の関する情報の有無を検索する、タンパク質の情報を有する 場合には、そのタンパク質情報から、 Gene Symbol, GO(biological process), GO(cellular component), GO(molecular fonction)、代表定量値等の機能情報と関 連させることができる。なお、図 15に示す工程図では、図 10の工程 S209にて実行し た、同位体非標識のペプチドと同位体標識のペプチドの波形面積の比を求める工程 を記載していない。しかし、工程 S502にて配列決定された同位体標識および同位 体非標識のペプチドにおいて、各々のペプチドの波形面積を求め、（同位体非標識 ペプチドの波形面積)/ (同位体標識ペプチドの波形面積)の比を算出し、工程 S504 および S505を実行することにより、機能情報と関連させることもできる。なお、波形面 積の比だけでなぐピーク強度比を用いても、同様に、機能情報と関連させることもで きる。
実施例
[0169] 以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではな い。
[実施例 1]
代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を調製するた め、以下の操作を行った。
マウス神経芽細胞種 Neuro2Aを培養した。培地には、 10%牛胎児血清（ MOREGATE社、 BATCH 32300102)、 100U/ml ペニシリン G、 100 g/mlストレプト マイシン（GIBCO社、 15140- 122)を含む RPMI- 1640 (Sigma社、 R— 7130)を用いた。 RPMト 1640としては、 L-グルタミン、 L-リジン、 L-メチォニン、 L-ロイシン、炭酸水素ナ トリウムを含まな 、粉末培地を選択し、当該培地に欠損した成分を加えて調製 (L-グ ルタミン（Sigma社製、 G- 8540)、 L-リジン（Sigma社製、 L- 9037)、 L-メチォニン（Sigma 社製、 M-5308)、炭酸水素ナトリウム（和光純薬、 191-01305)をそれぞれ 0.3g/L、 0.04g/L、 0.015g/L、 2g/Lをカ卩え、さらに、安定同位体で標識された L-ロイシン（ Cambridge Isotope Laboratories社、 CLM- 2262)を 0.05g/L加えた）した。このように して調製した培地を用いて、 5%CO下 37°Cで培養した。この培養によって得られた細
2
胞を、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞として 以下の実験に用いた (実施例 2— 7)。
[0170] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞におけるタ ンパク質量を測定するために以下の操作を行った。
代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞 1.9xl07個を 細胞溶解液 M-PER (PIERCE社、 78501) lmLで可溶化し、遠心分離により不溶性画 分を除去して可溶性画分を調製した。この可溶性画分に含まれるタンパク質量をタン パク質定量試薬 Micro BCA (PIERCE社、 23235)を用いて定量した。その結果、 6.2mg/mLで teつた。
[0171] [実施例 2]
再現性を確認するために、以下の実験を行った。
<測定サンプルの調製 >
サンプルとして、野生型マウス（C57BL/6)および ADAM22遺伝子を欠損させたマウス を複数用意し、それぞれの^ I を摘出し凍結保存した。脳湿重量あたりのタンパク質 量を測定するため、そのうちの 1個の脳湿重量を測定し、さらにプロテアーゼインヒビ ター（コンプリート™ (ロシュ ·ダイァグノスティックス株式会社、製品番号 1 697 498) をサンプルからの抽出液 50 mLあたり 2錠になるように溶解した）を含む
lOmMHEPES- (pH7.4)- ImMDTT- ImMMgCl - ImMNaF- ImM vanadate中でホモジ
2
ナイズし、 100,000xgl時間の遠心分離により可溶性画分を調製した。この可溶性画 分のタンパク質量を測定したところ、脳湿重量 lgあたりタンパク質量 39.4mgとなった。
[0172] 被検体とする脳を解凍して脳湿重量を測定し、上述の脳湿重量あたりのタンパク量 から、被検体のタンパク質量を推定した。そして、実施例 1で得られた代謝的に同位 体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞をタンパク質量が等しくなる ような細胞数（12.1xl07個）加えて、テフロン Rホモジナイザーでホモジナイズし、 500xg
5分間の遠心分離により未破壊の細胞、核などを除去した。次にその上清を 100,000xg 1時間の遠心分離することにより可溶性画分を調製した。
[0173] <サンプルの抽出、分画、精製、消化 >
サンプル中のあるタンパク質が定量できることを確認するために、 cytosolic malate dehydrogenase (cMDH)と親和性を持つことが知られている E70700. Med. Chem. 42, 3789-99, 1999)を固定化したァフィユティーマトリックス（Anal. Chem. 75, 2159-2165, 2003)を使用して、以下の操作を行った。可溶性画分 O.lmLを 0.9mLの PBSで希釈し、 E7070を固定ィ匕したァフィユティーマトリックス 0. lmLと混合して反応さ せた後に遠心分離で上清を除去した。沈殿したァフィユティーマトリックスを PBS、 1 MNaClで洗浄した後、吸着したタンパク質を、 PBS-10mM NADH溶液（NADHは、 Sigma社、 N-8129)で溶出することにより cMDHを回収した。回収した画分を限外ろ過 で濃縮して SDS PAGE(ATTO社製、 e- PAGEL、 E- T520L)にかけて精製し、 cMDH に相当するバンドを切り出してトリプシン（Promega社製， Cat. No. V5111)でゲル 内消化（Rapid Comm Mass Spectrom., 15, 1416-1421, 2001: Rapid Comm Mass Spectrom., 17, 1071-1078, 2003)し消化したサンプルを得た。
[0174] <消化したサンプルの測定 >
消化したサンプルを MALDI- MS (ABI4700, Applied Biosystems社製：
alpha— cyano— 4— hyaroxyl cinnamicacid (し Hし A)をマトリクスとして Dry— droplet法でサ ンプルと共結晶化した)で測定した。得られた結果を基に、フラグメントの同定、ピーク 強度比の算出 (付属のソフトウェアにピーク面積を計算させて、強度比を計算)を行 つた。具体的な計算は、以下のように行った。
[0175] 野生型マウス（Wild)および ADAM22遺伝子ノックアウトマウス（KO)における cMDH について、野生型マウスにおける cMDH由来の非標識ピーク（例えば、 m/z = 1750 のとき、非標識ピーク =12405.31)を内部標準物質における cMDH由来の標識ピーク（ m/z = 1762のとき（ロイシンを 2つ含むため分子量は 12増加する）、標識ピーク = 5373.19)で除することによって、 cMDHにおける非標識ピーク/標識ピーク（
12405.31/5373.19 = 2.308743)を求めた。次に、同じく野生型マウスにおける cMDH由来の非標識ピーク (例えば、 m/z = 1770のとき、非標識ピーク =
4533.977)を内部標準物質における cMDH由来の標識ピーク (m/z = 1776のとき（口 イシンを 1つ含むため分子量は 6増加する）、標識ピーク = 3156.617)で除すること によって、 cMDHにおける非標識ピーク/標識ピーク（4533.977/3156.617 =
1.436341)を求めた。さらに、同じく野生型マウスにおける cMDH由来の非標識ピーク m/z = 1392, 1039についても同様に非標識ピーク/標識ピークの比を求め、それぞ れ 2.435703, 1.750933と算出した。次に、このそれぞれのピーク強度比 2.308743, 1.436341, 2.435703, 1.750933の平均値 1.98293を求め、これを野生型マウスにお ける cMDH由来のピーク強度比とした。
[0176] 一方、 ADAM22遺伝子ノックアウトマウスにおける cMDHの非標識ピーク（非標識ピ ーク = 13011.03)を内部標準物質における cMDH由来の標識ピーク (標識ピーク = 6035.838)で除することによって、該生体分子における非標識ピーク/標識ピーク（ 13011.03/6035.838 = 2.155629)を求めた。同様に非標識ピーク/標識ピークの比 を求め、それぞれ 2.056147, 2.340332, 2.090195と算出した。次に、このそれぞれの ピーク強度比 2.155629, 2.056147, 2.340332, 2.090195の平均値 2.160576を求め、 これを ADAM22遺伝子欠損マウスにおける cMDH由来のピーク強度比とした。
[0177] 次に、野生型マウスにおけるピーク強度比（2.308743)と ADAM22遺伝子ノックアウト マウスにおけるピーク強度比（2.160576)とを比較し、比 0.917778を得た。
この操作を 5回繰り返し、実験間の測定値の変動を検討した。
その結果、ァフィユティー精製と言う実験間の測定値の変動が大き!、ステップを経て いるにも関わらず、 CV値 4.1%という再現性の良い結果を得ることが出来た。 （図 16 および表 1)
[0178] [表 1]
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000063_0002
[表 1] cMDHについて、野生型マウス脳および ADAM22遺伝子欠損マウス脳にお ける代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質とのピーク強度比なら びに内部標準物質に対する野生型マウス脳のピーク強度比と ADAM22遺伝子欠損 マウス脳のピーク強度比との比較における再現性 (n=5)を表して 、る。
[0179] [実施例 3]
目的物質の量の変化に応じて質量分析スペクトル上のピーク強度比が比例的に変 化することを確認するために以下の実験を行った。
<測定サンプルの調製 >
サンプルとして、野生型マウス (C57B6)の^ | を摘出し凍結保存した。脳湿重量を測 定し、プロテアーゼインヒビター（コンプリート™ (ロシュ'ダイァグノスティックス株式会 社、製品番号 1 697 498)をサンプルからの抽出液 50mLあたり 2錠になるように溶 解した）を含む 10mM HEPES-(pH7.4)-lmM DTT-lmM MgCl -ImM NaF-lmM
2
vanadate中でホモジナイズし、 100,000xg 1時間の遠心分離により可溶性画分を調 製した。可溶性画分のタンパク質濃度が 3.7mg/mLになるように調製した。
[0180] 実施例 1で得られた代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含 む細胞 1.9x107個を細胞溶解液 M-PER (PIERCE社、 78501) lmLで可溶化し、遠心分 離により不溶性画分を除去して、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標 準物質を調製した。代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を上 記可溶性画分に対し、 1 : 3、 1 : 1、 3 : 1、 10 : 1の割合で混合して、サンプルの可溶性 画分とした（0.2mLずつ）。
[0181] <測定サンプルの抽出、分画、精製、消化 >
サンプル中のあるタンパク質が定量できることを確認するために、 cytosolic malate dehydrogenase (cMDH)と親和性を持つことが知られている E70700. Med. Chem. 42, 3789-99, 1999)を固定化したァフィユティーマトリックス（Anal. Chem. 75, 2159-2165, 2003)を使用して、以下の操作を行った。サンプルの可溶性画分 0.1 mL を 0.9mLの PBSで希釈し、 E7070を固定化したァフィユティーマトリックス 0. lmLと混合 して反応させた後に遠心分離で上清を除去した。沈殿したァフィユティーマトリックス を PBS、 lMNaClで洗浄した後、吸着したタンパク質を、 PBS-lOmM NADH溶液（ NADHは、 Sigma社、 N-8129)で溶出することにより cMDHを回収した。回収した画分 を限外ろ過で濃縮して SDS PAGE (ATTO社製、 e- PAGEL、 E- T520L)にかけて精製 し、 cMDHに相当するバンドを切り出してトリプシン（Promega社製， Cat. No. V5111 )でゲル内消化（Rapid Comm Mass Spectrom., 15, 1416-1421, 2001: Rapid Comm Mass Spectrom., 17, 1071-1078, 2003)し、消化したサンプルを得た。
[0182] <測定サンプルの測定 >
消化したサンプルを MALDI- MS (ABI4700, Applied Biosystems社製：
alpha— cyano— 4— hyaroxyl cinnamicacid (し Hし A)をマトリクスとして Dry— droplet法でサ ンプルと共結晶化した)で測定した。得られた結果を基に、でフラグメントの同定、ピ ーク強度比の算出 (付属のソフトウェアにピーク面積を計算させて、強度比を計算)を 行った。その結果、ピーク強度比はサンプル量に比例した直線となり（R2=0.97)、非 常に精度良く定量することが可能であった（図 17および 18)。
[0183] [実施例 4]
動物組織由来のサンプル間の比較にぉ 、て、本法が適用できることを確認するため に以下の実験を行った。
<測定サンプルの調製 >
可溶性画分のタンパク質濃度が 3.7mg/mLになるように調製した。
サンプルとして、野生型マウス（C57B6)および ADAM22遺伝子を欠損させたマウス（ 系統、ブリーダー）を用意して、それぞれの^ I を摘出し凍結保存した。次に、脳を 解凍して脳湿重量を測定し、実施例 1で得た脳湿重量あたりのタンパク質量から、サ ンプル中のタンパク質量を算出した。そして、実施例 1で得られた代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質を含む細胞をタンパク質量が等しくなるような 細胞数カ卩えて、テフロン Rホモジナイザーにてホモジナイズし、 500xg 5分間の遠心分 離により未破壊の細胞、核などを除去した。次に、その上清を 100,000xg 1時間の遠 心分離することにより可溶性画分を調製した。タンパク質量を測定したところ、野生型 マウス由来のタンパク質は 3.02mg/mL、 AD AM22遺伝子を欠損させたマウス由来のタ ンパク質は 3.12mg/mLであった。これを分画したサンプルとした。 続、て、各分画したサンプルにっき 2mLずつ（lmLチューブ 2本ずつ）にっき以下の 操作を行った。尿素（Bio- Rad社 Cat. No. 161- 0731)を加えて 8Mとし、 lmLあたり 3mgのデイチオスレィトール (和光純薬 Cat.No. 045-08974: DTT)をカ卩えた 0.5M Tris緩衝液 (pH8.3, Sigma社製） 500 μ Lを各分画したサンプルに加え、 37度で 3時間 インキュベーションすることでタンパク質中のシスティン残基を還元した。その後、尿 素を加えて 8Μとし、 8mgのアクリルアミド (Bio- Rad社製 Cat. No. 161- 0107)をカ卩えた 0.5M Tris緩衝液 (pH8.3) 500 μ Lを、各分画したサンプルカ卩えて室温で 3時間イン キュベーシヨンしてシスティン残基をアルキル化した。そこに 8mgの DTTをカ卩えること で過剰のアクリルアミドを失活させた。分子量 1万カットの SnakeSkin (ピアス社、 Cat. No.68100)を使い、 1000倍量の 10mMの炭酸水素アンモ-ゥム緩衝液により、 4°Cにて 、 1昼夜透析することにより還元アルキルィ匕試薬を除去し、当該分画したサンプルを 野生型マウス由来のタンパク質、 ADAM22遺伝子を欠損させたマウス由来のタンパク 質それぞれ 2本ずつのチューブに分け、 SpeedVacにて凍結乾燥した。この各分画し たサンプルを 8Mの尿素を含む 0.2%ベータ'ォクチルダルコシド水溶液 200 μ Lで再 溶解し、 50mMの炭酸水素アンモ-ゥムで 5倍に希釈し、計 lmLとした。タンパク質量 0.3mgに対して 100 Lのトリプシン（プロメガ社製、 Cat. No. V5111)をカ卩えて 37°Cに て 24時間消化を行った。ここで消化したサンプルを得た。この各消化したサンプル（ 野生型マウス由来のタンパク質、 ADAM22遺伝子を欠損させたマウス由来のタンパク 質）を各 1本ずっァ-オン交換カラム（Mini- Q PC 3.2/3: Amersham Biosciences Cat. No. 17- 0686- 01)およびカチオン交換カラム (Mini- S PC 3.2/3: Amersham Biosciences Cat. No. 17- 0687- 01)にアプライし、 1分ごとに分取を行った。ァ-ォ ン交換カラムの場合には、消化したサンプルに 50 Lのアンモニア水と 0.5mLの超純 水をカ卩えて 2万 Gで 1分間遠心し、上清をァ-オン交換カラムに注入した。一方、カチ オン交換カラムの場合には、消化したサンプルに 50 Lのギ酸と 0.5mLの超純水を加 えて 2万 Gで 1分間遠心して上清をカチオン交換カラムに注入した。 HPLC条件は、流 速が毎分 0.2mL、 UV検出波長が 235nm & 280nm、カチオン交換カラムの場合には 、移動相 Aが 25mMのギ酸に 5%ァセトニトリル、移動相 Bが 1Mのギ酸アンモ-ゥムで pH3.5、 5%ァセトニトリルとした。ァ-オン交換の場合には、移動相 Aが 25mMのアン モユアに 5%ァセトニトリル、移動相 Bが 1Mの酢酸アンモ-ゥムで pH8.6に 5%ァセトニ トリルとした。グラディエントは、最初 5分間が 100%移動相 Aで、その後 40分かけて移 動相濃度を直線的に 40%まで増加させ、その後 15分間で移動相 Bを 100%として 5分 間流した。カラム力も溶出してくる各フラクションを、 TFAをカ卩えることにより酸性とし、 あらかじめァセトニトリルで洗浄後 0.1%TFA水でコンディショニングしておいた
ZipTipC18 (ミリポア社製 Cat. No. ZTC18S960)にアプライした。続いて、 5%ァセト 二トリルを含む 0.1%TFA 水 20 μ Lで 3回洗浄し、 5 μ Lの 70%ァセトニトリルを含む 0.1 %TFA水で溶出することにより脱塩した。ここで、 HPLCにより分離したサンプルを得 た。
次に、この HPLCにより分離したサンプルを 95 μ Lの 0.1%TFA水で希釈して
LC(C18column)/MS (ThermoFinnigan LCQ) で測定を行った。このときの条件は、 HPLC側としては Michrom BioResources Inc社の Magic C18カラム 0.2xl50mm (Cat.
No. 902-61261-00)に移動相 Aとして 5%ァセトニトリルと 0.01 %TFAを含む 0.2%酢 酸水、移動相 Bとして 95%ァセトニトリルと 0.01%TFAを含む 0.2%酢酸水を用いて、 最初の 1分間は 100%移動相 Aとして、その後 35分間で移動相 Bを直線的に 40%とし 、その後 0.1分間で移動相 Bを 100%にして 7分間維持、その後移動相 Aを 100%として 14分後に次のサンプルを注入した。装置には島津製作所の LC-10Aシリーズの ROM をミクロ対応として、また、ミキシングチャンバ一としては付属の島津製作所製を外し てノ レコ社の Tコネクターを採用した。流速としては Flow-splitting方式を採用し、カラ ムには約毎分 1 2 Lの流速となるように調整した。サンプルを CTC社のオートサンプ ラー PALによって 50 μ L注入し、サンプルを一度インジェクターのサンプルループに 組みこんだペプチド用キヤピラリートラップカラム (Michrom BioResource社
Cat.No.004-25109-32)で濃縮した後に分析カラムに送り込んだ。質量分析装置は、 ThermoFinnigan社の LCQ Duoに AMR社に特注した、シーズガスを使用しない、そし て XYZステージによってスプレー位置を任意に調整できる低流速対応のサブナノス プレイヤーを装着し、かつ、スプレーにはメタル-一ドル（GLサイエンス社製 (カタログ 番号 7820-59001)を C18カラムに直接つないで使用した。 ESI電圧としては 2.6kVを印 カロした。 1 J疋は、 Data Dependentモ ~~ドで Dvnamic Exclusionの Repeatを 1とした。 なお、スキャン回数を稼ぐために Zoom Scanモードを外したいわゆるダブルプレーモ ードで測定した。
[0186] 得られたデータについては、 SonarMSMS (Genomic solution社)および NCBInrデ ータベース用いてタンパク質の自動同定を行った。このとき、安定同位体で標識した ロイシン（ロイシン 1つにつき分子量 6の増力 [])でも NCBInrに対して検索できるように、 プログラムの一部を改変した。定量はロイシンを含むペプチドのピークで行うため、 SonarMSMSにより同定されたペプチドのうち、ロイシンを含むペプチドのみ選び出し、 かつ、そのペプチドピークの溶出位置（HPLCでの保持時間 =質量分析でのスキャン 番号）を特定するために LCQ Duoの付属ソフトである LCQ_dta.exeファイルからスキ ヤン情報を自動で選び出すソフトウェアを構築した。そして、そのスキャン番号の情報 から、そのスキャン番号の質量分析スペクトルを抜き出し、天然型ロイシンペプチドの ピークと同位体ペプチドのピークにっ 、て、 MS/MSを測定した際の親イオンの情報 (m/z値)とそのペプチド内に何個のロイシンがあるカゝ、そして電荷は何個かを
SonarMSMSでの検索結果力も求めて、ペアとなるピークを探し、そのピーク強度比を 自動計算した。このように構築した、本発明に係る解析ソフトウェアを用いてタンパク 質の同定およびピーク強度比の算出を行った。また、サンプル中に存在し、かつ、質 量分析により同定されていて、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準 物質に存在しな ヽタンパク質につ ヽては、そのペプチドが同定された質量分析スぺ タトルと同じ又は近い Scan番号に存在する、代謝的に同位体標識された生体分子で ある内部標準物質由来のペプチドピークとのピーク強度比を求めた。続いて野生型 マウスの^ I と ADAM22遺伝子を欠損させたマウスの^ | との間で可溶性画分に含 まれるタンパク質量について、先に求めたピーク強度比を比較することで算出した。
[0187] 図 19一図 22は、本発明による実施例 5にて得られたタンパク質の同定結果を示す その結果、複数の生体分子 (f列えば、 protein phosphatase 2a, myotrophin, heat shock protein 1, protein phosphatase PP2A, glyceraldehyde— 3— phosphate dehydrogenase, ADP— ribosylation factor, cofilin, tubulin— beta等)力 S同疋 れ、後 述するように、網羅的に相対定量することができた。 [0188] 図 23ないし 26は、前述のタンパク質の同定結果に基づき、本発明による波形分離 処理を施した、固有なタンパク質に由来する波形面積の比の結果を示す。
ロイシンを含むタンパク質を例として、本発明に係るプロテオーム解析にっ ヽて説 明する。図 19に示す、 protein phosphatase 2aに由来するタンパク質の質量分析結 果より、 m/z値が 644. 7の同位体標識されていないロイシンを含むタンパク質に由来 するピークに着目した（図 19中にて Lで示される)。なお、本ピークがロイシンに由来 するものであることは、前述の MS/MS処理力も判明している。つまり、前述の説明に て、図 10に示す工程 S200— S203は、既に実行されている。
[0189] 図 23は、時間、つまり、特定の連続したスキャン番号における質量分析スペクトル を示す図である。図 23に示す結果から、 644. 7である m/z値がスキャン 2で極大を むかえ、その後、減衰していることが、ピークの高さの変動から分かる。
[0190] 図 24は、図 23に示すスキャン番号を、必要な数だけ連続してつなぎ合わせた結果 のマスク口マトグラムを示す。具体的には、図 24は、中心を 644. 7として（m/z値： 64 4. 2— 645. 2)、スキャン番号 975— 1005までの質量分析スペクトルをつなぎ合わ せて作成したマスク口マトグラムを示す。
[0191] 以上の操作は、前述の解析ソフトにより、必要なスキャン情報を呼び出して実行す ることは可能であることは、当業者には容易に理解できる。
[0192] 次に、同位体標識されたロイシンを含むタンパク質に由来するピークに着目した。こ の場合、同位体標識されたロイシンは、非標識のタンパク質よりも 6/zだけ分子量が 大きい。ここで、 zとは、タンパク質が有する電荷のことである。図 19に示す質量分析 スペクトルの結果から、図 10の工程 S204にて、電荷が 3である protein phosphatase
2aの同位体標識されたロイシンに由来する質量分析スペクトルの m/z値力 644. 7 + 6/3 = 646. 7の質量分析スペクトルのピークに着目し、実測された質量分 析スペクトル力も抽出した（図 10の工程 205)。なお、図 19中において、同位体標識 されたロイシンを含むタンパク質に由来する質量分析スペクトルを Hで表示する。
[0193] 図 25は、図 23に示すスキャン番号を、必要な数だけ連続してつなぎ合わせた結果 のマスク口マトグラムを示す。具体的には、図 24は、中心を 646. 7として（m/z値： 64 6. 2— 647. 2)、スキャン番号 975— 1005までの質量分析スペクトルをつなぎ合わ せて作成したマスク口マトグラムを示す。
[0194] 通常、特定の m/z値におけるマスク口マトグラムは、単一のロイシンを含むタンパク 質に由来するものであるならば、単一のピークが観測されるはずである。しかしながら 、図 24および図 25に示す結果から、複数のピークが観測された。
[0195] そこで、本発明において、固有のタンパク質に由来するマスク口マトグラムを得るた めに、図 24および図 25で得られた質量分析スペクトルの波形分離処理を、図 10の 工程 S206にて、以下のように行った。すなわち、ガウシアン関数とローレンツ関数と を組み合わせて曲線適合法により、波形分離処理を実行した。
[0196] 図 26は、本発明による波形分離処理の結果を示す。図 26中の（A)は、図 19に示 す野生型マウス脳（Wild)由来の protein phosphatase 2aの Lで表示されるマスクロマ トグラムの波形分離処理の結果であり、一方、図 26中の（B)は、図 19に示す野生型 マウス脳（Wild)由来の同位体標識された protein phosphatase 2aの Hで表示される マスク口マトグラムの波形分離処理の結果である。実測された L及び Hのマスク口マト グラムは、各々、 5つの固有のタンパク質に由来するマスク口マトグラムの重ね合わせ であることが判明した。
[0197] 図 26 (A)に示す波形分離後の波形 1ないし波形 5において、各波形の面積を、積 分により算出することができる。同様に、図 26 (B)においても、波形分離後の波形 6 ないし波形 10において、各波形の面積を、積分により算出することができる（図 10の 工程 S 207)。
[0198] 必要に応じて、以上の説明力も得られた解析結果を、図 9に示す記録部 100に保 存をすることができる。このように算出した波形面積を、同位体標識したアミノ酸を含 むタンパク質由来の波形と、同位体非標識のアミノ酸を含むタンパク質由来の波形と の比を観測することにより、細胞中で発現されている、アミノ酸配列を同定した特定の タンパク質の経時変化を、同位体標識されたアミノ酸を含むタンパク質との比から、定 量的に追跡することが可能となる。
[0199] 図 27は、本発明の解析方法により得られた結果を示す図である。図 27では、代謝 的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来のピークに対する野生型 マウス脳 (Wild)由来および ADAM22遺伝子欠損マウス脳（K/0)由来のピーク強度 比を算出するにあたって、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質由来の同一配列のピークを用いた場合および別の配列のピークを用いた場合に おいて、野生型マウス脳 (Wild)由来および ADAM22遺伝子欠損マウス脳（Κ/Ο)由 来のピーク強度比の比較したものを示す。
絶対定量ができることを確認するために以下の実験を行った。
[0200] [実施例 5]代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中 の HSP60の定量（ELISAで定量した例）
代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の HSP60 の定量は、 Hsp60 ELISA Kit (Stressgen社、 EKS- 600)を用いて行った。実施例 1で 得られた代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を PBS (Sigma社、 D-8537)で洗浄し、細胞 3.75xl07個を Hsp60 ELISA Kitに添付され ている溶解液 3mLで溶解して、その遠心上清を可溶性画分とした。以下、定量操作 は Hsp60 ELISA Kitの説明書にしたがって行った。その結果、可溶性画分中の HSP60濃度は 480ng/mLと求められた。よって、代謝的に同位体標識された生体分子 である内部標準物質を含む細胞 3.75xl07個には 1440ngの HSP60が存在することが算 出された。
[0201] この値を元に、野生型マウス脳中の HSP60の定量を行った。脳 lgから抽出されたタ ンパク質量は 39.4mgであり、同タンパク質量の代謝的に同位体標識された生体分子 である内部標準物質を含む細胞（12.1X107個）を加えたので (実施例 2)、サンプルに 加えた代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の HSP60量とし ては、 12.1χ107個 X 1440 ng/3.75xl07個 = 4636ngとなる。一方、質量分析における 野生型マウス脳由来の HSP60 (配列 LPDGVAVLK)と代謝的に同位体標識された生 体分子である内部標準物質由来の HSP60のピーク強度比は、 6.8であった。よって、 野生型マウス脳 1 gあたり 4636ng X 6.8 = 約 32 gの HSP60が存在したことが算出さ れた。
[0202] したがって、この代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む 細胞を用いることによって、質量分析による測定において、絶対定量を行うことができ ることが明らかになった。 [0203] [実施例 6]代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞 中の cMDHの定量 (精製酵素標品の比活性を指標にした例）
実施例 1で得られた代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含 む細胞 1.9 107個を\1-?51? (^61^社、 78501) lmLにて溶解しその遠心上清を可溶性 画分とした。
[0204] <標準物質の調製 >
標準物質として用いる cMDHは、以下のようにして調製した。ヒト cMDH遺伝子をクロ 一ユングし、その N末端側に FLAGタグを挿入したものを、バキュロウィルスベクターに 組み込んだ。そして、そのベクターを持つバキュロウィルスを、 S19細胞に感染させて 培養した。培養した細胞を遠心分離で回収し、その沈殿を- 80°Cで凍結後再融解し、 25mLの PBSで懸濁させて cMDHを抽出した。抽出後、不溶性画分を遠心分離により 除去し、その上清を粗抽出液とした。 cMDHの精製は、 Anti FLAG M2 Agarose ( Sigma社、 A-2220) 1.5mLに粗抽出液をアプライし、 10mLの PBSで洗浄した後に、 5mL の FLAG PEPTIDE (Sigma社、 F- 3290)溶液（0.1mg/mL in PBS)で溶出した。溶出 主画分のタンパク質濃度は、 0.4mg/mLであった。この画分を標準 cMDH標品として 定量に用いた。
[0205] <比活性の測定 >
cMDH活性の測定は、以下の反応用溶液に cMDH溶液 1 μ Lを加え、 NADHに由来 する 340應の吸光度の減少を、分光光度計 (アマシャムバイオサイエンス社、 Ultrospec 4300 pro)を用いて経時的に測定し、 1分間あたりの吸光度の減少を cMDH活性とした。その結果、 cMDH濃度 0.02mg/mLの溶液 1 μ Lを用いたときの吸光 度の減少が 0.068/分、可溶性画分 1 μ Lを用いたときの吸光度の減少が 0.057/分で めつに。 反応用緩衝液 10mM Tris-HCl(pH7.4)-0.15M NaCl 0.98mL ォキザ口酢酸（和光純薬、 Lot.SEH1972) 10mM水溶液 O.OlmL
NADH (Sigma社、 Lot.l02K701) lOmM水溶液 O.OlmL
反応用溶液 1 mL この測定結果から、以下のように、野生型マウス脳中の cMDH濃度を定量した。 可溶性画分中のタンパク質量は 6.2mg/mLである（実施例 1)。また、可溶性画分中の 溶液に対する cMDH濃度は 0.057/0.068 x 0.02mg/mL = 0.0167mg/mLである。よ つて、可溶性画分中のタンパク質量に対する cMDH濃度は、 0.0167/6.2 =
0.0027mg/mg、と算出される。
[0206] また、質量分析による測定 (実施例）における野生型マウス脳由来の cMDHと代謝 的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来の cMDHとのピーク強度 比は約 2.0であった (表 lWild)。よって、野生型マウス脳由来の可溶性画分中のタン パク質量に対する cMDH濃度は、 0.0027 x 2 = 0.0054mg/mgとなる。また、野生型 マウス脳 lgあたり 39.4mgのタンパク質を含んでいる（実施例 2)。したがって、野生型 マウス脳 lgあたり 39.4 X 0.0054 = 0.21mgの cMDHが存在したことを算出できた。
[0207] したがって、この代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む 細胞を用いることによって、質量分析による測定において、絶対定量を行うことができ ることが明らかになった。
[0208] [実施例 7]生体分子の絶対定量 (合成ペプチドを用いた例）
実施例 1で得られた代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含 む細胞 1.9xl07個を、 M-PER (Pierce社、 78501) lmLで溶解しその遠心上清を可溶性 画分とした。
<合成ペプチドの調製 >
以下に掲げる 5種類の合成ペプチドは、ペプチド研究所株式会社 (大阪）に依頼し標 品を得た。 SQIHDIVLVGGSTR(heat shock 70kDa protein 8 isoforml),
HFSVEGQLEFR (heat shock protein 90- beta), HLIPAANTGESK(14- 3- 3 epsilon), SYELPDGQVITIGNER (mutant beta- actin (betaし actnv,
ELEAELEDER(Myosin heavy chain, nonmuscle type B)。これら合成ペプチド各 2pmolを先の可溶性画分に添加した。可溶性画分 (990ng/mL)と合成ペプチド (91nmol/mL)の混合溶液 3mLを LC/MSMS (アプライドネ土製 QSTAR PULSAR i)により 測定した。測定条件は以下の通りである。 [0209] < LC条件 >
ォートサンプラー： HTS-PAL(CTC Analytica社製）
ポンプおよびコントローラー： LC-lOAvp 2台（高圧グラジェントシステム）
，SCL- ΙΟΑνρ (島津製作所製）
フロースプリツター：3方ティー（GLサイエンス社製）に抵抗管（内径 m長さ l50mm のフューズドシリカキヤビラリ一、 GLサイエンス社製）をつけたもの。
カラム：エレクトロスプレー用ニードル（New Objective社製、内径 0.1mm, 長さ
0mm,先端径 8 μ m、導電物質被覆なし）に逆相系充填剤（ReproSil- Pur 120
C18-AQ, Dr.Maisch社製）をスラリー充填したもの。
移動相： (A) 0.5%酢酸水溶液、（B) 0.5%酢酸水溶液, 80%ァセトニトリル
流速： 0.06mL/min (ポンプ出力値）、 250nL/min (スプリット後）
グラジェント溶出条件：
[0210] [表 2]
Figure imgf000074_0001
測定時間： 110分
質量分析条件： ESIインターフェース： nanoelectrospray用（プロタナ社製）
MS スキャン: 350- 1400 amu, 1.0秒
MSMS スキャン: 1回の MSスキャンにっき最大 4回， 85-1400 amu, 各 1.5秒、 測定時間： 110分
スプレー電圧： 2400V
[0211] ペプチド配列の同定は、 MS/MSスペクトルをデータベース検索エンジン
ascot(MatrixScience, London)に出力して行った。タンパク質データベースには NCBIタンパク質データベース（http：〃 www4.ncbi.nlm.nih.gov/)を用いた。定量は質 量分析スペクトル上のピーク強度比を用いて行った。可溶性画分中の代謝的に同位 体標識された生体分子は、ロイシンが安定同位体13 Cx6個で標識されているため、添 カロした合成ペプチド由来のピークと質量分析スペクトル上において、容易に区別でき る。
[0212] また、ピーク強度比力も計算した値を基に、可溶性画分中に存在していた各タンパ ク質の絶対量にっ 、て表 3に示した (右端 wt%：可溶性画分中に含まれて 、る割合） [0213] [表 3]
Protein Peptide Ratiodabeレ unlabel: ProteinCfmoi/uL) MW(kD) ng/uし Wt% heat shock 70kDa protein 8 isoforrr SQIHDIVLVGGSTR 1.36 123.64 70.97 8.77 0.88 heat shock protein 90-beta HFSVEGQLEF 1.65 150.00 83.42 12.51 1.26
14-3-3 epsilon HLIPAANTGESK 0.24 21.82 29.32 0.64 0.06 mutant beta-actin (beta'-actin) SYELPDGQVITIGN 3.47 315.45 41.98 13.24 1.34
Myosin heavy chain, nonmuscle tyf ELEAELEDE 0.058 5.27 229.48 1.21 0.12
[表 3] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質に発現していた 各タンパク質の絶対量につ!、て測定結果を表す。
一方、実施例 4に示したように、野生型マウス脳由来のタンパク質と代謝的に同位 体標識された生体分子である内部標準物質由来の当該タンパク質とのピーク強度比 が求められる。そして、野生型マウス脳と代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞は、それぞれタンパク質量が同じになるように混ぜて測定 している（実施例 4)。また、マウス脳 lgあたりのタンパク質量は、 39.4mgである（実施 例 2)。よって、マウス脳 lgに含まれている絶対量は表 4のように算出することができた
[0215] したがって、この代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む 細胞を用いることによって、質量分析による測定において、絶対定量を行うことができ ることが明らかになった。
[0216] [表 4]
Figure imgf000076_0001
[表 4] 野生型マウス脳および ADAM22遺伝子欠損マウス脳中の各タンパク質の絶 対量につ ヽて測定結果を表す。
[0217] 以上のように、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細 胞中の各タンパク質について絶対定量しておくことによって、網羅的に生体分子を絶 対定量することができた。
[0218] 次に、実施例 4にて得られた波形分離後の質量分析スペクトルに関するデータ、特 に、定量値の値と、機能情報との関連付けについて説明する。
[実施例 8] まず、実施例 4で例示したように、波形分離後の一つ又は複数の配列に着目した。 図 28は、本発明の一の実施例において着目した波形分離後の配列と、その配列の 定量値を示す図である。具体的には、本実施例では、（1)
ALVLELCCNDESGEDVEVPWRゝ
(2) KPLLESGTLGTK, (3) NFPNAIEHTLQWAR, (4) YFLVGAGAIGCELLK,の 4 つの配列に着目した。また、図 28に示す定量値は、力かる配列毎の値を表す。なお 、同位体標識は、安定同位体で標識された L-Leudneを用いて行われた。図 28に示 すように、配列： NFPNAIEHTLQWAR および配列： YFLVGAGAIGCELLKには、同 一のペプチドに対して複数の定量値が算出されている。
[0219] 図 28に示すペプチド配列に基づき、外部データベース、具体的には、 NCBInrデー タベースへ照合し、かかるデータベースにて、 HomoSapiensにてパターン検索を実行 した。その結果、検索対象である各配列に対して同定タンパクの GiNoが得られた（図 29参照）。検索対象とした全ての配列において、（l) giI23510340IreflNP_695012.1I、 (2) giI35830IembICAA40296.1I、 (3) giI24485IembICAA37078.1Iが同定された。この 3つの GiNoに対して、 LocusLinkにて検索すると、 LocusID = 7317に集約された。こ の LocusIDに対して、図 30に示す結果が得られた。
[0220] 一方、 LocusID = 7317のタンパク質について、 L- Leucineにて同位体標識された 場合の、（LocusID = 7317のタンパク質の波形面積)/ (同位体標識された LocusID = 7317の波形面積）の定量値は、 1.10726332649であった。この値は、図 28に示す 各ペプチド配列にて得られた値とは相違する力 タンパク質の定量値として採用し、 各タンパク質毎に、この定量値を用いれば、機能が公知のタンパク質と定量値の関 連付けをすることができる。なお、本発明では、質量分析のために、予めサンプルを 酵素等で消化させ分解して 、るため、実際にタンパク質自体の質量分析スペクトル は測定されていない。しかし、タンパク質自体の質量分析スペクトルが測定されたと 仮定した場合、タンパク質の定量値と生物学的機能との関連性を示唆する情報を提 供することができる。
[0221] [実施例 9]
<合成ペプチドの調製 > 以下に掲げる 114種類の合成ペプチドのうち、 8種類はペプチド研究所株式会社（ 大阪）から入手した。残り 106種類（少なくとも 1つの Leu,ひとつの Tyrを含むもの）は、 島津 PSSM-8ペプチド合成機を用いて自家合成した。合成法および切り出し法は装 置に付属の F-moc用プロトコールに従った。以下に示す HPLC条件で分画した後、目 的画分の質量数を MSで確認した。さらに目的画分を HPLC- UV(280nm)で分析し、主 ピークのピーク面積と Tyrのモル吸光係数より溶液濃度を算出した。
く分取 HPLC条件〉
LCシステム (オートサンプラー、ポンプ、 UV検出器、フラクションコレクター、コント口 一ラー）： LClOAvp (島津製作所製）
カラム： YMC- Pack Pro C18 (10mm径、 150mm長）
移動相： (A) 0.1%トリフルォロ酢酸水溶液、（B)ァセトニトリル
流速： 4mL/min
検出器波長： 220 nm
グラジェント溶出条件：
[表 5]
Figure imgf000078_0001
測定時間: 20分
<分析 HPLC条件 >
流速、カラム径、検出器波長以外上記と同じ, カラム： YMC- Pack Pro C18 (4.6mm径、 150mm長）
流速： lmL/min
検出器波長： 280 nm
[0224] こうして得られた合成ペプチド各 2 pmolを先の可溶性画分に添加した。可溶性画分 (990 ng/mL)と合成ペプチド (91 nmol/mL)の混合溶液 3 mLを LC/MSMS (アプライド 社製 QSTAR PULSAR i)により測定した。さらに、合成ペプチド含量を 5倍および 5分 の 1にした混合溶液を調製し、同様に測定した。測定条件は以下の通りである。
[0225] [表 6]
Figure imgf000079_0001
測定時間： 110分
MS条件：
ESIインターフェース： nanoelectrospray用（プロタナ社製）
MSスキャン： 350-1400 amu, 1.0秒
MSMSスキャン： 1回の MSスキャンにっき最大 4回， 85-1400 amu,各 1.5秒、 測定時間： 110分
スプレー電圧： 2400V [0227] ペプチド配列の同定は、 MS/MSスペクトルをデータベース検索エンジン
Mascot(Matrix Science, London)に出力して行った。タンパク質データベースには SwissProtタンパク質データベース（http：〃 kr.expasy.org/sprot/)を用いた。定量は 質量分析スペクトル上のピーク強度比を用いて行った。可溶性画分中の代謝的に同 位体標識された生体分子は、ロイシンが安定同位体13 Cx6個で標識されて 、るため、 添加した合成ペプチド由来のピークと質量分析スペクトル上において、容易に区別 できる。
[0228] また、ピーク強度比力も計算した値を基に、可溶性画分中に存在して!/ヽた各タンパ ク質の絶対量について表 4に示した（右端 Cone in neuro2a: neuro2a可溶性画分タン ノ ク質 lmg当たりに含まれて 、る割合)。
[0229] [表 7]
[8¾
Figure imgf000081_0001
6ん
OL£LlO/tOOZdr/lDd 88T0S0/S00Z OAV [em
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08
/.£Il0/t00Zdf/13d 881 S0/S00Z: OAV [Οΐ挲]
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18
請 Zdf/ェ:) d 88T0S0/S00Z OAV
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L£Ll0/P00Zdr/13d 8810S0/S00Z OAV
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[表 7から表 11] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質に発現 して 、た各タンパク質の絶対量にっ 、て測定結果を表す。
一方 実施例 4に示したように、野生型および ADAM22ノックアウトマウス脳由来のタ ンパク質と代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来の当該タ ンパク質とのピーク強度比が求められる。そして、マウス脳と代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質を含む細胞は、それぞれタンパク質量が同じにな るように混ぜて測定しており、重量混合比は既知である（実施例 4)。よって、マウス脳 lmgに含まれている絶対量は表 8のように算出することができた。したがって、この代 謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を用いることによ つて、 MSによる測定において、絶対定量を行うことができることが明らかになった。
[表 12]
[ει挲]
Figure imgf000087_0001
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L£Ll0/P00ZdT/13d 8810S0/S001 OAV mm
Figure imgf000088_0001
Figure imgf000088_0002
98
L£Ll0/P00Zdr/13d 88T0S0/S00Z OAV [ST¾
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oz.ez.io/i700idfx3d 8810S0/S00Z OAV [ ]
Figure imgf000090_0001
88
L£Ll0/ 00ZdT/13d 88T0S0/S00Z OAV
Figure imgf000091_0001
[表 12から表 16] 野生型マウス脳および AD AM22遺伝子欠損マウス脳中の各タン パク質の絶対量につ!、て測定結果を表す。
[0232] 以上のように、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細 胞中の各タンパク質について絶対定量しておくことによって、網羅的に生体分子を絶 対定量することができた。
産業上の利用可能性
[0233] 本発明により、代謝的に標識することができないサンプルを含む、組織、生体液、 細胞、細胞器官、タンパク質複合体などのサンプル中の 1若しくは複数の生体分子を 精度よく定量することが可能となった。
[0234] すなわち、従来の in vivo標識法では、培養条件に影響を受けないような限られた 細胞でしか実施できなかったが、本発明では、代謝的に同位体標識された生体分子 である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質 を含む細胞をサンプルに加えるため、培養できる細胞に限られることなぐ代謝的に 標識することができないサンプルを含む、組織、生体液、細胞、細胞器官、タンパク 質複合体などのサンプル中の 1若しくは複数の生体分子を定量することが可能となつ た。
[0235] また、従来の in vitro標識法では、サンプルの消ィ匕、分画、精製など前処理段階で の実験ごとに定量値が変動することの補正はできな力つたが、本発明では、サンプル の消化、分画、精製などを行う前に代謝的に同位体標識された生体分子である内部 標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細 胞を加えるため、サンプル中の 1若しくは複数の生体分子を精度よく定量することが 可能となった。
[0236] 本発明により、 3個以上のサンプル間の比較が容易になった。すなわち、これまで の定量的プロテオーム解析法は、内部標準物質と被検体とを直接比較して 、たため 、測定のたびにサンプル調製を行う必要があった。さらに、測定対象が変わると標識 すべき内部標準物質も変わるため、その都度、標識についての条件検討を行う必要 があり、また、実験間の比較もできな力つたが、本発明では、代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞を保存し、適宜、用いることにより、実験間のデータ比較、 例えばある実験データに対し、一定期間経過後（例えば、 1ヶ月後、 1年後等）に比較 データを得て解析することが可能となる。さらには、使用した代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞を譲渡又は貸し渡しすることにより、今まで不可能であった 研究者間のデータ比較が可能となる。
[0237] 本発明により、あらかじめ代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の 生体分子の濃度を算出しておくことにより、生体分子の絶対定量が可能となった。代 謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質、又は代謝的に同位体標識 された生体分子である内部標準物質を含む細胞を譲渡又は貸し渡しすることにより、 研究者間のデータ共有ィ匕が可能となる。
[0238] さらに、本発明による解析装置および解析方法によれば、固有の生体分子に由来 する質量分析スペクトルを得ることができ、生体内の細胞で時々刻々変化する生体 分子の発現量を定量的に解析することが可能となる。さらにまた、本発明によるプロ グラムにより、前記解析方法を、コンピュータに実現させることができる。
[0239] くわえて、本発明によれば、タンパク質における（同位体非標識のタンパク質)/ (同 位体標識されたタンパク質)と 、う定量値と機能情報とを関連付けることが可能となる
[0240] 従来の方法 (AQUA法)では、サンプルに対して、合成ペプチドを添加するため、分 画、抽出、精製、消化 (特にゲル内消ィ匕）の過程におけるタンパク質の回収率の低さ により、精度のよい定量値が得られな力つた。一方、本発明の方法では、サンプルに 対して、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質または代謝的に 同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を添加するため、分画、 抽出、精製、消化 (特にゲル内消化)の過程におけるタンパク質の回収率の影響を受 けず、精度よく再現性の高い定量値を得ることが可能となった。
[0241] また、従来の方法では、サンプルに対して、合成ペプチドを添加するため、定量で きるペプチドは、合成ペプチドと同一の配列を有するペプチドのみである。そのため 、当該ペプチドの測定結果の誤差により、タンパク質の定量値が大きく影響を受ける こととなる。一方、本発明の方法では、代謝的に同位体標識された生体分子である内 部標準物質または代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む 細胞中の生体分子を定量しておき、サンプルに対して、当該代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質または代謝的に同位体標識された生体分子であ る内部標準物質を含む細胞を添加するため、定量できるペプチドは、合成ペプチドと 同一の配列を有するペプチドのみならず、当該ペプチドが構成して 、たタンパク質 由来のその他のペプチドについても定量することができる。そのため、一つのタンパ ク質に対し、複数のペプチドによって定量するため、個々のペプチドの測定結果の 誤差により、タンパク質の定量値が大きく影響を受けることがなぐ精度よく再現性の 高い定量値を得ることが可能となった。
[0242] さら〖こは、ペプチド合成機は、 10倍過剰量の試薬を用い、し力も合成スケールがマ イクログラム力もミリグラム単位となる。そのため、同位体標識されたペプチドの合成は 、非常に高価となり、従来の方法で網羅的な定量することはコストの面で難しい。一 方、本発明の方法では、生体分子の同位体標識は、細胞培養によって行うので、ごく 微量でも効率がよく生成することができる。また、代謝的に同位体標識された生体分 子である内部標準物質または代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準 物質を含む細胞中の生体分子を定量するための合成ペプチドは、同位体を必要とし な 、通常のペプチド合成で対応できるので、網羅的な定量方法として適して 、る。 図面の簡単な説明
[0243] [図 1]従来技術による定量法を表したものを示す。
[図 2]本発明による定量法を表したものを示す。
[図 3]本発明による生体分子の定量的解析方法の概略的な全体スキームを示す。
[図 4]本発明による同位体標識を利用する測定サンプル調製の一の態様のスキーム を示す。
[図 5]質量分析後、本発明による解析方法のスキームを示す。
[図 6]典型的な質量分析装置にて得られる質量分析スペクトルを示す。
[図 7]単一の m/zの値におけるマスク口マトグラムに対して、複数のピークが重なって
V、る一例のスペクトルを示す。 圆 8]図 7に示したスペクトルを、本発明にて用いた波形分離処理により分離された波 形スペクトルを示す。
圆 9]本発明が適用される解析システムの構成の機能ブロック図の一例を示す。 圆 10]本発明に係る解析方法を実行するプログラムを、概念的に表すフローチャート である。
圆 11]本発明に用いる制御部の詳細な構成を示す機能ブロック図である。
[図 12]本発明の第一の態様における方法を実行するためのプログラムの工程図を示 す。
圆 13]本発明で用いる外部データベースを利用した機能情報の取得に関するスキー ムを示す。
[図 14]本発明における波形分離後のペプチドのマスク口マトグラムの結果に基づき、 機能情報の付加を行う方法を実行するための工程図を示す。
[図 15]図 15は、波形分離をせずに、ペプチドの質量分析スペクトルの結果に基づき
、機能情報の付加を行う方法を実行するための工程図を示す。
[図 16]cMDHについて、野生型マウス脳由来および代謝的に同位体標識された生体 分子である内部標準物質由来の質量分析スぺ外ルを示す。
圆 17]cMDHについて、野生型マウス脳由来および代謝的に同位体標識された生体 分子である内部標準物質由来の質量分析スペクトルの比における用量依存性を表し たものを示す。
[図 18]cMDHにつ 、て、質量分析による野生型マウス脳由来および代謝的に同位体 標識された生体分子である内部標準物質由来の発現量における理論上の比と実際 に測定した比とをプロットしたものを示す。
[図 19]protein phosphatase 2aおよび myotrophinについて、野生型マウス脳（Wild) 由来 )および代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来 (H) の質量分析スペクトル、ならびに ADAM22遺伝子欠損マウス脳（K/0)由来（L)およ び代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来 (H)の質量分析ス ぺクトノレを示す。
[図 20]protein phosphatase PP2Aおよび heat shock protein 1について、野生型 マウス脳 (Wild)由来 (L)および代謝的に同位体標識された生体分子である内部標 準物質由来 (H)の質量分析スペクトルならびに ADAM22遺伝子欠損マウス脳 (K/0) 由来 )および代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来 (H) の質量分析スペクトルを示す。
[図 21]giyceraldehyde- 3- phosphate denydrogenaseおよび ADP- ribosylation factor について、野生型マウス脳 (Wild)由来 (L)および代謝的に同位体標識された生体分 子である内部標準物質由来 (H)の質量分析スペクトルならびに ADAM22遺伝子欠損 マウス脳 (K/0)由来 )および代謝的に同位体標識された生体分子である内部標 準物質由来 (H)の質量分析スペクトルを示す。
[図 22]cofilinおよび tubulin- betaについて、野生型マウス脳（Wild)由来（L)および代 謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来 (H)の質量分析スぺク トルならびに ADAM22遺伝子欠損マウス脳 (K/0)由来 )および代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質由来 (H)の質量分析スぺ外ルを示す。
[図 23]時間、つまり、特定の連続したスキャン番号における質量分析スペクトルを示 す図である。図中における Lとは、同位体標識されていないロイシンを含むタンパク質 に由来するピークを指す。
[図 24]中心を 644. 7とする、 644. 2— 645. 2の幅での m/z値におけるスキャン番号 975— 1005でのマスク口マトグラムを示す図である。
[図 25]中心を 646. 7とする、 646. 2— 647. 2の幅での m/z値における、スキャン番 号 975— 1005でのマスク口マトグラムを示す図である。図中における Hとは、同位体 標識されたロイシンを含むタンパク質に由来するピークを指す。
[図 26]本発明による波形分離処理の結果を示す。図 26中の (A)は、図 19に示す L で表示されるマスク口マトグラムの波形分離処理の結果を示し、一方で、図 26中の（ B)は、図 19に示す Hで表示されるマスク口マトグラムの波形分離処理の結果を示す 圆 27]代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来のピークに対 する野生型マウス脳 (Wild)由来および ADAM22遺伝子欠損マウス脳 (K/0)由来の ピーク強度比を算出するにあたって、同位体標識された生体分子である内部標準物 質由来の同一配列のピークを用いた場合および別の配列のピークを用いた場合に おいて、野生型マウス脳 (Wild)由来および ADAM22遺伝子欠損マウス脳（K/0)由 来のピーク強度比の比較した結果を示す。
圆 28]本発明の一の実施例において着目した波形分離後の配列と、その配列の定 量値を示す図である。
[図 29]本発明の一の実施例において、 NCBInrデータベースの HomoSapiensにてパタ ーン検索を行った結果、各配列に対して同定されたタンパクの GiNoの一覧を示す図 である。
圆 30]本発明において、波形分離後の質量分析データを、データベースを利用して 解析した結果の一例を示す図である。

Claims

請求の範囲
[1] サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又は代 謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を、加えることを 特徴とする質量分析計によるサンプル中の生体分子を定量する方法。
[2] サンプル中の 1又は複数の生体分子を定量する方法であって、
同位体標識された生体分子の前駆体を加えて培養し、代謝的に同位体標識された 生体分子である内部標準物質を、又は代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞を、サンプルに添加する工程と、
当該各サンプルから生体分子を抽出し分画する工程と、
当該分画した各生体分子を質量分析装置により分析する工程と、
質量分析の情報から当該生体分子を同定する工程と、
各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を定量 する工程と、
を含む、生体分子を定量する方法。
[3] 各サンプル間の該ピーク強度比を比較し、生体分子を相対定量する、請求項 1また は 2に記載の方法。
[4] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の、又は代謝的に同 位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体分子が既知量で ある、請求項 1な 、し 3の 、ずれか一項に記載の方法。
[5] 定量が絶対定量である、請求項 1ないし 4のいずれか一項に記載の方法。
[6] サンプル中の 1または複数の生体分子を定量する方法であって、
(1)サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、また は、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を、添カロ する工程と、
(2)当該サンプル中の各生体分子を質量分析する工程と、
(3)質量分析の情報から当該生体分子を同定する工程と、
(4)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 定量する工程と、 を含む、サンプル中の 1または複数の生体分子を定量する方法。
[7] サンプルから生体分子を抽出し分画する工程をさらに含む、請求項 6に記載の方 法。
[8] 同位体標識された生体分子の前駆体を加えて培養し、生体分子を代謝的に同位 体標識する工程をさらに含む、請求項 6または 7に記載の方法。
[9] 複数のサンプルにつ 、て行 、、各サンプル間の各生体分子のピーク強度比を比較 する工程をさらに含む、請求項 6ないし 8のいずれか一項に記載の方法。
[10] サンプル中の 1または複数の生体分子を絶対定量する方法であって、
代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の生体分子、または、 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体分 子が、既知量である、請求項 6ないし 9のいずれか一項に記載の方法。
[11] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の生体分子を、また は、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体 分子を、絶対定量する工程をさらに含む、請求項 6ないし 10のいずれか一項に記載 の方法。
[12] 請求項 11に記載の工程が、
(a)同位体非標識の合成ペプチドを、代謝的に同位体標識された生体分子である内 部標準物質、または、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を 含む細胞に添加する工程と、
(b)当該代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質または代謝的に 同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞力 生体分子を抽出し 分画する工程と、
(c)当該分画した各生体分子を質量分析する工程と、
(d)質量分析の情報から当該生体分子を同定する工程と、
(e)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 絶対定量する工程と、
を含む、請求項 11に記載の方法。
[13] サンプルが、代謝的に標識できな!/、サンプルである、請求項 1な!、し 12の 、ずれか 一項に記載の方法。
[14] サンプルが、細胞培養によって標識できな!/、サンプルである、請求項 1な!ヽし 13の
V、ずれか一項に記載の方法。
[15] 生体分子がタンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ力 なる 群から選択される!、ずれかの分子である、請求項 1な!ヽし 14の ヽずれか一項に記載 の方法。
[16] 生体分子がタンパク質である、請求項 1ないし 15のいずれか一項に記載の方法。
[17] 生体分子がタンパク質であって、当該タンパク質を抽出し分画し、タンパク質を消化 する工程をさらに含む、請求項 1ないし 16のいずれか一項に記載の方法。
[18] サンプルが、組織、生体液、細胞、細胞器官およびタンパク質複合体力ゝらなる群か ら選択される 、ずれかのサンプルである、請求項 1な 、し 17の!、ずれか一項に記載 の方法。
[19] 同位体が、 、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pおよび34 S並びにこれらの組み合わせ力 なる 群から選択されるいずれかの同位体である、請求項 1ないし 18のいずれか一項に記 載の方法。
[20] 同位体が、 13Cである、請求項 1ないし 19のいずれか一項に記載の方法。
[21] 請求項 1な!、し 20の 、ずれか一項に記載の方法に用いられる代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質。
[22] 請求項 1な!、し 20の 、ずれか一項に記載の方法に用いられる代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質を含む細胞。
[23] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含有する、請求項 1な
V、し 20の!、ずれか一項に記載の方法のための試薬。
[24] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を含有する 、請求項 1な 、し 20の!、ずれか一項に記載の方法のための試薬。
[25] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質の、請求項 1ないし 20の いずれか一項に記載の方法のための使用。
[26] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞の、請求項 1 な！、し 20の!、ずれか一項に記載の方法のための使用。
[27] 質量分析装置おいて得られた、サンプル中の 1又は複数の生体分子の質量分析 に関するデータを受けるコンピュータに、前記サンプル中の 1又は複数の生体分子の 定量をさせるためのプログラムであって、
(1)サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又は 、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を添加し、 当該各サンプル中の各生体分子を質量分析装置により分析し、質量分析装置から 分析結果を受ける工程と、
(2)質量分析の分析結果から当該生体分子を同定する工程と、
(3)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 定量する工程と、
を実行させるプログラム。
[28] 質量分析装置において得られた、サンプル中の 1又は複数の生体分子の質量分 祈に関するデータを受けるコンピュータに、前記サンプル中の 1又は複数の生体分 子の定量をさせるためのプログラムであって、
(1)サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又は 、代謝的に同位体標識された生体分である内部標準物質を含む細胞を添加し、当 該各サンプルから生体分子を抽出し分画し、当該分画した各生体分子を質量分析 装置により分析し、質量分析装置カゝら分析結果を受ける工程と、
(2)質量分析の分析結果から当該生体分子を同定する工程と、
(3)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 定量する工程と、
を実行させるプログラム。
[29] 複数のサンプルにつ 、て行 、、各サンプル間の各生体分子のピーク強度比を比較 する工程をさらに実行させる、請求項 27または 28に記載のプログラム。
[30] サンプル中の 1又は複数の生体分子の絶対定量をするためのプログラムであって、 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の、又は代謝的に同位 体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体分子が既知量であ る、請求項 27な!、し 29の!、ずれか一項に記載のプログラム。
[31] 第一の生体分子と、前記第一の生体分子に対して同位体標識された第二の生体 分子との質量分析に関するデータの解析システムであって、
前記第一および第二の生体分子の質量分析を実行する質量分析装置と、 前記質量分析装置から、前記生体分子の質量分析に関するデータを受けるデータ 入出部を有する制御部と、を備え、
前記制御部は、生体分子の構成成分の配列が決定された前記生体分子に対する 第一の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分子 に対する第二の m/zの値とを決定するとともに、前記第一および第二の m/zの値から 、前記第一の生体分子および前記第二の生体分子の m/zの値に対する質量分析ス ベクトルおよびマスク口マトグラムを含むデータを、前記質量分析装置にて得られた 質量分析に関するデータから抽出する処理部と、
前記処理部力 前記第一および第二の m/zの値におけるマスク口マトグラムを受け 、前記時間軸に対する質量分析スペクトルを波形分離処理する波形処理部と、を備 える、解析システム。
[32] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が決定さ れた前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体分子の同位体非 標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第二 の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列が決 定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子の同位 体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 31に 記載の解析システム。
[33] 前記制御部は、前記波形分離処理部からの波形分離処理により得られた固有の生 体分子に由来する波形の面積を算出し、前記第一の m/zの値における固有の生体 分子に由来する第一の波形面積の値と、前記第二の m/zの値における固有の生体 分子に由来する第二の波形面積の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記第二の 波形面積)の比を算出する演算部を、さらに備える、請求項 31又は 32に記載の解析 システム。
[34] 前記制御部は、波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類し、前記 配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し、その照合結果から、前 記配列と機能とを関連付けてグループィ匕する情報付加部を、さらに備える、請求項 3 1ないし 33のうち何れか一項に記載の解析システム。
[35] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定し、生体分子を 構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定 量値とする演算部を、さらに備える、請求項 31ないし 34のいずれか一項に記載の解 析システム。
[36] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列を、生体分子の機能情報を有するデ ータベースに照合し、当該生体分子の機能情報を取得する情報付加部を、さらに備 える、請求項 31な 、し 35の 、ずれか一項に記載の解析システム。
[37] 前記第一および第二の生体分子の質量分析を実行する際、内部標準物質の存在 下で質量分析を実行し、
前記波形処理部は、前記内部標準物質の m/zの値におけるマスク口マトグラムを受 けて、前記内部標準物質に固有の波形を得るために、さらに波形分離処理を行い、 前記演算部は、前記波形処理部からの内部標準物質に固有の波形面積を算出す るとともに、（前記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、 および/または、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の 比を、さらに算出する、請求項 31ないし 36のうち何れか一項に記載の解析システム
[38] 第一および第二の生体分子に対して、同位体標識された生体分子である内部標準 物質との質量分析に関するデータの解析システムであって、
前記第一および第二の生体分子並びに同位体標識された生体分子の質量分析を 実行する質量分析装置と、
前記質量分析装置から、前記生体分子の質量分析に関するデータを受けるデータ 入出部を有する制御部と、を備え、
前記制御部は、生体分子の構成成分の配列が決定された前記生体分子に対する 第一および第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記同位 体標識された生体分子に対する内部標準物質の m/zの値とを決定するとともに、前 記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記第一および第二の生 体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対する質量分析スぺタト ルおよびマスク口マトグラムを含むデータを、前記質量分析装置にて得られた質量分 祈に関するデータから抽出する処理部と、
前記処理部力 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値におけるマ スクロマトグラムを受け、前記マスク口マトグラムを波形分離処理する波形処理部と、 を備える、解析システム。
[39] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子の構成 成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/z の値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個数と前 記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質の生 体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列 が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、前記 内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標準物 質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の第一 および第二の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 38に記載の解析シ ステム。
[40] 前記制御部は、前記波形分離処理部からの波形分離処理により得られた固有の生 体分子に由来する波形の面積を算出し、前記第一および第二の m/zの値における 固有の生体分子に由来する第一および第二の波形面積の値と、前記内部標準物質 の m/zの値における固有の生体分子に由来する内部標準物質の波形面積の値とか ら、（前記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、および Zまたは、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比を 算出する演算部を、さらに備える、請求項 38又は 39に記載の解析システム。
[41] 前記制御部は、波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類し、前記 配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し、その照合結果から、前 記配列と機能とを関連付けてグループィ匕する情報付加部を、さらに備える、請求項 3 8ないし 40のうち何れか一項に記載の解析システム。
[42] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定し、生体分子を 構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定 量値とする演算部を、さらに備える、請求項 38ないし 41のいずれか一項に記載の解 析システム。
[43] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列を、生体分子の機能情報を有するデ ータベースに照合し、当該生体分子の機能情報を取得する情報付加部を、さらに備 える、請求項 38な 、し 42の 、ずれか一項に記載の解析システム。
[44] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pおよび34 S並び にこれらの組み合わせからなる群力も選択される!、ずれかの同位体である、請求項 3
1ないし 43のうち何れか一項に記載の解析システム。
[45] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、請求項 31ないし 44 のうち何れか一項に記載の解析システム。
[46] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分子に関 するデータベースとの照合により、前記構成成分の配列の決定が行われる、請求項 4
5に記載の解析システム。
[47] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、請求項 31な
V、し 46のうち何れか一項に記載の解析システム。
[48] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ からなる群から選択されるいずれかの分子である、請求項 31ないし 47のうち何れか 一項に記載の解析システム。
[49] 第一の生体分子と、前記第一の生体分子に対して同位体標識された第二の生体 分子の質量分析に関するデータの解析方法であって、
質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのうち、生 体分子の構成成分の配列が決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの値と、 生体分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値 を決定する工程と、
前記第一および第二の m/zの値から、前記第一の生体分子および前記第二の生 体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよびマスク口マトグラムを含むデー タを、前記質量分析に関するデータ力も抽出する工程と、
前記第一及び第二の生体分子のマスク口マトグラムを波形分離処理する工程と、 を含む、解析方法。
[50] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が決定さ れた前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体成分の同位体非 標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第二 の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列が決 定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子の同位 体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 49に 記載の解析方法。
[51] 前記波形分離処理工程により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積を 算出する工程と、
前記第一の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一の波形面積の値と 、第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第二の波形面積の値とから、 (前記第一の波形面積) I (前記第二の波形面積)の比を算出する工程と、 をさらに備える、請求項 49又は 50に記載の解析方法。
[52] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、
前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、 をさらに含む、請求項 49ないし 51のうち何れか一項に記載の解析方法。
[53] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値力 平均値を求めて、生体分 子の代表定量値とする工程と、
をさらに含む、請求項 49ないし 52のいずれか一項に記載の解析方法。
[54] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し て、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、 をさらに含む、請求項 49ないし 53のいずれか一項に記載の解析方法。
[55] 前記第一および第二の生体分子とともに、内部標準物質の m/zの値の決定するェ 程と、内部標準物質のマスク口マトグラムを含むデータを抽出する工程と、前記内部 標準物質のマスク口マトグラムの波形分離処理する工程と、前記内部標準物質に固 有の波形の面積を算出する工程とを実行し、
(前記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、および/ま たは、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比を、算 出する工程を、さらに含む、請求項 49ないし 54のうち何れか一項に記載の解析方法
[56] 第一および第二の生体分子に対して、同位体標識された生体分子である内部標準 物質との質量分析に関するデータの解析方法であって、
質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのうち、生 体分子の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一およ び第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する工程と、
前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記第一および第二 の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対する質量分析ス ベクトルおよびマスク口マトグラムを含むデータを、前記質量分析に関するデータから 抽出する工程と、
前記第一および第二並びに内部標準物質の生体分子のマスク口マトグラムを波形 分離処理する工程と、
を含む、解析方法。
[57] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子の構成 成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/z の値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個数と前 記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質の生 体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列 が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、前記 内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標準物 質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の第一 および第二の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 56に記載の解析方 法。
[58] 前記波形分離処理工程により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積を 算出する工程と、
前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一および 第二の波形面積の値と、前記内部標準物質の m/zの値における固有の生体分子に 由来する内部標準物質の波形面積の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記内部 標準物質に固有の波形面積)の比、および Zまたは、（前記第二の波形面積)/ (前記 内部標準物質に固有の波形面積)の比を算出する工程と、
をさらに備える、請求項 56又は 57に記載の解析方法。
[59] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、
前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、 をさらに含む、請求項 56ないし 58のうち何れか一項に記載の解析方法。
[60] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値力 平均値を求めて、生体分 子の代表定量値とする工程と、
をさらに含む、請求項 56ないし 59のいずれか一項に記載の解析方法。
[61] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し て、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、
をさらに含む、請求項 56ないし 58のいずれか一項に記載の解析方法。
[62] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pおよび34 S並び にこれらの組み合わせ力もなる群力も選択される 、ずれかの同位体である、請求項 4
9ないし 61のうち何れか一項に記載の解析方法。
[63] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、請求項 49ないし 62 のうち何れか一項に記載の解析方法。
[64] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られるデータと生体分子に関 するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、請求項 63に記 載の解析方法。
[65] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、請求項 49な V、し 64のうち何れか一項に記載の解析方法。
[66] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ からなる群から選択されるいずれかの分子である、請求項 49ないし 65のうち何れか 一項に記載の解析方法。
[67] 質量分析装置において得られた、第一の生体分子と、前記第一の生体分子に対し て同位体標識された第二の生体分子の質量分析に関するデータを受けるコンビユー タに、前記データの解析をさせるためのプログラムであって、
前記質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのう ち、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの 値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/z の値を決定する工程と、
前記第一および第二の m/zの値から、前記第一の生体分子および前記第二の生 体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよびマスク口マトグラムを含むデー タを、前記質量分析に関するデータ力も抽出する工程と、
前記第一および第二の生体分子のマスク口マトグラムを波形分離処理する工程と、 を実行させるプログラム。
[68] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が決定さ れた前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体分子の同位体非 標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第二 の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列が決 定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子の同位 体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行させる、請求項 67に 記載のプログラム。
[69] 前記波形分離処理により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積を算出 する工程と、
前記第一の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一の波形面積の値と 、第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第二の波形面積の値とから、 (前記第一の波形面積) I (前記第二の波形面積)の比を算出する工程と、 をさらに実行させる、請求項 67又は 68に記載のプログラム。
[70] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、
前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、 をさらに実行させる、請求項 67ないし 69のうち何れか一項に記載のプログラム。
[71] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値力 平均値を求めて、生体分 子の代表定量値とする工程と、
をさらに実行させる、請求項 67ないし 70のいずれか一項に記載のプログラム。
[72] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し て、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、
をさらに含む、請求項 67な!、し 71の!、ずれか一項に記載のプログラム。
[73] 前記質量分析装置において、前記第一および第二の生体分子とともに、内部標準 物質の質量分析に関するデータを得て、
前記質量分析に関するデータから、前記内部標準物質のマスク口マトグラムを抽出 するとともに、前記内部標準物質のマスク口マトグラムを波形分離処理し、
前記波形分離処理により得られた内部標準物質に固有の波形面積を算出し、（前 記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、および/または 、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積）に比を算出する 工程を、さらに実行させる、請求項 67ないし 72のうち何れか一項に記載のプログラム
[74] 第一および第二の生体分子と、当該第一および第二の生体分子に対して同位体 標識された生体分子である内部標準物質との質量分析に関するデータを受けるコン ピュータに、前記データの解析をさせるためのプログラムであって、
質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのうち、生 体分子の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一およ び第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する工程と、
前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記第一および第二 の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対する質量分析ス ベクトルおよびマスク口マトグラムを含むデータを、前記質量分析に関するデータから 抽出する工程と、
前記第一および第二並びに内部標準物質の生体分子のマスク口マトグラムを波形 分離処理する工程と、
を実行させるプログラム。
[75] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子の構成 成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/z の値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個数と前 記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質の生 体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列 が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、前記 内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標準物 質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の第一 および第二の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 74に記載のプロダラ ム。
[76] 前記波形分離処理工程により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積を 算出する工程と、
前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一および 第二の波形面積の値と、前記内部標準物質の m/zの値における固有の生体分子に 由来する内部標準物質の波形面積の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記内部 標準物質に固有の波形面積)の比、および Zまたは、（前記第二の波形面積)/ (前記 内部標準物質に固有の波形面積)の比を算出する工程と、
をさらに実行させる、請求項 74又は 75に記載のプログラム。
[77] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、
前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、 をさらに実行させる、請求項 74ないし 76のうち何れか一項に記載のプログラム。
[78] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体 分子の代表定量値とする工程と、
をさらにさせる、請求項 74ないし 77のいずれか一項に記載のプログラム。
[79] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し て、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、
をさらに含む、請求項 74ないし 78のいずれか一項に記載のプログラム。
[80] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pよび34 S並びに これらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、請求項 67 ないし 79のうち何れか一項に記載のプログラム。
[81] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、請求項 67ないし 80 のうち何れか一項に記載のプログラム。
[82] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分子に関 するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、請求項 81に記 載のプログラム。
[83] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、請求項 67な
V、し 82のうち何れか一項に記載のプログラム。
[84] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ からなる群から選択されるいずれかの分子である、請求項 67ないし 83のうち何れか 一項に記載のプログラム。
[85] 第一および第二の生体分子に対して、同位体標識された生体分子である内部標準 物質の質量分析に関するデータの解析方法であって、 質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのうち、生 体分子の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一およ び第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する工程と、
得られたデータをもとに、生体分子の機能情報を有するデータベースに照合して、 当該生体分子の機能情報を取得する工程と、
を含む解析方法。
[86] 前記決定工程の後、
前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記第一および第二 の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対する質量分析ス ベクトルおよびマスク口マトグラムを、前記質量分析に関するデータ力も抽出する工程 と、
をさらに含む解析方法。
[87] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子の構成 成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/z の値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個数と前 記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質の生 体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列 が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、前記 内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標準物 質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の第一 および第二の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 85または 86に記載 の解析方法。
[88] 前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一および 第二のピークの値と、前記内部標準物質の m/zの値における固有の生体分子に由 来する内部標準物質のピークの値とから、（前記第一のピーク)/ (前記内部標準物質 に固有のピーク)の比、および Zまたは、（前記第二のピーク)/ (前記内部標準物質に 固有のピーク）の比を算出する工程と、 をさらに備える、請求項 85ないし 87のうち何れか一項に記載の解析方法。
[89] 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、
をさらに含む、請求項 85ないし 88のうち何れか一項に記載の解析方法。
[90] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体 分子の代表定量値とする工程と、
をさらに含む、請求項 85ないし 89のいずれか一項に記載の解析方法。
[91] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pよび34 S並びに これらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、請求項 85 な 、し 90の 、ずれか一項に記載の解析方法。
[92] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、請求項 85ないし 91 のうち何れか一項に記載の解析方法。
[93] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分子に関 するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、請求項 92に記 載の解析方法。
[94] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、請求項 85な
V、し 93のうち何れか一項に記載の解析方法。
[95] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖もしくは核酸またはこれらの組み合わせ である、請求項 85な 、し 94のうち何れか一項に記載の解析方法。
[96] 質量分析装置において得られた、第一および第二の生体分子と、当該第一および 第二の生体分子に対して同位体標識された生体分子である内部標準物質との質量 分析に関するデータを受けるコンピュータに、前記データの解析をさせるためのプロ グラムであって、
質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのうち、生 体分子の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一およ び第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する工程と、
得られたデータをもとに、生体分子の機能情報を有するデータベースに照合して、 当該生体分子の機能情報を取得する工程と、
を実行させるプログラム。
[97] 前記決定工程の後、
前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記第一および第二 の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対する質量分析ス ベクトルおよびマスク口マトグラムを、前記質量分析に関するデータ力も抽出する工程 と、
をさらに実行させる請求項 96に記載のプログラム。
[98] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子の構成 成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/z の値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個数と前 記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質の生 体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列 が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、前記 内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標準物 質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の第一 および第二の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 96または 97に記載 のプログラム。
[99] 前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一および 第二のピークの値と、前記内部標準物質の m/zの値における固有の生体分子に由 来する内部標準物質のピークの値とから、（前記第一のピーク)/ (前記内部標準物質 に固有のピーク)の比、および Zまたは、（前記第二のピーク)/ (前記内部標準物質に 固有のピーク）の比を算出する工程と、
をさらに実行させる、請求項 96ないし 98のうち何れか一項に記載のプログラム。
[100] 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、
をさらに実行させる、請求項 96ないし 99のうち何れか一項に記載のプログラム。
[101] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体 分子の代表定量値とする工程と、
をさらに実行させる、請求項 96ないし 100のいずれか一項に記載のプログラム。
[102] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pよび34 S並びに これらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、請求項 96 ないし 101のうち何れか一項に記載のプログラム。
[103] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、請求項 96ないし 102 のうち何れか一項に記載のプログラム。
[104] 前記構成成分の配列決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分子に関す るデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、請求項 103に記 載のプログラム。
[105] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、請求項 96な
V、し 104のうち何れか一項に記載のプログラム。
[106] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ であるからなる群力 選択されるいずれかの分子である、請求項 96ないし 105のうち 何れか一項に記載のプログラム。
[107] 質量分析装置において得られた、サンプル中の 1または複数の生体分子の質量分 祈に関するデータを受けるコンピュータに、前記サンプル中の 1または複数の生体分 子の定量をさせるためのプログラムであって、
質量分析装置にて測定された生体分子の質量分析に関するデータのうち、生体分 子の構成成分の配列が決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの値と、生体 分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値を決 定する工程と、
前記第一および第二の m/zの値から、前記第一の生体分子および前記第二の生 体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよびマスク口マトグラムを含むデー タを、前記質量分析に関するデータ力も抽出する工程と、
前記第一および第二の生体分子のマスク口マトグラムを波形分離処理する工程と、 を実行させるプログラム。
[108] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が決定さ れた前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体分子の同位体非 標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第二 の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列が決 定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子の同位 体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 107 に記載のプログラム。
[109] 前記波形分離処理により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積を算出 する工程と、
前記第一の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一の波形面積の値と 、第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第二の波形面積の値とから、 (前記第一の波形面積) I (前記第二の波形面積)の比を算出する工程と、 をさらに実行させる、請求項 107又は 108に記載のプログラム。
[110] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、
前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、 をさらに実行させる、請求項 107ないし 109のうち何れか一項に記載のプログラム。
[111] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体 分子の代表定量値とする工程と、
をさらに実行させる、請求項 107ないし 110のいずれか一項に記載のプログラム。
[112] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合 して、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、
をさらに実行させる、請求項 107ないし 111のいずれか一項に記載のプログラム。
[113] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pよび34 S並びに これらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、請求項 10
7な!、し 112のうち何れか一項に記載のプログラム。
[114] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、請求項 107ないし 11 3のうち何れか一項に記載のプログラム。
[115] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分子に関 するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、請求項 114に 記載のプログラム。
[116] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、請求項 107 な！、し 115のうち何れか一項に記載のプログラム。
[117] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ からなる群から選択されるいずれかの分子である、請求項 107ないし 116のうち何れ か一項に記載のプログラム。
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