WO2005049691A1 - ポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法 - Google Patents

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pha
crystal
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Koichi Kinoshita
Fumio Osakada
Yasuyoshi Ueda
Karunakaran Narasimhan
Angella Christine Cearley
Kenneth Yee
Isao Noda
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Kaneka Corporation
The Procter & Gamble Company
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/88—Post-polymerisation treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/06—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds derived from hydroxycarboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently producing polyhydroxyalkanoate accumulated in biomass using a solvent.
  • PHA Polyhydroxyalkanoate
  • PHA is a biodegradable thermoplastic polyester that is synthesized and accumulated as an energy storage substance in cells of many microbial species.
  • PHA which is produced by microorganisms using natural organic acids and oils and fats as a carbon source, is completely biodegraded by microorganisms in soil and water, and is incorporated into the natural carbon cycle process. Therefore, PHA can be said to be an environmentally-friendly plastic material with almost no adverse effects on ecosystems.
  • synthetic plastics have become a serious social problem in terms of environmental pollution, waste disposal, and petroleum resources, and PHA has received attention as an environmentally friendly green plastic, and its practical application is highly desired.
  • PHA When PHA is produced industrially, a microorganism that naturally produces PHA is used, or a PHA synthase gene is recombined into a microorganism or a plant, and a transformant is obtained and used for production. May be used as a host. In both cases, PHA accumulates in the biomass, so that PHA is produced by recovering biomass containing PHA and separating and purifying the biomass.
  • Patent Document 2 discloses a method for extracting PHB (a homopolymer of 3-hydroxybutyrate) from wet biomass with a solvent, but the solvent used here is a special solvent such as propanediol / glycerin formal, which has a special displacement. However, it is insufficient for industrial use in terms of economic efficiency.
  • Patent Document 3 discloses extraction with a solvent, which is preferably miscible with water.
  • a solvent which is preferably miscible with water.
  • methanol, ethanol, or isopropanol are mentioned.
  • PHA cannot be extracted unless biomass is treated at a pressure of 100 ° C or more, which greatly exceeds the boiling point, with these solvents! /, It was used in Example 1 or 2, and it was concerned that melting at 140 ° C. could cause a severe decrease in molecular weight.
  • the gel is compressed by a rotating roll.However, when the polymer becomes a hard, opaque gel, it is no longer possible to discharge the reaction vessel power, In effect, the PHA experienced irretrievability.
  • Patent Document 4 the recovery of PHA mainly from vegetable power is performed using a solvent at a PHA concentration of 1% .At such a low concentration, the amount of solvent used becomes enormous and practically industrial It's difficult. In addition, the present inventors have experienced that even under the above-mentioned conditions, it is not possible to prevent Gerry Dani.
  • Patent Document 1 JP-A-59-205992
  • Patent Document 2 JP-A-2-69187
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication No. Hei 10-504460
  • Patent Document 4 U.S. Pat.No. 5,942,597
  • an object of the present invention is to provide a method for extracting polyhydroxyalkanoate from a biomass containing polyhydroxyalkanoate using a solvent and then crystallizing the polyhydroxyalkanoate. It is an object of the present invention to provide a method for obtaining the polymer in a state that is extremely easy to recover, while avoiding a possible gelled state.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, dissolved PHA from a dry biomass or a wet biomass in a monohydric alcohol having 4 to 10 carbon atoms at 70 ° C or higher. After dissolving, the extract is separated from the biomass residue, and an extract is prepared so that water is present in the extract at 0.1 to 10% by weight, preferably 2 to 8% by weight. Making it water-containing minimizes the strength of PHA gelling, and furthermore, by lowering the temperature of the solution below 70 ° C, the yield increases and the strength of the PHA can be recovered by filtration. The inventors have discovered that the present invention has been completed.
  • the present invention provides a polyhydroxyalkanoate solution containing 0.1 to 10% by weight of water based on the total amount of the solution, wherein the extraction solvent is a monohydric alcohol having 4 to 10 carbon atoms.
  • the present invention relates to a method for producing polyhydroxyalkanoate crystals, characterized in that polyhydroxyalkanoate crystals are precipitated by keeping the temperature of the polyhydroxyalkanoate at 70 ° C or higher and cooling the temperature to a temperature lower than 70 ° C.
  • the extraction solvent used in the present invention is a monohydric alcohol having 4 to 10 carbon atoms.
  • examples of such an extraction solvent include butanol, pentanol, hexanol, heptanol, otatanol, nonanol, decanol, and the like. More preferred is a monohydric alcohol having a relatively low boiling point and relatively inexpensive carbon number of 417, and excellent in extraction and dissolving ability.
  • the alcohol butanol, pentanol, hexanol, heptanol and isomers thereof are particularly preferred as the extractant of the present invention.
  • the butanol is preferably isobutanol.
  • One or more of the above extraction solvents can be used.
  • PHA can also extract dried biomasska. It can also be extracted from wet and biomass.
  • the extract is prepared so that the extract contains 0.1 to 10% by weight, preferably 2 to 8% by weight of water.
  • the present inventors have found for the first time that the gelling of the strength is relaxed during the crystallization after the extraction. However, if the water content in the extract exceeds 10% by weight, recovery of the extractant becomes difficult.
  • PHA is extracted from biomass with one of the extraction solvents according to the present invention.
  • the PHA concentration is not particularly limited, it is preferable that the extraction solvent is calorie so as to be preferably 1 to 20% by weight, more preferably 2 to 15% by weight, and still more preferably 3 to 10% by weight.
  • the temperature for extracting PHA is preferably 70 ° C. or higher, more preferably 80 ° C. or higher, and even more preferably 90 ° C. or higher. However, it is preferred that the temperature does not substantially exceed 100 ° C. to avoid PHA decomposition.
  • the time for extracting PHA is not particularly limited, but is generally 20 to 150 minutes, and more preferably 60 to 120 minutes from the viewpoint of good extraction efficiency and prevention of decomposition.
  • the extraction solution is then separated from the insoluble biomass.
  • a heated filter or a heated centrifuge such as a decanter.
  • the separation may be performed under a pressurized state, but if the temperature becomes lower than 70 ° C. during the separation, gelling may occur sharply, and eventually solidify, making it impossible to separate from the residue. Therefore, always keep the solution at 70 ° C or higher until the biomass residue is removed. Thereafter, the crystallization amount of PHA can be increased by gradually cooling the extract to a temperature lower than 70 ° C.
  • Recovery of PHA is performed by a method known to those skilled in the art, such as filtration and centrifugation of a liquid from a PHA solution.
  • the recovered PHA can be washed with a solvent such as water, methanol, ethanol, butanol, acetone, hexane, heptane or a mixture thereof, but is not limited thereto.
  • Drying of PHA is performed by a method well known to those skilled in the art, for example, flash drying, vacuum drying and the like.
  • PHA in the present invention is a general term for hydroxyalkanoate polymers.
  • the hydroxyalkanoate component is not particularly limited, but specific examples include 3-hydroxybutyrate (3HB), 3-hydroxyvalerate (3HV), 3-hydroxypropionate, 4-hydroxybutyrate, and 4-hydroxyvalerate. Rate, 5-hydroxyvalerate, 3-hydroxyhexyl Examples include sanoate (3HH), 3-hydroxyheptanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxyxinanoate, and 3-hydroxydecanoate.
  • the PH A in the present invention may be a homopolymer of these hydroxyalkanoates or a copolymer of two or more thereof, but is preferably a copolymer of two or more thereof.
  • PHA examples include PHB, which is a homopolymer of 3HB, PHBV, which is a two-component copolymer of 3HB and 3HV, and PHBH, a two-component copolymer of 3HB and 3HH (see Patent No. 2777757).
  • PHB which is a homopolymer of 3HB
  • PHBV which is a two-component copolymer of 3HB and 3HV
  • PHBH a two-component copolymer of 3HB and 3HH
  • PHBHV a three-component copolymer PHBHV of 3HB, 3HV and 3HH
  • PHBH a copolymer having 3HH as a monomer component
  • PHBH is more preferable, since it has degradability and soft properties as a biodegradable polymer.
  • the molar ratio of each monomer constituting the PHBH is not particularly limited, but from the viewpoint of good processability, it is preferably from 1 to 99 mol%, more preferably from 1 to 30 mol%. is there. Further, from the viewpoint of good crystal properties at the time of crystallization, 3HHmol% is preferably 20 mol% or less, more preferably 15 mol% or less, and particularly preferably 10 mol% or less from the viewpoint of good operability.
  • the composition ratio of each monomer unit is not particularly limited. The content is as low as 1 to 30 mol%, preferably in the range of i.
  • PHA In order for PHA to be practically used, PHA must have a weight average molecular weight of 10,000 or more using polystyrene as a molecular weight standard by gel chromatography. It is preferably at least 50,000, more preferably at least 100,000, especially at least 200,000.
  • the biomass used in the present invention is not particularly limited as long as it is an organism capable of accumulating PHA in cells.
  • Alcaligenes lipolytica Alcaligenes genus such as Alcaligenes latus
  • Ralstonia genus such as Ralstonia eutropha
  • Pseudomonas sp Microorganisms such as Clostridium, Halobacterium, Rhoao spirillum, Zoogloea Chen, Candida rot, Yarrowia Chen, and Saccnar omyces can accumulate PHA in cells by adjusting the culture conditions.
  • the genes involved in PHA synthesis of these microorganisms have been introduced.
  • a transformed transformant may be used.
  • the host is not particularly limited, and in addition to the above-mentioned microorganisms, microorganisms such as Escherichia coli and yeast (see WO01Z88144), and plants can also be mentioned.
  • microorganisms such as Escherichia coli and yeast (see WO01Z88144), and plants can also be mentioned.
  • A. caviae of the genus Aeromonas or a transformed cell into which a gene of the PHA synthase group of A. caviae has been introduced is preferable because it has the ability to synthesize excellent PHBH as a polymer.
  • Ralstonia eutropha into which a gene of the PHA synthase group of A.
  • Alcaligenes eutrophus AC32 (Accession date: August 7, 1997, Accession number: FERM BP— 6038) and deposited internationally under the Budapest Treaty with the Patent Organism Depositary at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology at 1-1 Tsukuba East East, Ibaraki, Japan
  • the method for culturing the PHA-producing microorganisms mentioned above is not particularly limited, and for example, a method well-known to those skilled in the art described in JP-A-2001-340078 is used.
  • the PHA content in the microorganism after culturing is preferably higher, and when applied at an industrial level, 50% by weight or more of PHA is contained in the dried cells.
  • the more preferable PHA content is 60% by weight or more, and more preferably 70% by weight or more.
  • the cells are obtained by a conventional method, for example, by direct drying of the cells by a method such as spray drying, or by a method such as centrifugation or membrane separation.
  • the recovered cells can be used in the extraction step in a dry state or in a wet cell state moistened with water.
  • wet cells obtained by washing the recovered cells with a lipid solvent such as methanol or acetone, or those obtained by drying the cells can be used as PHA extraction cells.
  • the polyhydroxyalkanoate obtained by the present invention can be used for various fibers, yarns, ropes, woven fabrics, knitted fabrics, nonwoven fabrics, papers, films, sheets, tubes, plates, rods, containers, bags, parts, foams and the like. It can be formed into a shape. It can also be processed into biaxially stretched films. Articles can be suitably used in agriculture, fisheries, forestry, horticulture, medicine, hygiene, clothing, non-clothing, packaging and other fields.
  • the biomass material treated according to the present invention is preferably used as animal feed.
  • the solvent used in the present invention is preferably in an amount acceptable as animal feed. .
  • the solvent substantially remove the biomass material.
  • the method of the present invention can suppress gelling and obtain a flowable and dispensable polyhydroxyalkanoate, thereby producing a biodegradable polyhydroxyalkanoate industrially at low cost. Be able to provide.
  • PHBH poly (3-hydroxybutylene co -3-hydroxyhexanoate)
  • R. eutropha (deposit number FERM BP-6038) into which PHA synthase genes derived from A. aeruginosa were introduced was cultured by the method described in Example 1 of JP-A-2001-340078 to produce PHBH. Was. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation to obtain wet cells. Further, the cells were dried in a vacuum at 50 ° C. for 15 hours to obtain dried cells. The content of PHBH in the dried cells was 60%, the weight average molecular weight was 1.3 million, and the composition of 3-hydroxyhexanoate (hereinafter abbreviated as 3HH) was 7 mol%.
  • 3HH 3-hydroxyhexanoate
  • R. eutropha into which PHA synthase genes from Aeromonas Accession No. FERM BP-6038 was cultured by the method described in Example 1 of JP-A-2001-340078 to produce PHBH. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation to obtain wet cells. The PHBH content in the wet cells was 30%, the weight average molecular weight was 1.3 million, and the 3HH composition was 7 mol%. 211.4 g of isobutanol was added to 50.Og of the wet cells, and extraction was performed at 100 ° C. for 1 hour. The solution was transferred to a jacket-type pressure filter maintained at 100 ° C, and the PHBH solution was recovered by filtration.
  • the recovered solution was kept at 90 ° C, and while maintaining the temperature, 5 g of water was gradually added while the solution was vigorously stirred (the water content was 1.9% by weight). After the addition was completed, the solution was gradually cooled to room temperature with vigorous stirring, whereby PHBH was precipitated. The precipitate was easily collected by filtration. The collected PHBH was washed with 50 g of isobutanol and then dried at 45 ° C under vacuum. The recovered amount was 14. lg (94%), the purity was 99% or more, and the 3HH composition was 7 mol%. The molecular weight was 1.1 million, which was sufficient for force processing.
  • Example 1 the PHA extract was slowly cooled to room temperature under vigorous stirring without adding water (water content: 0.04% by weight). As a result, the PHA was gelled and lost its fluidity and could not be dispensed. Thereafter, even if water was added, the fluidity was not improved, and it was impossible to pay out.
  • the molecular weight was measured using a gel chromatography system (RI detection) manufactured by Shimadzu Corporation equipped with Shodex K806L (300x8mm, two-piece connection) (manufactured by Showa Denko KK), using Cloguchi form as the mobile phase. analyzed. A commercially available standard polystyrene was used as a molecular weight standard sample. PHBH purity was measured by gas chromatography after converting PHBH to methyl ester. The water content was measured using an infrared moisture meter FD-230 manufactured by Kett Science Laboratory.

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Abstract

　本発明の目的は、生分解性のポリヒドロキシアルカノエートを溶剤抽出法により簡便に得る方法を提供することである。 　本発明は、抽出溶剤が炭素数４～１０の１価アルコールであり、溶解液総量に対して水を０．１重量％から１０重量％含有するポリヒドロキシアルカノエート溶解液を７０°C以上に保温し、７０°Cより低い温度に冷却することにより、ポリヒドロキシアルカノエートの結晶を析出させることを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法である。  

Description

明 細 書
ポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、バイオマス内に蓄積したポリヒドロキシアルカノエートを、溶剤を用いて効 率よく製造する方法に関する。
背景技術
[0002] ポリヒドロキシアルカノエート（以降、 PHAと略す）は、多くの微生物種の菌体内にェ ネルギー貯蔵物質として合成、蓄積される生分解性の熱可塑性ポリエステルである。 微生物によって天然の有機酸や油脂を炭素源に生産される PHAは、土中や水中の 微生物により完全に生分解されるため自然界の炭素循環プロセスに取り込まれること になる。従って、 PHAは生態系への悪影響がほとんどない環境調和型のプラスチッ ク材料と言える。近年、合成プラスチックが環境汚染、廃棄物処理、石油資源の観点 力も深刻な社会問題となるに至り、 PHAが環境に優しいグリーンプラスチックとして注 目され、その実用化が切望されている。
[0003] PHAを工業的に生産する場合には、生来的に PHAを生産する微生物を用いる場 合や、 PHA合成酵素遺伝子を微生物や植物に組換え、形質転換体を取得しそれを 製造用宿主として用いる場合がある。そのどちらの場合も PHAはそれらバイオマス中 に蓄積されるため、 PHAの製造は、 PHAを含むバイオマスを回収し、そのバイオマ ス力 分離精製して行われることになる。
[0004] バイオマスカ の PHAの分離精製に関しては、 PHA溶解性の溶剤を用いて抽出し 、貧溶剤を用いて晶析を行い、結晶を回収する方法が最も簡便な方法として知られ ている。例えば、 PHAが蓄積されたバイオマスを乾燥し、乾燥バイオマスカ クロロホ ルムゃ塩化メチレンなどのハロゲン系有機溶媒を用 ヽて PHAを抽出した後、抽出液 をメタノールやへキサンなどの貧溶媒と混合することによって PHAを析出させて回収 する方法 (特許文献 1)がある。これらの抽出溶剤では、乾燥バイオマスからしカゝ抽出 できな 、ため培養液力 得られたバイオマスを乾燥する工程が必要となってくる。さら に環境規制に関わるハロゲン系有機溶媒を使用することなどの問題がある。 特許文献 2には溶剤による湿バイオマスからの PHB (3—ヒドロキシブチレートのホモ ポリマー）の抽出方法が記載されているが、ここで用いられる溶剤はプロパンジォー ルゃグリセリンホルマールなど 、ずれも特殊なものであり、経済性等の点で工業的な 利用には不十分である。
[0005] また、特許文献 3では、水との混和性の好ま 、溶剤での抽出が公開されて 、る。そ こでは、メタノール、エタノール、またはイソプロパノールが挙げられている力 これら の溶剤では沸点を大きく超える 100°C以上の加圧状態でバイオマスを処理しな 、と P HAは抽出できな!/、し、実施例 1あるいは 2で用いられて!/、る 140°Cと!、う高温での溶 解は激しい分子量低下を起こすことが懸念される。さらに、冷却により硬質で不透明 なゲルを形成後、これを回転ロールで圧縮するとあるが、本発明者らはポリマーが硬 質で不透明なゲルになると、反応容器力 の払い出しがもはや不可能となり、実質的 に PHAは回収不能となることを経験した。
特許文献 4では、主に植物力ゝらの PHAの回収を溶剤を用いて行っている力 PHA 濃度 1%で行っており、このような低濃度では使用する溶剤量が膨大となり実質的に 工業ィ匕は困難である。また、上記条件においてもゲルィ匕を防止できないことを本発明 者らは経験した。
[0006] このように、 PHAを溶剤により抽出し回収する場合、晶析時のゲルィ匕が激しいため実 質的に簡便と考えられる溶剤抽出法が利用できない。あるいは、ゲル化を回避する ためには低濃度での溶解と晶析を行うしかなく、 PHAの回収が非効率になるためェ 業的に採算が合わない、という現状がある。このように、 PHAのゲルィ匕は深刻な問題 であるが、 PHAが実用化に到っていない大きな原因の一つになっているにもかかわ らず、未だゲルィ匕を回避する有効な手立ては見つ力つて 、な!/、。
特許文献 1：特開昭 59— 205992号公報
特許文献 2 :特開平 2 - 69187号公報
特許文献 3：特表平 10- 504460号公報
特許文献 4:米国特許第 5942597号明細書
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0007] 従って、本発明の課題は、ポリヒドロキシアルカノエート含有バイオマスより、溶剤を用 いてポリヒドロキシアルカノエートを抽出後ポリヒドロキシアルカノエートを晶析する時、 ポリヒドロキシアルカノエートが実質的に払い出し不可能なゲルイ匕した状態になるの を回避し、回収が極めて容易な状態の当該ポリマーを得る方法を提供することである
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、乾燥バイオマスある いは湿バイオマスから PHAを炭素数 4一 10の 1価のアルコール中に 70°C以上で溶 解させたのち、該抽出液をバイオマス残渣から分離し、抽出溶液中に水分が 0. 1— 10重量％、好ましくは 2— 8重量％存在するように抽出液を調製し、この抽出液を含 水状態にすることが PHAの強度のゲルィ匕を最小限に止め、さらに溶液を 70°Cより温 度を低くすることにより収量が増大し、し力も PHAが濾過により回収可能な状態となる ことを発見し、本発明を完成させた。
[0009] すなわち、本発明は、抽出溶剤が炭素数 4一 10の 1価アルコールであり、溶解液総 量に対して水を 0. 1重量％から 10重量％含有するポリヒドロキシアルカノエート溶解 液を 70°C以上に保温し、 70°Cより低い温度に冷却することにより、ポリヒドロキシアル カノエートの結晶を析出させることを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート結晶の 製造方法に関する。
[0010] 以下に好ましい実施の形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
本発明に使用される抽出溶剤は炭素数 4から 10の 1価のアルコールであり、そのよう な抽出溶剤としてはブタノール、ペンタノール、へキサノール、ヘプタノール、オタタノ ール、ノナノール、デカノール、及びそれらの異性体が挙げられる力 より好ましくは 沸点が比較的低ぐ値段が比較的安価な炭素数 4一 7の、抽出、溶解能力に非常に 優れている 1価アルコールであり、そのような 1価のアルコールとしては、ブタノール、 ペンタノール、へキサノール、ヘプタノール及びそれらの異性体が本発明の抽出溶 剤として特に好ましい。上記ブタノールとしては、イソブタノールが好ましい。上記抽 出溶剤は、 1種又は 2種以上を用いることができる。
[0011] 本発明の好ましい実施態様によれば、 PHAは乾燥バイオマスカも抽出することもで きるし、湿バイオマスからの抽出も行うことができる。何れの場合にも、抽出溶液中に 水分が 0. 1— 10重量％、好ましくは 2— 8重量％存在するように抽出液を調製する。 これにより、抽出後の晶析時に強度のゲルイ匕が緩和されることを、本発明者らは初め て発見した。但し、抽出液中の水分含量が 10重量％を超える場合、抽出溶剤の回 収が困難となる。
[0012] 抽出操作の好ましい実施態様によれば、バイオマスより PHAを本発明による抽出溶 剤の 1つで抽出する。 PHA濃度は特に制限されないが、好ましくは 1一 20重量％、よ り好ましくは 2— 15重量％、さらに好ましくは 3— 10重量％になるよう抽出溶剤をカロえ ればよい。 PHAを抽出するための温度は 70°C以上が好ましぐより好ましくは 80°C 以上、さらに好ましくは 90°C以上で行う。しかし、 PHAの分解を回避するために温度 は実質的に 100°Cを越えないことが好ましい。 PHAを抽出するための時間は特に制 限されないが、一般に 20— 150分であり、良好な抽出効率と分解を防ぐ点から 60— 120分がより好ましい。次いで抽出溶液を不溶性バイオマスと分離する。この場合カロ 熱された濾過器、あるいは加熱された遠心分離機、例えばデカンター等を使用する のが有利である。分離を行うときは加圧状態で行っても良いが、分離中に温度が 70 °Cよりも低くなると急激にゲルイ匕し、やがて固化して残渣との分離が不能となる場合 がある。そのためバイオマス残渣を除去するまでは溶液は常に 70°C以上で保温する 。その後、抽出液を 70°Cより低い温度まで徐冷することにより PHAの晶出量を増大さ せることができる。
[0013] PHAの回収は、 PHA溶解溶液から液体を濾過、遠心分離など当業者には周知の 方法で行われる。回収した PHAは、水、メタノール、エタノール、ブタノール、アセトン 、へキサン、ヘプタンなどの溶剤またはその混合物で洗浄することができる力 これら に限られるわけではない。 PHAの乾燥は、当業者には周知の方法、たとえば気流乾 燥、真空乾燥などで行われる。
[0014] 本発明における PHAとは、ヒドロキシアルカノエートの重合体の総称である。ヒドロキ シアルカノエート成分としては特に限定されないが、具体的には、 3—ヒドロキシブチレ ート（3HB)、 3—ヒドロキシバレレート（3HV)、 3—ヒドロキシプロピオネート、 4ーヒドロ キシブチレート、 4ーヒドロキシバレレート、 5—ヒドロキシバレレート、 3—ヒドロキシへキ サノエート（3HH)、 3—ヒドロキシヘプタノエート、 3—ヒドロキシォクタノエート、 3—ヒド 口キシノナノエート、 3—ヒドロキシデカノエートなどが挙げられる。本発明における PH Aは、これらヒドロキシアルカノエートの単重合体であっても、 2種以上が共重合した 共重合体であってもよいが、 2種以上が共重合した共重合体が好ましい。 PHAの具 体例としては、 3HBの単重合体である PHBや、 3HBと 3HVの 2成分共重合体であ る PHBV、 3HBと 3HHとの 2成分共重合体 PHBH (特許第 2777757号公報参照） または、 3HBと 3HVと 3HHとの 3成分共重合体 PHBHV (特許第 2777757号公報 参照）などが例示できる。特に、生分解性ポリマーとしての分解性と柔らかい性質を 持つ点で、モノマー成分として 3HHを有する共重合体が好ましぐより好ましくは PH BHである。このとき PHBHを構成する各モノマーの mol比については特に限定され るものではないが、良好な加工性を示す点から 1一 99mol%のものが好ましぐより好 ましくは 1一 30mol%である。また、晶析時の結晶性状の良好さから、好ましくは 3H Hmol%は 20mol%以下であり、より好ましくは 15mol%以下、とりわけ操作性の良 好さから 10mol%以下が好ましい。 PHBHVの場合、構成する各モノマーユニットの 糸且成比については特に限定されるものではないが、例えば、 3HBユニットの含量は 1 一 95mol%、 3HVユニットの含量は 1一 96mol%、 3HHユニットの含量は 1一 30m ol%と!、つた範囲のものが好適である。
[0015] PHAが実用化できるためには、 PHAはゲルクロマトグラフィー法でポリスチレンを分 子量標準とした重量平均分子量 1万以上を有しなければならない。好ましくは 5万以 上、より好ましくは 10万以上、特に 20万以上である。
[0016] 本発明に用いられるバイオマスは、細胞内に PHAを蓄積することが可能な生物であ れば特に限定されない。例えば、 Alcaligenes lipolytica, Alcaligenes latus等 のアルカリゲネス属、 Ralstonia eutrophaなどのラルストニア属、シュウドモナス属（ Pseudomonas)、バチノレス属 (Bacillus)、ァゾトバクター属 (Azotobacter)、ノカノレ ディア属 (Nocardia)、ァエロモナス属 (Aeromonas)、 Clostridium属、 Halobact erium属、 Rhoao spirillum 、 Zoogloea晨、 Candida腐、 Yarrowia晨、 Saccnar omyces属などの微生物は、培養条件を調整することによって PHAを細胞内に蓄積 することが可能である。また、これら微生物の PHA合成に関与する遺伝子群を導入 した形質転換体であっても良い。その場合、宿主としては特に限定されず、上記微生 物の他、大腸菌や酵母 (WO01Z88144参照）などの微生物や、さらには植物など が挙げられる。このなかで、ァエロモナス属の A. caviaeや、該 A. caviaeの PHA合 成酵素群の遺伝子を導入した形質転換菌体が、ポリマーとして優れた PHBHを合成 できる能力があるという点で好ましい。特に、 A. caviaeの PHA合成酵素群の遺伝子 を導入した Ralstonia eutrophaがより好ましぐ該微生物の 1例は、 Alcaligenes eutrophus AC32 (受託日：平成 9年 8月 7日、受託番号： FERM BP— 6038)とし て日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6にある独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センターに、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されている
[0017] ここに挙げた PHA生産微生物の培養方法については特に限定されないが、例えば 特開 2001— 340078号公報に示した当業者に周知の方法が用いられる。
[0018] PHAを回収するうえで、培養後の微生物菌中の PHA含有率は、高い方が好ましい のは当然であり、工業レベルでの適用においては乾燥菌体中に 50重量％以上の P HAが含有されているのが好ましぐ以後の分離操作、分離ポリマーの純度等を考慮 するとより好ましい PHA含有率は 60重量％以上、さらには 70重量％以上である。
[0019] 培養完了後は、菌体を定法で、例えば噴霧乾燥等により直接培養液力 乾燥菌体を 得る、あるいは、遠心や膜分離などの方法により菌体を回収する。回収した菌体は、 乾燥した状態、ある 、は水で湿らした湿菌体の状態で抽出工程に用いることができる 。また、回収菌体をメタノール、アセトン等の脂質溶剤で洗浄した湿菌体、あるいはこ れを乾燥したものも PHA抽出用菌体として用いることができる。
[0020] 本発明により得られたポリヒドロキシアルカノエートは、各種繊維、糸、ロープ、織物、 編物、不織布、紙、フィルム、シート、チューブ、板、棒、容器、袋、部品、発泡体など の形状に成形できる。また、 2軸延伸フィルムにも加工できる。成形品は、農業、漁業 、林業、園芸、医学、衛生品、衣料、非衣料、包装、その他の分野に好適に用いるこ とがでさる。
[0021] 本発明により処理した後のバイオマス物質は動物飼料として用いることが好ま U 、。
従って、本発明で用いる溶媒は、動物飼料として許容可能の量であることが好ましい 。しかし、溶媒はバイオマス物質力 実質的に除去する方が好ましい。 発明の効果
[0022] 本発明の方法により、ゲルィ匕を抑制し、流動性があり、払い出し可能なポリヒドロキシ アルカノエートを得ることができるため、生分解性のポリヒドロキシアルカノエートをェ 業的に安価に生産、提供できるようになる。
発明を実施するための最良の形態
[0023] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
以下の実施例においては、いずれも共重合ポリエステルとして、ポリ（3—ヒドロキシブ チレ一トー co— 3—ヒドロキシへキサノエート）（以下、 PHBHと略す)を生産した。もちろ ん本発明はこれら実施例にその技術範囲を限定するものではなぐ PHBHに限られ るものではない。
[0024] (実施例 1)
ァエロモナス ·キヤビエ由来の PHA合成酵素群遺伝子を導入した R. eutropha (寄 託番号 FERM BP— 6038)を特開 2001— 340078の実施例 1に記載した方法で培 養を行い、 PHBHの生産を行った。培養終了後遠心分離により菌体を回収し湿菌体 を得た。さらにこの菌体を 50°Cで 15時間真空乾燥し乾燥菌体を得た。乾燥菌体中 の PHBHの含量は 60%、重量平均分子量は 130万、 3—ヒドロキシへキサノエ一ト（ 以下、 3HHと略す)組成は 7mol%であった。この乾燥菌体 24. 8gにイソブタノール 211. 4gを加え、 100°Cで 1時間抽出を行った。溶液を 100°Cに保温したジャケット 式加圧濾過器に移し濾過により PHBH溶解液を回収した。回収した溶解液を 90°C に保温し、その温度を維持した状態で、溶液を強攪拌しながら水 10gを徐々に添カロ した (水含量は 4. 1重量％)。添加終了後、溶液を強攪拌しながら室温まで徐々に冷 却すると、 PHBHが沈殿した。該沈殿は濾過により容易に回収できた。回収した PH BHをイソブタノール 50gで洗浄後 45°Cで真空乾燥した。回収量は 14. lg (95%)、 純度 99%以上、 3HH組成 7mol%であった。分子量は 110万と減少した力 加工に は十分な分子量であった。
[0025] (実施例 2)
ァエロモナス ·キヤビエ由来の PHA合成酵素群遺伝子を導入した R. eutropha (寄 託番号 FERM BP— 6038)を特開 2001— 340078の実施例 1に記載した方法で培 養を行い、 PHBHの生産を行った。培養終了後遠心分離により菌体を回収し湿菌体 を得た。湿菌体中の PHBHの含量は 30%、重量平均分子量は 130万、 3HH組成 は 7mol%であった。この湿菌体 50. Ogにイソブタノール 211. 4gを加え、 100°Cで 1 時間抽出を行った。溶液を 100°Cに保温したジャケット式加圧濾過器に移し濾過に より PHBH溶解液を回収した。回収した溶解液を 90°Cに保温し、その温度を維持し た状態で、溶液を強攪拌しながら水 5gを徐々に添加した (水含量は 1. 9重量％)。 添加終了後、溶液を強攪拌しながら室温まで徐々に冷却すると、 PHBHが沈殿した 。該沈殿は濾過により容易に回収できた。回収した PHBHをイソブタノール 50gで洗 浄後 45°Cで真空乾燥した。回収量は 14. lg (94%)、純度 99%以上、 3HH組成 7 mol%であった。分子量は 110万と減少した力 加工には十分な分子量であった。
[0026] (比較例 1)
実施例 1において、水を添加することなく強攪拌下 PHA抽出液を徐冷により室温ま で冷却した (水含量は 0. 04重量％)。その結果、 PHAはゲルイ匕し流動性が無くなつ たため、払い出し不能であった。その後、水を添加しても流動性は改善されず、払い 出し不能であった。
[0027] 本実施例における分子量の測定は、 Shodex K806L (300x8mm, 2本連結）（昭 和電工社製)を装着した島津製作所製ゲルクロマトグラフィシステム (RI検出)を用い クロ口ホルムを移動相として分析した。分子量標準サンプルには市販の標準ポリスチ レンを用いた。また PHBHの純度は PHBHをメチルエステル化しガスクロマトグラフィ により測定した。水分含量はケット科学研究所製の赤外線水分計 FD— 230を用いて 測定した。

Claims

請求の範囲
[1] 抽出溶剤が炭素数 4一 10の 1価アルコールであり、溶解液総量に対して水を 0. 1重 量％から 10重量％含有するポリヒドロキシアルカノエート溶解液を 70°C以上に保温 し、 70°Cより低い温度に冷却することにより、ポリヒドロキシアルカノエートの結晶を析 出させることを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
[2] 1価アルコールがブタノール、ペンタノール、へキサノール、ヘプタノール、ォクタノー ル、ノナノール、デカノール、及びそれらの異性体から選択されることを特徴とする請 求項 1に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
[3] ポリヒドロキシアルカノエート溶解液におけるポリヒドロキシアルカノエート濃度が 1重 量％から 20重量％であることを特徴とする請求項 1あるいは 2に記載のポリヒドロキシ アルカノエート結晶の製造方法。
[4] ポリヒドロキシアルカノエートカ 3—ヒドロキシブチレート、 3—ヒドロキシバレレート、 3- ヒドロキシプロピオネート、 4ーヒドロキシブチレート、 4ーヒドロキシバレレート、 5—ヒドロ キシバレレート、 3—ヒドロキシへキサノエート、 3—ヒドロキシヘプタノエート、 3—ヒドロキ シォクタノエート、 3—ヒドロキシノナノエートおよび 3—ヒドロキシデカノエートからなる群 力 選択されるモノマーのうち少なくとも 2種類以上が共重合した共重合体であること を特徴とする請求項 1一 3のいずれか一項に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶 の製造方法。
[5] ポリヒドロキシアルカノエートカ 3—ヒドロキシへキサノエートと他のヒドロキシアルカノ エート 1種以上との共重合体であることを特徴とする請求項 1一 4のいずれか一項に 記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
[6] ポリヒドロキシアルカノエートカ 3—ヒドロキシへキサノエートと 3—ヒドロキシブチレート との共重合体であることを特徴とする請求項 1一 5のいずれか一項に記載のポリヒドロ キシアルカノエート結晶の製造方法。
[7] ポリヒドロキシァノレカノエートカ Aeromonas属、 Alcaligenes属、 Azotobacter属、 Bacillus属、 ClostridiumJ¾、 HalobacteriumJ¾、 Norcadia属、 Rhodospirillum 属、 Psuedomonas 、 Ralstonia厲、 Zoogloea厲、 Candida晨、 Yarrowia晨及び Saccharomyces属カ なる群より選択される少なくとも 1種の微生物により産生され たものであることを特徴とする請求項 1一 6のいずれか 1項に記載のポリヒドロキシァ ルカノエート結晶の製造方法。
[8] ポリヒドロキシアルカノエートカ ァエロモナス 'キヤビエ由来のポリヒドロキシアルカノ エート合成遺伝子群を導入された形質転換体により産生されたものである請求項 1 一 7のいずれか 1項に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
[9] ァエロモナス ·キヤビエ由来のポリヒドロキシアルカノエート合成遺伝子群を導入され た形質転換体力 ァエロモナス'キヤビエ由来のポリヒドロキシアルカノエート合成遺 伝子群を導入された Ralstonia eutrophaである請求項 8に記載のポリヒドロキシァ ルカノエート結晶の製造方法。
[10] ポリヒドロキシアルカノエートを抽出し、かつその溶媒含量を低下させた後の残存バイ ォマス物質を動物の飼料とすることを特徴とする請求項 1一 9のいずれか一項に記載 のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
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