WO2005042742A1

WO2005042742A1 - サルｎｐｙｙ４受容体及び化合物の評価方法

Info

Publication number: WO2005042742A1
Application number: PCT/JP2004/016242
Authority: WO
Inventors: Hideki Sano; Hisashi Iwaasa
Original assignee: Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2003-10-30
Filing date: 2004-11-01
Publication date: 2005-05-12
Also published as: EP1688494A1; CA2543999A1; JPWO2005042742A1; EP1688494A4; US20070083037A1

Abstract

　配列番号１又は３に記載の核酸、配列番号２又は４に記載のタンパク質、前記核酸からなる遺伝子を含む組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換細胞を用いることにより、ヒト以外の霊長類のＮＰＹ　Ｙ４遺伝子等が提供され、また、ＮＰＹ　Ｙ４受容体に作用する化合物の評価やスクリーニングが可能となる。

Description

明細書

サル NPY Y4受容体及び化合物の評価方法

技術分野

[0001] 本発明は、新規サル神経ペプチド Y (Neuropeptide - Y:以下、 NPYと称する） Y4 受容体遺伝子、タンパク質、前記遺伝子を含有する組換えベクター、前記組換えべクタ一を含む形質転換細胞及び前記遺伝子又はタンパク質を用いた化合物の評価方法に関する。

背景技術

[0002] NPYは 36アミノ酸力もなるペプチドであり、 1982年、立元らにより豚脳より単離された (非特許文献 1)。 NPYは中枢神経系及び末梢神経系に広く分布し、神経系における最も多量に存在するペプチドの一つとして、生体にぉ、て多様な機能を司っている。

[0003] すなわち、 NPYは中枢において食欲促進物質として働くとともに、各種ホルモンの分泌又は神経系の作用を介して脂肪蓄積を顕著に促進する。例えば、 NPYの脳室内連続投与はこれらの作用に基づき、肥満及びインスリン抵抗性を誘発することが知られている。また、 NPYは、うつ病、不安、精神***、痛み、痴呆及び概日リズムの調節などの中枢作用を持つことが知られている。さらに、 NPYは、末梢において、交感神経終末にノルェピネフリンと共存し、交感神経系の緊張性と関係している。 NPY の末梢投与は血管収縮を引き起こし、またノルェピネフリンを初めとする他の血管収縮物質の作用を増強することが知られている。

[0004] NPYは、その類縁体であるペプチド ΎΥ (Peptide— YY:以下、 PYYと称する）及びパンクレアティック ·ポリペプチド（Pancreatic Polypeptide：以下、 PPと称する）と一部共通の受容体を介して、多種多様な薬理作用を有する。これら NPYによる薬理作用は NPY Y1から Y5といった、少なくとも 5種類の受容体の単独あるいは相互作用を介して惹起されることが知られている（非特許文献 2)。なかでも、 NPY Y4受容体は、 PPとの親和性が高ぐ特に、顕著な薬理作用としては、膝外分泌及び消化管運動の抑制が報告されている（非特許文献 3)。また、中枢においては、性ホルモンの分泌を促進することが知られている（非特許文献 4)。さらに、マウスやヒトへ PPを末梢投与すると、食欲が抑制されることも見出されている (非特許文献 5、非特許文献 6)。

[0005] NPY及び関連ペプチドの機能は、中枢又は末梢神経系に存在する NPY受容体に結合することにより発現される。したがって、 NPY及び関連ペプチドの NPY受容体との結合を阻害すればこれらの薬理作用発現を阻止することができる。その結果、 NPY及び関連ペプチドの NPY受容体結合に拮抗する物質は、 NPY及び関連ぺプチドが関与する各種疾患、例えば狭心症、急性 ·うつ血性心不全、心筋梗塞、高血圧、腎臓病、電解質異常、血管れん縮等の循環器系疾患、例えば過食症、うつ病、不安、痙攣、てんかん、痴呆、痛み、アルコール依存症、薬物の断薬に伴う禁断症状、概日リズムの変調、統合失調症、記憶障害、睡眠障害、認知障害等の神経系疾患、例えば肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、痛風、脂肪肝等の代謝性疾患、不妊、早産、性機能障害等の生殖系疾患、消化管系疾患、呼吸器系疾患、炎症性疾患又は緑内障等の予防又は治療における有用性が期待できる。また、最近、ある種の NP

Y受容体拮抗物質が、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化症の予防又は治療において有用であることが見出されている（特許文献 1)。

[0006] このように、 NPY及び関連ペプチドとその受容体の生体内の機能の解明が前述の各種疾患に対する治療薬や診断薬の開発に繋がることから、遺伝子レベルでの解析が急速に進んできた。 NPY Y4受容体に関しては、遺伝子レベルでの解析として、既にヒト NPY Y4受容体遺伝子が単離されている (非特許文献 7、非特許文献 8、特許文献 2)。ヒト NPY Y4受容体は、ヒトゲノムライブラリーを NPY Y1受容体 cDNA をプローブとしてスクリーニングすることにより単離されたものであり、 7回膜貫通型構造を有し、 Y1受容体とはアミノ酸レベルで 42%の相同性を有することが明らかにされた。また、 NPYの他、 PPにも高い親和性を持ち、 NPY Y1受容体や Y2受容体と同じぐ細胞内カルシウム濃度を上昇させ、 cAMP産生に対して抑制的な効果を示すことが明らかにされている。

[0007] 一方、治療薬や診断薬の開発において、候補化合物は、げっ歯類及び霊長類においてその生理学的作用が評価される。これは、候補化合物が動物種によって異なる薬効を示すことがあるためであり、よりヒトに近い霊長類において評価することが効率的な治療薬や診断薬の開発に結びつく。

特許文献 1：国際公開第 99Z27965号パンフレット

特許文献 2 :国際公開第 95Z17906号パンフレット

非特許文献 l :Nature、 296卷、 659頁（1982年）

非特許文献 2 :Trends in Neuroscience、 20卷、 294頁（1997年）

非特許文献 3 : Gastroenterology、 85卷、 1411頁（1983年）

非特許文献 4: Endocrinologyゝ 140卷、 5171頁（1999年）

非特許文献 5 : Gastroenterologyゝ 124卷、 1325頁（2003年）

非特許文献 6 : The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism^ 8

8卷、 3989頁（2003年）

非特許文献 7 :The Journal of Biological Chemistry, 270卷、 26762頁（19 95年）

非特許文献 8 : The Journal of Biological Chemistry, 270卷、 29123頁（19 95年）

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] し力しながら、ヒト以外の霊長類の NPY Y4受容体遺伝子は未だ単離されておらず、このような遺伝子を用いた治療薬や診断薬の評価は不可能な状況であった。

[0009] 本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ヒト以外の霊長類の NPY Y4受容体遺伝子及びタンパク質を提供することを目的とする。また、当該遺伝子又はタンパク質を用いた化合物の評価方法を提供することを目的とする課題を解決するための手段

[0010] 本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ァカゲザルの NPY

Y4受容体遺伝子を単離することに成功するとともに、当該受容体を用ヽた結合実験によりリガンドの評価を行うことに成功し、本発明を完成した。

[0011] すなわち、本発明の核酸は、配列番号 1又は 3に記載の塩基配列を含むことを特徴とする。

[0012] また、本発明の核酸は、配列番号 1又は 3に記載の塩基配列力もなることを特徴とする。このような核酸カゝらなる、サル NPY Y4受容体遺伝子 (NPY Y4受容体としての活性を有するタンパク質をコードする、サル由来の遺伝子)も、本発明によって提供される。

[0013] さらに、本発明の核酸は、配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列力なるタンパク質をコードすることを特徴とする。このような核酸力もなる、サル NPY Y4受容体遺伝子も、本発明によって提供される。

[0014] また、本発明の核酸は、配列番号 1又は 3に記載の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ NPY Y4 受容体としての活性を有するタンパク質をコードする、サル由来の単離された核酸であることを特徴とする。このような核酸カゝらなる、サル NPY Y4受容体遺伝子も、本発明によって提供される。

[0015] さらに、本発明の組換えベクターは、前述の核酸又は遺伝子を含むことを特徴とする。また、本発明の形質転換細胞は、前記組換えベクターを含むことを特徴とする。

[0016] また、本発明のタンパク質は、配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

[0017] さらに、本発明のタンパク質は、配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする。

[0018] また、本発明のタンパク質は、配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列において 1又は 2以上のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ N PY Y4受容体としての活性を有する単離されたタンパク質であることを特徴とする。

[0019] このような核酸、遺伝子、タンパク質、組換えベクター又は形質転換細胞を利用することにより、霊長類 (主としてサル) NPY Y4受容体又はその変異体の発現系の構築が可能となるとともに、当該発現系を用いたィ匕合物の評価系の構築が可能となる。

[0020] また、本発明の化合物の評価方法は、サル NPY Y4受容体遺伝子を導入し、当該受容体を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該受容体に対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。

[0021] さらに、本発明の化合物の評価方法は、サル NPY Y4受容体遺伝子を導入し、当該受容体を発現する細胞を調製する工程と、該細胞に被検化合物を接触させるェ程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の当該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。

[0022] また、本発明の化合物の評価方法は、被検化合物を、サル NPY Y4受容体タンノク質 (NPY Y4受容体としての活性を有するサル由来のタンパク質）に接触させる工程と、接触による前記タンパク質の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。

[0023] 以上のような化合物の評価方法によれば、霊長類 NPY Y4受容体を使用した治療薬 '診断薬の候補ィ匕合物の評価やスクリーニングが可能となり、よりヒトに近いモデルシステムによって効率的な薬剤の開発が可能となる。

発明の効果

[0024] 本発明の核酸、タンパク質及び化合物の評価方法によれば、ヒト以外の霊長類の N PY Y4受容体遺伝子及びタンパク質を得ることが可能となるとともに、当該遺伝子又はタンパク質を用いて化合物の評価、スクリーニングを行うことが可能となる。従つて、当該遺伝子又はタンパク質を用いた治療薬や診断薬の評価、開発が可能となる

図面の簡単な説明

[0025] [図 1]図 1は、本発明の核酸 (配列番号 1)を用いた場合の、膜画分濃度とヒト PP結合量との関係を示すグラフである。

[図 2]図 2は、本発明の核酸 (配列番号 3)を用いた場合の、膜画分濃度とヒト PP結合量との関係を示すグラフである。

[図 3]図 3は、本発明の核酸 (配列番号 1)を用いた場合の、ヒト PP、ヒト NPY及びブタ PYYのペプチド濃度とヒト PP結合量との関係を示すグラフである。

[図 4]図 4は、本発明の核酸 (配列番号 3)を用いた場合の、ヒト PP、ヒト NPY及びブタ PYYのペプチド濃度とヒト PP結合量との関係を示すグラフである。 [図 5]図 5は、本発明の核酸 (配列番号 1又は 3)をトランスフエタトした細胞における、ヒト PP濃度と蛍光強度の変化との関係を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0026] 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

[0027] 本発明における「核酸」とは、例えば、 DNA、 RNA若しくは修飾された DNA又は R NAをいい、好ましくは DNAをいう。また、前記 DNAとしては、ゲノム DNAであると c DNAであるとを問わず、一本鎖であってもよぐ二本鎖であってもよい。

[0028] また、本発明における「単離された」核酸又はタンパク質とは、組換え DNA技術により作成された場合は細胞物質、培養培地を実質的に含有せず、化学合成された場合には前駆体物質又はその他の物質を実質的に含まない、核酸又はタンパク質をいう。

[0029] また、本発明における「ストリンジェントな条件でノ、イブリダィズする」とは、二つの核酸断片力 Molecular Cloning : A Laboratory Manual、第 2版、コールドスプリングノヽーノー（1989)、 9. 47-9. 62及び 11. 45—11. 61【こ記載されたノヽイブリダィゼーシヨン条件下で、相互にノ、イブリダィズすることを意味する。より具体的には、例えば、約 45°Cにて 6. 0 X SSCでハイブリダィゼーシヨンを行った後に、 50°Cにて 2 . OxSSCで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジエンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジエンシーとしての約 2. OxSSC, 50°Cから、高ストリンジエンシーとしての約 0. 2 X SSC、 50°Cまで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジエンシー条件の室温、約 22°Cから、高ストリンジエンシー条件の約 65°Cまで増大させることができる。

[0030] 次に、本発明に係るァカゲザル NPY Y4受容体について説明する。

[0031] 本発明に係るァカゲザル NPY Y4受容体遺伝子のうち、塩基配列が明らかになつているものには 2種類 (配列番号 1及び 3)あり、これらは 1塩基相違する。これらの遺伝子はいずれも 1128塩基のオープンリーディングフレームを有し、 375アミノ酸のタンパク質 (配列番号 2及び 4)をコードする。しかし、翻訳領域内の 1111番目の塩基が相違し、この相違に基づいて 361番目のアミノ酸が相違する。力かる相違は遺伝子多型によるものと本発明者らは考えて、る。 [0032] ァカゲザル NPY Y4受容体遺伝子のクローユング法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、ァカゲザル NPY Υ4受容体遺伝子又は当該遺伝子に相同性の高、遺伝子由来の核酸断片をもとに 5 RACE又は 3 '— RACEで全長 cDNA を増幅する方法、適切なベクター（プラスミドベクター、ノクテリオファージ等）を用いて構築された cDNAライブラリーをァカゲザル NPY Y4受容体遺伝子の核酸断片を用いてスクリーニングする方法が挙げられる。これらの方法は当業者に周知の方法によっておこなうことができ、例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 85卷、 8998頁（1988)を参照することができる。

[0033] また、配列番号 1に記載のァカゲザル NPY Y4受容体遺伝子とヒト NPY Y4受容体遺伝子（GenBank accession No. NM— 005972)との間の相同性は、コーデイング領域において約 95. 6%であり、 50塩基が相違する。また、配列番号 3に記載のァカゲザル NPY Y4受容体遺伝子とヒト NPY Y4受容体遺伝子との相同性は、コーディング領域において 95. 5%であり、 51塩基が相違する。本発明の核酸には、配列番号 1又は 3に記載の塩基配列において 1又は 2以上の塩基の置換、欠失、挿入又は付カ卩があるものも含まれ、好ましくは 1一 49塩基、より好ましくは 1一 30塩基、さらに好ましくは 1一 20塩基、特に好ましくは 1一 10塩基、さらに好ましくは 1一 5塩基の置換、欠失、挿入又は付加があってもよい。また、前記置換、欠失、挿入又は付加がある核酸の塩基配列は、その相同性に基づけば、配列番号 1又は 3に記載の塩基配列との相同性が 96%以上であることが好ましぐ 97%以上であることがより好ましく、 98%以上であることがさらに好ましぐ 99%以上であることが特に好ましい。ここで、前記置換、欠失、挿入又は付加がある核酸は、本発明に係る配列番号 1又は 3に記載の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列力なる核酸とストリンジントな条件下でノ、イブリダィズする核酸を単離することにより得ることができ、その種類としては生物学的に活性な核酸であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、サル由来の NPY Y4受容体遺伝子 (NPY Y4受容体としての活性を有するタンパク質をコードする遺伝子)であることが好ましぐサル由来の NPY Y4受容体遺伝子としては、例えば、ァカゲザル、力-クイザル、二ホンザル、リスザル、ミドリザノレ、ァヌビスヒヒ又はコモンマーモセットの NPY Y4受容体遺伝子が挙げられる。 [0034] また、本発明は、配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む。配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、上述したように、 375アミノ酸力もなる。また、これら二つのタンパク質間では、 361番目のアミノ酸が相違している。前記変異体としては、配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列において、 1又は 2以上 16以下のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されているアミノ酸配列からなるタンパク質や、 1又は 2以上のアミノ酸が付加されて、るアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。このような変異タンパク質は、生物学的に活性であることが好ましぐ NPY Y4受容体としての活性を有することがより好ましい。

[0035] ァカゲザル NPY Y4受容体タンパク質の調製方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、単離したァカゲザル NPY Y4受容体遺伝子を発現ベクターに挿入した後、この発現ベクター (組換えベクター）を動物細胞、昆虫細胞又は大腸菌等の宿主細胞に導入して前記遺伝子を発現させ、その遺伝子産物であるタンパク質を精製する方法が挙げられる。力かる方法は当業者に周知の方法によって行うことができ、例えば、 Molecular Cloning : A Laboratory Manual、第 2版、第 3版、コ一ルドスプリングハーバー（1989、 2001)を参照して行うことができる。

[0036] また、本発明は以下のヽずれかの核酸又は遺伝子を含有する発現ベクター (組換えベクター）をも提供する。

1.配列番号 1又は 3に記載の塩基配列を含む単離された核酸。

2.配列番号 1又は 3に記載の塩基配列からなる単離された核酸、又はこの核酸からなるサル NPY Y4受容体遺伝子。

3.配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列力なるタンパク質をコードする単離された核酸、又はこの核酸からなるサル NPY Y4受容体遺伝子。

4.配列番号 1又は 3に記載の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列力なる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ NPY Y4受容体としての活性を有するタンパク質をコードする、サル由来の単離された核酸、又はこの核酸力もなるサル NPY Y4受容体遺伝子。

[0037] 本発明の組換えベクターは、公知の方法に従って、本発明の核酸又は遺伝子を適当な発現ベクターに挿入することにより得ることができる。ここで、前記発現ベクターとしては、当業者に周知のベクターであれば特に制限はなぐ例えば、 pcDNA3. 1、 p BlueBacHis2、 pCI— neo、 pcDNAI、 pMClneo、 pXTl、 pSG5、 pEFl/V5— H isB、 pCR2. 1、 pETl l又はえ gtl lが挙げられる。本発明の組換えベクターは、宿主細胞中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列（S D配列)及びターミネータ一を含んだものであることが好ま、。

[0038] また、前記 1. における「配列番号 1又は 3に記載の塩基配列を含む」とは、前記塩基配列に、ベクターとのリンカ一配列や遺伝子組換えに使用可能な制限酵素切断部位等の遺伝子の改変に必要な配列が付加されて、ることを!、う。

[0039] さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む宿主細胞 (形質転換細胞)をも提供する。

[0040] 本発明の形質転換細胞は、公知の方法に従って、本発明の組換えベクターを適当な宿主細胞中に導入することにより得ることができる。ここで、前記宿主細胞としては、当業者に周知の細胞であれば特に制限はなぐ動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれでもよい。力かる細胞としては、具体的には、例えば、 COSl、 COS 7、 CHO、 NIH/3T3, 293、 Raji、 CV11、 C1271、 MRC— 5、 CPAE、 L— M (TK 一)、 HeLa又は Sf 9が挙げられる。前記組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、エレクト口ポレーシヨン、リン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、リポフエクシヨン法又は遺伝子銃法が挙げられる。

[0041] また、本発明は、配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体に対する抗体を含む。当該抗体は、前記タンパク質又はその一部のぺプチドを抗原として調製することができ、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の!/ヽずれであってもよい。当該抗体はェピトープとなるアミノ酸配列によってサル NPY Y 4受容体タンパク質のみならず、異種の NPY Y4受容体タンパク質にも反応する場合があるが、サル NPY Y4受容体タンパク質にのみ選択性を有する抗体を調製する場合には、サル NPY Y4受容体タンパク質において異種の NPY Y4受容体タンノク質との相同性の低い領域をペプチド抗原として使用してモノクローナル抗体を調製することにより、所望の特異性を有する抗体を調製することができる。 [0042] 次に、本発明にかかる、配列番号 1又は 3に記載の塩基配列を有する核酸、及び配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の用途について列挙し、それぞれ説明する。

[0043] (1)化合物の評価

本発明の核酸又はタンパク質を用いて、 NPY Y4受容体に作用する化合物の評価をすることができる。 NPY Y4受容体に対する作用の有無又はその程度を検出する方法として、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出する方法、被検化合物の接触によって変化した遺伝子の発現量を検出する方法、及び、当該接触によって生じた NPY Y4受容体を介した細胞内情報伝達の活性を検出する方法が挙げられる。以下、その内容を説明する。

[0044] 本発明の化合物の評価方法は、サル NPY Y4受容体遺伝子を導入し、当該受容体を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該受容体に対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。

[0045] また、本発明の第 2の化合物の評価方法は、サル NPY Y4受容体遺伝子を導入し、当該受容体を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。

[0046] 前記被検化合物としては、特に制限はなぐ例えば、タンパク質、ペプチド、非ぺプチド性ィ匕合物、人工的に合成されたィ匕合物が挙げられる。

[0047] また、サル NPY Y4受容体遺伝子を発現する細胞は、当業者が公知の方法で調製すればよぐ具体的な調製方法としては特に制限はないが、例えば以下の方法によることができる。すなわち、先ず、本発明の配列番号 1又は 3に記載の塩基配列を有する核酸又はその一部力なる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングする。ここで、前記ベクターとしては、発現べクタ一として利用可能なものであれば特に限定されないが、例えば、 pcDNA3. 1、 pBlu eBacHis2、 pCI— neo、 pcDNAI、 pMClneo、 pXTl、 pSG5、 pEFl/V5— HisB 、pCR2. 1、ρΕΤ11又はえ gtl l力挙げられる。

[0048] 次に、本発明の核酸又は遺伝子が挿入された発現ベクター (組換えベクター）を宿主細胞に導入する。力かる宿主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであつてもよく、具体的には、例えば、 COSl、 COS7、 CHO、 NIH/3T3, 293、 Raji、 C VI I、 C1271、 MRC— 5、 CPAE、 L M (TK—）、 HeLa又は Sf9が挙げられる。また、前記組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、エレクト口ポレーシヨン、リン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、リポフエクシヨン法又は遺伝子銃法が挙げられる。

[0049] 次に、このようにして調製した NPY Y4受容体を発現する細胞 (形質転換細胞）に被検化合物を接触させる。接触させる方法としては特に制限はなぐ例えば、水溶液や緩衝液のような溶液中で接触させる方法が挙げられる。細胞表面に発現した受容体と被検化合物との結合は、例えば、結合した化合物に付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度により検出する）のほか、細胞の膜画分を用いた結合実験による方法が挙げられ、これらは、当業者に公知の方法によって行うことができる。また、被検化合物の細胞表面上の前記受容体への結合による細胞内へのシグナル伝達 (例えば、 Gタンパク質の活性化、 Ca²⁺または cAMPの濃度変化 (FLI PR (Fluorometric Imaging Plate Reader)等が使用できる)、ホスホリパーゼ C の活性化、 pHの変化）を指標に検出することができる。また、前記シグナル伝達によつて生じたシグナル伝達経路上の分子の発現レベルや活性を指標にすることもできる。ここで、当該発現レベルを指標とする場合、発現レベルの測定法は特に制限されないが、例えば、ノーザンブロッテイング、リアルタイム PCR又は DNAチップが挙げられる。また、シグナル伝達経路上の分子の活性を指標にする場合、活性測定方法は特に制限されず、測定の対象となる分子の種類によって好適な方法を選択すればよい。

[0050] 一方、単離されたサル NPY Y4受容体タンパク質を化合物の評価に直接使用することもできる。すなわち、被検化合物をサル NPY Y4受容体に接触させ、次に、接触によって生じた前記タンパク質の活性の変化を検出する方法である。かかる接触の方法としては特に制限はなぐ具体的には、例えば、緩衝液 (リン酸緩衝液等)等の溶液中で混合することにより接触させる方法や、前記タンパク質をメンブレン上に固定し、メンブレン上で被検化合物と接触させる方法が挙げられる。

[0051] 次に、接触によって生じた前記タンパク質の活性の変化を検出する。

[0052] タンパク質の活性変化の検出方法としては、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよぐ具体的には、例えば、 NPY Y4受容体に対する NPY及び関連べプチドの結合活性を指標にする方法が挙げられる。

[0053] 前記の NPY及び関連ペプチドの結合活性を指標にする方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、 NPY Y4受容体タンパク質が固定されたメンブレンに対する被検化合物の親和性を測定することによって結合活性を測定する方法が挙げられる。ここで用いられる被検化合物は、検出が容易なように放射性同位体等で標識されていてもよい。また、前記結合活性の検出方法として、放射性同位体で標識した NPY及び関連ペプチドと競合して NPY Y4受容体へ結合する化合物を検出する方法も挙げられ、力かる方法を用いた場合には、被検化合物の標識は不要である

[0054] 以上のような化合物の評価方法により検出した結果、被検化合物の存在下における NPY及び関連ペプチドの結合活性力被検化合物の非存在下における NPY及び関連ペプチドの結合活性 (対照)より低ヽ値を示した場合には、当該被検化合物は、 NPY Y4受容体とリガンドまたはそのアナログとの結合を阻害すると判定される。このような化合物は、前記受容体に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物 (ァゴ二スト）および当該活性を有しな、化合物 (アンタゴ-スト）などが含まれる。ァゴ-ストは、前記受容体に対するリガンドと同様の生理活性を有している。一方、アンタゴ-ストは、前記受容体に対するリガンドが有する生理活性を有しておらず、前記受容体に対するリガンドの結合を阻害する。このため、これらァゴ- ストやアンタゴ-ストは、 NPY Y4受容体を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。

[0055] また、本発明の化合物の評価方法により、 NPY Y4受容体の活性を促進又は阻害する物質のスクリーニングを行うことができる。すなわち、上述した方法によって複数の被検化合物を評価することにより、ァゴニスト又はアンタゴ-ストとして機能する化合物を選択することができる。かかる選択の結果、被検化合物非存在下においてリガンドやそのアナログを作用させた場合の細胞における変化と比較して、細胞における変化が抑制されれば、当該被検化合物は、 NPY Y4受容体の活性を阻害する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が細胞における変化を増強させれば、当該化合物は、本発明に係る NPY Y4受容体の活性を促進する化合物であると判定される。このようなスクリーニング方法によって選択されたィ匕合物は、 NPYが関与する各種疾患、例えば狭心症、急性 ·うつ血性心不全、心筋梗塞、高血圧、腎臓病、電解質異常、血管れん縮等の循環器系疾患、例えば過食症、うつ病、不安、痙攣、てんかん、痴呆、痛み、アルコール依存症、薬物の断薬に伴う禁断症状、概日リズムの変調、統合失調症、記憶障害、睡眠障害、認知障害等の神経系疾患、例えば肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、痛風、脂肪肝等の代謝性疾患、不妊、早産、性機能障害等の生殖系疾患、消化管系疾患、呼吸器系疾患、炎症性疾患、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化症又は緑内障等の予防又は治療に有用であると考えられる。

[0056] また、上述した本発明の化合物の評価方法により、 PET(positron emission to mography)に用いるリガンドの評価を行うことができる。 PETは、水、酸素、ブドウ糖、アミノ酸と！/ヽつた生体内に存在する物質や薬物（目的とする受容体に対するリガンド等)を放射性物質で標識して体内に投与することにより、非侵襲的に生体機能を観察する方法であり、研究や臨床において利用されている。 PETの特徴は、トレーサーとして用いるリガンドに依存した機能特異的なイメージングを可能にする点にあり、新たなトレーサーの開発は未知の生体機能の解明や疾患の診断に不可欠である。本発明の化合物の評価方法によれば、被検化合物として PETリガンド候補物質を適用することにより、当該物質のインビト口での評価を行うことが可能となる。

[0057] (2)ハイブリダィゼーシヨンに用いるプローブ

本発明の配列番号 1又は 3に記載の塩基配列の一部、又は全部力なる核酸をノ、イブリダィゼーシヨン用のプローブとして使用することにより、 NPY Y4受容体遺伝子を検出することが可能である。力かる検出としては、生体由来の組織や細胞を被検体とした NPY Y4受容体遺伝子の検出のみならず、 ΝΡΥ Υ4受容体遺伝子又は当該遺伝子と相同性の高い遺伝子のクローユング等にも応用可能である。また、前記核酸をプローブとして使用し、種々の組織における遺伝子発現を調べることにより、遺伝子発現の分布を同定することも可能である。

[0058] 前記核酸をプローブとして使用する場合、ハイブリダィゼーシヨンの方法としては特に制限はなぐ例えば、サザンノヽイブリダィゼーシヨン、ノーザンハイブリダィゼーション、コロニーノヽイブリダィゼーシヨン、ドットノヽイブリダィゼーシヨン、 fluorescence in situ hybridization (FISH)ゝ in situ hybridization (ISH)ゝ DNAチップ法が挙げられる。

[0059] 前記核酸をノ、イブリダィゼーシヨン用のプローブとして使用する場合、少なくとも連続する 20塩基の長さの核酸が必要であり、好ましくは 40塩基、さらに好ましくは 60塩基、特に好ましくは 80塩基以上のものが使用される。また、当該プローブは、必要に応じて検出可能なように標識して用いてもよい。具体的には、例えば、 ³²P、 ¹⁴c、 ¹²⁵ι 、 ³H、 ³⁵S等の放射性同位体で標識されていてもよぐピオチン、蛍光色素、酵素、金コロイド等で標識されて、てもよ、。

[0060] また、前記核酸をノ、イブリダィゼーシヨン用のプローブとして使用する場合のハイブリダィゼーシヨンの条件としては、プローブの長さやハイブリダィゼーシヨンの対象となる遺伝子の種類に応じて当業者が適宜選択すればよいが、例えば、 Molecular C1 oning :A Laboratory Manual、第 2版、コールドスプリングハーバー（1989)、 9 . 47-9. 62及び 11. 45-11. 61を参照して行うことができる。より具体的には、約 4 5^QG【こて 6. 0 X SSCでノヽイブリダィゼーシヨンを行った後【こ、 50^oG【こて 2. OxSSCで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジエンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジエンシーとしての約 2. OxSSC, 50°C力ら、高ストリンジェンシ一としての約 0. 2 X SSC、 50°Cまで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジエンシー条件の室温、約 22°Cから、高ストリンジエンシー条件の約 6 5°Cまで増大させることができる。

[0061] (3) PCRに使用するプライマー

NPY Y4遺伝子を検出する方法として、本発明の配列番号 1又は 3に記載の塩基配列の一部をプライマーとして使用した Polymerase Chain Reaction (PCR)法を挙げることができる。

[0062] このようなプライマーの長さは、その塩基配列や単離する遺伝子の塩基配列等によつて適宜設定することができる力一般に、連続した 10— 60塩基であることが好ましく、 15— 30塩基であることがより好ましい。

実施例

[0063] 以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する力本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

[0064] (実施例 1：ァカゲザル Y4受容体遺伝子の単離）

ヒト Y4受容体遺伝子（GenBank accession No. U35232)の 5'及び 3'非翻訳領域の塩基配列に基づ、て hY4— 4FBamHI (配列番号 5)及び hY4— 1323RNotI 2 (配列番号 6)の 2本のオリゴ DNAプライマーを設計した。ァカゲザルのゲノム DNA (Clontech社）を铸型にして、これらのプライマーを用い、 94°C10秒間（変性反応） Z55°C1分間（アニーリング) Z68°C2分間（伸長反応）のサイクルを 40回繰り返し、 PCR反応を行った。得られた PCR増幅産物を制限酵素 BamHI及び Notlで消化し、 pEFl/V5— HisBプラスミドベクター（Invitrogen社）にクローユングした。独立した 6つの PCR反応より得られたクローンから 6クローンを無作為に選び、 T7、 BGHre verse, Y41、 Υ42、 Υ43、 Υ44、 Υ45、 Υ46、 Υ47、 Υ48の 10本のプライマー（配列番号 7— 16)を用いてダイターミネータ一法により塩基配列を決定した。これら 6クローンの塩基配列の比較により、配列番号 1及び 3の 2種のァカゲザル Υ4受容体遺伝子の塩基配列が明ら力となった。

[0065] 配列番号 1及び 3の配列には共に 1128塩基のオープンリーディングフレーム（30 番目力ら 1157番目）が存在する。各々のオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（375残基)を配列番号 2及び 4に示す。配列番号 1と 3の間にはその翻訳領域内（1111番目）に 1塩基の相違があり、その予測されるアミノ酸配列である配列番号 2と 4の間では 361番目のアミノ酸のみが異なっている。

[0066] 配列番号 2及び 4の配列をヒト Υ4受容体タンパク質のアミノ酸配列（GenPept acc ession No. NP 005963)と it較したところ、各々 96% (375残基中 359残基力 S 同一)及び 95% (375残基中 358残基が同一）の非常に高い同一性を示し、配列番号 1及び 3の塩基配列はァカゲザルの Y4受容体タンパク質をコードしているものと考えられた。

[0067] 以下に、使用したプライマーの塩基配列を示す。

hY4-4FBamHI: ATCGGATCCG TCATCCCTCA AGTGTATCAC TTAGTTC (配列番号 5)

hY4-1323RNotI: CATGCGGCCG CAAACAGCTC TTGCCAGCCT ATCTGG (配列番号 6)

T7: TAATACGACT CACTATAGGG (配列番号 7)

BGHreverse: GGAGCTGACA CGGAAGAT (配列番号 8)

Y41: GGGACATGGC AGGGAGAAGA (配列番号 9)

Y42: GCTGTTGAAC ACATGCAGAG (配列番号 10)

Y43: TCTTGTGGAA GACATTCTCC (配列番号 11)

Y44: AGAAGGCCAG GTTGGCGATA (配列番号 12)

Y45: GATGGTCTTC ATCGTCACTT (配列番号 13)

Y46: CAGCTCATCA TCAACCCAAC (配列番号 14)

Y47: ATCAAGGCCC TGGTGCTGAC TTGC (配列番号 15)

Y48: TTATGCACGC ATCTACCGGC (配列番号 16)。

[0068] (実施例 2： COS— 7細胞によるァカゲザル Y4受容体の発現と [¹²¾ヒト ΡΡとの結合

24ゥエル培養プレートに COS— 7細胞（American Type Culture Collection) を 5 X 10⁴個 Zゥエルの密度で播種し、 24時間後に実施例 1で得られた配列番号 1 及び 3の塩基配列を保持した PEF1ZV5— HisBプラスミドベクター並びにインサートを持たない同ベクター（mock)を Efectene (Qiagen社）を用いてトランスフエクシヨンした。 48時間培養後、 50pMの [¹²⁵1]ヒト PP (PerkinElmer社）を添カ卩した 240 1/ ゥエルの反応用緩衝液（20mM HEPES、0. 2% ゥシ血清アルブミンを含む Han ks，平衡塩溶液、 pH7. 4)中で 37°Cにて 30分間インキュベーションした。氷冷した反応用緩衝液で洗浄した後、 2M NaOHで細胞を溶解回収し γカウンター（Packa rd社、 Cobra)にて放射活性を測定した。

[0069] また、上記反応溶液中に 1 μ Μ ヒト ΡΡを加えることで非特異的結合量を測定した。表 1に示すように、配列番号 1あるいは 3の塩基配列を保持した発現ベクターをトランスフエクシヨンした COS— 7細胞は [¹²¾ヒト ΡΡに特異的結合を示した力インサートを持たな、ベクター (mock)をトランスフエクシヨンした細胞では特異的結合は見られなかった。

[0070] 本実施例より配列番号 1及び 3の塩基配列にコードされるタンパク質は Y4受容体の特徴である PPの結合能を有することが明らかとなった。

[0071] [表 1]

[0072] (実施例 3：ァカゲザル Y4受容体発現 COS - 7細胞膜画分を用いた受容体結合実験 )

COS— 7細胞に LipofectAmine Plus (Invitrogen社）を用いて配列番号 1及び 3 の配列を保持した PEF1ZV5— HisBプラスミドベクターをトランスフエタトした。 48時間後に細胞を回収し、 20%ショ糖、 154mM NaCl、 10mM KC1及び 0. 8mM CaClを含む lOmM MOPS緩衝液（pH7. 4)中で、氷冷しながら Polytronホモジ

2

ナイザー（Kinematica社）を用いて破砕した。得られたホモジネートを 1, 000 X gで 15分間、 4°Cにて遠心し、その上清をさらに 90, 000 X gで 50分間遠心して沈殿を回収した。これを 5mM HEPESZTris緩衝液 (pH7. 4)に懸濁した後に、再び 90 , 000 X gで 50分間遠心し、得られた沈殿を膜標品として回収した。

[0073] 上記のようにして得られた膜画分を 31pMの [¹²¾ヒト PPとともに、 lOmM MgCl

2

、 ImM フエ-ルメチルスルホ -ルフルオリド、 0. 1% バシトラシン及び 0. 5% ゥシ血清アルブミンを含む 25mM Tris緩衝液（pH7. 4)中で 25°Cにて 2時間インキ：ーシヨンした後、ポリエチレンィミン処理した UniFilter—96 GF/C (PerkinEl mer社）にて濾過した。 0. 3% ゥシ血清アルブミンを含む 5mM Tris緩衝液（pH7 . 4)にて洗浄した後に乾燥し、 MicroScintO (PerkinElmer社）を添カ卩して、 TopC ount HTS (Packard社)を用いてフィルター上に残存した放射活性を測定した。非特異的結合は 1 M ヒト PP存在下で測定した。

[0074] 図 1及び図 2に示すように、配列番号 1及び 3のどちらの配列をトランスフタトした細胞の膜標品についても、膜画分の濃度に依存した [¹²¾ヒト PPの特異的な結合が認められた。

[0075] また、膜画分濃度を 0. 155及び 0. 14mgタンパク質 Zml、 [¹²¾ヒト PP濃度を 59p Mに設定して、上記反応溶液中に各種濃度のヒト PP、ヒト NPY及びブタ PYYを各種濃度で添加し、各ペプチドの特異的 [¹²¾ヒト PP結合に対する阻害曲線 (図 3及び図 4)から Prism Version 4. 00 (GraphPad社）を用いて 50%阻害濃度（IC 値）を

50 求めた。各ペプチドの IC 値は表 2のようになり、配列番号 1及び 3の塩基配列にコー

50

ドされるタンパク質は、 NPYや PYYに比べて PPに対する親和性が高!、既知の Y4 受容体 [The Journal Biological Chemistry、 270卷、 26762頁（1995年）； T he Journal Biological Chemistry, 270^, 29123M (1995^)； FEBS Lett ers、 381卷、 58頁 (1996年)； Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93卷、 4661頁（1995年;）； P roceedings of the National Academy of Sciences of the United St ates of America、 93卷、 5111頁（1995年）]と同様の特性を示すことが明らかとなった。

[0076] [表 2]

[0077] (実施例 4 :ァカゲザル Y4受容体及び G o; タンパク質を共発現した CHO— K1細胞

15

における PPによる細胞内カルシウムイオン濃度上昇の測定）

Promiscuousな Gタンパク質 αサブユニットである G a を安定発現して!/、る CHO

15 —Kl細胞（Aurora Biosciences社、 CHO. G a l 5— blast. 3xNFAT— blaX— zeo . SI. C3—21)に、配列番号 1及び 3の配列を保持した pEFlZV5— HisBプラスミドベクター並びにインサートを持たない同ベクター（mock)を Efectene (Qiagen社）を用いてトランスフエクシヨンし、 Geneticin (Invitrogen社）而性細胞を選択した。得られた細胞を ViewPlate—96 (PerkinElmer社）に 2 X 10⁴個 Zゥエルの密度で播種し、 48時間培養した後に、 2 M Fluo-4, AM (Molecular Probes社)及び 1% ゥシ胎仔血清を含むアツセィ用緩衝液（20mM HEPES、2. 5mM プロベネシド、 0. 5% ゥシ血清アルブミンを含む Hanks'平衡塩溶液、 pH7. 4)中にて 37°Cで 1 時間インキュベーションしてカルシウムイオン指示薬である Fluo— 4を細胞内にロードした。アツセィ用緩衝液で 4回洗浄した後に、 FLIPR (Molecular Devices社）にセットし、種々の濃度のヒト PPを添カ卩した際の細胞内カルシウムイオン濃度の変化を蛍光強度の変化として測定した。

[0078] 図 5に示すように、配列番号 1及び 3の配列をトランスフタトした細胞では、ヒト PP の濃度に依存した蛍光強度の上昇が観察され、 PPがこれらの細胞の細胞内カルシゥムイオン濃度を上昇させることが示された。濃度反応曲線から、 EC は 1. 8nM (配

50

列番号 1)及び 4. 8nM (配列番号 3)と計算された。一方、インサートを持たないベタター（mock)をトランスフエクシヨンした細胞では上記のようなヒト PP添カ卩による蛍光強度の上昇は観察されなかった。

[0079] 本試験により、配列番号 1及び 3の塩基配列にコードされるタンパク質は、 PPとの相互作用により Gタンパク質と共役して細胞内にシグナルを伝達し得ることが明ら力となつ 7こ。

産業上の利用可能性

[0080] 本発明の核酸、タンパク質及び化合物の評価方法によれば、ヒト以外の霊長類の N PY Y4受容体遺伝子及びタンパク質を得ることが可能となるとともに、当該遺伝子又はタンパク質を用いて化合物の評価、スクリーニングを行うことが可能となる。従つて、当該遺伝子又はタンパク質を用いた治療薬や診断薬の評価、開発が可能となる。従って、ヒトの医薬の研究、開発の効率ィ匕に大きく貢献をするものである。

Claims

請求の範囲

[1] 配列番号 1又は 3に記載の塩基配列力なる単離された核酸。

[2] 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列力なるタンパク質をコードする単離された核酸。

[3] 配列番号 1又は 3に記載の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列力なる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ NPY Y4受容体としての活性を有するタンパク質をコードする、サル由来の単離された核酸。

[4] 請求項 1一 3の、ずれか一項に記載の核酸カゝらなるサル NPY Y4受容体遺伝子

[5] 請求項 4に記載のサル NPY Y4受容体遺伝子を含有する組換えベクター。

[6] 請求項 5に記載の組換えベクターを含む形質転換細胞。

[7] 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列力なる単離されたタンパク質。

[8] 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列において 1又は 2以上のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ NPY Y4受容体としての活性を有する単離されたタンパク質。

[9] サル NPY Y4受容体遺伝子を導入し、該受容体を発現する細胞を調製する工程と、

該細胞に被検化合物を接触させる工程と、

該受容体に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含む化合物の評価方法。

[10] サル NPY Y4受容体遺伝子を導入し、該受容体を発現する細胞を調製する工程と、

該細胞に被検化合物を接触させる工程と、

該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、

該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含む化合物の評価方法。

[11] 被検化合物を、 NPY Y4受容体としての活性を有するサル由来のタンパク質に接触させる工程と、該接触による該タンパク質の活性の変化を検出する工程と、を含む化合物の評価方法。

[12] 前記サルがァカゲザルである、請求項 9一 11のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。