WO2005042734A1 - An der autophagozytose beteiligte ser/thr-kinase als target für fungizide - Google Patents

An der autophagozytose beteiligte ser/thr-kinase als target für fungizide Download PDF

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WO2005042734A1
WO2005042734A1 PCT/EP2004/052810 EP2004052810W WO2005042734A1 WO 2005042734 A1 WO2005042734 A1 WO 2005042734A1 EP 2004052810 W EP2004052810 W EP 2004052810W WO 2005042734 A1 WO2005042734 A1 WO 2005042734A1
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WO
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nucleic acid
activity
polypeptide
acid sequence
autophagocytosis
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/052810
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English (en)
French (fr)
Inventor
Jan Rether
Heidrun Anke
Christoph Braun
Roland W.S. Weber
Eckhard Thines
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Basf Aktiengesellschaft
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase

Definitions

  • the present invention relates to the provision of a Ser / Thr kinase involved in autophagocytosis as a target for fungicides, methods for identifying fungicides which inhibit a polypeptide with the activity of a Ser / Thr kinase involved in autophagocytosis, and identifies the use of these compounds on the above process as fungicides.
  • the object of the present invention is therefore to identify fungicidal targets and to provide methods which are suitable for identifying compounds having a fungicidal action.
  • the object was achieved by using a polypeptide with the activity of a Ser / Thr kinase involved in the autophagocytosis encoded by a nucleic acid sequence comprising
  • nucleic acid sequence with the sequence shown in SEQ ID NO: 1; or b) a nucleic acid sequence which can be derived on the basis of the degenerate genetic code from the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2; or
  • nucleic acid sequence which can be derived on the basis of the degenerate genetic code by back-translating the amino acid sequence of a functional equivalent of SEQ ID NO: 2 which has an identity with SEQ ID NO: 2 of at least 45%;
  • Affinity Tag denotes a peptide or polypeptide whose coding nucleic acid sequence can be fused with the nucleic acid sequence of a polypeptide with the activity of a Ser / Thr kinase involved in autophagocytosis, either directly or by means of a linker using common cloning techniques.
  • the affinity tag is used for the isolation, enrichment and / or targeted purification of the recombinant target protein by means of affinity chromatography from whole cell extracts.
  • the linker mentioned above can advantageously contain a protease interface (e.g. for thrombin or factor Xa), as a result of which the affinity tag can be split off from the target protein if necessary.
  • affinity tags examples include the "HisTag” e.g. by Quiagen, Hilden, “StrepTag”, the MycTag “(Invitrogen, Carlsberg), the chitin-binding domain and an intein from New England Biolabs, the maltose-binding protein (pMal) from New England Biolabs and the so-called CBDTag from Novagen
  • the affinity tag can be attached to the 5 'or 3' end of the coding nucleic acid sequence with the sequence coding for the target protein.
  • activity encompasses the term enzymatic activity, ie the ability of an enzyme to convert a substrate into a product.
  • the enzymatic activity can be determined in a so-called activity test via the increase in the product, the decrease in the substrate (or starting material) or the decrease in one specific cofactor or a combination of at least two of the above parameters depending on a defined period of time.
  • An expression cassette contains a nucleic acid sequence according to the invention functionally linked with at least one genetic control element such as a promoter and advantageously with a further control element such as a terminator.
  • the nucleic acid sequence of the expression cassette can be, for example, a genomic or a complementary DNA sequence or an RNA sequence as well as semi or fully synthetic analogues thereof. These sequences can be in linear or circular form, extrachromosoma! or integrated into the genome.
  • the corresponding nucleic acid sequences can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA components, and consist of different heterologous gene segments from different organisms.
  • Artificial nucleic acid sequences are also suitable here as long as they enable the expression of a Ser / Thr kinase involved in autophagocytosis in a cell or an organism.
  • synthetic nucleotide sequences can be generated which have been optimized with regard to the codon usage of the organisms to be transformed.
  • nucleotide sequences mentioned above can be produced in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide building blocks, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleotide building blocks of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, page 896897).
  • various DNA fragments can be manipulated in such a way that a nucleotide sequence with the correct reading direction and correct reading frame is obtained.
  • the nucleic acid fragments are connected to one another using general cloning techniques, as described, for example, in T.
  • a functional or operative linkage means the sequential arrangement of regulatory sequences or genetic control elements in such a way that each of the regulatory sequences or each of the genetic control elements can perform its function as intended when expressing the coding sequence.
  • “Functional equivalents” here describe nucleic acid sequences which hybridize under standard conditions with SEQ ID NO: 1 or parts of SEQ ID NO: 1 and are capable of causing the expression of a polypeptide with the activity of a Ser / Thr kinase involved in autophagocytosis, which presence mediates the infectivity in a filamentous fungus and at the same time is able to catalyze the reaction catalyzed by a Ser / Thr kinase involved in autophagocytosis, the phosphorylation of a specific protein substrate on serine and theronine residues. If the protein with the activity of a Ser / Thr kinase involved in autophagocytosis is switched off, the resulting transformants are not infectious.
  • oligonucleotides For hybridization, short oligonucleotides with a length of approximately 10-50 bp, preferably 15-40 bp, for example of the conserved or other regions, which can be determined by comparison with other related genes in a manner known to the person skilled in the art, are advantageously used. However, longer fragments of the nucleic acids according to the invention with a length of 100-500 bp or the complete sequences for the hybridization can also be used. These standard conditions vary depending on the nucleic acid used: oligonucleotide, longer fragment or complete sequence or depending on the type of nucleic acid DNA or RNA used for the hybridization. For example, the melting temperatures for DNA: DNA hybrids are approx. 10 C lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • DNA hybrids are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 65 ° C., preferably between approximately 30 ° C. to 45 ° C.
  • DNA: RNA hybrids the hybridization conditions are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 30 ° C. to 65 ° C., preferably between approximately 45 ° C. to 55 ° C.
  • These specified temperatures for the hybridization are, for example, calculated melting temperature values for a nucleic acid with a length of approx. 100 nucleotides and a G + C content of 50% in the absence of formamide.
  • the experimental conditions for DNA hybridization are described in relevant textbooks of genetics such as Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, and can be determined according to formulas known to the person skilled in the art, for example, depending on the length of the nucleic acids Calculate the type of hybrid or the G + C content. The person skilled in the art can obtain further information on hybridization from the following textbooks: Ausubel et al.
  • a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations of the corresponding nucleic acid sequences coding for a Ser / Thr kinase coding for autophagocytosis and their homologues from other organisms.
  • the present invention also includes those nucleotide sequences which are obtained by modifying the nucleic acid sequence of a polypeptide with the activity of a Ser / Thr kinase involved in autophagocytosis.
  • modifications can be exemplified by techniques familiar to the person skilled in the art, such as “Site Directed Mutagenesis”, “Error Prone PCR", “DNA shuffling” (Nature 370, 1994, pp. 389391) or “Staggered Extension Process” (Nature Biotechnol. 16, 1998 , pp.258261).
  • the aim of such a modification can be, for example, the insertion of further restriction enzyme interfaces, the removal of DNA to shorten the sequence, the exchange of nucleotides for codon optimization or adding more sequences. Proteins that are encoded via modified nucleic acid sequences must still have the desired function despite a different nucleic acid sequence.
  • the term functional equivalent can also be defined by homology / identity (both at the nucleic acid level and at the protein level).
  • the term functional equivalent is further defined by the fact that a protein whose amino acid sequence encodes the nucleic acid sequence which codes for polypeptide with the activity of a Ser / Thr kinase involved in autophagocytosis is identical or homologous to a certain percentage a nucleic acid sequence is identical or homologous to a certain percentage with the nucleic acid sequence coding for the Ser / Thr kinase involved in the autophagocytosis.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described herein as well as artificial, e.g. nucleic acid sequences obtained by chemical synthesis and adapted to the codon, or the amino acid sequences derived therefrom.
  • Genetic Control Sequence The term “genetic control sequences” to be seen as equivalent to the term “regulatory sequence” describes the sequences which have an influence on the transcription and, if appropriate, translation of the nucleic acids according to the invention in prokaryotic or eukaryotic organisms. Examples are promoters, terminators or so-called “enhancer” sequences. In addition to these control sequences or instead of these sequences, the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified such that the natural regulation has been switched off and the expression of the target gene has been modified, that is to say increased or decreased. The control sequence is selected depending on the host organism or starting organism.
  • Genetic control sequences also include the 5 'untranslated region, introns or the non-coding 3' region of genes. Control sequences are also to be understood as those which enable homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or which allow removal from the genome. "Homology” or “identity” between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is determined by the identity of the
  • Nucleic acid sequence / polypeptide sequence defined over the respective total sequence length, which is calculated by comparison using the program algorithm program algorithm GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) with the following parameters:
  • Gap Weight 50 Length Weight: 3
  • “Mutations” include substitutions, additions, deletions, deletions, inversions (changes) or insertions of one or more nucleotide residues, which also change the corresponding amino acid sequence of the target protein by substitution, insertion or deletion of one or more Amino acids can change.
  • Knock-out transformants or KO transformations refer to individual cultures of a transgenic organism in which a specific gene has been specifically inactivated via transformation.
  • Natural genetic environment means the natural chromosomal locus in the organism of origin.
  • the natural genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially preserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least at 5 'or 3' Side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 100 bp, particularly preferably at least 500 bp, very particularly preferably at least 1000 bp, most preferably at least 5000 bp.
  • Response time means the time it takes to carry out an activity test until a significant statement about an activity is obtained and depends both on the specific activity of the protein used in the test and on the method used and the sensitivity of the devices used. The determination of the reaction times is known to the person skilled in the art. In methods based on photometric methods for the identification of substances with a fungicidal action, the reaction times are generally between> 0 to 360 minutes.
  • Recombinant DNA describes a combination of DNA sequences that can be produced by recombinant DNA technology.
  • Recombinant DNA technology generally known techniques for fusing DNA sequences (e.g. described in Sambrook et al., 1989, Cold Spring Habour, NY, Cold Spring Habour Laboratory Press).
  • Replication origins ensure the multiplication of the expression cassettes or vectors according to the invention in microorganisms and yeasts, e.g. the pBR322 ori, ColE1 or the P15A ori in E. coli (Sambrook et al .: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and the ARS1 ori in yeast ( Nucleic Acids Research, 2000, 28 (10): 20602068).
  • Reporter genes code for easily quantifiable proteins. Growth, fluorescence, chemo, bioluminescence or resistance assay or a photometric measurement (intrinsic color) or enzyme activity can be used to evaluate the transformation efficiency or the expression site or time using these genes. Reporter proteins (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1): 2944) such as "green fluorescence protein” (GFP) (Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996; 389 ( 1): 4447; Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325330; Leffel SM et al., Biotechniques.
  • GFP green fluorescence protein
  • Selection markers confer resistance to antibiotics or other toxic compounds: Examples include the neomycin phosphotransferase gene, which is resistant to the aminoglycoside antibiotics neomycin (G 418), kanamycin, paromycin (Deshayes A et al., EMBO J. 4 (1985) 27312737), the sul gene coding for a mutated dihydropteroate synthase (Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990; 15 (1): 127136), the hygromycin B phosphotransferase gene (Gen Bank Accession NO: K 01193) and the shble resistance gene, which is resistant to bleomycin antibiotics such as Zeocin gives.
  • selection marker genes are genes which confer resistance to 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) or phosphinotricin etc. or those which confer resistance to antimetabolites, for example the dhfr gene (Reiss, Plant Physiol. ( Life Sci. Adv.) 13 (1994) 142149). Also suitable are genes such as trpB or hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sei U S A. 85 (1988) 80478051).
  • Signal decrease based on the activity of the polypeptide encoded via a nucleic acid sequence according to the invention, here an activity decrease of the polypeptide mixed with a test compound is meant in comparison to the activity of the one not incubated with the test compound, which lies outside of a measurement error.
  • Target / target protein denotes a polypeptide, which can be an enzyme in the classical sense or, for example, a structural protein, a protein relevant for development processes, transport proteins, regulatory subunits which give a substrate complex or activity regulation to an enzyme complex. Common to all targets or sites of action is that the functional presence of the target protein is essential for the Survival or normal development, growth and / or infectivity of a phytopathogenic organism.
  • Transformation describes a process for introducing heterologous DNA into a pro- or eukaryotic cell.
  • a transformed cell describes not only the product of the transformation process itself, but also all transgenic descendants of the transgenic organism produced by the transformation.
  • Transgene Based on a nucleic acid sequence, an expression cassette or a vector containing a nucleic acid sequence according to the invention or an organism transformed with a nucleic acid sequence, expression cassette or vector according to the invention, the expression transgenic describes all such constructions produced by genetic engineering methods in which either the nucleic acid sequence of the target is located Protein or a genetic control sequence which is functionally linked to the nucleic acid sequence of the target protein or a combination of the abovementioned possibilities are not in their natural genetic environment or have been modified by genetic engineering methods. The modification can be achieved here, for example, by mutating one or more nucleotide residues of the corresponding nucleic acid sequence.
  • nucleic acid sequence at the 3 'or at the 5' end can contain additional nucleic acid sequences, the length of the additional nucleic acid sequences being 2000 bp, preferably 1500 bp, particularly preferably does not exceed 100, very particularly preferably 50 bp at the 5 'and 3' end.
  • Autophagocytosis plays an important role in the infection cycle of phytopathogenic fungi.
  • physiological examinations of the rice brandy pathogen Magnaporthe grisea have shown that the reserve substances mobilized in the rice brandy pathogen Magnaporthe grisea during the infection-relevant morphogenesis are transported by autophagocytosis into the central vacuole of the infection structure (Thines et al. (2000) Plant Cell 12: 1703- 1718, Weber et al. (2001) Protoplasma 216: 101-112.). There they are broken down, the breakdown products released apparently being used for melanin biosynthesis and for generation a turgor pressure in the appressorium, which is necessary to mechanically press an hypothyroidism through the cuticle of the host plant.
  • the present invention therefore relates to the use of a polypeptide with the activity of a Ser / Thr kinase involved in autophagocytosis encoded by a nucleic acid sequence comprising
  • nucleic acid sequence which can be derived on the basis of the degenerate genetic code from the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2; or
  • nucleic acid sequence which has an identity with SEQ ID NO: 1 of at least 46% can be derived
  • Functional equivalents of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 according to c) have an identity with SEQ ID No: 2 of at least 45% 46%, 47%, 48%, 49% or 50%, advantageously 51%, 52%, 53% , 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63% or 64% preferably at least 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75% or 76% particularly preferably at least 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% or 90% very particularly preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%.
  • nucleic acid sequences according to a) and b) and their functional equivalents according to c) come from a fungus such as a yeast such as a yeast of the genus Saccharomyces (S) such as S. cerevisiae,
  • Schizosaccharomyces such as e.g. Shizosaccharomyces pombe or Pichia such as e.g. P. pastoris, P. methanolica or a filamentous fungus such as e.g. from the saprophytic mushroom z.
  • Neurospora or a phytopathogenic fungus preferably from a phytopathogenic fungus, preferably from a phytopathogenic fungus
  • Gymnosporangium Leptotthrydium, Podosphaera; Gloedes; Cladosporium;
  • Phomopsis Phytopora; Phytophthora; Erysiphe; Fusarium; Verticillium; Glomerella;
  • Drechslera Bipolaris; Personospora; Phaeoisariopsis; Spaceloma;
  • Pseudocercosporella Pseudoperonospora; Puccinia; Typhula; Pyricularia; Rhizoctonia; Stachosporium; Uncinula; Ustilago; Gaeumannomyces, or Fusarium (F.), particularly preferably from a filamentous fungus selected from the genera and species
  • Neurospora such as N. crassa, Alternaria, Podosphaera, Sclerotinia, Physalospora e.g.
  • Botrytis e.g. B. cinerea, Corynespora e.g. Corynespora melonis; Colletotrichum; Diplocarpon e.g. Diplocarpon rosae; Elsinoe e.g. Elsinoe fawcetti, Diaporthe e.g. Diaporthe citri; Sphaerotheca; Cinula e.g. Cinula neccata,
  • Sphaerotheca e.g. Sphaerotheca fuliginea
  • Leveillula e.g. Leveillula taurica
  • Mycosphaerella Mycosphaerella; Phyllactinia e.g. Phyllactinia kakicola; Gloesporium e.g. Gloesporium kaki; Gymnosporangium e.g. Gymnosporangium yamadae, Leptotthrydium e.g. Leptotthrydium pomi, Podosphaera e.g. Podosphaera leucotricha; Gloedes e.g.
  • Gloedes pomigena Cladosporium e.g. Cladosporium carpophilum; Phomopsis;
  • Phytopora Phytophthora e.g. Phytophthora infestans
  • Verticillium Glomerella e.g.
  • Glomerella cingulata Drechslera; Bipolaris; Personospora; Phaeoisariopsis e.g.
  • Pyricularia e.g. Pyricularia oryzae (Magnaporthe grisea); Rhizoctonia; Stachosporium e.g. Stachosporium nodorum; Uncinula e.g. Uncinula necator; Ustilago;
  • Gaeumannomyces (G.) species e.g. G. graminis and Fusarium species e.g. F. dimerium, F. merismoides, F. lateritium, F. decemcellulare, F. poae, F. tricinctum, F. sporotrichioides, F. chlamydosporum, F. moniliforme, F. proliferatum, F. anthophilum, F. subglutinans, F. nygamai, F. oxysporum, F. solani, F. culmorum, F. sambucinum, F. crookwellense, F. avenaceum ssp. avenaceum, F.
  • G. graminis and Fusarium species e.g. F. dimerium, F. merismoides, F. lateritium, F. decemcellulare, F. poae, F. tricinctum, F.
  • avenaceum ssp. ayhong F. avenaceum ssp. nurragi, F. hetrosporum, F. acuminatum ssp. acuminatum, F. acuminatum ssp. armeniacum, F. longipes, F. compactum, F. equiseti, F. scripi, F. polyphialidicum, F. semitectum and F. beomiforme and F. graminearum very particularly preferably from a filamentous fungus selected from the genus Pyricularia such as, for example, Pyricularia oryzae ( Magnaporthe grisea).
  • the functional equivalents according to c) also comprise a nucleic acid sequence coding for a polypeptide with the function of a Ser / Thr kinase which is involved in autophagocytosis and which
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 5 or 7 on the basis of the degenerate genetic code.
  • nucleic acid sequence which can be derived on the basis of the degenerate genetic code from the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2; or
  • nucleic acid sequences according to the invention also includes the following nucleic acid sequences, which represent embodiments of the above-mentioned nucleic acid sequence c) and comprise a nucleic acid sequence which
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 5 or 7 on the basis of the degenerate genetic code
  • a polypeptide encoded by a nucleic acid sequence according to the invention with the activity of a Ser / Thr kinase involved in autophagocytosis is referred to below as "STK".
  • Another object of the invention is the use of expression cassettes containing
  • expression cassette according to the invention or vectors according to the invention for the expression of STK for in vitro or in vivo test systems.
  • an expression cassette according to the invention comprises a promoter at the 5'-end of the coding sequence and at the 3'- End of transcription termination signal and, if appropriate, further genetic control sequences which are functionally linked to the coding sequence for the STK gene in between.
  • Advantageous genetic control sequences for the expression cassettes according to the invention or vectors containing them are, for example, promoters such as cos, tac, trp, tet, Ipp, lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, IPR or in the IPL promoter, which are used for Expression of the STK in gram-negative bacterial strains can be used.
  • promoters such as cos, tac, trp, tet, Ipp, lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, IPR or in the IPL promoter, which are used for Expression of the STK in gram-negative bacterial strains can be used.
  • Further advantageous genetic control sequences are, for example, in the amy and SPO2 promoters, which can be used to express the STK in gram-positive bacterial strains, and in the yeast or fungal promoters AUG1, GPD1, PX6, TEF, CUP1, PGK, GAP1, TPI, PHO5, AOX1 , GAL10 / CYC1, CYC1, OliC, ADH, TDH, Kex2, MFa or NMT or combinations of the above promoters (Degryse et al., Yeast 1995 Jun 15; 11 (7): 62940; Romanos et al. Yeast 1992 Jun ; 8 (6): 42388; Benito et al. Eur. J. Plant Pathol.
  • suitable genetic control elements for expression in insect cells are the polyhedrin promoter and the p10 promoter (Luckow, VA and Summers, MD (1988) Bio / Techn. 6, 4755) and optionally also suitable terminators known to the person skilled in the art.
  • advantageous genetic control sequences for the expression of STK in cell culture are, for example, eukaryotic promoters of viral origin, e.g. Promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus, HIV thymidine kinase or Simian virus 40 and optionally also suitable terminators known to the person skilled in the art.
  • eukaryotic promoters of viral origin e.g. Promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus, HIV thymidine kinase or Simian virus 40 and optionally also suitable terminators known to the person skilled in the art.
  • Additional functional elements b) include, by way of example, but not by way of limitation, reporter genes, origins of replication, selection markers and so-called affinity tags, fused with the nucleic acid sequence according to the invention, directly or by means of a linker optionally containing a protease interface. Sequences are particularly preferred as additional functional elements, which ensure targeting into the vacuole, the mitochondrium, the peroxisome, the endoplasmic reticulum (ER) or, due to the lack of corresponding operative sequences, ensure that they remain in the compartment of formation, the cytosol (Kermode, Grit Rev. Plant Sci., 15: 4 (1996), 285423).
  • Vectors according to the invention also contain at least one copy of the nucleic acid sequences according to the invention and / or the expression cassettes according to the invention.
  • vectors are also understood to mean all other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposons, ISE elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or can be replicated chromosomally. Chromosomal replication is preferred.
  • the nucleic acid construct according to the invention can also advantageously be introduced into the organisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized plasmid or only of the nucleic acid construct as a vector or the nucleic acid sequences used.
  • Further prokaryotic and eukaryotic expression systems are mentioned in chapters 16 and 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Further advantageous vectors are described in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000).
  • the expression cassette according to the invention and vectors derived therefrom can be used for the transformation of bacteria, cyanobacteria, yeast, filamentous fungi and algae and eukaryotic, non-human cells (for example insect cells) with the aim of recombinantly producing the STK, the production of a suitable expression cassette following the organism in which the gene is to be expressed.
  • nucleic acid sequences used in the method according to the invention can also be introduced into an organism alone.
  • nucleic acid sequences in addition to the nucleic acid sequences, further genes are to be introduced into the organism, they can all be introduced into the organism together in a single vector or each individual gene can be introduced into the organism, the different vectors being able to be introduced simultaneously or successively.
  • nucleic acid (s) according to the invention, the expression cassette or the vector can be introduced into the corresponding organisms (transformation) by all methods known to the person skilled in the art.
  • suitable organisms for the recombinant expression of STK are also eukaryotic cell lines, preferably bacteria, yeasts and fungi.
  • bacteria of the genus Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Alcaligenes or Cyanobacteria, for example of the genus Synechocystis or Anabena are preferred.
  • yeasts are yeasts of the genera Saccharomyces, Schizosaccheromyces or Pichia.
  • Preferred mushrooms are Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, or others in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995).
  • transgenic animals are also suitable as host organisms, for example C. elegans.
  • yeast vectors for use in yeast are pYepSed (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933943), pJRY88 (Schultz et al., ( 1987) Gene 54: 113123), and pYES derivatives, pGAPZ derivatives, pPICZ derivatives and the vectors of the "Pichia Expression Kit” (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • insect cell expression vectors can also be used advantageously, e.g. for expression in Sf9, Sf21 or Hi5 cells, which are infected via recombinant baculoviruses.
  • These are e.g. the vectors of the pAc series (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 21562165) and the pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 3139).
  • the baculovirus expression systems "MaxBac 2.0 Kit” and "Insect Select System” from Invitrogen, Calsbald or “BacPAK Baculovirus Expression System” from CLONTECH, Palo Alto, CA.
  • insect cell expression vectors can also be used advantageously, e.g. for expression in Sf9, Sf21 or Hi5 cells, which are infected via recombinant baculoviruses.
  • These are e.g. the vectors of the pAc series (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 21562165) and the pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 3139).
  • the baculovirus expression systems "MaxBac 2.0 Kit” and "Insect Select System” from Invitrogen, Calsbald or “BacPAK Baculovirus Expression System” from CLONTECH, Palo Alto, CA.
  • plant cells or algal cells can advantageously be used for gene expression.
  • plant expression vectors can be found in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 11951197 or in Bevan, MW (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 87118721.
  • the nucleic acid sequences according to the invention can be expressed in mammalian cells. Examples of corresponding expression vectors are pCDM8 and pMT2PC mentioned in: Seed, B. (1987) Nature 329: 840 or Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187195).
  • promoters to be used are of viral origin, such as promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus or Simian virus 40.
  • promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus or Simian virus 40 are of viral origin, such as promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus or Simian virus 40.
  • prokaryotic and eukaryotic expression systems are mentioned in chapters 16 and 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Further advantageous vectors are described in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000).
  • Another object of the present invention is the use of STK as a target for fungicides.
  • STK in a method for identifying test compounds with a fungicidal action is preferred.
  • ii Evidence of whether the test substance binds to the polypeptide from i); or iii. Evidence of whether the test substances reduce or block the activity of the polypeptide from i); or
  • test substances reduce or block the transcription, translation or expression of the polypeptide from i).
  • the detection according to step ii of the above method can be carried out using techniques which demonstrate the interaction between protein and ligand.
  • Either the test compound or the enzyme may contain a detectable label, e.g. a fluorescent, radioisotope, chemiluminescent or enzymatic label.
  • enzymatic labels are Horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or lucifierase.
  • the subsequent detection depends on the marking and is known to the person skilled in the art.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • Fluorescence polarization also uses the property of a quiescent fluorophore excited with polarized light also polarized light again emit. However, if the fluorophore can rotate during the excited state, the polarization of the emitted fluorescent light is more or less lost. Under otherwise identical conditions (eg temperature, viscosity, solvent) the rotation is a function of the molecular size, with which one can make a statement about the size of the residue bound to the fluorophore via the measurement signal (Methods in Enzymology 246 (1995), pp. 283300) , A method according to the invention can be set up directly for measuring the binding of a tester bond marked by a fluorescent molecule to STK. Alternatively, the method according to the invention can also be designed in the form of the "displacement assay" described under 1.
  • Fluorescence Resonance Energy Transfer is based on the radiation-free energy transfer between two spatially adjacent fluorescence molecules under suitable conditions. A prerequisite is the overlap of the emission spectrum of the donor molecule with the excitation spectrum of the acceptor molecule. By means of fluorescence labeling of STK and the test compounds, the FRET can Binding can be measured (Cytometry 34, 1998, pp. 159179). Alternatively, the method according to the invention can also be designed in the form of the "displacement assay” described in 1. A particularly suitable embodiment of FRET technology is "Homogeneous Time Resolved Fluorescence" (HTRF) as sold by Packard BioScience The compounds identified in this way can be suitable as inhibitors.
  • HTRF Homogeneous Time Resolved Fluorescence
  • STK Surface Enhanced Laser Desorption / Ionization
  • MALDITOF Time of Flight mass spectrometer
  • STK is now immobilized on a suitable carrier and incubated with the chemical compound to be examined. After one or more suitable washing steps, the molecules of the chemical compound additionally bound to the STK can be detected by means of the methodology mentioned above, as a result of which suitable inhibitors can be selected. 5.
  • the measurement of surface plasmon resonance is based on the change in the refractive index on a surface when a chemical compound binds to a protein immobilized on said surface. Since the change in the refractive index for a defined change in the mass concentration at the surface is virtually identical for all proteins and polypeptides, this method can in principle be applied to any protein (Lindberg et al. Sensor Actuators 4 (1983) 299304; Malmquist Nature 361 (1993 ) 186187).
  • the measurement can be carried out, for example, with the aid of the automatic analyzers based on surface plasmon resonance, marketed by Biacore (Freiburg), in a throughput of currently up to 384 samples per day.
  • a method according to the invention can be set up directly for measuring the binding of the test compound to STK. Alternatively, the method according to the invention can also be designed in the form of the "displacement assay" described under 1.
  • STK from step a) is brought into contact with a test compound in the cell disruption of the transgenic or non-transgenic organism, in partially purified form or in a form purified to homogeneity;
  • a compound is selected which reduces or blocks the enzymatic activity of STK.
  • the enzymatic activity of the STK incubated with the test compound can be compared with the enzymatic activity of a STK not incubated with a test compound.
  • test compounds are selected which result in a significant decrease in the activity of STK compared to a STK not incubated with a test compound, a reduction of at least 10%, advantageously at least 20%, preferably at least 30%, particularly preferably by at least 50% and very particularly preferably by at least 70% or a 100% reduction (blocking).
  • the solution containing STK can consist of the lysate of the original organism or of the transgenic organism. If necessary, STK can be partially or completely cleaned using common methods.
  • common methods A general overview of common techniques for protein purification can be found, for example, in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1994); ISBN 0879693096.
  • the polypeptide fused to an affinity tag can be purified by affinity chromatography.
  • STK required for in vitro methods can thus be obtained either from a transgenic organism according to the invention by means of heterologous expression.
  • STK can also be isolated from an organism containing STK, for example from a fungus or a yeast (see e.g. Imblum and Rodwell (1975) J Lipid Res., 15, 211222).
  • Suitable yeasts are contained in the genera Saccharomyces, Schizosaccheromyces or Pichia.
  • Suitable yeasts and filamentous fungi are the species mentioned at the beginning.
  • the activity of STK can be determined, for example, using an enzyme activity test, ie by incubating the polypeptide according to the invention with a suitable substrate, the decrease in the substrate or the increase in the resulting product or the decrease or increase in the cofactor being tracked.
  • suitable substrates are, for example, protein hydrolyzates and for suitable cofactors ATP, GTP or UTP, preferably ATP and Mg 2+ or Mn 2+ .
  • suitable cofactors ATP, GTP or UTP preferably ATP and Mg 2+ or Mn 2+ .
  • derivatives of the above-mentioned compounds can also be used which contain a detectable label, such as. B. a fluorescent, radioisotope (eg 14 C labeled protein substrate, ⁇ 32 ory 33 ATP) or chem iluminescent.
  • the enzyme activity can be determined by detecting the cofactor hydrolysis.
  • a phosphate residue is transferred to a suitable substrate.
  • the diphosphate e.g. ADP
  • ADP can be detected in different ways.
  • the conversion of the substrate is monitored photometrically.
  • the enzymatic activity is determined by
  • polypeptide is mixed with a suitable cofactor and substrate;
  • the activity is determined by the amount of radiolabelled substrate.
  • the activity is determined by coupling the reaction catalyzed by the polypeptide with the activity of a Ser / Thr kinase involved in the autophagocytosis with the oxidation of NADH catalyzed by the pyruvate kinase and lactate dehydrogenase.
  • step c) the ADP production is coupled to the oxidation of NADH.
  • the NADH concentration can be determined by absorption according to the method of Schulte et al (2000) Arch. Biochem. Biophys., 378 (2) 287-98. The method described in Schulte et al is part of the present description.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention which is based on steps i) and iv), consists of the following steps: i. the production of a transgenic organism according to the invention; wherein in the transgenic organism the polypeptide is overexpressed with the activity of a Ser / Thr kinase involved in autophagocytosis;
  • step ii applying a test substance to the transgenic organism after step i) and to a non-transgenic organism of the same type;
  • test substances which reduce the non-transgenic organism compared to the growth of the transgenic organism.
  • the difference in growth or the difference in infectivity in step iv) for selecting an inhibitor with a fungicidal action is at least 10%, preferably 20%, preferably 30%, particularly preferably 40% and very particularly preferably 50%. Infectivity is only determined if the organism is a phytopathogenic fungus.
  • the transgenic organism can be produced by transforming the organism with a nucleic acid sequence according to the invention, an expression cassette according to the invention or a vector containing a nucleic acid sequence according to the invention or an expression cassette according to the invention.
  • the transgenic cells or organisms are bacteria, yeast, filamentous fungi or eukaryotic cell lines, preferably a phytopathogenic filamentous fungus, particularly preferably the phytopathogenic filamentous fungi mentioned on pages 11 and 12. These transgenic organisms or cells therefore have an increased tolerance to chemical compounds which inhibit the polypeptide according to the invention. All of the substances identified by means of the abovementioned methods can then be checked for their fungicidal activity in a further in vivo activity test. One possibility is to test the corresponding substance in an agar diffusion test as described, for example, by Zahnner, H. 1965 Antibiotic Biology, Berlin, Springer Verlag.
  • the test is carried out with a culture of a filamentous fungus, preferably a culture of a filamentous phytopathogenic fungus, the fungicidal activity being able to be determined, for example, via restricted growth.
  • a culture of a filamentous fungus preferably a culture of a filamentous phytopathogenic fungus, the fungicidal activity being able to be determined, for example, via restricted growth.
  • phytopathogenic fungus is to be understood as the species mentioned at the beginning.
  • test compounds can also be used in one method according to the invention. If the target is influenced by a group of test compounds, then it is either possible to isolate the individual test compounds directly or to divide the group of test compounds into different subgroups, e.g. if it consists of a large number of different components, so as to reduce the number of different test compounds in the method according to the invention.
  • the method according to the invention is then repeated with the individual test compound or the corresponding subgroup of test compounds.
  • the steps described above can be repeated several times, preferably until the subgroup identified according to the method according to the invention only comprises a small number of test compounds or only one test compound.
  • the method according to the invention can advantageously be carried out as a high throughput screen (HTS), since HTS enables the parallel testing of a large number of different connections.
  • HTS high throughput screen
  • HTS HTS
  • supports which carry one or more of the nucleic acid molecules according to the invention, one or more vectors containing the nucleic acid sequence according to the invention, one or more transgenic organisms which contain at least one of the nucleic acid sequences according to the invention or one or more (poly ) peptides encoded via the nucleic acid sequences of the invention.
  • the carrier used can be solid or liquid, is preferably solid, particularly preferably a microtiter plate.
  • the above-mentioned carriers are also the subject of the present invention. According to the most widespread technique, 96well microtiter plates are used, which can usually contain volumes from 50 to 500 ⁇ l. In addition to the microtiter plates, the other components of a HTS system are suitable for the 96well microtiter plates, such as many instruments, materials, automatic pipetting devices, robots, automated plate readers and plate washers.
  • the invention further relates to compounds identified by the methods according to the invention. These compounds are referred to below as "selected compounds". They have a molecular weight of less than 1000 g / mol, advantageously less than 500 g / mol, preferably less than 400 g / mol, particularly preferably less than 300 g / mol. Compounds with fungicidal activity have a Ki value of less than 1 mM, preferably less than 1 mM, particularly preferably less than 0.1 mM, very particularly preferably less than 0.01 mM.
  • the selected compounds are suitable for combating phytopathogenic fungi.
  • phytopathogenic fungi are the genera and species mentioned above.
  • the selected compounds can also be in the form of their agriculturally useful salts.
  • Agriculturally useful salts include, in particular, the salts of those cations or the acid addition salts of those acids, the cations or anions of which do not adversely affect the fungicidal activity of the compounds with fungicidal activity identified by the process according to the invention. All of the compounds identified by means of the abovementioned methods, provided they contain centers of chirality, are the subject of the present invention both as pure enantiomers or diastereomers or as mixtures thereof and as a racemate.
  • the selected compounds can be chemically synthesized or microbiologically produced substances and e.g. in cell extracts of e.g. Plants, animals or microorganisms occur.
  • the reaction mixture can be a cell-free extract or can comprise a cell or cell culture. Suitable methods are known to the person skilled in the art and are e.g. generally described in Alberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), e.g. Chapter 17.
  • test compounds can be expression libraries such as cDNA expression libraries, peptides, proteins, nucleic acids, antibodies, small organic substances, hormones, PNAs or the like (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs , Cell. 79 (1994), 193-198 and references cited therein).
  • Fungicidal agents that contain the selected compounds fight phytopathogenic fungi very well, especially at high application rates.
  • crops such as wheat, rice, corn, soybeans and cotton
  • they act against phytopathogenic fungi without significantly damaging the crop plants. This effect occurs especially at low application rates.
  • fungicidal active substances found with the aid of the processes according to the invention act as total or selective fungicides depends, inter alia, on the amount used, their selectivity and other factors.
  • the substances can be used to control the pathogenic fungi already mentioned above.
  • the selected compounds or the compositions containing them can advantageously be used to eliminate the phytopathogenic fungi already mentioned at the beginning.
  • the invention furthermore relates to a process for the preparation of the fungicidal composition already mentioned above, characterized in that selected compounds are suitable for the formulation of fungicides Aids formulated.
  • the selected compounds can e.g. be formulated in the form of directly sprayable aqueous solutions, powders, suspensions, also high-proof aqueous, oily or other suspensions or suspoemulsions or dispersions, emulsifiable concentrates, emulsions, oil dispersions, pastes, dusts, sprinkling agents or granules and by spraying, atomizing, dusting, Scattering or pouring can be applied.
  • the application forms depend on the intended use and the nature of the selected compounds and should in any case ensure the finest possible distribution of the selected compounds.
  • the fungicidal compositions contain a fungicidally effective amount of at least one selected compound and auxiliaries customary for the formulation of fungicidal compositions.
  • emulsions, pastes or aqueous or oil-containing formulations and dispersible concentrates the selected compounds can be dissolved or dispersed in an oil or solvent, it being possible to add further formulation auxiliaries for homogenization.
  • liquid or solid concentrates which are suitable for dilution with water can also be prepared from selected compound, optionally solvents or oil and optionally further auxiliaries.
  • EC, EW emulsifiable concentrates
  • SC suspensions
  • SL soluble concentrates
  • DC dispersible concentrates
  • pastes pastilles, wettable powders or granules, with the solid formulations being either soluble in water or soluble can be dispersible.
  • corresponding powders or granules or tablets can also be provided with a solid coating ("coating") which prevents abrasion or premature release of the active ingredient.
  • auxiliary means the following substance classes: anti-foaming agents, thickeners, wetting agents, adhesives, dispersants, emulsifiers, bactericides and / or thixotrophic agents.
  • anti-foaming agents thickeners, wetting agents, adhesives, dispersants, emulsifiers, bactericides and / or thixotrophic agents.
  • SLs, EWs and ECs can be produced by simply mixing the corresponding ingredients, powder by mixing or grinding in special mill types (e.g. hammer mills).
  • DC, SCs and SEs are usually produced by wet milling, it being possible to produce an SE from a SC by adding an organic phase which may contain further auxiliaries or selected compounds.
  • the manufacture is known.
  • Powder, litter and dusts can advantageously be produced by mixing or grinding the active substances together with a solid carrier.
  • Granules for example coating, impregnation and homogeneous granules, can be produced by binding the selected compounds to solid carriers. Further details of the preparation are known to the person skilled in the art and are listed, for example, in the following documents: US Pat. No.
  • inert liquid and / or solid carriers suitable for the formulations according to the invention are known to the person skilled in the art, e.g. liquid additives such as medium to high boiling point mineral oil fractions such as kerosene or diesel oil, also coal tar oils as well as oils of vegetable or animal origin, aliphatic, cyclic and aromatic hydrocarbons, e.g.
  • Solid carriers are, for example, mineral earths such as silicas, silica gels, silicates, talc, kaolin, limestone, lime, chalk, bolus, loess, clay, dolomite, diatomaceous earth, calcium and magnesium sulfate, magnesium oxide, ground plastics, fertilizers such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, Urea and vegetable products such as flour, tree bark, wood and nutshell flour, cellulose powder or other solid carriers.
  • mineral earths such as silicas, silica gels, silicates, talc, kaolin, limestone, lime, chalk, bolus, loess, clay, dolomite, diatomaceous earth, calcium and magnesium sulfate, magnesium oxide, ground plastics, fertilizers such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, Urea and vegetable products such as flour, tree bark, wood and nutshell flour,
  • Surfactants suitable for the formulations according to the invention are known to a person skilled in the art in a large number, such as, for example, alkali, alkaline earth, ammonium salts of aromatic sulfonic acids, for example lignin, phenol, naphthalene and dibutylnaphthalenesulfonic acid, and also of fatty acids, alkyl and alkylarylsulfonates, alkyl, lauryl ether and fatty alcohol sulfates, and salts of sulfated hexa-, hepta- and octadecanols and of fatty alcohol glycol ethers, condensates of sulfonated naphthalene and its derivatives with formaldehyde, condensation products of naphthalene or naphthalenesulfonic acids with phenol and formaldehyde, polyoxyethylene octylphenol ether, ethoxylated isooct
  • the fungicidal compositions or the active compounds can be applied curatively, eradicatively or protectively.
  • the application rates of fungicidal active ingredient are 0.001 to 3.0, preferably 0.01 to 1.0 kg / ha, depending on the control target, season, target plants and growth stage.
  • cloning processes such as restriction cleavage, DNA isolation, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, sequence analysis of recombinant DNA and Southern and Western blots were described as in Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6.
  • the bacterial strains used below (E. coli XL1-blue) were obtained from Stratagene. 8958 of the Fungal Genetics Stock Center, Kansas City (FGSC) was used as Magnaporthe grisea strain.
  • Aut3_V1_rev GAC TCC GCC AAA CCC CAC ACT G (SEQ ID NO: 9) a 5.833 kb fragment was identified from genomic DNA isolated from the M. grisea strain by PCR and cloned into the vector pCR-XL-TOPO (Invitrogen, Düsseldorf) using standard methods.
  • sequence of the Aut3 gene belonging to the 5.833 kb insert (SEQ ID NO: 3) and its flanking regions were identified by comparison with the publicly accessible database of the Whitehead Institute [Whitehead Institute, Cambridge, USA / www.wi. mit.edu].
  • This sequence contains the nucleic acid sequence coding for SEQ ID NO: 2 and containing intron (from 1267 bp to 4505 bp).
  • the corresponding nucleic acid sequence without introns coding for SEQ ID NO: 2 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the 5.833 kb insert contained plasmid is hereinafter referred to as pAUT301.
  • the hygromycin cassette was made with the palindromic primer Sacll hyg TCC CCG CGG GGA AAT TCG TCG ACG TTA AC (SEQ ID NO: 12)
  • the positive clones were identified by transforming the ligation mixture obtained into E. coli XL1 blue and then isolating positive clones according to the manufacturer's instructions via blue / white screening).
  • the vector thus obtained is hereinafter referred to as pAUT302.
  • CM medium 0.08M sucrose, 5 g agar / l
  • CMS bottom agar plates CM medium, 0.08M sucrose, 15 g agar / I
  • the plates are kept in the dark at 22 ° C. for 16 hours and finally overlaid with 15 ml of CM medium with 100 mg / l of hygromycin.
  • the first transformants that had grown through the hygromycin agar are placed on fresh CM agar plates with 100 mg / l hygromycin (15 g agar / l) inoculated. Grown transformants were inoculated onto fresh CM plates without hygromycin and cultivated further on this medium.
  • the genomic DNA was isolated using the DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden).
  • the genomic DNA which was isolated from fungi transformed with _dAUT3 and the M. grisea wild type 70-15, was cut with the restriction enzyme Sall.
  • the vectors pAUT301 and pAUT302 used as controls were also restricted with Sall.
  • the vector pAUT301 is cut into three fragments (6119 bp, 1962 bp and 1271 bp).
  • the Aut3_schreibhyg probe binds specifically to the 1271 bp fragment, which is also produced in wild type 70-15 and in transformants resulting from heterologous recombination of 4AUT3 by restriction with Sall.
  • the Aut3_ko probe specifically binds to the 1962 bp fragment, which is also present in wild type 70-15 and in the transformants resulting from heterologous recombination of zdAUT3. This fragment is no longer present in transformants resulting from homologous recombination.
  • Wild type 70-15 reduced by more than a power of ten.
  • drops of a spore suspension of the individual isolates set to 1 ⁇ 10 5 conidia / ml were applied to cut barley leaves and incubated for three days in an incubator. The development of symptoms was followed and documented macroscopically and microscopically.
  • the evaluation is carried out after a total of 96 hours, 10 infected leaves are evaluated for their lesion density.
  • the results are documented with the digital camera C-2500L (Olympus, Camedia) and the leaves are then treated as described in 1.4.3.2 for coloring intracellular hyphae and evaluated by fluorescence microscopy.
  • the ⁇ aut3 mutants were no longer able to infect barley and rice.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung einer an der Autophagozytose beteilitgten Ser/Thr-Kinase als Target für Fungizide, Verfahren zur Identifizierung von Fungiziden, welche ein Polypeptid mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteilitgten Ser/Thr-Kinase inhibieren sowie die Verwendung dieser Verbindungen identifiziert über das vorstehend genannte Verfahren als Fungizide.

Description

An der Autophagozytose beteiligte Ser/Thr-Kinase als Target für Fungizide
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase als Target für Fungizide, Verfahren zur Identifizierung von Fungiziden, welche ein Polypeptid mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase inhibieren sowie die Verwendung dieser Verbindungen identifiziert über das vorstehend genannte Verfahren als Fungizide.
Das grundlegende Prinzip, Fungizide über Inhibierung eines definierten Targets zu identifizieren ist bekannt (z.B. US 5,187071 , WO 98/33925, WO 00/77185). Generell besteht ein großer Bedarf, Enzyme zu detektieren, welche neue Targets für Fungizide darstellen könnten. Gründe hierfür sind neben dem Problem von auftretende Resistenzproblematiken das ständige Bemühen neue fungizide Wirkstoffe zu identifizieren, die sich durch einen möglichst breiten Wirkungsbereich, ökologische und toxikologische Unbedenklichkeit sowie geringe Aufwandmengen auszeichnen.
Die Detektion neuer Targets ist in der Praxis mit großen Schwierigkeiten verbunden, da die Hemmung eines Enzyms, das Bestandteil eines Stoffwechselweges ist, häufig das Wachstum oder die Infektiosität des pathogenen Pilzes nicht weiter beeinflusst. Dies kann daran liegen, dass der pathogene Pilz auf alternative Stoffwechselwege ausweicht, deren Existenz nicht bekannt ist, oder dass das inhibierte Enzym nicht limitierend für den Stoffwechselweg ist. Die Targeteignung eines Genproduktes lässt sich daher auch mit Kenntnis der Genfunktion nicht vorhersagen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, fungizide Targets zu identifizieren sowie Verfahren bereitzustellen, welche zur Identifizierung von Verbindungen mit fungizider Wirkung geeignet sind.
Die Aufgabe wurde gelöst durch die Verwendung eines Polypeptides mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz umfassend
a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz; oder b) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt; oder
c) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents der SEQ ID NO:2, das eine Identität mit der SEQ ID NO:2 von mindestens 45% aufweist, ableiten lässt;
sowie von durch die vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen kodierten Proteine als Targets für Fungizide.
An dieser Stelle werden nun einige der in der Beschreibung verwendeten Begriffe definiert.
"AffinitätsTag": Bezeichnet ein Peptid oder Polypeptid, dessen kodierende Nukleinsäuresequenz mit der Nukleinsäuresequenz eines Polypeptids mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase direkt oder mittels eines Linkers über gängige Klonierungstechniken fusioniert werden kann. Das AffinitätsTag dient zur Isolierung, Anreicherung und/oder gezielten Aufreinigung des rekombinanten Zielproteins mittels Affinitäts Chromatographie aus Gesamtzellextrakten. Der oben erwähnte Linker kann vorteilhaft eine Protease Schnittstelle (z.B. für Thrombin oder Faktor Xa) enthalten, wodurch das Affinitäts Tag bei Bedarf vom Zielprotein abgespalten werden kann. Beispiele für gängige Affinitäts Tags sind das "HisTag" z.B. von Quiagen, Hilden, "StrepTag", das MycTag" (Invitrogen, Carlsberg), das aus einer Chitin bindenden Domäne und einem Intein bestehende Tag von New England Biolabs, das Maltosebindende Protein (pMal) von New England Biolabs und das sogenannte CBDTag von Novagen. Der AffinitätsTag kann dabei am 5' oder 3Εnde der kodierenden Nukleinsäuresequenz mit der für das Zielprotein kodierenden Sequenz angebracht sein.
"Aktivität": Der Begriff Aktivität umfasst einerseits den Begriff enzymatische Aktivität, d.h. die Fähigkeit eines Enzyms ein Substrat in ein Produkt umzuwandeln. Die enzymatische Aktivität kann in einem sogenannten Aktivitätstest über die Zunahme des Produktes, die Abnahme des Substrates (oder Eduktes) oder die Abnahme eines spezifischen Cofaktors oder über eine Kombination aus mindestens zwei der vorstehend genannten Parameter in Abhängigkeit einer definierten Zeitspanne bestimmt werden.
"Expressionskassette": Eine Expressionskassette enthält eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz funktioneil verknüpft mit mindestens einem genetischen Kontrollelement wie einem Promotor sowie vorteilhaft mit einem weiteren Kontrollelement wie einem Terminator. Die Nukleinsäuresequenz der Expressionskassette kann beispielsweise eine genomische oder eine komplementäre DNA Sequenz oder eine RNA Sequenz sowie halb oder vollsynthetische Analoga davon sein. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulärer Form, extrachromosoma! oder integriert in das Genom vorliegen. Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.
Auch artifizielle Nukleinsäuresequenzen sind hierbei geeignet, solange sie die Expression einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase in einer Zelle oder einem Organismus ermöglichen. Beispielsweise können synthetische NukleotidSequenzen erzeugt werden, die bezüglich der Kodon Nutzung des von den zu transformierenden Organismen optimiert wurden.
Alle vorstehend erwähnten Nukieotid Sequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragment Kondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleotidbausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896897) erfolgen. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA Fragmente so manipuliert werden, dass eine Nukieotid Sequenz mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhalten wird. Die Verbindung der Nukleinsäure Fragmente untereinander erfolgt über allgemeine Klonierungstechniken wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wileylnterscience (1994) beschrieben sind.
"Funktionelle Verknüpfung": Unter einer funktioneilen oder operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung regulativer Sequenzen bzw. genetischer Kontrollelemente derart, daß jede der regulativen Sequenzen bzw. jedes der genetischer Kontrollelemente ihre Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
"Funktionelle Äquivalente" beschreiben hier Nukleinsäuresequenzen, die unter Standardbedingungen mit der SEQ ID NO:1 oder Teilen der SEQ ID NO:1 hybridisieren und befähigt sind die Expression eines Polypeptides mit Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase zu bewirken, welches durch Präsenz die Infektiosität in einem filamentösen Pilz vermittelt und zugleich in der Lage ist, die von einer aus einem filamentösen Pilz stammenden an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase katalysierte Reaktion, die Phosphorylierung eines spezifischen Proteinsubstrates an Serin und Theronin Resten zu katalysieren. Wird die das Proteins mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase ausgeschaltet, so sind die resultierenden Transformanden nicht infektiös.
Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 10- 50bp, vorzugsweise 15-40bp beispielsweise der konservierten oder sonstigen Bereiche, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit einer Länge von 100-500 bp oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10 C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardhybridisierungsbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure
Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50 % Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 65°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 65°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man ferner insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen der entsprechenden für eine an der Autophagozytose beteilitgte Ser/Thr-Kinase codierenden Nukleinsäuresequenzen sowie deren Homologe aus anderen Organismen.
Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der Nukleinsäuresequenz eines Polypeptides mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase erhält. Beispielhaft können solche Modifikationen durch dem Fachmann geläufige Techniken, wie "Site Directed Mutagenesis", "Error Prone PCR", "DNA shuffling" (Nature 370, 1994, pp.389391) oder "Staggered Extension Process" (Nature Biotechnol. 16, 1998, pp.258261) erzeugt werden. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung von DNA zur Verkürzung der Sequenz, der Austausch von Nukleotiden zur Codon Optimierung oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen sein. Proteine, die über modifizierte Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, müssen trotz abweichender Nukleinsäuresequenz noch die gewünschte Funktion besitzen.
Der Begriff des funktioneilen Äquivalents kann des weiteren durch die über Homologie/ Identität definiert werden (sowohl auf Nukleinsäuresebebene als auch auf Proteinebene). In diesem Fall wird der Begriff des funktionellen Äquivalents dadurch weiter definiert, dass ein Protein, dessen Aminosäuresequenz mit der Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptid mit der Aktivität einer der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase codiert, bis zu einem bestimmten Prozentsatz identisch oder homolog ist bzw. eine Nukleinsäuresequenz mit der für die an der Autophagozytose beteilitgte Ser/Thr-Kinase codierende Nukleinsäuresequenz bis zu einem bestimmten Prozentsatz identisch oder homolog ist.
Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon Gebrauch adaptierte Nukleinsäuresequenzen bzw. die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen.
"Genetische Kontrollsequenz": Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen äquivalent zu sehen mit dem Begriff "regulatorische Sequenz" beschreibt die Sequenzen, die einen Einfluss auf die Transkription und gegebenenfalls Translation der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in prokaryotischen oder eukaryontischen Organismen haben. Beispiele sind hierfür sind Promotoren, Terminatoren oder sogenannte "enhancer" Sequenzen. Zusätzlich zu diesen Kontrollsequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch so modifiziert worden sein, dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression des Zielgens modifiziert, also erhöht oder erniedrigt wurde. Die Auswahl der Kontrollsequenz erfolgt abhängig vom Wirtsorganismus oder Ausgangsorganismus. Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3'Region von Genen. Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. "Homologie" oder "Identität" zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch die Identität der
Nukleinsäuresequenz/Polypeptidsequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Nukleotide
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10000 Average Mismatch: 0
Sofern andere Parameter zur Bestimmung von Identitäten verwendet werden, werden diese im folgenden aufgeführt.
Anstelle des Begriffs homolog oder Homologie wird im Folgenden auch gleichbedeutend der Begriff Identität verwendet.
"Mutationen" umfassen Substitutionen (Ersetzungen), Additionen (Hinzufügung), Deletionen (Löschung), Inversion (Veränderungen) oder Insertionen (Einfügungen) eines oder mehrerer Nukleotidreste, wodurch sich auch die entsprechende Aminosäuresequenz des Zielproteins mittels Substitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren verändern kann.
"Knock-Out Transformanden" oder auch KO Transformationen bezeichnet Einzelkulturen eines transgenen Organismus, in denen über Transformation ein spezifisches Gen gezielt inaktiviert wurde.
"Natürliche genetische Umgebung" meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an 5' oder 3' Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50bp, bevorzugt mindestens 100 bp, besonders bevorzugt mindestens 500 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, am meisten bevorzugt mindestens 5000 bp.
"Reaktionszeit" bezeichnet die Zeit, die man für die Durchführung eines Aktivitätstests bis zum Erhalt einer signifikanten Aussage über eine Aktivität benötigt und hängt sowohl von der spezifischen Aktivität des im Test eingesetzten Proteins als auch von der verwendeten Methode und der Empfindlichkeit der verwendeten Geräte ab. Dem Fachmann ist die Ermittlung der Reaktionszeiten bekannt. Bei auf photometrischen Methoden basierenden Verfahren für die Identifizierung von Substanzen mit fungizider Wirkung liegen die Reaktionszeiten im allgemeinen zwischen > 0 bis 360 Minuten.
"Rekombinante DNA" beschreibt eine Kombination von DNA-Sequenzen herstellbar durch rekombinante DNA Technologie.
"Rekombinate DNA Technologie": allgemein bekannte Techniken zur Fusionierung von DNA-Sequenzen (z.B. beschrieben in Sambrook et al., 1989, Cold Spring Habour, NY, Cold Spring Habour Laboratory Press).
"Replikationsursprünge" gewährleisten die Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in Mikroorganismen und Hefen z.B. der pBR322 ori, ColE1 oder der P15A ori in E. coli (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und der ARS1 ori in Hefe (Nucleic Acids Research, 2000, 28(10): 20602068).
"Reportergene" kodieren für leicht quantifizierbare Proteine. Über Wachstums, Fluoreszenz, Chemo, Biolumineszenz- oder Resistenzassay oder über eine photometrische Messung (Eigenfarbe) oder Enzymaktivität kann mittels dieser Gene eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder Zeitpunktes vorgenommen werden. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):2944) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996; 389(1):4447; Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6:325330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5):9128, 1997), die Chloramphenicolacetyltransferase, eine Luziferase (Giacomin, Plant Sei 1996, 116:5972; Scikantha, J Bact 1996, 178:121 ; Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10:324414), sowie Luziferasegene im allgemeinen die beta- Galactosidase, oder die beta-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 39013907) oder das Ura3-Gen.
"Selektionsmarker" verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika, oder andere toxische Verbindungen: Beispielhaft zu nennen seien hier das Neomycin PhosphotransferaseGen, das eine Resistenz gegen die Aminoglycosid Antibiotika Neomycin (G 418), Kanamycin, Paromycin (Deshayes A et al., EMBO J. 4 (1985) 27312737), das sul Gen kodierend für eine mutierte Dihydropteroat Synthase (Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990; 15(1):127136), das Hygromycin B Phosphotransferase Gen (Gen Bank Accession NO: K 01193) und das shble Resistenzgen, das eine Resistenz gegen die Bleomycin Antibiotika wie z.B. Zeocin verleiht. Weitere Beispiele für SelektionsmarkerGene sind Gene, die eine Resistenz gegen 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder Phosphinotricin etc. verleihen oder solche, die eine Antimetaboliten Resistenz verleihen, zum Beispiel das dhfr Gen (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13 (1994) 142149). Geeignet sind ferner Gene wie trpB oder hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sei U S A. 85 (1988) 80478051). Geeignet ist auch das Gen der Mannose Phosphat Isomerase (WO 94/20627), das ODC (Ornithin Decarboxylase) Gen (McConlogue, 1987 in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg.) oder die Deaminase aus Aspergillus terreus (Tamura K etal., Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 23362338).
"Signifikante Abnahme": bezogen auf die Aktivität des über eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz kodierten Polypeptides ist hier eine Aktivitätsabnahme des mit einer Testverbindung versetzten Polypeptides im Vergleich zur Aktivität des nicht mit der Testverbindung inkubierten gemeint, die außerhalb eines Meßfehlers liegt.
"Target/Target Protein": bezeichnet ein Polypeptid, welches ein Enzym im klassischen Sinne sein kann oder z.B. ein Strukturprotein, ein für Entwicklungsprozesse relevantes Protein, Transportproteine, regulatorische Untereinheiten die einem Enzymkomplex eine Substrat oder Aktivitätsregulation verleihen. Allen Targets oder Wirkorten gemein ist dabei, dass die funktionale Anwesenheit des Target Proteins essentiell für das Überleben oder die normale Entwicklung, das Wachstum und/oder die Infektiosität eines phytopathogenen Organismus sind.
"Transformation" beschreibt einen Prozess zur Einführung heterologer DNA in eine pro- oder eukaryontische Zelle. Mit einer transformierten Zelle ist nicht nur das Produkt des Transformationsprozesses an sich beschrieben, sondern auch alle transgenen Nachkommen des durch die Transformation hergestellten transgenen Organismus.
"Transgen": Bezogen auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette oder einen Vektor enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder einen Organismus transformiert mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, Expressionskassette oder Vektor beschreibt der Ausdruck transgen alle solche durch gentechnische Methoden hergestellten Konstruktionen, in denen sich entweder die Nukleinsäuresequenz des Target Proteins oder eine mit der Nukleinsäuresequenz des Zielproteins funktioneil verknüpfte genetische Kontrollsequenz oder eine Kombination der vorstehend genannten Möglichkeiten sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden. Die Modifikation kann hier beispielsweise über Mutation eines oder mehrerer Nukleotidreste der entsprechenden Nukleinsäuresequenz erreicht werden.
"Umfassend": Der Begriff "umfassend" oder "umfassen" bezogen auf Nuklein- oder Aminosäuresequenzen meint, daß die Nukleinsäuresequenz am 3' oder am 5' Ende zusätzliche Nukleinsäuresequenzen enthalten kann, wobei die Länge der zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen 2000 bp, vorzugsweise 1500 bp, besonders bevorzugt 100, ganz besonders bevorzugt 50bp am 5' und 3' Ende nicht überschreitet.
Autophagozytose spielt eine wichtige Rolle im Infektionszyklus von phytopathogenen Pilze. So haben zum Beispiel physiologische Untersuchungen des Reisbranderregers Magnaporthe grisea gezeigt, dass die während der Infektions-relevanten Morphogenese im Reisbranderreger Magnaporthe grisea mobilisierten Reservestoffe durch Autophagozytose in die zentrale Vakuole der Infektionsstruktur transportiert werden (Thines et al. (2000) Plant Cell 12:1703-1718, Weber et al. (2001) Protoplasma 216:101-112.). Dort werden sie abgebaut, wobei die freiwerdenden Abbauprodukte anscheinend für die Melaninbiosynthese verwendet werden sowie zur Generierung eines Turgordrucks im Appressorium, der nötig ist, um eine Inktionshyphe mechanisch durch die Kutikula der Wirtspflanze zu pressen.
Die Deletion eines an der Autophagozytose beteiligten Gens in Hefe, welche für eine Ser/Thr-Kinase codiert, das sog. AUT3-Gen führte zu Mutanten, die nicht mehr zur Autophagozytose befähigt sind (Straub et al. (1997), J. Bacteriol 179:3875-3883).
Ob ein deratiges Gen in phytopathogenen Pilzen exisitert oder gar eine Rolle spielt, ist nicht bekannt.
Überraschender Weise wurde gefunden, dass eine an der Autophagozytose beteilitgte Ser/Thr-Kinase als Target für Fungzide geeignet ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung eines Polypeptides mit der Aktivität einer der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz umfassend
a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz;
b) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt; oder
c) eine Nukleinsäuresequenz, welche eine Identität mit der SEQ ID NO:1 von mindestens 46% aufweist, ableiten lässt
als Target für Fungizide.
Funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:1 gemäß c) weisen eine Identität mit der SEQ ID No:2 von mindestens 45% 46%, 47%, 48%, 49% oder 50%, vorteilhaft 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63% oder 64% bevorzugt mindestens 65%, 66%, 67%,68%,69%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75% oder 76% besonders bevorzugt mindestens 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90% ganz besonders bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf. Die oben genannten Nukleinsäuresequenzen gemäß a) und b) sowie deren funktioneilen Äquivalente gemäß c) stammen aus einem Pilz wie einer Hefe wie z.B. einer Hefe der Gattung Saccharomyces (S) wie z.B. S. cerevisiae,
Schizosaccharomyces wie z.B. Shizosaccharomyces pombe oder Pichia wie z.B. P. pastoris, P. methanolica oder einem filamentösen Pilz wie z.B. aus dem saprophytischen Pilz z. Neurospora oder einem phytopathogenen Pilz, vorzugsweise aus einem phytopathogenen Pilz, bevorzugt aus einem phytopathogenen Pilz der
Gattung Alternaria, Podosphaera, Sclerotinia, Physalospora, Botrytis, Corynespora;
Colletotrichum; Diplocarpon; Elsinoe; Diaporthe; Sphaerotheca; Cinula, Cercospora; Erysiphe; Sphaerotheca; Leveillula; Mycosphaerella; Phyllactinia; Gloesporium;
Gymnosporangium, Leptotthrydium, Podosphaera; Gloedes; Cladosporium;
Phomopsis; Phytopora; Phytophthora; Erysiphe; Fusarium; Verticillium; Glomerella;
Drechslera; Bipolaris; Personospora; Phaeoisariopsis; Spaceloma;
Pseudocercosporella; Pseudoperonospora; Puccinia; Typhula; Pyricularia; Rhizoctonia; Stachosporium; Uncinula; Ustilago; Gaeumannomyces, oder Fusarium (F.), besonders bevorzugt aus einem filamentösen Pilz ausgewählt aus den Gattungen und Arten
Neurospora (N.) wie N. crassa, Alternaria, Podosphaera, Sclerotinia, Physalospora z.B.
Physalospora canker, Botrytis (B.) z.B. B. cinerea, Corynespora z.B. Corynespora melonis; Colletotrichum; Diplocarpon z.B. Diplocarpon rosae; Elsinoe z.B. Elsinoe fawcetti, Diaporthe z.B. Diaporthe citri; Sphaerotheca; Cinula z.B. Cinula neccata,
Cercospora; Erysiphe z.B. Erysiphe cichoracearum and Erysiphe graminis;
Sphaerotheca z.B. Sphaerotheca fuliginea; Leveillula z.B. Leveillula taurica;
Mycosphaerella; Phyllactinia z.B. Phyllactinia kakicola; Gloesporium z.B. Gloesporium kaki; Gymnosporangium z.B. Gymnosporangium yamadae, Leptotthrydium z.B. Leptotthrydium pomi, Podosphaera z.B. Podosphaera leucotricha; Gloedes z.B.
Gloedes pomigena; Cladosporium z.B. Cladosporium carpophilum; Phomopsis;
Phytopora; Phytophthora z.B. Phytophthora infestans; Verticillium; Glomerella z.B.
Glomerella cingulata; Drechslera; Bipolaris; Personospora; Phaeoisariopsis z.B.
Phaeoisariopsis vitis; Spaceloma z.B. Spaceloma ampelina; Pseudocercosporella z.B. Pseudocercosporella herpotrichoides; Pseudoperonospora; Puccinia; Typhula;
Pyricularia z.B. Pyricularia oryzae (Magnaporthe grisea); Rhizoctonia; Stachosporium z.B. Stachosporium nodorum; Uncinula z.B. Uncinula necator; Ustilago;
Gaeumannomyces (G.) species z.B. G. graminis und Fusarium species z.B. F. dimerium, F. merismoides, F. lateritium, F. decemcellulare, F. poae, F. tricinctum, F. sporotrichioides, F. chlamydosporum, F. moniliforme, F. proliferatum, F. anthophilum, F. subglutinans, F. nygamai, F. oxysporum, F. solani, F. culmorum, F. sambucinum, F. crookwellense, F. avenaceum ssp. avenaceum, F. avenaceum ssp. aywerte, F. avenaceum ssp. nurragi, F. hetrosporum, F. acuminatum ssp. acuminatum, F. acuminatum ssp. armeniacum, F. longipes, F. compactum, F. equiseti, F. scripi, F. polyphialidicum, F. semitectum and F. beomiforme und F. graminearum ganz besonders bevorzugt aus einem filamentösen Pilz ausgewählt aus den Gattung Pyricularia wie z.B. Pyricularia oryzae (Magnaporthe grisea).
Die funktioneilen Äquivalente gemäß c) umfassen auch eine Nukleinsäuresequenz codierend für ein Polypeptid mit der Funktion einer der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase, welche
(i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:4 oder 6 dargestellten Sequenz; oder
(ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO:5 oder 7 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt.
umfasst.
Im folgenden werden zur Vereinfachung Nukleinsäuresequenzen codierend für eine der Autophagozytose beteilitgte Ser/Thr-Kinase umfassend
a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz; oder
b) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt; oder
c) eine Nukleinsäuresequenz, welche eine Identität mit der SEQ ID NO:1 von mindestens 46% aufweist, ableiten lässt;; welche vorzugsweise aus einem phytopathogenen Pilz stammen, als „erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen" bezeichnet. Unter den Begriff „erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen" fallen auch die folgenden Nukleinsäuresequenzen, welche Ausführungsformen der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenz c) darstellen und eine Nukleinsäuresequenz umfassen, welche
i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:4 oder 6 dargestellten Sequenz; oder
ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO:5 oder 7 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt
Ein durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz codiertes Polypeptid mit der Aktivität einer der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase wird im folgenden als "STK" bezeichnet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Expressionskassetten enthaltend
a) genetische Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz; oder
b) zusätzliche Funktionselemente; oder
c) eine Kombination aus a) und b).
sowie von Vektoren enthaltend die vorstehend genannte Expressionskassette (im folgenden als "erfindungsgemäße Expressionskassetten" bzw. "erfindungsgemäße Vektoren" bezeichnet) zur Expression von STK für in vitro oder in vivo Testsysteme.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine erfindungsgemäße Expressionskassette am 5'-Ende der kodierenden Sequenz einen Promotor und am 3'- Ende Transkriptions-Terminations-Signal und gegebenenfalls weitere genetische Kontrollsequenzen, welche mit der dazwischen liegenden kodierenden Sequenz für das Gen von STK funktionell verknüpft sind.
Erfindungsgemäß sind auch Äquivalente der oben beschriebenen Expressionskassetten die zum Beispiel durch eine Kombination der einzelnen Nukleinsäuresequenzen auf einem Polynukleotid (Mehrfachkonstrukte), auf mehreren Polynukleotiden in einer Zelle (Kotransformation) oder durch sequenzielle Transformation zustande kommen können.
Vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen für die erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder diese enthaltene Vektoren sind beispielsweise Promotoren wie cos, tac, trp, tet, Ipp, lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, IPR oder im IPLPromotor, die zur Expression der STK in gramnegativen Bakterienstämmen verwendet werden können.
Weitere vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den Promotoren amy und SPO2, die zur Expression der STK in grampositiven Bakterienstämmen verwendet werden können, sowie in den Hefe oder Pilzpromotoren AUG1, GPD1, PX6, TEF, CUP1, PGK, GAP1, TPI, PHO5, AOX1, GAL10/CYC1, CYC1 , OliC, ADH, TDH, Kex2, MFa oder NMT oder Kombinationen der vorstehend genannten Promotoren enthalten (Degryse et al., Yeast 1995 Jun 15; 11(7):62940; Romanos et al. Yeast 1992 Jun;8(6):42388; Benito et al. Eur. J. Plant Pathol. 104, 207220 (1998); Cregg et al. Biotechnology (N Y) 1993 Aug;11(8):90510; Luo X., Gene 1995 Sep 22;163(1):12731 ; Nacken et al., Gene 1996 Oct 10;175(12): 25360; Turgeon etal., Mol Cell Biol 1987 Sep;7(9):3297305) oder den Transkriptionsterminatoren NMT, Gcy1 , TrpC, AOX1 , nos, the PGK oder CYC1 (Degryse et al., Yeast 1995 Jun 15; 11(7):62940; Brunelli et al. Yeast 1993 Dec9(12): 130918; Frisch et al., Plant Mol. Biol. 27 (2), 405409 (1995); Scorer et al., Biotechnology (N.Y.) 12 (2), 181184 (1994), Genbank acc. number Z46232; Zhao et al. Genbank acc number : AF049064; Punt et al., (1987) Gene 56 (1), 117124), die zur Expression der STK in Hefestämmen verwendet werden können.
Als zur Expression in Insektenzellen geeignete genetische Kontrollelemente sind exemplarisch der Polyhedrin Promotor sowie der p10 Promotor (Luckow, V.A. and Summers, M.D. (1988) Bio/Techn. 6, 4755) sowie gegebenenfalls auch geeignete, dem Fachmann bekannte Terminatoren.
Vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen zur Expression von STK in Zellkultur sind neben Polyadenylierungssequenzen zum Beispiel eukaryontische Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus, HIVThymidinkinase oder Simian Virus 40 sowie gegebenenfalls auch geeignete, dem Fachmann bekannte Terminatoren.
Unter zusätzlichen Funktionselementen b) sind beispielhaft aber nicht einschränkend Reportergene, Replikationsursprünge, Selektionsmarker und sogenannte AffinitätsTags, fusioniert mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz direkt oder mittels eines Linkers optional enthaltend eine Protease-Schnittstelle zu verstehen. Insbesondere bevorzugt sind weiterhin als zusätztliche Funktionselemente Sequenzen, die ein Targeting in die Vakuole, das Mitochondrium, das Peroxisom, das Endoplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Grit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285423).
Erfindungsgemäß sind ferner Vektoren, die mindestens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und/oder der erfindungsgemäßen Expressionskassetten enthalten.
Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, ISEIemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt als Vektor oder den verwendeten Nukleinsäuresequenzen bestehen. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette sowie davon abgeleitete Vektoren können zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen und eukaryontischen, nicht humanen Zellen (z.B. Insektenzellen) mit dem Ziel der rekombinanten Herstellung der STK eingesetzt werden, wobei sich die Herstellung einer geeigneten Expressionskassette nach dem Organismus, in welchen das Gen exprimiert werden soll, richtet.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.
Sollen neben den Nukleinsäuresequenzen weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.
Hierbei kann das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n), der Expressionskassette oder des Vektors in die entsprechenden Organismen (Transformation) prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Für die Transformation von Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1 , (1995), IRL Press (ISBN 0199634769), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen. Bei der Transformation von filamentösen Pilzen bieten sich folgende Methoden an: Zum einen die Herstellung von Protoplasten und Transformation mit Hilfe von PEG (Wiebe et al. (1997) Mycol. Res. 101 (7): 971877; Proctor et al. (1997) Microbiol. 143, 25382591), zum anderen die Transformation unter zur Hilfenahme von Agrobacterium tumefaciens (de Groot et al. (1998) Nat. Biotech. 16, 839842).
Geeignete Organismen für die rekombinante Expression von STK sind neben Bakterien, Hefen, Moose, Algen, Pilze auch eukaryontische Zellinien, bevorzugt Bakterien, Hefen und Pilze.
Innerhalb der Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis oder Anabena bevorzugt.
Bevorzugte Hefen sind Hefen der Gattungen Gattungen Saccharomyces, Schizosaccheromyces oder Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) beschriebene Pilze.
Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geeignet beispielsweise C. elegans.
Bevorzugt ist auch die Verwendung von Expressionsystemen und Vektoren, die öffentlich zugänglich oder kommerziell erhältlich sind.
Zur Verwendung in E. coli Bakterien sind die typischen vorteilhaften, kommerziell erhätlichen Fusions und Expressionsvektoren pGEX [Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:3140], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion Stransferase beinhaltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A, die pTrcVektoren (Amann et al., (1988) Gene 69:301315) der "pKK2332" von CLONTECH, Palo Alto, CA und die "pET", und die "pBAD'VektorSerien von Stratagene, La Jolla zu nennen. Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYepSed (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113123), and pYES Derivate, pGAPZ Derivate, pPICZ Derivate sowie die Vektoren des "Pichia Expression Kit" (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren für die Nutzung in filamentösen Pilzen sind beschrieben in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and Vektor development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 128, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressionsvektoren genutzt werden z.B. für die Expression in Sf9, Sf21 oder Hi5 Zellen, welche über rekombinante Baculoviren infiziert werden. Dies sind z.B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:21562165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:3139). Weiterhin genannt seien die Baculovirus Expressionssysteme "MaxBac 2.0 Kit" und "Insect Select System" von Invitrogen, Calsbald oder "BacPAK Baculovirus Expressionssystem" von CLONTECH, Palo Alto, CA. Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressionsvektoren genutzt werden z.B. für die Expression in Sf9, Sf21 oder Hi5 Zellen, welche über rekombinante Baculoviren infiziert werden. Dies sind z.B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:21562165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:3139). Weiterhin genannt seien die Baculovirus Expressionssysteme "MaxBac 2.0 Kit" und "Insect Select System" von Invitrogen, Calsbald oder "BacPAK Baculovirus Expressionssystem" von CLONTECH, Palo Alto, CA. Die Handhabung von Insektenzellen in Zellkultur sowie ihre Infektion zur Expression von Proteinen sind dem Fachmann bekannt und können in Analogie zu bekannten Methoden erfolgen (Luckow und Summers, Bio/Tech. 6, 1988, pp.4755; Glover and Harnes (eds) in DNA Cloning 2, A practical Approach, Expression Systems, Second Edition, Oxford University Press, 1995, 205244).
Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzenzellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren finden sich in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 11951197 oder in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 87118721. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC genannt in: Seed, B. (1987) Nature 329:840 oder Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Sämtliche durch die oben beschriebenen Ausführungen möglichen Ausführungsformen transgener Organismen, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz z.B. durch Transformation mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder eines erfindungsgemäßen Vektors enthaltend eine erfindungsgemäßen Expressionskassette werden im folgenden als "erfindungsgemäße Organismen" bezeichnet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von STK als Target für Fungizide.
Bevorzugt ist die Verwendung von STK in einem Verfahren zur Identifizierung von Testverbindungen mit fungizider Wirkung.
Sämtliche Verfahren für die Identifizierung von Inhibitoren mit fungizider Wirkung werden im folgenden als erfindungsgemäße Verfahren bezeichnet.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren die folgenden Schritte:
i. Inkontaktbringen von STK mit einer oder mehreren Testsubstanzen unter Bedingungen, welche die Bindung der Testsubstanz(en) an das Nukleinsäuremolekül oder das Polypeptid, das über das vorstehend genannte Nukleinsäuremolekül kodiert wird, erlauben; und
ii. Nachweis, ob die Testsubstanz an das Polypeptid aus i) bindet; oder iii. Nachweis, ob die Testsubstanzen die Aktivität des Polypeptides aus i) reduzieren oder blockieren; oder
iv. Nachweis, ob die Testsubstanzen die Transkription, Translation oder Expression des Polypeptides aus i) reduzieren oder blockieren.
Der Nachweis gemäß Schritt ii des oben stehenden Verfahrens kann anhand von Techniken, welche die Wechselwirkung zwischen Protein und Ligand aufzeigen, detektieren, erfolgen. Hierbei kann entweder die Testverbindung oder das Enzym eine detektierbare Markierung enthalten, wie z.B. eine fluoreszierende, radioisotope, chemilumineszierende oder enzymatische Markierung. Beispiele für enzymatische Markierungen sind Horseradish Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Luzifierase. Die anschließende Detektion richtet sich nach der Markierung und ist dem Fachmann bekannt.
Hierbei sind insbesondere fünf bevorzugte Ausführungsformen zu nennen, die in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch für Hochdurchsatzmethoden (High Troughput Screening, HTS) geeignet sind:
1. Über Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1994) 1175311575) lässt sich die durchschnittliche Diffusionsrate eines Fluoreszenzmoleküls in Abhängigkeit zur Masse in einem kleinen Probenvolumen bestimmen. Durch Messen der Massenänderung bzw. der daraus resultierenden veränderten Diffunsionsrate einer Testverbindung beim Binden an STK lässt sich FCS zur Bestimmung von Protein Inhibitor Wechselwirkungen einsetzten. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer durch ein Fluoreszenzmolekül markierten Testerbindung aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren so konzipiert sein, dass eine durch ein Fluoreszenzmolekül markierte chemische Referenzverbindung durch zu testende weitere chemische Verbindungen verdrängt wird ("Verdrändungsassay").
2. Fluoreszenzpolarisation nutzt die Eigenschaft eines mit polarisiertem Licht angeregten ruhenden Fluorophors ebenfalls wieder polarisiertes Licht zu emittieren. Kann der Fluorophor allerdings während des angeregten Zustande rotieren, so geht die Polarisation des emittierten Fluoreszenzlichts mehr oder weniger verloren. Bei sonst gleichen Bedingungen (z.B. Temperatur, Viskosität, Lösungsmittel) ist die Rotation eine Funktion der Molekülgröße, womit man über das Messsignal eine Aussage über die Größe des am Fluorophor gebundenen Rests treffen kann (Methods in Enzymology 246 (1995), pp. 283300). Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer durch ein Fluoreszenzmolekül markierten Testerbindung an STK aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungsassays" konzipiert sein.
3. Fluoreszenz Resonanz Energie Tranfer" (FRET) basiert auf der strahlungslosen Energieübertragung zwischen zwei räumlich benachbarten Fluoreszenzmolekülen unter geeigneten Bedingungen. Eine Voraussetzung ist die Überlappung des Emissionsspektrums des Donormoleküls mit dem Anregungsspektrum des Akzeptormoleküls. Durch Fluoreszenzmarkierung von STK und den Testverbindungen kann mittels FRET die Bindung gemessen werden (Cytometry 34, 1998, pp. 159179). Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungsassays" konzipiert sein. Eine besonders geeignete Ausführungsform der FRET Technologie ist die "Homogenous Time Resolved Fluorescence" (HTRF), wie sie von Packard BioScience vertrieben wird. Die so identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein.
4. Surface Enhanced Laser Desorption/Ionisation (SELDI) in Kombination mit einem Time of Flight Massenspektrometer (MALDITOF) ermöglicht die schnelle Analyse von Molekülen auf einem Träger und kann zur Analyse von Protein Ligand Wechselwirkungen verwendet werden (Worral et al., (1998) Anal. Biochem. 70:750756). In einer bevorzugten Ausführungsform immobilisiert man nun STK auf einem geeigneten Träger und inkubiert diesen mit der zu untersuchenden chemischen Verbindung. Nach einem oder mehreren geeigneten Waschschritten können die an die STK zusätzlich gebundenen Moleküle der chemischen Verbindung mittels der oben erwähnten Methodik detektiert werden, wodurch geeignete Inhibitoren selektiert werden können. 5. Die Messung von Oberflächen Plasmonenresonanz basiert auf der Änderung des Brechungsindexes an einer Oberfläche beim Binden einer chemischen Verbindung an ein auf besagter Oberfläche immobilisierten Protein. Da die Änderung des Brechungsindex für eine definierte Änderung der Massenkonzentration an der Oberfläche quasi für alle Proteine und Polypeptide identisch ist, kann diese Methode prinzipiell auf jedes Protein angewendet werden (Lindberg et al. Sensor Actuators 4 (1983) 299304; Malmquist Nature 361 (1993) 186187). Die Messung kann beipielsweise mit Hilfe der von Biacore (Freiburg) vertriebenen auf Oberflächen Plasmonenresonanz basierenden Analyseautomaten in einem Durchsatz von derzeit bis zu 384 Proben pro Tag durchgeführt werden. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung der Testverbindung an STK aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungsassays" konzipiert sein.
Sämtliche, über die oben genannten Verfahren identifizierten Substanzen können anschließend in einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren auf ihre fungizide Wirkung überprüft werden.
Auch besteht die Möglichkeit, über Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von STK mittels Röntgenstrukturanalyse weitere potentielle fungizide Wirkstoffe mittels "Molecular Modelling" zu detektieren. Die Herstellung von für die Röntgenstrukturanalyse benötigten Proteinkristallen sowie die entsprechenden Messungen und anschließenden Auswertungen dieser Messungen, die Detektion einer Bindungstelle im Protein sowie die Vorhersage möglicher Inhibitorstrukturen sind dem Fachmann bekannt. Über "Molecular Modelling" ist prinzipiell auch eine Optimierung der über die oben genannten Verfahren identifizierten Wirkstoffe möglich.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das auf den Schritten i) und iii) basiert, dadurch gekennzeichnet, dass
a) entweder STK in einem Organismus exprimiert wird oder ein Organismus, der naturgemäß STK enthält, kultiviert wird; b) STK aus Schritt a) im Zellaufschluss des transgenen bzw. nicht transgenen Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird; und
c) eine Verbindung selektiert wird, welche die enzymatische Aktivität von STK reduziert oder blockiert. Hierbei kann die enzymatische Aktivität des mit der Testverbindung inkubierten STK mit der enzymatischen Aktivität eines nicht mit einer Testverbindung inkubierten STK verglichen werden.
In Schritt (c) werden Testverbindungen selektiert, die eine signifikante Abnahme der Aktivität von STK im Vergleich zu einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten STK zur Folge haben, wobei eine Reduktion von mindestens 10 %, vorteilhaft mindestens 20 %, bevorzugt mindestens 30 %, besonders bevorzugt um mindestens 50 % und ganz besonders bevorzugt um mindestens 70 % oder eine 100% Reduktion (Blockierung) erzielt wird.
Die STK enthaltende Lösung kann aus dem Lysat des ursprünglichen Organismus oder des transgenen Organismus bestehen. Falls erforderlich kann STK partiell oder vollständig über gängige Methoden aufgereinigen werden. Eine allgemeine Übersicht über gängige Techniken zur Reinigung von Proteinen sind beispielsweise in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1994); ISBN 0879693096 beschrieben. Bei rekombinanter Darstellung kann eine Reinigung des mit einem Affinitäts-Tag fusionierten Polypeptides über Affinitätschromoatographie erfolgen.
Das für in vitro Verfahren benötigte STK kann somit entweder mittels heterologer Expression aus einem erfindungsgemäßen, transgenen Organismus erhalten werden. Alternativ kann STK auch aus einem Organismus, der STK enthält, isoliert werden, beispielsweise aus einem Pilz oder einer Hefe (s. z.B. Imblum and Rodwell (1975) J Lipid Res., 15, 211222). Geeignete Hefen sind in den Gattungen Saccharomyces, Schizosaccheromyces oder Pichia enthalten. Geeignete Hefen und filamentöse Pilze sind die eingangs erwähnten Spezies.
Die Bestimmung der Aktivität von STK kann beispielsweise über einen Enzym- Aktivitätstest erfolgen, d.h. durch Inkubation des erfindungsgemäßen Polypeptides mit einem geeigneten Substrat, wobei die Abnahme des Substrates oder der Anstieg des entstehenden Produktes oder die Ab- bzw. Zunahme des Cofaktors verfolgt wird.
Beispiele für geeignete Substrate sind z.B. Proteinhydrolysate und für geeignete Cofaktoren ATP, GTP oder UTP, bevorzugt ATP und Mg2+ oder Mn2+. Gegebenenfalls können auch Derivate der vorstehend genannten Verbindungen verwendet werden, die eine detektierbare Markierung enthalten, wie z. B. eine fluoreszierende, radioisotope (z.B. 14C markiertes Proteinsubstat, γ32 odery33 ATP) oder chem ilumineszierende.
Die Enzymaktivität kann durch Nachweis der Cofaktor Hydrolyse erfolgen. Ein Phosphatrest wird auf ein geeignetes Substrat übertragen. Das entsehende Diphosphat (z.B. ADP) kann auf verschiedene Arten nachgewiesen werde.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Umsatz des Substrates photometrisch verfolgt.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung der enzymatischen Aktivität, dass man
a) das Polypeptid mit einem geeigneten Cofaktor und Substrat versetzt; und
b) die Aktivität über die Menge an radioaktiv markiertem Substrat bestimmt; oder
c) die Aktivität über Kopplung der durch das Polypeptid mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase katalysierten Reaktion mit der durch die Pyruvat Kinase und Lactat Dehydrogenase katalysierten Oxidation von NADH bestimmt.
Im Schritt c) wird die ADP Produktion an die Oxidation von NADH gekoppelt. Die NADH Konzentration kann durch Absorptionbestimmt werden nach der Methode von Schulte et al (2000) Arch. Biochem. Biophys., 378 (2) 287-98. Die in Schulte et albeschriebene Methode ist Bestandteil der vorliegenden Beschreibung.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das auf den Schritten i) und iv) basiert, besteht aus den folgenden Schritten: i. der Herstellung eines erfindungsgemäßen transgenen Organismus; wobei in dem transgenen Organismus das Polypeptid mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase überexprimiert wird;
ii. das Aufbringen einer Testsubstanz auf den transgenen Organismus nach Schritt i) und auf einen nichttransgenen Organismus der gleichen Art;
iii. das Bestimmen der Infektiosität des transgenen und des nicht transgenen Organismus nach der Aufbringung der Testsubstanz; und
iv. der Selektion von Testsubstanzen, die eine vermindertelnfektiosität des nichttransgenen Organismus bewirken verglichen mit dem Wachstum des transgenen Organmismus bewirken.
Hierbei beträgt der Wachstumsunterschied bzw. der Unterschied bezüglich der Infektiosität in Schritt iv) zur Selektion eines Inhibitors mit fungizider Wirkung mindestens 10%, vorzugsweise 20%, bevorzugt 30%, besonders bevorzugt 40% und ganz besonders bevorzugt 50%. Die Bestimmung der Infektiosität erfolgt nur, wenn es sich bei dem Organismus um einen phytopathogenen Pilz handelt.
Die Herstellung des transgenen Organismus kann wie oben erwähnt durch Transformation des Organismus mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder eines Vektors enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder eine erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgen.
Die transgenen Zellen bzw. Organismen sind hierbei Bakterien, Hefen, filamentöse Pilze oder eukaryontische Zelllinien, bevorzugt ein phytopathogener filamentöser Pilze, besonders bevorzugt die auf den Seiten 11 und 12 erwähnten phytopathogenen filamentösen Pilze. Diese transgenen Organismen bzw. Zellen weisen daher eine erhöhte Toleranz gegen chemische Verbindungen auf, welche das erfindungsgemäße Polypeptid inhibieren. Sämtliche, über die oben genannten Verfahren identifizierten Substanzen können anschließend in einem weiteren in vivo Aktivitätstest auf ihre fungizide Wirkung überprüft werden. Eine Möglichkeit besteht darin, die entsprechende Substanz in einem Agardiffusionstests wie z.B bei Zähner, H. 1965 Biologie der Antibiotika, Berlin, Springer Verlag beschrieben, zu testen. Durchgeführt wird der Test mit einer Kultur eines filamentösen Pilzes, bevorzugt einer Kultur eines filamentösen phytopathogenen Pilzes, wobei die fungizide Wirkung z.B. über eingeschränktes Wachstum festgestellt werden kann. Hierbei sind unter dem Begriff phytopathogener Pilz die eingangs erwähnten Spezies zu verstehen.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch mehrere Testverbindungen in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Wenn durch eine Gruppe von Testverbindungen eine Beeinflussung des Targets erfolgt, dann ist es entweder möglich, die einzelnen Testverbindungen direkt zu isolieren oder die Gruppe von Testverbindungen in verschiedene Untergruppen zu teilen, z.B. wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten besteht, um so die Zahl der verschiedenen Testverbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren zu reduzieren. Das erfindungsgemäße Verfahren wiederholt man dann mit der einzelnen Testverbindung oder der entsprechenden Untergruppe von Testverbindungen. Abhängig von der Komplexität der Probe können die oben beschriebenen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugsweise bis die gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Untergruppe nur noch eine geringe Anzahl von Testverbindungen oder nur noch eine Testverbindung umfaßt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhaft als Hochdurchsatzverfahren (High Throughput Screen, HTS) durchgeführt werden, da HTS das parallele Testen einer Vielzahl verschiedener Verbindungen ermöglicht.
In HTS bietet sich für die praktische Durchführung die Verwendung von Trägern an, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, einen oder mehrere die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz enthaltenden Vektoren, einen oder mehrere transgene Organismen, welche mindestens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten oder eines oder mehrere (Poly)peptide codiert über die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen. Der verwendete Träger kann fest oder flüssig sein, ist bevorzugt fest, besonders bevorzugt eine Mikrotiterplatte. Die vorstehend genannten Träger sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Gemäß der am weit verbreitetsten Technik werden 96well Mikrotiterplatten verwendet, die in der Regel Volumina von 50 bis 500μl umfassen können. Neben den Mikrotiterplatten sind die weiteren Bestandteile eines HTS Systems passend zu den 96well Mikrotiterplatten wie viele Instrumente, Materialien, automatische Pipettiervorichtungen, Robotoren, automatisierte Plattenleser sowie Plattenwascher kommerziell erhältlich.
Neben den auf Mikrotiterplatten basierenden HTS Verfahren können auch sogenannte "free format assays" oder Testsysteme, die zwischen den Proben keine physischen Barrieren aufweisen, verwendet werden wie z.B. in Jayaickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 19 (1994) 161418; Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial Libaries, First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Philadelphia, Pa. (Nov. 710, 1995); Salmon et al., Molecular Diversity 2 (1996), 5763 und US 5,976,813.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren. Diese Verbindungen werden im folgenden "selektierte Verbindungen" genannt. Sie weisen ein Molekulargewicht von kleiner als 1000 g/mol, vorteilhaft kleiner 500 g/mol, bevorzugt kleiner 400 g/mol, besonders bevorzugt kleiner 300 g/mol. Verbindungen mit fungizider Wirkung weisen einem Ki Wert kleiner 1 mM, bevorzugt kleiner 1 mM, besonders bevorzugt kleiner 0,1 mM ganz besonders bevorzugt kleiner 0,01 mM aufweisen.
Die selektierten Verbindungen eigenen sich zur Bekämpfung phytopathogener Pilze. Beispiele für phytopathogene Pilze sind die oben genannten Gattungen und Arten.
Die selektierte Verbindungen können auch in Form ihrer landwirtschaftlich brauchbaren Salze vorliegen. Unter landwirtschaftlich brauchbaren Salzen kommen vor allem die Salze derjenigen Kationen oder die Säureadditionssalze derjenigen Säuren in Betracht, deren Kationen beziehungsweise Anionen die fungizide Wirkung der über die erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen mit fungizider Wirkung nicht negativ beeinträchtigen. Sämtliche, über die oben genannten Verfahren identifizierten Verbindungen sind, sofern sie Chiralitätszentren enthalten, sowohl als reine Enantiomere oder Diastereomere oder als deren Gemische sowie als Racemat Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die selektierten Verbindungen können chemisch synthetisierte oder mikrobiologisch produzierte Stoffe sein und z.B. in Zellextrakten von z.B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen auftreten. Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und werden z.B. allgemein beschrieben in Alberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), z.B. Kapitel 17.
Mögliche Testverbindungen können Expressionsbibliotheken wie z.B. cDNA- Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Stoffe, Hormone, PNAs oder ähnliches sein (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Referenzen).
Fungizide Mittel, welche die selektierten Verbindungen enthalten, bekämpfen phytopathogene Pilze sehr gut, besonders bei hohen Aufwandmengen. In Kulturen wie Weizen, Reis, Mais, Soja und Baumwolle wirken sie gegen phytopathogene Pilze, ohne die Kulturpflanzen nennenswert zu schädigen. Dieser Effekt tritt vor allem bei niedrigen Aufwandmengen auf. Ob die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen fungiziden Wirkstoffe als totale oder selektive Fungizide wirken, hängt unter anderem von der angewandten Menge, ihrer Selektivität und weiteren Faktoren ab. Die Substanzen können zur Bekämpfung der oben bereits erwähnten pathogenen Pilze verwendet werden.
In Abhängigkeit von der jeweiligen Applikationsmethode können die selektierten Verbindungen bzw. die enthaltende Zusammensetzungen vorteilhaft zur Beseitigung der eingangs bereits erwähnten phytopathogenen Pilze verwendet werden.
Weiter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der oben bereits erwähnten fungiziden Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet dass man selektierten Verbindungen mit für die Formulierung von Fungiziden geeigneten Hilfsmitteln formuliert.
Die selektierten Verbindungen können z.B. in Form von direkt versprühbaren wässrigen Lösungen, Pulvern, Suspensionen, auch hochprozentigen wäßrigen, öligen oder sonstigen Suspensionen bzw. Suspoemulsionen oder Dispersionen, emulgierbaren Konzentraten, Emulsionen, Öldispersionen, Pasten, Stäubemitteln, Streumitteln oder Granulaten formuliert werden und durch Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen angewendet werden. Die Anwendungsformen richten sich nach den Verwendungszwecken und der Natur der selektierten Verbindungen und sollte in jedem Fall möglichst die feinste Verteilung der selektierten Verbindungen gewährleisten. Die fungiziden Zusammensetzung enthalten einefungizid wirksame Menge mindestens einer selektierten Verbindung und für die Formulierung von fungiziden Zusammensetzungen übliche Hilfsstoffe.
Zur Herstellung von Emulsionen, Pasten oder wässrigen oder ölhaltigen Formulierungen sowie dispergierbaren Konzentraten (DC) können die selektierten Verbindungen in einem Öl oder Lösungsmittel gelöst oder dispergiert werden, wobei weitere Formulierungshilfsstoffe zur Homogenisierung zugesetzt werden können. Es können aber auch aus selektierter Verbindung, gegebenenfalls Lösungsmitteln oder Öl sowie optional weiteren Hilfsmitteln bestehende flüssige oder feste Konzentrate hergestellt werden, die zur Verdünnung mit Wasser geeignet sind. Hier zu nennen sind emulgierbare Ko nzentrate (EC, EW), Suspensionen (SC), lösliche Konzentrate (SL), dispergierbaren Konzentrate (DC), Pasten, Pastillen netzbaren Pulvern oder Granulaten, wobei die festen Formulierungen entweder in Wasser löslich (soluble) oder dispergierbar (wettable) sein können. Desweiteren können entsprechende Pulver bzw. Granulate oder Tabletten noch mit einem festen, den Abrieb oder eine vorzeitige Wirkstofffreisetzung verhinderenden Überzug ("coating") versehen werden.
Prinzipiell sind unter dem Begriff Hilfsmittel folgende Substanzklassen zu verstehen: Antischäumungsmittel, Verdicker, Netzmittel, Haftmittel, Dispergiermittel, Emulgiermittel, Bakterizide und/oder thixotrophe Agentien. Die Bedeutung der oben genannten Mittel ist dem Fachmann bekannt.
SLs, EWs und ECs können durch einfaches Mischen der entsprechenden Inhaltsstoffe hergestellt werden, Pulver über Mischen oder Vermählen in speziellen Mühlentypen (z.B. Hammermühlen). DC, SCs und SEs werden üblicherweise über Naßvermahlung ("wet milling") hergestellt, wobei ein SE aus einem SC durch Zugabe einer organischen Phase, die weitere Hilfsmittel oder selektierte Verbindungen enthalten kann, hergestellt werden kann. Die Herstellung ist bekannt. Pulver, Streu und Stäubemittel können vorteilhaft durch Mischen oder gemeinsames Vermählen der wirksamen Substanzen mit einem festen Trägerstoff hergestellt werden. Granulate, z.B. Umhüllungs-, Imprägnierungs und Homogengranulate können durch Bindung der selektierten Verbindungen an feste Trägerstoffe hergestellt werden. Weitere Details der Herstellung sind dem Fachmann bekannt, und z.B. in folgenden Schriften aufgeführt: US 3,060,084, EPA 707445 (für flüssige Konzentrate), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 14748, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGrawHill, New York, 1963, pages 857 und ff. WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701 , US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 und Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Federal Republic of Germany), 2001.
Inerte flüssige und/oder feste Trägerstoffe geeignet für die erfindungsgemäßen Formulierungen sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, wie z.B. flüssige Zusatzstoffe wie Mineralölfraktionen von mittlerem bis hohem Siedepunkt, wie Kerosin oder Dieselöl, ferner Kohlenteeröle sowie Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, aliphatische, cyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe, z.B. Paraffin, Tetrahydronaphthalin, alkylierte Naphthaline oder deren Derivate, alkylierte Benzole oder deren Derivate, Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Cyclohexanol, Ketone wie Cyclohexanon oder stark polare Lösungsmittel, z.B. Amine wie NMethylpyrrolidon oder Wasser.
Feste Trägerstoffe sind beispielsweise Mineralerden wie Kieselsäuren, Kieselgele, Silikate, Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Bolus, Löß, Ton, Dolomit, Diatomeenerde, Calcium und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid, gemahlene Kunststoffe, Düngemittel, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Harnstoffe und pflanzliche Produkte wie Getreidemehl, Baumrinden, Holz und Nußschalenmehl, Cellulosepulver oder andere feste Trägerstoffe. Oberflächenaktive Stoffe (Tenside) geeignet für die erfindungsgemäßen Formulierungen sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, wie z.B. Alkali, Erdalkali, Ammoniumsalze von aromatischen Sulfonsäuren, z.B. Lignin, Phenol, Naphthalin und Dibutylnaphthalinsulfonsäure, sowie von Fettsäuren, Alkyl und Alkylarylsulfonaten, Alkyl, Laurylether und Fettalkoholsulfaten, sowie Salze sulfatierter Hexa, Hepta und Octadecanolen sowie von Fettalkoholglykolether, Kondensationsprodukte von sulfoniertem Naphthalin und seiner Derivate mit Formaldehyd, Kondensationsprodukte des Naphthalins bzw. der Naphthalinsulfonsäuren mit Phenol und Formaldehyd, Polyoxyethylenoctylphenolether, ethoxyliertes Isooctyl, Octyl oder Nonylphenol, Alkylphenyl, Tributylphenylpolyglykolether, Alkylarylpolyetheralkohole,
Isotridecylalkohol, Fettalkoholethylenoxid Kondensate, ethoxyliertes Rizinusöl, Polyoxyethylenalkylether oder Polyoxypropylenalkylether,
Laurylalkoholpolyglykoletheracetat, Sorbitester, LigninSulfitablaugen oder Methylcellulose.
Die Applikation der fungiziden Zusammensetzungen bzw. der Wirkstoffe kann curativ, eradikativ oder protektiv erfolgen. Die Aufwandmengen an fungiziden Wirkstoff (= Substanze und/oder Mittel) betragen je nach Bekämpfungsziel, Jahreszeit, Zielpflanzen und Wachstumsstadium 0.001 bis 3.0, vorzugsweise 0.01 bis 1.0 kg/ha.
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt.
Beispiele Klonierungsverfahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, DNA-Isolierung, Agarose- Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Sequenzanalyse rekombinanter DNA sowie Southern und Western Blots wurden wie in Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli XL1-blue) wurden von Stratagene bezogen. Als Magnaporthe grisea Stamm wurde 8958 des Fungal Genetics Stock Center, Kansas City (FGSC) verwendet.
Des weiteren wurden alle, im Folgenden verwendeten Chemikalien, sofern nicht anders erwähnt, in p.A. Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) sowie Sigma (Deisenhofen) bezogen. Lösungen wurden mit aufbereitetem, pyrogenfreiem Wasser, im weiteren Text als H2O bezeichnet, aus einer Milli-Q Water System Wasseraufbereitungsanlage (Millipore, Eschborn) angesetzt. Restriktionsenzyme, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits wurden von den Firmen AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Biometra (Göttingen), Röche (Mannheim), Genomed (Bad Oeynhausen), New England Biolabs (Schwalbach/Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Promega (Madison, Wisconsin, USA), Pharmacia (Freiburg) Qiagen (Hilden) und Stratagene (Heidelberg) bezogen. Sie wurden, soweit nicht anders erwähnt, nach Herstellerangaben verwendet.
Alle für die gentechnischen Experimente verwendeten Medien und Puffer wurden entweder über Sterilfiltration oder Erhitzen im Autoklaven sterilisiert.
1. Identifikation der SEQ ID NO:1
Anhand des Contigs MG-Contig_21185, (welches aus der Datenbank des Whitehead Institutes stammt (Whitehead Institute, Cambridge, USA / www.wi.mit.edu) wurden Primer entworfen, mit deren Hilfe ein geeignet großes genomisches PCR-Fragment mit relativ großen flankierenden Enden entworfen werden sollte. Weiterhin wurde darauf geachtet, dass sich in den flankierenden Regionen keine zusätzlichen Gene befinden, bzw. dass die beiden Primer nicht innerhalb anderer Gene lagen.
Mit Hilfe der Primer
Aut3_V1_for CCC CCG CCC GCA ACA TCC (SEQ ID NO:8)
Aut3_V1_rev GAC TCC GCC AAA CCC CAC ACT G (SEQ ID NO:9) wurde aus genomischer DNA isoliert aus dem M. grisea Stamm ein 5,833 kb Fragment über PCR identifiziert, in den Vektor pCR-XL-TOPO (Fa. Invitrogen, Karlsruhe) über Standardmethoden kloniert.
Mittels Transformation in E. coli XL1 , anschließender Isolation positiver Klone nach Herstellerangaben über blue/white screening wurden vom 5' und vom 3' Ende des 5,833kb-Fragmentes mit Hilfe der auf dem Vektor bindenden Primer
T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG (SEQ ID NO:10)
und
M13 CAG GAA ACA GCT ATG ACC (SEQ ID NO:11 )
sequenziert.
Mit dieser Sequenzinformation wurde die zum 5,833 kb Insert gehörende Sequenz des Aut3-Gens (SEQ ID NO:3) und dessen flankierende Regionen über Abgleich mit der der Öffentlichkeit zugänglichen Datenbank des Whitehead Institutes identifiziert [Whitehead Institute, Cambridge, USA / www.wi.mit.edu]. Diese Sequenz enthält die für die SEQ ID NO:2 codierende, Intron enthaltende, Nukleinsäuresequenz (von 1267bp- 4505bp). Die entsprechende Nukleinsäuresequenz ohne Introns codierend für SEQ ID NO:2 ist in der SEQ ID NO:1 dargestellt.
Das 5,833 kb-lnsert enthaltene Plasmid wird im folgenden als pAUT301 bezeichnet.
2. Herstellung eines für die Transformation von M. grisea geeigneten Transformationsvektors
Zunächst wurde über das Restriktionsenzym Sacll aus dem Vektor pAUT301 ein 1 ,317 Fragment aus dem 5,883kb Insert (SEQ ID NO:3) entfernt, wodurch der Vektor pAUT 301 -del erhalten wurde.
Die Hygromycinkassette wurde mit dem palindromischen Primer Sacll hyg TCC CCG CGG GGA AAT TCG TCG ACG TTA AC (SEQ ID NO: 12)
über PCR mit dem Vektor pCB1003 (FGSC) als Templat amplifiziert. Das so erhaltene Fragment wurde in den Vektor pAUT301-Del kloniert.
Identifikation der positiven Klone erfolgte über Transformation des erhaltenen Ligationsansatzes in E. coli XL1 blue und anschließender Isolation positiver Klone nach Herstellerangaben über blue/white screening) . Der so erhaltene Vektor wird im Weiteren als pAUT302 bezeichnet.
3. Transformation von M. grisea
A) Herstellung von Protoplasten Die Herstellung der Protoplasten erfolgte nach Talbot et al. (1993) Plant Cell 5, 1575-1590
B) PEG-vermittelte Transformation von M. grisea-Protop lasten mit rekombinanter DNA
107 Protoplasten (Konzentrationsbestimmung mittels Neubauer-Zählkammer) wurden mit 1-2 μg linearisierter Plasmid-DNA gemischt, 20 min bei RT inkubiert, mit 1ml PTC- Puffer (Tris-HCI pH 7,5 10mM, CaCI2 10mM, PEG 4000 60g, H2O ad 100ml) versetzt, weitere 20min bei RT inkubiert, mit 10ml OCM-Flüssigmedium (CM-Medium, 1M Saccharose) versetzt und über Nacht bei 28°C und 70Upm auf inkubiert.
Nach 16 Stunden wurden die Protoplasten in 100ml CMS-Topagar (CM-Medium, 0.08M Saccharose, 5g Agar/I), im Wasserbad abgekühlt auf 42°C) auf CMS- Bottomagarplatten (CM-Medium, 0.08M Saccharose, 15g Agar/I) ausplattiert. Die Platten werden 16 Stunden bei 22°C im Dunkeln aufbewahrt und schließlich mit 15ml CM-Medium mit 100mg/l Hygromycin überlagert.
C) Selektion der Transformanten
Nach vier Tagen werden die ersten Transformanten, die durch den Hygromycin-Agar gewachsen waren, auf frische CM-Agarplatten mit 100mg/l Hygromycin (15g Agar/I) überimpft. Angewachsene Transformanten wurden auf frische CM-Platten ohne Hygromycin überimpft und auf diesem Medium weiterkultiviert.
Durch die Transformation des M. grisea-Wildtypstammes 70-15 mit dem durch den Einbau einer Hygromycin -Resistenzkassette zerstörten AUT3-Genes, konnten 183 Transformanten generiert werden, die in der Lage sind, auf Hygromycin -haltigem Medium zu wachsen.
Beispiel 4 Charakterisierung der Transformanten
A) Charakterisierung über PCR und Southern Blot
Aus diesen hygromycinresistenten Transformanten, die somit sicher über eine ins Genom integrierte Hygromycinkassette verfügen, wurde DNA isoliert, um zu untersuchen, ob diese Transformanten durch homologe oder heterologe Rekombination des zerstörten AUT3-Genes in das Genom entstanden sind.
Die genomische DNA wurde unter Nutzung des DNeasy Plant Mini Kits (Qiagen, Hilden) isoliert.
Der Nachweis des homologen Rekombinationsereignisses in das Genom von M. grisea, und somit der erfolgreich durchgeführten Geninaktivierung des durch das 3,2 kb codierten AUT3-Gens (Δ Aut3) erfolgte zunächst durch PCR mittels der Primerpaare
Aut3_ko_for TGG CGA TGC ACC CTT TGT CAG A (SEQ ID NO:13) und
Aut3_ko_rev GAG AAG GCC GCG CAG GAT GTA GC (SEQ ID NO: 14) sowie
Aut3_halbhyg_for AGC TGC GCC GAT GGT TTC TAG AA (SEQ ID NO:15) und
Aut3_halbhyg_rev ACA CTT CGC GGC GTC ACA TCA C (SEQ ID NO:16) Die Primerbindestelle des Primers Aut3_halbhyg_for sind an der Hygromycinkassette lokalisiert, während die des Primers Aut3_halbhyg_rev im Fragment Frag_Aut3 liegt. Dadurch kommt es bei allen Transformanten, die _AUT3 in ihr Genom integriert haben, zur Amplifikation des PCR-Produktes.
Um zwischen homologer und heterologer Integration unterscheiden zu können, wurde eine weitere PCR mit dem Aut3_ko-Primerpaar durchgeführt. Die Primerbindestellen dieser beiden Primer lagen auf dem 1317 bp großen Fragment, das über Restriktion mit Sacll aus dem Fragment Frag_Aut3 des pAUT301 -Vektors entfernt und durch die Hygromycin-Resistenzkassette ersetzt wurde.
Somit konnte bei einer PCR mit genomischer template-DNA aus Transformanten mit dem Aut3_ko-Primerpaar nur ein Produkt amplifiziert werden, wenn die Transformanten durch ein heterologes Rekombinationsereignis entstanden sind. Diese Transformanten verfügen neben dem ins Genom integrierten rekombinanten DNA noch über das ursprüngliche Gen, AUT3, und somit über die Primerbindestellen für das Aut3_ko-Primerpaar. Bei der Integration von zlAUT3 über ein homologes Rekombinationsereignis ist der Teil des AUT3-Genes, auf dem diese Primerbindestellen liegen, deletiert. Somit findet keine Amplifikation eines Produkts statt.
Durch die Untersuchungen mittels PCR konnten 12 aus 60 Transformanten als durch homologe Rekombination entstanden identifiziert werden. Die Transformanten T2, T3, T10, T13, T18, T20, T21 , T34, T36, T39, T42 und T48 wurden somit durch PCR- Untersuchungen als zlAUT3-Mutanten bestimmt.
Die durch die Untersuchungen mittels PCR erhaltenen Ergebnisse wurden durch einen Southern Blot verifiziert. Zur Untersuchung, ob die Transformanten über das veränderte Gen verfügen, wurde die aus den Transformanten isolierte genomische DNA mit der Restriktionsendonuclease Sall verdaut und mit spezifischen, DIG- markierten Gensonden geprobt.
Die beiden Primerpaare, mit denen die PCR-Untersuchung der mit lAUT3 generierten Transformanten durchgeführt wurde, Aut3_halbhyg und Aut3_ko, dienten hierbei zur Herstellung zweier DIG-markierter Gensonden. Die Herstellung erfolgte unter Standartbedingungen mit Hilfe der PCR.
Der Nachweis der Integration von _4AUT3 ins Genom der Transformanten durch Southern Blotting verlief nach dem gleichen Schema wie auch der Nachweis durch PCR. Auch hier wurde durch die Aut3_halbhyg-Sonde gezeigt, dass eine Integration von _dAUT3 in s Genom stattgefunden hat. Mit Hilfe der Aut3_ko-Sonde konnte daraufhin gezeigt werden, ob diese Integration durch homologe oder heterologe Rekombination zustande kam.
Dazu wurde die genomische DNA, die aus mit _dAUT3 transformierten Pilzen und dem M. grisea Wildtyp 70-15 isoliert wurde, mit dem Restriktionsenzym Sall geschnitten. Die zur Kontrolle eingesetzten Vektoren pAUT301 und pAUT302 wurden ebenfalls mit Sall restringiert.
Durch die Restriktion mit Sall wird der Vektor pAUT301 in drei Fragmente (6119 bp, 1962 bp und 1271 bp) geschnitten. Die Aut3_halbhyg -Sonde bindet spezifisch an das 1271 bp große Fragment, das auch beim Wildtyp 70-15 und bei durch heterologe Rekombination von 4AUT3 entstandenen Transformanten durch Restriktion mit Sall entsteht.
Die Aut3_ko-Sonde bindet spezifisch an das 1962 bp große Fragment, das ebenfalls beim Wildtyp 70-15 und bei den durch heterologe Rekombination von zdAUT3 entstandenen Transformanten vorhanden ist. Bei durch homologe Rekombination entstandenen Transformanten ist dieses Fragment nicht mehr vorhanden.
Die Restriktion des Vektors pAUT302 mit Sall ergibt vier Fragmente (6119 kb, 1424 kb, 1046 kb und 898 kb). Zwei dieser Fragmente (1424 kb und 1046 kb) sind durch die Aut3_halbhyg-Sonde nachweisbar.
B) Charakterisierung des Phänotyps und Untersuchung der Pathogenität der Mutanten
Bestimmung der Sporenbildungsrate der Mutanten Um die Sporenbildung der Mutanten mit der des Wildtyps vergleichen zu können, wurden je Pilz die Sporen von 20 Komplettmedium-Platten, die 10 Tage zuvor inokuliert worden waren, abgeschwemmt und in einem definierten Volumen H2Odeion aufgenommen. Anschließend wurde die Konzentration bestimmt und die pro Platte gebildete Sporenanzahl bestimmt .
Es zeigte sich, dass die Sporenbildungsrate der _ aut3-Mutante im Vergleich zum
Wildtyp 70-15 um mehr als eine Zehnerpotenz reduziert.
Pathogenitätstests
Um zu zeigen, ob die _laut3-Mutanten in der Lage waren, erfolgreich ihre Wirtspflanzen zu infizieren wurden Blattsegmenttests mit Gerste, sowie Infektionstests mit ganzen Reispflanzen durchgeführt.
A) Blattsegmenttest mit Gerste und Reis
Hierzu wurden Tropfen einer auf 1 x 105 Konidien/ml eingestellten Sporensuspension der einzelnen Isolate auf abgeschnittene Gersteblätter aufgebracht und drei Tage lang in einem Brutschrank inkubiert. Die Symptomausbildung wurde makroskopisch und mikroskopisch verfolgt und dokumentiert.
B) Pflanzentest auf Reis (Oryza sativa)
Nach den ersten Tests auf Gerste-Blattsegmenten werden weiterführende in vivo Tests auf Reispflanzen durchgeführt.
Hierzu inkubiert man Reis-Saatgut bis zur Keimung der Samen in einer Feuchtkammer (siehe 1.4.3.1) und pflanzt anschließend 20 vorgekeimte Samen pro Topf. 14 -21 Tage alte Reispflanzen werden pro Topf mit je 5 ml einer Sporensuspension (1 x 105 Konidien/ml von M. grisea 70 - 15 sowie der verschiedenen Mutanten) in 2 %iger Gelatine-Lösung (L4) mittels Airbrush-Pistole (Airbrush-Set, Revell) inokuliert. Inkubation der Pflanzen erfolgt anschließend in verschlossenen durchsichtigen Plastikbeuteln für 48 Stunden bei 28°C und 80% Luftfeuchte inkubiert. Danach werden die Pflanzen aus den Beuteln genommen, gegossen, zur Vergrößerung vorhandener Läsionen mit Wasser besprüht und weitere 48 Stunden unter gleichen Bedingungen inkubiert. Die Auswertung erfolgt nach insgesamt 96 Stunden, bewertet werden 10 befallene Blätter, auf ihre Läsionendichte. Die Ergebnisse werden mit der Digitalkamera C-2500L (Olympus, Camedia) dokumentiert und die Blätter anschließend wie unter 1.4.3.2 beschrieben zur Färbung intrazellulärer Hyphen behandelt und fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet.
Die Δaut3-Mutanten waren nicht mehr in der Lage Gerste und Reis zu infizieren.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Polypeptides mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz umfassend a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz; oder b) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt; oder c) eine Nukleinsäuresequenz, welche eine Identität mit der SEQ ID NO:1 von mindestens 46% aufweist, ableiten lässt; als Target für Fungizide.
2. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit fungizider Wirkung, worin ein Polypeptid mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr- Kinase verwendet wird kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz umfassend a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz; oder b) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt; oder c) eine Nukleinsäuresequenz, welche eine Identität mit der SEQ ID NO:1 von mindestens 46% aufweist, ableiten lässt.
3. Verfahren nach Anspruch 2 umfassend i. Inkontaktbringen eines Polypeptides mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase mit einer oder mehreren Testsubstanzen unter Bedingungen, welche die Bindung der Testsubstanz(en) an das Nukleinsäuremolekül oder das Polypeptid, das durch das vorstehend genannte Nukleinsäuremolekül kodiert wird, erlauben; und ii. Nachweis, ob die Testverbindung an das Polypeptid aus i) bindet. iii. Nachweis, ob die Testverbindung die Aktivität des Polypeptids aus i) reduziert oder blockiert; oder iv. Nachweis, ob die Testverbindung die Transkription, Translation oder Expression der Nukleinsäure aus i) reduziert oder blockiert.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3 zur Identifizierung von Substanzen mit fungizider Wirkung in einem Hemmtest, worin ein Polypeptid mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass i. entweder das Polypeptid mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase in einem transgenen Organismus exprimiert wird oder ein Organismus, der naturgemäß eine an der Autophagozytose beteilitgte Ser/Thr-Kinase enthält, kultiviert wird; ii. das Polypeptid aus Schritt i) im Zellaufschluss des transgenen bzw. nicht transgenen Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird; und iii. eine Verbindung selektiert wird, welche die Aktivität des Polypeptides aus ii) reduziert oder blockiert.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität des Polypeptides mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr- Kinase dadurch bestimmt wird, dass man a) das Polypeptid mit einem geeigneten Cofaktor und Substrat versetzt; und b) die Aktivität über die Menge an radioaktiv markiertem Substrat bestimmt; oder
c) die Aktivität über Kopplung der durch das Polypeptid mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase katalysierten Reaktion mit der durch die Pyruvat Kinase und Lactat Dehydrogenase katalysierten Oxidation von NADH bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Schritte umfasst:
i. Kultivierung eines transgenen Organismus enthaltend eine Nukleinsäuresequenz umfassend a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz; oder b) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt; oder c) eine Nukleinsäuresequenz, welche eine Identität mit der SEQ ID NO:1 von mindestens 46% aufweist, ableiten lässt;; wobei in dem transgenen Organismus das Polypeptid mit der Aktivität einer an der Autophagozytose beteiligten Ser/Thr-Kinase überexprimiert wird;
ii. das Aufbringen einer Testsubstanz auf den transgenen Organismus nach Anspruch a) und auf einen nicht-transgenen Organismus der gleichen Art;
iii. das Bestimmen der Infektiosität des transgenen und des nicht transgenen Organismus nach der Aufbringung der Testsubstanz; und
iv. der Selektion von Testsubstanzen, die eine verminderte Infektiosität des nicht-transgenen Organismus bewirken verglichen mit der Infektiosität des transgenen Organmismus bewirken.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einem Pilz durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die über das Verfahren identifizierte besagte chemische Verbindung zur Verifizierung der fungiziden Wirkung auf einen phytopathogenen Pilz appliziert wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der Substanzen in einem High-Throughput-Screening durchgeführt wird.
11. Verbindungen mit fungizider Wirkung identifiziert über eins der Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 10.
12. Verfahren zur Herstellung einer fungiziden Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet dass man einen fungiziden Wirkstoff identifizierbar über eines der Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 10 mit für die Formulierung von Fungiziden geeigneten Hilfsmitteln formuliert.
13. Verfahren zur Bekämpfung von Schadpilzen, dadurch geken nzeichnet, dass man die Pilze oder die vor Pilzbefall zu schützenden Materialien, Pflanzen, Boden oder Saatgüter mit einer wirksamen Menge einer Verbindung nach Anspruch 11 oder einer Zusammensetzung herstellbar nach einem Verfahren gemäß Anspruch 12 behandelt.
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