WO2005040394A1 - Procede de fabrication de compose comprenant un groupement hydroxyle libre et un groupement hydroxyle protégé par une fonction ester par reaction enzymatique - Google Patents

Procede de fabrication de compose comprenant un groupement hydroxyle libre et un groupement hydroxyle protégé par une fonction ester par reaction enzymatique Download PDF

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WO2005040394A1
WO2005040394A1 PCT/FR2004/002665 FR2004002665W WO2005040394A1 WO 2005040394 A1 WO2005040394 A1 WO 2005040394A1 FR 2004002665 W FR2004002665 W FR 2004002665W WO 2005040394 A1 WO2005040394 A1 WO 2005040394A1
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compound
formula
lipase
group
chosen
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Application number
PCT/FR2004/002665
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English (en)
Inventor
Laurent Garel
Mirjana Gelo-Pujic
Thierry Schlama
Original Assignee
Rhodia Chimie
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Definitions

  • the present invention relates to a process for the manufacture of a compound comprising a free hydroxyl group and a hydroxyl group protected by an ester function by enzymatic reaction using a lipase of class EC 3.1.1.3.
  • the present invention also relates to the use of this compound as an intermediate for the manufacture of medicaments and pharmaceutical products.
  • Chiral synthons comprising a free hydroxyl group and a hydroxyl group protected by an ester function are particularly advantageous for the asymmetric synthesis of pharmaceutical products.
  • chiral synthons of the 1-acetoxy-4-hydroxycyclopent-1-ene type are particularly used as a precursor of prostaglandins, des. prostacyclins and thromboxanes.
  • pancreatin an enzyme from pig pancreas, catalyzes the monoacetylation reaction of 1,4-dihydroxycyclopent-2-ene to produce enantiomerically pure monoacetate S compounds.
  • the present invention relates to a new process for manufacturing chiral synthons comprising a free hydroxyl group and a hydroxyl group protected by an ester function, using a lipase originating from Gram-negative bacteria Alcaligenes spp.
  • the manufacturing process consists of an enzymatic transesterification of a diol compound with a lipase and an acylating agent, for example, as follows:
  • lipase thus makes it possible to obtain a transesterification reaction of the compound (I) with performances superior to those obtained with an enzyme of animal origin, with significantly lower amounts. From the compound of formula (II) of the invention it is possible to manufacture medicaments and pharmaceutical products using this compound as an intermediate.
  • the present invention firstly relates to a process for the manufacture of a compound of formula (II):
  • R is a covalent bond or a hydrocarbon chain comprising from 1 to 10 carbon atoms; preferably from 1 to 5 carbon atoms;
  • R 1 is a hydrocarbon group comprising from 1 to 10 carbon atoms; preferably from 1 to 6 carbon atoms;
  • R 2 corresponds to a hydrogen atom;
  • n is an integer between 0 and 2, ie 0, 1 or 2;
  • X is an atom chosen from the group comprising: carbon, nitrogen, oxygen, and sulfur, preferably carbon; comprising at least the following steps: a) reacting at least one compound of formula (I):
  • the present invention also relates to a compound of formula (II) capable of being obtained by the process as described above.
  • the a subject of the present invention is also a composition capable of being obtained by the process as described above.
  • the lipases used according to the invention are lipases of class EC 3.1.1.3 of the genus (genus) Alcaligenes spp.
  • the genus Alcaiigenes spp, of the family Alcaligenacae includes several species, such as: , Alcaligenes ruhlandii, Alcaligenes venustus, Alcaligenes xylosoxidans.
  • Different lipases according to the invention can be used according to the method of the invention.
  • the lipases of the invention can be obtained from a culture of Alcaligenes spp.
  • the culture conditions can vary depending on the type of strain used. It is recommended to choose these conditions in order to produce the lipases in the most advantageous way possible.
  • the culture temperature is generally between 5 and 50 ° C.
  • the culture period is generally between 1 and 10 days.
  • the recovery of lipases from Alcaligenes spp can be carried out in various ways well known to those skilled in the art. It is for example possible to carry out a separation of the bacteria and the culture medium, in particular by centrifugation or filtration, and then to carry out a purification of the lipases. For example, the purification of lipases can be carried out by precipitation, lyophilization, ion exchange chromatography, immunoaffinity using specific mono- or polyclonal antibodies, and / or dialysis. It is also possible to collect the lipases of Alcaligenes spp by destruction of the bacteria, for example by sonication and recovery of the ground material, or by an enzymatic lysis of the cell walls.
  • the lipases of the invention can in particular be purified from the strains of Alcaligenes spp by adding salts, using for example ammonium sulphate, passage through an ion exchange chromatography and then gel filtration. It is understood that natural, synthetic, mutated, chimeric and / or recombinant lipases originating from Alcaligenes spp can be used in the process according to the invention, to the extent or their transesterification activity with respect to the substrates of the invention is preserved, see improved. Thus, mutated lipases of Alcaligenes spp expressed by other microorganisms or produced by chemical synthesis are also concerned by the present invention.
  • the alkaligenes spp lipases used according to the invention make it possible to obtain the following parameters: - Enantiomeric excess in compound (II) greater than or equal to 50%, preferably greater than or equal to 70%, particularly greater than or equal to 90 %; especially equal to 100%.
  • the lipases used according to the method of the invention have an amino acid sequence having a percentage of homology greater than or equal to 80%, in particular 90%, preferably 95, more preferably 100% with the acid sequence of the QL lipase of Alcaligenes sp PL-266, registered under the number FERM-P No. 3187, the protein having a transesterification activity on the substrates of the invention.
  • the lipases used according to the invention can come from nucleotide sequences having a percentage of homology greater than or equal to 80%, in particular 90%, preferably 95, more preferably 100% with the nucleotide sequence of the QL lipase gene.
  • Alcaligenes sp PL-266 registered under the number FERM-P No. 3187, the lipase obtained having transesterification activity on the substrates of the invention.
  • homology refers to the perfect resemblance or identity between the amino acids compared but also to the non-perfect resemblance which is called similarity.
  • the amino acid sequence may differ from the reference sequence by substitution, deletion and / or insertion of one or more amino acids, preferably by a reduced number of amino acids, in particular by substitution of natural amino acids by unnatural amino acids or pseudo-amino acids, at positions such that these modifications do not significantly affect the biological activity of the protein.
  • Homology is generally determined using sequence analysis software (e.g.
  • amino acid sequences of natural, synthetic, mutated, chimeric and / or recombinant lipases can be the same length as the reference sequences.
  • the lipases of class EC 3.1.1.3 can come from bacteria of the genus of Alcaligenes spp. However, for example in the context of an industrial process for manufacturing these lipases, it is possible that they are produced by host cells or by chemical processes.
  • the nucleotide sequences leading to the synthesis of natural, synthetic, mutated, chimeric and / or recombinant lipases can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or integrative vectors.
  • Such vectors will be prepared according to methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as for example electroporation or transformation with calcium chloride, polyethylene.
  • the signals controlling the expression, or the overexpression, of the nucleotide sequences are chosen according to the cell host used.
  • Host cells can be transiently or stably transfected with these expression vectors. These cells can be obtained by introduction into host, prokaryotic or eukaryotic cells. Examples of host cells include in particular mammalian cells, such as cells 293, CMV (cytomegalovirus cell), insect cells such as cells derived from ovary of Spodoptera frugiperda or embryonic cells of Drosophila melanogaster, bacteria such as E. coli, B. subtilis and yeast strains such as Saccharomyces cerevisiae.
  • mammalian cells such as cells 293, CMV (cytomegalovirus cell)
  • insect cells such as cells derived from ovary of Spodoptera frugiperda or embryonic cells of Drosophila melanogaster
  • bacteria such as E. coli, B. subtilis and yeast strains such as Saccharomyces cerevisia
  • the lipases of the invention can also be produced by chemical synthesis.
  • chemical synthesis For this purpose, one can use any method well known to those skilled in the art.
  • the peptide of the invention can for example be synthesized by the techniques of synthetic chemistry, such as Merrifield type synthesis which is advantageous for reasons of purity, antigenic specificity, absence of unwanted secondary products and for its ease of production.
  • Chemical synthesis makes it possible in particular to produce nucleotide or amino acid sequences, optionally comprising substitutions, deletions and / or insertions with respect to a reference sequence.
  • one or more expression cassettes containing the nucleotide sequence expressing the lipases of the invention may be inserted into the genome of the microorganism, under the dependence of one or more elements allowing its expression or the regulation of its expression, such as in particular promoters, activators and / or transcription terminators.
  • the QL lipase from Alcaligenes sp PL-266 registered under the number FERM-P N ° 3187 (also called QLM) mentioned for example in patent JP 58-36953, or the lipase PL of Alcaligenes sp PL-679, registered under the number FERM-P N ° 3783, but also ATCC 31371 and DSM 1239, mentioned for example in patent JP 60-15312.
  • the lipase can be immobilized on a suitable solid support or not immobilized.
  • the solid support can be chosen from the group comprising: DEAE cellulose, DEAE sepharose, diatom, silica, alumina, polypropylene, ceramic particles and / or mixtures thereof.
  • lipases of class EC 3.1.1.3 of Alcaligenes spp it is possible in particular to use Chirazyme TM L-10 sold by the company Roche or the lipases QL (or QLM), QLC, QLG, PL, PLC and PLG sold by the Meito-Sangyo company.
  • the PLC and PLG lipases correspond respectively to the PL lipase immobilized on diatoms and on diatomaceous earth granules.
  • the QLC and QLG lipases correspond respectively to the QL lipase immobilized on diatomaceous earth and on diatomaceous earth granules.
  • Many substrates of formula (I) can be monoacylated according to the process of the present invention.
  • the group R may be a covaited bond or a hydrocarbon chain comprising from 1 to 10 carbon atoms, preferably from 1 to 5 carbon atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, aliphatic, cyclic and / or aromatic, which may comprise and / or form one or more cycles, possibly aromatic.
  • This hydrocarbon chain can optionally comprise one or more heteroatoms chosen from the group comprising carbon, nitrogen, phosphorus, oxygen, silicon and sulfur. If R is a co perennial bond, the compound of formula (1) will be a compound derived from cyclopropane.
  • R is a hydrocarbon chain comprising at least one unsaturation.
  • R can be a hydrocarbon chain comprising one or more aromatic or non-aromatic cycle (s).
  • the compound of formula (I) is cis-4-cyclopentene-1,3-diol, the group R corresponds to an unsaturated hydrocarbon chain comprising 2 carbon atoms.
  • the compound of formula (I) is chosen from the group comprising chosen from the group comprising the compounds of formula (V), (VI) and / or (VII):
  • the preferred substrate according to the invention is cis-4-cyclopentene-1,3-diol.
  • the compound of formula (II) obtained from this substrate according to the process of the invention is (1R, 4S) -4-acetoxy-cyclopent-2-en-1-ol.
  • the isolated lipase can be used in aqueous solution, optionally buffered, in organic solvents, in mono-phasic or bi-phasic solution.
  • the solvent is by definition capable of dissolving, at least partially, the substrate, such as the compound of formula (I). Particularly preferred is an organic solvent miscible with water.
  • the organic solvent can be an aliphatic, cyclic or aromatic hydrocarbon compound, optionally comprising chlorine, nitrogen, acid, ketone, nitrile aldehyde and / or ester functions.
  • the organic solvent is preferably chosen from the group comprising: ketones such as acetone, methyl ethyl ketone, cyclohexanone, cyclopentanone, and methyl isobutyl ketone (MIBK); ethers such as methyl tert-butyl ether (MTBE) and tetrahydrofuran (THF); nitriles such as acetonitrile; and aromatic compounds such as toluene.
  • the solvent is compatible with the lipase of the invention, that is to say that it does not degrade the protein and / or that it does not decrease its biological activity with respect to the process of the invention in addition.
  • the reaction medium in particular that of step a), can comprise water, for example 0.1 and 30% by weight of water relative to the weight of the compound of formula (I) , preferably from 5 to 20% by weight of water, in particular from 5 to 30% by weight of water.
  • acylating agent is intended to mean a compound capable of reacting with a hydroxyl function of the compound (I) so as to protect the latter via an ester function.
  • the acylating agent can in particular be an ester, an anhydrous or a carbonate.
  • the acylating agent can be a compound of formula (VIII): R 1 -COO-R 3 (VIII) in which: - R 1 is defined above; and R 3 is a hydrocarbon group comprising from 1 to 10 carbon atoms, optionally linear, cyclic, aromatic, branched, saturated and / or unsaturated; and optionally comprising one or more heteroatoms, such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or chlorine.
  • R 3 is preferably an alkyl group comprising from 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted by one or more fluorine atoms, or an alkenyl group comprising from 2 to 6 carbon atoms.
  • R 1 can be a hydrocarbon group comprising from 1 to 10 carbon atoms; preferably from 1 to 6 carbon atoms; optionally linear, cyclic, aromatic and / or branched and optionally comprising one or more heteroatoms, such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or chlorine.
  • R 1 can be chosen from the group comprising methyl, ethyl, propyl, phenyl and isopropyl.
  • This acylating agent can be chosen from the group comprising: acetates, benzoates and isobutyrates.
  • the acylating agent is preferably chosen from the group comprising: vinyl acetate, ethyl acetate, isopropyl acetate, 2,2,2-trifluoroethyl acetate, and acetate isopropenyl.
  • the acylating agent can also be used as an organic solvent. According to the process of the invention, the proportion of acylating agent is preferably greater than 1 mole equivalent relative to the compound of formula
  • (I) preferably between 2 and 6 moles equivalent, more preferably between 1 and 10 moles equivalent.
  • the reaction medium can be obtained by mixing the compound of formula (I), and optionally the acylating agent with the solvent, and then adding the lipase of the invention.
  • the reaction medium can also be obtained by successive addition of the following products: compound of formula (I), lipase, solvent and finally addition of the acylating agent.
  • the proportion of lipase can be between 0.1 to 30% by weight relative to the weight of the compound of formula (I), preferably from 0.1 to 20% by weight, particularly from 0 , 5 to 10% by weight.
  • the enzymatic catalysis reaction of step a) is preferably carried out at a temperature between -5 and 40 ° C, preferably between 1 and 15 ° C.
  • a temperature between -5 and 40 ° C, preferably between 1 and 15 ° C.
  • a person skilled in the art is perfectly capable of easily determining the optimal duration conditions for a given substrate. This can be achieved by taking regular samples of the reaction medium on which the evolution of the enantiomeric excess and the conversion rate are evaluated.
  • the duration of the enzymatic reaction of step a) is generally between 1 and 24 hours, preferably between 4 and 16 hours.
  • the enzymatic reaction is carried out in a suitable reactor possibly provided with suitable stirring means or mixtures.
  • the enzymatic reaction can in particular be stopped by any suitable chemical means, such as by adding a solvent, adding base or acid, detergents, and / or salts; or suitable physical means, such as for example by freezing, centrifugation, heating, and / or filtration.
  • suitable chemical means such as by adding a solvent, adding base or acid, detergents, and / or salts
  • suitable physical means such as for example by freezing, centrifugation, heating, and / or filtration.
  • the compound of formula (II) can be isolated in different ways known to a person skilled in the art, such as for example by purification by filtration, extraction, distillation, crystallization, column chromatography, and / or centrifugation. In particular, filtration can be carried out at the end of the reaction, followed by one or more distillations and crystallization before filtration.
  • the present invention also relates to the use of a compound of formula (II) obtained by a manufacturing process as defined above, as an intermediate, for the manufacture of a medicament or of a product.
  • pharmaceutical such as prostaglandins, prostacyclins and / or thromboxanes.
  • From the compound of formula (II) of the invention it is possible to manufacture medicaments and pharmaceutical products using this compound as an intermediate.
  • (1 R, 4S) -4- acetoxy-cyclopent-2-en-1-ol, corresponding to a compound of formula (II) is used for the synthesis of pharmaceutical products, as mentioned in patent WO9526729 and the following publications: J. Stjenschantz et al.
  • Example 1 Materials used: Lipase d'Alcaligenes sp. : GLG, QLC or QL sold by the company Meito-Sangyo; or Chirazyme L10 TM sold by the company Roche (hereinafter called L10); Pancreatin Lipase: Pancreatin from pigs marketed by the company Sigma; Diol substrate: cis-4-cyclopentene-1, 3-diol sold by the company Fluka (compound of formula (I)).
  • a sample of 0.5 ml of medium is taken reaction which is centrifuged. 200 ⁇ L are taken and diluted in 800 ⁇ L of acetone before injection by chiral gas chromatography. The rest of the reaction medium is filtered so as to separate the lipase; the cake is washed with approx. 3 g of acetone. The filtrate to which about 8 g of TMBE (tert-butyl methyl ether) was added is then distilled in vacuo so as to remove acetone and vinyl acetate. About 15 g of TMBE and activated carbon are added at the end of this first devolatilization. The reaction medium is stirred and filtered on clarsel. The filtrate is devolatilized.
  • TMBE tert-butyl methyl ether
  • Heptane is then added to crystallize the desired product and the temperature is reduced from 28 to 8 ° C. The start of crystallization is observed around 16 ° C.
  • the desired compound is then filtered, which is in the form of white crystals.
  • the crystals comprising the monoacetate R (compound III) and the monoacetate S (compound II) are dried under 50 mbar at room temperature for 18 hours.
  • Gas chromatography (GC) is carried out using a Cyclodex B column composed of permethylated beta-cyclodextrin deposited in a silicone oil consisting of 86% of dimethylsiloxane units and 14% of methyl-cyanopropylsiloxane units.
  • the column has a length of 30 m, an internal diameter of 250 ⁇ m and a thickness of silicone oil film of 0.25 ⁇ m.
  • the diol (compound (I)) is eluted with a relative retention time of 1.00, the monoacetate R (compound (III)) of 1.10, the monoacetate S (compound (II)) of 1.13 and the diacetate compound (IV)) of 1.38.
  • the conversion or conversion rate of the compound (I) (%) is calculated as follows: (surface percentage of the compound (I) at time 0 (start of the reaction) - the surface percentage of the compound (I) at the end of reaction) / area percentage of compound (I) at time 0.
  • the enantiomeric excess of compound (II) (%) is calculated as follows: (absolute value of (area area of compound (II) - area area of compound (III))) / (area percentage of compound (II) + area percentage of compound (III)).
  • the selectivity is calculated as follows: It corresponds to (area percentage of the compounds (II) + (III)) / (area percentage of the compound (IV)).
  • the yield of compound (II) (%) is calculated as follows: (surface area of compound (II)) / (area area of compound (I) at time 0).

Abstract

La présente invention concerne un procédé de fabrication d’un composé comprenant un groupement hydroxyle libre et un groupement hydroxyle protégé par une fonction ester par réaction enzymatique en utilisant une lipase de la classe EC 3.1.1.3. La présente invention concerne également l’utilisation de ce composé comme intermédiaire pour la fabrication de médicaments et de produits pharmaceutiques.

Description

Procédé de fabrication de composé comprenant un groupement hydroxyle libre et un groupement hydroxyle protégé par une fonction ester par réaction enzymatique
La présente invention concerne un procédé de fabrication d'un composé comprenant un groupement hydroxyle libre et un groupement hydroxyle protégé par une fonction ester par réaction enzymatique en utilisant une lipase de la classe EC 3.1.1.3. La présente invention concerne également l'utilisation de ce composé comme intermédiaire pour la fabrication de médicaments et de produits pharmaceutiques.
Les synthons chiraux comprenant un groupement hydroxyle libre et un groupement hydroxyle protégé par une fonction ester sont particulièrement intéressants pour la synthèse asymétrique de produits pharmaceutiques. Ainsi, les synthons chiraux du type 1-acétoxy-4-hydroxycyclopent-1-ène sont particulièrement utilisés comme précurseur des prostaglandines, des. prostacyclines et des thromboxanes. Il existe notamment dans l'art antérieur plusieurs procédés développés pour la préparation de composés monoacétate S et/ou R énantiomeriquement purs par catalyse enzymatique de la réaction de monoacylation par des enzymes d'origine animale principalement. Par exemple, la pancréatine, une enzyme provenant de pancréas du porc, catalyse la réaction de monoacétylation du 1,4- dihydroxycyclopent-2-ène pour la fabrication de composés monoacétate S énantiomeriquement purs.
Toutefois, les autorités nationales réglementaires souhaitent à terme éliminer l'utilisation de produits d'origine animale pour la fabrication de médicaments et des produits pharmaceutiques, pour des raisons de sécurités médicales. Il existe donc un besoin de développer des procédés de fabrication d'intermédiaires chiraux pharmaceutiques en utilisant des enzymes qui ne sont pas d'origine animale. Par ailleurs, il existe également un besoin de mettre en évidence des enzymes efficaces, notamment à de faibles quantités, permettant d'obtenir une bonne sélectivité des synthons chiraux souhaités. Il existe dans l'art antérieur des procédés de fabrication de synthons chiraux énantiomeriquement purs utilisant des enzymes d'origines végétales ou microbiennes. Toutefois, la plupart de ces procédés décrits sont difficilement transposables à l'échelle industrielle. Il est dont très intéressant de disposer d'un procédé industriel permettant d'accéder aux synthons chiraux énantiomeriquement purs souhaités. La présente invention concerne un nouveau procédé de fabrication de synthons chiraux comprenant un groupement hydroxyle libre et un groupement hydroxyle protégé par une fonction ester, en utilisant une lipase provenant des bactéries Gram-négatif Alcaligenes spp. Le procédé de fabrication consiste en une transestérification enzymatique d'un composé diol par une lipase et un agent d'acylation, par exemple, de la manière suivante :
Figure imgf000003_0001
(D d")
Figure imgf000003_0002
L'utilisation de la lipase permet ainsi d'obtenir une réaction de transestérification du composé (I) avec des performances supérieures à celles obtenues avec une enzyme d'origine animale, avec des quantités nettement plus faibles. A partir du composé de formule (II) de l'invention il est possible de fabriquer des médicaments et produits pharmaceutiques en utilisant ce composé comme intermédiaire.
La présente invention à pour premier objet un procédé pour la fabrication d'un composé de formule (II) :
Figure imgf000004_0001
dans lequel : R est une liaison covalente ou une chaîne hydrocarbonée comprenant de 1 à 10 atomes de carbone ; préférentiellement de 1 à 5 atomes de carbone ; R1 est un groupe hydrocarboné comprenant de 1 à 10 atomes de carbone ; préférentiellement de 1 à 6 atomes de carbone ; R2 correspond à un atome d'hydrogène ; n est un nombre entier compris entre 0 et 2, c'est à a dire 0, 1 ou 2 ; X est un atome choisi dans le groupe comprenant : le carbone, l'azote, l'oxygène, et le soufre, préférentiellement le carbone ; comprenant au moins les étapes suivantes : a) on fait réagir au moins un composé de formule (I) :
Figure imgf000004_0002
avec un agent d'acylation dans un solvant organique en présence d'une lipase de la classe EC 3.1.1.3 du genre (genus) Alcaligenes spp, de façon à former le composé de formule (II) ; b) on isole le composé de formule (II).
La présente invention a également pour objet un composé de formule (II) susceptible d'être obtenu par le procédé tel que décrit précédemment. La présente invention a aussi pour objet une composition susceptible d'être obtenue par le procédé tel que décrit précédemment.
Les lipases utilisées selon l'invention sont des lipases de la classe EC 3.1.1.3 du genre (genus) Alcaligenes spp. Le genre Alcaiigenes spp, de la famille Alcaligenacae comprend plusieurs espèces, telles que par exemple : Alcaligenes aestus, Alcaligenes aquamarinus, Alcaligenes cupidus, Alcaligenes defragrans, Alcaligenes denitrificans, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes faecaiis, Alcaligenes latus, Alcaligenes pacificus, Alcaligenes paradoxus, Alcaligenes piechaudii, Alcaligenes ruhlandii, Alcaligenes venustus, Alcaligenes xylosoxidans. On peut utiliser selon le procédé de l'invention différentes lipases conformes à l'invention.
Les lipases de l'invention peuvent être obtenues à partir de culture d'Alcaligenes spp. Les conditions de culture peuvent varier en fonction du type de souche utilisées. Il est recommandé de choisir ces conditions de façon à produire les lipases de la manière la plus avantageuse possible. La température de culture est généralement comprise entre 5 et 50°C. La période de culture est généralement comprise entre 1 et 10 jours.
La récupération des lipases d'Alcaligenes spp peut être réalisée de différentes manières bien connues de l'homme du métier. Il est par exemple possible de procéder à une séparation des bactéries et du milieu de culture, notamment par centrifugation ou filtration, et ensuite procéder à une purification des lipases. Par exemple, la purification des lipases peut être réalisée par précipitation, lyophilisation, chromatographie échangeuse d'ions, immuno-affinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, et/ou dialyse. On peut également recueillir les lipases d'Alcaligenes spp par destruction des bactéries, par exemple par sonication et récupération du broyât, ou par une lyse enzymatique des parois cellulaires. Les lipases de l'invention peuvent notamment être purifiées à partir des souches d'Alcaligenes spp par ajout de sels, en utilisant par exemple du sulfate d'ammonium, passage dans une chromatographie échangeuse d'ions et ensuite filtration sur gel. Il est bien entendu que des lipases naturelles, synthétiques mutées, chimériques et/ou recombinantes provenant d'Alcaligenes spp peuvent être utilisées dans le procédé selon l'invention, dans la mesure ou leur activité de transestérification vis à vis des substrats de l'invention est conservée, voir améliorée. Ainsi, des lipases mutées d'Alcaligenes spp exprimées par d'autres micro-organismes ou produites par synthèse chimique sont également concernées par la présente invention.
Préférentiellement, les lipases d'Alcaligenes spp utilisées selon l'invention permettent d'obtenir les paramètres suivants : - Excès énantiomérique en composé (II) supérieur ou égal à 50 %, préférentiellement supérieur ou égal à 70 %, particulièrement supérieur ou égal à 90 % ; tout particulièrement égal à 100 %. Sélectivité en composés (II) et (III) supérieure ou égale à 2, préférentiellement supérieure ou égale à 2,5, particulièrement supérieure ou égale à 3,3 ; Rendement en composé (II) supérieur ou égal à 40 %, préférentiellement supérieur ou égal à 50 % ; particulièrement supérieure ou égale à 75 % ; et Taux de transformation ou conversion du composé (I) supérieur ou égal à 70 %, préférentiellement supérieur ou égal à 90 %, particulièrement supérieur ou égal à 95 %.
Pour déterminer ces paramètres, on peut procéder au test suivant : dans un réacteur de 100 mL, on introduit sous agitation 4,21 g (0,0421 mol) de 1 ,3- dihydroxycyclopent-2-ène (correspondant au composé (I)), ci-après appelé diol, dans 30 mL d'acétone (23,7 g) à température ambiante (24-25 °C). Après solubilisation du 1 ,3-dihydroxycyclopent-2-ène dans l'acétone, on ajoute 18,08 g (0,215 mol; 5 équivalents molaires par rapport au diol) d'acétate de vinyle, puis 420 μL (10 % en poids par rapport au diol) d'eau déminéralisée. La température du milieu est alors fixée à 5°C. On ajoute 5 % en poids d'enzyme lipase de la classe EC 3.1.1.3 d'Alcaligenes spp par rapport au diol. Au bout de 12 heures, on effectue un prélèvement de 0,5 mL de milieu reactionnel que l'on centrifuge. 200 μL sont prélevés et dilués dans 800 μL d'acétone avant injection en chromatographie en phase gazeuse chirale. On mesure ensuite les caractéristiques mentionnées précédemment comme expliqué dans la partie expérimentale.
Ce test permet à l'homme du métier de déterminer les lipases de la classe EC 3.1.1.3, provenant du genre Alcaligenes spp et/ou leurs fragments qui ont une activité conforme à l'invention.
Préférentiellement, les lipases utilisées selon le procédé de l'invention présentent une séquence d'acides aminés ayant un pourcentage d'homologie supérieur ou égal à 80 %, notamment 90 %, de préférence 95, plus préférentiellement 100 % avec la séquence d'acides aminés de la lipase QL d'Alcaligenes sp PL-266, enregistrées sous le numéro FERM-P N°3187, la protéine ayant une activité de transestérification sur les substrats de l'invention. Les lipases utilisées selon le l'invention peuvent provenir de séquences nucléotidiques présentant un pourcentage d'homologie supérieur ou égal à 80 %, notamment 90 %, de préférence 95, plus préférentiellement 100 % avec la séquence nucléotidique du gêne de la lipase QL d'Alcaligenes sp PL-266, enregistrées sous le numéro FERM-P N°3187, la lipase obtenue ayant une activité de transestérification sur les substrats de l'invention. Il est entendu que le terme homologie se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les acides aminés comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Les séquence d'acides aminés peuvent différer de la séquence de référence par substitution, délétion et/ou insertion d'un ou de plusieurs acides aminés, de préférence d'un nombre réduit d'acides aminés, notamment par substitution d'acides aminés naturels par des acides aminés non naturels ou pseudo-acides aminés, à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité biologique de la protéine. L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Séquence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705 ; ou BLAST software du National Center for Biotechnology Information, US National Library of Médecine, 8600 Rockville Pike Bethesda, MD 20894).
Les séquences d'acides aminés des lipases naturelles, synthétiques mutées, chimériques et/ou recombinantes peuvent être de la même longueur que les séquences de référence.
Il en entendu selon l'invention que les lipases de la classe EC 3.1.1.3 peuvent provenir des bactéries du genre d'Alcaligenes spp. Toutefois, par exemple dans le cadre de procédé industriel de fabrication de ces lipases, il est possible que celles-ci soient produite par des cellules hôtes ou par des processus chimiques. Les séquences nucléotidiques conduisant à la synthèse des lipases naturelles, synthétiques mutées, chimériques et/ou recombinantes peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la transformation au chloride de calcium, polyéthylène glycol ou la fusion de protoplastes. Les signaux contrôlant l'expression, ou la sur-expession, des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Les cellules hôtes peuvent être transfectees de manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes. Des exemples de cellules hôtes incluent notamment des cellules de mammifères, telles que les cellules 293, CMV (cellule de cytomegalovirus), des cellules d'insectes telles que les cellules dérivées d'ovaire de Spodoptera frugiperda ou cellules d'embryons de Drosophila melanogaster, des bactéries telles que E. coli, B. subtilis et des souches de levures telles que Saccharomyces cerevisiae. Les lipases de l'invention peuvent également être produites par synthèse chimique. A cet effet, on peut recourir à n'importe quelle méthode bien connue de l'homme du métier. Le peptide de l'invention peut par exemple être synthétisé par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production. La synthèse chimique permet notamment de produire des séquences nucléotidiques ou d'acides aminés, comportant éventuellement des substitutions, délétions et/ou insertions par rapport à une séquence de référence.
On peut encore utiliser directement dans le procédé, des cellules entières d'Alcaligenes spp, éventuellement recombinées de manière à sur-exprimer les lipases à un niveau satisfaisant. A cet effet, on peut insérer dans le génome du micro-organisme une ou plusieurs cassettes d'expression contenant la séquence nucleotidique exprimant les lipases de l'invention, sous la dépendance d'un ou des élément(s) permettant son expression ou la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminateurs de transcription. A titre d'exemple, on peut notamment utiliser la lipase QL d'Alcaligenes sp PL- 266, enregistrée sous le numéro FERM-P N°3187 (également appelé QLM) mentionnée par exemple dans le brevet JP 58-36953, ou la lipase PL d'Alcaligenes sp PL-679, enregistrée sous le numéro FERM-P N°3783, mais, également ATCC 31371 et DSM 1239, mentionnée par exemple dans le brevet JP 60-15312. La lipase peut être immobilisée sur un support solide approprié ou non immobilisée. Le support solide peut être choisi dans le groupe comprenant : le DEAE cellulose, le DEAE sepharose, la diatomée, la silice, l'alumine, le polypropylène, les particules céramiques et/ou leurs mélanges. Comme lipases de la classe EC 3.1.1.3 d'Alcaligenes spp, on peut notamment utiliser la Chirazyme™ L-10 commercialisée par la société Roche ou les lipases QL (ou QLM), QLC, QLG, PL, PLC et PLG commercialisées par la société Meito- Sangyo. Les lipases PLC et PLG correspondent respectivement à la lipase PL immobilisée sur diatomée et sur granulés de terres de diatomée. Les lipases QLC et QLG correspondent respectivement à la lipase QL immobilisée sur diatomée et sur granulés de terres de diatomée. De nombreux substrats de formule (l) peuvent être monoacylés selon le procédé de la présente invention.
Le groupement R peut être une liaison covaiente ou une chaîne hydrocarbonée comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 5 atomes de carbone, saturée ou insaturée, linéaire ou branchée, aliphatique, cyclique et/ou aromatique, pouvant comprendre et/ou former un ou plusieurs cycles, éventuellement aromatique. Cette chaîne hydrocarbonée peut éventuellement comprendre un ou plusieurs hétéroatomes choisi(s) dans le groupe comprenant le carbone, l'azote, le phosphore, l'oxygène, le silicium et le soufre. Si R est une liaison covaiente, le composé de formule (1) sera un composé dérivé du cyclopropane.
Préférentiellement, R est une chaîne hydrocarbonée comprenant au moins une insaturation. R peut être une chaîne hydrocarbonée comprenant un ou plusieurs cycle(s) aromatique(s) ou non-aromatique(s). Par exemple, si le composé de formule (I) est le cis-4-cyclopentene-1,3-diol, le groupement R correspond à une chaîne hydrocarbonée insaturée comprenant 2 atomes de carbone.
Le groupement R2n est dépendant de la valence de l'atome X. Par exemple, si X est l'atome de carbone, R2=H et n=2. Si X est l'atome d'oxygène ou de soufre, R2=H et n=0. De même si X est un atome d'azote, R2=H et n=1.
Préférentiellement, le composé de formule (I) est choisi dans le groupe comprenant choisi dans le groupe comprenant les composés de formule (V), (VI) et/ou (VII) :
Figure imgf000010_0001
Le substrat préféré selon l'invention est le cis-4-cyclopentene-1,3-diol. Le composé de formule (II) obtenu à partir de ce substrat selon le procédé de l'invention est le (1R, 4S)-4-acétoxy-cyclopent-2-èn-1-ol. La lipase isolée peut être employée en solution aqueuse, éventuellement tamponnée, dans des solvants organiques, en solution mono-phasique ou bi- phasique.
Différents types de solvants organiques peuvent être utilisés selon la présente invention. Le solvant est par définition capable de dissoudre, au moins partiellement, le substrat, tel que le composé de formule (I). On préfère notamment un solvant organique miscible à l'eau. Le solvant organique peut être un composé hydrocarboné aliphatique, cyclique ou aromatique, comprenant éventuellement des fonctions chlorés, azotés, acides, cétone, nitrile aldéhyde et/ou ester. Le solvant organique est préférentiellement choisi dans le groupe comprenant : les cétones telle que l'acétone, la méthyléthylcétone, la cyclohexanone, la cyclopentanone, et la méthylisobutylcétone (MIBK) ; les éthers tel que le méthyle tertiobutyle éther (MTBE) et le tétrahydrofurane (THF) ; les nitriles tel que l'acétonitrile ; et les composés aromatiques tel que le toluène. Préférentiellement, le solvant est compatible avec la lipase de l'invention, c'est à dire qu'il ne dégrade pas la protéine et/ou qu'il ne diminue pas son activité biologique vis à vis du procédé de l'invention de plus de 30 %, mesuré par exemple par rapport au rendement, l'excès énantiomérique en composé (II), le taux de transformation ou conversion du composé (I) et/ou la sélectivité. Outre le solvant organique, le milieu reactionnel, notamment celui de l'étape a), peut comprendre de l'eau, par exemple de 0,1 et 30 % en poids d'eau par rapport au poids du composé de formule (I), préférentiellement de 5 à 20 % en poids d'eau, notamment de 5 à 30 % en poids d'eau. On entend par agent d'acylation, un composé capable de réagir avec une fonction hydroxyle du composé (I) de façon à protéger celui-ci par l'intermédiaire d'une fonction ester. L'agent d'acylation peut être notamment un ester, un anhydre ou un carbonate.
L'agent d'acylation peut être un composé de formule (VIII) : R1-COO-R3 (VIII) dans laquelle : - R1 est défini précédemment ; et R3 est un groupe hydrocarboné comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, éventuellement linéaire, cyclique, aromatique, ramifié, saturé et/ou insaturé ; et comprenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tel que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou le chlore. R3 est de préférence un groupe alkyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes de fluor, ou un groupe alcényle comprenant de 2 à 6 atomes de carbone.
R1 peut être un groupe hydrocarboné comprenant de 1 à 10 atomes de carbone ; préférentiellement de 1 à 6 atomes de carbone ; éventuellement linéaire, cyclique, aromatique et/ou ramifié et comprenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tel que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou le chlore. R1 peut être choisi dans le groupe comprenant le méthyle, l'éthyle, le propyle, le phényle et l'isopropyle.
Cet agent d'acylation peut être choisi dans le groupe comprenant : les acétates, les benzoates et les isobutyrates.
L'agent d'acylation est préférentiellement choisi dans le groupe comprenant : l'acétate de vinyle, l'acétate d'éthyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de 2,2,2- trifluoroéthyle, et l'acétate d'isopropényle.
L'agent d'acylation peut également être utilisé comme solvant organique. Selon le procédé de l'invention, la proportion d'agent d'acylation est préférentiellement supérieur à 1 mole équivalent par rapport composé de formule
(I), préférentiellement compris entre 2 et 6 mole équivalent, plus préférentiellement compris entre 1 et 10 moles équivalent.
Le milieu reactionnel peut être obtenu par mélange du composé de formule (I), et éventuellement l'agent d'acylation au solvant, et ensuite ajout de la lipase de l'invention. On peut également obtenir le milieu reactionnel par ajout successifs des produits suivants : composé de formule (I), lipase, solvant et enfin ajout de l'agent d'acylation.
Les concentrations optimales en enzyme peuvent être déterminées pour chaque substrat et peuvent varier dans d'assez larges proportions. Selon le procédé de l'invention, la proportion de lipase peut être comprise entre 0,1 à 30 % en poids par rapport au poids du composé de formule (I), préférentiellement de 0,1 à 20 % en poids, particulièrement de 0,5 à 10 % en poids.
La réaction de catalyse enzymatique de l'étape a) s'effectue préférentiellement à une température comprise entre -5 et 40 °C, préférentiellement entre 1 et 15 °C. Pour chaque substrat, il est possible de déterminer à l'avance et/ou de contrôler en continu la durée de la réaction enzymatique, en fonction du composé de formule (I) utilisé. Un homme du métier est parfaitement à même de déterminer facilement les conditions de durée optimales pour un substrat donné. Ceci peut être réalisé en réalisant des prélèvements réguliers du milieu reactionnel sur lesquels on évalue l'évolution de l'excès énantiomérique et le taux de conversion. La durée de la réaction enzymatique de l'étape a) est généralement comprise entre 1 et 24 heures, préférentiellement entre 4 et 16 heures. La réaction enzymatique est conduite dans un réacteur approprié éventuellement muni de moyens d'agitation ou de mélanges adaptés. La réaction enzymatique peut notamment être arrêtée par tout moyen chimique approprié, tel que par ajout d'un solvant, addition de base ou d'acide, de détergents, et/ou de sels ; ou moyen physique approprié, comme par exemple par congélation, centrifugation, chauffage, et/ou filtration. Selon l'étape b), le composé de formule (II) peut être isolé de différentes manières connues de l'homme du métier, tel que par exemple par purification par filtration, extraction, distillation, cristallisation, chromatographie sur colonne, et/ou centrifugation. On peut notamment procéder en fin de réaction à une filtration, suivie d'une ou plusieurs distillations et d'une cristallisation avant filtration. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un composé de formule (II) obtenu par un procédé de fabrication tel que défini précédemment, en tant qu'intermédiaire, pour la fabrication d'un médicament ou d'un produit pharmaceutique, tel que prostaglandines, des prostacyclines et/ou des thromboxanes. A partir du composé de formule (II) de l'invention, il est possible de fabriquer des médicaments et produits pharmaceutiques en utilisant ce composé comme intermédiaire. Ainsi, par exemple, l'utilisation du (1 R, 4S)-4- acétoxy-cyclopent-2-èn-1-ol, correspondant à un composé de formule (II) est utilisé pour la synthèse de produits pharmaceutiques, comme mentionné dans le brevet W09526729 et les publications suivantes : J. Stjenschantz et al. Drugs of the Future, 1992, 17, 691 ; Noyori et al. Angew. Chem. Int. Ed., 1984, 23, 847 ; Kaumen et al. J. Chem. Soc, Chem. Comm., 1986, 1298 ; Kondo et al. Angew. Chem. Int. Ed., 1975, 14, 103 ; Tômόskôzi et al. Tetrahedron Lett., 1976, 4639. On donne ci-après des exemples de réalisation pratique de l'invention. Les exemples suivent illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
Exemple 1 : Matériaux utilisés : Lipase d'Alcaligenes sp. : GLG, QLC ou QL commercialisées par la société Meito-Sangyo ; ou Chirazyme L10™ commercialisée par la société Roche (ci- après appelé L10) ; Lipase Pancréatine : Pancréatine de porc commercialisée par la société Sigma ; Substrat diol : cis-4-cyclopentene-1 ,3-diol commercialisé par la société Fluka (composé de formule (I)).
Dans un réacteur de 100 mL, on introduit sous agitation 4,21g (0,042 mol) de 1 ,3-dihydroxycyclopent-2-ène dans 30 mL d'acétone (23,7g) à température ambiante (24-25°C). Après solubilisation du diol dans l'acétone, on ajoute 18,08g d'acétate de vinyle (0,21 mol; 5 équivalents molaires par rapport au diol) puis 420μL (10 % en poids par rapport au diol) d'eau déminéralisée. La température du milieu est alors fixée à 5°C. On ajoute 100 % en poids d'enzyme Pancréatine par rapport au diol ou un pourcentage en poids déterminé d'enzyme lipase d'Alcaligenes sp par rapport au diol. Au bout de 6,5 heures, on effectue un prélèvement de 0,5 mL de milieu reactionnel que l'on centrifuge. 200 μL sont prélevés et dilués dans 800 μL d'acétone avant injection en chromatographie en phase gazeuse chirale. Le reste du milieu reactionnel est filtré de manière à séparer la lipase ; le gâteau est lavé avec env. 3 g d'acétone. Le filtrat auquel on a ajouté environ 8 g de TMBE (tertiobutyle méthyle éther) est ensuite distillé sous vide de façon à éliminer l'acétone et l'acétate de vinyle. On ajoute à la fin de cette première dévolatilisation environ 15 g de TMBE et du charbon actif. On agite et on filtre le milieu reactionnel sur du clarsel. Le filtrat est dévolatilisé. On ajoute ensuite de l'heptane pour cristalliser le produit souhaité et on diminue la température de 28 à 8°C. Le début de la cristallisation est observé vers 16°C. On filtre ensuite le composé souhaité qui se présente sous forme de cristaux blancs. Les cristaux comprenant le monoacétate R (composé III) et le monoacétate S (composé II) sont séchés sous 50 mbar à température ambiante durant 18 heures. La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est réalisée à l'aide d'une colonne Cyclodex B composée deβ -cyclodextrine permethylée déposée dans une huile silicone constituée à 86% de motifs diméthylsiloxane et de 14 % de motifs méthyl-cyanopropylsiloxane. La colonne possède une longueur de 30 m, un diamètre interne de 250 μm et une épaisseur de film d'huile silicone de 0,25 μm. Le diol (composé (I)) est élue avec un temps de rétention relatif de 1,00, le monoacétate R (composé (III)) de 1,10, le monoacétate S (composé (II)) de 1,13 et le diacétate composé (IV)) de 1 ,38.
On mesure ensuite le pourcentage surface des pics extraits de la chromatographe pour les composés (I), (II), (III) et (IV). Les résultats sont mentionnés dans le tableau I : Tableau I
Figure imgf000016_0001
Le taux de transformation ou conversion du composé (I) (%) est calculé de la manière suivante : (pourcentage surface du composé (I) au temps 0 (début de la réaction) - le pourcentage surface du composé (I) en fin de réaction) / pourcentage surface du composé (I) au temps 0. L' excès énantiomérique en composé (II) (%) est calculé de la manière suivante : (valeur absolue du (pourcentage surface du composé (II) - pourcentage surface de composé (lll))) / (pourcentage surface du composé (II) + pourcentage surface de composé (III)).
La sélectivité est calculée de la manière suivante : Il correspond au (pourcentage surface des composés (II) + (III)) / (pourcentage surface du composé (IV)). Le rendement en composé (II) (%) est calculé de la manière suivante : (pourcentage surface du composé (II)) / (pourcentage surface du composé (I) au temps 0).
On observe ainsi que l'utilisation de la lipase permet d'obtenir une réaction de transestérification du diol pour obtenir un composé (II) avec des performances supérieures à celles obtenues avec une enzyme d'origine animale, avec des quantités nettement plus faibles. Comme il se produit un schéma reactionnel du type :
(II) . (0 (IV) . (lll)
la faible quantité de composé (IV) obtenue en fin de réaction en utilisant l'enzyme pancréatine entraîne une mesure de sélectivité importante.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour la fabrication d'un composé de formule (ii) :
Figure imgf000018_0001
dans lequel : R est une liaison covaiente ou une chaîne hydrocarbonée comprenant de 1 à 10 atomes de carbone ; R1 est un groupe hydrocarboné comprenant de 1 à 10 atomes de carbone ; R2 correspond à un atome d'hydrogène ; n est un nombre entier compris entre 0 et 2 ; X est un atome choisi dans le groupe comprenant le carbone, l'azote, l'oxygène, et le soufre ; comprenant au moins les étapes suivantes : a) on fait réagir au moins un composé de formule (I) :
Figure imgf000018_0002
avec un agent d'acylation dans un solvant organique en présence d'une lipase de la classe EC 3.1.1.3 d'Alcaligenes spp, de façon à former le composé de formule (II) ; b) on isole le composé de formule (II).
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la lipase de la classe EC 3.1.1.3 présentent les caractéristiques suivantes : Excès énantiomérique en composé (II) supérieur ou égal à 50 % ; Sélectivité en composés (11) et (lll) supérieure ou égale à 2 ; Rendement en composé (II) supérieur ou égal à 40 % ; et Taux de transformation ou conversion du composé (l) supérieur ou égal à 70 %.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que la lipase est choisie dans le groupe comprenant : la lipase QL d'Alcaligenes sp PL-266, enregistrées sous le numéro FERM-P N°3187, et la lipase PL d'Alcaligenes sp PL-679, enregistrées sous le numéro FERM-P N°3783.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la lipase est immobilisée sur un support solide approprié ou non immobilisée.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le support solide est choisi dans le groupe comprenant : le DEAE cellulose, le DEAE sepharose, la diatomée, la silice, l'alumine, le polypropylène et/ou leurs mélanges.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la lipase est choisie dans le groupe comprenant : les lipases QL, QLC, QLG, PL, PLC et PLG.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que R est une chaîne hydrocarbonée comprenant au moins une insaturation.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le composé de formule (I) est choisi dans le groupe comprenant les composés de formule (V), (VI) et/ou (VII) :
Figure imgf000020_0001
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la proportion de lipase est comprise entre 0,1 à 30 % en poids par rapport au poids du composé de formule (I).
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le solvant organique est choisi dans le groupe comprenant : les cétones telle que l'acétone, la méthyléthylcétone, la cyclohexanone, la cyclopentanone, et la methylisobutylcetone (MIBK) ; les ethers tel que le methyle tertiobutyle éther (MTBE) et le tétrahydrofurane (THF) ; les nitriles tel que l'acétonitrile ; et les composés aromatiques tel que le toluène.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le milieu reactionnel de l'étape a) comprend de l'eau.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que l'agent d'acylation est un composé de formule (VIII) : R1-COO-R3 (VIII) dans laquelle : R1 est défini précédemment ; et R2 est un groupe hydrocarboné comprenant de 1 à 10 atomes de carbone.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'agent d'acylation est choisi dans le groupe comprenant : les acétates, les benzoates et les isobutyrates.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'agent d'acylation est choisi dans le groupe comprenant : l'acétate de vinyle, l'acétate d'ethyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de 2,2,2-trifluoroéthyle, et l'acétate d'isopropényle.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que la réaction de l'étape a) s'effectue à une température comprise entre -5 et 40 °C.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce. que la durée de la réaction enzymatique de l'étape a) est comprise entre 1 et 24 heures.
17. Utilisation d'un composé de formule (II) obtenu selon le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 en tant qu'intermédiaire, pour la fabrication d'un médicament ou d'un produit pharmaceutique.
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