WO2005013679A1 - Reproductive and non-reproductive cloning method - Google Patents

Abstract

A method for cloning mammal animals using post-natal germinal cells as a nuclear donor in order to increase the longevity of clones (and to reduce cellular ageing, in therapeutic cloning).

Description

Méthode de clonage reproductif et non reproductif.Reproductive and non-reproductive cloning method.

APPLICATIONAPPLICATION

Clonage d'organismes mammifères, reproductif et non reproductif, avec une capacité de survie augmentée pour les clones (et une diminution du vieillissement cellulaire, dans le cadre du clonage dit « thérapeutique »), en rapport aux résultats obtenus avec les méthodes actuelles.Cloning of mammalian organisms, reproductive and non-reproductive, with increased survival capacity for clones (and a decrease in cell aging, in the context of so-called “therapeutic” cloning), in relation to the results obtained with current methods.

ETAT DE LA TECHNIQUESTATE OF THE ART

Le clonage d'organismes, ou transfert nucléaire, est une opération visant à produire la copie identique d'un individu « matrice ». La démarche consiste en un transfert du matériel génétique nucléaire d'une cellule de l'individu destiné à être copié (dormeur nucléaire) dans un ovule énucléé, et au transfert de la cellule diploïde ainsi obtenue dans une mère porteuse. Les mitochondries sont héritées de la femelle qui fournit l'ovule, le clone a donc un patrimoine génétique identique à celui de l'organisme matrice, excepté en ce qui concerne l'ADN mitochondrial (sauf si le donneur d'ovule est l'individu matrice ou une femelle « de la famille » ayant hérité des mêmes mitochondries).The cloning of organisms, or nuclear transfer, is an operation aimed at producing the identical copy of an individual "matrix". The approach consists of a transfer of nuclear genetic material from an individual cell intended to be copied (nuclear sleeper) into an enucleated ovum, and the transfer of the diploid cell thus obtained into a surrogate mother. The mitochondria are inherited from the female who provides the ovum, so the clone has a genetic heritage identical to that of the matrix organism, except with regard to mitochondrial DNA (unless the ovum donor is the individual matrix or a female “of the family” having inherited the same mitochondria).

Une cellule somatique est prélevée chez l'individu matrice. L'ovule d'une femelle « donneuse d'ovule » est activé et énucléé. Il existe à ce jour trois techniques de bases pour le transfert nucléaire dans l'ovule énucléé, soit :A somatic cell is removed from the matrix individual. The ovum of a female "egg donor" is activated and enucleated. To date, there are three basic techniques for nuclear transfer into the enucleated ovum:

La fusion cellulaire de l'ovule énucléé et de la cellule donneuse de noyau dans une chambre de fusion permettant l'application d'un courant électrique visant à faire fusionner les membranes ((Wilmut I. et al. 1997.); (Cibelli P. et al. 1998); (Kato Y. 1998)).Cell fusion of the enucleated ovum and the nucleus donor cell in a fusion chamber allowing the application of an electric current aimed at fusing the membranes ((Wilmut I. et al. 1997.); (Cibelli P . et al. 1998); (Kato Y. 1998)).

Le prélèvement et l'injection du noyau dans l'ovule à l'aide d'une micropipette (Walcayama T et al. 2003).Collection and injection of the nucleus into the ovum using a micropipette (Walcayama T et al. 2003).

L'injection de la cellule donneuse de noyau entière dans l'ovule énucléé (Lee J.W. et al. 2003).Injection of the whole nucleus donor cell into the enucleated ovum (Lee J.W. et al. 2003).

Figure 1. Schéma récapitulatif des techniques de clonageFigure 1. Summary diagram of cloning techniques

Les taux de réussite sont très faible, de l'ordre de 1%, ils prennent des valeurs entre 0 et 10% (X Cindy Tian et al. 2003. Review). Les clones naissent souvent avec des malformations, et pourraient avoir une durée de vie réduite. Les individus clones à ce jour sont peu nombreux et n'ont, pour la plupart, pas encore vécu suffisamment longtemps pour montrer une diminution d'espérance de vie. Certains protagonistes de la controverse du vieillissement accéléré des clones soutiennent que les clones issus de cellules somatiques ne vieillissent pas prématurément ; cependant ils semblent ne pas tenir compte du fait que l'accumulation de mutations ou plutôt la perte d'information n'est pas significative :Success rates are very low, around 1%, they take values between 0 and 10% (X Cindy Tian et al. 2003. Review). Clones are often born with malformations, and may have a short lifespan. The cloned individuals to date are few and, for the most part, have not yet lived long enough to show a decrease in life expectancy. Some protagonists of the controversy of accelerated aging of clones maintain that clones derived from somatic cells do not age prematurely; however, they seem to ignore the fact that the accumulation of mutations or rather the loss of information is not significant:

Lorsque les clones sont trop jeunes pour montrer une quelconque trace de vieillissement (Kubota et al. 2000).When the clones are too young to show any sign of aging (Kubota et al. 2000).

Lorsque l'organisme matrice n'est pas encore né (donneur embryonnaire), ou est encore jeune, (un effet clair de diminution de la longévité a cependant été démontré en prenant comme donneur nucléaire des organismes jeunes à l'instant du transfert nucléaire (Narumi Ogonuki et al. 2002).When the matrix organism is not yet born (embryonic donor), or is still young, (a clear effect of decreasing longevity has however been demonstrated by taking young organisms as nuclear donor at the time of nuclear transfer ( Narumi Ogonuki et al. 2002).

Aujourd'hui le débat est ouvert, comme beaucoup d'animaux clones ont des malformations ((Rhind SM. et al. 2003), (Latham KE. 2004)), et comme certains d'entre eux ont vécu suffisamment longtemps pour montrer une longévité diminuée. Des problèmes épigénétiques, dus à la « conformation épigénétique » du donneur nucléaire divergeant de celle des gamètes (dont les gènes soumis à « l'imprinting » permettent un développement normal lors d'une fécondation classique) apparaissent et sont révélateurs d'une reprogrammation défectueuse du plan de développement et de fonctionnement de l'individu.Today the debate is open, as many cloned animals have malformations ((Rhind SM. Et al. 2003), (Latham KE. 2004)), and as some of them have lived long enough to show a reduced longevity. Epigenetic problems, due to the “epigenetic conformation” of the nuclear donor diverging from that of the gametes (whose genes subjected to “printing” allow normal development during conventional fertilization) appear and are indicative of defective reprogramming the individual's development and operating plan.

Différents problèmes ont été reportés et il semblerait judicieux de les classer par types :Different problems have been reported and it would seem wise to classify them by types:

Dans toutes les espèces, un grand nombre d'avortements spontanés ont lieu . Les défauts au niveau du développements adviennent essentiellement au niveau de la gastrulation et de la placentation ((Hill J. R. et al. 2000) ; (Tanaka S. et al. 2001)). Ces derniers ont une composante épigénétique démontrée (Santos F. et al. 2003). Les gènes dérégulés sont hétérogènes suivant l'essai, le type cellulaire utilisé et l'espèce ((Rhind SM. et al. 2003) ; (Latham KE. 2004)). Cependant quelques gènes clés semblent « préférentiellement » dérégulés. Des gènes indispensables au développement de la masse cellulaire interne comme Oct4 (Boian M. 2002) sont, chez les animaux issus de NT, fréquemment méthylés de manière aberrante ; il en est de même pour Sall3, impliqué dans la placentation (Ohgane J. 2004 ).In all species, a large number of spontaneous abortions take place. Defects in development mainly occur in gastrulation and placentation ((Hill J. R. et al. 2000); (Tanaka S. et al. 2001)). The latter have a demonstrated epigenetic component (Santos F. et al. 2003). The deregulated genes are heterogeneous depending on the test, the cell type used and the species ((Rhind SM. Et al. 2003); (Latham KE. 2004)). However, some key genes seem "preferentially" deregulated. Genes essential for the development of internal cell mass such as Oct4 (Boian M. 2002) are, in animals from NT, frequently aberrantly methylated; the same is true for Sall3, involved in placentation (Ohgane J. 2004).

Les morts périnatales sont aussi relativement fréquentes. Le large offspring syndrome (LOS) (Young L. E. et al. Wilmut. 1998), fréquent chez les ruminants issus de NT, présente des placentomégalies et un développement souvent anormal des organes qui sont trop grands. Ce syndrome, n'est pas spécifique au NT, mai il découlerait plutôt des techniques de manipulation de l'embryon, car son incidence est aussi augmentée, dans une moindre mesure, lors de FIV traditionnelle, chez les ruminants et chez l'humain. L'homologue humain du LOS est le syndrome de Beckwith Wiedemann (DeBaun M. R. et al. 2003), ce syndrome est le résultat d'aberrations épigénétiques, connues (Reik W. & Maher E. R. 1997).Perinatal deaths are also relatively common. The large offspring syndrome (LOS) (Young L. E. et al. Wilmut. 1998), common in ruminants from NT, presents with placentomegaly and an often abnormal development of the organs which are too large. This syndrome, is not specific to NT, it may rather result from techniques for manipulating the embryo, since its incidence is also increased, to a lesser extent, during traditional IVF, in ruminants and in humans. The human counterpart of LOS is Beckwith Wiedemann syndrome (DeBaun M. R. et al. 2003), this syndrome is the result of known epigenetic aberrations (Reik W. & Maher E. R. 1997).

Des individus apparemment « sains », qui se développent et naissent sans problèmes morphologiques, puis croissent jusqu'à l'âge adulte sans montrer d'anomalies, semblent ensuite, transitoirement « normaux ». La reprogrammation chez ces clones doit être quasiment parfaite, comme aucun phénotype lié à des défauts épigénétiques ne semble apparaître ; la méthylation semble normale à 99% (Shiota & Yanagimachi. 2002), et à 100% chez (Ogura et al. 2002). Lorsque l'on sait que des variations de méthylation sont relativement fréquentes à des niveaux intraspécifiques (Pritchard C. et al. 2001), et que l'on observe aucune anomalie phénotypique ressemblant à un problème épigénétique ; on pourrait considérer le clone comme « réussi » ou « normal », du moins au niveau de la reprogrammation (Ogura et al. 2002). Ces individus clones semblent semblent cependant avoir une durée de vie diminuée (Narumi Ogonuki et al. 2002).Apparently "healthy" individuals, which develop and are born without morphological problems, then grow until adulthood without showing anomalies, then appear, transiently "Normal". The reprogramming in these clones must be almost perfect, as no phenotype linked to epigenetic defects seems to appear; methylation seems 99% normal (Shiota & Yanagimachi. 2002), and 100% in (Ogura et al. 2002). When it is known that variations in methylation are relatively frequent at intraspecific levels (Pritchard C. et al. 2001), and that no phenotypic anomaly resembling an epigenetic problem is observed; one could consider the clone as “successful” or “normal”, at least in terms of reprogramming (Ogura et al. 2002). However, these cloned individuals seem to have a reduced lifespan (Narumi Ogonuki et al. 2002).

Lorsque le vieillissement des clones est clairement abordé, comme dans la revue « Aging of animais produced by nuclear transfer », on ne parle pas de syndrome progéroide, mais plutôt de détériorations physiques hétérogènes, liées à des problèmes épigénétiques, et parfois à la longueur des télomères (Kϋhholzer-Cabot B. & Brem G. 2002. Revie ).When the aging of clones is clearly addressed, as in the review "Aging of animais produced by nuclear transfer", we do not speak of progeroid syndrome, but rather of heterogeneous physical deterioration, linked to epigenetic problems, and sometimes to the length of telomeres (Kϋhholzer-Cabot B. & Brem G. 2002. Revie).

L'hypothèse de la télomérase comme facteur essentiel dans la diminution de la durée de vie des clones est maintenant très controversée ; on pensait que le phénotype de Dolly était dû à un raccourcissement des télomères, comme une diminution de leur longueur a été observée chez plusieurs clones de moutons (P. G. Shiels et al. 1999). Il a été tenté, afin d'augmenter la durée de vie des clones, de simplement de rallonger les télomères du donneur nucléaire (R.P. Lanza et al. 2000). Le raccourcissement de la longueur des télomères des clones est aujourd'hui très controversée, comme chez le veau, aucune diminution n'a été remarquée (X.C. Tian. et al. 2000). La variabilité de la longueur tantôt diminuée tantôt augmentée des télomères des clones décrite dans (N. Miyashitaet al. 2002), suggère une compensation liée à des télomères à la base trop courts, ou un allongement aléatoire dans l'embryon.The hypothesis of telomerase as an essential factor in reducing the lifespan of clones is now very controversial; it was thought that the Dolly phenotype was due to a shortening of the telomeres, as a decrease in their length was observed in several sheep clones (P. G. Shiels et al. 1999). It has been attempted, in order to increase the lifespan of the clones, to simply extend the telomeres of the nuclear donor (R.P. Lanza et al. 2000). The shortening of the length of the telomeres of clones is today very controversial, as in the calf, no reduction has been noticed (X.C. Tian. Et al. 2000). The variability in the length, sometimes decreased, sometimes increased, of the telomeres of the clones described in (N. Miyashita et al. 2002), suggests a compensation linked to telomeres at the base that are too short, or a random lengthening in the embryo.

L'hypothèse d'un syndrome progéroïde intrinsèque à une perte d'information génétique somatiques n'est pas prise en compte ou est rejetée lors de l'interprétation phénotypique du clone ; ceci vient du fait que les taux de mutations germinaux et somatiques sont considérés comme équivalents. The hypothesis of a progeroid syndrome intrinsic to a loss of somatic genetic information is not taken into account or is rejected during the phenotypic interpretation of the clone; this is because the rates of germline and somatic mutations are considered to be equivalent.

BASES SCIENTIFIQUESSCIENTIFIC BASES

Des détériorations physiques semblent donc affecter les clones et diminuer leur espérance de vie (Narumi ogonuki et al. 2002.), selon la seule étude, menée sur toute une durée de vie d'un échantillon significatif de clones, étude montrant une diminution dramatique de la longévité des clones en rapport aux contrôles.Physical deterioration therefore seems to affect the clones and decrease their life expectancy (Narumi ogonuki et al. 2002.), according to the only study, carried out over a lifetime of a significant sample of clones, a study showing a dramatic decrease in the longevity of the clones in relation to the controls.

l'hypothèse que je propose serait celle d'un syndrome progéroïde lié aux mutations accrues dans la lignée somatique en rapport à la lignée germinale. Ces problèmes génétiques liés aux mutations¹ devraient logiquement aussi avoir un impact négatif sur le développement global des clones.my hypothesis is that of a progeroid syndrome linked to increased mutations in the somatic line in relation to the germ line. These genetic problems linked to mutations ¹ should logically also have a negative impact on the overall development of the clones.

Les clones produits à partir des cellules germinales post-natales devraient être obtenus avec un taux de succès légèrement supérieur et avoir une durée de vie nettement augmentée en rapport à ceux obtenus par clonage somatique.Clones produced from postnatal germ cells should be obtained with a slightly higher success rate and have a significantly increased lifespan compared to those obtained by somatic cloning.

Cette hypothèse découle, à la base, de trois faits qui vont à encontre de « la current opinion » et qui n'ont ni clairement été énoncés ni démontrés :This hypothesis stems, basically, from three facts which run counter to "the current opinion" and which have neither been clearly stated nor demonstrated:

1. Les cellules germinales conservent « infiniment » mieux l'information génétique portée par leur ADN que les cellules somatiques.1. Germ cells store genetic information carried by their DNA "infinitely" better than somatic cells.

2. L'unique cause à la source du vieillissement est une perte d'information désoxyribonucléique due à un comportement nucléaire.2. The only cause at the source of aging is a loss of deoxyribonucleic information due to nuclear behavior.

3. Le syndrome « pseudo - progéroïde » des clones est essentiellement génétique et non épigénétique.3. The “pseudo-progeroid” syndrome of the clones is essentially genetic and not epigenetic.

Ces faits s'intègrent dans une explication du phénomène de la sénescence (du moins le type de sénescence caractéristique des humains et de beaucoup d'autres espèces sexuées qui leur sont semblables en ce qui concerne ce phénomène), sénescence qui est amenée à être définie comme le résultat du désintéressement de la sélection naturelle vis-à-vis de l'expression et/ou la surexpression d'outils de préservation de l'intégrité de l'ADN au sein des cellules somatiques, outils qui ont été sélectionnés pour être exprimés et/ou surexprimés au sein des cellules germinales.These facts are integrated into an explanation of the phenomenon of senescence (at least the type of senescence characteristic of humans and many other sexual species which are similar to them with regard to this phenomenon), senescence which is brought to be defined. as the result of the disinterestedness of natural selection with respect to the expression and / or overexpression of tools for preserving the integrity of DNA within somatic cells, tools which have been selected to be expressed and / or overexpressed within germ cells.

ADN GERMINALGERMINAL DNA

Il s'agira, au travers de ce paragraphe, de démontrer que les cellules germinales doivent avoir des taux de mutations négligeables en rapport aux taux somatiques, c'est à dire non significatif au niveau genérationnel. LaIt will be a question, through this paragraph, of demonstrating that the germ cells must have negligible rates of mutations compared to the somatic rates, ie not significant at the generational level. The

¹ Le terme de mutations, utilisé pour simplifier la lecture, englobera dans ce paragraphe tout type de perte d'information désoxyribonucléique. « current opinion » supporte que les taux de mutations sont similaires dans les lignées germinales et somatiques, elle est essentiellement construite sur des estimations de mutations de novo ((Vekemans M. et al. 2002) ; (Zhang Y. et al. 1999) ; (Kuick RD. et al.1992)) ainsi que des études sur l'incidence de l'âge parental sur la longévité de la progéniture ((Gavrilov LA. et al. 1997) ; (Gavrilov L.A. & Gavrilova N.S. 2001)) ; cette opinion a un corollaire logique - c'est le clonage somatique, l'explication épigénétique des syndromes « progéroïdes » des clones, et la non existence du clonage germinal post-natal. ¹ The term mutations, used to simplify reading, will include in this paragraph any type of deoxyribonucleic information loss. "Current opinion" supports that the mutation rates are similar in germline and somatic lines, it is essentially built on estimates of de novo mutations ((Vekemans M. et al. 2002); (Zhang Y. et al. 1999) ; (Kuick RD. Et al. 1992)) as well as studies on the impact of parental age on the longevity of offspring ((Gavrilov LA. Et al. 1997); (Gavrilov LA & Gavrilova NS 2001)) ; this opinion has a logical corollary - it is the somatic cloning, the epigenetic explanation of the “progeroid” syndromes of the clones, and the non-existence of post-natal germinal cloning.

L'ADN des cellules germinales, étant fonctionnel durant des générations et des générations, fait contraste avec l'ADN de la lignée somatique, ne permettant à cette dernière de subsister, dans l'espèce humaine par exemple, guère plus que 3 générations. Les taux de mutations étant considérés comme similaires dans les lignées somatiques et germinales, une idée de l'existence d'une forme de sélection négative de l'information génétique altérée, à différents niveaux, entre et au cours des générations, a émergé. Ces niveaux n'ont auparavant jamais été clairement définis, ni explorés dans leur globalité^'.The DNA of the germ cells, being functional for generations and generations, contrasts with the DNA of the somatic line, allowing the latter to subsist, in the human species for example, little more than 3 generations. With mutation rates considered to be similar in somatic and germline lines, an idea has emerged of the existence of a form of negative selection of altered genetic information, at different levels, between and over generations. These levels have never before been clearly defined, nor explored in their entirety ^' .

Une démonstration se basant sur la continuité du transfert intergenerationnel d'information génétique sera conduite sous la forme d'une preuve « par l'absurde », avec une hypothèse première, qui est celle de la « current opinion » et s'énoncerait de la manière suivante :A demonstration based on the continuity of the intergenerational transfer of genetic information will be conducted in the form of proof "by the absurd", with a primary hypothesis, which is that of the "current opinion" and would state the as follows:

Comme l'ADN d'un individu âgé est très muté en comparaison à celui d'un individu jeune, il devrait être plus discriminé par la sélection naturelle, lors de la transmission de l'information génétique à la génération suivante e/ou durant la génération suivante. En d'autres termes, les cellules germinales altérées augmentant en nombre avec l'âge, devraient être éliminées par la sélection naturelle lors du transfert de leur information à la génération suivante et/ou au cours de la génération suivante.As the DNA of an elderly individual is very mutated compared to that of a young individual, it should be more discriminated by natural selection, during the transmission of genetic information to the next generation e / or during the next generation. In other words, the damaged germ cells increasing in number with age, should be eliminated by natural selection when transferring their information to the next generation and / or during the next generation.

L'absence d'une significative augmentation de discrimination sélective avec l'âge, infirmerait la présence d'une accumulation de détériorations génétiques germinale avec l'âge, du moins d'une détérioration génétique significative sur la conception, la longévité et la fertilité d'un individu de la génération suivante. Il s'agira alors d'observer la sélection au niveau de la production et de la rencontre des gamètes, au niveau de l'embryon et de la fitness de l'individu de la génération suivante.The absence of a significant increase in selective discrimination with age would invalidate the presence of an accumulation of germline genetic deterioration with age, at least of a significant genetic deterioration in conception, longevity and fertility. 'an individual of the next generation. It will then be a question of observing the selection at the level of production and the meeting of gametes, at the level of the embryo and the fitness of the individual of the next generation.

L'estimation de l'impact de cette sélection se fera sur le mâle, comme la vieillesse du corps somatique de la mère doit nuire au bon développement de l'enfant indépendamment de la qualité de l'information génétique qu'elle transmet. Une démonstration au niveau du mâle est suffisante comme sa contribution génétique est essentielle.The impact of this selection will be estimated on the male, as the old age of the somatic body of the mother must harm the good development of the child regardless of the quality of the genetic information it transmits. A demonstration at the level of the male is sufficient as its genetic contribution is essential.

Figure 2. Sélection discriminative en fonction de la qualité de l'information génétique L'observation de la discrimination sélective au niveau de la production du gamète consiste en l'analyse de la qualité du sperme en fonction de l'âge au niveau du nombre de spermatozoïdes, leur motilité, et la quantité de sperme produite. Ces paramètres (justement appelés paramètres du sperme) varient très peu avec l'âge (Plas E.P. et al. 2000. Review), l'une des plus récentes études sur le sujet (Krause W. & Habermann B. 2000.) ne montre aucun changement de ces derniers en fonction de l'âge. L'absence d'augmentation globale d'apoptose avec l'âge des cellules germinales (Barnes CJ. et al. 1998) infirme l'hypothèse de sélection génétique âge-dépendante au niveau de la production des gamètes.Figure 2. Discriminatory selection based on the quality of genetic information The observation of selective discrimination in terms of gamete production consists in analyzing the quality of sperm as a function of age in terms of the number of sperm, their motility, and the quantity of sperm produced. These parameters (aptly called sperm parameters) vary very little with age (Plas EP et al. 2000. Review), one of the most recent studies on the subject (Krause W. & Habermann B. 2000.) does not show no change of these according to age. The absence of an overall increase in apoptosis with the age of germ cells (Barnes CJ. Et al. 1998) invalidates the hypothesis of age-dependent genetic selection at the level of gamete production.

La discrimination sélective, au niveau de la rencontre du gamète et de la survie de l'embryon est évaluable par l'observation des taux de réussite des fécondations in vitro en fonction de l'âge paternel. Lorsqu'on parle de sélection négative des « ratés » au fil des générations, particulièrement chez un parent âgé, il est souvent dit que la discrimination se fait au niveau embryonnaire, conduisant à des avortements spontanés augmentant avec l'âge. Jusqu'à récemment, il était difficile, voire impossible, de quantifier l'ampleur de cette sélection, cependant aujourd'hui, grâce aux techniques de fécondation in vitro, particulièrement l'observation de leurs taux de réussite (indiquant le « input » et le « output »), il est possible de le faire avec précision. La plupart des études sur le sujet n'observent pas de diminution du taux de réussite de la FIV avec l'âge paternel ((Paulson R.J. et al. 2001) ; (Spandorfer SD. et al. 1998) (ICSI)). (Avec ROSI et ROSNI, aucune diminution du succès en fonction de l'âge paternel n'a été décrite ; ces techniques, « bypassant » à 100% la sélection sur la motilité et le chimiotactisme du spermatozoïde permettent de quantifier à la fois la sélection du spermatozoïde et la sélection embryonnaire.)Selective discrimination, at the level of the meeting of the gamete and the survival of the embryo can be evaluated by observing the success rates of in vitro fertilizations as a function of paternal age. When we speak of negative selection of “failures” over the generations, particularly in an elderly parent, it is often said that discrimination occurs at the embryonic level, leading to spontaneous abortions increasing with age. Until recently, it was difficult, if not impossible, to quantify the extent of this selection, however today, thanks to in vitro fertilization techniques, particularly the observation of their success rates (indicating the "input" and the "output"), it is possible to do it with precision. Most studies on the subject do not observe a decrease in the success rate of IVF with paternal age ((Paulson R.J. et al. 2001); (Spandorfer SD. Et al. 1998) (ICSI)). (With ROSI and ROSNI, no reduction in success as a function of paternal age has been described; these techniques, “bypassing” the selection on motility and chemotaxis of the sperm at 100%, make it possible to quantify both the selection sperm and embryo selection.)

L'impact de la sélection de l'individu s'observe par la fitness de l'individu en fonction de l'âge paternel ; la fitness dépendant de « survie » et « fécondité » est évaluable par une étude de la fécondité ainsi que par une observation de l'espérance de vie moyenne de la progéniture, chacune en^' fonction de l'âge paternel à la conception.The impact of the selection of the individual is observed by the fitness of the individual according to the paternal age; fitness dependent "survival" and "fertility" is assessable by a study of fertility, as well as an observation of the average life expectancy of offspring, each in ^'function of paternal age at conception.

Au niveau de la fécondité, l'âge paternel à la conception n'a aucune influence; d'après des mesures sur la fécondité d'individus issus de reproduction tardive (J. M. Wattiaux 1968).At the level of fertility, the father's age at conception has no influence; according to measurements on the fertility of individuals from late reproduction (J. M. Wattiaux 1968).

Les études les plus citées regardant partiellement l'impact de l'âge paternel à la conception sur la survie de la descendance, sur l'humain du moins, sont trois études de Gavrilov et Gavrilova regardant la longévité après 30 ans (Gavrilov L.A, Gavrilova N.S. 2001.) ; (Gavrilov L.A, Gavrilova N.S. 1997.) ; ( Gavrilov L.A, Gavrilova N.S. 1997). Leurs résultats souvent cités et acceptés, concluent que l'âge paternel avancé diminue l'espérance de vie de la progéniture. Quelques études sur la mortalité infantile en fonction de l'âge paternel sont disponibles et controversées. Aucune étude regardant la survie globale soit l'espérance de vie à la naissance ne semble avoir été publiée.The most cited studies partially looking at the impact of paternal age at conception on the survival of offspring, at least on humans, are three studies by Gavrilov and Gavrilova looking at longevity after 30 years (Gavrilov LA, Gavrilova NS 2001.); (Gavrilov L.A, Gavrilova N.S. 1997.); (Gavrilov L.A, Gavrilova N.S. 1997). Their often cited and accepted results conclude that advanced paternal age decreases the life expectancy of the offspring. Some studies on infant mortality as a function of paternal age are available and controversial. No study looking at overall survival, ie life expectancy at birth, seems to have been published.

En observant l'étude de Gavrilov et Gavrilova, j'ai remarqué que l'effet observé n'est visible que chez les filles, dans la dernière tranche d'âge des pères qui s'étend de 50 à 60 ans, ceci dans une population ou l'espérance de vie moyenne est de 60 ans environ; ce qui signifie qu'un enfant né d'un père appartenant cette tranche d'âge paternel perd son père à un âge moyen d'environ 5 ans; il doit donc y avoir un biais dans les résultats, biais lié à l'impact socio psychologique de la perte d'un père en bas âge, dont l'effet est négatif sur la durée de vie.By observing the study by Gavrilov and Gavrilova, I noticed that the observed effect is only visible in girls, in the last age group of fathers which ranges from 50 to 60 years, this in a population or the average life expectancy is around 60 years; which means that a child born to a father belonging to this age group paternal loses his father at an average age of around 5 years; there must therefore be a bias in the results, a bias linked to the socio-psychological impact of the loss of an infant father, whose effect is negative on lifespan.

Une analyse d'autres données généalogiques, non publiée, que j'ai dirigée, regardant la longévité après 30 ans, la mortalité infantile et pour la première fois, l'espérance de vie à la naissance, ne montre aucun effet significatif de l'âge paternel ni sur les fils, ni sur les filles, au niveau de leur capacité à survivre globale dès la naissance. Dans cette étude, en limitant l'effet de la perte d'un parent en bas-âge, un impact négatif de la perte d'un parent en bas âge sur la longévité a été démontré. J'ai aussi étudié la mortalité infantile, la longévité et l'espérance de vie à la naissance de cadets et aînés de différentes familles; les résultats découlant de cette homogénéisation unique du millieu génético-socio-économique confirment l'absence d'effet négatif de l'âge paternel avancé sur la capacité à survivre de la progéniture.An analysis of other unpublished genealogical data that I have directed, looking at longevity after 30 years, infant mortality and for the first time, life expectancy at birth, shows no significant effect of the paternal age neither on sons nor on daughters, in terms of their ability to survive overall from birth. In this study, by limiting the effect of the loss of an infant parent, a negative impact of the loss of an infant parent on longevity was demonstrated. I have also studied infant mortality, longevity and life expectancy at birth of cadets and elders from different families; the results from this unique homogenization of the genetic-socio-economic environment confirm the absence of a negative effect of advanced paternal age on the offspring's ability to survive.

De surcroît, une publication antérieure de Gavrilov lui-mêmes (L. A. Gavrilov et al. 1995) ne montre aucune incidence de l'âge paternel à la conception sur la longévité de la descendance féminine.In addition, an earlier publication by Gavrilov themselves (L. A. Gavrilov et al. 1995) does not show any impact from paternal age at conception on the longevity of female offspring.

Une étude sur un autre échantillon ne montre pas cette diminution de la longévité des filles issues d'un père âgé (Rudi G. J. Westendorp & Thomas B.L. Kirkwood 2001.).A study on another sample does not show this decrease in the longevity of daughters from an elderly father (Rudi G. J. Westendorp & Thomas B.L. Kirkwood 2001.).

La capacité à se reproduire, indépendamment de la survie et de la fécondité, a été négligée dans cette analyse regardant la sélection au niveau du transfert intergenerationnel d'information génétique. Cependant, les gènes spécifiquement impliqués dans ces caractéristiques sont évidemment négligeables en rapport au reste de la totalité du génome prise en compte lors de cette analyse.The capacity to reproduce, independently of survival and fertility, was neglected in this analysis looking at selection at the level of intergenerational transfer of genetic information. However, the genes specifically involved in these characteristics are obviously negligible compared to the rest of the entire genome taken into account during this analysis.

Figure 3. Evidence d'une préservation de l'information génétique germinale avec l'âge.Figure 3. Evidence of preservation of germline genetic information with age.

CLONAGE (TRANSFERT NUCLEAIRE)CLONING (NUCLEAR TRANSFER)

Si les conclusions au niveau des différences de taux de mutations entre lignée germinale et lignée somatique s'avèrent pertinentes, les implications au niveau du clonage d'organismes sont claires. Lors d'un transfert nucléaire somatique, l'ADN du noyau comporte les mutations accumulées le temps écoulé entre la séparation embryonnaire entre lignée germinale et somatique et le moment du transfert nucléaire.If the conclusions regarding the differences in mutation rates between germ line and somatic line prove to be relevant, the implications for the cloning of organisms are clear. During a somatic nuclear transfer, the DNA of the nucleus contains the mutations accumulated the time elapsed between the embryonic separation between germ line and somatic and the moment of nuclear transfer.

Le phénotype des clones d'organismes « somatiques » doit être semblable à celui que l'on caractériserait comme vieillissement accéléré, mais pas identique, en partie à cause du fait que certaines lignées sont issues d'un plus grand nombre de divisions embryonnaires que d'autres. Les altérations tissulaires devraient donc être quelque peu différentes au niveau de leur chronologie de celles liées au vieillissement. La perte d'information durant l'embryogenèse ne doit, de surcroît, pas être parfaitement identique qualitativement à celle ayant lieu au cours du processus de vieillissement ; ceci de par une grande différence du comportement cellulaire au niveau du développement en rapport à celui d'un organisme adulte. L'addition de l'âge du clone à celui de l'organisme matrice au moment du transfert nucléaire semble d'autant plus simpliste que les altérations génétiques accumulées lors des divisions embryonnaires sont nombreuses, notamment de par le fait qu'un grand nombre de divisions ont lieu ; ces divisions^' sont d'ailleurs spécialement susceptibles de mener à une grande perte d'information au niveau des clivages durant lesquels des « check points » sont négligés. Le fait d'entamer une embryogenèse avec un matériel génétique altéré doit de surcroît amplifier la perte d'information standard ayant lieu dans un embryon issu des gamètes, ceci proportionnellement aux altérations primordiales. Les prévisions conformes à une préservation germinale et une . négligence somatique de l'intégrité de l'information désoxyribonucléique seraient donc l'observation, chez les clones d'organismes, de phénotypes hétérogènes suivant l'âge de l'organisme matrice, relativement semblables à ce que l'on décrirait comme un vieillissement accéléré, et menant à une diminution de l'espérance de vie proportionnelle à l'âge de l'organisme matrice. The phenotype of clones of "somatic" organisms must be similar to that which one would characterize as accelerated aging, but not identical, in part because of the fact that some lines are from a greater number of embryonic divisions than d 'other. Tissue damage should therefore be somewhat different in chronology from that associated with aging. The loss of information during embryogenesis must not, moreover, be perfectly identical qualitatively to that which takes place during aging process; this due to a great difference in cellular behavior at the developmental level compared to that of an adult organism. The addition of the age of the clone to that of the matrix organism at the time of nuclear transfer seems all the more simplistic as the genetic alterations accumulated during embryonic divisions are numerous, in particular due to the fact that a large number of divisions take place; these ^divisions' are also especially likely to lead to a great loss of information at the divisions in which "checkpoints" are neglected. The fact of initiating embryogenesis with altered genetic material must also amplify the loss of standard information taking place in an embryo derived from gametes, this in proportion to the primordial alterations. The forecasts conform to germline preservation and a. somatic neglect of the integrity of deoxyribonucleic information would therefore be the observation, in clones of organisms, of heterogeneous phenotypes according to the age of the matrix organism, relatively similar to what one would describe as accelerated aging , and leading to a decrease in life expectancy proportional to the age of the matrix organism.

r rr r

SYNDROME PROGEROÏDE : EPIGENETIQUE VERSUS GENETIQUE.PROGEROID SYNDROME: EPIGENETICS VERSUS GENETICS.

Dolly, le célèbre mouton clone, a souffert d'arthrite (Williams N. 2002), et d'obésité. Elle a récemment été euthanasiée, justement suite à des problèmes de santé ressemblant à ceux venant avec l'âge, problèmes qui, chez un individu issu d'une reproduction standard, adviennent plus tardivement dans la vie. Les souris clonées souffrent souvent d'obésité (Inui A. 2003) ; la surcharge pondérale augmente avec l'âge et ces souris ne montrent pas de phénotype post-natal apparentés au LOS.Dolly, the famous clone sheep, suffered from arthritis (Williams N. 2002), and obesity. She was recently euthanized, precisely because of health problems resembling those which come with age, problems which, in an individual resulting from a standard reproduction, occur later in life. Cloned mice often suffer from obesity (Inui A. 2003); the overweight increases with age and these mice do not show a post-natal phenotype related to LOS.

La seule étude comparative (Narumi Ogonuki et al. 2002.) menée sur la durée d'une espérance de vie d'un nombre significatif d'individus, confronte la durée de vie de clones de souris avec celle de souris « contrôle », et montre un flagrant raccourcissement du temps de vie des clones (à 800 jours 83% des clones sont morts contre 27% de contrôles). L'hypothèse des auteurs reste épigénétique, alors qu'à part des placentomégalies, aucune anomalie n'a été détectée sur ces clones, de surcroît les nouveaux nés n'ont pas montré de problèmes épigénétiques (les 7 gènes observés ont montré une méthylation normale) ; le décès prématuré de ces clones est essentiellement lié à des cancers et des pneumonies (Ogura et al. 2002).The only comparative study (Narumi Ogonuki et al. 2002.) conducted on the life expectancy of a significant number of individuals, compares the life of mouse clones with that of "control" mice, and shows a blatant shortening of the life of the clones (at 800 days 83% of the clones died against 27% of controls). The authors' hypothesis remains epigenetic, while apart from placentomegaly, no abnormality was detected on these clones, in addition the newborns did not show epigenetic problems (the 7 genes observed showed normal methylation ); the premature death of these clones is mainly linked to cancers and pneumonia (Ogura et al. 2002).

Il est intéressant de noter que les détériorations physiques de ces clones « normaux », montrant une espérance de vie diminuée, sont assez caractéristiques du vieillissement (cancers, arthrite, diminution des défenses immunitaires) ; il est surprenant, « statistiquement », que des erreurs épigénétiques puissent générer un phénotype si semblable à celui du vieillissement.It is interesting to note that the physical deteriorations of these "normal" clones, showing a reduced life expectancy, are fairly characteristic of aging (cancers, arthritis, reduced immune defenses); it is surprising, "statistically", that epigenetic errors can generate a phenotype so similar to that of aging.

Si la préservation d'information génétique était identique pour lignées somatiques et germinales, le transfert de l'information génétique somatique entre générations devrait, à l'instar de l'ADN germinal, ne pas subir d'augmentation de sélection avec l'âge. Un groupe a réussi à cloner des souris sur plusieurs générations (Wakayama et al. 2000) ; ce résultat a été utilisé comme un argument allant dans la direction d'une absence de vieillissement accéléré. Pourtant leur taux de réussite diminue dramatiquement à chaque génération de souris pour finalement disparaître : les taux de réussite diminuèrent d'un facteur supérieur à 10 pour la 5 ^roe génération de souris clonées, et il n'y eut pas de 6 génération... On a ici indiscutablement observé une sélection plus discriminative avec l'âge de l'ADN somatique, ceci malgré que les souris aient été clonées à partir d'individus jeunes. Cette discrimination s'est vérifiée dans une étude qui mesurait les taux de réussite en fonction de l'âge du donneur nucléaire. Cette étude conclut que « la conformation » épigénétique des fibroblastes, devant changer avec l'âge, était la cause de cette diminution du succès avec l'âge (d'un facteur 2.5 pour des lapins jeunes/vieux) (Galat V. et al. 2002).If the preservation of genetic information was identical for somatic and germinal lines, the transfer of somatic genetic information between generations should, like germinal DNA, not undergo an increase in selection with age. One group has successfully cloned mice over several generations (Wakayama et al. 2000); this result was used as an argument in the direction of an absence of accelerated aging. However, their success rate decreases dramatically with each generation of mice and finally disappears: the success rates decreased by a factor of more than 10 for the 5th ^roe generation of cloned mice, and there was no 6 generation ... There was undoubtedly observed a more discriminatory selection with age of somatic DNA, this despite the fact that the mice were cloned from young individuals. This discrimination was verified in a study which measured success rates according to the age of the nuclear donor. This study concludes that the epigenetic "conformation" of fibroblasts, which must change with age, was the cause of this decrease in success with age (by a factor of 2.5 for young / old rabbits) (Galat V. et al . 2002).

De surcroît, le fait que les taux de réussite diminuent dramatiquement en fonction des générations ne peut être lié qu'à une accumulation de dommages somatiques et non à des facteurs épigénétiques, dont les défauts ne peuvent s'accumuler entre les générations, comme lors de la reprogrammation, une sorte de « remise à zéro » est nécessaire pour la différentiation de toutes les lignées cellulaires de chaque copie successive. Cette diminution des taux de réussite ne peut être que le résultat d'une accumulation de « quelque chose », et ce « quelque chose » ne peut être rien d'autre que les détériorations de séquences d'ADN somatiques, comme à chaque fois une reprogrammation quasiment parfaite permet la génération de tous les types cellulaires fonctionnels. Cet effacement s'il n'est pas parfait (hypothèse peu probable comme la génération de tous les types cellulaires nécessite une grande précision), sera légèrement différent à chaque reprise, mais aucune accumulation de cette imprécision n'a lieu d'exister ; même si les caractéristiques épigénétiques d'un fibroblaste étaient altérées, les fibroblastes n'auraient aucune raison de moins bien se dédifférencier qu'un fibroblaste, dont les caractéristiques épigénétiques sont adéquates à un fonctionnement idéal, mais de toute manière inapproprié à la dédifférenciation, donc au clonage d'organismes.In addition, the fact that success rates decrease dramatically between generations can only be linked to an accumulation of somatic damage and not to epigenetic factors, the defects of which cannot accumulate between generations, as in reprogramming, a kind of "reset" is necessary for the differentiation of all cell lines of each successive copy. This decrease in success rates can only be the result of an accumulation of "something", and this "something" can be nothing other than the deterioration of somatic DNA sequences, as each time a Nearly perfect reprogramming allows generation of all functional cell types. This erasure, if it is not perfect (unlikely hypothesis as the generation of all cell types requires great precision), will be slightly different each time, but no accumulation of this imprecision takes place; even if the epigenetic characteristics of a fibroblast were altered, fibroblasts would have no reason less to dedifferentiate than a fibroblast, whose epigenetic characteristics are adequate for an ideal functioning, but in any case inappropriate for dedifferentiation, therefore cloning of organisms.

Les changements épigénétiques liés à l'âge sont infimes en rapport aux mises en place «définitives » qui ont lieu au sein de l'embryon ; pourtant les taux de réussite changent bien plus avec l'âge de l'individu qu'avec le stade embryonnaire (Galat V. et al. 2002) (rapport de 3 : d'un facteur 2.5 pour des lapins jeunes / vieux, contre 0.75 pour les stades morulas / fibroblaste foetal). Les détériorations génétiques liées à l'âge de l'organisme sont donc incomparablement plus impliquées dans cette sélection discriminative que les facteurs épigénétiques.The age-related epigenetic changes are tiny compared to the “final” implantations that take place within the embryo; however success rates change much more with the age of the individual than with the embryonic stage (Galat V. et al. 2002) (ratio of 3: by a factor of 2.5 for young / old rabbits, against 0.75 for fetal morula / fibroblast stages). Genetic deterioration linked to the age of the organism is therefore incomparably more involved in this discriminatory selection than epigenetic factors.

(L' implication mineure des télomères dans le syndrome progéroïde des clones est envisageable, dans la mesure ou la télomérase fait partie de cet ensemble d'outils de maintien de l'information génétique germinale absente et/ou diminuée au sein des cellules somatiques ; cependant, comme je l'ai précédemment stipulé, la variabilité de la longueur des télomères des clones suggère une compensation ou un allongement aléatoire des télomères dans l'embryon.)(The minor involvement of telomeres in the progeroid clone syndrome is possible, since telomerase is part of this set of tools for maintaining germline genetic information absent and / or reduced in somatic cells; however , as I previously stated, the variability in the length of the telomeres of the clones suggests a compensation or a random lengthening of the telomeres in the embryo.)

SÉLECTION NATURELLE AU NIVEAU DU TRANSFERT INTERGENERATIONNEL D'INFORMATION GÉNÉTIQUENATURAL SELECTION AT THE LEVEL OF INTERGENERATIONAL GENETIC INFORMATION TRANSFER

SOMATIQUE VERSUS GERMINALESOMATIC VERSUS GERMINALE

La sélection discriminative du transfert de l'information génétique au travers des générations augmente avec l'âge paternel lors du clonage où l'information génétique transférée est somatique, alors qu'elle reste constante lors de la fécondation in vitro où l'information génétique transférée est germinale.The discriminative selection of the transfer of genetic information across generations increases with paternal age during cloning where the genetic information transferred is somatic, while it remains constant during in vitro fertilization where the genetic information transferred is germinal.

Figure 4. Préservation génétique germinale versus somatiqueFigure 4. Germline versus somatic genetic preservation

CONTRE-ARGUMENTSCOUNTER ARGUMENTS

Des arguments vont dans le sens de taux de mutations somatiques et germinaux identiques, soit, les estimations des mutations de novo dont les cancers des cellules germinales et les estimations de mutations somatiques.Arguments go in the direction of identical somatic and germinal mutation rates, that is, estimates of de novo mutations including germ cell cancers and estimates of somatic mutations.

L'approche de la quantification de l'éventuelle discrimination sélective lors du passage de l'information génétique de générations en générations, regarde la survie de l'individu et gagne en significativité en rapport aux mesures de mutations de novo sur un ou quelques gènes car elle tient compte de l'interaction de plus de 30 000 gènes.The approach of quantifying possible selective discrimination during the passage of genetic information from generation to generation, looks at the survival of the individual and gains in significance in relation to de novo mutation measurements on one or a few genes because it takes into account the interaction of more than 30,000 genes.

-De surcroît, comme ces taux sont faibles, des biais de séquençages peuvent encore avoir lieu.-In addition, as these rates are low, sequencing biases may still occur.

(Par ailleurs, dans le cadre de ces mutations de novo : soit l'individu malade de la première génération ne donne pas naissance à une génération suivante de par le fait qu'il est stérile, qu'il n'atteint pas l'âge de la maturité, ou plus globalement, que sa fitness soit diminuée. Les mutations ont très bien pu dans ce cas de figure s'effectuer dans des lignées non germinales, au sein d'une population de cellules précise, qui spécifiquement expriment le gène altéré, suffisamment tôt dans l'embryon, pour atteindre un nombre significatif de cellules, et donner un phénotype visible. soit l'individu de la première génération donne lieu à une descendance atteinte ; dans ce cas des mutations au sein de cellules haploïdes venant des spermatogonies A, ou au sein de cellules embryonnaires destinées à devenir des cellules germinales et n'ayant pas encore le pattern d'expression des cellules germinale, ont très bien pu s'effectuer.(In addition, in the context of these de novo mutations: either the sick individual of the first generation does not give birth to a next generation due to the fact that it is sterile, that it does not reach age maturity, or more generally, that his fitness is reduced. The mutations could very well have been carried out in non-germinal lines, within a precise population of cells, which specifically express the altered gene , sufficiently early in the embryo, to reach a significant number of cells, and to give a visible phenotype. or the individual of the first generation gives rise to an affected progeny; in this case mutations within haploid cells coming from spermatogonia A, or within embryonic cells intended to become germ cells and not yet having the pattern of expression of germ cells, could very well have been carried out.

En outre, les mutations dans les types cellulaires conservant l'information le temps qu'un processus de transmission débute, soit les spermatogonies A et les ovocytes primaires bloqués en métaphase 1, doivent être bien moins touchés par les mutations de novo et les cancers des cellules germinales que ce que les prévisions laissent supposer. Car il serait plus que probable, d'un point de vue statistique et évolutif, que le souci de sélection au niveau du maintien de l'intégrité de l'information génétique soit moindre au sein des états cellulaires constituant le véhicule de l'information voyageant de cellules souches germinales en cellules souches germinales de générations en générations, que dans les cellules souches germinales elles-mêmes; comme l'information y passe bien moins de temps. Certaines estimations de taux de mutations vont dans ce sens, en avançant que les mutations embryonnaires sont très nombreuses, en partie à cause de l'absence de contrôle sur le cycle cellulaire lors des clivages (A.H. Handysyde. 1997.). Le résultat d'une étude récente, montrant un bien trop faible taux de mutations dans des spermatozoïdes, au niveau du gène responsable de Pachondroplasie en rapport à l'incidence de la maladie (Tiemann - Boege I. 2002), suggère aussi une implication embryonnaire des mutations de novo.In addition, mutations in the cell types that hold information for as long as a transmission process begins, i.e. spermatogonia A and primary oocytes blocked in metaphase 1, must be much less affected by de novo mutations and cancer germ cells than expected. Because it would be more than probable, from a statistical and evolutionary point of view, that the concern for selection at the level of the maintenance of the integrity of genetic information would be less within the cellular states constituting the vehicle of traveling information from germinal stem cells to germ stem cells from generation to generation, than in the germ stem cells themselves; as information spends much less time on it. Some estimates of mutation rates go in this direction, arguing that embryonic mutations are very numerous, partly because of the lack of control over the cell cycle during cleavages (A.H. Handysyde. 1997.). The result of a recent study, showing a far too low rate of mutations in spermatozoa, at the level of the gene responsible for Pachondroplasia in relation to the incidence of the disease (Tiemann - Boege I. 2002), also suggests an embryonic implication de novo mutations.

INTERPRÉTATION SPERMATOGONIALE.SPERMATOGONIAL INTERPRETATION.

Les mesures de mutations directement effectuées sur les cellules germinales sont étonnamment rares. Leur impact sur « la current opinion » est très faible en rapport à celui des études sur les mutations de novo, beaucoup plus nombreuses. Apparemment aucune donnée directe corrélant ovocyte primaire, âge, mutations et cellules somatiques ne semble être disponible. Au niveau des cellules germinales mâles, des estimations de taux de mutation ont été faites sur des homogénats de testicules, comprenant une faible proportion de cellules somatiques (Sertolly) et des cellules germinales spermatogéniques appartenant à tous les stades. Ces mesures sur des « mixed germ cells » (MGC) (comprenant des cellules somatiques), sont légèrement controversées : deux études montrent des taux de mutations « germinales » similaires aux taux somatiques ((Nishino H. et al. 1996) ; (Douglas G. R. et al. 1994)), d'autres, dont la plus récente, montrent des taux significativement plus faibles des MGC en rapport aux cellules somatiques ((Kohler S.W. et al. 1991) ; (Christi A. et al. 1998)).Measurements of mutations directly made on germ cells are surprisingly rare. Their impact on "current opinion" is very low compared to that of the studies on de novo mutations, which are much more numerous. Apparently no direct data correlating primary oocyte, age, mutations and somatic cells seems to be available. At the level of male germ cells, mutation rate estimates have been made on testicular homogenates, comprising a small proportion of cells somatic (Sertolly) and spermatogenic germ cells belonging to all stages. These measurements on “mixed germ cells” (including somatic cells) are slightly controversial: two studies show rates of “germ” mutations similar to somatic levels ((Nishino H. et al. 1996); (Douglas GR et al. 1994)), others, including the most recent, show significantly lower rates of MGC in relation to somatic cells ((Kohler SW et al. 1991); (Christi A. et al. 1998)) .

Cette dernière étude (Christi A. et al. 1998) a aussi observé le taux de mutations spécifique à chaque type de cellules spermatogoniales de souris transgéniques Lac I ; parmi les résultats qu'elle présente, elle conclut :This last study (Christi A. et al. 1998) also observed the rate of mutations specific to each type of spermatogonal cells of transgenic Lac I mice; among the results it presents, it concludes:

1. un taux de mutation plus faible de mutations dans les MGC en rapport aux cellules somatiques (facteur 10).1. a lower mutation rate of mutations in MGC compared to somatic cells (factor 10).

2. un taux de mutations plus grand pour les spermatogonies A que pour les autres cellules germinales.2. a higher mutation rate for A spermatogonia than for other germ cells.

Cette dernière étude semble unique dans son approche et est d'ailleurs utilisée par un article publié en 2004 dans « Science of Aging Knowlege and Environnement. » (Neeper S. 2004) comme principal argument moléculaire pour l'impact négatif de l'âge paternel avancé sur la progéniture.This last study seems unique in its approach and is also used by an article published in 2004 in “Science of Aging Knowlege and Environment. (Neeper S. 2004) as the main molecular argument for the negative impact of advanced paternal age on offspring.

Comme les cellules germinales transportent l'information de générations en générations, malgré la « current opinion » supportant qu'une sélection génétique négative des « ratés » a lieu, la possibilité d'une préservation germinale de l'informations génétique travaillant en parallèle avec la sélection est parfois envisagée. Cette hypothèse était celle des auteurs (Christi A. et al. 1998) , supposant originellement que la pression de sélection naturelle sur la fidélité de l'ADN devrait plutôt s'exercer sur les cellules souches germinales (spermatogonies A) que sur les autres cellules de la spermatogenèse ; ils ont d'ailleurs signalé avoir été surpris de leurs résultats.As germ cells carry information from generation to generation, despite the "current opinion" that negative genetic selection of "failures" takes place, the possibility of germline preservation of genetic information working in parallel with selection is sometimes considered. This hypothesis was that of the authors (Christi A. et al. 1998), originally assuming that the pressure of natural selection on DNA fidelity should be exerted more on germinal stem cells (spermatogonia A) than on other cells spermatogenesis; they also reported being surprised at their results.

La deuxième conclusion majeure de cette étude, soit « un taux de mutations plus grand pour les spermatogonies A que pour les autres cellules germinales » ne peut être juste, comme il est parfaitement impossible que les cellules de la spermatogenèse en aval des spermatogonies puissent avoir moins de mutations que ces dernières. C'est bien l'addition de nouvelles mutations aux mutations ayant eu lieu dans les spermatogonies A qui est observée lors de cette expérience ; pour obtenir un taux de mutation plus faible dans ces cellules, il faudrait cultiver chaque type cellulaire «bloqué » au stade de la spermatogenèse qu'il représente, et mesurer l'évolution des mutations en fonction du temps. Une explication de ce résultat surprenant pourrait être la confusion sur le type de spermatogonie isolé.The second major conclusion of this study, "a higher mutation rate for A spermatogonia than for other germ cells" cannot be correct, as it is perfectly impossible that spermatogenesis cells downstream from spermatogonia can have less of mutations than these. It is indeed the addition of new mutations to the mutations that have taken place in spermatogonia A which is observed during this experiment; to obtain a lower mutation rate in these cells, it would be necessary to cultivate each “blocked” cell type at the stage of spermatogenesis which it represents, and to measure the evolution of the mutations as a function of time. One explanation for this surprising finding could be the confusion over the type of spermatogonia isolated.

Les conclusions tirées de cette publication ne peuvent par conséquent pas être prises en considération.The conclusions drawn from this publication cannot therefore be taken into account.

Or, les conclusions du paragraphe précédent sur la sélection au niveau des états cellulaires constituant le véhicule de l'information voyageant de cellules souches germinales en cellules souches germinales de générations en génération suggèrent un plus faible taux de mutations pour les spermatogonies A ; donc ces cellules devraient être responsables du faible taux de mutation dans les MGC. Le taux de mutations des spermatogonies A devrait alors logiquement être très inférieur à la moyenne obtenue avec les MGC, moyenne déjà, selon (Christi A. et al. 1998), près de 10 fois inférieure à la moyenne des taux des cellules somatiques.However, the conclusions of the preceding paragraph on the selection at the level of the cellular states constituting the vehicle of information traveling from germinal stem cells to germinal stem cells from generation to generation suggest a lower rate of mutations for A spermatogonia; therefore these cells should be responsible for the low mutation rate in MGC. The mutation rate of A spermatogonia should then logically be much lower than the average obtained with MGC, average already, according to (Christi A. et al. 1998), almost 10 times lower than the average of the somatic cell levels.

FAITS EXPÉRIMENTAUX DIRECTSDIRECT EXPERIMENTAL FACTS

Certains récents faits expérimentaux directs vont dans le sens d'une surprotection de l'information dans les cellules germinales. Une expérience observant l'expression du gène rapporteur lacZ au sein d'extraits de tabules séminifères (Sandra L. Martin et al. 2001.), suggère que ces dernières ne montrent pas d'augmentation de transposition, souvent considérée comme une des causes primaires du vieillissement ((Murray V. 1990.) ; (Jan Vijg & Martijn E. T. Dollé 2002)), ni de mutations, avec l'âge. Une grande activité de systèmes d'excision- réparation de bases (BER) a aussi été détectée au sein d'extraits nucléaires de cellules germinales spermatogoniales (Intano GW et al. 2001.).Certain recent direct experimental facts point in the direction of an overprotection of information in germ cells. An experiment observing the expression of the lacZ reporter gene in seminiferous tabule extracts (Sandra L. Martin et al. 2001.) suggests that the latter do not show an increase in transposition, often considered as one of the primary causes. of aging ((Murray V. 1990.); (Jan Vijg & Martijn ET Dollé 2002)), nor of mutations, with age. A large activity of basic excision-repair systems (BER) has also been detected in nuclear extracts of spermatogonal germ cells (Intano GW et al. 2001.).

Les conclusions au niveau de l'implication de l'ADN nucléaire dans le phénomène du vieillissement et au niveau de la préservation d'information génétique germinale, découlant des nouvelles approches du clonage et du transfert inter-générationel d'information germinale en fonction de l'âge paternel, démontrent, dans le cadre du clonage, la nécessité d'utiliser pour le clonage de mammifères, une méthode prenant comme donneur nucléaire les cellules germinales post-natales. Cette technique permettra d'éviter, chez les mammifères clones, un syndrome progéroïde intrinsèque aux détériorations de l'information génétique somatique liées à l'âge.Conclusions regarding the involvement of nuclear DNA in the phenomenon of aging and at the level of preservation of germinal genetic information, arising from new approaches to cloning and the inter-generational transfer of germinal information as a function of paternal age, demonstrate, in the context of cloning, the need to use for the cloning of mammals, a method taking as nuclear donor the post-natal germ cells. This technique will avoid, in cloned mammals, a progeroid syndrome intrinsic to deterioration of somatic genetic information linked to age.

SOURCE DU VIEILLISSEMENT, IMPLICATION AU NIVEAU DU CLONAGESOURCE OF AGING, INVOLVEMENT IN CLONING

L'opinion générale semble s'accorder sur le fait que le phénomène à la source du vieillissement serait une détérioration des mitochondries, soumises au stress des radicaux libres qu'elles génèrent. Leur disfonctionnement mènerait à la diffusion de radicaux libres dans la cellule, ces radicaux s'attaqueraient aux structures cellulaires, dont l'ADN et les protéines, provoquant après un certain temps, des dysfonctionnements atteignant tous les niveaux structuraux et fonctionnels de l'organisme.The general opinion seems to agree on the fact that the phenomenon at the source of aging would be a deterioration of the mitochondria, subjected to the stress of the free radicals which they generate. Their dysfunction would lead to the diffusion of free radicals in the cell, these radicals would attack the cellular structures, including DNA and proteins, causing after a certain time, dysfunctions reaching all the structural and functional levels of the organism.

Parallèlement est prise en considération une détérioration de l'ADN, indépendamment de la génération des radicaux libres par les mitochondries, détérioration que l'on ne peut nier. Ces détériorations auraient des sources diverses dont principalement : un raccourcissement des chromosomes à chaque division cellulaire, que l'on imputerait à une absence d'expression de télomérase dans les cellules somatiques humaines. diverses mutations liées à des erreurs de réplication ou à divers mutagènes, menant à une diminution de la réparation de l'ADN, qui est toujours considérée comme un facteur parmi d'autres situés à la source du vieillissement.At the same time, a deterioration of the DNA is taken into account, independently of the generation of free radicals by the mitochondria, a deterioration which cannot be denied. These deteriorations would have various sources including mainly: a shortening of the chromosomes with each cell division, which one would attribute to an absence of expression of telomerase in human somatic cells. various mutations linked to replication errors or various mutagens, leading to a decrease in DNA repair, which is always considered as one factor among others located at the source of aging.

Dans ce cadre, des changements au niveau de la₍ production d'hormones sont parfois considérés comme parallèles voire prépondérants (notamment dans des théories neuroendocrines du vieillissement) et non comme une conséquence des causes précédentes.In this context, changes in the level of ₍ hormone production are sometimes considered to be parallel or even preponderant (especially in neuroendocrine theories of aging) and not as a consequence of the previous causes.

NOUVELLE APPROCHE THÉORIQUE : ADN NUCLÉAIRE EN AMONT DES MITOCHONDRIES.NEW THEORETICAL APPROACH: NUCLEAR DNA UPSTREAM OF MITOCHONDRIA.

Il est maintenant établi que l'organisme est constitué d'organes et de tissus, constitués de structures moléculaires et animés par des réactions biochimiques. La qualité de ces structures et de ces réactions déterminent donc l'état, et à fortiori l'âge de l'organisme. Ces molécules sont entièrement déterminées par les protéines, indépendamment d'apports nutritionnels et structuraux extérieurs.It is now established that the organism is made up of organs and tissues, made up of molecular structures and animated by biochemical reactions. The quality of these structures and of these reactions therefore determine the state, and a fortiori the age of the organism. These molecules are entirely determined by proteins, regardless of external nutritional and structural contributions.

Hormis les altérations intrinsèques - à l'augmentation du stress ambiant, lié à l'accroissement du taux de radicaux libres dans les milieux intra- et inter- cellulaires - au temps de vie des protéines - et celles liées à l'accumulation de déchets toxiques, il est légitime, prenant en considération les récents progrès de la biologie moléculaire, d'émettre la supposition que lors de l'altération d'une protéine, une altération, directe ou indirecte de l'ADN a préalablement eu lieu.Apart from the intrinsic alterations - to the increase in ambient stress, linked to the increase in the rate of free radicals in the intra- and intercellular environments - to the lifetime of proteins - and those linked to the accumulation of toxic waste , it is legitimate, taking into account recent progress in molecular biology, to make the assumption that during the alteration of a protein, a direct or indirect alteration of DNA has previously taken place.

(Une protéine issue d'une séquence d'ADN qui n'a pas été modifiée peut se révéler inactive, suite à des interactions (transcriptionelles post- transcriptionelles, au niveau de l'épissage, post-traductionelles lorsqu'elle n'est qu'un précurseur, ou encore plus tard dans le cadre de son activité en tant que protéine mature) inopportunes (quantitativement ou qualitativement) avec des protéines, des ARNs ou des complexes ARN- protéines, qui eux seront altérés dans leurs fonctions, ceci suite à des mutations dans l'ADN ou suite à une interaction fallacieuse avec des protéines ou des ARNs... dont les défauts découleront à la base de manière directe ou indirecte, de séquences d'ADN mutées.)(A protein resulting from a DNA sequence which has not been modified can prove to be inactive, following interactions (post-transcriptional transcriptional, at the level of splicing, post-translational when it is only 'a precursor, or even later in the context of its activity as a mature protein) inappropriate (quantitatively or qualitatively) with proteins, RNAs or RNA-protein complexes, which will be altered in their functions, this following mutations in DNA or following a fallacious interaction with proteins or RNAs ... the defects of which will arise, directly or indirectly, from mutated DNA sequences.)

Des altérations de protéines ou d'ARNs, mènent à leur remplacement par le biais de rétroactions positives, médiées par des protéines, codées par l'ADN.Alterations of proteins or RNAs lead to their replacement by means of positive feedbacks, mediated by proteins, encoded by DNA.

L'accumulation de déchets devrait être compensée par leur élimination que certains faits expérimentaux suggèrent. (Des mutations de gènes, hypothétiquement impliqués dans cette élimination, semblent effectivement induire l'accumulation de lipofuscines (Radu RA. 2003)). Un entassement de déchets viendrait d'une accumulation d'erreurs dans ces gènes, ou de défauts dans leur expression, accumulation ou défauts liés à l'âge. Aucune accumulation de lipofuscines n'a apparemment été décrite dans les ovules, dont l'ADN (y compris les gènes impliqués dans l'élimination des lipofuscines) est préservé. Il s'agit ensuite de tenter de déterminer si l'augmentation du stress environnant, essentiellement généré par les radicaux libres provenant des mitochondries, vient, comme le supporte la « current opinion », en amont du déclenchement du vieillissement. L'ADN mitochondrial code pour seulement 13 polypeptides, 2 rRNAs et 22 tRNAs. Tous les polypeptides générés par l'ADNmt sont des sous-unités de la machinerie énergétique. Les gènes codant pour des enzymes anti-oxydantes, pour divers facteurs liés à un souci de contrôle du bon fonctionnement des mitochondries, sont exprimés dans l'ADN nucléaire. L'absence d'un vieillissement significatif des cellules germinales avec l'âge viendrait donc non pas d'un comportement mitochondrial, constant au niveau des gènes exprimés, mais plutôt d'un comportement nucléaire. Lors des fécondations in vitro dont 1TCSI, ROSI et ROSNI, aucun vieillissement accéléré n'a été rapporté - contrairement au cas du clonage, Pourtant aucune sélection différentielle d'ovules n'a lieu entre ces deux techniques. L'hérédité mitochondriale est donc la même dans les deux cas. Le vieillissement, spécifiquement lié au clonage ne doit donc pas être lié à l'état de l'ADN du receveur, soit l'ADN mitochondrial, mais à celui du donneur, nucléaire ; il s'ensuit que la qualité de l'information portée par l'ADN nucléaire doit à elle seule déterminer la vieillesse prématurée des clones.The accumulation of waste should be compensated for by their elimination, which certain experimental facts suggest. (Gene mutations, hypothetically implicated in this elimination, seem to actually induce the accumulation of lipofuscins (Radu RA. 2003)). A heap of waste would come from an accumulation of errors in these genes, or defects in their expression, accumulation or defects linked to age. No accumulation of lipofuscins has apparently been described in the ova, whose DNA (including the genes involved in the elimination of lipofuscins) is preserved. The next step is to try to determine whether the increase in surrounding stress, essentially generated by free radicals from the mitochondria, comes, as the "current opinion" supports, before the onset of aging. Mitochondrial DNA codes for only 13 polypeptides, 2 rRNAs and 22 tRNAs. All polypeptides generated by mtDNA are subunits of the energy machinery. The genes coding for antioxidant enzymes, for various factors linked to a concern for controlling the proper functioning of the mitochondria, are expressed in nuclear DNA. The absence of a significant aging of the germ cells with age would therefore come not from mitochondrial behavior, constant at the level of the genes expressed, but rather from nuclear behavior. During in vitro fertilizations including 1TCSI, ROSI and ROSNI, no accelerated aging has been reported - unlike the case of cloning, yet no differential selection of eggs takes place between these two techniques. The mitochondrial inheritance is therefore the same in both cases. Aging, specifically linked to cloning, must therefore not be linked to the state of the recipient's DNA, ie mitochondrial DNA, but to that of the donor, nuclear; it follows that the quality of the information carried by nuclear DNA alone must determine the premature old age of the clones.

Le vieillissement « mitochondrial » doit donc venir en aval du vieillissement nucléaire ; le mécanisme de maintien ou de renouvellement du matériel génétique des mitochondries devrait être le suivant. Le taux élevé de mutations dans l'ADN mitochondrial, à l'instar de l'ancêtre procaryote, est justifié par le besoin d'adaptation continuel au changement de l'environnement ; une forme de sélection naturelle doit avoir lieu dans le cytoplasme, sur les mitochondries. L'ubiquitination et l'autophagie de ces dernières, pouvant être un mécanisme impliqué dans cette sélection, a déjà été décrit dans plusieurs publications ((Steven P. Elmore et al. 2001.) ; (Peter Sutovsky et al. 2000)).“Mitochondrial” aging must therefore come downstream from nuclear aging; the mechanism of maintenance or renewal of the genetic material of the mitochondria should be as follows. The high rate of mutations in mitochondrial DNA, like that of the prokaryotic ancestor, is justified by the need for continual adaptation to environmental change; a form of natural selection must take place in the cytoplasm, on the mitochondria. The ubiquitination and autophagy of the latter, which may be a mechanism involved in this selection, has already been described in several publications ((Steven P. Elmore et al. 2001.); (Peter Sutovsky et al. 2000)).

Il est établi que le nombre de mutations dans l'ADN augmente avec l'âge, il semble le faire exponentiellement, comme l'un de ces effets directs qu'est le cancer dont l'incidence croît exponentiellement avec l'âge.It is established that the number of mutations in DNA increases with age, it seems to do so exponentially, as one of these direct effects which is cancer whose incidence increases exponentially with age.

Le vieillissement devrait alors être assimilé à une perte progressive d'information désoxyribonucléique, liée à un comportement nucléaire somatique particulier - perte s'auto catalysant, de manière à croître « pseudo exponentiellement » jusqu'à ce que l'ADN ne puisse plus assumer la tâche qui lui incombe de remplir, soit celle de maintenir en vie l'organisme dont il définit le plan d'organisation et de fonctionnement.Aging should then be assimilated to a progressive loss of deoxyribonucleic information, linked to a particular somatic nuclear behavior - loss self-catalyzing, so as to grow "pseudo exponentially" until the DNA can no longer assume the the task which falls to him to fulfill, that is to keep alive the organism of which he defines the plan of organization and operation.

PLÉIOTROPIE RÉVISÉEREVISED PLEIOTROPY

Il n'est pas nécessaire de survivre plus longtemps que le temps requis pour transmettre son information de manière efficace à la génération suivante. La sélection sur la préservation du corps somatique est très restreinte, et une perte d'information désoxyribonucléique nucléaire doit avoir lieu. En tenant compte des arguments précédents, cette perte ne doit pas avoir lieu au sein des cellules germinales d'une manière significative, comme ces dernières doivent conserver leur information au travers des générations. Une nouvelle analyse du vieillissement s'impose et constitue une forme d'extension de la pléiotropie (non-antagoniste), et postule qu'il n'y a pas de sélection somatique de gènes agissant tardivement. La pléiotropie est néanmoins complétée par divers faits et une approche plus spécifique notamment au niveau de la définition de ce que sont ces gènes (ce sont eux qui maintiennent l'intégrité de l'ADN uniquement) et m'amène à proposer une nouvelle définition du vieillissement qui serait le résultat du désintéressement de la sélection naturelle vis-à-vis de l'expression et/ou la surexpression d'outils de préservation de l'intégrité de l'ADN au sein des cellules somatiques, outils qui ont été sélectionnés pour être exprimés et/ou surexprimés au sein des cellules germinales.There is no need to survive longer than the time required to effectively transmit information to the next generation. The selection on the preservation of the somatic body is very limited, and a nuclear deoxyribonucleic information loss must occur. Taking into account the previous arguments, this loss should not take place within germ cells in a significant way, as the latter must keep their information through generations. A new analysis of aging is necessary and constitutes a form of extension of pleiotropy (non-antagonist), and postulates that there is no somatic selection of genes acting late. Pleiotropy is nevertheless supplemented by various facts and a more specific approach, in particular in terms of the definition of what these genes are (they are the ones that maintain the integrity of DNA only) and leads me to propose a new definition of aging which would be the result of the disinterestedness of natural selection with regard to the expression and / or overexpression of tools for preserving the integrity of DNA within somatic cells, tools which have been selected for be expressed and / or overexpressed within germ cells.

Il est donc impératif, dans le cadre du clonage post-natal d'organismes mammifères, d'utiliser les cellules germinales comme donneur nucléaire afin d'éviter un syndrome progéroïde lié aux détériorations somatiques.It is therefore imperative, in the context of postnatal cloning of mammalian organisms, to use germ cells as a nuclear donor in order to avoid a progeroid syndrome linked to somatic deterioration.

Figure 5. Le clonage germinal est la seule issue du clonage post-natal de mammifères. Figure 5. Germinal cloning is the only outcome of post-natal cloning of mammals.

DEMARCHESTEPS

Méthode utilisant comme donneur nucléaire, lors du clonage post-natal d'organismes mammifères (clonage reproductif et non reproductif), de cellules germinales post-natales pour tout transfert nucléaire (ou cellulaire) d'ADN dans un ovocyte énucléé. Method using as nuclear donor, during post-natal cloning of mammalian organisms (reproductive and non-reproductive cloning), post-natal germ cells for any nuclear (or cellular) transfer of DNA into an enucleated oocyte.

REFERENCESREFERENCES

Barnes CJ. Covington BW. Cameron IL. Lee M. Effect of aging on spontaneous and induced mouse testicular germ cell apoptosis. Aging (Milano). 1998 Dec; 10(6):497-501.Barnes CJ. Covington BW. Cameron IL. Lee M. Effect of aging on spontaneous and induced mouse testicular germ cell apoptosis. Aging (Milano). 1998 Dec; 10 (6): 497-501.

Boiani M. Eckardt S. Scholer H. R. & McLaughlin K. J. Oct4 distribution and level in mouse clones: conséquences for pluripotency. Gènes Dev. 16, pp. 1209-1219 (2002).Boiani M. Eckardt S. Scholer H. R. & McLaughlin K. J. Oct4 distribution and level in mouse clones: consequences for pluripotency. Genes Dev. 16, pp. 1209-1219 (2002).

Cibelli P, Stice SL, Golueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, deLeon FAP, Robl JM. Cloned transgenic calves produced from non-quiescent fetal fibroblasts. Science 1998; 280:1256-1258.Cibelli P, Stice SL, Golueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, deLeon FAP, Robl JM. Cloned transgenic calves produced from non-quiescent fetal fibroblasts. Science 1998; 280: 1256-1258.

Christi A. Walter Gabriel W. Intano J. McCarrey R. Mutation frequency déclines during spermatogenesis in young mice but increases in old mice, C. Alex McMahan, and Ronald B. Walter Genetics. Vol. 95, Issue 17, pp. 10015- 10019, August 18, 1998.Christi A. Walter Gabriel W. Intano J. McCarrey R. Mutation frequency declines during spermatogenesis in young mice but increases in old mice, C. Alex McMahan, and Ronald B. Walter Genetics. Flight. 95, Issue 17, pp. 10015-10019, August 18, 1998.

DeBaun M. R. Niemitz E. L. & Feinberg A. P. Association of in vitro fertilization with Beckwith-Wiedemann syndrome and epigenetic altérations of LIT1 and H19. Am. J. Hum. Genêt. 72, pp. 156-160.DeBaun M. R. Niemitz E. L. & Feinberg A. P. Association of in vitro fertilization with Beckwith-Wiedemann syndrome and epigenetic alterations of LIT1 and H19. Am. J. Hum. Broom. 72, pp. 156-160.

Douglas G. R. Gingerich J. D. Gossen J. A. & Bartlett, S. A. (1994) Mutagenesis 9, pp. 451-458.Douglas G. R. Gingerich J. D. Gossen J. A. & Bartlett, S. A. (1994) Mutagenesis 9, pp. 451-458.

Galat V, Lagutina I, Mezina M, Prokofiev MI, Zakhartchenko V. Effect of donor cell âge on the efficiency of nuclear transfer in rabbits Reprod. Biomed jan 2002. 4.(1). 32-7.Galat V, Lagutina I, Mezina M, Prokofiev MI, Zakhartchenko V. Effect of donor cell age on the efficiency of nuclear transfer in rabbits Reprod. Biomed Jan 2002. 4. (1). 32-7.

Gavrilov L.A, Gavrilova N.S. Biodemographic studies of familial déterminants of human longevity. Popultion: An English sélection 13 1 2001, 197-222.Gavrilov L.A, Gavrilova N.S. Biodemographic studies of familial determinants of human longevity. Popultion: An English selection 13 1 2001, 197-222.

Gavrilov L.A, Gavrilova N.S. Parental âge at conception and offspring longevity. Reviews in clinical longevity, 7. p 5- 12.Gavrilov L.A, Gavrilova N.S. Parental age at conception and offspring longevity. Reviews in clinical longevity, 7. p 5- 12.

Gavrilov L.A, Gavrilova N.S. When should fatherhood stop. Science. 277, p 17-18.Gavrilov L.A, Gavrilova N.S. When should fatherhood stop. Science. 277, p 17-18.

L. A. Gavrilov et al. Paternal âge and the lifespan of descendants. Dokaldy biological sciences. Vol 341, 1995, pp 196- 198.L. A. Gavrilov et al. Paternal age and the lifespan of descendants. Dokaldy biological sciences. Vol 341, 1995, pp 196-198.

Y. M. Han, Y. K. Kang, D. B. Koo and K. K. Lee. Nuclear reprogramming of cloned embryos produced in vitro Theriogenology Volume 59, Issue 1 , 1 January 2003, Pages 33-44.Y. M. Han, Y. K. Kang, D. B. Koo and K. K. Lee. Nuclear reprogramming of cloned embryos produced in vitro Theriogenology Volume 59, Issue 1, 1 January 2003, Pages 33-44.

A.H. Handysyde. Preimplantation genetic diagnosis:strategies and surprises. TIG July 1997 Vol3 no 7. Hill, J. R. et àl. Evidence for placental abnormality as the major cause of mortality in first-trimester somatic cell cloned bovine fetuses. Biol. Reprod. 63, pp. 1787-1794 (2000).AH Handysyde. Preimplantation genetic diagnosis: strategies and surprises. TIG July 1997 Vol3 no 7. Hill, JR et al. Evidence for placental abnormality as the major cause of mortality in first-trimester somatic cell cloned bovine fetuses. Biol. Reprod. 63, pp. 1787-1794 (2000).

Intano GW. McMahan CA. Walter RB. McCarrey JR. Walter CA. Mixed spermatogenic germ cell nuclear extracts exhibit highbase excision repair activity.Nucleic Acids Research. 29(6): 1366-72, 2001 Mar 15.Intano GW. McMahan CA. Walter RB. McCarrey JR. Walter CA. Mixed spermatogenic germ cell nuclear extracts exhibit highbase excision repair activity.Nucleic Acids Research. 29 (6): 1366-72, 2001 Mar 15.

Inui A.empreinte Obesity-a chronic health problem in cloned mice? Trends Pharmacol Sci. 2003 Feb;24(2):77-80.Inui A.empreinte Obesity-a chronic health problem in cloned mice? Trends Pharmacol Sci. 2003 Feb; 24 (2): 77-80.

Jeanisch R, Eggan K, Humpherys D, Rideout W, Hochedlinger K. Nuclear cloning, stem cells, and genomic reprogramming. Cloning Stem Cells. 2002;4(4):389-96.Jeanisch R, Eggan K, Humpherys D, Rideout W, Hochedlinger K. Nuclear cloning, stem cells, and genomic reprogramming. Cloning Stem Cells. 2002; 4 (4): 389-96.

Kato Y, Tani T, Sotomaru Y, Kurokawa K, Kato J, Doguchi H, Yasue H and Tsunoda Y. 1998. Eight calves cloned from somatic cells of a single adult. Science 1998; 282:2095-2098.Kato Y, Tani T, Sotomaru Y, Kurokawa K, Kato J, Doguchi H, Yasue H and Tsunoda Y. 1998. Eight calves cloned from somatic cells of a single adult. Science 1998; 282: 2095-2098.

Kohler S. W. Provost G. S. Fieck A. Kretz P. L. Bullock W. O. Sorge J. A. Putman D. L. & Short J. M. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, pp. 7958-7962.Kohler S. W. Provost G. S. Fieck A. Kretz P. L. Bullock W. O. Sorge J. A. Putman D. L. & Short J. M. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, pp. 7958-7962.

Krause W Habermann B. No change with âge in semen volume, sperm count and sperm motility in individual men consulting an infertility clinic.Urologia Intemationalis. 64(3):139-42, 2000.Krause W Habermann B. No change with age in semen volume, sperm count and sperm motility in individual men consulting an infertility clinic.Urologia Intemationalis. 64 (3): 139-42, 2000.

Kubota et al. 2000. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture. Proc Natl Acad Sci USA 97, pp.990-995.Kubota et al. 2000. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture. Proc Natl Acad Sci USA 97, pp. 990-995.

Birgit Kϋhholzer-Cabot and Gottfried Brem Aging of animais produced by somatic cell nuclear transfer Expérimental Gerontology Volume 37, Issue 12 , December 2002, Pages 317-1323.Birgit Kϋhholzer-Cabot and Gottfried Brem Aging of animais produced by somatic cell nuclear transfer Experimental Gerontology Volume 37, Issue 12, December 2002, Pages 317-1323.

Kuick RD; Neel JV; Straliler JR; Chu EH; Bargal R; Fox DA; Hanash SM. Similarity of spontaneous germinal and in vitro somatic cell mutation rates in humans: implications for carcinogenesis and for the rôle of exogenous factors in "spontaneous" germinal mutagenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 1992 Aug 1; 89(15):7036-40.Kuick RD; Neel JV; Straliler JR; Chu EH; Bargal R; Fox DA; Hanash SM. Similarity of spontaneous germinal and in vitro somatic cell mutation rates in humans: implications for carcinogenesis and for the role of exogenous factors in "spontaneous" germinal mutagenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 1992 Aug 1; 89 (15): 7036-40.

R.P. Lanza, J.B. Cibelli, C. Blackwell, V.J. Cristofalo, M.K. Francis, G.M. Baerlocher, J. Mak, M. Schertzer, E.A. Chavez, N. Sawyer, P. M. Lansdorp and M.D. West , Extension of cell life-span and telomere length in animais cloned from senescent somatic cells. Science 288 (2000), pp. 665-669.R.P. Lanza, J.B. Cibelli, C. Blackwell, V.J. Cristofalo, M.K. Francis, G.M. Baerlocher, J. Mak, M. Schertzer, E.A. Chavez, N. Sawyer, P. M. Lansdorp and M.D. West, Extension of cell life-span and telomere length in animais cloned from senescent somatic cells. Science 288 (2000), pp. 665-669.

Latham KE. Cloning: questions answered and unsolved. Différentiation. 2004 Feb. ; 72(1):11-22.Latham KE. Cloning: questions answered and unsolved. Differentiation. 2004 Feb. ; 72 (1): 11-22.

Jang-Won Leel, Shin-Chih Wu2, X. Cindy Tianl, Michèle Barberl, Thomas Hoaglandl, John Riesenl, Kun-Hsiung Lee2, Ching-Fu Tu, Winston T.K. Cheng and Xiangzhong Yang. Production of Cloned Pigs by Whole Cell Intracytoplasmic Microinjection BOR Papers in Press. Published on May 28, 2003 as DOI:10.1095 biolreprod.l03.015917 Production of Cloned Pigs by Whole Cell Intracytoplasmic Microinjection.Jang-Won Leel, Shin-Chih Wu2, X. Cindy Tianl, Michèle Barberl, Thomas Hoaglandl, John Riesenl, Kun-Hsiung Lee2, Ching-Fu Tu, Winston TK Cheng and Xiangzhong Yang. Production of Cloned Pigs by Whole Cell Intracytoplasmic Microinjection BOR Papers in Press. Published on May 28, 2003 as DOI: 10.1095 biolreprod.l03.015917 Production of Cloned Pigs by Whole Cell Intracytoplasmic Microinjection.

N. Miyashita, K. Shiga, M. Yonai, K. Kaneyama, S. Kobayashi, T. Kojima, Y. Goto, M. Kishi, H. Aso, T. Suzuki, M. Sakaguchi and T. Nagai , Remarkable différences in telomere lengths among cloned calves derived from différent cell types. Biol. Reprod. 66 (2002), pp. 1649-1655.N. Miyashita, K. Shiga, M. Yonai, K. Kaneyama, S. Kobayashi, T. Kojima, Y. Goto, M. Kishi, H. Aso, T. Suzuki, M. Sakaguchi and T. Nagai, Remarkable differences in telomere lengths among cloned calves derived from different cell types. Biol. Reprod. 66 (2002), pp. 1649-1655.

Murray V . Mutât Res Are transposons a cause of ageing? 1990 Mar;237(2):59-63.Murray V. Mutât Res Are transposed because of aging? 1990 Mar; 237 (2): 59-63.

Neeper S. Riddled With Errors Sci. Aging Knowl. Environ., March 17, 2004.Neeper S. Riddled With Errors Sci. Aging Knowl. Environ., March 17, 2004.

Nishino H. Buettner V. L. Haavik J. Schaid D. J. & Sommer S.S. (1996) Environ. Mol. Mutagen. 28, 299-312 Narumi Ogonuki, et al. Early death of mice cloned from somatic cells. Nature genetics, volume 30, march 2002.Nishino H. Buettner V. L. Haavik J. Schaid D. J. & Sommer S.S. (1996) Approx. Mol. Mutagen. 28, 299-312 Narumi Ogonuki, et al. Early death of mice cloned from somatic cells. Nature genetics, volume 30, market 2002.

Ogura A. Inoue K. Ogonuki N. Lee J. Kohda T. Ishino F. Phenotypic effects of somatic cell cloning in the mouse. Cloning Stem Cells. 2002 ; 4(4):397-405.Ogura A. Inoue K. Ogonuki N. Lee J. Kohda T. Ishino F. Phenotypic effects of somatic cell cloning in the mouse. Cloning Stem Cells. 2002; 4 (4): 397-405.

Ohgane J. Wakayama T. Senda S. Yamazaki Y. Inoue K. Ogura A. Marh J. Tanaka S. Yanagimachi R. Shiota K. The Sall3 locus is an epigenetic hotspot of aberrant DNA méthylation associated with placentomegaly of cloned mice. Gènes Cells.2004 Mar ; 9(3):253-60.Ohgane J. Wakayama T. Senda S. Yamazaki Y. Inoue K. Ogura A. Marh J. Tanaka S. Yanagimachi R. Shiota K. The Sall3 locus is an epigenetic hotspot of aberrant DNA methylation associated with placentomegaly of cloned mice. Genes Cells. 2004 Mar; 9 (3): 253-60.

Onishi A, Iwamoto M, Akita T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry AC. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289:1188-1190.Onishi A, Iwamoto M, Akita T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry AC. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190.

Paulson R J. Robert MD. Milligan C. MD, and Sokol R Z. The lack of influence of âge on maie fertility. Am J Obstet Gynecol. 2001 Apr;184(5):818-22; discussion 822-4.Paulson R J. Robert MD. Milligan C. MD, and Sokol R Z. The lack of influence of age on maie fertility. Am J Obstet Gynecol. 2001 Apr; 184 (5): 818-22; discussion 822-4.

Plas E. P. et al. Effects of aging on maie fertility ? Expérimental Gerontology. Volume 35, Issue 5, 1 August 2000, pp. 543-551.Plas E. P. et al. Effects of aging on maie fertility? Experimental Gerontology. Volume 35, Issue 5, 1 August 2000, pp. 543-551.

Pritchard C. C. Hsu L. Delrow J. & Nelson P. S. Project normal: defming normal variance in mouse gène expression. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, pp. 13266-13271 (2001).Pritchard C. C. Hsu L. Delrow J. & Nelson P. S. Project normal: defming normal variance in mouse gene expression. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, pp. 13266-13271 (2001).

Radu RA. Mata NL. Nusinowitz S. Liu X. Sieving PA. Travis GH. Related Articles, with isotretinoin inhibits lipofiiscin accumulation in a mouse model of récessive Stargardt's macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003.Radu RA. Mata NL. Nusinowitz S. Liu X. Sieving PA. Travis GH. Related Articles, with isotretinoin inhibits lipofiiscin accumulation in a mouse model of recessive Stargardt's macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003.

Reik W. & Maher E. R. Imprinting in clusters: lessons from Beckwith-Wiedemann syndrome. Trends Genêt. 13, pp. 330-334 (1997). Rhind S.M. Taylor J.E. De Sousa P.A. King T.J. McGarry M. & Wilmut I. Human cloning : can it be made safe ? Nature Reviews Genetics 4, pp. 855-864 (2003).Reik W. & Maher ER Imprinting in clusters: lessons from Beckwith-Wiedemann syndrome. Trends Broom. 13, pp. 330-334 (1997). Rhind SM Taylor JE De Sousa PA King TJ McGarry M. & Wilmut I. Human cloning: can it be made safe? Nature Reviews Genetics 4, pp. 855-864 (2003).

Sandra L. Martin³, Craig L. Hopkins, Anne Naumer, Martijn E. T. Dollé and Jan Vijg. Mutation frequency and type during ageing in mouse seminiferous tabules Mechanisms of Ageing and Development Volume 122, Issue 12, September 2001, Pages 1321-1331.Sandra L. Martin ³ , Craig L. Hopkins, Anne Naumer, Martijn ET Dollé and Jan Vijg. Mutation frequency and type during aging in mouse seminiferous tabules Mechanisms of Aging and Development Volume 122, Issue 12, September 2001, Pages 1321-1331.

P.G. SHels, A.J. Kind, K.H.S. Campbell, D. Waddington, I. Wilmut, A. Colman and A.E. Schnieke , Analysis of telomere length in cloned sheep. Nature 399 (1999), pp. 316-317).P.G. SHels, A.J. Kind, K.H.S. Campbell, D. Waddington, I. Wilmut, A. Colman and A.E. Schnieke, Analysis of telomere length in cloned sheep. Nature 399 (1999), p. 316-317).

Shiota & Yanagimachi. Epigenetics by DNA méthylation for development of normal and cloned animais. Différentiation (2002) 69:162-166.Shiota & Yanagimachi. Epigenetics by DNA methylation for development of normal and cloned animais. Differentiation (2002) 69: 162-166.

Spandorfer SD. Avrech OM. Colombero LT. Palermo GD. Rosenwaks Z.Effect of parental âge on fertilization and pregnancy characteristics in couples treated by intracytoplasmic sperm injection.Human Reproduction. 13(2):334-8, 1998 Feb.Spandorfer SD. Avrech OM. Colombero LT. Palermo GD. Rosenwaks Z. Effect of parental age on fertilization and pregnancy characteristics in couples treated by intracytoplasmic sperm injection.Human Reproduction. 13 (2): 334-8, 1998 Feb.

Steven P. Elmore, Ting Qian, Sherry F. Grissom, and John J. Lemasters The mitochondrial permeability transition initiâtes autophagy in rat hepatocytes -The FASEB Journal express article 10.1096/fj.01-0206fje. Published online August l7, 2001.Steven P. Elmore, Ting Qian, Sherry F. Grissom, and John J. Lemasters The mitochondrial permeability transition initiâtes autophagy in rat hepatocytes -The FASEB Journal express article 10.1096 / fj.01-0206fje. Published online August 17, 2001.

Peter Sutovsky,3 Ricardo D. Moreno,3 Joa~o Ramalho-Santos,4 Tanja Dominko,3 Calvin Simerly,3 and Gerald Schatten2,3 Ubiquitinated Sperm Mitochondria, Sélective Proteolysis, and the Régulation of Mitochondrial Inheritance in Mammalian Embryos. BIOLOGY OF REPRODUCTION 63, 582-590 (2000).Peter Sutovsky, 3 Ricardo D. Moreno, 3 Joa ~ o Ramalho-Santos, 4 Tanja Dominko, 3 Calvin Simerly, 3 and Gerald Schatten2,3 Ubiquitinated Sperm Mitochondria, Sélective Proteolysis, and the Régulation of Mitochondrial Inheritance in Mammalian Embryos. BIOLOGY OF REPRODUCTION 63, 582-590 (2000).

X.C. Tian, J. Xu and X. Yang , Normal telomere lengths found in cloned cattle. Nat. Genêt. 26 (2000), pp. 272-273.X.C. Tian, J. Xu and X. Yang, Normal telomere lengths found in cloned cattle. Nat. Broom. 26 (2000), pp. 272-273.

Tanaka S. et al. Placentomegaly in cloned mouse conception caused by expansion of the spongiotrophoblast layer. Biol. Reprod. 65, pp. 1813-1821 (2001).Tanaka S. et al. Placentomegaly in cloned mouse conception caused by expansion of the spongiotrophoblast layer. Biol. Reprod. 65, pp. 1813-1821 (2001).

X Cindy Tian et al. Cloning animais by somatic cell nuclear transfer - biological factors. Reproductive Biology and Endocrinology 2003, 1:98. Review.X Cindy Tian et al. Cloning animais by somatic cell nuclear transfer - biological factors. Reproductive Biology and Endocrinology 2003, 1:98. Review.

Vekemans M. Parental âge and the risk of genetic defects in the offspring. Gynécologie Obstétrique & Fertilité. Volume 30, Issue 10, October 2002, pp. 831-833.Vekemans M. Parental age and the risk of genetic defects in the offspring. Obstetrics & Fertility Gynecology. Volume 30, Issue 10, October 2002, pp. 831-833.

Wakayama T, Perry AC, Zuccotti M, Johnson KR, Yanagimachi R. FuU-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 1998; 394:369-374. J. M. Wattiaux Parental âge effects in Drosophila pseudoobscura Expérimental Gerontology Volume 3, Issue 1 , March 1968, Pages 55-61.Wakayama T, Perry AC, Zuccotti M, Johnson KR, Yanagimachi R. FuU-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 1998; 394: 369-374. JM Wattiaux Parental age effects in Drosophila pseudoobscura Experimental Gerontology Volume 3, Issue 1, March 1968, Pages 55-61.

Rudi G. J. WestendorpThomas B.L. Kirkwood La transmission héréditaire de la longévitéen fonction de la longévité en lignes maternelles et paternelles. Population. 56 (1-2),2001, 253-268.Rudi G. J. Westendorp Thomas B.L. Kirkwood The hereditary transmission of longevity as a function of longevity in maternal and paternal lines. Population. 56 (1-2), 2001, 253-268.

Williams, 2002. N. Williams , Dolly clouds cloning hopes. Curr. Biol. 12 (2002), pp. R79-R80.Williams, 2002. N. Williams, Dolly clouds cloning hopes. Curr. Biol. 12 (2002), pp. R79-R80.

William M. Rideout III, Kevin Eggan, Rudolf Jaenisch. Nuclear Cloning and Epigenetic Reprogramming of the Génome Volume 293, Number 5532, Issue of 10 Aug 2001, pp. 1093-1098.William M. Rideout III, Kevin Eggan, Rudolf Jaenisch. Nuclear Cloning and Epigenetic Reprogramming of the Génome Volume 293, Number 5532, Issue of 10 Aug 2001, pp. 1093-1098.

Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH Viable offspring derived form fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385:810-813.Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH Viable offspring derived form fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385: 810-813.

Young L. E. Sinclair K. D. & Wilmut I. Large offspring syndrome in cattle and sheep. Rev. Reprod. 3, pp. 155-163 (1998).Young L. E. Sinclair K. D. & Wilmut I. Large offspring syndrome in cattle and sheep. Rev. Reprod. 3, pp. 155-163 (1998).

Zhang Y. Rreger BE. Dorgan JF. Cupples LA. Myers RH. Splansky GL. Schatzkin A. Ellison RC. Parental âge at child's birth and son's risk of prostate cancer. The Framingham Study. Am J Epidemiol. 1999 Dec 1;150(11):1208-12. Zhang Y. Rreger BE. Dorgan JF. Cupples LA. Myers RH. Splansky GL. Schatzkin A. Ellison RC. Parental age at child's birth and son's risk of prostate cancer. The Framingham Study. Am J Epidemiol. 1999 Dec 1; 150 (11): 1208-12.

GLOSSAIREGLOSSARY

Clonage d'organismes : production d'un ou plusieurs individus « clones », identiques à un individu « matrice » ; en fait l'ADN nucléaire du clone sera identique à celui de l'organisme matrice ; le clonage d'organisme comprend non seulement la production d'un organisme, mais aussi la production de cellules embryonnaires issues de procédés de transfert d'information génétique nucléaire dans un ovule énucléé (clonage thérapeutique).Cloning of organisms: production of one or more "clone" individuals, identical to a "matrix" individual; in fact the nuclear DNA of the clone will be identical to that of the matrix organism; organism cloning includes not only the production of an organism, but also the production of embryonic cells resulting from nuclear genetic information transfer processes in an enucleated ovum (therapeutic cloning).

Cellules germinales post-natales diploïdes : cellules destinées à transmettre l'information génétique à la génération suivante et à conserver cette dernière. En d'autres termes, cellules diploïdes post-natales issues des PGCs (Primordial Germ Cells).Post-natal diploid germ cells: cells intended to transmit genetic information to the next generation and to keep the latter. In other words, post-natal diploid cells from PGCs (Primordial Germ Cells).

Cellules germinales mâles diploïdes : soit toutes les cellules souches germinales : toutes les spermatogonies (A,B) et les spermatocytes I avant la cytokinese. En d'autre termes, les cellules souches germinales mâles et toutes les cellules étant dans un stade précédant la cytokinese de la première division méiotique.Male diploid germ cells: either all germ stem cells: all spermatogonia (A, B) and spermatocytes I before cytokinesis. In other words, the male germinal cells and all the cells being in a stage preceding the cytokinesis of the first meiotic division.

Cellules germinales femelles diploïdes : ovocyte primaire avant la cytokinese de la première division méiotique.Female diploid germ cells: primary oocyte before cytokinesis of the first meiotic division.

Syndrome progéroïde : phénotype ressemblant à un vieillissement accéléré.Progeroid syndrome: phenotype resembling accelerated aging.

FIV : Fécondation In Vitro (IVF : In Vitro Fecundation)IVF: In Vitro Fertilization (IVF: In Vitro Fecundation)

ICSI : Intra Cytoplasmic Sperm InjectionICSI: Intra Cytoplasmic Sperm Injection

PGCs : Primordial Germ CellsPGCs: Primordial Germ Cells

ROSI : Round Spermatid InjectionROSI: Round Spermatid Injection

ROSNI : Round Spermatid Nucleus Injection ROSNI: Round Spermatid Nucleus Injection

RESUMEABSTRACT

La méthode consistant à utiliser des cellules germinales post-natales pour le clonage de mammifères dans le but d'augmenter la longévité de l'organisme (clonage reproductif), et la sénescence cellulaire (clonage thérapeutique), est justifiée par les faits suivants.The method of using postnatal germ cells for the cloning of mammals with the aim of increasing the longevity of the organism (reproductive cloning), and cell senescence (therapeutic cloning), is justified by the following facts.

La sélection naturelle ne devient pas plus discriminative avec l'âge lors du passage de l'information germinale de générations en générations:Natural selection does not become more discriminating with age when passing germ information from generation to generation:

- au niveau de la production des gamètes, car les paramètres du sperme ne varient pas avec l'âge.- at the level of gamete production, because the parameters of sperm do not vary with age.

- au niveau de la rencontre des gamètes et de l'embryogenèse, le succès des FIV ne variant pas en fonction de l'âge du père.- at the level of the meeting of gametes and embryogenesis, the success of IVF does not vary according to the age of the father.

- au niveau de la fitness de la génération suivante, comme il n'y a ni influence de l'âge paternel sur la survie de la progéniture, ni diminution de la fertilité des individus issus d'une reproduction tardive.- at the level of fitness of the next generation, as there is no influence of paternal age on the survival of the offspring, nor decrease in the fertility of individuals resulting from late reproduction.

En revanche, la sélection naturelle devient plus discriminatoire avec l'âge des cellules somatiques lors du transfert d'information génétique à la génération suivante, comme avec le transfert nucléaire somatique : -on obtient une durée de vie réduite par rapport aux animaux contrôles, d'après la seule étude menée sur toute la durée de vie d'un échantillon significatif de clones (Narumi Ogonuki et al. 2002.).On the other hand, natural selection becomes more discriminatory with the age of the somatic cells during the transfer of genetic information to the next generation, as with nuclear somatic transfer: - we obtain a reduced lifespan compared to the control animals, d 'after the only lifetime study of a significant sample of clones (Narumi Ogonuki et al. 2002.).

-les taux de réussite diminuent en fonction des générations clonées successivement (Wakayama et al. 2000) et de l'âge des organismes (Galat. V et al. 2002.).-the success rates decrease according to the successively cloned generations (Wakayama et al. 2000) and the age of the organisms (Galat. V et al. 2002.).

Une analyse logique des techniques de transfert nucléaire mène à la conclusion que les détériorations génétiques liées à l'âge de l'organisme sont plus impliquées dans cette sélection discriminatoire que les facteurs épigénétiques. L'argumentation est basée sur le fait que les taux de réussite changent amplement plus avec l'âge de l'individu qu'avec le stade embryonnaire (Galat V et al. 2002) ; soit amplement plus en fonction de différences de code génétique qu'avec des divergences épigénétiques. De plus, la diminution des succès du transfert nucléaire (NT) en fonction des générations, ne pouvant vraisemblablement pas être imputée à une reprogrammation défectueuse, ainsi que l'apparente absence de problèmes de reprogrammation chez les clones « réussis » (Ogura et al. 2002), dont la durée de vie est néanmoins diminuée (Narumi Ogonuki et al. 2002), suggèrent une prépondérante implication de la séquence dans le syndrome progéroïde des clones.A logical analysis of nuclear transfer techniques leads to the conclusion that genetic deteriorations linked to the age of the organism are more involved in this discriminatory selection than epigenetic factors. The argument is based on the fact that success rates change significantly more with the age of the individual than with the embryonic stage (Galat V et al. 2002); is more a function of differences in genetic code than with epigenetic differences. In addition, the decrease in successes of nuclear transfer (NT) according to generations, which cannot possibly be attributed to defective reprogramming, as well as the apparent absence of reprogramming problems in "successful" clones (Ogura et al. 2002), whose lifespan is nevertheless shortened (Narumi Ogonuki et al. 2002), suggest a preponderant implication of the sequence in the progeroid clone syndrome.

On n'a donc apparemment pas d'augmentation de sélection discriminative au niveau du transfert d'information génétique à la génération suivante et durant celle-ci en ce qui concerne les cellules germinales alors que cette discrimination existe au niveau somatique.There is therefore apparently no increase in discriminatory selection at the level of the transfer of genetic information to and during the next generation with regard to germ cells whereas this discrimination exists at the somatic level.

La FIV ne montre pas de syndrome progéroide contrairement au clonage. Les deux techniques utilisent les mêmes critères de sélection de l'ovule ; le mode de l'hérédité mitochondriale est similaire dans les deux techniques. La différence fondamentale est la source d'ADN qui est germinale pour la FIV et somatique pour le clonage. Ce syndrome progéroide doit donc être lié à une détérioration somatique de l'ADN nucléaire, qui n'a pas significativement lieu dans l'ADN germinal.IVF does not show progeroid syndrome unlike cloning. Both techniques use the same criteria for egg selection; the mode of mitochondrial inheritance is similar in the two techniques. The fundamental difference is the source of DNA which is germinal for IVF and somatic for cloning. This progeroid syndrome must therefore be linked to a somatic deterioration of nuclear DNA, which does not significantly occur in germline DNA.

Les cellules germinales doivent donc conserver leur information génétique bien mieux que les cellules somatiques. Le vieillissement, issu d'une négligence des cellules somatiques à exprimer des instruments permettant la conservation de l'information génétique dans les cellules germinales, semble provenir du désintéressement de l'évolution à sélectionner une survie tardive.Germ cells therefore have to keep their genetic information much better than somatic cells. Aging, resulting from a neglect of somatic cells to express instruments allowing the conservation of the genetic information in the germ cells seems to come from the disinterestedness of evolution in selecting late survival.

Une nouvelle approche évolutive et une démarche logique permettent de prévoir une amélioration de la technologie de clonage post-natal de mammifères en conférant aux clones une durée de vie augmentée en rapport à ceux issus des méthodes actuelles, en utilisant comme donneur nucléaire, les cellules germinales.A new evolutionary approach and a logical approach allow to foresee an improvement of the technology of post-natal cloning of mammals by giving to the clones a longer lifespan compared to those resulting from current methods, using as nuclear donor, germ cells .

Aucune tentative de clonage à partir de cellules germinales post-natales mammifères dans un but de prolonger l'espérance de vie des clones n'a été discutée, stipulée ni tentée.No attempt to clone from mammalian post-natal germ cells for the purpose of prolonging the clones' life expectancy has been discussed, stipulated or attempted.

Un nouvel ingrédient dans un procédé de ce fait amélioré, ceci dans un but précis (étant celui d'obtenir des clones de mammifères nés, clones ayant une durée de vie augmentée à par rapport à ceux obtenus avec les méthodes actuelles, ceci de par l'absence détériorations génétiques intrinsèques à l'âge somatique), constitue donc un élément brevetable. A new ingredient in a process thereby improved, this for a specific purpose (being that of obtaining clones of born mammals, clones having a longer lifespan compared to those obtained with current methods, this by l absence of genetic damage intrinsic to the somatic age), therefore constitutes a patentable element.

Claims

REVENDICATIONS

Ce qui est revendiqué :What is claimed:

1- Méthode de clonage (reproductif et non reproductif) d'organismes mammifères utilisant comme donneur nucléaire des cellules germinales post-natales dans le but d'augmenter la longévité des clones (et de diminuer le vieillissement cellulaire, dans le cadre du clonage dit « thérapeutique »).1- Cloning method (reproductive and non-reproductive) of mammalian organisms using post-natal germ cells as nuclear donor in order to increase the longevity of the clones (and decrease cell aging, in the context of cloning known as " therapeutic ”).

2- En accord avec la revendication numéro 1, en ce qui concerne le clonage d'organismes mâles, il est revendiqué que l'utilisation des cellules germinales post-natales comprend :2- In accordance with claim number 1, with regard to the cloning of male organisms, it is claimed that the use of post-natal germ cells comprises:

(i) Les cellules souches germinales diploïdes, soit les spermatogonies À et toutes les cellules prises à des stades ultérieurs intermédiaires précédant la cytokinese menant à la formation des spermatocytes 2, lors de la division réductionnelle ; soit toutes les cellules d'un individu né, issues des cellules germinales primordiales.(i) The diploid germinal stem cells, namely the A spermatogonies and all the cells taken at later intermediate stages preceding the cytokinesis leading to the formation of spermatocytes 2, during the reduction division; or all the cells of a born individual, derived from primordial germ cells.

(ii) Soit l'utilisation, pour le transfert nucléaire, de l'ADN qui est naturellement transmis de générations en générations.(ii) Or the use, for nuclear transfer, of DNA which is naturally transmitted from generation to generation.

(iii) En accord avec la revendication 2 (ii), de multiples injections (cellulaires ou nucléaires) d'ADN de cellules ayant subi la meïose 1 ou 2, ou 1 et 2 pour reconstituer la totalité de l'information génétique du donneur est comprise.(iii) In accordance with claim 2 (ii), multiple injections (cellular or nuclear) of DNA from cells having undergone meiosis 1 or 2, or 1 and 2 to reconstitute all of the genetic information of the donor is understood.

3- En accord avec la revendication numéro 1, en ce qui concerne le clonage d'organismes femelles, l'utilisation des cellules germinales post-natales comprend :3- In accordance with claim number 1, with regard to the cloning of female organisms, the use of postnatal germ cells comprises:

(i) Les ovocytes primaires et toutes les cellules prises à des stades ultérieurs intermédiaires, précédant la cytokinese menant à l'ovocyte secondaire, lors de la division réductionelle.(i) Primary oocytes and all cells taken at later intermediate stages, preceding cytokinesis leading to the secondary oocyte, during reduction division.

(ii) Soit l'utilisation, pour le transfert nucléaire, de l'ADN qui est naturellement transmis de générations en générations.(ii) Or the use, for nuclear transfer, of DNA which is naturally transmitted from generation to generation.

(iii) En accord avec la revendication 3 (ii), de multiples injections (cellulaires ou nucléaires) d'ADN de cellules ayant subi la meïose 1 ou 2, ou 1 et 2 pour reconstituer la totalité de l'information génétique du donneur est comprise. 4 - La méthode en accord avec la revendication numéro 1 s'étend à tous les types cellulaires dérivés de ceux inclus dans les revendications 1, 2, 3.(iii) In accordance with claim 3 (ii), multiple injections (cellular or nuclear) of DNA from cells having undergone meiosis 1 or 2, or 1 and 2 to reconstruct all of the genetic information of the donor is understood. 4 - The method in accordance with claim number 1 extends to all cell types derived from those included in claims 1, 2, 3.

(i) La revendication 4 incluant la possibilité que ces cellules puissent être modifiées épigénétiquement.(i) Claim 4 including the possibility that these cells may be modified epigenetically.

(ii) La revendication 4 incluant le fait que ces cellules puissent être transgéniques.(ii) Claim 4 including the fact that these cells can be transgenic.

5 - En accord avec les revendications 1, 2, 3, 4, le transfert d'information génétique comprend par exemple, mais ne se limite pas aux trois méthodes suivantes :5 - In accordance with claims 1, 2, 3, 4, the transfer of genetic information includes, for example, but is not limited to the following three methods:

(i) L'injection du noyau.(i) Injection of the nucleus.

(ii) La fusion cellulaire.(ii) Cell fusion.

(iii) L'injection de la cellule entière.(iii) Injection of the whole cell.

6- En accord avec les revendications 1, 2, 3, 4, 5, les cellules peuvent appartenir à des individus nés, comprenant entre autres :6- In accordance with claims 1, 2, 3, 4, 5, the cells can belong to born individuals, comprising inter alia:

(i) Les nouveaux-nés.(i) Newborn babies.

(ii) Les adultes.(ii) Adults.

(iii) Les échantillons d'individus morts.(iii) Samples of dead individuals.

7- En accord avec les revendications 1, 2, 3, 4, 5, 6, ces cellules peuvent être cryopréservées.7- In accordance with claims 1, 2, 3, 4, 5, 6, these cells can be cryopreserved.

8- En accord avec les revendications 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, la protection de cette technique s'étend à tous les mammifères.8- In accordance with claims 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, the protection of this technique extends to all mammals.

9- Les clones obtenus à l'aide de la nouvelle méthode n'hériteront pas des détériorations d'information génétique intrinsèques aux méthodes actuelles utilisant des cellules somatiques, comme ils sont issus d'un ADN mieux préservé. (i) Leur espérance de vie sera augmentée.9- Clones obtained using the new method will not inherit deterioration of genetic information intrinsic to current methods using somatic cells, as they come from better preserved DNA. (i) Their life expectancy will be increased.

(ii) Leur risque de cancers sera diminué.(ii) Their risk of cancer will be reduced.

(iii) Les maladies liées à l'âge apparaîtront plus tard, il en sera donc de même pour les maladies liées au stress oxydatif ; les risques de maladies neurodégénératives, cardiaques, (et de toutes les autres dont l'incidence augmente avec l'âge) seront diminués.(iii) Age-related diseases will appear later, so it will be the same for diseases linked to oxidative stress; the risks of neurodegenerative and cardiac diseases (and of all others whose incidence increases with age) will be reduced.

(iv) Le taux de réussite du transfert nucléaire menant à une naissance viable sera augmenté, en rapport au clonage somatique, de par l'absence d'augmentation en fonction de l'âge, de la discrimination sélective lors du transfert intergenerationnel d'information génétique germinale, et donc un ADN plus intègre. (iv) The success rate of nuclear transfer leading to a viable birth will be increased, in relation to somatic cloning, due to the absence of an increase as a function of age, of selective discrimination during the intergenerational transfer of information germline genetics, and therefore more integrated DNA.