WO2004105774A1 - オリゴ核酸担持複合体、当該複合体を含有する医薬組成物 - Google Patents

オリゴ核酸担持複合体、当該複合体を含有する医薬組成物 Download PDF

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WO2004105774A1
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dna
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Junichi Yano
Kazuko Hirabayashi
Tohru Yamaguchi
Satoru Sonoke
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Nippon Shinyaku Co., Ltd.
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Definitions

  • Oligonucleic acid-supported complex pharmaceutical composition containing the complex
  • an oligonucleic acid is supported on a force-ionic ribosome composed mainly of 2- ⁇ - (2-getylaminoethyl) forcerubamoyl-1,1,3-dioleoylglycerol and a phospholipid.
  • oligonucleic acid refers to a nucleic acid molecule consisting of RNA or DNA or a derivative thereof having 10 to 50 nucleobases in one molecule, and exerts a physiologically active effect in cells.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleic acid molecule containing multiple strands, or a combination thereof (for example, a double-stranded nucleic acid molecule formed from two single-stranded nucleic acid molecules).
  • Antisense nucleic acid technology is known as a method for specifically inhibiting the gene expression of cells in a base sequence.
  • the antisense nucleic acid referred to here is a single-stranded DNA derivative having a chain length of about 20 bases, and the phosphorothioate compound is the most known compound. Ivo administration is possible.
  • the phosphorothioate antisense nucleic acid is capable of cleaving target RNA in cells without forming a complex with a carrier such as the phytonic liposome which is the object of the present invention. It is said to exert physiological function suppression and action as a drug.
  • lipozym @ DNA enzyme (Deoxy ribozyme or DNAzyme) is known.
  • siRNA siRNA
  • siRNA is a double-stranded RNA type molecule of about 19 to 23 bases, which is generated from double-stranded RNA by an enzyme with an activity similar to RNAsell, called dicer, which is present in cells.
  • oligo RNA composed of single-stranded RNA and having a stem-loop structure (double-stranded structure in the molecule) may also act as a precursor of siRNA (commonly referred to as short hairin RNA or sh RNA).
  • siRNA commonly referred to as short hairin RNA or sh RNA.
  • This molecule is processed by Dicer (Dicer) and exhibits RNA interference by having a structure similar to that of siRNA.
  • Dicer Dicer
  • efficient and stable transfer into cells is an extremely important issue for practical use as pharmaceuticals. ing.
  • liposomes composed of positively charged lipids in an aqueous solution are effective for intracellular transfer of nucleic acids such as genes. Since nucleic acids such as genes are negatively charged, it is considered that they easily form complexes with cationic ribosomes, and the complexes are taken into cells by phagocytosis of cells. In experiments using cultured cells, it is widely known that antisense DNA and siRNA are only effective enough if they are transferred into cells using the Cationic Liposomes.
  • a strong ionic ribosome composed of a certain glycerol derivative and a phospholipid forms a long double-stranded RNA (50-10,000 base pairs) such as p01y (I): po1y (C).
  • Is known to be effective for transferring (Eg, WO94Z19314, WO99X20283, WO99 / 48531).
  • the complex formed at this time has an average particle size of more than 100 nm and tends to be distributed more in the reticuloendothelial system of the liver and spleen (for example, W ⁇ 99 / 4853
  • RNAs of 50 base pairs or more are used.
  • Complex formation of an oligonucleic acid with a length of less than 50 base pairs and the cationic ribosome described in the literature has sufficient physical properties as a complex and is sufficiently complex for in vivo administration Whether body formation is possible is unknown. Furthermore, it is not known at all whether or not the conjugate is administered iN Vivo to exhibit safety and pharmacological effects enough to be put into practical use as a pharmaceutical. Disclosure of the invention
  • the present invention has as its object to provide a complex of an oligonucleic acid and a phytonic ribosome, which is capable of ensuring sufficient drug efficacy and safety as a pharmaceutical.
  • a complex of a certain kind of cationic ribosome and an oligonucleic acid can be administered to a living body, and that it can be used as a drug by exerting its drug efficacy in a living body, thus completing the present invention.
  • the present invention relates to, for example, cationic ribosomes (hereinafter, referred to as "2- ⁇ - (2-getylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol” and phospholipids as main components) A complex in which the oligonucleic acid is carried by the “ribosome”.
  • cationic ribosomes hereinafter, referred to as "2- ⁇ - (2-getylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol” and phospholipids as main components
  • the present inventors have made further intensive efforts and have found that the average particle size of the composite particles greatly changes the metabolic kinetics. That is, when a complex having an average particle size of more than 10 Onm is administered into an artery or vein, the complex is mainly accumulated in the liver site, but compared with a complex less than 100 nm, for example, less than 80 nm, However, it escaped supplementation in the reticuloendothelial system, such as the liver and spleen, and was found to be widely distributed throughout the body. This means that the target site for drug treatment is lungs other than the liver. It also clarifies that it will be expanded to applications for circulatory organs. Therefore, the present invention provides a complex having an oligonucleic acid supported on the ribosome and having an average particle diameter of 100 nm or less.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease involving a target molecule (target DNA, target RNA, target protein) of the oligonucleic acid, comprising a complex in which the oligoribonucleic acid is supported on the ribosome.
  • FIG. 1 shows a state of a complex dispersion when an oligofectamine siRNA complex is prepared by a recommended method. Aggregates are visible at 10 M complex.
  • FIG. 2 shows a state of the complex dispersion when the si RNA complex is prepared using the ribosome.
  • FIG. 3 is a diagram obtained by adding a complex of be 1-2 sRNA and the ribosome to A431 cells, and examining the effect of suppressing the expression of Be1-2 protein by Western blotting.
  • FIG. 4 is a diagram obtained by adding a complex of be 1-2 sRNA and the ribosome to A549 cells, and examining the effect of suppressing the expression of Be1-2 protein by Western blotting.
  • FIG. 5 is a diagram in which a complex of 130 1_2 si RNA and the ribosome was added to 8,431 cells, and the effect of suppressing the expression of be 1-2 mRNA was examined by semi-quantitative RT-PCR.
  • FIG. 6 is a diagram showing the effect of adding a complex of be 1-2 si RNA and the ribosome to A549 cells, and examining the cell growth inhibitory effect.
  • the vertical axis of the graph reflects the number of living cells by absorbance.
  • FIG. 7 is a diagram in which a complex of bc1-2 siRNA and the liposome was administered to A549 cell liver metastasis mice, and the distribution of siRNA in cancer foci 5 minutes after the administration was examined.
  • the left panel shows hematoxylin-eosin staining, and the right panel shows immunohistochemical staining using a fluorescein antibody.
  • the upper row shows the growth site of A549 cells of mice to which the siRNA complex was administered, and the lower row shows the growth site of A549 cells of the mouse to which naked siRNA was administered. A positive signal is confirmed in blue by immunohistochemical staining.
  • FIG. 8 is a view showing the results of suppressing the growth of metastatic cancer when administering a complex of bc1-2siRNA and the liposome to A549 cell liver metastasis mice.
  • FIG. 9 is a diagram showing a survival curve of a mouse to which a complex of bc1-2siRNA and the liposome was administered to A549 cell liver metastasis mouse.
  • FIG. 10 is a view showing a survival curve of a mouse to which a complex of bc1-2siRNA and the liposome was administered to an A549 cell liver metastasis mouse.
  • FIG. 11 is a graph showing the dose-dependency of the life-prolonging effect when a complex of bc1-2siRNA and the liposome was administered to A549 cell liver metastasis mice.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of studying the administration schedule of a complex of bc1-2siRNA and the ribosome in A549 cell liver metastasis mice.
  • FIG. 13 shows the effect of local administration of a complex of be1-2siRNA and the ribosome.
  • FIG. 14 is a diagram comparing the intra-tissue concentrations of si RNA in plasma, liver and spleen after administration of mice to each of two types of si RNA complexes.
  • FIG. 15 is a diagram in which a complex of be1-2 antisense DNA and the ribosome was added to A431 cells, and the effect of suppressing the expression of Be1-2 protein was examined by Western blotting.
  • FIG. 16 is a diagram in which a complex of Bc1-2 DNA enzyme and the ribosome was added to A431 cells, and the effect of suppressing the expression of Be1-2 protein was examined by Western blotting.
  • glycerol derivative A 2-09- (2-Jethylaminoethyl) carbamoyl-1,3- ⁇ -dioleoylglycerol
  • the phospholipid which is a component of the ribosome is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinosyl, phosphatidylserine, sphingomyelin, and lecithin can be mentioned.
  • Preferred phospholipids include egg yolk phosphatidylcholine, egg yolk lecithin, soybean lecithin and the like.
  • the mixing ratio of the glycerol derivative A and the phospholipid in the ribosome carrier depends on the type of the phospholipid, but is suitably in the range of 0.1 to 10 parts by weight of the phospholipid to 1 part by weight of the glycerol derivative A. Yes, preferably in the range of 0.5 to 3 parts by weight, more preferably in the range of 1 to 2 parts by weight.
  • the ribosome can be prepared by mixing the glycerol derivative A and a phospholipid and dispersing them in an aqueous solution.
  • an apparatus such as an ultrasonic dispersion apparatus and an emulsification dispersion apparatus can be appropriately used.
  • oligonucleic acid refers to a nucleic acid molecule consisting of RNA or DNA having 10 to 50 nucleobases in one molecule or a derivative thereof, and has a bioactive effect in a cell.
  • a protein that exerts its activity and acts on target DNA, RNA, or its expression product protein to control or destroy the original cell function, and its structure is a single-stranded nucleic acid molecule or a single-stranded nucleic acid molecule.
  • a combination thereof eg, a double-stranded nucleic acid molecule formed from two single-stranded nucleic acid molecules).
  • Non-limiting examples of oligonucleic acids used in the present invention include common RNAs and DNAs and their derivatives. Specific examples of oligonucleic acids include siRNA, shRNA, antisense DNA, antisense RNA, DNA enzyme, lipozyme, and abutama one, and other well-known nucleic acid molecules in the literature.
  • Oligonucleic acids can be designed for almost any target RNA or DNA sequence, even when the target is a protein. Either case can be used in the present invention.
  • Non-limiting examples of oligonucleic acid target molecules include oncogenes such as bcl-2, c-myc, bcr-ab1, viral genes such as HIV, hepatitis C virus, hepatitis B virus, and TNF- And inflammation-related genes such as Fas.
  • oncogenes such as bcl-2, c-myc, bcr-ab1
  • viral genes such as HIV, hepatitis C virus, hepatitis B virus, and TNF- And inflammation-related genes such as Fas.
  • Fas Fas
  • RNA molecules that act on the regulation of protein expression for example, RNA molecules that act on the tRNA precursor that has a splicing sequence, or RNA molecules such as microRNAs Is also included in the target.
  • the oligonucleic acid used in the present invention is not limited to a natural type.
  • the oligonucleic acid such as a sugar or phosphate backbone constituting the nucleotide may be used. At least a part may be modified.
  • desirable modifications include modifications at the 2'-position of the sugar, modifications of other parts of the sugar, and modifications of the phosphate backbone of the oligonucleic acid. 'As position modifications, ⁇ _R, R, R' 2 of the sugar ⁇ _R, SH, SR, NH 2, NHR, NR 2, N 3, CN, F, C l, B r, substituents such as I No.
  • R represents an alkyl or aryl, preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • Modified forms of other parts of the sugar include 4′-thio bodies and the like.
  • Modifications of the phosphate backbone of oligonucleic acids include phosphorothioate, phosphorodithioate, alkyl phosphonate, Suphoramidate forms and the like.
  • the oligonucleic acid according to the present invention has 10 to 50 nucleobases in one molecule, but may also have 15 to 35 nucleobases or 18 to 25 nucleobases. it can.
  • Oligonucleic acids can be synthesized in the solid phase or in the liquid phase by the phosphoramidite or triester method known to those skilled in the art.
  • the most common embodiment is a solid phase synthesis method by the phosphoramidite method, which can be synthesized by an automatic nucleic acid synthesizer or manually. After the completion of solid phase synthesis, elimination from the solid phase, deprotection of protecting groups, purification of the target product, etc. are performed. It is desirable to obtain a nucleic acid having a purity of 90% or more, preferably 95% or more, by purification.
  • composition ratio of the oligonucleic acid and the ribosome when forming a complex varies depending on the type of the oligonucleic acid, but the ribosome is preferably used in an amount of 0.01 to 100 parts by weight with respect to 1 part by weight of the oligonucleic acid. And preferably from 1 to 30 parts by weight, more preferably from 10 to 20 parts by weight.
  • the complex of the present invention may be prepared by first dispersing the glycerol derivative A and the phospholipid in an aqueous solvent to form the ribosome, and then adding the oligonucleic acid and then dispersing the ribosome again. And an oligonucleic acid can be produced by dispersing in an aqueous solvent.
  • aqueous solvent used for forming the complex examples include water for injection, distilled water for injection, electrolyte solutions such as physiological saline, and sugar solutions such as glucose solution and maltose solution.
  • Dispersion processing includes, for example, a homomixer, a homogenizer, an ultrasonic disperser, an ultrasonic homogenizer, a high-pressure emulsifying disperser, a microfluidizer (trade name), a nanomizer (trade name), and an agitzer (trade name) , DeBEE 2000 (trade name), a Manton-Gaurin type high-pressure homogenizer, and the like. Processing conditions, processing time, processing temperature, and the like are appropriately selected. In addition, the dispersion process involves several steps, such as through coarse dispersion. Can be performed separately.
  • the average particle size of the composite according to the present invention is not particularly limited, but a particle size of up to 300 nm is appropriate.
  • the preferred average particle size of the composite according to the present invention is in the range of 10 to 10 Onm, more preferably 20 to 80 nm, and still more preferably 3011111 to 5011111. By changing the setting of the dispersion processing conditions, the size can be appropriately adjusted from 1 Onm to 300 nm.
  • the complex of the present invention is taken into cells and exerts a physiologically active effect or a pharmacological effect on RNA, DNA or protein as a target molecule.
  • a targeting effect on RNA, DNA or protein in cells in the body.
  • Such intracellular targeting can degrade the target RNA, control the expression of the target DNA, and inhibit the function by binding to the target protein. It can suppress expression or inhibit function.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a complex of an oligonucleic acid and the ribosome, that is, a pharmaceutical composition that can be safely administered to humans.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be in the form of, for example, a liquid in which the complex is dispersed in an aqueous solution (e.g., an injection or a drip) or a lyophilized preparation thereof.
  • aqueous solution e.g., an injection or a drip
  • a lyophilized preparation thereof e.g., a lyophilized preparation thereof.
  • the complex is present within the concentration range of 0.001 to 25% (w / v), and within the concentration range of 0.01 to 5% (w / v). Are preferred, and those present within a concentration range of 0.1 to 2% (wZv) are more preferred.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain an appropriate amount of any pharmaceutically acceptable additive, for example, an emulsifying aid, a stabilizing agent, an isotonic agent, and a PH adjuster.
  • fatty acids having 6 to 22 carbon atoms eg, caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, arachidonic acid, Cosahexanoic acid
  • pharmaceutically acceptable salts eg, sodium salt, potassium salt, calcium salt
  • emulsifying aids such as albumin and dextran
  • stabilizers such as cholesterol and phosphatidic acid, sodium chloride, glucose , Maltose, lactose, sucrose, trehalose and the like
  • tonicity adjusting agents such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide and triethanolamine. it can.
  • Any pharmaceutically acceptable additive can be added at an appropriate step before or after dispersion.
  • a freeze-dried preparation of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by freeze-drying the complex obtained by the dispersion treatment.
  • the lyophilization treatment can be performed by a conventional method. For example, after sterilizing the complex obtained by the dispersion treatment, a predetermined amount is dispensed into a vial, and pre-freezing is performed for about 2 hours under conditions of about 140 to 120, and about 0 to Primary drying can be performed under reduced pressure at 10 ° C, then secondary drying under reduced pressure at about 15 to 25 ° C and freeze-dried. Then, generally, the inside of the vial is replaced with nitrogen gas and stoppered to obtain a lyophilized preparation of the present complex.
  • the freeze-dried preparation of the pharmaceutical composition of the present invention can be generally used by re-dissolving it by adding any appropriate solution (re-dissolved solution).
  • a re-dissolved solution include water for injection, physiological saline, and other general infusions.
  • the volume of the re-dissolved solution varies depending on the application and is not particularly limited, but is suitably 0.5 to 2 times the volume of the solution before lyophilization, or 50 mL or less.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is desirably administered in the form of a dosage unit.
  • a dosage unit For animals, including humans, intravenous administration, intraarterial administration, oral administration, intradermal administration, transdermal administration, transmucosal administration or transdermal administration. It can be administered rectally.
  • intravenous administration, transdermal administration, and transmucosal administration are desirable.
  • Local administration such as local administration in cancer can also be performed.
  • they are administered in dosage forms suitable for administration, for example, various injections, oral preparations, drops, absorbents, eye drops, ointments, lotions, suppositories and the like.
  • the dose of the composition of the present invention as a medicament depends on the drug, dosage form, age, body weight, etc. Although it is desirable to prepare it taking into account the condition of the individual, the administration route, and the nature and extent of the disease, the amount of oligonucleic acid for an adult is preferably in the range of 0.1 mg to 10 gZ per day for an adult. Is generally in the range of lmg to several g. This number may vary depending on the type of disease targeted, the mode of administration, and the target molecule. Thus, in some cases, lower doses may be sufficient, and conversely, higher doses may be required. It can be administered once to several times daily or at intervals of one to several days.
  • Example 1 Example 1
  • oligonucleic acid using bc1-2 mRNA as a target molecule will be described as an example, but the present invention is not limited to the ranges shown in these examples.
  • the sequence of the oligonucleic acid used at that time is shown below.
  • SEQ ID NO: 1 (bcl—2 si RNA sense strand)
  • SEQ ID NO: 2 (be 1-2 sRNA antisense strand)
  • SEQ ID NO: 3 (luciferase s i RNA sense strand)
  • SEQ ID NO: 4 (Luciferase s i RNA antisense strand)
  • SEQ ID NO: 8 (bcl—2 DNA Enzyme mutant / negative control)
  • SEQ ID NO: 11 (bcl-2 si RNA sense strand)
  • SEQ ID NO: 12 (be 1-2 si RNA antisense strand)
  • the synthesis of some of the above oligonucleic acids was performed by Dharmacon (Colorado, USA), Japan Requested Bioservice (Saitama Prefecture) and Hokkaido System Science Co., Ltd. (Hokkaido).
  • si RNA has a 2'-deoxy form with 2 bases at the 3 'end.
  • the antisense DNA and DNA enzyme are all 2'-doxy forms, but the phosphate backbone in the portion indicated by s is modified with a phosphorothioate form.
  • Production Example 1 Synthesis of bc l—2 s i RNA
  • siRNAs of SEQ ID NOS: 1 and 2 and SEQ ID NOs: 9 and 10 were synthesized using an automated DNA synthesizer (Applied Biosystems) using the standard amidite method (Nuc1 eic Acid Reseach 1984, 12, 4539.). Systems, Exp edite 8909). Cleavage from CPG was performed using a mixture of concentrated ammonium hydroxide (3Z1) and deprotection was performed at 55 ° C (18 hours) in the same solution. Then, the 2'-silyl group was deprotected at room temperature (20 hours) using a 1 M tetrabutylammonium fluoride solution in tetrahydrofuran.
  • the obtained oligoliponucleotide was purified by reverse phase chromatography. Furthermore, at room temperature (30 minutes) with an 80% acetic acid aqueous solution, the 5 ' After deprotection, the product was purified again by ion exchange chromatography. Oligoliponucleotides obtained after desalting were determined to be 90% or more of the full-length substance by capillary gel electrophoresis.
  • siRNA solution 200 ⁇ double-stranded siRNA solution (SEQ ID NOS: 1 and 2) Add 100% of 10% mal! To 100 L of siRNA solution, and add 20 M (268 Mg / mL) of siRNA solution ImL was prepared. Further, 732 L of 10% maltose was added to 16 mg ZmL of the ribosome solution 268 described in Reference Example 1 to prepare 4.3 mg / mL of the ribosome solution ImL. To the ribosome solution ImL, the above siRNA solution ImL was gradually added while stirring. By the above operation, a siRNA complex having a final concentration of 10 as siRNA was obtained.
  • the average particle size of this complex was measured using a dynamic light scattering particle size measuring device (NI COMP 380 ZLS, Partic 1 e Design Systems, U.S.A.) in the Vesic 1 e mode as the measurement mode. (Hereinafter, the average particle diameter was measured by the same instrument in the same measurement mode).
  • This composite was further subjected to a dispersion treatment using a water bath type ultrasonic device to obtain a composite having an average particle diameter of 155 nm.
  • a complex between the double-stranded RNA consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10 and the double-stranded RNA consisting of SEQ ID NOs: 11 and 12 and the ribosome was also prepared in the same manner as the above si RNA complex.
  • Rat blood collected by heparin treatment was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and then the upper plasma and leukocyte layers were removed.
  • To the obtained erythrocytes twice the volume of physiological saline for injection was added, mixed, and centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes. This operation was repeated twice more, and the obtained red blood cells were diluted to 1 ⁇ 10 8 ZmL using physiological saline for injection to obtain a red blood cell suspension.
  • OL measurement buffer — (74 mM NaCl, 147 mM Sucrose, 6 mM Glucose, 2 OmM Tris—HC1 pH 7.2) diluted with ribosome or commercial carrier diluted to appropriate concentration with physiological saline
  • 50 L of the above erythrocyte suspension was added and mixed, followed by incubation at 37 ° C for 45 minutes.
  • the reaction solution was centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes, the absorbance of the supernatant at 543 nm was measured, and the hemolysis rate (%) was calculated using the formula 1.
  • Table 1 shows the carrier concentration that lyses rat erythrocytes by 40%.
  • Table 2 shows the concentrations of various carriers that inhibit the growth of human umbilical vein endothelial cells by 50%.
  • the complex using the liposome was found to be less toxic than the complex composed of another commercial carrier (commercial product used in Comparative Example 1). 2004/007785
  • a complex with bc1-2siRNA (SEQ ID NOS: 1 and 2) was formed using Oligofectamine TM (Invitrogen).
  • Oligofectamine TM Oligofectamine TM (Invitrogen).
  • the mixture ratio of siRNA and oligofectamine is described in the guidebook of Tusch 1 et al. (http: //www.mpibpc.gwdg.de/ab teil ung en / 100/105 / si RN A.html) was mixed at a ratio of oligofectamine 3 to 60 pmo 1 e of siRNA (double-stranded).
  • the siRNA was used after performing an annealing operation according to the instruction manual. In this way, 10 ⁇ , 3 ⁇ and liM siRNA complexes were prepared, and their morphologies were compared.
  • the concentration of the siRNA complex is indicated by the molar concentration of the double-stranded siRNA contained in the complex.
  • the composite preparation of 1 was slightly cloudy, but the aggregate of 3 began to show aggregates, and the 1 O ⁇ M composite was completely visible as coarse particles. (Figure 1) .
  • A431 cells (human epidermoid carcinoma cells) were seeded in a 6 cm diameter petri dish at 2 ⁇ 10 5 cells / dish and cultured overnight. The following day, the medium was replaced with 2.7 mL of the fresh medium, and 0.3 mL of the complex dispersion containing be1-2 siRNA (SEQ ID NOS: 1 and 2) prepared by the method described in Example 1 was added thereto. Added to the medium. The complex dispersion at the time of addition was adjusted to 10 times the final concentration with a 10% maltose solution and added. As a negative control, a complex containing siRNA (SEQ ID NOs: 3 and 4) against luciferase was also prepared and added at the same time.
  • Cells were harvested 72 hours after addition, and the harvested cells were washed with cell lysis buffer (5 OmM Tris-HC1 (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 x Comp 1 ete TM (Roche Diagnostics)].
  • cell lysis buffer 5 OmM Tris-HC1 (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 x Comp 1 ete TM (Roche Diagnostics)].
  • a sample containing 15 g of total protein per lane was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (5-20% gradient gel).
  • the separated protein is transferred to a PVDF membrane using a semi-dry blotting device, and then, an anti-human Be1-2 antibody (M0887, DAKO) or an anti-actin polyclonal antibody (sc_1616, Santa Cruz B Western blot analysis was performed using iotechno 1 ogy).
  • an anti-human Be1-2 antibody M0887, DAKO
  • an anti-actin polyclonal antibody sc_1616, Santa Cruz B Western blot analysis was performed using iotechno 1 ogy.
  • sc_1616 an anti-actin polyclonal antibody
  • the band of the target protein was detected using a chemiluminescent reagent (Renaissance Reminol, Daiichi Kagaku).
  • be1-2 siRNA inhibited the expression of Bc1-2 protein in a concentration-dependent manner, and no inhibition was observed with the luciferase siRNA, a negative control.
  • be 1-2 si RNA is It was found that the expression of Be1-2 protein was suppressed in a sequence-specific manner, and that the liposome was effective in expressing the effect of siRNA in vitro. In addition, the expression of Be1-2 protein was also suppressed in a concentration-dependent manner with respect to bc1-2 siRNA consisting of SEQ ID NOS: 11 and 12.
  • Test Example 2 Effect of siRNA Using the Ribosome (2) —Protein Level
  • A549 cells human lung epithelial cancer cells
  • FIG. 4 the effectiveness of the ribosome was shown.
  • Test Example 3 Effect of siRNA Using the Ribosome (3) — mRNA Level— Expression of mRNA of target gene mRNA in order to investigate whether the protein-suppressing action of the siRNA by the ribosome is due to suppression of mRNA expression. The amount was checked. The same treatment as in Test Example 1 was performed, and total RNA was extracted from A431 cells collected 24 hours after the addition of the complex using ISOGEN (Futtsubon Gene). Subsequently, cDNA was synthesized from a certain amount of! ⁇ -Tal RNA in a reverse transcription reaction using THERMOS CR I PT RT-PC R System (Invitrogen).
  • the mRNA level of be1-2 was determined by the detection and quantification system (light cycler, Roche Diagnostics) by the cabillari-PCR method. Semi-quantification was performed. As a result, the treatment of the bc1-2 siRNA complex at 10 nM for 24 hours reduced the amount of bc1-2 mRNA to about 20% of that when the negative control complex was added (Fig. Five) . From these results, it was confirmed that the protein-suppressing action of si RNA using the ribosome was caused by suppression of mRNA expression.
  • Test Example 4 Effect of siRNA Using the Ribosome (4) —Cell Growth Inhibition—A 549 cells were cultured in a 96-well plate at a density of l ⁇ 10 3 cells / we 11, and the next day, 1/10 volume of the complex dispersion containing be1-2siRNA (SEQ ID NOs: 1 and 2), prepared by the method described in 1 above, was added to the medium. As a negative control, a complex containing siRNA (SEQ ID NOS: 3 and 4) against firefly luciferase was simultaneously prepared and added. Six days after addition of the complex, the number of viable cells It was measured with Cell Proliferati on Kit 1 (Roche Diagnostics). As shown in FIG. 6, it was confirmed that the growth of A549 cells in which the expression of Be122 protein was suppressed by the be1-2siRNA complex was suppressed in a concentration-dependent manner.
  • Test Example 5 Delivery of s i RNA to cancer lesion using the ribosome
  • Nude mice (BALBZc, nu / nu, O scan, 5 weeks old) spleen were implanted with A 549 cells (10 6 cells / mouse) of, spleens were excised after 10 minutes. By this operation, A549 cells are implanted in the liver and form metastatic foci.
  • a complex of the siRNA (SEQ ID NOS: 1 and 2) labeled with fluorescein at the 5 ′ end and the liposome was prepared in the same manner as in Example 1, and 5 mgZkg was injected into the tail vein of the mouse at 5 mgZkg. Administration. The average particle size of the complex administered at this time was 235.4 nm.
  • Livers were removed from the mice 5 minutes and 1 hour after administration of the complex, and fixed in PBS containing 4% paraformaldehyde. After embedding in paraffin according to a standard method, a tissue section having a thickness of 3 ⁇ m was prepared. Each tissue section was subjected to immunohistochemical staining using an anti-fluorescein antibody (D5101, DAKO) labeled with alfa phosphatase to examine the distribution of siRNA in the tissue. BC IP / NBT chromogenic substrate (DAKO) was used for color development of alkaline phosphatase. As a result, 5 minutes and 1 hour after administration of the complex, a positive signal was confirmed in a wide range at the growth site of A549 cells.
  • D5101, DAKO anti-fluorescein antibody
  • BC IP / NBT chromogenic substrate DAKO
  • FIG. 7 is a serial section of a cancer lesion in a mouse liver 5 minutes after administration of the conjugate.
  • the upper row shows the cancer foci of the mice to which the complex was administered, and the lower row shows the cancer foci of the mice to which the naked siRNA was administered.
  • staining was wide blue. Therefore, it was suggested that siRNA could be delivered to cancer cells in the growth foci by using the ribosome.
  • A549 cells (10 6 cell mice) were transplanted into spleens of nude mice (BALBZc, nu / nu, os, 5 weeks old), and the spleens were removed 10 minutes later. 6 days after transplantation After 45 days, the complex containing bc 1-2 s iRNA (SEQ ID NOs: 1 and 2) prepared as described in Example 1 was used once a week (total of 6 times) or 3 times a week (total of 18 times) ) Was administered intravenously at a frequency of 1 Omg / kg each time. The control group received a 10% maltose solution three times a week (a total of 18 times).
  • Figure 8 and Table 3 show the results of liver observation and liver weight of each group 34 days after transplantation (during the administration period).
  • Test Example 7 Effect of s iRNA using the ribosome (6) 1 n V 1
  • Nude mice (BALBZc, nu / nu, O scan, 5 weeks old) spleen were implanted with A 549 cells (10 6 cells mouse) of, spleens were excised after 10 minutes. From 6 days to 45 days after transplantation, the complex containing bc 1-2 s iRNA (SEQ ID NOS: 1 and 2) prepared by the method described in Example 1 was used once a week (total 6 times) or 3 times a week (total). (Total 18 times) intravenously. The control group received a 10% maltose solution three times a week (total 18 times).
  • FIG. 9 is a graph showing the number of surviving mice up to 100 days after transplantation.
  • A549 cells (10 6 cells // mouse) were transplanted into the spleen of a nude mouse (BALBZc, nu / nu, os, 5 weeks old), and the spleen was removed 10 minutes later. From 6 days to 44 days after transplantation, be 1-2 s iRNA (distribution) prepared by the method described in Example 1 was used. The conjugate containing column numbers 9 and 10) was administered intravenously twice a week (12 times in total). The dose per administration was 1 Omg / kg body weight as the siRNA. The control group received a 10% maltose solution twice a week (12 times in total).
  • FIG. 10 is a graph showing the number of surviving mice up to 100 days after transplantation.
  • Test Example 7-3 Effect of sRNA using the ribosome (8) —Dose-dependent A549 cells (10 6 cell mice) were spleen in nude mice (BALBZc, nu / nu, os, 5 weeks old) After transplantation, the spleen was extracted 10 minutes later. From 6 to 44 days after transplantation, the complex containing bc1-2 siRNA (SEQ ID NOS: 9 and 10) prepared by the method described in Example 1 was injected into the vein twice a week (12 times in total). It was administered internally. The dose per dose was 1 mgZkg body weight, 3 mgZkg body weight, and 1 OmgZkg body weight, respectively, as the siRNA. The control group was administered a 10% maltose solution twice a week (12 times in total). Fig. 11 shows the results.
  • Nude mice (BALB / c, nu / nu, O scan, 5 weeks old) spleen were implanted with A 549 cells (10 6 cells / mouse) of, spleens were excised after 10 minutes.
  • a complex containing bc 1-2 siRNA (SEQ ID NOS: 9 and 10) prepared by the method shown in Example 1 was used 5 times a week ( (5 or 12 times in total).
  • the dose per administration was 1 OmgZkg body weight as the siRNA.
  • the control group received a 10% maltose solution 5 times a week (total 12 times).
  • Figure 12 shows the results.
  • Test Example 7 5 Effect of Local Administration Using the Ribosome — In Vivo Effect—100 L PBS subcutaneously subcutaneously on the right flank of nude mice (BALB / c, nu / nu, os, 5 weeks old) 2.5 x 10 6 PC_3 cells that were cloudy were implanted. From 7 days to 18 days after the transplantation, a complex containing bc 1-2 siRNA (SEQ ID NOS: 1 and 2, SEQ ID NOs: 9 and 10) prepared by the method described in Example 1 was given 5 times a week (for a total of 10 ) Was administered subcutaneously around the cancer. The dose per administration was 0.1 mgZ mouse as the siRNA.
  • the control group received a 10% maltose solution 5 times a week (total of 10 times).
  • Figure 13 shows the results.
  • the increase in tumor volume was statistically significantly reduced between each complex administration group and the control group from 14 days to 36 days after cancer implantation (P ⁇ 0.01, Dunnett's test).
  • Test Example 8 Concentration of s i RNA / the relevant ribosome complex in tissue
  • an siRNA complex having an average particle diameter of 187.5 nm and a siRNA complex having an average particle diameter of 43.3 nm were prepared.
  • Each complex was prepared by mixing a 3 H-labeled product and an unlabeled product, and the specific activity was adjusted from 1000 dpmZg to 2000 dpmZg.
  • mice (ddy, 4 weeks old, oss, Nippon S.L.I.) were administered the above two sized complexes through the tail vein at 5 mgZkg (siRNA concentration). Mice were bled and killed under ether anesthesia at 5, 15 and 60 minutes after administration. Heparin was used as an anticoagulant for obtaining plasma. Next, the liver, lung, heart, spleen and kidney were excised, and their wet weight was measured. 1 mL of the tissue solubilizer in vials containing excised organs (Sorubaburu TM, Packard) was added, 40 ° was shaken overnight Te dissolving tissue in C (although the liver and kidneys were weighed partially dissolved did) .
  • tissue solubilizer in vials containing excised organs (Sorubaburu TM, Packard) was added, 40 ° was shaken overnight Te dissolving tissue in C (although the liver and kidneys were weighed partially dissolved did) .
  • aqueous hydrogen peroxide in a sample coloration from red blood cells is observed decolorized by adding 100 L, added scintillator one Chillon cocktail 1 OML to each vial (Haionikkufuro one TM, Packard) and mixed.
  • the radioactivity contained per unit weight of each organ was measured with a liquid scintillation counter (2500TR, Packard), and the tissue concentration of siRNA administered as a complex was calculated.
  • A431 cells were seeded on a 6 cm diameter Petri dish with Zdish and cultured for 1 hour. The following day, the medium was replaced with 2.25 mL of the fresh medium, and the complex dispersion containing antisense DNA (SEQ ID NO: 5) for bc1-2 prepared in the same manner as described in Example 3 was added. mL was added to the medium. The complex dispersion at the time of addition was adjusted to a concentration 10 times the final concentration with a 10% maltose solution and added. As a negative control, a complex containing the reverse sequence (SEQ ID NO: 6) was also prepared and added simultaneously. Added. The cells were collected 72 hours after the addition, and the expression of the Be1-2 protein was analyzed in the same manner as in Test Example 1.
  • the expression of the Be1-2 protein was specifically suppressed by transferring the antisense DNA against bc1-2 into the cells using the ribosome.
  • DNA for negative control A complex containing a point mutation introduced to eliminate the enzyme activity (SEQ ID NO: 8) was also prepared and added at the same time as the enzyme, and the medium was replaced with a fresh medium 24 hours after the addition of the complex. The same complex was added again, and cells were collected 72 hours after the initial addition of the complex, and the expression of Be1-2 protein was analyzed in the same manner as in Test Example 1.
  • an oligonucleic acid is supported on a force ionic ribosome composed of 2- (1-ethyl) ethyl 1,3-O-dioleoylglycerol and phospholipid as main components.
  • the complex can be administered to a living body, and can be practically used as a medicament by exerting a drug effect in a living body.
  • the target molecule of the oligonucleic acid containing the complex (target DNA, target RNA, target protein) Can be used as a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of a disease associated with.

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Abstract

　本発明は、主成分として２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとリン脂質とから構成されるカチオニックリポソームにオリゴ核酸が担持されている複合体を提供する。また本発明は、前記複合体が生体に投与可能であり、生体内での薬効発揮により医薬品として実用可能であることから、前記複合体を含む、前記オリゴ核酸の標的分子（標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡ、標的タンパク質）が関与する疾患の治療用または予防用医薬組成物を提供する。

Description

オリゴ核酸担持複合体、 当該複合体を含有する医薬組成物 技術分野
本発明は、 主成分として 2—〇— （2—ジェチルアミノエチル） 力ルバモイル 一 1, 3—〇一ジォレオイルグリセロールとリン脂質とから構成される力チォニ ックリボソームにオリゴ核酸が担持されている複合体に関するものである。 ここで本発明でいう 「オリゴ核酸」 とは、 一分子内に 10〜 50の核酸塩基を 有する、 RNAないし DNAからなる核酸分子またはその誘導体であって、 細胞 内において生理活性作用を発揮し、 標的となる DNA、 RNA、 ないしその発現 産物であるタンパク質に作用することによって本来の細胞機能を制御または破壊 せしめるものをいい、 その構造は一本鎖の核酸分子、 もしくは一分子内に二重鎖 もしくは多重鎖を含む核酸分子、 またはその組み合せ （例えば、 2つの一本鎖核 酸分子から形成される二本鎖核酸分子） によりなる。 背景技術
細胞の遺伝子発現を塩基配列特異的に阻害する方法としてアンチセンス核酸の 技術が知られている。 ここで言うアンチセンス核酸とは、 20塩基程度の鎖長を 有する一本鎖 DN A誘導体であり、 ホスホロチォエート体が最も知られている化 合物であり、 この分子単独での i n V i v o投与が可能である。 ホスホロチォ ェ一ト体のァンチセンス核酸は、 本発明の対象である力チォニックリポソ一ムの ような担体と複合体を形成することなしに細胞内の標的 RNAを切断することが 可能であり、 生体内における生理機能抑制や医薬品としての作用を発揮するとさ れている。 その他にも RN A切断活性を有する化合物としてリポザィムゃ DN A ェンザィム （De oxy r i bo z ymeまたは DNAz yme) が知られてい る。 しかし、 これらの化合物は天然の核酸構造を含むことから核酸分解酵素によ る分解を受けやすく、 また細胞内への取り込みが極めて低いという性質を有して いる。 従って、 その生理活性作用を細胞内で効率的に発揮させるためにはカチォ ニックリポソ一ムのような担体が必要である。 最近においては、 RNA干渉作用 （相補鎖 mRNAの分解） を示すオリゴ RN Aとして s i RNA (sma 1 1 i n t e r f e r i ng RNA) が見い だされている。 s i RNAは、 細胞内に存在するダイサー （D i c e r) と呼ば れる RNAa s elll 様の活性をもつ酵素によって二本鎖 RNAから生成される 19から 23塩基程度の二本鎖 RN A型の分子であり、 それぞれの鎖の 3 ' 末端 に 2〜3塩基の一本鎖構造をもつ突出型の構造を有している。 s i RNAの誘導 体も幾つか報告されているが、 少なくとも 3' 末端に突出をもつ分子が十分な R NA干渉作用を示すとされている。 また一本鎖の RNAからなり、 ステムループ 構造 （分子内で二本鎖構造） を持つオリゴ RNAも s i RNAの前駆体 （一般的 に s ho r t h a i r i n RNA, s h RNAと呼ばれる） として働くこ とが知られている。 この分子はダイサー （D i c e r) によってプロセッシング され、 s i RNAと同様の構造になることによって RNA干渉作用を示すもので ある。 しかしながら、 前述したように、 以上のような天然の構造およびそれに近 い誘導体の核酸分子の場合は、 細胞内に効率よく安定に移入されることが医薬品 としての実用化に極めて重要な課題となっている。
水溶液中で正に荷電する脂質により構成されるリポソーム （カチォニックリポ ゾーム） が遺伝子等の核酸の細胞内移入に有効であることが知られている。 遺伝 子等の核酸は負に荷電しているためカチォニックリボソームと容易に複合体を形 成し、 細胞の食作用により複合体が細胞内に取り込まれると考えられている。 培 養細胞を使った実験においては、 アンチセンス DNAや s i RNAはカチォニッ クリポソ一ムで細胞内に移入されることで、 初めて十分な効果を発揮することが 広く知られている。
しかしながら、 これまでに前記のような核酸分子とカチォニックリボソームか らなる複合体を動物に投与したときに標的遺伝子の発現を抑制するような、 医薬 品としての実用化が可能な複合体は未だ見いだされていない。 その主要な理由と して、 カチォニックリポソームの細胞毒性があると考えられている。
ところで、 ある種のグリセロール誘導体とリン脂質とから構成される力チォニ ックリボソームが p 01 y ( I) ： p o 1 y (C)などの長鎖の二本鎖 RNA (5 0-10, 000塩基対） を細胞内へ移入するのに有効であることが知られてい る （例えば、 W〇94Z19314、 WO 99X20283、 WO 99/485 31) 。 このとき形成される複合体は 100 nmを超える平均粒子径をもち、 肝 臓や脾臓の細網内皮系に多く分布する傾向にある （例えば、 W〇99/4853
1)
WO 94/1 9314 WO 99 Z 20283および W〇 99ノ 48531号 公報においては、 50塩基対以上の二本鎖 RNAが用いられている。 50塩基対 未満の長さのオリゴ核酸と当該文献記載のカチォニックリボソームとの複合体形 成が、 複合体として物性的に十分な安定性を有し、 かつ i n v i v o投与が十 分に可能な複合体形成ができるかどうかは未知である。 また、 その複合体を i n V i vo投与した場合、 医薬品としての実用化に耐え得る安全性と薬効の発揮が なされるかどうかについては全くわかっていない。 発明の開示
本発明は、 主として、 医薬品として十分な薬効の発揮と安全性が確保され得る 、 オリゴ核酸と力チォニックリボソームとの複合体を提供することを目的とする 本発明者らは、 鋭意検討を重ねた結果、 ある種のカチォニックリボソームとォ リゴ核酸との複合体が生体に投与可能であり、 生体内での薬効発揮により医薬品 として実用可能であることを見出し、 本発明を完成した。
本発明は、 例えば、 主成分として 2—〇— （2—ジェチルアミノエチル） カル バモイルー 1, 3— O—ジォレオイルグリセロールとリン脂質とから構成される カチォニックリボソーム （以下、 「当該リボソーム」 という） にオリゴ核酸が担 持されている複合体を提供する。
また、 本発明者らは、 更に鋭意努力を重ねた結果、 複合体粒子の平均粒子径が 代謝動態に大きな変動を与えることを見出した。 即ち、 平均粒子径が 10 Onm を超える複合体を動脈あるいは静脈内に投与したときには、 それが主に肝臓部位 に集積するのに比べ、 100 nm以下、 例えば 80 nmに満たない複合体の場合 は、 それが肝臓や脾臓のような細網内皮系での補足を逃れ、 全身に広く分布する ことを見出した。 このことは、 医薬品治療の標的となる疾患部位が肝臓以外の肺 や、 循環器系臓器などを対象とした用途にも拡大することを明らかにしている。 従って、 本発明は、 当該リボソームにオリゴ核酸が担持されている、 平均粒子 径が 100 nm以下の複合体を提供する。
また本発明は、 当該リボソームにオリゴ核酸が担持させてなる複合体を含む、 当該オリゴ核酸の標的分子 （標的 DNA、 標的 RNA、 標的タンパク質） が関与 する疾患の治療用または予防用医薬組成物を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 推奨される方法でオリゴフエクトァミンの s i RNA複合体を調製し たときの複合体分散液の様子である。 10 Mの複合体では凝集体が見える。 図 2は、 当該リボソームで s i RNA複合体を調製したときの複合体分散液の 様子である。
図 3は、 A431細胞に b e 1 -2 s i RNAと当該リボソームの複合体を 添加し、 Be 1— 2タンパク質の発現抑制効果をウェスタンブロッテイングで調 ベた図である。
図 4は、 A549細胞に b e 1 -2 s i RNAと当該リボソームの複合体を 添加し、 Be 1— 2タンパク質の発現抑制効果をウエスタンブロッテイングで調 ベた図である。
図 5は、 八431細胞に130 1 _2 s i RNAと当該リボソームの複合体を 添加し、 b e 1— 2 mRNAの発現抑制効果を準定量的 RT— PCRで調べた 図である。
図 6は、 A549細胞に b e 1 -2 s i RNAと当該リボソームの複合体を 添加し、 細胞の増殖抑制効果を調べた図である。 グラフの縦軸は吸光度で生細胞 数を反映している。
図 7は、 A549細胞肝転移マウスに b c 1—2 s i RNAと当該リポソ一 ムの複合体を投与し、 投与 5分後の癌増殖巣内での s i RNAの分布を調べた図 である。 左図はへマトキシリンーェォシン染色、 右図はフルォレセイン抗体を用 いて免疫組織染色を行った図である。 上段は s i RNA複合体を投与したマウス の、 下段は裸の s i RNAを投与したマウスの A 549細胞の増殖部位である。 免疫組織染色では陽性シグナルが青色で確認される。
図 8は、 A549細胞肝転移マウスに b c 1— 2 s i RNAと当該リポソ一 ムの複合体を投与したとき、転移癌の増殖を抑制している結果を示した図である。 図 9は、 A549細胞肝転移マウスに b c 1—2 s i RNAと当該リポソ一 ムの複合体を投与したときのマウスの生存曲線を示した図である。
図 10は、 A549細胞肝転移マウスに b c 1— 2 s i RNAと当該リポソ ームの複合体を投与したときのマウスの生存曲線を示した図である。
図 11は、 A549細胞肝転移マウスに b c 1— 2 s i RNAと当該リポソ —ムの複合体を投与したときの延命作用における用量依存性を示した図である。 図 12は、 A549細胞肝転移マウスにおける b c 1—2 s i RNAと当該 リボソームの複合体の投与スケジュール検討結果を示した図である。
図 13は、 b e 1—2 s i RNAと当該リボソームの複合体の局所投与効果 を示した図である。
図 14は、 マウスに二種類の粒子径の s i RNA複合体をそれぞれ投与し、 血 漿、 肝臓、 脾臓における s i RNAの組織内濃度を比較した図である。
図 15は、 A431細胞に b e 1—2 アンチセンス DNAと当該リボソーム の複合体を添加し、 Be 1—2タンパク質の発現抑制効果をウェスタンブロッテ ィングで調べた図である。
図 16は、 A431細胞に B c 1— 2 DNA ェンザィムと当該リボソーム の複合体を添加し、 Be 1— 2タンパク質の発現抑制効果をウェスタンブロッテ ィングで調べた図である。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を詳細に説明する。
(1) 当該リポソ一ム
当該リボソームの構成成分である 2—〇— （2—ジェチルアミノエチル） カル バモイルー 1, 3—〇—ジォレオイルグリセロール （以下、 「グリセロール誘導 体 A」 という） は、 W094Z19314号公報に開示されており、 下記の構 造式を有する。 グリセロール誘導体 Aの合成方法に関しては WO 94 193 14号公報を参照されたい。 グリセ口ール誘導体 Aの構造式
化 1
CH2 - O— CO - (CH2) 7CH=CH (CH2) 7CH3 —c i s
CH-0-CO-NHCH2CH2N (CH2CH3) 2
CH2 - O— CO— (CH2) 7CH=CH (CH2) 7CH3-c i s
当該リボソームの構成成分であるリン脂質は、 医薬品として許容されるもので あれば特に制限されるものではない。 例えばホスファチジルコリン、 ホスファチ ジルエタノールァミン、 ホスファチジルイノシ] ^一ル、 ホスファチジルセリン、 スフインゴミエリン、 レシチンを挙げることができる。 好ましいリン脂質として は卵黄ホスファチジルコリン、 卵黄レシチン、 大豆レシチン等を挙げることがで きる。
当該リボソーム担体中のグリセロール誘導体 Aおよびリン脂質の混合比は、 リ ン脂質の種類にもよるが、グリセロール誘導体 A 1重量部に対してリン脂質 0. 1〜10重量部の範囲内が適当であり、 0. 5〜 3重量部の範囲内が好ましく、 1〜 2重量部の範囲がより好ましい。
当該リボソームは、 グリセロール誘導体 Aとリン脂質を混合し、 水溶液中で分 散させることにより調製することができる。 分散には超音波分散装置、 乳化分散 装置等の装置を適宜用いることができる。
(2) オリゴ核酸 '
本発明でいう 「オリゴ核酸」 とは、 前述のとおり、 一分子内に 10〜 50の核 酸塩基を有する、 RN Aないし DNAからなる核酸分子またはその誘導体であつ て、 細胞内において生理活性作用を発揮し、 標的となる DNA、 RNA、 ないし その発現産物であるタンパク質に作用することによって本来の細胞機能を制御ま たは破壊せしめるものをいい、 その構造は一本鎖の核酸分子、 もしくは一分子内 に二重鎖もしくは多重鎖を含む核酸分子、 またはその組み合せ （例えば、 2つの 一本鎖核酸分子から形成される二本鎖核酸分子） によりなる。
本発明で使用されるオリゴ核酸の制限的でない例として、 一般的な RNAおよ び DNA、 およびそれらの誘導体を挙げることができる。 具体的なオリゴ核酸と しては s i RNA, s hRNA、 アンチセンス DNA、 アンチセンス RNA、 D NAェンザィム、 リポザィム、 アブタマ一等の文献的にもよく知られた核酸分子 を挙げることができる。
ォリゴ核酸は、 ほとんど全ての標的となる RNAあるいは DNAの配列に対し て設計可能であり、 また標的がタンパク質の場合においても同様である。 いずれ の場合においても本発明に用いることができる。 オリゴ核酸の標的分子の制限的 でない例としては、 b c l— 2、 c—myc、 b c r— a b 1などの癌遺伝子、 H IVウィルス、 C型肝炎ウィルス、 B型肝炎ウィルスなどのウィルス遺伝子、 TNF— や F a sなどの炎症関連遺伝子が挙げられる。 また上記の遺伝子の転 写産物のみならず翻訳産物もオリゴ核酸の標的になり得る。 更に構造遺伝子のみ ならず、 任意のタンパク質をコードしないゲノム DNAやタンパク質発現の調節 に働く RNA分子、 例えばスプライシング配列をもつ t RNA前駆体のマチユレ —シヨンに働く RNA分子や m i c r o RNAのような RNA分子も標的に含ま れる。
本発明に使用されるオリゴ核酸は天然型に限定されるものではなく、 ヌクレア —ゼ耐性など、 生体内における安定性を高めるために、 そのヌクレオチドを構成 している糖またはリン酸バックボーンなどの、 少なくとも一部が修飾されていて もよい。 修飾される場合、 望ましい修飾は、 糖の 2' 位の修飾、 糖のその他の部 分の修飾、 オリゴ核酸のリン酸パックボーンの修飾等である。 糖の 2' 位の修飾 として、 〇R、 R、 R' 〇R、 SH、 SR、 NH2、 NHR、 NR2、 N3、 CN、 F、 C l、 B r、 Iなどの置換基が挙げられる。 ここで、 Rはアルキルまたはァ リ一ル、 好ましくは炭素数 1〜6のアルキル基を、 R' はアルキレン、 好ましく は炭素数 1〜6のアルキレンを示す。 糖のその他の部分の修飾体としては、 4' チォ体などが挙げられる。 オリゴ核酸のリン酸バックボーンの修飾体としては、 ホスホロチォエート体、 ホスホロジチォエート体、 アルキルホスホネート体、 ホ スホロアミデート体などが挙げられる。
本発明に係るオリゴ核酸は、 一分子中に 1 0〜 5 0の核酸塩基を有するが、 1 5〜3 5の核酸塩基のものや、 1 8〜2 5の核酸塩基のものも挙げることができ る。
オリゴ核酸は、 当業者に既知のホスホアミダイト法またはトリエステル法によ り固相で、 または液相で合成できる。 最も一般的な態様はホスホアミダイト法に よる固相合成法であり、 核酸自動合成機または手動にて合成することができる。 固相での合成が終了した後は、 固相からの脱離、 保護基の脱保護および目的物の 精製等を行う。 精製により、 純度 9 0 %以上、 好ましくは 9 5 %以上の核酸を得 るのが望ましい。
( 3 ) 複合体
複合体を形成させるときのオリゴ核酸と当該リボソームの構成比率は、 オリゴ 核酸の種類にもよつて異なるが、ォリゴ核酸 1重量部に対して当該リボソーム 0 . 0 1から 1 0 0重量部が適当であり、 1から 3 0重量部が好ましく、 1 0から 2 0重量部がさらに好ましい。
当該リボソームは中性以下の p Hでは正電荷を有しているので、 負に荷電した オリゴ核酸とは容易に複合体を形成することができる。 従って、 本発明の複合体 は、 水性溶媒中でグリセロール誘導体 Aおよびリン脂質をまず分散処理して当該 リボソームを形成させ、 続いてオリゴ核酸を加え再度分散処理する方法、 または グリセロール誘導体 A、 リン脂質およびオリゴ核酸を水性溶媒中で分散処理する ことにより製造することができる。
複合体形成のために用いる水性溶媒としては、 注射用水、 注射用蒸留水、 生理 食塩水等の電解質液、 ブドウ糖液やマルトース液などの糖液を挙げることができ る。
分散処理は例えば、 ホモミキサー、 ホモジナイザー、 超音波分散機、 超音波ホ モジナイザー、 高圧乳化分散機、 マイクロフルイダィザー （商品名） 、 ナノマイ ザ一（商品名） 、 アルティマイザ一（商品名） 、 D e B E E 2 0 0 0 (商品名） 、 マントンーガウリン型高圧ホモジナイザー等が挙げられる。処理条件や処理時間、 処理温度等は適宜選択される。 また、 当該分散処理は、 粗分散を経るなど数段階 に分けて行うことができる。
本発明に係る複合体の平均粒子径は特に制限されないが、 300 nmまでの粒 子サイズが適当である。 本発明に係る複合体の好ましい平均粒子径は 10〜10 Onmの範囲内であり、 20〜80 nmがより好ましく、 3011111から5011111 が更に好ましい。 分散処理条件の設定を変えることによって、 1 Onmから 30 0 nmまでの適宜サイズ調節が可能である。
(4) 複合体の用途
本発明の複合体は、 細胞内に取り込まれ、 標的分子である RNA、 DNAある いは夕ンパク質に対する生理活性作用あるいは薬効薬理作用を発揮する。 本発明 の複合体を用いることにより、 体内における細胞内での RNA、 あるいは DNA やタンパク質に対する夕ーゲティング作用を発揮させることが可能である。 この ような細胞内ターゲティングによって、 標的 RNAの分解、 標的 DNAの発現制 御、 標的タンパク質への結合による機能阻害を生じさせることが可能であり、 最 終的には疾患治療の標的であるタンパク質の発現抑制あるいは機能阻害をおこす ことができる。 これらの作用はオリゴ核酸のもつ諸機能を医薬品用途に用いるこ とを可能せしめ、 本発明の複合体はオリゴ核酸医薬品による種々の疾患の治療お よび予防をすることができる医薬組成物の成分として有用である。
(5) 医薬組成物
本発明は、 オリゴ核酸と当該リボソームとの複合体を含むことを特徴とする医 薬組成物、 すなわちヒトに安全に投与できる医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、たとえば、本複合体が水溶液中に分散している液 （注 射剤、 点滴剤等） やその凍結乾燥製剤の形態をとることができる。 液剤の場合、 本複合体が、 0. 001〜25% (w/v) の濃度範囲内で存在しているものが 適当であり、 0. 01〜5% (w/v) の濃度範囲内で存在しているものが好ま しく、 0. 1〜2% (wZv)の濃度範囲内で存在しているものがより好ましい。 本発明の医薬組成物は、 任意の医薬上許容される添加剤、 例えば、 乳化補助剤、 安定化剤、 等張化剤、 PH調整剤を適当量含有していてもよい。 具体的には、 炭 素数 6〜22の脂肪酸 （例、 力プリル酸、 力プリン酸、 ラウリン酸、 ミリステン 酸、 パルミチン酸、 ステアリン酸、 ォレイン酸、 リノール酸、 ァラキドン酸、 ド コサへキサェン酸）やその医薬上許容される塩（例、ナトリゥム塩、力リゥム塩、 カルシウム塩） 、 アルブミン、 デキストラン等の乳化補助剤、 コレステロール、 ホスファチジン酸等の安定化剤、 塩化ナトリウム、 グルコース、 マルトース、 ラ クト一ス、スクロース、 トレハロース等の等張化剤、塩酸、硫酸、 リン酸、酢酸、 水酸化ナトリウム、 水酸化カリウム、 トリエタノールァミン等の p H調整剤など を挙げることができる。
医薬上許容される任意の添加剤は、 分散前でも分散後でも適当な工程で添加す ることができる。
また、 十分な除菌または滅菌処置を行うことによって、 医薬品として供するこ とが可能である。
上記分散処理によって得られた本複合体を凍結乾燥処理することにより、 本発 明医薬組成物の凍結乾燥製剤を調製することができる。 凍結乾燥処理は、 常法に より行うことができる。 例えば、 上記分散処理して得られた本複合体を滅菌後、 所定量をバイアル瓶に分注し、 約一 4 0〜一 2 0 の条件で予備凍結を約 2時間 程度行い、 約 0〜1 0 °Cで減圧下に一次乾燥を行い、 次いで、 約 1 5〜2 5 °Cで 減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。 そして、 一般的にはバイアル 内部を窒素ガスで置換し、打栓して本複合体の凍結乾燥製剤を得ることができる。 本発明医薬組成物の凍結乾燥製剤は、 一般には任意の適当な溶液 （再溶解液） の添加によって再溶解し使用することができる。 このような再溶解液としては、 注射用水、 生理食塩水、 その他一般輸液を挙げることができる。 この再溶解液の 液量は、 用途等によって異なり特に制限されないが、 凍結乾燥前の液量の 0 . 5 〜2倍量、 又は 5 0 O mL以下が適当である。
本発明の医薬組成物は、 投与単位形態で投与することが望ましく、 ヒトを含む 動物に対し、 静脈内投与、 動脈内投与、 経口投与、 組織内投与、 経皮投与、 経粘 膜投与または経直腸投与することができる。 特に静脈内投与、 経皮投与、 経粘膜 投与が望ましい。 また癌内局所投与などの局所投与も行うことができる。 これら の投与に適した剤型、 例えば各種の注射剤、 経口剤、 点滴剤、 吸収剤、 点眼剤、 軟膏剤、 ローション剤、 座剤等で投与されるのはもちろんである。
例えば、 本発明組成物の医薬としての用量は、 薬物、 剤型、 年齢や体重等の患 者の状態、 投与経路、 疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましい が、 通常は、 成人に対してオリゴ核酸量として、 1日当たり 0. lmgから 10 gZヒトの範囲が、 好ましくは lmgから数 gの範囲が一般的である。 この数値 は標的とする疾患の種類、 投与形態、 標的分子によっても異なる場合がある。 従 つて、 場合によってはこれ以下でも十分であるし、 また逆にこれ以上の用量を必 要とするときもある。 また 1日 1回から数回の投与または 1日から数日間の間隔 で投与することができる。 実施例
以下に b c 1一 2の mRNAを標的分子としたオリゴ核酸を例に説明するが、 本発明はこれらの例に示される範囲に限定されるものではない。 その際に用いた オリゴ核酸の配列については以下に示した。 配列番号 1 (bc l— 2 s i RNAセンス鎖）
5 ' 一 GUGAAGUCAACAUGCCUGCdTdT - 3 '
配列番号 2 (b e 1 -2 s i RNAアンチセンス鎖）
5 ' -GCAGGCAUGUUGACUUCACdTdT-3 '
配列番号 3 (ルシフェラ一ゼ s i RNAセンス鎖）
5 ' -CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT- 3 '
配列番号 4 (ルシフェラ一ゼ s i RNAアンチセンス鎖）
5 ' 一 UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT - 3 '
配列番号 5 (b e 1 -2 アンチセンス DNA)
5 ' -Ts C sTs C s C s CsAs Gs C s Gs Ts Gs C s Gs C s C sA s T- 3 '
配列番号 6 (b c 1 -2 ァンチセンス D N A逆向き配列 陰性対照）
5 ' -TsAs C s Cs Gs Cs GsTs Gs C s GsAs C s C s C sTs C s T-3 '
配列番号 7 (b e 1 -2 DNAェンザィム）
5 ' -Gs Gs C s C sAs C sAsAGs GC sTAs GC sTAs CAsA C s GAC s C sTs Cs C s Cs Cs C-3'
配列番号 8 (b c l— 2 DNAェンザィム ミュータント/陰性対照）
5 ' -Gs Gs C s CsAs C sAsAGs GC s GAs CC s TAs CAsA
C s GAC s C sTs Cs C s Cs Cs C - 3'
配列番号 9 (b e 1 -2 s i RNAセンス鎖）
5 ' -GUGAUGAAGUACAUCCAUUdTdT- 3 '
配列番号 10 (bc l— 2 s i RNAアンチセンス鎖）
5 ' -AAUGGAUGUACUUCAUCAC dTdT- 3 '
配列番号 11 (b c l— 2 s i RNAセンス鎖） 配列番号 12 (b e 1 -2 s i RNAアンチセンス鎖） 上記の一部のオリゴ核酸の合成は D ha rma c on社（コロラド州、米国）、 日本バイオサービス （埼玉県） および北海道システム ·サイエンス株式会社 （北 海道）に依頼した。なお s i RNAは3'末端の 2塩基が 2 'デォキシ体である。 アンチセンス DNAおよび DNAェンザィムはすべて 2 ' デォキシ体であるが、 sで表記した部分のリン酸バックボーンはホスホロチォエート体で修飾されてい る。 製造例 1 bc l— 2 s i RNAの合成
配列番号 1および 2ならびに配列番号 9および 10の s i RNAの合成は、 標 準的なアミダイト法（Nu c 1 e i c Ac i d Re s e a r ch 1984, 12， 4539. ) で自動 DNA合成装置 （アプライド■バイオシステムズ、 Exp e d i t e 8909) により合成した。 濃水酸化アンモニゥムーェタノ —ル（3Z1)混合液を用いて CPGより開裂させ、さらに同溶液中で 55°C (1 8時間） において脱保護した。 その後、 1Mテトラプチルアンモニゥムフルオラ イドのテトラヒドロフラン溶液を用いて室温 （20時間） で 2' 位のシリル基を 脱保護した。 得られたオリゴリポヌクレオチドを逆相クロマトグラフィーにて精 製した。 さらに、 80%酢酸水溶液にて室温 （30分） で 5' 位の DMTr基を 脱保護した後、 イオン交換クロマトグラフィーにて再度精製した。 脱塩後に得ら れたオリゴリポヌクレオチドは、 キヤビラリ一ゲル電気泳動により 90 %以上が 全長物質であると判定された。
参考例 1 当該リボソームの調製
グリセロール誘導体 A1. 2 gと高純度卵黄レシチン 2 gに 10 OmLの注射 用水に溶解したマルトース 20 gを添加し、 実験用小型乳化分散機を用いて 30 分間分散処理した。 注射用水で 20 OmLに定容して 16mg/mLの当該リポ ソ一ムを得た。
実施例 1 s ί RNAと当該リボソームとの複合体の調製 （1)
200 Μの二本鎖 s i R N A溶液 (配列番号 1および 2) 100 Lに 10 % マル! ^一スを 9 0 0 L添加し、 20 M (26 8 M g/mL) 濃度の s i RN A溶液 ImLを調製した。 また 16mgZmLの参考例 1記載の当該リボソーム 液 268 に 10%マルト一ス 732 Lを添加し、 4. 3mg/mLの当該 リボソーム液 ImLを調製した。 この当該リボソーム液 ImLに上記 s i RNA 溶液 ImLを、 攪拌しながら徐々に添加した。 以上の操作により s i RNAとし ての終濃度が 10 である s i RNA複合体を得た。 この複合体の平均粒子径 を動的光散乱方式による粒子径測定装置 （N I COMP 380 ZLS、 Pa r t i c 1 e S i z i ng Sy s t ems社， 米国） にて、 測定モードとして Ve s i c 1 eモードを用いて （以下、 平均粒子径の測定は同機により、 同測定 モ一ドにて行つた） 測定すると 181 n mであつた。 この複合体をさらに水浴型 超音波装置により分散処理することにより、 平均粒子径が 155 nmの複合体を 得た。
配列番号 9および 10からなる二本鎖 RN Aないし配列番号 11および 12か らなる二本鎖 RNAと当該リボソームとの複合体についても上記 s i RNA複合 体と同様に調製した。
実施例 2 s i RNAと当該リボソームとの複合体の調製 （2)
グリセ口一ル誘導体 A30 Omg、 高純度卵黄レシチン 50 Omg、 マル! ス 1 gに蒸留水 8mLを加え、 激しく攪拌し分散させた。 プローブ型の超音波破 砕機で、 氷水で冷却しながら 15分間超音波を照射した。 この照射後の分散液を 蒸留水で 1 OmLに定容後、 0. 22 mのフィルタ一でろ過し、 平均粒子径 4 4. 4nmの当該リポソ一ム （8 Omg/mL) を得た。 この当該リボソーム 液 ImLに 2. 61mLの 15. 3 %マルトース水溶液を加え攪拌した。 この溶 液を再び氷冷し、 超音波照射しながら、 3. 6mgZmLの s i RNA (配列番 号 1および 2) 1. 39 mLを当該リボソーム液に注入した。 その後、 超音波照 射を行い、 平均粒子径 38. 5nm、 1 mg mLの s i RNA複合体を得た。 実施例 3 アンチセンス DN Aと当該リボソームの複合体の調製
200 Mのアンチセンス DNA (配列番号 5) 溶液 100 Lに 10%マル ト一スを 90 O L添加し、 2 O M (1 14 g/mL) 濃度のアンチセンス DNA溶液 ImLを調製した。 また 16mgZmLの参考例 1記載の当該リポ ソ一ム液 114 Lに 10%マルトース 886 /Lを添加し、 1. 8mgZmL の当該リポソーム液 1 mLを調製した。 この当該リポソーム液 1 mLに上記アン チセンス DN A溶液 ImLを、 攪拌しながら徐々に添加した。 以上の操作により アンチセンス DNAとしての終濃度が 10 Mであるアンチセンス DNA複合体 を得た。 この複合体粒子を水浴型超音波装置により分散処理することにより、 平 均粒子径が 120. 5 nmの複合体粒子を得た。
実施例 4 D N Aェンザィムと当該リボソームの複合体の調製
200 Mの DNAェンザィム （配列番号 7) 溶液 100 に 10%マルト ースを 900 L添加し 20 nU (191 g/mL) の濃度の DNAェンザィ ム溶液 ImLを調製した。 また 16mg/mLの参考例 1記載の当該リボソーム 液 191 Lに 10%マルトース 809 Lを添加し、 3. lmgZmLの当該 リポソ一ム液 1 mLを調製した。 この当該リポソ一ム液 1 mLに上記 D N Aェン ザィム溶液 ImLを、 攪拌しながら徐々に添加した。 以上の操作により DNAェ ンザィムとしての終濃度が 10 Mである DNAェンザィム複合体を得た。 この 複合体粒子を水浴型超音波装置で分散処理することにより、平均粒子径が 135. 1 n mの複合体粒子を得た。
比較例 1 市販の担体と当該リポソ一ムの溶血性比較
一般的にカチオン性担体は界面活性作用を有するものが多いことから、 担体自 身の赤血球溶血性について各種市販担体と当該リボソームの比較を行った。 市販 担体として、 01 i go i e c t ami n e (商品名） 、 T r an s I T-T KO (商品名） 、 Tr an s Me s s e ng e r (商品名） 、 L i p o f e c t am i n e 2000 (商品名） 、 L i po f e c t ami ne (商品名） 、 および DMR I E— C (商品名） を用いた。
へパリン処理して回収したラット血液を 3000 r pmで 10分間遠心分離し た後、 上層の血漿および白血球層を除いた。 得られた赤血球に対し 2倍量の注射 用生理食塩水を加え、 混和後 3000 r pmで 5分間遠心分離した。 この操作を さらに 2回繰り返して得られた赤血球は注射用生理食塩水を用いて 1 X 108個 ZmLになるように希釈し、 赤血球懸濁液とした。 85 O Lの測定用バッファ — (74mM NaC l、 147mM S u c r o s e、 6mM G l uc o s e、 2 OmM Tr i s— HC 1 pH7. 2) に生理食塩水で適当な濃度に 希釈した当該リボソームもしくは市販担体を 10 添加し、 37°Cで予備加 温した後、 上記赤血球懸濁液 50 Lを加え混和し、 37 °Cで 45分間ィンキュ ペートした。 反応液を 3000 r pmで 3分間遠心分離し、 543 nmにおける 上清の吸光度を測定し、 式 1を用いて溶血率 (%) を算出した。
式 1
ODeX|1-ODb|„„k
溶血度 (％)= - 100
OD100-OD„,„„
OD xp ： 被検物質を添加したときの吸光度
OD10。 ： 0· 2%Tr i t onXl 00を添加して完全に溶血させたときの吸光度 ODblank ： 注射用生理愈塩水を添加したときの吸光度
表 1にラット赤血球を 40 %溶血させる担体濃度を示した。
このように当該リボソームは他の市販担体と比較して、 溶血作用が極めて低い , とが判った。 表 1
Figure imgf000018_0001
比較例 2 市販の担体と当該リポソームの細胞毒性比較
ヒトさい帯静脈内皮細胞 （三光純薬） を 3, 000 c e 1 1 sZwe 1 1とな るように 96ゥエルプレートに播種し、 ー晚培養した。 当該リポソ一ムもしくは 市販担体とホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的とした s i RNA (配列番号 3お よび 4) との複合体を調製して 1 10容量添加した。 72時間培養後、 Ce l 1 Count i ng K i t 8 (WST— 8、 同仁化学） を加えて生存細胞数 を吸光度により測定した。 ただし s iRNAと担体の混合比率 （重量比） は 1 ： 16で、 複合体調製は各試薬の添付プロトコルに準じて行った。
表 2に、 ヒトさい帯静脈内皮細胞の増殖を 50 %阻害する各種担体の濃度を示 した。当該リポソ一ムを用いた複合体は他の市販担体（比較例 1で用いた市販品） からなる複合体より低毒性であることが判つた。 2004/007785
表 2
Figure imgf000019_0001
比較例 3 オリゴフエクトァミンと s i RNAの複合体、 当該リボソームと s i
RNAの複合体の形態比較
ォリゴフェクトァミン TM (インビトロジェン社） を用いて b c 1 - 2 s i R NA (配列番号 1， 2) との複合体を形成させた。 s i RNAとォリゴフェクト ァミンの混合比は、 Tu s c h 1らの手引き書 （h t t p ： //www. mp i bp c. gwd g. d e/ab t e i l ung e n/100/105/s i RN A. h tml) に従い、 60 pmo 1 eの s i RNA (二本鎖） に対してオリゴ フエクトァミン 3 の比で混合した。 s i RNAについては同手引書に従いァ ニーリング操作を行って用いた。 この方法で 10〃Μ、 3〃Μおよび l iMの s i RNA複合体をそれぞれ調製し、 その形態を比較した。 ただし s i RNA複合 体の濃度は複合体に含まれている二本鎖 s i RNAのモル濃度で示している。 そ の結果 1 の複合体調製品では若干白濁する程度であつたが、 3 の複合体 では凝集体が見え始め、 1 O ^Mの複合体では完全に粗大な粒子が目視できる状 態になった （図 1) 。
一方、 実施例 1と同様の方法により、 終濃度が 10 ^Μ、 3 および 1 H Mの s i RNA複合体となるように、 当該リボソームと s i RNAとの複合体を 調製し、 その形態を比較した （図 2) 。
ォリゴフェクトァミンの場合、 3 iM以上で目視できる凝集体が形成されてい たが、 当該リボソームを用いた場合 10 Mの濃度でも目立った凝集体は認めら れなかった。
試験例 1 当該リポソ一ムを用いた s i RNAの効果 （1) —タンパク質レベル
6 cm径のシャーレに A431細胞 （ヒト類表皮癌細胞） を 2 X 105個/ d i s hで播種し一晩培養した。 翌日新鮮な上記培地 2. 7mLに交換し、 これに 実施例 1記載の方法により調製した、 b e 1—2 s i RNA (配列番号 1およ び 2) を含む複合体分散液 0. 3 mLを培地に添加した。 添加時の複合体分散液 は 10%マルトース液により終濃度の 10倍濃度に調製して添加している。 なお 陰性対照としてホ夕ルルシフェラーゼに対する s i RNA (配列番号 3および 4) を含む複合体も同時に調製し添加した。 添加 72時間後に細胞を回収し、 回収し た細胞は細胞溶解緩衝液 〔5 OmM Tr i s-HC 1 (pH8. 0) 、 150 mM NaC l、 1%NP— 40、 1 mM PMSF、 1 xComp 1 e t e™ (ロシュ ·ダイァグノスティックス） 〕 で溶解した。 1レーンあたり総タンパク 質の量を 15 gとしたサンプルを SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (5— 20%グラディエントゲル） に供した。 分離したタンパク質を、 セミドラ ィ式ブロッテイング装置を用いて PVDF膜に転写後、抗ヒト Be 1—2抗体 (M 0887、 DAKO) または抗ァクチンポリクロ一ナル抗体 （s c _ 1616、 S an t a C r u z B i o t e c h n o 1 o g y社） を用いてウェスタンブ ロット解析を行った。 なお、 二次抗体としてペルォキシダーゼ標識抗マウス I g G抗体または同標識抗ャギ I gG抗体を用い、 化学発光試薬 （ルネッサンス レ ミノール、 第一化学薬品社） を用いて目的タンパク質のバンドを検出した。
図 3に示すように b e 1—2 s i RNAは濃度依存的に B c 1—2タンパク 質の発現を抑制しており、 陰性対照であるルシフェラ一ゼの s i RNAでは抑制 は認められなかった。 また他の内在性タンパク質であるべ一夕ァクチンの発現に はまったく影響を及ぼしていなかった。 このことから b e 1—2 s i RNAは 配列特異的に Be 1— 2タンパク質の発現を抑制することが判り、 当該リポソ一 ムが s i RNAの i n v i t r oでの効果発現に有効であることが判った。 ま た、 配列番号 11および 12からなる b c 1 - 2 s i RNAについても、 濃度 依存的に Be 1 _ 2タンパク質の発現を抑制した。
試験例 2 当該リボソームを用いた s i RNAの効果 （2) —タンパク質レベル 試験例 1記載の方法と同様に A 549細胞 （ヒト肺上皮癌細胞） に対する Be 1 _ 2タンパク質発現抑制効果を調べた。 図 4に示すように、 当該リボソームの 有効性が示された。
試験例 3 当該リボソームを用いた s i RNAの効果 （3) — mRNAレベル— 当該リボソームによる s i RNAのタンパク質抑制作用は mRNAの発現抑制 に起因するものかどうかを調べるため、標的遺伝子の mRN Aの発現量を調べた。 試験例 1と同様の処理を行い、 複合体添加 24時間後に回収した A431細胞 から I SOGEN (二ツボンジーン） を用いてトータル RNAを抽出した。 続い て、 一定量の! ^一タル RNAを铸型に、 THERMOS CR I PT RT— PC R Sy s t em (インビトロジェン） を用いた逆転写反応で c DNAを合成し た。 さらに、 この逆転写反応液の一定量を PCR反応の铸型に用い、 キヤビラリ — PCR法による検出 ·定量システム （ライトサイクラ一、 ロッシュ ·ダイァグ ノスティックス） により、 b e 1—2の mRNAレベルの準定量を行った。 その結果、 10 nM、 24時間の b c 1— 2 s i RNA複合体の処理で b c 1— 2の mR N Aの量は陰性対照の複合体を添加した場合の 20 %程度に減少 していた （図 5) 。 この結果から当該リボソームを用いた s i RNAのタンパク 質抑制作用は mRN Aの発現抑制に起因するものであることが確認できた。
試験例 4 当該リボソームを用いた s i RNAの効果 （4) —細胞増殖抑制一 A 549細胞を 96穴プレートに l X 103c e l l s /w e 1 1の密度で培 養し、 翌日これに実施例 1で述べた方法により調製した、 b e 1— 2 s i RN A (配列番号 1および 2) を含む複合体分散液 1/10容量を培地に添加した。 なお陰性対照としてホタルルシフェラーゼに対する s i RNA (配列番号 3およ び 4) を含む複合体も同時に調製し添加した。 複合体添加 6日後に、 生細胞数を Ce l l P r o l i f e r a t i on K i t 1 (ロシュ ·ダイァグノステイツ クス） にて測定した。 図 6に示すように b e 1—2 s i RNA複合体で Be 1 一 2タンパク質の発現を抑制した A 549細胞は濃度依存的に増殖が抑制される ことが確認できた。
試験例 5 当該リボソームを用いた s i RNAの癌病巣へのデリバリー
ヌードマウス （BALBZc、 nu/nu, ォス、 5週齢） の脾臓に A 549細 胞 （106細胞/マウス） を移植し、 10分後に脾臓を摘出した。 この操作により A549細胞は肝臓に着床し、 転移増殖巣を形成する。 手術から 5週間後に 5 ' 末端をフルォレセイン標識した s i RNA (配列番号お 1よび 2) と当該リポソ —ムの複合体を実施例 1と同様の方法で調製し、 5mgZkgで上記マウスの尾 静脈より投与した。 このとき投与した複合体の平均粒子径は 235. 4nmであ つた。 複合体投与 5分および 1時間後にマウスから肝臓を摘出し、 4%パラホル ムアルデヒドを含む PB S中で固定した。 さらに定法に従いパラフィン包埋した 後、 厚さ 3ミクロンの組織切片を作成した。 それぞれの組織切片に対してアル力 リフォスファタ一ゼ標識の抗フルォレセイン抗体 （D5101、 DAKO) を用 いた免疫組織染色を行い、 組織中の s i RNAの分布を調べた。 なおアルカリフ ォスファタ一ゼの発色には BC I P/NBT発色基質 （DAKO) を用いた。 そ の結果、 複合体投与後 5分および 1時間後に A 549細胞の増殖部位において広 範囲に陽性シグナルが確認できた。 しかしフルォレセイン標識した s i RNAを 裸で投与した場合は癌病巣でのシグナルはまったく確認できなかった。 図 7は複 合体投与 5分後のマウス肝臓における癌病巣の連続切片である。 上段は複合体を 投与したマウスの癌病巣であり、 下段は裸の s i RNAを投与したマウスの癌病 巣である。 フルォレセインが検出された上段右の図では広範囲に青色に染色され た。 したがって当該リボソームを用いることにより、 増殖巣の癌細胞へ s i RN Aがデリバリ一される可能性が示唆された。
試験例 6 当該リボソームを用いた s i RNAの効果 （5) — i n v i vo効 果ー
ヌ一ドマウス （BALBZc, nu/nu, ォス， 5週齢） の脾臓に A549 細胞 （106細胞 マウス） を移植し、 10分後に脾臓を摘出した。 移植 6日後 から 45日後まで、実施例 1で示した方法で調製した b c 1— 2 s iRNA (配 列番号 1および 2) を含む複合体を週 1回 （計 6回） または週 3回 （計 18回） の頻度で各回 1 Omg/k g静脈内投与した。コントロール群には週 3回、 10% マルトース溶液を投与した （計 18回） 。 図 8および表 3に、 移植 34日後 （投 与期間途中） の各群のマウス肝臓観察結果と肝重量を示す。
表 3
Figure imgf000023_0001
試験例 7 当該リボソームを用いた s iRNAの効果 （6) 1 n V 1
V o 効果一
ヌードマウス （BALBZc, nu/nu, ォス， 5週齢） の脾臓に A 549 細胞 （106細胞 マウス） を移植し、 10分後に脾臓を摘出した。 移植 6日後 から 45日後まで、実施例 1で示した方法で調製した b c 1— 2 s iRNA (配 列番号 1および 2) を含む複合体を週 1回 （計 6回） または週 3回 （計 18回） の頻度で静脈内投与した。 コントロール群には週 3回、 10%マルトース溶液を 投与した （計 18回） 。 図 9は移植後 100日までのマウスの生存匹数を示した グラフである。
両薬物投与群とコントロール群との間の力プランマイヤー曲線を一般化ウィル コクソン検定したところ、 統計的に有意差が認められた （P<0. 01) 。 試験例 7— 2 当該リボソームを用いた s i RNAの効果 （7) — i n v i v o効果—
ヌードマウス （BALBZc、 nu/nu, ォス、 5週齢） の脾臓に A549 細胞 （106細胞/ /マウス） を移植し、 10分後に脾臓を摘出した。 移植 6日後 から 44日後まで、実施例 1で示した方法で調製した be 1—2 s iRNA (配 列番号 9および 10) を含む複合体を、 週 2回 （計 12回） の頻度で静脈内投与 した。 1回当たりの投与量は、当該 s i RNAとして 1 Omg/kg体重とした。 コントロール群には週 2回、 10%マルトース溶液を投与した （計 12回） 。 図 10は移植後 100日までのマウスの生存匹数を示したグラフである。
b c 1 -2 s i RNA投与群とコントロール群との間の力プランマイヤ一曲 線を一般ィヒウィルコクソン検定したところ、 統計的に有意差が認められた （Pく 0. 01) 。
試験例 7— 3 当該リボソームを用いた s iRNAの効果 （8) —用量依存性 ヌードマウス （BALBZc、 nu/nu, ォス、 5週齢） の脾臓に A 549 細胞 （106細胞 マウス） を移植し、 10分後に脾臓を撺出した。 移植 6日後 から 44日後まで、実施例 1で示した方法で調製した b c 1 -2 s i RNA (配 列番号 9および 10) を含む複合体を、 週 2回 （計 12回） の頻度で静脈内投与 した。 1回当たりの投与量は、当該 s i RNAとしてそれぞれ lmgZkg体重、 3mgZkg体重、 1 OmgZk g体重とした。 コントロール群には週 2回、 1 0%マルトース溶液を投与した （計 12回） 。 その結果を図 11に示す。
lmg/kg体重投与群、 3mgZkg体重投与群、 10mg/kg体重投与 群とコントロール群との間の、 癌移植 69日後までの力プランマイヤー曲線を一 般化ウィルコクソン検定したところ、 統計的に有意差が認められた （それぞれ P く 0. 05、 Pく 0. 01、 Pく 0. 01) 。
試験例 7— 4 当該リボソームを用いた s iRNAの効果 （9) 一連続投与ス ケジュールの検討一
ヌードマウス （BALB/c、 nu/nu, ォス、 5週齢） の脾臓に A 549 細胞 （106細胞/マウス） を移植し、 10分後に脾臓を摘出した。 移植 5日後 から 10日後まで、 または移植 5日後から 20日後まで、 実施例 1で示した方法 で調製した b c 1 -2 s i RNA (配列番号 9および 10) を含む複合体を、 週 5回（計 5回または 12回）の頻度で静脈内投与した。 1回当たりの投与量は、 当該 s i RNAとして 1 OmgZk g体重とした。 コントロール群には週 5回、 10%マルトース溶液を投与した （計 12回） 。 その結果を図 12に示す。 癌移植 69日後において、 5回投与群および 12回投与群共に 10匹全てが生 存していた。 そして、 両薬物投与群とコントロール群との間の、 癌移植 69日後 までの力ブランマイヤー曲線を一般化ウィルコクソン検定したところ、 統計的に 有意差が認められた （P<0. 01) 。
試験例 7— 5 当該リボソームを用いた局所投与効果 — i n V i v o効果一 ヌードマウス （BALB/c、 nu/nu, ォス、 5週齢） の右脇腹皮下に、 100 Lの PB Sに懸濁した 2. 5X 106個の P C _ 3細胞を移植した。 移 植 7日後から 18日後まで、 実施例 1で示した方法で調製した b c 1— 2 s i RNA (配列番号 1および 2、 配列番号 9および 10) を含む複合体を、 週 5回 (計 10回） の頻度で癌周辺部の皮下へ投与した。 1回当たりの投与量は、 当該 s i RNAとして 0. lmgZマウスとした。コントロール群には週 5回、 10 % マルトース溶液を投与した （計 10回） 。 腫瘍体積は、 腫瘍を楕円体とみなし、 「体積 =短径 X短径 X長径 ÷2」 の式により求めた。 その結果を図 13に示す。 腫瘍体積の増加は、 各複合体投与群とコントロール群との間でいずれも癌移植 14日後から 36日後に渡って統計的に有意に減少した （Pく 0. 01、 ダネッ ト検定） 。
試験例 8 s i RNA/当該リボソーム複合体の組織内濃度
(1) トリチウム標識 s i RNAの合成
トリチウム （3H) による内部標識の s i RNAの合成には S i 1 e n c e rT M s i RNA Con s t r u c t i on k i t (Amb i o n) を用い、 T 7ポリメラ一ゼの転写反応の際、 3Η標識 ATP (NET— 420、 パーキン エルマ一ライフサイエンス） を基質の一部として取り込ませた。 3H標識 ATP は反応液 20 xLにっき 3. 7Mb q (2. 7 nmo 1 e) を添加し、 キットの 添付書類に従い二本鎖 s i RNAを合成した。 その後反応液をフエノール Zクロ 口ホルム処理してタンパク質を除去し、 さらに G— 25スピンカラム （フアルマ シァ） による未反応モノマーの除去を行った。 得られた3 H標識二本鎖 s i RN Aを 12%アクリルアミドゲルで電気泳動し、 イメージアナライザー （BAS 2 500、 富士写真フィルム） で検定したところ、 サイズは 20から 21塩基対で モノマーを含まないことを確認した。 (2) 複合体の調製
実施例 1の方法および実施例 2の方法によりそれぞれ平均粒子径が 187. 5 nmの s i RNA複合体と43. 3nmの s i RNA複合体を調製した。 それぞ れの複合体は3 H標識体と未標識体を混合したもので調製し、 比活性は 1000 d pmZ gから 2000 d pmZ gに調整した。
(3) 組織内濃度の測定
マウス （ddy、 4週齢、 ォス、 日本エスエルシ一） に 5mgZkg (s i R NA濃度）で上記の 2種類の大きさの複合体を尾静脈より投与した。投与後、 5、 15および 60分後にマウスをエーテル麻酔下で採血致死させた。 血漿取得のた めの抗血液凝固剤にはへパリンを用いた。 次いで肝臓、 肺、 心臓、 脾臓および腎 臓を摘出し、 それぞれの湿重量を測定した。 摘出した臓器を含むバイアル中に 1 mLの組織溶解剤 （ソルバブル TM、 パッカード） を加え、 40°Cで一晩振とうし て組織を溶解させた （ただし肝臓と腎臓は一部を秤量し溶解した） 。 赤血球由来 の着色が認められるサンプルには 30 %過酸化水素水を 100 L添加して脱色 した後、 各バイアルに 1 OmLのシンチレ一シヨンカクテル （ハイォニックフロ 一 TM、 パッカード） を添加、 混合した。 液体シンチレ一シヨンカウンター （25 00TR、 パッカード） により各臓器の単位重量あたりに含まれる放射活性を測 定し、 複合体として投与した s i RNAの組織内濃度を算出した。
(4) 結果
図 14から明らかなように、 平均粒子径が 43. 3nmの複合体は 187. 5 nmの複合体に比べて肝臓および脾臓といった細網内皮系における捕捉が極めて 減少し、 血漿中濃度が著しく上昇していることが判つた。
試験例 9 当該リボソームを用いたアンチセンス DN Aの効果
6 cm径のシャーレに A431細胞を 2. 5X 105個 Zd i s hで播種し一 晚培養した。 翌日新鮮な上記培地 2. 25mLに交換し、 これに実施例 3で述べ たのと同様の方法で調製した b c 1— 2に対するアンチセンス DNA (配列番号 5) を含む複合体分散液 0. 25 mLを培地に添加した。 添加時の複合体分散液 は 10%マルトース液により終濃度の 10倍濃度に濃度調整して添加している。 なお陰性対照として逆向き配列 （配列番号 6) を含む複合体も調製し、 同時に添 加した。 添加 72時間後に細胞を回収し、 試験例 1記載の方法と同様に B e 1— 2タンパク質の発現を解析した。
図 1 5に示すように当該リボソームで b c 1一 2に対するアンチセンス DNA を細胞に移入させることにより、 B e 1—2タンパク質の発現が特異的に抑制で きた。
試験例 10 当該リボソームを用いた DNAェンザィムの効果
6 cm径のシャーレに A431細胞を 2. 5 X 105個 Zd i s hで播種し一 晚培養した。 翌日新鮮な上記培地 1. 8mLに交換し、 これに実施例 4で述べた のと同様の方法で調製した B c 1— 2に対する DNAェンザィム （配列番号 7) を含む複合体分散液 0. 2mLを培地に添加し終濃度 1 ;( Mとした。 添加時の複 合体分散液は 10%マルト一ス液により終濃度の 10倍濃度に濃度調整して添加 している。 なお陰性対照の DNAェンザィムとして、 その酵素活性を消失する ようにポイントミューテ一シヨンを導入したもの （配列番号 8) を含む複合体も 同時に調製し添加した。 さらに複合体添加後 24時間に新鮮な培地に交換し、 再 度同様の複合体を添加し、 最初の複合体添加から 72時間後に細胞を回収し、 試 験例 1記載の方法と同様に B e 1 _ 2タンパク質の発現を解析した。
図 16に示した結果のように、 当該リボソームで B e 1—2に対する DNAェ ンザィムを細胞に移入させることにより、 B e 1— 2のタンパク質の発現を特異 的に抑制することが示された。 産業上の利用可能性
本発明は、 主成分として 2—〇一 （2—ジェチルアミノエチル） 力ルバモイル 一 1， 3— O—ジォレオイルグリセロールとリン脂質とから構成される力チォニ ックリボソームにオリゴ核酸が担持されている複合体を提供する。 前記複合体は 生体への投与が可能であり、 生体内での薬効発揮により医薬品として実用可能で あり、 前記複合体を含む前記オリゴ核酸の標的分子 （標的 DNA、 標的 RNA、 標的夕ンパク質） が関与する疾患の治療用または予防用医薬組成物として利用す ることができる。

Claims

請求の範囲
1. 主成分として 2—0— （2—ジェチルアミノエチル） 力ルバモイル— 1, 3 _0—ジォレオイルグリセロールとリン脂質とから構成されるカチォニックリ ポソームに 10〜50の核酸塩基を有するオリゴ核酸が担持されている複合体。
2. 前記リン脂質がレシチンである、 請求項 1記載の複合体。
3. 平均粒子径が 10〜 100 nmの範囲内である、 請求項 1または 2記載の 複合体。
4. 前記オリゴ核酸が、 RNAもしくは DNA、 またはそれらいずれかの誘導 体である、 請求項 1ないし 3のいずれか 1項に記載の複合体。
5. 前記 RNAもしくは DNA、 またはそれらいずれかの誘導体が、 s i RN A、 s hRNA、アンチセンス DNA、アンチセンス RNA、 DNAェンザィム、 リボザィム、 またはアブタマ一である、 請求項 4記載の複合体。
6. 前記オリゴ核酸が、 配列番号 1に示す配列における 3' 末端の 2塩基の d Tを除いた部分からなるセンス鎖 RNAと、 配列番号 2に示す配列における 3 ' 末端の 2塩基の d Tを除いた部分からなるァンチセンス鎖 R N Aを二重鎖形成部 として含むォリゴ 2本鎖 R N Aである、 請求項 1ないし 4記載の複合体。
7. オリゴ核酸の標的分子 （標的 DNA、 標的 RNA、 標的タンパク質） が存 在する細胞内へデリバリーされる、 請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の複 合体。
8. オリゴ核酸の標的分子が、 b c 1— 2、 c -my c、 b c r— a b 1に代 表される癌遺伝子、 HIVウィルス、 C型肝炎ウィルス、 B型肝炎ウィルスに代 表されるウィルス遺伝子、 もしくは TNF—ひ、 F a sに代表される炎症関連遺 伝子、 もしくはこれら遺伝干の転写産物もしくは翻訳産物、 または任意のタンパ ク質をコードしないゲノム DNAもしくはタンパク質発現の調節に働く RNAで ある、 請求項 7記載の複合体。
9. 請求項 1ないし 8のいずれか 1項に記載の複合体を含む、 オリゴ核酸の標 的分子 （標的 DNA、 標的 RNA、 標的タンパク質） が関与する疾患の治療用ま たは予防用医薬組成物。
1 0 . 該疾患が癌である、 請求項 9記載の医薬組成物。
1 1 . 該疾患がウィルス性疾患である、 請求項 9記載の医薬組成物。
1 2 . 該疾患が炎症性疾患である、 請求項 9記載の医薬組成物。
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