WO2004063217A1

WO2004063217A1 - 二量体化ペプチド

Info

Publication number: WO2004063217A1
Application number: PCT/JP2004/000254
Authority: WO
Inventors: Haruo Sugiyama; Hideo Takasu; Fumio Samizo
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha; Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
Priority date: 2003-01-15
Filing date: 2004-01-15
Publication date: 2004-07-29
Also published as: US20060217297A1; JP4926231B2; EP1584627A4; CN101851275A; AU2004204031B2; KR20120054644A; JPWO2004063217A1; KR101399678B1; HK1141539A1; BRPI0406800B8; ES2332590T3; CN1756763B; US20100292164A1; JP2010047603A; HK1081975A1; DE602004023476D1; EP2154145A3; CA2513701C; EP2154145A2; CN1756763A

Abstract

　新たな癌抗原ペプチドおよび当該癌抗原ペプチドの癌ワクチンを提供する。　少なくとも１つのシステイン残基を含みかつ７～３０個のアミノ酸残基からなる、癌抗原ペプチドを生じさせる２つのペプチド単量体がジスルフィド結合により結合しているペプチド二量体に関する。

Description

明細書二量体化ぺプチド技術分野

本発明は、癌ワクチン療法の分野に属し、詳細には細胞傷害性 T細胞誘導活性を有する癌抗原ぺプチドを生じさせるぺプチドニ量体およびそれを含有する医薬組成物に関する。背景技術

生体による癌細胞やウィルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性 T細胞（以下、 CTLと称する）が重要な働きをしている。 CTLは、癌細胞上の癌抗原タンパク質由来の抗原ペプチド（癌抗原ペプチド）と MHC (Major Histocompatibility Complex) クラス I抗原（ヒトの場合は HLA抗原と称する）とにより形成される複合体を認識し、癌細胞を攻撃 '破壌する。癌抗原タンパク質は、 Immunity, vol.10： 281, 1999の表中に記載のものが代表例として挙げられる。具体的には、メラノサイト組織特異的タンパク質である g p i 00 (J. Exp. Med., 179： 1005， 1994) 、 MART— 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994) 、およびチロシナーゼ（J. Exp. Med., 178： 489， 1993〉などのメラノソーム抗原、ならびにメラノーマ以外の癌抗原タンパク質として HER 2 ^n e u (J. Exp. Med., 181: 2109, 1995) 、 CEA (J. Natl. Cancer. Inst. , 87:982, 1995) 、およぴ PS A (J. Natl. Cancer. Inst. , 89:293， 1997) などの癌マーカーがある。

癌抗原べプチドは、癌抗原タンパク質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成される約 8から 11個のアミノ酸から成るペプチドである（Cur.

Opin, Immunol. , 5: 709， 1993； Cur. Opin, Immunol. , 5： 719, 1993； Cell, 82： 13， 1995； Immunol. Rev., 146： 167, 1995) 。前記のように、この生成された癌抗原べプチドと MH Cクラス I抗原 (HL A抗原）との複合体が細胞表面に提示され、 CTLにより認識される。従って、 CTLによる癌細胞破壌を利用する癌免疫療法剤（癌ワクチン）を開発する場合、 CTLを効率良く誘導できる癌抗原べプチドを癌抗原タンパク質から同定することが、非常に重要となる。発明の開示

本発明の目的は、ィン■ビポにて有用な癌抗原ぺプチドから誘導される新たな癌抗原を提供することにある。

本発明者らは、癌抗原ペプチドとして証明されているペプチドの中にはシスティン残基が含まれているものがあり、意外にもこのようなぺプチドをニ量体化させて投与すると単量体と同等の C T Lの誘導活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、

( 1 ) 少なくとも 1つのシスティン残基を含みかつ 7〜 30個のァミノ酸残基からなる、 CTL誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる 2つのべプチド単量体が相互にジスルフィド結合により結合しているペプチド二量体；

(2) CTL誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる、上記 (1) 記載のぺプチドニ量体；

(3) 2つのペプチド単量体が 1または 2個のジスルフィド結合によ結合している、上記 (1) または（2) 記載のペプチド二量体；

(4) ペプチド単量体が癌抑制遺伝子産物 WT 1に由来する、上記 (1) 〜 (3) のいずれか記載のぺプチドニ量体；

( 5 ) ぺプチド単量体が Cys Xaa Thr Trp Asn Gin Met Asn Xaa (配列番号： 72) (第 2位の Xaaは、 Tyr、 Phe、 Metおよび Trpからなる群より選ばれる 1 つのアミノ酸残基を示し、第 9位の Xaaは、 Phe、 Leu、 Ile、 Trpおよ tBfetからなる群より選ばれる 1つのアミノ酸残基を示す）である、上記（1) 〜（4) のいずれか記載のぺプチドニ量体：

( 6 ) ぺプチド単量体が Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 1 1 ) 、 Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe (配列番号： 1 8 ) 、 Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr (配歹 lj番号： 1 9 ) 、 Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu (配列番号： 20 ) 、 Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu (配列番号： 21) 、 Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 22)、 Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu (配列番号： 23) および Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 44) からなる群より選ばれる、上記

(1) 〜（4) のいずれ力記載のペプチド二量体；

(7) 上記 (1) 〜（6) のいずれか記載のペプチド二量体と製薬的に許容されうる担体とを含有してなる医薬組成物；

(8) 癌ワクチンとして使用される、上記 (7) に記載の医薬組成物；

(9) 上記（1) 〜（6) のいずれ力記載のペプチド二量体における、癌ヮクチンを製造するための使用；および

(10) 癌を治療または予防するための方法であって、上記 (1) 〜（6) のいずれカゝ記載のぺプチドニ量体の治療または予防に有効な量を、それを必要としている WT 1陽性の患者に投与する方法：

に関する。 ' 図面の簡単な説明

図 1は、トランスジエニックマウスにおけるペプチド二量体（配列番号： 4 4) による CTL誘導の結果を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

本発明のぺプチドニ量体は、 2つのぺプチド単量体間における少なくとも 1対のシスティン残基の S H基間でのジスルフィド結合によって 2つの単量体が相互に結合して二量体化している。

本発明のぺプチドニ量体は C T Lの誘導能を有するものであり、誘導された C

TLは、細胞傷害作用ゃリンフォ力インの産生を介して抗癌作用を発揮することができる。従って本発明の二量体は、癌の治療または予防のための癌ワクチンに使用することができる。

本発明のぺプチドニ量体を構成するぺプチド単量体は、少なくとも 1つのシスティン残基を含みかつ 7〜 30個のァミノ酸残基からなり、そして C T L誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる。「癌抗原ペプチドを生じさせる」とは、ペプチド単量体が H L A抗原と結合して細胞傷害性 T細胞 (C T L) により認識される癌抗原ペプチドを生じさせる、という特性を有する意味である。ペプチド単量体は、それ自身 C T L誘導活性を有している限り特に制限されるものではないが、多くの癌種で高発現しているヒト W i l m s癌の癌抑制遺伝子 WT 1

(Cell. , 60: 509， 1990、 NCBIデータベース Accession No. XP— 034418、配列番号： 1 ) に由来しかつシスティン残基を少なくとも 1つ含有するものが好ましい。 WT 1遺伝子は、 W i l m s癌、無紅彩、泌尿生殖異常、精神発達遅延などを合併する WAG R症候群の解析から W i l m s癌の原因遺伝子の 1つとして染色体 1 1 1 3から単離され（Nature, 343： 774, 1990) 、そのゲノム D NAは約 5 O kbであり 1 0のェキソンから成り、そしてその c D NAは約 3kbである。 c D

NAから推定されるアミノ酸配列は、配列番号： 1に示す通りである（Cell. , 60:509, 1990) 。 WT 1遺伝子はヒト白血病で高発現しており、白血病細胞を W T 1アンチセンスオリゴマーで処理するとその細胞増殖が抑制される（特開平 9 - 1 0 4 6 2 7号公報）ことなど力ら、 WT 1遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆されている。さらに、 WT 1遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現しており（特開平 9一 1 0 4 6 2 7号公報および国際公開第 00/0⁶⁶0²号パンフレット）、白血病および固形癌における新しい癌抗原タンパク質であることが判明した（J. Immunol. , 164： 1873-80, 2000および J. Clin. Immunol. , 20, 195 - 202， 2000) 。癌免疫療法（癌ワクチン）は多くの癌患者に対して適用可能であることが好ましいことから、多くの癌種で高発現している WT 1における癌抗原べプチドの同定、および当該癌抗原ぺプチドを利用した癌ワクチンの開発は重要である。これに関し、国際公開第 00/06602号パンフレツトおよび国際公開第 00/1S79⁵号パンフレツトには、 WT 1タンパク質の部分から成る幾つかの天然型の癌抗原ぺプチドが記載されているが、ィン■ビポでの効果は知られていない。

本発明に用いられる他のペプチド単量体としては、 Immunity, vol. 10： 281, 1999の表中に記載の癌抗原タンパク質由来の癌抗原べプチドであり力つシスティン残基を少なくとも 1つ含有するものが拳げられる。 C T L誘導活性は、 H L Aテトラマー法（Int. J. Cancer: 100， 565-570 (2002) ) または限界希釈法 (Nat. Med. :4, 321-327 (1998) )により C T Lの数を測定することにより確認することができる。あるいは、例えば HLA-A24拘束性の C T L誘導活性の場合、国際公開第 02/47474号パンフレットおよび Int. J. Cancer: 100, 565-570 (2002)に記述された HLA-A24モデルマウスを用いることなどにより調べることができる。

ペプチド単量体のアミノ酸残基の個数は 7〜 3 0個であるが、 8〜1 2個が好ましく、 9〜1 1個がより好ましい。ペプチド単量体中のシスティン残基の数は、 H L Aとの結合モチーフとぺプチドの長さとを考慮し、 1または 2個であることが好ましい。

ペプチド単量体は、通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ぺプタイド'シンセシス（Peptide Synthesis ) ， Interscience, New York, 1966；ザ ·プロテインズ (The

Proteins) , Vol 2， Academic Press Inc. ， New York, 1976；ぺプチド合成, 丸善（株）， 1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）， 1985 ;医薬品の開発続第 14卷 'ペプチド合成，広川書店， 1991) などに記載されている方法が挙げられる。

得られたぺプチド単量体は、通常のぺプチド化学に用いられる方法に準じて分子間でジスルフィド結合を形成することができる。ジスルフィド結合の形成方法は、文献（ぺプタイド■シンセシス（Peptide Synthesis ) ， Interscience,

New York, 1966；ザ ·プロテインズ (The Proteins) , Vol 2， Academic Press Inc. ， New York, 1976；ぺプチド合成，丸善（株）， 1975；ぺプチド合成の基礎と実験、丸善（株） , 1985 ;医薬品の開発続第 14卷'ペプチド合成，広川書店， 1991) などに記載されている方法が挙げられる。

具体的には、ペプチド単量体に含まれるシスティン残基が 1個の場合、システィン側鎖の保護基を含むすべての保護基を除去した後、ぺプチド単量体を含む溶液をアルカリ条件下で空気酸化反応に付す方法、あるいは、アルカリ性または酸性条件下酸化剤を添カ卩してジスルフィド結合を形成する方法などが挙げられる。ここで、酸化剤としては、ヨウ素、ジメチルスルホキシド（DMS O) 、フェリシアン化力リゥムなどが挙げられる。

システィン残基が 2個以上の場合も、前記と同様の方法を用いることができる。この場合はジスルフィド結合様式が異なる異性体が得られる。システィン側鎖の保護基を特定の組み合わせにすることにより、目的のシスティン残基間でジスルフィド結合を形成した二量体を得ることができる。前記保護基の組み合わせとしては、 M e B z 1 (メチルベンジル）基と A c m (ァセトアミドメチノレ）基、 T r t (トリチル）基と A c m基、 N p y s ( 3—ニトロ一 2—ピリジルチオ) 基と A c m基、 S—B u _ t ( S— tert—プチル）基と A c m基などが挙げられる。例えば M e B z 1基と A c m基の組み合わせの場合、まず M e B z 1基とシステイン側鎖以外のその他の保護基を除去した後、ペプチド単量体を含む溶液を空気酸化反応に付して脱保護されたシスティン残基間にジスルフィド結合を形成し、次いでヨウ素による脱保護および酸化を行って A c m基で保護されていたシステイン残基間にジスルフィド結合を形成する方法などが挙げられる。

得られたぺプチドニ量体は、通常のぺプチド化学に用いられる方法に準じて精製することができる。ペプチド二量体の精製方法は、文献（ぺプタイド ·シンセシス (Peptide Synthesis ) ， Interscience, New York, 1966；ザ ·プロテインズ (The Proteins) ， Vol 2 , Academic Press Inc. ， New York, 1976；ぺプチド合成，丸善（株）， 1S75 ;ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）， 1985 ;医薬品の開発続第 14巻 ·ペプチド合成，広川書店， 1991) などに記載されているが、 H P L Cが好ましい。

このようにして得られた本発明のぺプチドニ量体は、システィン残基がジスルフィド結合を形成していることにより、溶液中での酸化剤等に対する安定性に優れており、医薬品原料として一定の品質と C T Lの誘導活性を保持するものである。

本努明に用いられるぺプチド単量体の好ましい具体例として WT 1を例に以下に示す。なお、本明細書においてアミノ酸残基を略号で表示する場合、次の 3文字表記または 1文字表記を用いる：

Ala (A) ：ァラニン残基、 Arg (R) ：アルギ-ン残基、 Asn (N) ：ァスパラギン残基、 Asp (D) ：ァスパラギン酸残基、 Cys (C) ：システィン残基、 Gin (Q) ：グルタミン残基、 Glu (E) ：グルタミン酸残基、 Gly (G) ：グリシン残基、 His (H) ：ヒスチジン残基、 lie (I) ：イソロイシン残基、 Leu (L) ：ロイシン残基、 Lys (K) ：リジン残基、 Met (M) ：メチォニン残基、 Phe (F) ：フエニノレアラニン残基、 Pro (P) ：プロリン残基、 Ser (S) ：セリン残基、 Thr

(T) ：トレオニン残基、 Tip (W) ：トリプトファン残基、 Tyr (Y> ：チロシン残基、 Val (V) ：パリン残基。

表中、「位置」とは配列番号 1に記載のヒト WT 1におけるペプチドの位置を示す。

表 1

HLA-A1拘束性ペプチド単量体

表 2

HLA-A0201拘束性ペプチド単量体位アミノ酸配列配列番号

280-288 ILCGAQYRI 10

235-243 CMTWNQMNL 11

227-235 YQMTSQLEC 12 408-416 KTSEKPFSC 13

228-236 QM SQLECM 14

86-94 EQCLSAFTV 15

HLA-A0205拘束性ペプチド単量体位置アミノ酸配列配列番号

235-243 CMTWNQMNL 11

227-235 YQM SQLEC 12

194-202 SVPPPVYGC 16

280-288 ILCGAQYRI 10

81-89 AEPHEEQCL 17 表 4

HLA-A24拘束性ペプチド単量体

：配列番号 11において、 236位 Mを Yに改変表 5

HLA-A3拘束性ペプチド単量体

表 7

HLA-A1101拘束性ペプチド単量体

HLA-A3101拘束性ペプチド単量体位置アミノ酸配列配列番号

386-394 KTCQRKFSR 6

137-145 CLESQPAIR 2

100-108 FTGTAGACR 26

325-333 CAYPGCNKR 7

279-287 PILCGAQYR 30

354-362 QCDFKDCER 4

383-391 FQCKTCQRK 25

358-366 KDCERRFSR 31

HLA-A3302拘束性ペプチド単量体位置アミノ酸配列配列番号

409-417 TSEKPFSCR 5

137-145 CLESQPAIR 2

表 1 0

HLA-B14拘束性ペプチド単量体位置アミノ酸配列配列番号

329-337 GCNKRYFKL 33 表 1 1

HLA-B40拘束性ペプチド単量体位アミノ酸配列配列番号

81-89 AEPHEEQCL 17

410-418 SEKPFSCRW 34

318-326 SEKRPFMCA 35

233-241 LECMTWNQM 36

349-357 GEKPYQCDF 37

85-93 EEQCLSAFT 38

23-31 GCALPVSGA 39

206-214 TDSCTGSQA 40

24-32 CALPVSGAA 41

84-92 HEEQCLSAF 42 HLA-B60拘束性ペプチド単量体

表 1 4

HLA-B62拘束性ペプチド単量体

表 1 5

HLA-B7拘束性ペプチド単量体位置アミノ酸配列配列番号

130-138 NAPYLPSCL 20

208-216 SCTGSQALL 45

18-26 LGGGGGCAL 46

207-215 DSCTGSQAL 23

209-217 CTGSQALLL 43

329-337 GCNKRYFKL 33

235-243 CMTWNQMNL 11 表 1 6

H LA-B8拘束性ぺプチド単量体位アミノ酸配列配列番号

329-337 GCNKRYFKL 33

208-216 SCTGSQALL 45 130-138 NAPYLPSCL 20

420-428 SCQKKFARS 51

387-395 TCQRKFSRS 52

207-215 DSCTGSQAL 23

384-392 QCKTCQRKF 49

136-144 SCLESQPAI 53

347-355 HTGEKPYQC 54 表 1 7

HLA-B2702拘束性ペプチド単量体位置アミノ酸配列配列番号

416-424 CRWPSCQKK 55

107-115 CRYGPFGPP 56 表 1 8

HLA-B2705拘束性ペプチド単量体位置アミノ酸配列配列番号

416-424 CRWPSCQKK 55

383-391 FQCKTCQRK 25 表 1 9

HLA-B3501拘束性ペプチド単量体位置アミノ酸配列配列番号

278-286 TPILCGAQY 57

327-335 YPGCNKRYF 58 82-90 EPHEEQCLS 59

207-215 DSCTGSOAL

412-420 KPFSCRWPS 60 表 2 0

HLA-B3701拘束性ペプチド単量体估晋 - y sノノ蹄 gg西c;グ^リ 1 目 Gグリ Φ

81-89 AEPHEEQCL 17

85-93 EEQCLSAFT 38

208-216 SCTGSQALL 45

209-217 CTGSQALLL 43

206-214 TDSCTGSQA 40

84-92 HEEQCLSAF 42

233-241 LECMTWNQM 36

349-357 GEKPYQCDF 37 表 2 1

HLA-B3801拘束性ペプチド単量体 M アミノ酸配列配列番号

202-210 CHTPTDSCT 61

417-425 RWPSCQKKF 22

327-335 YPGCNKRYF 58

208-216 SCTGSQALL 45

18-26 LGGGGGCAL 46

83-91 PHEEQCLSA 62 表 2 2

HLA-B3901拘束性ペプチド単量体位 ii アミノ酸配列配列番号

136-144 SCLESQPAI 53

208-216 SCTGSQALL 45

207-215 DSCTGSQAL 23 表 2 3

H LA-B3902拘束性ぺプチド単量体位アミノ酸配列配列番号

130-138 NAPYLPSCL 20

209-217 CTGSQALLL 43

207-215 DSCTGSQAL 23

208-216 SCTGSQALL 45

329-337 GCNKRYFKL 33 表 2 4

H LA-B4403拘束性ぺプチド単量体位置アミノ酸配列配列番号

349-357 GEKPYQCDF 37

84-92 HEEQCLSAF 42

410-418 SEKPFSCRW 34

278-286 TPILCGAQY 57

318-326 SEKRPFMCA 35

81-89 AEPHEEQCL 17 no 上丄 / <jr し It X OKJ

85-93 EEQCLSAFT 38

T , M WNOM ΟΌ

104-112 AGACRYGPF 63 表 2 5

HLA-B5101拘束性ペプチド単量体位アミノ酸配列配列番号

130-138 NAPYLPSCL 20

20-28 GGGGCALPV 47

18-26 LGGGGGCAL 46

418-426 WPSCQKKFA 64

82-90 EPHEEQCLS 59

280-288 ILCGAQYRI 10

204-212 TPTDSCTGS 65 表 2 6

HLA-B5102拘束性ペプチド単量体位置アミノ酸配列配列番号

130-138 NAPYLPSCL 20

20-28 GGGGCALPV 47

412-420 KPFSCRWPS 60

18-26 LGGGGGCAL 46

24-32 CALPVSGAA 66

136-144 SCLESQPAI 53

418-426 WPSCQKKFA 64 351-359 KPYQCDFKD 67 表 2 7

HLA-B5201拘束性ペプチド単量体位置アミノ酸配列配列番号

86-94 EQCLSAFTV 15

20-28 GGGGCALPV 47

327-335 YPGCNKRYF 58

104-112 AGACRYGPF 63 表 2 8

HLA-B5801拘束性ペプチド単量体 M アミノ酸配列配列番号

230-238 TSQLECMTW 68

408-416 KTSEKPFSC 13

276-284 HTTPILCGA 69

347-355 HTGEKPYQC 54

317-325 TSEKRPFMC 9 表 2 9

H LA-CW0301拘束性ぺプチド単量体位置アミノ酸配列配列番号

329-337 GCNKRYFKL 21

24-32 CALPVSGAA 41

136-144 SCLESQPAI 53 130-138 NAPYLPSCL 20 表 3 0

HLA-CW0401拘束性ペプチド単量体ァ =ゾ職 5¹511 し

356-364 DFKDCERRF 18

327-335 YPGCNKRYF 58

326-334 AYPGCNKRY 19

417-425 RWPSCQKKF 22

278-286 TPILCGAQY 57

99-107 QFTGTAGAC 70 表 3 1

HLA-CW0602拘束性ペプチド単量体位置アミノ酸配列配列番号

130-138 NAPYLPSCL 20

319-327 EKRPFMCAY 71

207-215 DSCTGSQAL 23 表 3 2

HLA- CW0702拘束性ぺプチド単量体アミノ酸配列配列番号

319-327 EKRPFMCAY 71

326-334 AYPGCNKRY 19

278-286 TPILCGAQY 57 327-335 YPGCNKRYF 58

101-109 TGTAGACRY 50

130-138 NAPYLPSCL 20

84-92 HEEQCLSAP 42

HLA分子には多くのサブタイプが存在し、結合できる抗原ぺプチドのァミノ酸配列にはそれぞれのタイプについて規則性（結合モチーフ）が存在することが知られている。 HLA- A24の結合モチーフとして、 8〜11アミノ酸からなるペプチドのうちの第 2位のアミノ酸がチロシン（Tyr) 、フエ二ルァラニン (Phe；)、メチォ二ン（Met) またはトリプトファン（Trp) であり、 C末端のアミノ酸がフエニルァラニン (Phe)、ロイシン (Leu)、イソロイシン（Ile)、トリプトファン（Trp)またはメチォニン (Met)となることが知られている（J. Immunol. , 152， p3913， 1994、 I隱 biogenetics, 41， pl78， 1995、 J. Immunol. , 155, p4307, 1994) 。従って、上記表 4に示すぺプチド単量体に加え、ぺプチド単量体が Cys Xaa Thr Trp Asn Gin

Met Asn Xaa (配列番号： 7 2 ) (第 2位の Xaaは、 Tyr、 Phe、 Metおよび Trpからなる群より選ばれる 1つのアミノ酸残基を示し、第 9位の Xaaは、 Phe、 Leu、 Ile、 Trpおよひ etからなる群より選ばれる 1つのアミノ酸残基を示す）であるぺプチドも、 HLA - A24拘束性ペプチド単量体として好適に用いられる。

また HLA- A0201の結合モチーフとして、 8〜11アミノ酸からなるぺプチドのうちの第 2位のアミノ酸がロイシン（Leu) またはメチォニン (Met) であり、 C末端のアミノ酸がバリン (Val)またはロイシン (Leu)となることが知られている。 HLA - A0205の結合モチーフとして、 8〜11アミノ酸からなるペプチドのうちの第 2位のアミノ酸がパリン (Val)、ロイシン (Leu)、イソロイシン（lie) またはメチォ二ン（Met) であり、 C末端のアミノ酸がロイシン（Leu)となることが知られている

(Immunogenetics, 41， pl78, 1995、 J. Immunol. , 155 :p4749, 1995) 。従って、上記表 2または 3に示すぺプチド単量体の第 2位のァミノ酸または C末端のァミノ酸を上記モチーフのいずれかに置換したペプチドも HLA- Α0¾)1または HLA-A0205拘束性ぺプチド単量体として好適に用いられる。

上記表 4に示すペプチド単量体が本宪明においては特に好適に用いられる。表 4中、配列番号： 4 4のぺプチドは、配列番号： 1 1 ( 2 3 5 ~ 2 4 3位）のァミノ酸配列において 2 3 6位のメチォニンをチロシンに改変した非天然の改変型ペプチドである。よって、本発明におけるペプチド単量体には、天然型ペプチド中のシスティン残基以外の残基を一部改変したぺプチドであって、 C T Lの誘導活性を有するぺプチドも含まれる。

本発明は別の態様として、本発明のぺプチドニ量体と製薬的に許容されうる担体とを含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物中の有効成分であるぺプチド二量体の量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常 0. 0001mg〜1000mg、好ましくは 0. 001rag〜1000mg、より好ましくは 0. lmg〜20mgである。

本発明医薬組成物には有効成分として、本発明ペプチド二量体だけでなく、ぺプチド単量体を含むことができる。本宪明医薬組成物中に含まれる「ペプチド二量体」の割合は、 C T Lの誘導活性をもたらす限り特に制限されるものではない力 S、全ペプチド中 5 0 %以上であり、 7 0〜； L 0 0 %が好ましく、 8 0〜： L O 0 %がより好ましい。ペプチド二量体の割合は、高速液体クロマトグラフィー

(H P L C) により確認することができる。

製薬的に許容されうる担体は、細胞性免疫を増強する作用を有するものである。当該担体としては、例えばアジュバントが挙げられる。アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol. Rev. , 7 : 277-289， 1994) に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分、サイトカイン、植物由来成分、水酸化アルミニゥム如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリア二オン、ペプチド、または油乳濁液（ェマルジヨン製剤）などを挙げることができる。また、リボソーム製剤、直径数 μ πιのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤などの製剤化に必要な成分も担体に含まれる。

本発明医薬,袓成物の投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈內投与などが挙げられる。 C T Lを効率よく誘導する皮内投与や皮下投与が好ましい。投与回数および投与間隔は、治療または予防目的の疾患、患者の個体差により適宜調整することができる力通常複数回であり、数曰ないし数月に 1回投与するのが好ましい。

例えば、 WT I由来のペプチド単量体から構成されるペプチド二量体を含有する本発明医薬組成物を WT I陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞の H L A抗原にぺプチドが提示され、提示された H L A抗原複合体特異的 C T Lが増殖して癌細胞を破壌することができ、従って、癌の治療または予防が可能となる。本発明の医薬組成物は、 WT I遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、 fl旁胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または治療のために使用することができる。本発明はさらに別の態様として、本発明の医薬組成物を WT 1陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。実施例

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによりなんら限定されるものではない。

製造例 1

1.保護べプチド樹脂 (E-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn( rt)- Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-Resi の合成

Fmoc-Leu-Alko-樹月旨（ここに、 Alkoは p—アルコキシベンジルアルコール) 12 g (渡辺化学製； 0.81mmol/g)を Advanced ChemTech社製 ACT90型固相合成機の 500ml反応槽内に入れ、一旦この樹脂を DMF等で洗净後（工程 1〉、 25%Pip (ピペリジン）で処理（3分 X 1回及ぴ 15分 X 1回）して Fmoc基を切断後（工程 2 ) 、再び DMF等で樹脂を洗浄し（工程 1 ) 、 Pipを除去した。この反応槽内に、 Fmoc-Asn(Trt)-OH 29.36gと HOBT ( 1—ヒドロキシベンゾトリアゾール） 7.5gを NMP (N—メチルピロリジノン） 150mlに溶解した溶液を加え、更に DIPCI (N, N，一ジイソプロピルカルポジイミド） 7.6mlを加えて 30分間室温撹拌を行った（工程 3 ) 。 30分後、 NMPで樹脂を洗浄し（工程 4 ) 、 Fmoc-Asn(Trt)-OH 29.36gと ΉΟΒΤ 7.5gを用いて再度力ップリング反応を行い (工程 5 ) 、 Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko樹脂を合成した。その後、工程 2の脱保護操作を行い、 H-Asn(Trt)-Leu-Alko-樹脂とした。次いで、工程 1の洗浄操作を行い、 Fmoc-Met-OH 18.27g、 Fmoc-Gln(Trt)-OH 30.04g, Fmoc-Asn(Trt)- OH29.36g、 Fmoc-Trp(Boc) -OH 25.9 lg, Fmoc-Thr(tBu)-OH 19.56g_s Fmoc- Tyr(tBu)-OH22.60g、 Fmoc-Cys(Trt)-OH 28.82gを順次カロえ、工程 3のカップリング反応を行った。但し Fmoc- r(tBu)-OHについては力ップリングを 3回繰り返して行った後、得られた樹脂を DMFで洗浄後、 25%AC₂0 (無水酢酸）で 15分 X2回で未反応のァミノ基をキヤッビングした。 N末端の Fmoc-Cys( rt)- OHを縮合後、工程 2の脱保護操作を行い、工程 6の洗浄操作を実施し、 H- Cys(Trt)- Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc) -Asn(Trt)- Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu- Alko-Resinを得た。上記合成工程の概要を表 3 3に示す。表 3 3

ぐ合成工程 >

工程試薬処理回数時間 (分）

1 ) 洗浄 DMF 100ml X6 0.3

MeOH 100ml X I 0.3

DMF 100ml X 3 0.3

2 ) 脱保護 25%ピぺリジン DMF 100ml 3.0

100ml 15.0

3 ) カツプリング各ァミノ基保護アミノ酸（5当量） 30 X 1

HOBT (5当量） DIPCI (5当量） /NMP 150ml

4 ) 洗浄 NMP 100ml X 2 0.3

5 ) カップリング各ァミノ基保護アミノ酸（5当量） 30 X 1

HOBT (5当量） DIPCI (5当量） NMP 150ml

6 ) 洗浄 DMF 100ml X5 0.3

MeOH 100ml X I 0.3

DMF 100ml X2 0.3 2.保護ぺプチド樹脂の脱保護

上記操作によって得られた保護ぺプチド樹脂 (H-Cys(Trt)-Tyr( rt)-Thr(tBu)- Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gla(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-Resia 14.06gに Reagent K(5%フエノール / 5%チオア二ソール /5% 0/2.5%エタンジチオール/ TFA溶液) 100mlとトリイソプロビルシラン（TIPS) 15mlを加え、室温で 2.5時間攪拌した。その後、ジェチルエーテル約 500mlを加え、グラスフィルターで濾過を行い、 Reagent Kとジェチルエーテルを濾液として除いた。濾上物を約 100mlのジェチルエーテルで 3回洗浄し、洗浄後の濾上物に約 100mlの TFAを加える操作を 3回繰り返して行い、目的物を含む濾液を約 300ml得た。この濾液を濃縮して TFAを除き、ァセトニトリル約 50mlと 20%酢酸水約 250ml¾口え凍結乾燥し、ノ、。ウダ一状の粗ぺプチド (H-Cys-Tyr-Thr-Tip-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH、配列番号： 4 4)6.12gを得た。

3.粗ぺプチドの精製

得られた粗ぺプチド 749mgを TFA 10mlに溶解し、 HPLC(Shimazu製； LC8AD型） 1液 =H₂ O/0.1%TFAで平衡ィ匕している YMC社製 ODS C, ₈ 5cm Φ X 50cmLの力ラムに HPLCのポンプでチャージした。その状態で約 30分間保ち、 30分後、 2液 =CH₃ CN/0.1%T:FAの濃度を 30分間で 0%から 15%迄上昇した。その後、更に 330分かけて 28%まで 2液の濃度を上昇させ、目的とするペプチドの溶出液を 220nmの UVでモニターしながら、目的物を含む分画を集めた。集めた分画を、 YMC社製 ODS C_{1 8} 4.6nm^ X25cmLカラムをセットした HPLC (日立製 L-4000型)で 1液 =H₂ O/0.1%TFAと 2液 =CH₃ CN/0.1VTFAの溶出液で、 2夜 =CH₃ CN/0.1%TFAの濃度を 17%で平衡化しているカラムに注入し、

220nmの UVでモニターしながら 2液の濃度 47%まで 30分間で上昇させ、保持時間 14.79分の目的ぺプチド単量体の精製品 227.5mgを得た。

•アミノ酸分析

加水分解： 1%フエノール /6N塩酸水、 110°C 10時間

分析法：ニンヒドリン法

Asx:1.71(2) Thr:0.75(l) Glx: 1.07(1) Met:0.91(l) * Leu:(l)

Tyr:0.82(l)

* ) Leu=基準ァミノ酸（）内理論値 '質量分析： LC MS M^{+ 1} =1173.0 論値 = 1172.36)

'アミノ酸配列分析： N末 2残基目 Tyrから、 C末 Leuまで順次確認した。実施例 1

次式で示される二量体の合成：

C-Y-T-W-N-Q-M-N-L-OH

C-Y-T-W-N-Q-M-N-L-OH 製造例 1により得られたぺプチド単量体 227.5mg、 N-メチルダルカミン

(NMG) 227.5mg, 水 23mlを加え室温で約 2日間攪拌することにより、空気酸化を行った。その後、反応液中に酢酸ナトリウム 2gを水 5mlに溶解した水溶液を加え約 20分間室温攪拌を行い、更に水 200mlとァセトニトリル約 200mlを加えた後、桐山ロート（ろ紙 No5C) で濾過し、濾上物を水（約 50mlX 3回）で洗浄した。濾上物を濾取し、水約 200mlを加えて凍結乾燥を行い、目的とする粗ペプチド二量体 158mgを得た。粗ぺプチドニ量体の精製

粗ペプチド二量体 158mgを DMS0 9mlに溶解し、 HPLC(Shimazu製；

LC8AD型)に 1液 =H₂ O/l%AcOHで平衡化して、る YMC社製 ODS C, ₈ 5cm Φ X 50cmLのカラムに HPLCのポンプでチヤージした。その状態で約 30分間保ち、 30分後、 2液 =CH₃ CN/l%AcOHの濃度を 360分間で 0%から 40%迄上昇した。その後、目的とする二量体の溶出液を 220nmの UVでモニターしながら、自動分画装置により目的物を含む分画を集めた。集めた分画を、 YMC社製 ODS C_{1 8} 4.6mm Φ X 25cmL力ラムをセットした HPLC(日立製 L-4000型)で 1液 =

H₂ O/0.1%TFAと 2液 =CH₃ CN/0.1%TFAの溶出液で、 2液 =

CH₃ CN/0.1VTFAの濃度を 17%で平衡化しているカラムに注入し、 220nmの UV でモニターしながら 2液の濃度を 0%から 47%まで 30分で上昇させ、保持時間 20.51分の目的とするぺプチドニ量体精製品 46.6mgを得た。 FARMS 2365.0 論値 2342.70) Na⁺ F=0.25% 試験例 1

ぺプチドニ量体による CTL誘導

実施例 1にて調製したぺプチドニ量体の CTL誘導能を HLA-A24トランスジェニックマウス（Int. J. Cancer: 100， 565, 2002) を用いて評価した。ぺプチドニ量体をジメチルスルホキシド (DMSO)で溶解し、 4 0 m g Ζπι 1のぺプチド溶液を作製した。このぺプチド溶液 35 μ 1を 581 /X 1の 10mMリン酸緩衝液 ( p H 7 . 5 ) に添加してペプチド懸濁液を調製した。このペプチド懸濁液 550 μ 1と Montanide ISA51 (Seppic社） 700 μ 1を連結したガラスシリンジを用いて混合し、エマルシヨンを作製して投与液を調製した。

投与液 200 μ 1を HLA-A24トランスジエニックマウスの尾根部皮下に投与した。マウスは 3匹用いた。投与 7日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞の一部を 100 / g /m 1のぺプチドニ量体で 1時間パルスした。ぺプチドをパルスしていない脾細胞を 24穴プレートに 7 X 10⁶個/ wellで播種し、更に上記のぺプチドをパルスした脾細胞を 1 X 10⁶個 Zwell添加して培養した。培養液には、 RPMI1640培地に 10%FCS、 10mM HEPES、 20mM L-グルタミン、 ImM ピルビン酸ナトリゥム、 ImM MEM非必須ァミノ酸、 1% MEMビタミン、 55 μ Μ 2-メルカプトエタノールを含ませ、 5日間培養した。

培養した脾細胞中の投与ぺプチド特異的な CTLの活性を^{5 1} Crリリースアツセィ (J. Immunol.: 159, 4753, 1997)により測定した。標的細胞としては、 HLA- A24と H-2K^b のキメラの MHCクラス I分子 (Int. J. Cancer: 100, 565, 2002)を安定的に発現するようにマウスリンパ腫由来細胞株 EL-4細胞 (ATCC株番号 TIB- 39)に遺伝子導入して作製した細胞株 EL-4-A2402ZK^bを用いた。標的細胞は 3.7Mbq/10⁶個で^{5 1} Crラベル後、前記べプチドを 100 g/mlになるように添加して更に 1時間ノ、。ルスした。またぺプチド非ノ、。ルスの標的細胞を 2時間^{5 1} Crラベルしてコントロール標的細胞とした。これらのラベルされた標的細胞と先に調製された脾細胞を 1： 120の割合で混合して 4時間培養し、傷害を受けた標的細胞の割合より CTL活性を求めた。結果を図 1に示した。前記ペプチドを投与したマウスより調製した脾細胞は、ペプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コントロールのぺプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったこと力ら、ぺプチド特異的 CTLが誘導されていることが明らかとなった。産業上の利用可能性

本発明により、インビボにおいて CTL誘導活性を有するぺプチドニ量体およびそれを有効成分として含有する医薬組成物が提供される。本発明は、多くの癌患者の病態の改善に有効であると考えられる。

Claims

請求の範囲

1. 少なくとも 1つのシスティン残基を含みかつ 7〜 30個のァミノ酸残基からなる、 CTL誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる 2つのペプチド単量体が相互にジスルフィド結合により結合しているぺプチドニ量体。

2. CTL誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる、請求項 1記載のぺプチドニ量体。

3. 2つのペプチド単量体が 1または 2個のジスルフィド結合により結合している、請求項 1または 2記載のぺプチドニ量体。

4. ぺプチド単量体が癌抑制遺伝子産物 WT 1に由来する、請求項 1〜 3のいずれ力記載のぺプチドニ量体。

5. ぺプチド単量体が Cys Xaa Thr Trp Asn Gin Met Asn Xaa (配列番号： 7 2) (第 2位の Xaaは、 Tyr、 Phe, Metおよび Trpからなる群より選ばれる 1つのァミノ酸残基を示し、第 9位の Xaaは、 Phe、 Leu、 Ile、 Trpおよひ ¾etからなる群より選ばれる 1つのアミノ酸残基を示す）である請求項 1〜4のいずれ力記載のぺプチドニ量体。

6. ぺプチド単量体が Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 1 1 ) 、 Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe (配列番号： 18 ) 、 Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr (配歹 Ij番号： 19) 、 Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu (配列番号： 20) 、 Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu (配列番号： 21) 、 Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 22)、 Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu (配列番号： 23) および Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 44) からなる群より選ばれる、請求項 1〜 4のいずれ力記載のぺプチドニ量体。

7. 請求項 1〜6のいずれ力記載のペプチド二量体と製薬的に許容されうる担体とを含有してなる医薬組成物。

8. 癌ワクチンとして使用される、請求項 7記載の医薬組成物。

9. 請求項 1〜6のいずれ力、記載のペプチド二量体における、癌ワクチンを製造するための使用。

1 0. 癌を治療または予防するための方法であって、請求項 1〜6のいずれか記載のペプチド二量体の治療または予防に有効な量を、それを必要としている W T 1陽性の患者に投与する方法。