WO2004041840A2 - Peptide-bound chromogens used for determining enzymatic activities - Google Patents

Peptide-bound chromogens used for determining enzymatic activities Download PDF

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WO2004041840A2
WO2004041840A2 PCT/EP2003/012463 EP0312463W WO2004041840A2 WO 2004041840 A2 WO2004041840 A2 WO 2004041840A2 EP 0312463 W EP0312463 W EP 0312463W WO 2004041840 A2 WO2004041840 A2 WO 2004041840A2
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amino
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Stefan Spichiger
Ursula Spichiger-Keller
Michael Linnhoff
Gleb Zhylyak
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C-Cit Ag
Fluka Gmbh
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Definitions

  • the determination of enzyme activities is important, for example, for the diagnosis of disease states such as thromboembolism, fibrinolysis, arthritis, wound healing or when used to monitor anticoagulant therapy in laboratories or hospitals.
  • protease activities is also important for the diagnosis of carcinoma cells or the development of inhibitors.
  • active substances are tested for their inhibitory effects from protease activities.
  • the determination of the enzymatic activity is used as a means for the detection of pyrogens, for example endotoxins, which can occur during sterilization in solutions to be injected by the so-called LAL (Limulus amebocyte lysate) test.
  • LAL Limulus amebocyte lysate
  • endotoxin of gram-negative bacteria can be detected enzymatically by determining the proteolytic activity of the enzymes used.
  • the absorption properties of chromogens are used in the LAL test.
  • Chromogens are molecules that can absorb electromagnetic radiation, such as visible light, UV or IR. Usually Chromogenic characterized by extensive conjugated compound systems in which the ⁇ -lT "transitions are shifted into the visible.
  • the proteolytic activity of the enzyme is measured in the LAL test as an increase in the optical density when a peptide bond is cleaved between a specific recognition sequence of a peptide and a dissociable chromogen (Witt, I. 1991).
  • the split the peptide bond leads, for example in the case of a chromogen labeled with p-nitroaniline, to a change in the absorption spectrum of the released chromogen compared to the chromogen bound to the peptide.
  • a disadvantage of p-nitroaniline and 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) labeled chromogens is that they have absorption maxima in the wave range of ⁇ 400 nm and are evaluated at 405 nm, in which cell components, for example hemoglobin, also absorb electromagnetic radiation. It is therefore difficult to determine specific enzyme activities in biological fluids, such as blood or other body fluids, with chromogens labeled in this way.
  • Chromogens are also known from the prior art which have their absorption maxima in other wavelength ranges, for example in a wavelength range of> 600 nm.
  • their use is problematic for the LAL detection of enzyme activities, since the enzymatic attack by the target protease in the labeled chromogen is mostly incomplete or very slow due to the size and spatial structure of the chromogen. This is because the enzyme's access to the corresponding recognition sequence is hindered by the molecular structure of such chromogens.
  • the object of the invention was therefore to meet one or more of the above-mentioned needs.
  • the invention therefore relates to novel chromogens which are coupled to peptide sequences and which absorb at wavelengths in the range from approximately 530 to 700 nm, preferably from 630 nm to 700 nm.
  • the present invention relates to a chemical compound of the general formula (I):
  • X is hydrogen or a protective group for terminal amino groups which is customary in peptide chemistry
  • a and B stand for a natural or synthetic -, ⁇ -, or ⁇ -amino acid and its stereoisomers / enantiomers, which have 2 to 15 C atoms and up to 4 N atoms, up to 2 S atoms and up to 6 O.
  • -Atoms include and where A and B are identical or can be different and B optionally represents a dipeptide or oligopeptide, in particular a dipeptide to dodecapeptide, which is formed from these amino acids,
  • C stands for natural amino acids, in particular arginine, lysine, tyrosine, phenylalanine, glycine, methionine, lencin, sarin or tryptophan or their respective homologues and enantiomers / stereoisomers and isologues,
  • L stands for a linker which is capable of forming a peptide bond with C, or which is itself an amino acid or an oligopeptide.
  • CRS stands for a conjugated carbon ring system which is connected to the radical -L-C-B-A-X via a nitrogen atom and the compound of the general formula (I) has an absorption maximum at a wavelength of more than 530 nm.
  • the conjugated carbon ring system CRS is to be understood in principle as meaning any carbon compound which has its absorption maximum in the range from about 530 nm to about 850 nm, preferably in the range from 600 to 700 nm and more preferably in the range 630 to 680 nm, which has at least four conjugated double bonds and at least one carbon ring, preferably 2, 3 or 4 carbon rings.
  • the carbon ring can be a continuous acyclic or aromatic carbon chain with 3 to 9 carbon atoms, but it is also possible for the ring to have one or more identical or different substituents, or heteroatoms, for example oxygen, sulfur or nitrogen.
  • the conjugated carbon ring system according to the invention preferably contains at least one carbon ring with a continuous carbon chain.
  • linker L denotes any compound which is capable of forming a peptide bond with C and which is responsible for the spatial arrangement of CRS and the The rest of the -CBAX is affected, in particular the distance between the CRS and the rest of the -CBAX is increased. Furthermore, the linker is characterized in that it is connected to CRS via an N atom. This can also take the form of an imine or imide bond. The nature of the linker essentially only has to meet the condition that the proteolytic cleavage of the peptide bond between L and C is possible by means of a suitable enzyme.
  • L can therefore be, for example, a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl (s) radical having 1 to about 40 C atoms, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10 C atoms, but it is also possible for L Contains cycloalkyls.
  • L can furthermore represent, for example, one or more, for example 2, 3, 4, 5, 6 or more amino acids, furthermore e.g. represent a p-aminobenzoic acid, a phenydiamine, diamine, amine, aniline, substituted aniline, substituted aromatics, alkaloid, thiol, thiolates, thiocyanate, aniline, aminocarboxylic acid, substituted or unsubstituted phenol, nitroaromatic or derivatives of the above-mentioned compounds.
  • amino acids furthermore e.g. represent a p-aminobenzoic acid, a phenydiamine, diamine, amine, aniline, substituted aniline, substituted aromatics, alkaloid, thiol, thiolates, thiocyanate, aniline, aminocarboxylic acid, substituted or unsubstituted phenol, nitroaromatic or derivatives of the above-mentioned compounds.
  • the linker should have stability that does not allow all of the CRS-LCBAX compound to be exposed to air, water, alcohol and / or fats or other organic or non-organic solvents at temperatures up to about 40 ° C without the presence of enzymes reacts in such a way that the basic structure of the CRS-LCBAX connection is changed.
  • the linker has at least the length of an ethyl, in particular at least one, propyl radical.
  • linker significantly longer or to introduce a further aromatic compound or a further amino acid or an oligopeptide.
  • linkers which can be used according to the invention are hydroquinones, quinones, aminoquinones, quinolines, aminocarboxylic acids, dicarboxylic acids (or their anhydrides), ⁇ -aminobutyric acid, carboxamides, aminophenols, 2- or 3- or 4-hydroxyanilines and their homologues.
  • the absorption maximum of the chemical compound according to the general formula (I) is preferably at lower wavelengths than that of the free structural element CRS alone.
  • this can also be done by choosing the linker which, in addition to the absorption maximum, also contains other physical parameters of the compound (I), such as the degree of protonation (pKa) and its photostability.
  • pKa degree of protonation
  • the linker has a slight influence on the UV / VIS spectrum with Nilblau and Meldolablau derivatives, but a significant influence on the pKa and the photo stability. In the case of naphthoquinone derivatives, a hypsochromic shift usually occurs due to the influence of the linker.
  • the compounds according to the invention are characterized by the property that the structural element CRS (-L) can be cleaved enzymatically from the rest X-A-B-C- and that after this cleavage the absorption maximum of the structural element CRS (- L) shifts bathochromically, that is to say towards longer wavelengths.
  • this bathochromic “shift” comprises at least 30 nm, preferably at least 50 (in particular i and more preferably at least 100 nm.
  • the bathochromic shift is about 30 to about 100 nm for naphthoquinones, for p-nitroaniline it is about 100 nm measured in absorption and for AMC derivatives 400 to about 470 nm. With fluorescence emission, this shift is about 70 nm when excited with 330 or 380 nm.
  • the above-mentioned enzymatic cleavage of the structural element CRS (-L) from the rest of the chemical compound of the general formula (I) is carried out by enzymes as defined below.
  • Enzymes in the sense of the invention are highly specialized proteins that catalyze biochemical reactions without being consumed in the process. Ribozymes, which under the
  • enzymes can be subsumed include ribonucleic acid molecules. Enzymes outperform synthetic catalysts in their catalytic properties. Enzymes have a high affinity and selectivity for certain substrates. Important among the enzymes are in particular proteases, the so-called serine proteases I, such as trypsin, bacterial serine proteases II, such as subtilism,
  • Cysteine proteases such as papain, aspartate proteases such as penicillopepsin, metalloproteases I such as boron coride oxide peptidase A, bacterial metalloproteases II such as thermolysin. Proteases always digest at a certain point on a peptide or
  • Endopeptidases hydrolyze certain amide bonds within a protein, while exopeptidases C or N terminate one to three amino acids from the peptide.
  • the chemical compound according to the general formula (I) can comprise various structural elements CRS with regard to the electrical charge.
  • the structural element CRS can be neutral, anionic, cationic or zwitterionic.
  • the protonated form is preferably long-wave absorbent.
  • the deprotonated, negatively charged form is preferably long-wave absorbent.
  • the type and strength of the charge of the structural element CRS should not lead to reactions being triggered which would impair an enzymatic cleavage reaction of the structural element CRS (-L) from the chemical compound of the general formula (I).
  • the type and strength of the charge of the structural element CRS is selected according to the medium in which an enzymatic cleavage takes place (for example blood, serum, urine).
  • the structural element CRS is neutral or basic. It advantageously has a pKa value of 6-13.
  • suitable structural elements CRS in addition to the basic bodies Meldolablanlau and Nilblau are, for example, amino-substituted 1,4 naphthoquinones such as 6-amino-2,3-dichloro-l, 4-naphthoquinone and 6-amino-2,3-dicyano-l, 4- naphthoquinone).
  • phenolic azo compounds such as calmagite (absorption max: 665 nm), naphthol blue black (absorption max: 680 nm); Brilliant yellow (absorption max: 554 nm), nitrazin yellow (absorption max: 620 nm);
  • calmagite as calmagite (absorption max: 665 nm)
  • naphthol blue black asbsorption max: 680 nm
  • Brilliant yellow absorption max: 554 nm
  • nitrazin yellow absorption max: 620 nm
  • the 4 or 5 amino naphthoquinones can of course also be used.
  • chromogens are, for example, 2-anilino-3-chloro-l, 4-naphthoquinone, 2- (4-N, N-diethylamino-phenyl) -l, 4-naphthoquinone, 2,3-dicyano-l, 4-naphtholdiol , 2,3-dicyano-l, 4-naphthoquinone, 2,3-dicyano-l, 4-naphthoquinone-l-phenyleneimine, 4-nitro [2.2] paracyclophanes or other nitrated paracyclophanes and simple cyclophanes, indane derivatives such as 2 -p-amino benzylidene-l, 3-bisdicyanovinylindan and their derivatives or homologs.
  • the present invention furthermore relates to chemical compounds of the general formula (I) in which the structural element CRS is a compound selected from the following group of compounds (a), (b), (c) or (d):
  • R is H, C ⁇ to C 8 alkyl, in particular methyl, ethyl, propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, aryl, aralkyl, CN, halogen,
  • R 1 and R 2 can be the same or different and represent H, CN, halogen, aryl or aralkyl or alkoxy,
  • R 3 , Ri, R 5 , R ⁇ 5 , R 7 and R 8 can be the same or different and for H, CN, NO 2 , NH 2 , - HSO 3 " , COO " , -OH (-O “ ) - SO 3 " , alkyl, aralkyl, halogen, in particular CI, Br, or alkoxy,
  • radical R 9 influences the solubility of the compound, which can be adjusted in accordance with the respective radical R 9 .
  • those chemical compounds are particularly preferred which have a structural element CRS which, after dissociation from the rest of the compound of the general formula (I), has a low water solubility.
  • “low water solubility” means values in the range from about 50 mg / 1 to about 1 mg / 1.
  • the water solubility of the structural element CRS is in the range from about 10 to about 0.1 mg / l.
  • the present invention further provides a process for the preparation of a compound of the general formula (I) comprising the following steps:
  • oligopeptide XAB- under customary conditions, where X is hydrogen or a protective group which is customary in peptide chemistry for terminal amino groups, A and B are an ⁇ -, ⁇ - or ⁇ -amino acid which are 2 to 15 C- Comprise atoms and up to 4 N atoms, up to 2 S atoms and up to 6 O atoms and where A and B can be identical or different and B optionally represents a dipeptide which is formed from these amino acids,
  • CRS-L where L stands for a linker as defined above which is capable of forming a peptide bond with C and where the linker is preferably covalently bound to an N atom of the structural element CRS and where CRS is for a is as defined above conjugated carbon ring system which has an absorption maximum at a higher wavelength than the compound XAB-CL-CRS (I), whose absorption maximum is preferably in the range of ⁇ 530 nm, 3.
  • CRS-LC where C is arginine, lysine, tyrosine, phenylalanine or tryptophan or other amino acids and their stereoisomers or their respective homologues
  • steps (1) and (2) can be carried out in any order.
  • the present invention furthermore relates to a method for the detection of target substances, comprising the following steps:
  • Aerosol mixture or pure substance
  • biosensors are preferably used to detect the target substances.
  • Biosensors are based on a coupling of biomolecules that recognize specific analytes as receptors in the broadest sense with physicochemical transducers that convert a biologically generated signal into electrical measurement signals.
  • Bioactive recognition components include, but are not limited to, antibodies, enzymes, Cell organelles or whole microorganisms. Peptides and proteins are also considered
  • peptides are not bioactive in that they can convert other molecules or promote specific bonds to other molecules.
  • biosensors on the one hand the so-called bioaffinity sensors and on the other hand the so-called bioaffinity sensors
  • bioaffinity sensors generate a signal by complexing bioactive molecules to form an analyte.
  • enzyme activities are to be determined, the enzymes causing a change in the absorption spectrum of the substrate by proteolysis of the corresponding substrate.
  • the use of a planar thin-film waveguide chip which is chemically e.g. modified with a selective chemical polymer was suitable for an enzyme test, in particular for an endotoxin test.
  • the coupled light travels within a planar waveguide and creates an evanescent field along the surface.
  • the evanescent field migrates within the neighboring medium and has a penetration depth of a few nanometers (approximately 10 nm) in the Z direction of the traveling light.
  • the absorption of light using the ATRS technique within the adjacent layer correlates with the change in the concentration of the specific analyte.
  • the ATR technology has the advantage that CRS, CRS-L and CRS-L-C-B-A-X do not need to have different absorption wavelengths and generally do not have either. On the other hand, simple local separation is possible with pH adjustment.
  • chromogen-labeled substrates can be used, for example, on a chip such as that in the unpublished German patent application DE 10251893.9 is described as a so-called waveguide chip, applied and immobilized.
  • the chip surface is chemically modified and functionalized using two different methods:
  • chromogens can be coupled to a peptide, such as BOC-Ser (Bz) -Gly-Arg, via suitable linkers and immobilized on a waveguide of an optical chip at the N-terminal.
  • the proteolysis is detected by measuring the change in absorption in the region of the evanescent field of the waveguide, which is induced by the chromogen's diffusion from the path.
  • the chromogen only needs to have a low water solubility, since it is released in very small quantities based on the volume of the measuring cell.
  • the chromogenic part of the chemical compound according to the general formula (I) can show a spectral shift due to various mechanisms. If the chromogenic part of the chemical compound according to the general formula (I) is cleaved from the immobilized peptide after adding the enzyme (eg serine protease), the chromogenic part (CRS or CRS-L) can change its absorption spectrum or at least its distribution and diffuse from the detection layer closer to the surface of the waveguide (diffusion-restricted process).
  • the layers of the detection area can be applied, for example (using a "Genesis NPS" pipettor) with an active Tip M (volume) from Tecan.
  • the substrates can be applied as optically active materials in defined areas on the surface of the optical chip.
  • Another object of the present invention is the use of compounds according to the invention for the detection of target substances, in particular the use for the detection of endotoxins.
  • Fig. 1 shows a synthetic scheme for the representation of a peptide labeled with an amino naphthoquinone.
  • Fig. 2 shows the cleavage of the LAL substrate serine (BZ) -Gly-Arg-L-LM46 (linker: p-aminobenzoic acid, chromophore: Nile blue) in TRIS buffer pH 7 at 37 ° C with bovine trypsin 10 "6 M Measurement at 641 nm.
  • Fig. 3 shows the cleavage of the LAL substrate serine (BZ) -Gly-Arg-L-LM46 (linker: p-aminobenzoic acid, chromophore: Nile blue) in TRIS buffer pH 7 at 37 ° C with bovine trypsin 10 "6 M Measurement at 674 nm.
  • Nile blue as a chromogen which is coupled to 4-aminobenzoic acid (as a linker) in the form of a carboxylamide.
  • Substrates 1 and 2 (hereinafter also referred to as LAL substrates) were cleaved by trypsin, although there was no spectral shift. However, a change in the absorbance at 641 and 674 nm could be detected in solution, since the chromogen was cleaved from the substrate and is almost insoluble in solution.
  • the absorption spectra and the absorption coefficients were characterized in different solvents at a pH of 7 and a temperature of 37 ° C.
  • Aminonaphthoquinones are a class of chromogens, the spectra of which change after enzymatic hydrolysis, in particular due to a change in the absorption maximum towards longer wavelengths.
  • the chromogen is linked via the amino-terminated group directly to the peptide (arginine) at the 6-amino position and changes its spectrum after hydrolysis of the amide group.
  • the amino-1,4-naphthoquinones are optionally linked to the peptide sequence via a linker.
  • Step A 4-nitro-N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide
  • Step B 4-amino-N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide
  • Step B 4- (L-arginylamido) - N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide
  • Step D 4 - ((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl) -L-arginylamido) -N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid reamide
  • Step B 4-amino-N- (9-dimethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline
  • Step B 4- (L-arginylamido) -N- (9-dimethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline
  • Step D 4- (fBenzyl-L-serinyl-L-glycyl) -L-arginylamido) -N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline
  • the RP was then dissolved in DCM and the solution was combined with the ether phase. You washed with sat. CuSO 4 (until the color was no longer intensified) and sat.
  • the RG was then filtered through a glass suction filter (D3), the residue was washed with a little boiling EtOH and the filtrate was concentrated on a RV at a bath temperature of 60 ° C. until most of the ethyl acetate formed had been removed. The same was stirred into 780 ml of ice / water mixture (2/3 ice) and the resulting mixture was left to stand at RT overnight. The next day the mixture was extracted with DCM, the extract was dried over MgSO 4 , concentrated on a RV and the resulting brownish orange-red solid was dried on a HV.
  • D3 glass suction filter
  • the mixture was cooled to room temperature and the light solid was filtered off.
  • the solid (6-amino-2,3-dicyano-l, 4-naphthodiol) was suspended in a solution of 17 g FeClx6 HO in 300 ml water and at room temperature for 45 min. touched.
  • the blue solid was filtered and dried in a desiccator. 0.114 g of 6-amino-2,3-dicyano-1,4-naphthoquinone was obtained (approximately 10% yield).
  • Trypsin 1 mg trypsin (bovine pancreas) dissolved in 100 ml 0.001 M HC1,
  • the stock solution was filtered twice over a little cotton in a Pasteur pipette. After leaving the residue not used for the experiments for two days, a fine but distinct sediment had formed.
  • the measuring solutions were prepared directly in the measuring cuvettes in such a way that 2 ml total volume contained 25 ⁇ g / 1 trypsin, 100 ⁇ l DMSO (5%), simple TRIS buffer concentration (0.015 M CaCl 2 , 0.005 M TRIS) and the indicated ideal substrate concentration ,
  • the trypsin solution was added after annealing the solution at 37.2 ° C. for 15 minutes immediately before the start of the measurement.

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Abstract

The invention relates to a chemical compound of a general formula (I): X-A-B-C-L-CRS, wherein X is hydrogen or a protection group of amino-terminal groups which are routine for peptide chemistry; A and B are a α-, β-, or η-aminoacids containing from 2 to 15 C atoms, up to 4 N atoms, up to 2 S atoms and up to 6 O atoms, A and B can be identical or different, and B eventually being a peptide formed by said amino-acids; C is arginine, lysine, tyrosine, phenylalanine or tryptophan of the homologues respectively ; L is a linker forming a peptide liaison with C ; CRS is a combined cyclic carbon system linked to a L-C-B-A-X radical by means of a nitrogen atom. The inventive compound of said general formula (I) and CRS produce a maximum absorption having a wavelength equal to or higher than 550 nm.

Description

PEPTΓDGEBUNDENE CH OMOGENE ZUR BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITÄTEN PEPTΓDBUNDENE CH OMOGENE FOR DETERMINING ENZYM ACTIVITIES
Die Bestimmung von Enzymaktivitäten ist beispielsweise für die Diagnostik von Krankheitszuständen wie Thromboembolie, Fibrinolyse, Arthritis, Wundheilung oder beim Einsatz zur Verfolgung der antikoagulierenden Therapie in Laboratorien bzw. Hospitälern wichtig.The determination of enzyme activities is important, for example, for the diagnosis of disease states such as thromboembolism, fibrinolysis, arthritis, wound healing or when used to monitor anticoagulant therapy in laboratories or hospitals.
Die Bestimmung von Proteaseaktivitäten ist auch für die Diagnostik von Karzinomzellen bzw. die Entwicklung von Hemmstoffen wichtig. Im so genannten Drug-Screening werden Wirkstoffe auf ihre hemmende Wirkung von Proteaseaktivitäten hin getestet.The determination of protease activities is also important for the diagnosis of carcinoma cells or the development of inhibitors. In so-called drug screening, active substances are tested for their inhibitory effects from protease activities.
Weiterhin wird die Bestimmung der enzymatischen Aktivität als Mittel zur Detektion von Pyrogenen, beispielsweise Endotoxinen, verwendet, die während Sterilisation in zu injizierenden Lösungen durch den sogenannten LAL (Limulus Amöbozyten Lysat) -Test auftreten können. Mit dem LAL-Test kann Endotoxin gram-negativer Bakterien enzymatisch nachgewiesen werden, indem die proteolytische Aktivität der dabei verwendeten Enzyme bestimmt wird.Furthermore, the determination of the enzymatic activity is used as a means for the detection of pyrogens, for example endotoxins, which can occur during sterilization in solutions to be injected by the so-called LAL (Limulus amebocyte lysate) test. With the LAL test, endotoxin of gram-negative bacteria can be detected enzymatically by determining the proteolytic activity of the enzymes used.
Im Rahmen des LAL-Tests werden neben der turbidimetrischen Bestimmung die Absorptionseigenschaften von Chromogenen ausgenutzt.In addition to turbidimetric determination, the absorption properties of chromogens are used in the LAL test.
Chromogene sind Moleküle, die elektromagnetische Strahlung, beispielsweise sichtbares Licht, UV oder IR, absorbieren können. Üblicherweise zeichnen sich Chromogene durch ausgedehnte konjugierte Verbindungssysteme aus, bei denen die π-lT "Übergänge ins Sichtbare verschoben sind.Chromogens are molecules that can absorb electromagnetic radiation, such as visible light, UV or IR. Usually Chromogenic characterized by extensive conjugated compound systems in which the π-lT "transitions are shifted into the visible.
Die proteolytische Aktivität des Enzyms wird im LAL-Test als Zunahme der optischen Dichte bei Spaltung einer Peptidbindung zwischen einer spezifischen Erkennungssequenz eines Peptids und eines dissozierbaren Chromogens gemessen (Witt, I. 1991). Die Spaltung der Peptidbindung führt beispielsweise im Falle eines mit p-Nitroanilin markierten Chromogens zu einer Änderung des Absorptionsspektrums des freigesetzten Chromogens gegenüber dem an das Peptid gebundenen Chromogen.The proteolytic activity of the enzyme is measured in the LAL test as an increase in the optical density when a peptide bond is cleaved between a specific recognition sequence of a peptide and a dissociable chromogen (Witt, I. 1991). The split the peptide bond leads, for example in the case of a chromogen labeled with p-nitroaniline, to a change in the absorption spectrum of the released chromogen compared to the chromogen bound to the peptide.
Diese Absorptionsänderung kann bestimmt werden und damit auch indirekt die proteolytische Aktivität des entsprechenden Enzyms.This change in absorption can be determined and thus also indirectly the proteolytic activity of the corresponding enzyme.
Nachteilig an p-Nitroanilin und 7-Amino-4-methylcumarin (AMC) markierten Chromogenen ist jedoch, dass sie Absorptionsmaxima im Wellenbereich von < 400 nm aufweisen und bei 405 nm ausgewertet werden, in dem auch Zellbestandteile, beispielsweise Hämoglobin, elektromagnetische Strahlen absorbieren. Daher ist die Bestimmung spezifischer Enzymaktivitäten in biologischen Flüssigkeiten, wie Blut oder anderen Körperflüssigkeiten, mit derartig markierten Chromogenen schlecht möglich.A disadvantage of p-nitroaniline and 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) labeled chromogens, however, is that they have absorption maxima in the wave range of <400 nm and are evaluated at 405 nm, in which cell components, for example hemoglobin, also absorb electromagnetic radiation. It is therefore difficult to determine specific enzyme activities in biological fluids, such as blood or other body fluids, with chromogens labeled in this way.
Aus dem Stand der Technik sind auch Chromogene bekannt, die in anderen Wellenlängenbereichen, beispielsweise in einem Wellenlängenbereich von > 600 nm, ihre Absorptionsmaxima aufweisen. Deren Einsatz ist jedoch für den LAL-Nachweis von Enzymaktivitäten problematisch, da der enzymatische Angriff durch die Zielprotease im markierten Chromogen meist aufgrund der Größe und räumlichen Struktur des Chromogens nur unvollständig oder sehr langsam verläuft. Das liegt daran, dass der Zugang für das Enzym zur entsprechenden Erkennungssequenz durch die Molekülstruktur solcher Chromogene behindert wird.Chromogens are also known from the prior art which have their absorption maxima in other wavelength ranges, for example in a wavelength range of> 600 nm. However, their use is problematic for the LAL detection of enzyme activities, since the enzymatic attack by the target protease in the labeled chromogen is mostly incomplete or very slow due to the size and spatial structure of the chromogen. This is because the enzyme's access to the corresponding recognition sequence is hindered by the molecular structure of such chromogens.
Problematisch ist auch die Messung von Änderungen der Absorptionsmaxima von Chromogenen, welche direkt an das Substrat gebunden sind. Diese dürfen nur eine beschränkte Molekülgröße aufweisen, um den enzymatischen Angriff durch die Zielprotease nicht zu behindern. Bekannte Beispiele sind 7-Amino-4-methylcurnarin (AMC), p-Nitroanilin und 2-Aminoacridon (2-AA). Es bestand daher ein Bedürfnis nach einer optischen Nachweismöglichkeit für Zielsubstanzen, beispielsweise Endotoxine, die durch die Anwesenheit natürlicher Bestandteile im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten nicht nachteilig beeinfiusst wird.The measurement of changes in the absorption maxima of chromogens which are directly bound to the substrate is also problematic. These may only have a limited molecular size in order not to hinder the enzymatic attack by the target protease. Known examples are 7-amino-4-methylcurnarin (AMC), p-nitroaniline and 2-aminoacridone (2-AA). There was therefore a need for an optical detection possibility for target substances, for example endotoxins, which is not adversely affected by the presence of natural components in the blood or other body fluids.
Weiterhin bestand ein Bedürfnis nach Verbindungen, mit denen Zielsubstanzen, wie Endotoxine, bereits in geringen Konzentrationen eindeutig und direkt oder indirekt bestimmt werden können.There was also a need for compounds with which target substances, such as endotoxins, can be clearly and directly or indirectly determined even in low concentrations.
Es bestand darüber hinaus ein Bedürfnis nach einem Verfahren, derartige Verbindungen herzustellen sowie nach einem einfachen und möglichst kostengünstigen Verfahren, mit dem bereits geringe Konzentrationen bestimmter Zielsubstanzen auch in biologischen Flüssigkeiten spezifisch nachgewiesen werden können.There was also a need for a method for producing such compounds and for a simple and inexpensive method with which even low concentrations of certain target substances can also be specifically detected in biological liquids.
Aufgabe der Erfindung war es daher, eines oder mehrere der oben genannten Bedürfnisse zu erfüllen.The object of the invention was therefore to meet one or more of the above-mentioned needs.
Die Erfindung betrifft daher mit Peptidsequenzen gekoppelte neue Chromogene, die bei Wellenlängen im Bereich von etwa 530 bis 700 nm, vorzugsweise von 630 nm bis 700 nm absorbieren.The invention therefore relates to novel chromogens which are coupled to peptide sequences and which absorb at wavelengths in the range from approximately 530 to 700 nm, preferably from 630 nm to 700 nm.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung stellt eine chemische Verbindung der allgemeinen Formel (I) dar:The present invention relates to a chemical compound of the general formula (I):
X-A-B-C-L-CRSX-A-B-C-L-CRS
wobei X für Wasserstoff oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für terminale Aminogruppen steht,where X is hydrogen or a protective group for terminal amino groups which is customary in peptide chemistry,
A und B für eine natürliche oder synthetische -, ß-, oder γ-Aminosäure und deren Stereoisomeren/Enantiomeren stehen, die 2 bis 15 C-Atome und bis zu 4 N-Atome, bis zu 2 S-Atome und bis zu 6 O-Atome umfassen und wobei A und B identisch oder verschieden sein können und B gegebenenfalls für ein Dipeptid bzw. Oligopeptid, insbesondere ein Dipeptid bis Dodecapeptid steht, das aus diesen Aminosäuren gebildet ist,A and B stand for a natural or synthetic -, β-, or γ-amino acid and its stereoisomers / enantiomers, which have 2 to 15 C atoms and up to 4 N atoms, up to 2 S atoms and up to 6 O. -Atoms include and where A and B are identical or can be different and B optionally represents a dipeptide or oligopeptide, in particular a dipeptide to dodecapeptide, which is formed from these amino acids,
C für natürliche Aminosäuren, insbesondere Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin, Glycin, Methionin, Lencin, Sarin oder Tryptophan oder ihre jeweiligen Homologen und Enantiomeren/Stereoisomeren und Isologensteht,C stands for natural amino acids, in particular arginine, lysine, tyrosine, phenylalanine, glycine, methionine, lencin, sarin or tryptophan or their respective homologues and enantiomers / stereoisomers and isologues,
L für einen Linker steht, der in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden, oder selbst eine Aminosäure bzw. ein Oligopeptid ist.L stands for a linker which is capable of forming a peptide bond with C, or which is itself an amino acid or an oligopeptide.
CRS für ein konjugiertes Kohlenstoffringsystem steht, das über ein Stickstoff atom mit dem Rest -L-C-B-A-X verbunden ist und wobei die Verbindung der allgemeinen Formel (I) ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von mehr als 530 nm aufweist.CRS stands for a conjugated carbon ring system which is connected to the radical -L-C-B-A-X via a nitrogen atom and the compound of the general formula (I) has an absorption maximum at a wavelength of more than 530 nm.
Unter dem konjugierten Kohlenstoffringsystem CRS ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung grundsätzlich jede Kohlenstoffverbindung zu verstehen, die im Bereich von etwa 530 nm bis etwa 850 nm ihr Absorptionsmaximum aufweist, bevorzugt im Bereich von 600 bis 700 nm und weiter bevorzugt im Bereich 630 bis 680 nm, die mindestens vier konjugierte Doppelbindungen sowie mindestens einen Kohlenstoffring, bevorzugt 2, 3 oder 4 Kohlenstoffringe aufweist.In the context of the present invention, the conjugated carbon ring system CRS is to be understood in principle as meaning any carbon compound which has its absorption maximum in the range from about 530 nm to about 850 nm, preferably in the range from 600 to 700 nm and more preferably in the range 630 to 680 nm, which has at least four conjugated double bonds and at least one carbon ring, preferably 2, 3 or 4 carbon rings.
Der Kohlenstoffring kann eine durchgehende acyclische oder aromatische Kohlenstoffkette mit 3 bis 9 C-Atomen sein, es ist jedoch ebenso möglich, dass der Ring einen oder mehrere gleiche oder verschiedene Substituenten, oder Heteroatome beispielsweise Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff aufweist. Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße konjugierte Kohlenstoffringsystem mindestens einen Kohlenstoffring mit einer durchgehende Kohlenstoffkette.The carbon ring can be a continuous acyclic or aromatic carbon chain with 3 to 9 carbon atoms, but it is also possible for the ring to have one or more identical or different substituents, or heteroatoms, for example oxygen, sulfur or nitrogen. The conjugated carbon ring system according to the invention preferably contains at least one carbon ring with a continuous carbon chain.
Mit dem Begriff "Linker" L (synonym dazu kann auch der Begriff "Spacer" verwendet werden) wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede Verbindung bezeichnet, die in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden und die die räumliche Anordung von CRS und dem Rest -C-B-A-X beeinfiusst, insbesondere den Abstand zwischen CRS und dem Rest -C-B-A-X vergrößert. Weiterhin zeichnet sich der Linker dadurch aus, dass er über ein N-Atom mit CRS verbunden ist. Dies kann auch in Form einer Imin- oder Imidbindung erfolgen. Die Beschaffenheit des Linkers muss im wesentlichen nur die Bedingung erfüllen, dass die proteolytische Aufspaltung der Peptidbindung zwischen L und C durch ein geeignetes Enzym möglich ist.In the context of the present invention, the term "linker" L (synonymously the term "spacer" can also be used) denotes any compound which is capable of forming a peptide bond with C and which is responsible for the spatial arrangement of CRS and the The rest of the -CBAX is affected, in particular the distance between the CRS and the rest of the -CBAX is increased. Furthermore, the linker is characterized in that it is connected to CRS via an N atom. This can also take the form of an imine or imide bond. The nature of the linker essentially only has to meet the condition that the proteolytic cleavage of the peptide bond between L and C is possible by means of a suitable enzyme.
L kann daher beispielsweise ein linearer oder verzweigter, gesättigter oder ungesättigter Alkyl(en)rest mit 1 bis etwa 40 C-Atomen, bevorzugt 1 bis 15, weiter bevorzugt von 1 bis 10 C-Atomen sein, es ist jedoch ebenso möglich, dass L Cycloalkyle enthält.L can therefore be, for example, a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl (s) radical having 1 to about 40 C atoms, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10 C atoms, but it is also possible for L Contains cycloalkyls.
L kann weiterhin beispielsweise für eine oder mehrere, beispielsweise 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr Aminosäuren stehen, weiterhin z.B. für eine p-Aminobenzoesäure, ein Phenydiamin, Diamin, Amin, Anilin, substituiertes Anilin, substituierten Aromaten, Alkaloid, Thiol, Thiolate, Thiocyanat, Anilin, Aminocarbonsäure, substituiertes oder nicht substituiertes Phenol, Nitroaromat oder Derivate von den oben genannten Verbindungen stehen.L can furthermore represent, for example, one or more, for example 2, 3, 4, 5, 6 or more amino acids, furthermore e.g. represent a p-aminobenzoic acid, a phenydiamine, diamine, amine, aniline, substituted aniline, substituted aromatics, alkaloid, thiol, thiolates, thiocyanate, aniline, aminocarboxylic acid, substituted or unsubstituted phenol, nitroaromatic or derivatives of the above-mentioned compounds.
Der Linker sollte jedoch über eine Stabilität verfügen, die es ermöglicht, dass die gesamte Verbindung CRS-L-C-B-A-X mit Luft, Wasser, Alkohol und/oder Fetten oder anderen organischen oder nicht organischen Lösungsmitten bei Temperaturen bis etwa 40 °C ohne die Gegenwart von Enzymen nicht derartig reagiert, dass die Verbindung CRS-L-C-B-A-X in ihrer Grundstruktur verändert wird.However, the linker should have stability that does not allow all of the CRS-LCBAX compound to be exposed to air, water, alcohol and / or fats or other organic or non-organic solvents at temperatures up to about 40 ° C without the presence of enzymes reacts in such a way that the basic structure of the CRS-LCBAX connection is changed.
Im Rahmen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn der Linker mindestens die Länge eines Ethyl-, insbesondere mindestens eines Propylrests aufweist.In the context of an embodiment of the present invention, it has proven to be advantageous if the linker has at least the length of an ethyl, in particular at least one, propyl radical.
Je nach Beschaffenheit des Strukturelementes CRS kann es aber auch vorteilhaft sein, den Linker wesentlich länger zu gestalten bzw. eine weitere aromatische Verbindung oder eine weitere Aminosäure oder ein Oligopeptid einzuführen.Depending on the nature of the structural element CRS, it can also be advantageous to make the linker significantly longer or to introduce a further aromatic compound or a further amino acid or an oligopeptide.
Im Rahmen einer besonderen Ausführungsformen eignen sich beispielsweise 4- Aminobenzoesäure und 1 ,4-Phenylendiamin sowie deren Homologe und Derivate als Linker zwischen dem Strukturelement CRS und -C-B-A-X. Weitere nicht einschränkende Beispiele für erfindungsgemäß einsetzbare Linker sind Hydrochinone, Chinone, Aminochinone, Chinoline, Aminocarbonsäuren, Dicarbonsäuren (bzw. ihre Anhydride), γ-Aminobuttersäure, Carbonsäureamide, Aminophenole, 2- bzw. 3- bzw. 4-Hydroxyaniline und deren Homologe.In a particular embodiment, for example, 4-aminobenzoic acid and 1,4-phenylenediamine and their homologs and derivatives are suitable as linkers between the structural element CRS and -CBAX. Further non-limiting examples of linkers which can be used according to the invention are hydroquinones, quinones, aminoquinones, quinolines, aminocarboxylic acids, dicarboxylic acids (or their anhydrides), γ-aminobutyric acid, carboxamides, aminophenols, 2- or 3- or 4-hydroxyanilines and their homologues.
Bevorzugt liegt das Absorptionsmaximum der chemische Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) bei niedrigeren Wellenlängen als dasjenige des freien Strukturelements CRS alleine. Geeigneterweise kann dies in einer bevorzugten Ausführungsform neben der üblichen Auswahl entsprechender Strukturelemente CRS mit geeignetem Absorptionsmaximum auch über die Wahl des Linkers erfolgen, der neben dem Absorptionsmaximum auch weitere physikalische Parameter der Verbindung (I), wie beispielsweise den Protonierungsgrad (pKa) und deren Photostabilität. Beispielhaft gilt insbesondere für die drei nachstehenden spezifischen Verbindungsklassen:The absorption maximum of the chemical compound according to the general formula (I) is preferably at lower wavelengths than that of the free structural element CRS alone. Suitably, in a preferred embodiment, in addition to the usual selection of corresponding structural elements CRS with a suitable absorption maximum, this can also be done by choosing the linker which, in addition to the absorption maximum, also contains other physical parameters of the compound (I), such as the degree of protonation (pKa) and its photostability. The following applies in particular to the following three specific classes of compounds:
Der Linker hat bei Nilblau- und Meldolablau-Derivaten einen geringen Einfluss auf das UV/VIS Spektrum, jedoch eine wesentlichen Einfluss auf den pKa und die Photo- Stabilität. Bei Naphthochinonderivaten erfolgt in aller Regel durch den Einfluß des Linkers eine hypsochrome Verschiebung.The linker has a slight influence on the UV / VIS spectrum with Nilblau and Meldolablau derivatives, but a significant influence on the pKa and the photo stability. In the case of naphthoquinone derivatives, a hypsochromic shift usually occurs due to the influence of the linker.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen kennzeichnet die Eigenschaft, dass das Strukturelement CRS(-L) vom Rest X-A-B-C- enzymatisch abgespalten werden kann und dass sich nach dieser Abspaltung das Absorptionsmaximum des Strukturelementes CRS (- L) bathochrom, das heisst hin zu längeren Wellenlängen, verschiebt.The compounds according to the invention are characterized by the property that the structural element CRS (-L) can be cleaved enzymatically from the rest X-A-B-C- and that after this cleavage the absorption maximum of the structural element CRS (- L) shifts bathochromically, that is to say towards longer wavelengths.
Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft erwiesen, wenn dieser bathochrome „Shift" mindestens 30 nm umfasst, vorzugsweise mindestens 50 (insbesonder iund weiter bevorzugt mindestens 100 nm.In the context of the present invention, it has proven to be advantageous if this bathochromic “shift” comprises at least 30 nm, preferably at least 50 (in particular i and more preferably at least 100 nm.
Im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der bathochrome Shift etwa 30 bis etwa 100 nm für Naphtochinone, bei p-Nitroanilin betrag er ca. 100 nm gemessen in Absorption und bei AMC Derivaten 400 bis ca. 470 nm. Bei Fluoreszenz-Emission beträgt dieser Shift ca. 70 nm bei Anregung mit 330 bzw. 380 nm. Die oben genannte enzymatische Abspaltung des Strukturelementes CRS (-L) vom Rest der chemischen Verbindung der allgemeinen Formel (I) erfolgt durch Enzyme, wie sie nachfolgend definiert werden.In a preferred embodiment, the bathochromic shift is about 30 to about 100 nm for naphthoquinones, for p-nitroaniline it is about 100 nm measured in absorption and for AMC derivatives 400 to about 470 nm. With fluorescence emission, this shift is about 70 nm when excited with 330 or 380 nm. The above-mentioned enzymatic cleavage of the structural element CRS (-L) from the rest of the chemical compound of the general formula (I) is carried out by enzymes as defined below.
Enzyme im Sinne der Erfindung sind hochspezialisierte Proteine, die biochemische Reaktionen katalysieren ohne dabei verbraucht zu werden. Ribozyme, die unter demEnzymes in the sense of the invention are highly specialized proteins that catalyze biochemical reactions without being consumed in the process. Ribozymes, which under the
Begriff Enzyme subsumiert werden können, umfassen Ribonukleinsäuremoleküle. Enzyme übertreffen in ihren katalytischen Eigenschaften synthetische Katalysatoren. Enzyme weisen eine hohe Affinität und Selektivität zu bestimmten Substraten auf. Wichtig unter den Enzymen sind insbesondere Proteasen, die sogenannten Serinproteasen I, wie beispielsweise Trypsin, bakterielle Serinproteasen II, wie beispielsweise Subtilism,The term enzymes can be subsumed include ribonucleic acid molecules. Enzymes outperform synthetic catalysts in their catalytic properties. Enzymes have a high affinity and selectivity for certain substrates. Important among the enzymes are in particular proteases, the so-called serine proteases I, such as trypsin, bacterial serine proteases II, such as subtilism,
Zysteinproteasen wie Papain, Aspartatproteasen, wie Penicillopepsin, Metalloproteasen I wie Borincoridoxidpeptidase A, bakterielle Metalloproteasen II, wie Thermolysin, umfassen. Proteasen verdauen stets an einer bestimmten Stelle an einem Peptid bzw.Cysteine proteases such as papain, aspartate proteases such as penicillopepsin, metalloproteases I such as boron coride oxide peptidase A, bacterial metalloproteases II such as thermolysin. Proteases always digest at a certain point on a peptide or
Protein. Endopeptidasen hydrolisieren innerhalb eines Proteins bestimmte Amidbindungen, während Exopeptidasen C oder N terminal eine bis drei Aminosäuren vom Peptid abspalten.Protein. Endopeptidases hydrolyze certain amide bonds within a protein, while exopeptidases C or N terminate one to three amino acids from the peptide.
Die chemischen Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) kann in Bezug auf die elektrische Ladung verschiedenartige Strukturelemente CRS umfassen. So kann das Strukturelement CRS beispielsweise neutral, anionisch, kationisch oder zwitterionisch sein. So ist beispielweise im Falle der Nil- und Meldolablau-Derivate bevorzugt die protonierte Form langwellig absorbierend. Hingegen ist bei phenolischen Verbindungen bevorzugt die deprotonierte, negativ geladene Form langwellig absorbierend.The chemical compound according to the general formula (I) can comprise various structural elements CRS with regard to the electrical charge. For example, the structural element CRS can be neutral, anionic, cationic or zwitterionic. For example, in the case of the Nile and Meldola blue derivatives, the protonated form is preferably long-wave absorbent. In contrast, in the case of phenolic compounds, the deprotonated, negatively charged form is preferably long-wave absorbent.
Die Art und Stärke der Ladung des Strukturelementes CRS sollte jedoch nicht dazu führen, dass Reaktionen ausgelöst werden, die eine enzymatische Abspaltungsreaktion des Strukturelementes CRS (-L) von der chemischen Verbindung der allgemeinen Formel (I) beeinträchtigen würden. Das bedeutet, dass entsprechend dem Medium, in dem eine enzymatische Abspaltung abläuft (beispielsweise Blut, Serum, Urin) die Art und Stärke der Ladung des Strukturelementes CRS gewählt wird.However, the type and strength of the charge of the structural element CRS should not lead to reactions being triggered which would impair an enzymatic cleavage reaction of the structural element CRS (-L) from the chemical compound of the general formula (I). This means that the type and strength of the charge of the structural element CRS is selected according to the medium in which an enzymatic cleavage takes place (for example blood, serum, urine).
Im Rahmen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Strukturelement CRS neutral oder basisch. Dabei weist es vorteilhafterweise einen pKa-Wert von 6-13 auf. Beispiele für geeignete Strukturelemente CRS sind neben den Grundkörpern Meldolablanlau und Nilblau beispielsweise aminosubstituierte 1,4 Naphthochinone wie beispielsweise 6-Amino-2,3-dichloro-l,4-naphthochinon und 6-Amino-2,3-dicyano-l,4- naphthochinon). Außerdem phenolische Azoverbindungen wie Calmagite (Absorptionsmax: 665 nm), Naphtolblau Schwarz (Absorptionsmax: 680 nm); Brilliantgelb (Absorptionsmax: 554 nm), Nitrazinegelb (Absorptionsmax: 620 nm); Ebenso können natürlich auch die 4 bzw. 5 Aminonaphthochinone verwendet werden. Weitere geeignete Chromogene sind beispielsweise 2-Anilino-3-chloro-l,4-naphthochinon, 2-(4-N,N-diethylamino-phenyl)-l,4-naphthochinon, 2,3-Dicyano-l,4-naphtholdiol, 2,3- Dicyano-l,4-naphthochinon, 2,3-Dicyano-l,4-naphthochinon-l-phenylenimin, 4- Nitro[2.2]paracyclophane bzw. weitere nitrierte Paracyclophane und einfache Cyclophane, Indanderivate, wie z.B. 2-p-Amino benzyliden-l,3-bisdicyanovinylindan und deren Derivate bzw. Homologe.In the context of an embodiment of the present invention, the structural element CRS is neutral or basic. It advantageously has a pKa value of 6-13. Examples of suitable structural elements CRS in addition to the basic bodies Meldolablanlau and Nilblau are, for example, amino-substituted 1,4 naphthoquinones such as 6-amino-2,3-dichloro-l, 4-naphthoquinone and 6-amino-2,3-dicyano-l, 4- naphthoquinone). Also phenolic azo compounds such as calmagite (absorption max: 665 nm), naphthol blue black (absorption max: 680 nm); Brilliant yellow (absorption max: 554 nm), nitrazin yellow (absorption max: 620 nm); The 4 or 5 amino naphthoquinones can of course also be used. Other suitable chromogens are, for example, 2-anilino-3-chloro-l, 4-naphthoquinone, 2- (4-N, N-diethylamino-phenyl) -l, 4-naphthoquinone, 2,3-dicyano-l, 4-naphtholdiol , 2,3-dicyano-l, 4-naphthoquinone, 2,3-dicyano-l, 4-naphthoquinone-l-phenyleneimine, 4-nitro [2.2] paracyclophanes or other nitrated paracyclophanes and simple cyclophanes, indane derivatives such as 2 -p-amino benzylidene-l, 3-bisdicyanovinylindan and their derivatives or homologs.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin chemische Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I), bei denen das Strukturelement CRS eine Verbindung ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Verbindungen (a), (b), (c) oder (d) ist:The present invention furthermore relates to chemical compounds of the general formula (I) in which the structural element CRS is a compound selected from the following group of compounds (a), (b), (c) or (d):
(a)(A)
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(b)
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(B)
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(c)(C)
Figure imgf000011_0002
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(d)(D)
^^
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wobei R für H, C\ bis C8 Alkyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i- Butyl, Aryl, Aralkyl, CN , Halogen steht,where R is H, C \ to C 8 alkyl, in particular methyl, ethyl, propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, aryl, aralkyl, CN, halogen,
Ri und R2 gleich oder verschieden sein können und für H, CN, Halogen, Aryl oder Aralkyl oder Alkoxy stehen,R 1 and R 2 can be the same or different and represent H, CN, halogen, aryl or aralkyl or alkoxy,
R3, Ri, R5, R<5, R7 und R8 gleich oder verschieden sein können und für H, CN, NO2, NH2, - HSO3 ", COO", -OH (-O") -SO3 ", Alkyl, Aralkyl, Halogen, insbesondere CI, Br, oder Alkoxy stehen,R 3 , Ri, R 5 , R <5 , R 7 and R 8 can be the same or different and for H, CN, NO 2 , NH 2 , - HSO 3 " , COO " , -OH (-O " ) - SO 3 " , alkyl, aralkyl, halogen, in particular CI, Br, or alkoxy,
R9 H, Halogen, SH, SR, OH, OR, Carbonsäure, Aminocarbonsäure, HSO3 ", COO", -OH (- O") -SO3 ", eine Azo- bzw. Diazogruppe, substituierter oder unsubstituierter Aromat wie Nitroaromaten, halogenierte Aromaten, Thiocyanat, sunbstituiertes bzw. unsubstituiertes Phenol, bedeutet, und mit der Bedingung bei Verbindung (c), dass mindestens ein Rest aus R3 bis Ö eine Aminogruppe ist, deren einer Stickstoffsubstituent mit dem Reste der Verbindung der allgemeinen Formel (I) verbunden ist.R9 H, halogen, SH, SR, OH, OR, carboxylic acid, aminocarboxylic acid, HSO 3 " , COO " , -OH (- O " ) -SO 3 " , an azo or diazo group, substituted or unsubstituted aromatic such as nitroaromatic, halogenated aromatics, thiocyanate, unsubstituted or unsubstituted phenol means and with the condition for compound (c) that at least one radical from R 3 to Ö is an amino group, one nitrogen substituent of which is linked to the radical of the compound of the general formula (I).
Inbesondere beeinflußt der Rest R9 die Löslichkeit der Verbindung, die so entsprechend dem j eweiligen Rest R9 eingestellt werden kann.In particular, the radical R 9 influences the solubility of the compound, which can be adjusted in accordance with the respective radical R 9 .
Im Rahmen einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind besonders diejenigen chemischen Verbindungen bevorzugt, die ein Strukturelement CRS aufweisen, das nach der Dissoziation vom Rest der Verbindung der allgemeinen Formel (I) eine geringe Wasserlöslichkeit aufweist. Unter "geringer Wasserlöslichkeit" sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Werte im Bereich von etwa 50 mg/1 bis etwa 1 mg/1 zu verstehen.In the context of a particular embodiment of the present invention, those chemical compounds are particularly preferred which have a structural element CRS which, after dissociation from the rest of the compound of the general formula (I), has a low water solubility. In the context of the present invention, “low water solubility” means values in the range from about 50 mg / 1 to about 1 mg / 1.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die Wasserlöslichkeit des Strukturelements CRS im Bereich von etwa 10 bis etwa 0.1 mg/I.According to a particularly preferred embodiment of the present invention, the water solubility of the structural element CRS is in the range from about 10 to about 0.1 mg / l.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) umfassend die folgenden Schritte:The present invention further provides a process for the preparation of a compound of the general formula (I) comprising the following steps:
1. Herstellung eines Oligopeptids X-A-B- unter üblichen Bedingungen, wobei X für Wasserstoff oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für terminale Aminogruppen steht, A und B für eine α-, ß-, oder γ- Aminosäure stehen, die 2 bis 15 C- Atome und bis zu 4 N-Atome, bis zu 2 S-Atome und bis zu 6 O-Atome umfassen und wobei A und B identisch oder verschieden sein können und B gegebenenfalls für ein Dipeptid steht, das aus diesen Aminosäuren gebildet ist,1. Preparation of an oligopeptide XAB- under customary conditions, where X is hydrogen or a protective group which is customary in peptide chemistry for terminal amino groups, A and B are an α-, β- or γ-amino acid which are 2 to 15 C- Comprise atoms and up to 4 N atoms, up to 2 S atoms and up to 6 O atoms and where A and B can be identical or different and B optionally represents a dipeptide which is formed from these amino acids,
2. Herstellung von CRS-L, wobei L für einen wie vorstehend definierten Linker steht, der in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden und wobei der Linker bevorzugt an ein N-Atom des Strukturelementes CRS kovalent gebunden wird und wobei CRS für ein wie vorstehend definiertes konjugiertes Kohlenstoffringsystem steht, das ein Absorptionsmaximum bei einer höheren Wellenlänge aufweist als die Verbindung X-A-B- C-L-CRS (I), deren Absorptionsmaximum bevorzugt im Bereich von < 530 nm liegt, 3. Umsetzen des so gebildeten CRS-L mit C unter üblichen Bedingungen zu CRS-L-C, wobei C für Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan oder andere Aminosäuren und deren Stereoisomeren oder ihre jeweiligen Homologen steht2. Production of CRS-L, where L stands for a linker as defined above which is capable of forming a peptide bond with C and where the linker is preferably covalently bound to an N atom of the structural element CRS and where CRS is for a is as defined above conjugated carbon ring system which has an absorption maximum at a higher wavelength than the compound XAB-CL-CRS (I), whose absorption maximum is preferably in the range of <530 nm, 3. Reacting the CRS-L thus formed with C under customary conditions to CRS-LC, where C is arginine, lysine, tyrosine, phenylalanine or tryptophan or other amino acids and their stereoisomers or their respective homologues
4. Umsetzen von X-A-B und CRS-L-C zu X-A-B-C-L-CRS4. Convert X-A-B and CRS-L-C to X-A-B-C-L-CRS
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Schritte (1) und (2) in beliebiger Reihenfolge vorgenommen werden.In the context of the method according to the invention, steps (1) and (2) can be carried out in any order.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zum Nachweis von Zielsubstanzen umfassend folgende Schritte:The present invention furthermore relates to a method for the detection of target substances, comprising the following steps:
- des Bereitstellens von Verbindungen der allgemeinen Formel (I),the provision of compounds of the general formula (I),
- der Bestimmung der Wellenlänge, bei dem die Verbindungen ihr Absorptionsmaximum aufweisen sofern die Wellenlänge nicht bekannt ist,- the determination of the wavelength at which the compounds have their absorption maximum if the wavelength is not known,
- Des In-Kontakt-bringens (und gegebenenfalls Einwirken lassen) der bereitgestellten Verbindungen mit der für den Nachweis vorgesehenen Lösung, Emulsion, Gas,- bringing the provided connections into contact (and if necessary allowing them to act) with the solution, emulsion, gas intended for the detection,
Aerosol, Mischung oder Reinstoff,Aerosol, mixture or pure substance,
- Der Bestimmung der Wellenlänge, bei dem die Verbindungen, die im ersten Schritt bereitgestellt wurden, nach dem in Kontakt bringen (und Einwirken lassen) der bereitgestellten Verbindungen mit der für den Nachweis vorgesehenen Lösung, Emulsion, Gas, Aerosol, Mischung oder Reinstoff ihr Absorptionsmaximum aufweisen, evtl. nach Änderung des pHs mit Säure, Base oder Puffer- The determination of the wavelength at which the compounds, which were provided in the first step, after the provided compounds have been brought into contact (and allowed to act) with the solution, emulsion, gas, aerosol, mixture or pure substance intended for the detection, their absorption maximum after changing the pH with acid, base or buffer
Zum Nachweis der Zielsubstanzen werden erfmdungsgemäß vorzugsweise Biosensoren eingesetzt. Biosensoren basieren auf einer Kopplung von Biomolekülen, die als Rezeptoren im weitesten Sinne spezifische Analyten erkennen mit physikochemischen Transduktoren, die ein biologisch erzeugtes Signal in elektrische Messsignale umwandeln. Bioaktive Erkennungskomponenten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt, auf Antikörper, Enzyme, Zellorganellen oder ganze Mikroorganismen. Auch Peptide bzw. Proteine werden alsAccording to the invention, biosensors are preferably used to detect the target substances. Biosensors are based on a coupling of biomolecules that recognize specific analytes as receptors in the broadest sense with physicochemical transducers that convert a biologically generated signal into electrical measurement signals. Bioactive recognition components include, but are not limited to, antibodies, enzymes, Cell organelles or whole microorganisms. Peptides and proteins are also considered
Biomoleküle bezeichnet. Jedoch sind Peptide nicht bioaktiv, indem sie andere Moleküle umsetzen können oder spezifische Bindungen an weitere Moleküle fördern. BeiCalled biomolecules. However, peptides are not bioactive in that they can convert other molecules or promote specific bonds to other molecules. at
Biosensoren werden zwei Grundtypen voneinander unterschieden: Einerseits die sogenannten Bioaffinitätssensoren und andererseits die sogenanntenA distinction is made between two basic types of biosensors: on the one hand the so-called bioaffinity sensors and on the other hand the so-called
Metabolismussensoren. Die Bioaffinitätssensoren generieren ein Signal durch i Komplexbildung von bioaktiven Molekülen zu einem Analyten. Hierbei liegt nach derMetabolism sensors. The bioaffinity sensors generate a signal by complexing bioactive molecules to form an analyte. Here lies after the
Messung wieder der Ausgangszustand vor. Während letztere auf einer spezifischenMeasurement again the initial state. While the latter on a specific
Erkennung und anschließenden Umsetzung von Substraten beruhen. Nach dem Messvorgang muss dieser Sensor entweder verworfen oder der Ausgangszustand wieder hergestellt werden.Detection and subsequent implementation of substrates are based. After the measurement process, this sensor must either be discarded or the initial state restored.
Bei der vorliegenden Erfindung sollen Enzymaktivitäten bestimmt werden, wobei die Enzyme durch eine Proteolyse des entsprechenden Substrates eine Änderung des Absorptionsspektrum des Substrates bewirken.In the present invention, enzyme activities are to be determined, the enzymes causing a change in the absorption spectrum of the substrate by proteolysis of the corresponding substrate.
Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als günstig herausgestellt die Absorptionsänderungen mit der sogenannten abgeschwächten totalen Reflektionsspektroskopie (Attenuated total reflection spectroscopy (ATRS)) zu bestimmen. Weiterhin ist insbesondere die Verwendung eines planaren Dünnfilmwellenleiterchips, der chemisch z.B. mit einem selektiven chemischen Polymer modifiziert wurde für einen Enzymtest, insbesondere für einen Endotoxintest geeignet. Das eingekoppelte Licht wandert innerhalb eines planaren Wellenleiters und erzeugt ein evaneszentes Feld entlang der Oberfläche. Das evaneszente Feld wandert innerhalb des benachbarten Mediums und weist eine Eindringtiefe in Größe von wenigen Nanometern auf (ungefähr 10 nm) in der Z- Richtung des wandernden Lichts auf. Die Absorption des Lichts unter Verwendung der ATRS Technik innerhalb der benachbarten Schicht korreliert mit der Änderung der Konzentration des spezifischen Analyten. Die ATR Technik bringt den Vorteil mit sich, dass CRS, CRS-L und CRS-L-C-B-A-X nicht verschiedene Absorptionswellenlängen zu haben brauchen und in der Regel auch nicht haben. Andererseits ist eine einfache lokale Trennung möglich mit pH- Anpassung.In the context of the present invention, it has been found to be advantageous to determine the absorption changes with the so-called attenuated total reflection spectroscopy (ATRS). Furthermore, the use of a planar thin-film waveguide chip, which is chemically e.g. modified with a selective chemical polymer was suitable for an enzyme test, in particular for an endotoxin test. The coupled light travels within a planar waveguide and creates an evanescent field along the surface. The evanescent field migrates within the neighboring medium and has a penetration depth of a few nanometers (approximately 10 nm) in the Z direction of the traveling light. The absorption of light using the ATRS technique within the adjacent layer correlates with the change in the concentration of the specific analyte. The ATR technology has the advantage that CRS, CRS-L and CRS-L-C-B-A-X do not need to have different absorption wavelengths and generally do not have either. On the other hand, simple local separation is possible with pH adjustment.
Um ein besonders effizientes Nachweisverfahren zu ermöglichen, können Chromogen- markierte Substrate beispielsweise auf einem Chip, wie er beispielsweise in der unveröffentlichten deutschen Patentanmeldung DE 10251893.9 als sogenannter Wellenleiterchip beschrieben ist, aufgebracht und immobilisiert werden. Die Chipoberfläche wird beispielsweise unter Verwendung zweier verschiedener Verfahren chemisch modifiziert und funktionalisiert:In order to enable a particularly efficient detection method, chromogen-labeled substrates can be used, for example, on a chip such as that in the unpublished German patent application DE 10251893.9 is described as a so-called waveguide chip, applied and immobilized. For example, the chip surface is chemically modified and functionalized using two different methods:
a) Durch kovalente Bindung(Immobilisierung) der vorstehend definierten Chromophoren und chromogenen Substrate auf der aktivierten, vorbehandelten Oberfläche des Chips beispielsweise eine in mittels eines Spacers (Avidin-Biotin, Suberinsäure, Kohlenwasserstoffketten, Hexylendiamin, Sulfhydrylgruppen).a) By covalent binding (immobilization) of the above-defined chromophores and chromogenic substrates on the activated, pretreated surface of the chip, for example one using a spacer (avidin-biotin, suberic acid, hydrocarbon chains, hexylenediamine, sulfhydryl groups).
b) Durch nano-strukturiertes Immobilisieren oder physikochemische Adsorption chromogener und chromophorer Substrate (spezifisches Oligopeptid, das mit einem der vorgenannten Farbstoffe gelabelt ist) auf dem Wellenleiter chip.b) By nano-structured immobilization or physicochemical adsorption of chromogenic and chromophoric substrates (specific oligopeptide that is labeled with one of the aforementioned dyes) on the waveguide chip.
So können Chromogene beispielsweise über geeignete Linker an ein Peptid, wie BOC- Ser(Bz)-Gly-Arg, gekoppelt werden und N-terminal auf einem Wellenleiter eines optischen Chips immobilisiert werden. Die Detektion der Proteolyse erfolgt über die Messung der Absorptionsänderung im Bereich des evaneszenten Feldes des Wellenleiters, die durch die Weg-Diffusion des Chromogens aus demselben induziert wird. Das Chromogen muss dazu nur über eine geringe Wasserlöslichkeit verfügen, da es dementsprechend auf das Volumen der Messzelle bezogen in nur sehr kleinen Mengen freigesetzt wird.For example, chromogens can be coupled to a peptide, such as BOC-Ser (Bz) -Gly-Arg, via suitable linkers and immobilized on a waveguide of an optical chip at the N-terminal. The proteolysis is detected by measuring the change in absorption in the region of the evanescent field of the waveguide, which is induced by the chromogen's diffusion from the path. The chromogen only needs to have a low water solubility, since it is released in very small quantities based on the volume of the measuring cell.
Innerhalb der polymeren Membran kann der chromogene Teil der chemischen Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) einen spektralen Shift aufgrund verschiedener Mechanismen zeigen. Wird der chromogene Teil der chemischen Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) vom immobilisiertem Peptid nach Zugabe des Enzyms (z.B. Serinprotease) abgespalten, kann der Chromogene Teil (CRS oder CRS-L) sein Absorptionsspektrum wechseln oder wenigstens seine Verteilung und diffundiert aus der Erkennungschicht näher an die Oberfläche des Wellenleiters (diffusionsbeschränkter Prozess). Das Aufbringen der Schichten des Erkennungsbereiches kann beispielsweise (mittels eines Pipettors "Genesis NPS") mit einem aktiven Tip M (Volumina) von Tecan erfolgen. Die Substrate können als optisch aktive Materialien auf definierten Gebieten auf der Oberfläche des optischen Chips aufgebracht werden.Within the polymeric membrane, the chromogenic part of the chemical compound according to the general formula (I) can show a spectral shift due to various mechanisms. If the chromogenic part of the chemical compound according to the general formula (I) is cleaved from the immobilized peptide after adding the enzyme (eg serine protease), the chromogenic part (CRS or CRS-L) can change its absorption spectrum or at least its distribution and diffuse from the detection layer closer to the surface of the waveguide (diffusion-restricted process). The layers of the detection area can be applied, for example (using a "Genesis NPS" pipettor) with an active Tip M (volume) from Tecan. The substrates can be applied as optically active materials in defined areas on the surface of the optical chip.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen zum Nachweis .von Zielsubstanzen, insbesondere die Verwendung zum Nachweis von Endotoxinen.Another object of the present invention is the use of compounds according to the invention for the detection of target substances, in particular the use for the detection of endotoxins.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung durch Ausführungsbeispiele näher erläutert ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.The present invention is explained in more detail below by means of exemplary embodiments without restricting the invention to these.
Abbildungenpictures
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Abbildungen und Ausführungsbeispielen beispielhaft erläutert. Es ist klar, dass die vorstehend erläuterten und nachstehend noch zu beschreibenden Merkmale nicht nur in Kombination, sondern auch in Alleinstellung beansprucht werden.The invention is explained below using examples and examples. It is clear that the features explained above and to be described below are claimed not only in combination but also on their own.
Abb. 1 zeigt ein Syntheseschema für die Darstellung eines mit einem Aminonaphtochinon gelabelten Peptids.Fig. 1 shows a synthetic scheme for the representation of a peptide labeled with an amino naphthoquinone.
Abb. 2 zeigt die Spaltung des LAL Substrates Serin-(BZ)-Gly-Arg-L-LM46 (Linker: p- Aminobezoesäure, Chromophor: Nilblau) in TRIS-Puffer pH 7 bei 37°C mit bovinem Trypsin 10"6M. Messung bei 641 nm.Fig. 2 shows the cleavage of the LAL substrate serine (BZ) -Gly-Arg-L-LM46 (linker: p-aminobenzoic acid, chromophore: Nile blue) in TRIS buffer pH 7 at 37 ° C with bovine trypsin 10 "6 M Measurement at 641 nm.
Abb. 3 zeigt die Spaltung des LAL Substrates Serin-(BZ)-Gly-Arg-L-LM46 (Linker: p- Aminobezoesäure, Chromophor: Nilblau) in TRIS-Puffer pH 7 bei 37°C mit bovinem Trypsin 10"6M. Messung bei 674 nm. Ausführungsbeispiele und Beschreibung der AbbildungenFig. 3 shows the cleavage of the LAL substrate serine (BZ) -Gly-Arg-L-LM46 (linker: p-aminobenzoic acid, chromophore: Nile blue) in TRIS buffer pH 7 at 37 ° C with bovine trypsin 10 "6 M Measurement at 674 nm. Exemplary embodiments and description of the figures
Im Rahmen der Erfindung wurden beispielsweise die folgenden Substrate hergestellt:For example, the following substrates were produced within the scope of the invention:
1 . BOC-Ser(Bn)-Gly-Arg(HCl)-p-NA(p-NitroaniIin): Dieses Substrat wurde als Referenz für enzymatische Spaltungstest in Lösungen verwendet. Messungen auf einem Chip waren nicht möglich, da die Wellenlänge von ungefähr 405 nm mit dem Laserspektrometer nicht zugänglich ist.1 . BOC-Ser (Bn) -Gly-Arg (HCl) -p-NA (p-NitroaniIin): This substrate was used as a reference for enzymatic cleavage test in solutions. Measurements on a chip were not possible because the wavelength of approximately 405 nm is not accessible with the laser spectrometer.
2. Nilblau als Chromogen, das an 4-Aminobenzoesäure (als Linker) in Form eines Carboxylamids gekoppelt ist.2. Nile blue as a chromogen which is coupled to 4-aminobenzoic acid (as a linker) in the form of a carboxylamide.
3. Meldolablanlau als Chromogen, das an 1,4-Phenylendiamin (Linker) gekoppelt ist. Dies führt weiter zu einem 4-((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl)-L-arginylamindo)-N-(9- diethylamino-benzo [a]phenoxazin-5-yliden)anilin.3. Meldolablanlau as chromogen, which is coupled to 1,4-phenylenediamine (linker). This further leads to a 4 - ((benzyl-L-serinyl-L-glycyl) -L-arginylamindo) -N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline.
Substrate 1 und 2 (im folgenden auch als LAL-Substrate bezeichnet) wurden durch Trypsin gespalten, obgleich ein spektraler Shift nicht auftrat. Jedoch konnte eine Änderung der Absorbanz bei bei 641 und 674 nm in Lösung entdeckt werden, da das Chromogen vom Substrat abgespalten wurde und in Lösung nahezu unlöslich ist. Die Absorptionsspektren und die Absorptionskoeffizienten wurden in verschiedenen Lösungsmitteln bei einem pH- Wert von 7 und einer Temperatur von 37°C charakterisiert.Substrates 1 and 2 (hereinafter also referred to as LAL substrates) were cleaved by trypsin, although there was no spectral shift. However, a change in the absorbance at 641 and 674 nm could be detected in solution, since the chromogen was cleaved from the substrate and is almost insoluble in solution. The absorption spectra and the absorption coefficients were characterized in different solvents at a pH of 7 and a temperature of 37 ° C.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass Aminonaphthochinone alle Anforderungen an ein Chromogen, das an ein Peptid gekoppelt ist, erfüllen. Beispiele für erfindungsgemäße Naphthochinone sind: Schema 1: 5- und 6-Amino-l,4-naphthochinone (ANC)Surprisingly, it has been found that aminonaphthoquinones meet all the requirements for a chromogen that is coupled to a peptide. Examples of naphthoquinones according to the invention are: Scheme 1: 5- and 6-amino-l, 4-naphthoquinones (ANC)
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Aminonaphthochinone sind eine Klasse von Chromogenen, deren Spektren sich nach enzymatischer Hydrolyse ändern, insbesondere durch einen Wechsel des Absorptionsmaximums hin zu längeren Wellenlängen. Bei diesen Chromogenen ist das Chromogen über die Amino-endständige Gruppe direkt an das Peptid (Arginin) an der 6- Amino-Position verbunden und wechselt sein Spektrum nach der Hydrolyse der Amid- Gruppe. Auch hier sind die Amino-l,4-naphthochinone gegebenenfalls über einen Linker an die Peptidsequenz gebunden.Aminonaphthoquinones are a class of chromogens, the spectra of which change after enzymatic hydrolysis, in particular due to a change in the absorption maximum towards longer wavelengths. In these chromogens, the chromogen is linked via the amino-terminated group directly to the peptide (arginine) at the 6-amino position and changes its spectrum after hydrolysis of the amide group. Here too, the amino-1,4-naphthoquinones are optionally linked to the peptide sequence via a linker.
Während Verbindung 4 in Ethanol im ungeladenen Zustand die langwelligste Absorptionsbande bei 479 nm besitzt, ist diese im Vergleich dazu im protonierten Zustand um 200 nm bathochrom verschoben. Bei 6-Amino-2,3-dicyano-l ,4-naphthochinon (6) tritt ein weiterer bathochromer Shift um 86 nm für die Absorptionsbande auf, aufgrund der im Vergleich zu den Chlor substituenten in 5 stärker elektronenziehend wirkenden Cyanosubsti uenten. Demzufolge liegt die Absorptionsbande von 6 in Ethanol bei etwa 598 nm.While compound 4 in ethanol has the longest wavelength absorption band at 479 nm in the uncharged state, this is bathochromically shifted by 200 nm in the protonated state. With 6-amino-2,3-dicyano-l, 4-naphthoquinone (6) there is a further bathochromic shift around 86 nm for the absorption band, due to the more electron-withdrawing cyano substituents in 5 compared to the chlorine substituents. As a result, the absorption band of 6 in ethanol is around 598 nm.
Durch das Koppeln des Aminonaphthochinon (ANC)-Chromogens an das Peptid wurde beispielsweise das Substrat BOC-Ser-(Bz)-Gly-Arg-6-ANC erzeugt; das Peptidsubstrat zeigte eine Absorbanz von A< 0,06 bei einer Wellenlänge λ = 479 nm und eine Basislinienabsorbanz bei 550 nm. Durch Zugabe von Trypsin bei einem pH- Wert von 7,4 in Ethanol zeigte sich schnell ein Absorptionsmaximum von freien ANC bei einer Wellenlänge λ = 479 nm und einer zweiter entsprechenden Wellenlänge λ =550 nm.By coupling the aminonaphthoquinone (ANC) chromogen to the peptide, for example, the substrate BOC-Ser- (Bz) -Gly-Arg-6-ANC was generated; the peptide substrate showed an absorbance of A <0.06 at a wavelength λ = 479 nm and a baseline absorbance at 550 nm. The addition of trypsin at a pH of 7.4 in ethanol quickly showed an absorption maximum of free ANC at one Wavelength λ = 479 nm and a second corresponding wavelength λ = 550 nm.
Durch Vergleich der Effekte von elektronenakzeptierenden Substituenten auf die Absorptionsspektren von existierenden Chromophoren (7-Amino-4-methylcumarin und 2- Aminoacridon) wurde gefunden, dass der bathochrome Effekt von Elektronendonorsubstituenten in der Größenordnung von bis zu ungefähr 100 nm liegt. υ i -> ΔΛIIUM 19By comparing the effects of electron-accepting substituents on the absorption spectra of existing chromophores (7-amino-4-methylcoumarin and 2-aminoacridone), it was found that the bathochromic effect of electron donor substituents is on the order of up to approximately 100 nm. υ i -> ΔΛIIUM 19
Abkürzungen:Abbreviations:
DMF N,N-DimethylformamidDMF N, N-dimethylformamide
NEt3 TriethylaminNEt 3 triethylamine
EE EssigsäureethylesterEE ethyl acetate
DC DünnschichtchromatographieTLC thin layer chromatography
IBCF IsobutylchloroformiatIBCF isobutyl chloroformate
AcOH Eisesssig iPrOH 2-PropanolAcOH glacial acetic acid iPrOH 2-propanol
BOG B enzy loxy carbonylBOG B enzy loxy carbonyl
MeOH MethanolMeOH methanol
RF RetentionsfaktorRF retention factor
«BuOH ra-Butanol«BuOH ra-butanol
ANC AminonaphthochinonANC aminonaphthoquinone
TsCC TosylchloridTsCC tosyl chloride
EtOH EthanolEtOH ethanol
DCM DichlormethanDCM dichloromethane
FC Flashchromatographie FC flash chromatography
Beispiel 1example 1
Nilblau als chromogener BausteinNile blue as a chromogenic building block
Synthese von 4-((Benzyl-L-seήnyl-L-glycyl)~L~arginylamido)-N-(9-diethylamino- benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamidSynthesis of 4 - ((benzyl-L-senήnyl-L-glycyl) ~ L ~ arginylamido) -N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide
1.1. Synthese von 4-Amino-N-(9-diethylamino-heήzo[a]phenoxazin-5- yliden) benzoesäureamid1.1. Synthesis of 4-amino-N- (9-diethylamino-heήzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide
Schritt A: 4-Nitro- N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamidStep A: 4-nitro-N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide
11.3 g Nilblau A wurden in 140 ml DMF eingerührt und 11 g NEt3 zum Gemisch hinzugefügt, gefolgt von 7.2 g 4-Nitrobenzoesäure-N-oxy-succinimidylester. Nach Rühren über Nacht wurde das Lösungsmittel an Vakuum und Hochvakuum entfernt, der Rückstand auf Kieselgel 60 adsorbiert und die Titelverbindung nach Aufbringen desselben auf eine mit CHC13/EE 8:1 (v/v) konditionierte, mit Kieselgel 60 gefüllte Chromatographiesäule mit demselben Lösungsmittelgemisch eluiert. Ausbeute: 5.6 g Reinheitskontrolle: DC R^ = 0.60 (CHOb/EE 11:1 v/v)11.3 g of Nilblau A were stirred into 140 ml of DMF and 11 g of NEt 3 were added to the mixture, followed by 7.2 g of N-oxy-succinimidyl 4-nitrobenzoate. After stirring overnight, the solvent was removed in vacuo and under high vacuum, the residue was adsorbed on silica gel 60 and the title compound was applied to a chromatography column filled with CHC1 3 / EE 8: 1 (v / v) and filled with silica gel 60 with the same solvent mixture eluted. Yield: 5.6 g Purity control: DC R ^ = 0.60 (CHOb / EE 11: 1 v / v)
Schritt B: 4-Amino-N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamidStep B: 4-amino-N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide
4 g 4-Nitro- N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid wurden in 70 ml Eisessig gelöst und unter Rühren mit 10 g Zinkstaub versetzt. Nach einer halben Stunde Rühren wurde das Lösungsmittel im Vakuum weitgehend entfernt und der Rückstand mit CHCI3 in einen Schütteltrichter überführt. Die organische Phase wurde mit 2 N NaOH gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde der verbleibende Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 aufgereinigt (CHCl3/MeOH 40:1 v/v). Ausbeute: 2.2 g Reinheitskontrolle: DC RF= 0.24 1.2 Synthese von (4-((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylamino- benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid)4 g of 4-nitro-N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide were dissolved in 70 ml of glacial acetic acid and 10 g of zinc dust were added with stirring. After stirring for half an hour, the solvent was largely removed in vacuo and the residue was transferred into a shaking funnel with CHCI 3 . The organic phase was washed with 2N NaOH and dried over MgSO 4 . After removing the solvent in vacuo, the remaining residue was purified by chromatography on silica gel 60 (CHCl 3 / MeOH 40: 1 v / v). Yield: 2.2 g purity control: DC R F = 0.24 1.2 Synthesis of (4 - ((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl) -L-arginylamido) -N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide)
Schritt A:Step A:
4-(NaN&Nω-tri-Z-L-arginylamido)-N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5- yliden) benzoesäureamid4- (N a N & N ω -tri-ZL-arginylamido) -N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide
2.88 g Nα,Nδ,Nω-tri-Z-L-arginin wurden unter Argon in 8 ml abs. DMF in der Hitze gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 0.7 ml NEt3 und 0.65 ml IBCF zugegeben und das resultierende Gemisch während 20 min gerührt. Danach fügte man 1.32 g 4- Amino-N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid zu und rührte das Reaktions-gemisch über 12 h bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wurde im Hochvakuum entfernt und der Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 (CHCl3/EtOH 30:1 v/v) aufgereinigt. Ausbeute: 2.89 g Reinheitskontrolle: DC RF = 0.342.88 g of N α , N δ , N ω -tri-ZL-arginine were dissolved in 8 ml of abs. DMF dissolved in the heat. After cooling to room temperature, 0.7 ml of NEt 3 and 0.65 ml of IBCF were added and the resulting mixture was stirred for 20 minutes. Then 1.32 g of 4-amino-N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide were added and the reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. The solvent was removed in a high vacuum and the residue was purified by chromatography on silica gel 60 (CHCl 3 / EtOH 30: 1 v / v). Yield: 2.89 g purity control: DC R F = 0.34
Schritt B: 4-(L-arginylamido)- N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamidStep B: 4- (L-arginylamido) - N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide
750 mg 4-( Nα,Nδ,Nω-tri-Z-L-arginylamido)- N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5- yliden)benzoesäureamid wurden in 20 ml Dioxan gelöst und unter Nachspülen mit 30 ml MeOH zu einer vorhydrierten Suspension von 500 mg Palladium auf Aktivkohle (10%, etwa 50% Wassergehalt) in 50 ml MeOH gegeben. Nach 3 h Hydrieren bei intensivem Rühren unter 1.1 bar H2 wurden 12.5 ml 1%-ige methanolische HC1 zum Reaktionsgemisch gegeben und dasselbe über Celite filtiert. Nachdem man das Filtrat im Vakuum vom Lösungsmittel befreit hatte, wurde der Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 (zPrOH/AcOH/H2O 3:2:2 v/v/v) aufgereinigt. Ausbeute: 250 mg Reinheitskontrolle: DC R^= 0.20 Schritt C: 4-(((Na-BOC-(benzyl-L-serinyl))-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylamino- benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid750 mg of 4- (N α , N δ , N ω -tri-ZL-arginylamido) - N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide were dissolved in 20 ml of dioxane and rinsed with 30 ml of MeOH was added to a pre-hydrogenated suspension of 500 mg of palladium on activated carbon (10%, about 50% water content) in 50 ml of MeOH. After 3 h of hydrogenation with vigorous stirring under 1.1 bar of H 2 , 12.5 ml of 1% methanolic HCl were added to the reaction mixture and the same was filtered through Celite. After the filtrate had been freed from the solvent in vacuo, the residue was purified by chromatography on silica gel 60 (zPrOH / AcOH / H 2 O 3: 2: 2 v / v / v). Yield: 250 mg purity control: TLC R ^ = 0.20 Step C: 4 - (((N a -BOC- (benzyl-L-serinyl)) - L-glycyl) -L-arginylamido) -N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide
453 mg 4-(L-arginylamido)- N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5- yliden)benzoesäureamid und 433 mg Nα-BOC-(benzyl-L-serinyl))-L-glycyl-N- oxysuccinimidylester wurden mit einem Gemisch von 7.5 ml DMF und 91 mg NEt3 versetzt und die resultierende Lösung über 12 h gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Hochvakuum wurde der resultierende Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 (z'PrOH/AcOH/H2O 4:1:1 v/v/v) aufgereinigt. Ausbeute: 350 mg Reinheitskontrolle: DC RF= 0.18453 mg 4- (L-arginylamido) - N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide and 433 mg N α -BOC- (benzyl-L-serinyl)) - L-glycyl-N - A mixture of 7.5 ml of DMF and 91 mg of NEt 3 was added to the oxysuccinimidyl ester and the resulting solution was stirred for 12 h. After removal of the solvent in a high vacuum, the resulting residue was purified by chromatography on silica gel 60 (z'PrOH / AcOH / H 2 O 4: 1: 1 v / v / v). Yield: 350 mg purity control: DC R F = 0.18
Schritt D: 4-((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5- yliden)benzoesä reamidStep D: 4 - ((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl) -L-arginylamido) -N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid reamide
222 mg 4-(((Nα-BOC-(benzyl-L-serinyl))-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylamino- benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid wurden in einem Gemisch von 10 ml DCM und 10 ml TFA über 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum und anschließend im Hochvakuum entfernt und der Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 (CHCl3/MeOH/AcOH 1 :2:2 v/v/v) aufgereinigt. Ausbeute: 180 mg Reinheitskontrolle: DC R^ = 0.17 (zPrOH/AcOH/H2O 2:1:1 v/v/v) 222 mg of 4 - (((N α -BOC- (benzyl-L-serinyl)) - L-glycyl) -L-arginylamido) -N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) benzoic acid amide in a mixture of 10 ml DCM and 10 ml TFA for 2 h at room temperature. The solvent was removed in vacuo and then in a high vacuum and the residue was purified by chromatography on silica gel 60 (CHCl 3 / MeOH / AcOH 1: 2: 2 v / v / v). Yield: 180 mg purity control: DC R ^ = 0.17 (zPrOH / AcOH / H 2 O 2: 1: 1 v / v / v)
Beispiel 2Example 2
Meldolablau als chromogener BausteinMeldola blue as a chromogenic building block
Synthese von 4-((Benzyl- -serinyl-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylamino- benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilinSynthesis of 4 - ((benzyl-serinyl-L-glycyl) -L-arginylamido) -N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline
2.1 Synthese von 4-Amino-N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin2.1 Synthesis of 4-amino-N- (9-dimethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline
Schritt A:Step A:
4-Nitro-N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin (ETHT 6005)4-nitro-N- (9-dimethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline (ETH T 6005)
7.03 g Meldolablau und 3.28 g 4-Nitroanilin wurden unter Argon gesetzt. Anschließend gab man 172 ml über Molekularsieben getrocknetes DCE und 8 ml ebenfalls über Molekulasieben getrocknetes NEt3 zu und kochte die resultierende Suspension während 12 h am Rückfluss. Nach dem Erkalten gab man 110 g neutrales Aluminiumoxid (Aktivitätsstufe III) zum RG und engte im Vakuum und anschließend Hochvakuum ein. Das Rohprodukt wurde anschließend an 200 g neutralem Aluminiumoxid (Aktivitätsstufe III) chromatographiert (Gradient von Hexan/DCM 1/1 bis zu reinem DCM). Das resultierende Produkt wurde aus DCM/EE umkristallisiert. Ausbeute: 2.7 g Reinheitskontrolle: DC RF.7.03 g of Meldola blue and 3.28 g of 4-nitroaniline were placed under argon. Then 172 ml of DCE dried over molecular sieves and 8 ml of NEt 3 also dried over molecular sieves were added and the resulting suspension was refluxed for 12 h. After cooling, 110 g of neutral aluminum oxide (activity level III) were added to the RG and concentrated in vacuo and then in a high vacuum. The crude product was then chromatographed on 200 g of neutral aluminum oxide (activity level III) (gradient from hexane / DCM 1/1 to pure DCM). The resulting product was recrystallized from DCM / EE. Yield: 2.7 g purity control: DC R F.
Schritt B: 4-Amino-N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilinStep B: 4-amino-N- (9-dimethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline
Eine Suspension von 413 mg 4-Nitro-N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5- yliden)anilin in 8 g Eisessig wurde bei RT unter Rühren mit 1.1 g Zinkstaub versetzt. Die zuvor tiefblaue Suspension ging dabei in eine hellgrüne Lösung über. Nach 15 min wurde das RG im Vakuum weitgehend von AcOH befreit und mit DCM in einen Schütteltrichtertrichter überführt. Man wusch mit 2 N NaOH und extrahierte die wässrige Phase nochmals mit DCM. Nach Trocknen über MgSO4 und Einengen im Vakuum wurde die Titelverbindung in für die nachfolgende Kopplung ausreichender Reinheit erhalten. Ausbeute: 346 mg Reinheitskontrolle: DC R^= 0.45 (MeOH/AcOH 2:1 v/v)A suspension of 413 mg of 4-nitro-N- (9-dimethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline in 8 g of glacial acetic acid was mixed with 1.1 g of zinc dust at RT with stirring. The previously deep blue suspension turned into a light green solution. After 15 min the RG was largely freed of AcOH in vacuo and into one with DCM Shake funnel transferred. It was washed with 2 N NaOH and the aqueous phase was extracted again with DCM. After drying over MgSO 4 and concentration in vacuo, the title compound was obtained in sufficient purity for the subsequent coupling. Yield: 346 mg purity control: TLC R ^ = 0.45 (MeOH / AcOH 2: 1 v / v)
2.2 Synthese von 4-((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylamino- benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin2.2 Synthesis of 4 - ((benzyl-L-serinyl-L-glycyl) -L-arginylamido) -N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline
Schritt A:Step A:
4-(Na,Nδ,~Nta-tri-Z-L-arginylamido)- N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5- yliden)anilin4- (N a , N δ , ~ N ta -tri-ZL-arginylamido) - N- (9-dimethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline
378 mg Nα,N5,N(0-tri-Z-L-arginin wurden unter Argon in 1.2 ml abs. DMF in der Hitze gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 66 mg abs. NEt3 und 90 mg IBCF zugegeben und das resultierende Gemisch während 20 min gerührt. Danach fügte man eine Lösung von 250 mg 4-Amino-N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin in 3.5 ml DMF zu und rührte das Reaktionsgemisch über 12 h bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wurde im Hochvakuum entfernt und der Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 (CHCl3/MeOH/AcOH 13:1:1 v/v/v) aufgereinigt. Das resultierende Acetat wurde in DCM aufgenommen, mit 2 N NaOH gewaschen und die organische Phase über K2CO3 getrocknet und im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 338 mg Reinheitskontrolle: DC R = 0.21378 mg of N α , N 5 , N (0 -tri-ZL-arginine were dissolved under argon in 1.2 ml of absolute DMF while hot. After cooling to room temperature, 66 mg of absolute NEt 3 and 90 mg of IBCF were added and the resulting The mixture was stirred for 20 min, after which a solution of 250 mg of 4-amino-N- (9-dimethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline in 3.5 ml of DMF was added and the reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h The solvent was removed under high vacuum and the residue was purified by chromatography on silica gel 60 (CHCl 3 / MeOH / AcOH 13: 1: 1 v / v / v) The resulting acetate was taken up in DCM, washed with 2 N NaOH and the organic Phase dried over K 2 CO 3 and concentrated in vacuo Yield: 338 mg purity control: TLC R = 0.21
Schritt B: 4-(L-arginylamido)-N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilinStep B: 4- (L-arginylamido) -N- (9-dimethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline
200 mg 4-( Nα,Nδ,Nω-tri-Z-L-arginylamido)- N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5- yliden)anilin wurden in 18 ml MeOH suspendiert respektive teilweise gelöst und zu einer vorhydrierten Suspension von 155 mg Palladium auf Aktivkohle (10%, etwa 50% Wassergehalt) in 6 ml MeOH gegeben. Nach 2 h Hydrieren bei intensivem Rühren unter 1.1 bar H2 wurden einige Tropfen Eiseesig ins Reaktionsgemisch gegeben und dasselbe über Cellit filtiert. Nach Befreien des Filtrats vom Lösungsmittel im Vakuum wurde die Titelverbindung in für die nachfolgende Umsetzung ausreichender Reinheit erhalten. Ausbeute: 105 mg Reinheitskontrolle: DC RF.200 mg of 4- (N α , N δ , N ω -tri-ZL-arginylamido) - N- (9-dimethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline were suspended in 18 ml MeOH or partially dissolved and added a pre-hydrogenated suspension of 155 mg palladium on activated carbon (10%, about 50% Water content) in 6 ml of MeOH. After 2 hours of hydrogenation with vigorous stirring under 1.1 bar of H 2 , a few drops of glacial acetic acid were added to the reaction mixture and the same was filtered through cellite. After the filtrate had been freed from the solvent in vacuo, the title compound was obtained in sufficient purity for the subsequent reaction. Yield: 105 mg purity control: DC R F.
Schritt C:Step C:
4-(((Na-BOC-(benzyl-L-serinyl))-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-dimethylamino- benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin4 - (((N a -BOC- (benzyl-L-serinyl)) - L-glycyl) -L-arginylamido) -N- (9-dimethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline
73 mg Nα-BOC-(benzyl-L-serinyl))-L-glycyl-N-oxysuccinimidylester und 81 mg 4-( L- arginylamido)-N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin wurden mit einem Gemisch von 1 ml DMF und 22 mg NEt versetzt und die resultierende Lösung über 12 h gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Hochvakuum wurde der resultierende Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 («BuOH/AcOH/H2O 5:1 :1 v/v/v) aufgereinigt. Ausbeute: 65 mg Reinheitskontrolle: DC R^ = 0.2373 mg N α -BOC- (benzyl-L-serinyl)) - L-glycyl-N-oxysuccinimidyl ester and 81 mg 4- (L-arginylamido) -N- (9-dimethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene ) Aniline was mixed with a mixture of 1 ml DMF and 22 mg NEt and the resulting solution was stirred for 12 h. After removal of the solvent in a high vacuum, the resulting residue was purified by chromatography on silica gel 60 (“BuOH / AcOH / H 2 O 5: 1: 1 v / v / v). Yield: 65 mg purity control: TLC R ^ = 0.23
Schritt D: 4-(fBenzyl-L-serinyl-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5- yliden)anilinStep D: 4- (fBenzyl-L-serinyl-L-glycyl) -L-arginylamido) -N- (9-diethylamino-benzo [a] phenoxazin-5-ylidene) aniline
Beispiel 3Example 3
Naphthochinon als chromogener BausteinNaphthoquinone as a chromogenic building block
Zunächst wurde Verbindung 4 nach dem in der Literatur beschriebenen Verfahren synthetisiert (vgl. experimenteller Teil) und anschließend an Z-Arg(Z2)-OH (13) gekoppelt. Nach dem entschützen zu 16 erfolgte die Synthese des Substrats 18 BOC- Ser(Bz)-Gly-Arg-6ANC ohne Schwierigkeiten (s. Schema 2). Schema 2: Schema der Synthesen von 6-Amino-l,4-naphthochinon (4) und BOC-Ser(Bz)- Gly-Arg-6ANC (18)Compound 4 was first synthesized according to the method described in the literature (cf. experimental part) and then coupled to Z-Arg (Z 2 ) -OH (13). After deprotection to 16, the synthesis of the substrate 18 BOC-Ser (Bz) -Gly-Arg-6ANC was carried out without difficulty (see Scheme 2). Scheme 2: Scheme of the syntheses of 6-amino-l, 4-naphthoquinone (4) and BOC-Ser (Bz) - Gly-Arg-6ANC (18)
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C10HgNQ 159.18C 10 HgNQ 159.18
1212
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C10H7NO2 173.17 C 1 0H7NO2 173.17
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Synthesestrategie zur Darstellung der Chromogenlabel 4, 5 und 6
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Synthesis strategy to display chromogen labels 4, 5 and 6
Für die Darstellung von 6 wurde folgender Weg gewählt:The following path was chosen for the representation of 6:
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C10H5CljNO2
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242.06
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C 10 H 5 CljNO 2
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242.06
KCN EtOH.RT.1h KCN EtOH. RT.1 h 83%? 83%?KCN EtOH.RT.1h KCN EtOH. RT.1 h 83%? 83%?
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Alternativ erfolgte die Umsetzung von 5 zu 6 über 25:Alternatively, the conversion from 5 to 6 took place over 25:
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3.1 Synthese von 6-Amino-l,4-naphthochinon (4)3.1 synthesis of 6-amino-1,4-naphthoquinone (4)
3.1.1 p-Toluolsulfonsäure- ß-naphthylamid (8)3.1.1 p-toluenesulfonic acid-β-naphthylamide (8)
55.7 g (389 mmol) ß -Naphthylamin (7) wurden in 111 g (1.4 mol = 113 ml) Pyridin gelöst und unter Rühren bei RT portionsweise mit 84.8 g (393 mmol = 1.01 eq.) TsCl versetzt. Man liess etwa 2 h rühren, dann wurde das RG auf das Gemisch von 175 ml konz. HC1 und55.7 g (389 mmol) of β-naphthylamine (7) were dissolved in 111 g (1.4 mol = 113 ml) of pyridine, and 84.8 g (393 mmol = 1.01 eq.) Of TsCl were added in portions with stirring at RT. The mixture was allowed to stir for about 2 h, then the RG was concentrated to the mixture of 175 ml. HC1 and
500 g Eis gegossen. Das RP wurde abfiltriert und das Filtrat einmal mit Ether extrahiert.Poured 500 g of ice. The RP was filtered off and the filtrate extracted once with ether.
Daraufhin wurde das RP in DCM gelöst und die Lösung mit der Etherphase vereinigt. Man wusch mit ges. CuSO4 (bis keine Intensivierung der Farbe mehr festzustellen war) und ges.The RP was then dissolved in DCM and the solution was combined with the ether phase. You washed with sat. CuSO 4 (until the color was no longer intensified) and sat.
NaCl, trocknete über MgSO4 und engte an RV und HV ein. DC (H/EE 2:1) zeigte nur geringe, am Startfleck verbleibende rötliche Verunreinigungen an. Ausbeute: 101.98 gNaCl, dried over MgSO 4 and concentrated at RV and HV. DC (H / EE 2: 1) showed only slight reddish impurities remaining at the starting spot. Yield: 101.98 g
(342.9 mmol = 88%).(342.9 mmol = 88%).
3.1.2 1, 6-Dinitro-p-toluolsulfonyl-2-naphthylamid (9)3.1.2 1, 6-Dinitro-p-toluenesulfonyl-2-naphthylamide (9)
29.7 g (100 mmol) Tosylat 8 wurden in 89 ml auf 55 °C erwärmtem Eisessig gelöst und unter Rühren langsam mit 20.8 ml 72%-iger HNO3 (aus Gemisch von 18 ml 65%-iger HNO3 und 4.5 ml rauchender HNO3) versetzt. Man liess das RG unter Rühren auf RT abkühlen, worauf ein Teil des Produkts in Form eines hellgelben Festkörpers auskristallisierte, versetzte das RG mit 10 ml Wasser und saugte nach 10 min über eine Glasfilternutsche ab. Durch Waschen mit wenig halbkonzentrierter HOAc und Trocknen am HV wurde die Titelverbindung in reiner Form gewonnen. Ausbeute: 27.9 g (72 mmol = 72%).29.7 g (100 mmol) of tosylate 8 were dissolved in 89 ml of glacial acetic acid heated to 55 ° C and slowly stirred with 20.8 ml of 72% HNO 3 (from a mixture of 18 ml of 65% HNO 3 and 4.5 ml of smoking HNO 3 ) offset. The RG was allowed to cool to RT with stirring, whereupon a portion of the product crystallized out in the form of a light yellow solid, the RG was mixed with 10 ml of water and, after 10 minutes, suction filtered through a glass suction filter. The title compound was obtained in pure form by washing with a little semi-concentrated HOAc and drying on the HV. Yield: 27.9 g (72 mmol = 72%).
3.1.3 6-Nitro-2-diazo-l-naphthol (10)3.1.3 6-Nitro-2-diazo-l-naphthol (10)
13 g (33.6 mmol) 9 wurden in 26 ml konz. H2SO4 eingerührt und das Gemisch anschließend auf 40°C erwärmt, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Das RG wurde dann auf < 20°C gekühlt und unter Rühren mit der Lösung von 3.12 g (45 mmol = 1.3 eq.) NaNO2 in 14.3 ml konz. H2SO4 versetzt. Danach gab man unter Rühren portionsweise 52 ml Eisessig zu und rührte das RG, bis keine Phasentrennung mehr sichtbar war. Anschließend wurde das RG langsam in 1.5 1 Eiswasser (50% Eis) gegeben und das Ganze über Nacht stehengelassen. Das Produkt wurde abgesaugt und am HV getrocknet. Ausbeute: 6.67 g (31 mmol = 92%). 3.1.4 6-Nitro-l-naphthol (11)13 g (33.6 mmol) 9 were concentrated in 26 ml. H 2 SO 4 was stirred in and the mixture was then heated to 40 ° C. until a clear solution was obtained. The RG was then cooled to <20 ° C and concentrated with stirring with the solution of 3.12 g (45 mmol = 1.3 eq.) NaNO 2 in 14.3 ml. H 2 SO 4 added. 52 ml of glacial acetic acid were then added in portions with stirring and the RG was stirred until no more phase separation was visible. The RG was then slowly added to 1.5 l of ice water (50% ice) and the whole was left to stand overnight. The product was suctioned off and dried at the HV. Yield: 6.67 g (31 mmol = 92%). 3.1.4 6-nitro-l-naphthol (11)
7.82 g (36.3 mmol) 10 wurden unter Kühlen (~ 10 °C) im Gemisch von jeweils 58.6 ml Eisessig und konz. H2SO4 gelöst. Diese Lösung gab man über einen Zeitraum von etwa 15 min zur gut gerührten, auf 55°C erwärmten Suspension von 19.55 g Cu2O in 156 ml EtOH. Anschließend erwärmte man das RG auf 80 °C, wobei man darauf achtete, dass diese Temperatur nicht überschritten wurde, gab noch 5.45 g Cu2O zum RG und ließ noch 30 min rühren. Anschließend wurde das RG durch eine Glasfilternutsche (D3) filtriert, der Rückstand mit wenig siedendem EtOH gewaschen und das Filtrat am RV bei 60°C Badtemperatur eingeengt, bis man den Grossteil des gebildeten Essigesters entfernt hatte. Dasselbe wurde in 780 ml Eis/Wassermischung eingerührt (2/3 Eis) und das resultierende Gemisch über Nacht bei RT stehengelassen. Anderntags wurde mit DCM extrahiert, der Extrakt über MgSO4 getrocknet, am RV eingeengt und der resultierende bräunlich orangerote Festkörper am HV getrocknet. Die Titelverbindung wurde durch Filtration über Kieselgel (0 = 5 cm, h = 5 cm, Hexan/Essigester 3:1) und anschließendes Einengen und Trocknen rein in Form eines orangeroten Festkörpers gewonnen. Rf: 0.25 (Hexan/Essigester 3:1) Ausbeute: 2.61 g (13.8 mmol = 38%).7.82 g (36.3 mmol) 10 were cooled (~ 10 ° C) in a mixture of 58.6 ml glacial acetic acid and conc. H 2 SO 4 dissolved. This solution was added over a period of about 15 minutes to the well-stirred suspension of 19.55 g of Cu 2 O in 156 ml of EtOH, heated to 55 ° C. The RG was then heated to 80 ° C., taking care that this temperature was not exceeded, 5.45 g of Cu 2 O were added to the RG and the mixture was stirred for a further 30 min. The RG was then filtered through a glass suction filter (D3), the residue was washed with a little boiling EtOH and the filtrate was concentrated on a RV at a bath temperature of 60 ° C. until most of the ethyl acetate formed had been removed. The same was stirred into 780 ml of ice / water mixture (2/3 ice) and the resulting mixture was left to stand at RT overnight. The next day the mixture was extracted with DCM, the extract was dried over MgSO 4 , concentrated on a RV and the resulting brownish orange-red solid was dried on a HV. The title compound was obtained by filtration over silica gel (0 = 5 cm, h = 5 cm, hexane / ethyl acetate 3: 1) and subsequent concentration and drying in the form of an orange-red solid. Rf: 0.25 (hexane / ethyl acetate 3: 1) Yield: 2.61 g (13.8 mmol = 38%).
3.1.5 6-Amino-l-naphthol (12)3.1.5 6-amino-1-naphthol (12)
2.1 g (11.1 mmol) 11 wurden in 21 ml iPrOH gelöst und zum gut vorhydrierten Gemisch von 5.5 ml Ra-Ni Suspension und 5.5 ml iPrOH gegeben. Das RG wurde unter intensivem Rühren 3 h bei RT unter 3 bar H2 hydriert, anschließend saugte man den Katalysator über eine Glasfilternutsche ab und wusch mit Aceton nach. Das RP wurde in wenig Aceton gelöst über Kieselgel filtriert (0 = 5 cm, h = 10 cm, Hexan/Essigester 3:2), anschließend in Essigester gelöst und 12 daraus nach Versetzen mit Hexan in Form farbloser Kristalle erhalten. Rf: 0.28 (Hexan/Essigester 3:2) Ausbeute: 1.64 g (10.3 mmol = 93%). 3.1.6 6-Amino-l,4-naphthochinon (4)2.1 g (11.1 mmol) 11 were dissolved in 21 ml iPrOH and added to the well pre-hydrogenated mixture of 5.5 ml Ra-Ni suspension and 5.5 ml iPrOH. The RG was hydrogenated with intensive stirring for 3 h at RT under 3 bar H2, then the catalyst was sucked off through a glass filter and washed with acetone. The RP was dissolved in a little acetone and filtered through silica gel (0 = 5 cm, h = 10 cm, hexane / ethyl acetate 3: 2), then dissolved in ethyl acetate and 12 were obtained from it in the form of colorless crystals after adding hexane. Rf: 0.28 (hexane / ethyl acetate 3: 2) Yield: 1.64 g (10.3 mmol = 93%). 3.1.6 6-amino-l, 4-naphthoquinone (4)
Zu einer auf 10°C gekühlten, gerührten Lösung von 400 mg (2.52 mmol) 6-Amino-l- naphthol (12) in 24.8 ml MeOH, welche man in einem 500 ml Zweihalskolben vorgelegt hatte, tropfte man unter sanftem Ar-Strom über eine 1/2 h eine gekühlte Lösung (5-10°C) von 1.55 g (5.78 mmol = 2.3 eq.) Kaliumnitrodisulfonat (Fremysches Salz) [14, 15] in 25 ml 1/6 M KH2PO und 88 ml Wasser. Nachdem im RG kein Edukt mehr vorhanden war, etwa nach 45 min, wurde das RG mit Essigester extrahiert, der Extrakt über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Nach Aufreinigung über FC (0 = 3 cm, h = 20 cm, Hexan/Essigester 3:2) wurden 271 mg (1.56 mmol = 62%) reine Titelverbindung in Form dunkelvioletter Kristalle erhalten. Rf: 0.32 (DCM/Essigester 10:1)To a stirred, cooled to 10 ° C solution of 400 mg (2.52 mmol) of 6-amino-1-naphthol (12) in 24.8 ml of MeOH, which had been placed in a 500 ml two-necked flask, was added dropwise under a gentle Ar stream a 1/2 h a chilled solution (5-10 ° C) of 1.55 g (5.78 mmol = 2.3 eq.) Potassium nitrodisulfonate (Fremy salt) [14, 15] in 25 ml 1/6 M KH 2 PO and 88 ml water , After no more educt was present in the RG, approximately after 45 min, the RG was extracted with ethyl acetate, the extract was dried over MgSO 4 and concentrated. After purification via FC (0 = 3 cm, h = 20 cm, hexane / ethyl acetate 3: 2), 271 mg (1.56 mmol = 62%) of pure title compound were obtained in the form of dark violet crystals. Rf: 0.32 (DCM / ethyl acetate 10: 1)
3.2 Synthese von BOC-Ser(Bz)-Gly-Arg-6ANC (18)3.2 Synthesis of BOC-Ser (Bz) -Gly-Arg-6ANC (18)
3.2.1 Z-Arg(Z2)-6ANC (15)3.2.1 Z-Arg (Z 2 ) -6ANC (15)
1.038 g (1.8 mmol) Z-Arg(Z2)OH (13) wurden mit einem Rührmagneten unter Ar in einem ausgeheizten und mit Septum verschlossenem 25 ml Kolben vorgelegt und mittels einer Spritze mit 2.7 ml absolutem THF versetzt. Nachdem man durch Rühren bei RT eine klare Lösung erhalten hatte, wurde das RG auf -5°C gekühlt und unter Rühren durch das Septum mit 249 μl (181.8 mg = 1.8 mmol, Hamilton-Spritze) absolutem NEt3, gefolgt von 234 μl (246.3 mg = 1.8 mmol, Hamilton-Spritze) frisch destilliertem Isobutyl- chloroformiat versetzt. Man ließ etwa 1/2 h bei -5°C rühren und gab dann die Lösung von 156 mg (0.9 mmol = 0.5 eq.) 6-Amino-l,4-naphthochinon (4) in 1.5 ml trockenem DMF in einem Schuss zu. Nach 1/2 h Rühren bei -5°C wurde die Kühlung entfernt und das RG noch 6 h bei RT gerührt. Das RG wurde am RV eingeengt und gründlich am HV getrocknet. Nach Aufreinigung via FC (0 = 3 cm, h = 20 cm, DCM/Essigester 11 :1 bis nach der Elution von überschüssigem 6ANC (4), dann DCM/Essigester 10:1) wurden 270 mg (369 μmol = 41%)7 reine Titelverbindung in Form eines hellgelben Festkörpers erhalten. Rf: Z-Arg(Z2)-6ANC (15): 0.25 (DCM/Essigester 10: 1) 6ANC (4): 0.32 (DCM/Essigester 10:1) Pl (Nebenprodukt): 0.53 (DCM/Essigester 10:1 3.2.2 Arg-6ANC (16)1,038 g (1.8 mmol) of Z-Arg (Z 2 ) OH (13) were placed with a stirring magnet under Ar in a 25 ml flask which had been heated and sealed with a septum, and 2.7 ml of absolute THF were added by means of a syringe. After a clear solution had been obtained by stirring at RT, the RG was cooled to -5 ° C. and with stirring through the septum with 249 μl (181.8 mg = 1.8 mmol, Hamilton syringe) absolute NEt 3 , followed by 234 μl ( 246.3 mg = 1.8 mmol, Hamilton syringe) freshly distilled isobutyl chloroformate. The mixture was stirred at -5 ° C. for about 1/2 h and then the solution of 156 mg (0.9 mmol = 0.5 eq.) 6-amino-1,4-naphthoquinone (4) in 1.5 ml of dry DMF was added in one shot , After stirring for 1/2 h at -5 ° C., the cooling was removed and the RG was stirred for a further 6 h at RT. The RG was concentrated on the RV and thoroughly dried on the HV. After purification via FC (0 = 3 cm, h = 20 cm, DCM / ethyl acetate 11: 1 until after the elution of excess 6ANC (4), then DCM / ethyl acetate 10: 1), 270 mg (369 μmol = 41%) 7 pure title compound in the form of a light yellow solid. Rf: Z-Arg (Z 2 ) -6ANC (15): 0.25 (DCM / ethyl acetate 10: 1) 6ANC (4): 0.32 (DCM / ethyl acetate 10: 1) Pl (by-product): 0.53 (DCM / ethyl acetate 10: 1 3.2.2 Arg-6ANC (16)
100 mg (137 μmol) Z-Arg(Z2)-6ANC (15) wurden in ca. 4 ml 1,4-Dioxan gelöst und unter Nachspülen mit wenig MeOH zu der vorhydrierten Suspension von 37 mg Pd/ Aktivkohle (10%, 50% Wassergehalt) in 10 ml MeOH gegeben. Das Gemisch wurde unter intensivem Rühren für 2 1/2 h unter 1.2 bar H2 in einem Rührautoklaven hydriert. Man gab 2.28 ml 1%-ige methanolische HC1 (273 μmol = 2 eq.) zum RG und saugte den Katalysator unter Nachspülen mit MeOH über eine mit Celite gestopfte Glasfilternutsche ab. Das Filtrat wurde an RV und HV zur Trockene eingeengt und via FC (0 = 1 cm, h = 20 cm, 1- Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1) aufgereinigt. Nach Einengen an RV und HV wurden 56.6 mg (126 μmol = 92%) Titelverbindung als Diacetat in Form eines grünlich-gelben Festkörpers erhalten. Rf: 0.47 (1-Butanol/HOAc/Wasser 3:1:1)100 mg (137 μmol) of Z-Arg (Z 2 ) -6ANC (15) were dissolved in approx. 4 ml of 1,4-dioxane and rinsed with a little MeOH to give the prehydrated suspension of 37 mg Pd / activated carbon (10%, 50% water content) in 10 ml of MeOH. The mixture was hydrogenated with vigorous stirring for 2 1/2 hours under 1.2 bar H 2 in a stirred autoclave. 2.28 ml of 1% methanolic HC1 (273 μmol = 2 eq.) Were added to the RG and the catalyst was sucked off through a glass filter funnel filled with Celite while rinsing with MeOH. The filtrate was evaporated to dryness at the RV and HV and purified via FC (0 = 1 cm, h = 20 cm, 1-butanol / glacial acetic acid / water 3: 1: 1). After concentration on RV and HV, 56.6 mg (126 μmol = 92%) of the title compound were obtained as diacetate in the form of a greenish-yellow solid. Rf: 0.47 (1-butanol / HOAc / water 3: 1: 1)
3.2.3 BOC-Ser(Bz)-Gly-Arg-6ANC (18)3.2.3 BOC-Ser (Bz) -Gly-Arg-6ANC (18)
26 mg (57.8 μmol) Arg-6ANC (16) und 36 mg (80 μmol = 1.38 eq.) BOC-Ser(Bz)-Gly- OSu (17) wurden in 0.4 ml trockenem DMF gelöst (bräunlichgelbe Lösung) und 13.8 μl (10.5 mg = 1.8 eq.) NEt3 mittels einer GC-Spritze zugefügt. Das RG wurde über Nacht geschüttelt und anschließend am HV vom Lösungsmittel befreit. Die nach FC (0 = 1 cm, h = 20 cm, CHCl3/MeOH/HOAc 8:1:1 bis kurz vor (gut sichtbarer) Elution von 18, dann CHCl3/MeOH/HOAc 7:1:1) erhaltene Produktfraktion wurde an RV und HV zur Trockene eingeengt und anschließend zur Abtrennung von Resten von Kieselgel in CHC suspendiert und filtriert. Nach Einengen resultierten 27 mg (37.2 μmol = 64%) der geringfügig apolar verunreinigten Titelverbindung als Monoacetat in Form eines bräunlich-gelben Pulvers. Rf: 0.11 - 0.25 (CHCl3/MeOH/HOAc 8:1:1)26 mg (57.8 μmol) Arg-6ANC (16) and 36 mg (80 μmol = 1.38 eq.) BOC-Ser (Bz) -Gly-OSu (17) were dissolved in 0.4 ml dry DMF (brownish yellow solution) and 13.8 μl (10.5 mg = 1.8 eq.) NEt 3 added using a GC syringe. The RG was shaken overnight and the solvent was then removed at the HV. The one obtained after FC (0 = 1 cm, h = 20 cm, CHCl 3 / MeOH / HOAc 8: 1: 1 until shortly before (clearly visible) elution of 18, then CHCl 3 / MeOH / HOAc 7: 1: 1) The product fraction was evaporated to dryness on RV and HV and then suspended in CHC to remove residues of silica gel and filtered. After concentration, 27 mg (37.2 μmol = 64%) of the slightly apolar-contaminated title compound resulted as monoacetate in the form of a brownish-yellow powder. Rf: 0.11 - 0.25 (CHCl 3 / MeOH / HOAc 8: 1: 1)
3.3 Synthese von 6-Amino-2,3-dichloro-l,4-naphthochinon (5)3.3 Synthesis of 6-amino-2,3-dichloro-l, 4-naphthoquinone (5)
3.3.1 6-Nitro-2, 3-dichlor-l, 4-naphthochinon (22)3.3.1 6-nitro-2,3-dichloro-1,4-naphthoquinone (22)
5 g (22 mmol) 2,3-Dichloro-l,4-naphthochinon wurden zu 15 ml konz. H2SO4 gegeben und das Gemisch unter Rühren auf 80°C erwärmt, bis man eine klare Lösung erhielt. 30 ml rauchende HNO3 wurden zugegeben und das RG während 1 h bei 80 - 90°C gerührt. Anschließend wurde dasselbe in 800 ml Eiswasser gegeben und die Fällung abgesaugt. Das Filtrat wurde mit Ether extrahiert und mit der Extrakt mit der Lösung der Fällung in Ether vereinigt. Man wusch zweimal mit ges. NaHCO3 und einmal mit ges. NaCl, trocknete über MgSO4 und engte ein. Das RP wurde auf 3 große Polylöffel Kieselgel aufgezogen und via FC (0 = 5 cm, h = 20 cm, Hexan/Essigester 5:1) aufgereinigt. Dabei resultierten 1.12 g (4.13 mmol = 16.5%) reine Titelverbindung in Form zitronengelber Blättchen. Rf: 5-Nitro-2,3-dichlornaρhthochinon (22): 0.38 (Hexan/Essigester 5:1) 5-Nitro- 2,3-dichlornaphthochinon: 0.16 (Hexan/Essigester 5:1)5 g (22 mmol) 2,3-dichloro-l, 4-naphthoquinone were concentrated to 15 ml. H 2 SO 4 was added and the mixture was heated to 80 ° C. with stirring until a clear solution was obtained. 30 ml smoking HNO 3 were added and the RG was stirred at 80-90 ° C. for 1 h. The same was then placed in 800 ml of ice water and the precipitate was filtered off with suction. The filtrate was extracted with ether and combined with the extract with the solution of the precipitation in ether. You washed twice with sat. NaHCO 3 and once with sat. NaCl, dried over MgSO 4 and concentrated. The RP was drawn onto 3 large polyspoons of silica gel and purified via FC (0 = 5 cm, h = 20 cm, hexane / ethyl acetate 5: 1). This resulted in 1.12 g (4.13 mmol = 16.5%) of pure title compound in the form of lemon-yellow leaves. Rf: 5-nitro-2,3-dichloronaphthoquinone (22): 0.38 (hexane / ethyl acetate 5: 1) 5-nitro-2,3-dichloronaphthoquinone: 0.16 (hexane / ethyl acetate 5: 1)
3.3.2 6-Amino-2,3-dichloro-l,4-naphthochinon (5)3.3.2 6-amino-2,3-dichloro-l, 4-naphthoquinone (5)
a.) 135 mg (0.5 mmol) 6-Nitro-2,3-dichloro-l,4-naphthochinon (22) wurden in 0.7 ml heis- sem Eisessig gelöst und unter Ar die Lösung von 450 mg SnCl2 Dihydrat (2 mmol) in 3-4 Tropfen konz. HC1 zugegeben. Das RG wurde bei Rühren unter Ar auf 80°C erhitzt, bis Farbumschlag von violett nach schmutziggelb erfolgte (wenige Minuten). Durch Zugabe von 0.7 ml konz. HC1 fällte man das Hydrochlorid von 6-Amino-2,3-dichloro-l,4- naphthohydro-chinon und saugte ab. Nach Trocknen am HV löste man das RP in wenig Wasser (ca. 5 ml) und säuerte mit viel konz. HC1 an. Das nach etwa halbstündigem Kühlen im Eisschrank auskristallisierte Hydrochlorid wurde abgesaugt und am HV gründlich getrocknet. Es resultierten 81 mg (287 μmol = 57%) 6-Amino-2,3-dichloro-l,4- naphthohydrochinonhydrochlorid in Form eines leicht gelblichen Pulvers.a.) 135 mg (0.5 mmol) 6-nitro-2,3-dichloro-l, 4-naphthoquinone (22) were dissolved in 0.7 ml hot glacial acetic acid and the solution of 450 mg SnCl 2 dihydrate (2 mmol ) in 3-4 drops of conc. HC1 added. The RG was heated to 80 ° C. while stirring under Ar until the color changed from violet to dirty yellow (a few minutes). By adding 0.7 ml of conc. HC1, the hydrochloride of 6-amino-2,3-dichloro-l, 4-naphthohydro-quinone was precipitated and suction filtered. After drying at the HV, the RP was dissolved in a little water (approx. 5 ml) and acidified with a lot of conc. HC1 on. The hydrochloride which crystallized out after about half an hour of cooling in the refrigerator was suction filtered and thoroughly dried at the HV. This resulted in 81 mg (287 μmol = 57%) of 6-amino-2,3-dichloro-l, 4-naphthohydroquinone hydrochloride in the form of a slightly yellowish powder.
b.) 22.8 mg (81 μmol) Hydrochlorid wurden in 2 ml Wasser gelöst und unter Rühren mit einer Lösung von etwa 500 mg FeC!3 in einigen ml Wasser versetzt, worauf sich das RG augenblicklich tiefviolett färbte. Nach etwa • h Rühren wurde das RG mit Essigester extrahiert, der Extrakt über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Es resultierten 19 mg (78 μmol = 97%) reine Titelverbindung in Form tiefvioletter Kristalle. Rf: 0.45 (Hexan/Essigester 1:1) 3.4 Synthese von 6-Amino-2,3-dicyano-l,4-naphthochinonb.) 22.8 mg (81 μmol) of hydrochloride were dissolved in 2 ml of water and a solution of about 500 mg of FeC ! 3 in a few ml of water was added with stirring, whereupon the RG immediately turned deep purple. After stirring for about • h, the RG was extracted with ethyl acetate, the extract was dried over MgSO 4 and concentrated. 19 mg (78 μmol = 97%) of pure title compound resulted in the form of deep violet crystals. Rf: 0.45 (hexane / ethyl acetate 1: 1) 3.4 Synthesis of 6-amino-2,3-dicyano-l, 4-naphthoquinone
10 g (44 mmol) 2,3-dichloro-l,4-naphthochinon (erhältlich gemäß Schema 1) wurden sorgfältig in 30 mml konzentrierter H2SO bei 80°C gelöst bis eine klare Lösung erhalten wurde. 60 mml rauchender HnO3 wurden langsam zu dieser Lösung zugegeben und die Temperatur bei ungefähr 80 bis 90°C belassen. Die Reaktionsmischung wurde bei 80°C für eine weitere Stunde gerührt. Nach einer Stunde wurde die kalte Lösung in 1,6 1 Eiswassermischung gegeben und das Produkt abfiltriert. Der erhaltene Feststoff wurde in Ethylacetat gelöst und 4 mal mit 50 mml NaHCO3 gesättigt und 2 mal mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. 5-Nitro-2,3-dichloro-l,4-naphthochinon(Rf:0,16) wurde von 6- Nitro-2,3-dichloro-l,4-naphthochinon(Rf:0,38) über Säulenchromatographie oder über Silica und Hexan/Ethylacetat (5:1) abgetrennt.10 g (44 mmol) 2,3-dichloro-l, 4-naphthoquinone (obtainable according to scheme 1) were carefully dissolved in 30 mml concentrated H 2 SO at 80 ° C until a clear solution was obtained. 60 ml of smoking HnO 3 was slowly added to this solution and the temperature was kept at approximately 80 to 90 ° C. The reaction mixture was stirred at 80 ° C for an additional hour. After one hour, the cold solution was poured into 1.6 l of ice-water mixture and the product was filtered off. The solid obtained was dissolved in ethyl acetate and saturated 4 times with 50 mml NaHCO 3 and washed 2 times with saturated NaCl solution. 5-nitro-2,3-dichloro-l, 4-naphthoquinone (Rf: 0.16) was obtained from 6-nitro-2,3-dichloro-l, 4-naphthoquinone (R f : 0.38) via column chromatography or separated on silica and hexane / ethyl acetate (5: 1).
1,41 g (5,2 mmol) 6-Nitro-2,3-dichloro-l,4-naphthochinon wurden in 20 mml Ethanol gegeben. Die Mischung wurde auf 30 bis 40°C erhitzt und eine Lösung von 1,7 g (5 mol Äquivalente) NaCn in 5 mml Wasser wurde tropfenweise zugegeben und die Mischung für eine weitere Stunde gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit konzentrierter HC1 angesäuert. Der helle Feststoff wurde filtriert und mit Wasser gewaschen. Der Feststoff wurde in 20 ml Essigsäure gelöst und eine Lösung von 6,3 g SnCl2 x2 H2O in 30 ml konzentrierter HC1 wurde zugegeben. Die Mischung wurde erhitzt und bei 80°C für 30 min. gerührt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und der helle Feststoff abfiltriert. Der Feststoff (6-Amino-2,3-dicyano-l,4-naphthodiol) wurde in einer Lösung von 17 g FeClx6 H O in 300 ml Wasser suspendiert und bei Raumtemperatur für 45 min. gerührt. Der blaue Feststoff wurde filtriert und in einem Exsikkator getrocknet. Es wurden 0,114 g 6-Amino-2,3-dicyano-l,4-naphthochinon erhalten (ungefähr 10% Ausbeute).1.41 g (5.2 mmol) of 6-nitro-2,3-dichloro-l, 4-naphthoquinone were placed in 20 mml of ethanol. The mixture was heated to 30 to 40 ° C and a solution of 1.7 g (5 mol equivalents) of NaCn in 5 mml of water was added dropwise and the mixture was stirred for an additional hour. The reaction mixture was cooled to room temperature and acidified with concentrated HC1. The light solid was filtered and washed with water. The solid was dissolved in 20 ml of acetic acid and a solution of 6.3 g of SnCl 2 x2 H 2 O in 30 ml of concentrated HCl was added. The mixture was heated and at 80 ° C for 30 min. touched. The mixture was cooled to room temperature and the light solid was filtered off. The solid (6-amino-2,3-dicyano-l, 4-naphthodiol) was suspended in a solution of 17 g FeClx6 HO in 300 ml water and at room temperature for 45 min. touched. The blue solid was filtered and dried in a desiccator. 0.114 g of 6-amino-2,3-dicyano-1,4-naphthoquinone was obtained (approximately 10% yield).
Beispiel 4Example 4
Enzymatische Spaltung von BOC-Ser(Bz)-Gly-Arg-6ANC (18) mit Trypsin (bovine pancreas) Stammlösungen:Enzymatic cleavage of BOC-Ser (Bz) -Gly-Arg-6ANC (18) with trypsin (bovine pancreas) Stock solutions:
TRIS-Puffer: 4.41 g (30 mmol) CaCl2 . 2 H2O undTRIS buffer: 4.41 g (30 mmol) CaCl 2 . 2 H 2 O and
(2 konz.) 1.211 g (10 mmol) TRIS(2 conc.) 1,211 g (10 mmol) TRIS
in 100 ml Wasser, mit 0.1 M HC1 auf pH 7.4 eingestelltin 100 ml of water, adjusted to pH 7.4 with 0.1 M HC1
Trypsin: 1 mg Trypsin (bovine pancreas) in 100 ml 0.001 M HC1 gelöst,Trypsin: 1 mg trypsin (bovine pancreas) dissolved in 100 ml 0.001 M HC1,
5 ml davon mit 0.001 M HC1 auf 100 ml verdünnt => 0.5 mg/1.5 ml of which diluted to 100 ml with 0.001 M HC1 => 0.5 mg / 1.
Substrat: 4.34 mg (6 μmol) in 240 ml DMSO gelöst, dazuSubstrate: 4.34 mg (6 μmol) dissolved in 240 ml DMSO, plus
2.4 ml TRIS-Puffer (2x) und 2.16 ml Wasser.2.4 ml TRIS buffer (2x) and 2.16 ml water.
Konzentration: 1.25 mMConcentration: 1.25 mM
Die Stammlösung wurde zweimal in einer Pasteurpipette über etwas Baumwolle filtriert. Nach zweitägigem Stehenlassen des für die Versuche nicht verwendeten Rests hatte sich ein feiner, aber deutlicher Bodensatz gebildet.The stock solution was filtered twice over a little cotton in a Pasteur pipette. After leaving the residue not used for the experiments for two days, a fine but distinct sediment had formed.
Messlösungen:Measurement solutions:
Die Messlösungen wurden direkt in den Messküvetten derart hergestellt, dass in 2 ml Gesamtvolumen 25 μg/1 Trypsin, 100 μl DMSO (5%), einfache TRIS-Pufferkonzentration (0.015 M CaCl2, 0.005 M TRIS) und die angegebene ideale Substratkonzentration enthalten waren. Die Trypsinlösung wurde nach 15 minütigem Tempern der Lösung auf 37.2 °C unmittelbar vor Messbeginn zugegeben.The measuring solutions were prepared directly in the measuring cuvettes in such a way that 2 ml total volume contained 25 μg / 1 trypsin, 100 μl DMSO (5%), simple TRIS buffer concentration (0.015 M CaCl 2 , 0.005 M TRIS) and the indicated ideal substrate concentration , The trypsin solution was added after annealing the solution at 37.2 ° C. for 15 minutes immediately before the start of the measurement.
Beispiel 5Example 5
Enzymatische Spaltung eines LAL-Substrates, welches mit L-MEL-46 markiert war (Linker, Paraaminobenzoesäure, Chromophor CAS, Nilblau protoniert bei pH 7,5 Die Absorptionsbanden des Substrates in wässriger Lösung (TRIS-Puffer pH 7,5, 10 mmol, 10% DMSO, Substratkonzentration: 40x10"6M entsprechen 10xlO"6M, enzymatische Spaltung mit Trypsin): Die Absorptionsbanden sind im sichtbaren Bereich von 350 nm bis 750 nm gelegen und haben die folgenden Charakteristika:Enzymatic cleavage of a LAL substrate which was labeled with L-MEL-46 (linker, paraaminobenzoic acid, chromophore CAS, Nile blue protonates at pH 7.5 The absorption bands of the substrate in aqueous solution (TRIS buffer pH 7.5, 10 mmol, 10% DMSO, substrate concentration: 40x10 "6 M correspond to 10xlO " 6 M, enzymatic cleavage with trypsin): The absorption bands are in the visible range of 350 nm up to 750 nm and have the following characteristics:
Tabelle 1Table 1
Gemessene Absorbanzwerte des markierten Substrates in (TRIS, pH 7,5, 10 mmol) Konzentration des Substrates: 10 μmol, 37°C in Lösung vor Beginn der Spaltungsreaktion und den entsprechenden molaren Konzentrationen bei entsprechenden Wellenlängen, die auf den Chip zugänglich sind, Reproduzierbarkeitstest:Measured absorbance values of the labeled substrate in (TRIS, pH 7.5, 10 mmol) concentration of the substrate: 10 μmol, 37 ° C in solution before the start of the cleavage reaction and the corresponding molar concentrations at corresponding wavelengths that are accessible on the chip, reproducibility test :
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Tabelle 2:Table 2:
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Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Chemische Verbindung der allgemeinen Formel (I):1. Chemical compound of the general formula (I):
X-A-B-C-L-CRSX-A-B-C-L-CRS
wobei X für Wasserstoff oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für terminale Aminogruppen steht,where X is hydrogen or a protective group for terminal amino groups which is customary in peptide chemistry,
A und B für eine α-, ß-, oder γ-Aminosäure stehen, die 2 bis 15 C-Atome und bis zu 4 N- Atome, 2 S-Atome und 6 O-Atome umfassen und A und B identisch oder verschieden sein können und B gegebenenfalls für ein Dipeptid steht, das aus diesen Aminosäuren gebildet ist,A and B represent an α-, β- or γ-amino acid which comprise 2 to 15 C atoms and up to 4 N atoms, 2 S atoms and 6 O atoms and A and B are identical or different and B optionally represents a dipeptide formed from these amino acids,
C für Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan oder ihre jeweiligen Homologen steht,C represents arginine, lysine, tyrosine, phenylalanine or tryptophan or their respective homologues,
L für einen Linker steht, der in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden,L stands for a linker which is able to form a peptide bond with C,
CRS für ein (neutrales oder positiv geladenes) konjugiertes Kohlenstoffringsystem steht, das über ein Stickstoffatom mit dem Rest -L-C-B-A-X verbunden ist und wobei die Verbindung der allgemeinen Formel (I) ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von mehr als 550 nm aufweist.CRS stands for a (neutral or positively charged) conjugated carbon ring system which is connected to the radical -L-C-B-A-X via a nitrogen atom and the compound of the general formula (I) has an absorption maximum at a wavelength of more than 550 nm.
2. Chemische Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Absorptionsmaximum bei niedrigeren Wellenlängen aufweist als CRS (und L-CRS).2. Chemical compound according to claim 1, characterized in that it has an absorption maximum at lower wavelengths than CRS (and L-CRS).
3. Chemische Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Verbindungsteil CRS neutral oder positiv geladen ist. Chemische Verbindung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Strukturelement CRS eine Verbindung ist ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Verbindungen (a), (b), (c) oder (d):3. Chemical compound according to claim 1 or 2, characterized in that the connecting part CRS is neutral or positively charged. Chemical compound according to one of the preceding claims, characterized in that the structural element CRS is a compound selected from the following group of compounds (a), (b), (c) or (d):
(a)(A)
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(b)(B)
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(C)
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wobei R für H, Ct bis C8 Alkyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i- Butyl, Aryl, Aralkyl, CN , Halogen steht,where R is H, C t to C 8 alkyl, in particular methyl, ethyl, propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, aryl, aralkyl, CN, halogen,
R] und R2 gleich oder verschieden sein können und für H, CN, Halogen, Alkyl. Aryl oder Aralkyl oder Alkoxy stehen oder die Bedeutung von R hat, R3, R4, R5, R5, R7 und R8 gleich oder verschieden sein können und für H, CN, NO2, NH2, NR, -HSO3", COO", -OH (-O") -SO3 ", Alkyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl,Aralkyl, Halogen, insbesondere CI, Br oder Alkoxy stehen,R] and R 2 may be the same or different and are H, CN, halogen, alkyl. Aryl or aralkyl or alkoxy or has the meaning of R, R 3 , R 4 , R 5 , R 5 , R 7 and R 8 may be the same or different and for H, CN, NO 2 , NH 2 , NR, -HSO3 " , COO " , -OH (-O " ) -SO 3 " , alkyl, in particular methyl, ethyl, propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, aralkyl, halogen, in particular CI, Br or alkoxy,
R9 H, Halogen, SH, SR, OH, OR, Carbonsäure, Aminocarbonsäure, HSO3 ", COO", -OH (- O") -SO3 ", eine Azo- bzw. Diazogruppe, substituierter oder unsubstituierter Aromat wie Nitroaromaten, halogenierte Aromaten, Thiocyanat, substituiertes bzw. unsubstituiertes Phenol, bedeutet,R 9 H, halogen, SH, SR, OH, OR, carboxylic acid, aminocarboxylic acid, HSO 3 " , COO " , -OH (- O " ) -SO 3 " , an azo or diazo group, substituted or unsubstituted aromatic such as nitroaromatic , halogenated aromatics, thiocyanate, substituted or unsubstituted phenol,
und mit der Bedingung bei Verbindung (c), dass mindestens ein Rest aus R3 bis Rβ eine Aminogruppe ist, deren einer Stickstoffsubstituent mit dem Reste der Verbindung der allgemeinen Formel (I) verbunden ist.and with the condition for compound (c) that at least one radical from R 3 to Rβ is an amino group, one nitrogen substituent of which is linked to the radical of the compound of the general formula (I).
5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) umfassend die folgenden Schritte:5. A process for the preparation of a compound of general formula (I) comprising the following steps:
a) der Herstellung eines Oligopeptids X-A-B unter üblichen Bedingungena) the preparation of an oligopeptide X-A-B under usual conditions
wobei X für Wasserstoff oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für terminale Aminogruppen steht,where X is hydrogen or a protective group for terminal amino groups which is customary in peptide chemistry,
A und B für eine α-, ß-, oder γ-Aminosäure stehen, die 2 bis 15 C-Atome und bis zu 4 N-Atome, bis zu 2 S-Atome und bis zu 6 O-Atome umfassen und wobei A und B identisch oder verschieden sein können und B gegebenenfalls für einA and B represent an α-, β- or γ-amino acid which comprise 2 to 15 C atoms and up to 4 N atoms, up to 2 S atoms and up to 6 O atoms and where A and B may be identical or different and B may be for one
Dipeptid steht, das aus diesen Aminosäuren gebildet ist,Dipeptide, which is formed from these amino acids,
b) der Herstellung von CRS-L, wobei L für eine Linkerverbindung steht, der in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden und wobei die Linkerverbindung an ein N-Atom des Strukturelementes CRS gebunden wird und wobei CRS für ein konjugiertes Kohlenstoffringsystem steht, das ein Absorptionsmaximum bei einer höheren Wellenlänge aufweist als die Verbindung X-A-B-C-L-CRS (I), deren Absorptionsmaximum im Bereich von mehr als 550 nm liegt,b) the production of CRS-L, where L stands for a linker compound which is capable of forming a peptide bond with C and where the linker compound is bonded to an N atom of the structural element CRS and wherein CRS stands for a conjugated carbon ring system which has an absorption maximum at a higher wavelength than the compound XABCL-CRS (I), whose absorption maximum is in the range of more than 550 nm,
c) der Umsetzung von CRS-L mit C unter üblichen Bedingungen zu CRS-L-C, wobei C für Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan oder ihre jeweiligen Homologen stehtc) the reaction of CRS-L with C under customary conditions to CRS-L-C, where C is arginine, lysine, tyrosine, phenylalanine or tryptophan or their respective homologues
d) der Umsetzung von X-A-B und CRS-L-C zu X-A-B-C-L-CRSd) the conversion of X-A-B and CRS-L-C to X-A-B-C-L-CRS
6. Verfahren zum Nachweis von Zielsubstanzen umfassend folgende Schritte:6. A method for the detection of target substances comprising the following steps:
- des Bereitstellens von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4,the provision of connections according to one of claims 1 to 4,
- der gegebenenfalls Bestimmung der Wellenlänge, bei dem die Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 ihr Absorptionsmaximum aufweisen sofern die Wellenlänge nicht bekannt ist,optionally determining the wavelength at which the compounds according to one of claims 1 to 4 have their absorption maximum if the wavelength is not known,
- des in Kontakt bringens (und gegebenenfalls Einwirken lassens) der bereitgestellten Verbindungen mit der für den Nachweis vorgesehenen Lösung, Emulsion, Gas, Aerosol, Mischung oder Reinstoff,- bringing the provided compounds into contact (and if necessary allowing them to act) with the solution, emulsion, gas, aerosol, mixture or pure substance intended for the detection,
- ' der Bestimmung der Wellenlänge, bei dem die Verbindungen, die im ersten Schritt bereitgestelt wurden, nach dem in Kontakt bringen (und Einwirken lassen) der bereitgestellten Verbindungen mit der für den Nachweis vorgesehenen Lösung,- ' the determination of the wavelength at which the compounds which were provided in the first step, after contacting (and allowing to act) of the compounds provided with the solution provided for the detection,
Emulsion, Gas, Aerosol, Mischung oder Reinstoff ihr Absorptionsmaximum aufweisen.Emulsion, gas, aerosol, mixture or pure substance have their absorption maximum.
7. Verwendung von chemischen Verbindungen gemäß einem der Anspruch 1 bis 4 zum Nachweis von Zielsubstanzen.7. Use of chemical compounds according to one of claims 1 to 4 for the detection of target substances.
8. Verwendung nach Anspruch 7 zum Nachweis von Endotoxinen. 8. Use according to claim 7 for the detection of endotoxins.
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