WO2004033475A1

WO2004033475A1 - チロシナーゼ活性調整剤、その製法、及びそれを含有する外用剤

Info

Publication number: WO2004033475A1
Application number: PCT/JP2003/013018
Authority: WO
Inventors: Yutaka Tokiwa; Masaru Kitagawa; Kenji Yoshino; Shusaku Yanagidani; Takao Raku; Tetsuzo Totani; Hiromi Shimakawa
Original assignee: National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology; Toyo Boseki Kabushiki Kaisha; Konan Chemical Industry Co., Ltd.
Priority date: 2002-10-10
Filing date: 2003-10-10
Publication date: 2004-04-22
Also published as: EP1550667A4; JP2008200054A; JP4168170B2; JPWO2004033475A1; JP4803557B2; AU2003272968A1; JP4892660B2; US7754864B2; JP2008214361A; EP1550667A1; AU2003272968A8; US20060052318A1

Abstract

本発明は、チロシナーゼ阻害活性又は促進活性を有する化合物を有効成分とするチロシナーゼ活性調整剤及び該活性調整剤を含む外用剤、また該化合物の製造方法を開示するものである。

Description

明細書

チロシナ一ゼ活性 ¾、その去、及びそれを含；る外用剤技術分野

本発明は、チロシナ一ゼ阻害活性又はィ腿?舌性をる化合物を有効成分とするチ口シナ一ゼ活性雾膽汲ぴ該活性薩 IJを含む外用剤に関する。また、該化合物の纖方法に関する。

詳しくは、本発明は、チロシナーゼ阻害活性を；る新規アルブチンエステル化合物、該化合物を摘とするチロシナ一ゼ阻餘 IJ及び該阻豁 IJを含む外用剤に関する。また、本発明は、ゥンデシレン Xはその塩或いはそのエステル誘を^ ¾戯とするチロシナ一ゼ阻豁 ljおよぴ該阻 ^^を含む外用剤に関する。また、本発明は、ァスコルビンはその誘^を^ とするチロシナ一ゼ活性鍵びに該チロシナ一ゼ活附腿!!を含る外用剤に関する。また、本発明は、該チロシ:^ゼ阻豁仅はィ腿の^^となり得る化合物の織に適した酵素によるエステル化物の s ^法に関する。背景技術

チロシナーゼの阻害活性をる化合物として、アルブチンやコウジ酸などの天然物河匕 ¾などの分野において美白剤としてよく用いられている（例えば、 ^1¾、 112 (4) 、 pp. 276— 282、 1992、 ^m^, 115 (8) 、 pp. 6 26— 632、 1995、ノィォインダストリ一、 11 (4) 、 206、 1994、及び Biosci. Biotech. Biochem. , 61、 11、 pp. 1926— 1928、 1997参照）し力ながら、化 fe¾などの贿外用剤として用いる:^には、 Ι¾ 性カ槁ぐ

り、 ¾7j性を高めたアルブチン誘本や他の化合物の開発力望まれていた。アルブチン誘穎本としては、脱色剤としてアルプチンのフエノー盼をエステル化した化合物が知られている（特開平 11— 71225号公幸 g) 。また、脱色化粧料として、アルブチンの 6位をヒドロキシエステル化した化合物が知られている（特開平 5—19418 l )。さらに、リパーゼによるアルブチンとケィ皮酸ビエルのエステルによって、アルブチンの 6位力的にエステル化された化合物も幸浩されているひイィエンスバイオテクノロジーアンドバィォケミストリー (Bioscience Biotechnology and Biochemistry) 、 61、 11、 pp. 1926— 1928、 1997) 。し力、しなが、ら、ァ Jレブチン誘本のチロシナ —ゼ f乍用又はそれに起因する美白効果にっレては明確になっておらず、未だ満足のレべ誘 ^は得られていなかった。

ゥンデシレン酸は炭素数 11の不飽和脂肪酸であり、人の皮膚に含まれる成分であつて、越の清乍用の主役を努めている。ェ灘勺にはひまし油の■早で得られる。ゥンデシレン酸、その^ Xはその誘 »ί本は、 ¾¾¾作用が知られており、 ^Jt洗? として^し得ることが^^されている（特開 2002— 114669，g) 。また最近では、トレ八ロースエステル力匕口口素材として開発されている（特開 2001—2 78752 ^^幸 g¾ ^開平 5— 137994ΨΜ) 。しかしながら、クンデシレン酸またはその塩、或いはそのエステル誘のチロシナーゼ阻割乍用についてはこれまでにまったく知られていなかった。

一方、老化現象の一つである白髪の発生メカニズムについては、メラニン色素が角化^^にさくなることにより生じることが知られている。このため、白髪防止剤の開発を目的として、チロシゼの活性メラニン産生の^^ 主になされてきた。具には、天 »1等の抽出 »各種物質の白髪防止作用を^^することあるいは種々の化合物を; として用いることなどが試みられてきた。例えば、メラニン生成 ^ιとして、 0) -アルコキシカルボ二ルァルキルアンモニゥム及び Z又はその塩、 ω—アルコキシカルポニルアルキルトリアルキルアンモニゥム及び Ζ又はその塩カ輔であることが驗されている（特開平 7— 316048 幸。また、アデノシン誘^ (特開平 6— 30594 O ^)ゃジヒドロぺォ一リレ誘^: (特開 2002— 3381 が驗されている。しかしながら、これらの化^ l質は、 ¾生の点で不^^ある。また、ォゥレンのK又はエタノーリレ抽出物を^^とする白髪防 Ih^jが^されている（特開平 5— 78222 幸。また、コックル、ミドリガイ、カキ等の貝類のエッセンスからなるメラニン生成 {©^IJが ί驟されている（特開平 7— 285874 ¾) 。また、スギナ、スイカズラ、ヒキォコシ、ブドウ、へチマ、セィョゥニヮトコ、ブッチャーブ! /"ム及びタイソゥから選ばれる 1 しくは 2@¾上、又はその抽出物を有効とする白髪防 il^ijが提案されている（特開平 11 -12431

。また、シメ' 斗、ハリ夕サルノコシカケ科、カンゾゥタケ科、キコブタ^ κ ノポリリュウ科、モェギタケ科及び八ラタケ科からなる群より藤される担の培篛 Xは菌体の抽出液群のメラニン «ΤΉΚ^の 1 SXは 2種以上を配合した頭 »斗が^されている（特開平 7— 316026^幸 g) 。また、ピパーメチシクム及び/又出物がメラニン果を^ Tることが験されている（特開平 11-189541号公幸 g) 。更に、ゥブゲダサ属、アミジグら遨尺される 1鶴ま 2種以上の纏の抽出物（特開平 10-330218 g) 、ォタネニンジン、田七人参、タンジン、ユッカ、ビヮ、キンギン力、サから選ばれる 1種又は 2種以上の抽出物（特開 2001-288098号么、幸 g) 、イチジク若しくはクヮ又はそれらの抽 mt/ (特開 2002-47130号公幸 g)がメラニン果を有することカ聰忍されている。しかし、植物や動物)^の抽出物は、原料入手が困難であるため、その製造に制約があり、また原抖の含有量も一 ¾ なぐ性能も不安定であつた。そのため、十分なチロシナ一ゼ活性 ί© ΐ果ゃメラニン産生果を有する化合物の開発が望まれていた。

一方、上記に挙げられるようなエステル化合物のに删し得る酵素的エステル化は、原料が ¾性のアルコールと脂靈の齢には、食品: 1¾で既に麵化されている漏である（バイオインダストリ一、 19、 p. 62-71 (2002) ) 。しかし、性で、 ¾Κ性の^ W媒には溶けにくい化合物を原料に用いる驗、糧が低ぐ実際の $¾tには棚しにくい ^iS あった。例えば、有謹媒に対して可溶性の酵素を用いて、ォクタ ^へキサ^の有謹媒中で、ショ糖エステルを織する方法カ賠されている（特開平 8— 245680 ^^幸 β) 。しかし、それらの溶媒にはショ糖が溶けにくいため、収率は高くない。一方、やプリンヌクレオシドなどカ搞 (^溶解性を示す溶媒としては、 DMSOや DMFがある。例えばショ糖は、 DMSOに対しては約 40 %の 1¾で溶解する（アドバンスォブカーボハイドレートケミストリ一アンドバイオケミストリー、 27、 p. 85-125 (1972) ) 。また、プリンヌクレオシド、例えばグアノシンは、 DMSOを 50%以上含む DMF中で溶ける。しかし、 DMFや DMSOのような非プロトン 1生有靈媒を用いると、 "^的に力 Π 分は失活しゃすくなり、が困難になると考えられていた（特開平 9— 2713 87 ΜΈθΜΤ 8- 9987 MmM)。従って、性の化合物カ犒ぃ溶解性を^ Tる溶媒中でも高い活性を Tる酵素が求められていた。これまでに DMFなどの溶^活性を ¾ るものとして、バチルス属由来やストレプトマイセス属由来のプロテァ―ゼは見出されている (ジャーナルォブアメリカンケミカルソサイエティ、 110、 p. 584-589 (1988) ) 。し力し、糖類ゃヌクレオシドが溶な溶媒中で高い活性を ί辦する他の酵素は、これまでに知られていなかった。発明の開示

本発明は、チロシナ一ゼ阻害活' f Xはィ腿活性を ¾Τる化合物を械成分とするチ口シナ一ゼ活性醒吸ぴ該活性薩 Uを含む外用剤、並びに該化合物の sstに翻し得るエステル化物の^ 法に関する。

以下、本発明の内容について、詳細に説明する。

I. 本発明の第 1の好ましい難形態としては、チロシナーゼ阻害活性がアルプチンに比べて有意に高ぐかつ、越吸収性の向上したアルブチンエステル化合物及びその^ 法力職される。

本発明者らは、鋭意職を重ねた結果、アルブチンの 6位に ¾ΤΚ性置漏を導入することにより、阻害活性がアルブチンに比べて高まることを見出し、更に検討を重ねて本発明を開 ¾ "るに至った。

即ち、本発明には、以下のアルブチンエステル化合物、チロシナーゼ活性阻豁【外用剤及ぴプルブチンエステル化合物の法が含まれる。

1. (1) で表されるアルブチンエステル化合物。

(1)

[式中、 Ra i性基を示す。 ] 1— 2. (2) で表される 1—1に記載のアルブチンエステル化合物。

(2)

[式中、は単！^、アルキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

.一 3. ( 3) で表される 1—1に記載のアルブチンエステル化合物。

(3)

1 - 4. (4) で表される 1—1に記載のアルブチンエステル化合物。

(4)

CH20C0-R! -COOCH=CH₂

-OH

OH

[式中、は戦給、アルキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

1 - 5. (5) で表される 1—1に記載のアルプチンエステル化合物。

[式中、は単齢、アルキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

1-6. (6)で表される 1—1に記載のアルブチンエステル化合物。

(6)

中、 R,は単齢、アルキレン基、又はァリーレン基を示す。 R₂はアルキル基、又はァリール基を示す。 3 1-7. H« ( 7 ) で表される 1― 1に記載のアルブチンエステル化合物。

-« (7)

ぼ中、、、、 R₅はそれぞ結合、アルキレン基、又はァリーレン基を示す。 Xは 1〜6の繰り返し単位を示す。 ]

1-8. H¾ (8)で表される 1一 1に記載のアルブチンエステル化合物。

[式中、 R,は単!^、アルキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

1-9. (9)で表される 1—1に記載のアルブチンエステル化合物。

-« (9)

CHoOCO-R-!-CeHs

Ό、

OH 、0- Η

ΟΗ

OH

[式中、は単齢、アルキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

1-10. (10)で表される — 1に記載のアルブチンエステル化合物。

(10)

[式中、は単!^、アルキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

1-11. 1— 1〜； 1— 10のいずれかに記載のアルブチンエステル化合物の 1種又は 2種以上を有効成分とするチロシナーゼ阻豁 ϋ。

12. 1— 11に記載のチロシナーゼ阻割 IJを含^ る雌外用剤。 1 - 1 3. 下記 H¾式 ( 1 1)〜（1 9) のいずれかで表されるカルボン酸類と、アルブチンとを、エステルさせる工程を ¾ るアルプチンエステル化合物の難方法。好ましくは、下記一 « (1 1)〜（1 9) のいずれかで表されるカルボン酸類と、アルブチンとを、エステルイ rosさせる工程を； trる、 (1)〜（1 0) で表されるアルブチンエステル化合物の法。

-m, (1 1)

A-OCO-R CH=CH₂

中、 A mm, 置は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。 R,は単齢、ァリレキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

-m, (1 2)

A-OCO-R_rC(CH₃)=CH₂

[式中、 A «τΚ素、置默は非纖のアルキル基又はビニル基を示す。 R_Tは単!^、ァレキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

Hl¾ ( 1 3)

A-OCO-R_rCOOCH=CH₂

[式中、 A お嬉、置默は非置換アルキル基又はビニ I ^を示す。は単齢、アルキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

H¾ ( 1 4)

A-OCO-RrCOOH

[式中、 A〖お素、置は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。 R_Tは、単!^、ァレキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

H« ( 1 5)

A-OCO-R COO-R₂

中、 A〖¾K素、置は非藤のアルキル基又はビニル基を示す。 ¾は単!^、ァルキレン基、又はァリーレン基を示す。 R₂はァルキル基、又はァリール基を示す。 ] (16)

A-OCO-Rr [- R₃-CH=CH-R₄-]_X-R₅-CH₃

中、 A «7j素、置默は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。 ¾、 R₃、 R₄ 、 R ₅はそれぞ博、アルキレン基又はァリーレン基を示す。 Xは;!〜 6の繰り返し単位を示す。 ]

(17)

[式中、 A « 素、置^ Xは非置換のアルキル基又はビニル基を示す。は単糸給、ァルキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

(18)

A-OCO-R C₆H₅

中、 A wm,置は非置換のアルキル基又はビエル基を示す。 R_tは単！^、ァルキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

-«； (19)

A-OCO-R_rCH₃

[式中、 A〖お K素、置默は非置換のアルキル基又はビエル基を示す。 ¾は職給、ァレキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

1-14. 酵素下でエステル化反応させる 1— 13に記載のアルプチンェステル化合物の S¾i^法。

1-15. 化 ¾¾¾下でエステル化反応させる 1-13に記載のアルブチンェステル化合物の ^^法。 1 - 1 6. エステルイさせる工程が、 S½ 纏を行いながらエステ MbKSさせる工程である 1— 1 3〜： 1— 1 5のいずれかに記載のアルブチンエステル化合物の纖方法。 1 - 1 7. エステ Mraso:程後、エステルイ版厳中の未カルボン騰を、 s性有漏媒を用いて抽出して分 it る工程、次レ？、画の水を加えて未アルブチンを抽出して分离るともにアルブチンエステル化合物を灘させる工程をる

1— 1 3〜 1— 1 6のい f lかに記載のアルブチンエステル化合物の法。以下、本発明の第 1の難形態について更に詳しく説明する。

本発明におけるアルブチンエステル化合物は、アルブチンの 6位に棘性基を導入した化合物である。具体的には、 (1) 〜（1 0) で表される化合物である。本発明のアルブチンエステル化合物は、アルブチンとカルボン酸類をエステル化反応させることによって^ iすることがきる。ここでカルボン酸類とは、カルボン酸、ジカルボン MXはそれらの誘本をいう。

以下、アルブチンヱステル化合物の織について具体的に示す。

H¾ (2) の化合物

(2) の化合物は、アルブチンに、下記 ¾ (1 1) のカルボンはその誘

^本をさせることによって合すること力きる。

-«： (1 1)

A-OCO-R_rCH=CH₂

中、 A ¾zK素、置叙は非醒のアルキル基又はビニル基を示す。 ¾は単!^、ァルキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

アルキレン基の炭素数は 1〜1 6、好ましくは 2〜8であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特にされない。具 # ^には、メチレン、エチレ^ののァリレキレン基、ェチルエチレン、イソプロピレ ^の分險資を；るアルキレンを挙げることが、できる。ァリ一レン基としてはフエ二レンを挙げること力きる。

- ^ ( 1 1) で表されるカルボン酸誘 ¾ί本としては、例えば、アクリル酸誘灘、

1 0—ゥンデシレン酸誘^:を挙げること力きる。 H¾ (3) の化合物

式 o) の化合物は、アルブチンに下記^^式（1 2) のカルボン m はその誘 #ί本を芯させることによって合成することが、できる。

(1 2)

A-OCO-R C(CH₃)=CH₂

ぼ中、 A « _Κ素、置は非鍵のアルキル基又はビニル基を示す。 R,は単!^、ァルキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

アルキレン基の炭素数は 1〜1 6、好ましくは 2〜8であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に跪さい。具働には、メチレン、エチレ^の翻のアルキレン基、ェチルエチレン、イソプロピレ^の分瞧を^ "るアルキレン藤を挙げることが、できる。ァリーレン基としてはフエ二レン基等を挙げること力 ?きる。

"^式（1 2) で表されるカルボン酸誘としては、例えば、メタアクリル酸誘 ^本を挙げることがきる。

-m, (4) の化合物

~«式（4) の化合物は、アルブチンに下記一般式（1 3) のカルボン酸又はジカルボン酸誘導体をさせることによって合^ "Tること力 ?きる。

-m ( 1 3)

A-OCO-R_rCOOCH=CH₂

中、 A mm, 置は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。 R,は単!^、ァルキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

アルキレン基の炭素数は 1〜1 6、好ましくは 2〜8であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に P跪さ池い。具欄には、メチレン、エチレ^の纖のアルキレン基、ェチルエチレン、イソプロピレ^の分帳 Iをるアルキレン藤を挙げること力 ?きる。ァリ一レン基としてはフエ二レンを挙げること力きる。

~«式（1 3) で表されるジカルボン酸誘 i本としては、例えば、シユウ酸、マロン酸、コハク酸、ダルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スペリン酸、ァゼライン酸、セバシン酸、ノナンジカルボン酸、ドデカンジカルボン酸等の脂肪族ジカルボン酸、又は（オルト、メタ、パラ）フタ等のジカルボン勸ゝら誘導される化合物、例えばプジピン酸ジビエルを挙げることがきる。

H¾ (5) の化合物

H¾式 (5) の化合物は、アルブチンに下記 ~«式 ( 1 4) のジカルボン酸又はその誘本をさせることによって合^ Tることがきる。

( 1 4)

A-OCO-RrCOOH

[式中、 A〖お素、は非藤のアルキル基又はビニル基を示す。 ¾は聯給、ァルキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

アルキレン基の炭素数は 6〜2 1、好ましくは 8〜1 2であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特にされない。具働には、メチレン、エチレ^の翻のアルキレン基、ェチルエチレン、イソプロピレの分纖を; るアルキレン纏を挙げること力きる。ァリーレン基としてはフエ二レンを挙げること力きる。

"^式（1 4) で表されるジカルボン酸誘^:としては、具体的には、スペリン酸、ァゼライン酸、セバシン酸、ノナンジカルボン酸、ドデカンジ力ルポン酵の脂膽ジカルボン酸、又は（オルト、メタ、パラ）フタリ離等のジカルボン MXはそれらジカルポン^ 0ゝら誘導される化合物を挙げること力きる。 H¾ (6) の化合物

~¾式 (6) の化合物は、アルブチンに、下記 ~¾式（1 5) のカルボン酸又はジカルボン酸誘離をさせることによって合^ "Tること力きる。

Η¾ ( 1 5)

A-OCO-RrCOO-R₂

[式中、 A « j<素、置は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。 R,は単拾、ァルキレン基、又はァリーレン基を示す。 R₂はアルキル基、又はァリール基を示す。 ] アルキレン基の炭素数は 1〜1 6、好ましくは 2〜8であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に跪されない。具働には、メチレン、ェチレの纖のアルキレン基、ェチルエチレン、イソプロピレン等の分纖をるアルキレン纏を挙げることが、できる。ァリ一レン基としてはフエ二レンを挙げることがきる。

R₂はァルキル基、ァリ一ル基を示す。アルキル基の難数は 1〜： L 6、好ましくは 2 〜8である。具側には、メチル、ェチリの麵のアルキル基、イソプロピル藤の分謹をるアルキル基カ举げられる。ァリール基としては、フエ二ル藤を挙げることがきる。

~«式（1 5) で表されるジカルボン酸誘としては、具体的には、シユウ酸、マロン酸、コハク酸、ダルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スペリン酸、ァゼライン酸、セバシン酸、ノナンジカルボン酸、ドデカンジカルポン麟の脂膽ジカルボン酸、又は（オルト、メタ、パラ）フ夕ルのジカルボン、ら誘導される化合物を挙げることがきる。

- ^ (7) の化合物

¾式 ( 7 ) の化合物は、アルブチンに下記^ K ( 1 6 ) のカルボン MXはその誘 f本を Hj させることによって合^ること力きる。

-« ( 1 6)

A-OCO-Rr [- R₃-CH=CH-R₄-]x -R₅-CH₃

[式中、 A « j素、置叙は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。 R〖、 R₃、 R₄ 、 R₅はそれぞ; Wl^r、アルキレン基又はァリ一レン基を示す。 Xは：!〜 6の繰り返し単位を示す。 ]

アルキレン基の炭素数は 1〜2 1、好ましくは 2〜8であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に P跪されない。具御勺には、メチレン、ェチレの麵のアルキレン基、ェチルエチレン、イソプロピレ^の分醒を^ るアルキレン藤を挙げることが、できる。ァリーレン基としてはフエ二レン基等を挙げることがきる。

~«式（1 6 ) で表されるカルボン酸又はその誘としては、具体的には、デセン酸、ミリストレイン酸、ペン夕デ、セン酸、パルミトレイン酸、へキ、力トリェン酸、ヘプタデセン酸、ヘプタデ'カジエン酸、ォレイン酸、リノー、リノレン酸、ァ？リノレン酸、ォクタデカテトラェン酸、ィコセン酸、ィコサジェン酸、ィコサトリェン酸、ィコサテトラェン酸、ァラキドン酸、ィコサペンタエン酸、ドコセン酸、ドコサジェン酸、ドコサテトラェン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサへキサェン酸、テトラコセン酸又は該カルボン勸ゝら誘導されるィ匕合物を挙げること力きる。

(8) の化合物

HIS式 (8) の化合物は、アルブチンに下記 H¾式（1 7) のカルボンはその誘難を ^させることによって合 ί¾Τることがきる。

( 1 7)

中、 k m, 置は非藤のアルキル基又はビニル基、 R,は単、アルキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

アルキレン基の炭素数は 1〜1 6、好ましくは 2〜 8であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に P跪されない。具働には、メチレン、ェチレの謹のアルキレン基、ェチルエチレン、イソプロピレ ^の分謹を^ るアルキレン藤を挙げることがきる。ァリ一レン基としてはフエ二レンを挙げること力 ?きる。

H¾式（1 7) で表されるカルボン酸誘 ί本としては、具体的には、ピパリン酸から誘導される化合物等を挙げることが、できる。

-m, (9) の化合物

"^式 (9) の化合物は、アルブチンに下記 H¾ ( 1 8) のカルボン Xはその誘 ί本を芯させることによって合^ることがきる。

-« ( 1 8)

A-OCO-R_rC₆H₅

中、 A m, 置叙は非纖のアルキル基又はビニル基を示す。 R,は単！^、ァルキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

アルキレン基の炭素数は 1〜1 6、好ましくは 2〜8であって、その形状は直鎖状、分! ^状、環状など特にされない。具勺には、メチレン、エチレ^ののァリレキレン基、ェチルエチレン、イソプロピレの分醒を; fTるアルキレン藤を挙げることができる。ァリーレン基としてはフエ二レンを挙げることができる。

式（1 8) で表されるカルボン酸誘本としては、具体的には、ベンゾィル酸から誘導される化合物を挙げること力 τ'きる。 ( 1 0) の化合物

-« ( 1 0 ) の化合物は、アルブチンに下記 ~«式（1 9 ) のカルボンはその誘をさせることによって合^ること力きる。

( 1 9)

A-OCO-R_rCH₃

[式中、 A〖お素、置は非藤のアルキル基又はビニル基を示す。 R,は単給、ァルキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

アルキレン基の炭素数は 1〜1 6、好ましくは 2〜8であって、その形状は直鎖状、分岐状、環状など特に P跪さょい。具 #¾勺には、メチレン、エチレ^の謹のアルキレン基、ェチルエチレン、イソプロピレ ^の分麵を^ Tるアルキレン藤を挙げることがきる。ァリ一レン基としてはフエ二レンを挙げることがきる。

式（1 9) で表されるカルボン酸としては、具体的には、酪酸、へキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデ、カン酸、八リレミチン酸、ヘプ夕デカン酸、ステアリン酸、ァラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン齢ゝら誘導される化合物を挙げることがきる。上記の方法において、アルブチンと、式 ( 1 1 ) 〜（1 9 ) で表される化合物とのエステリレイ匕は、酵¾»^¾下又は化^ 下で行うことが好ましい。酵素触媒としては、例えば、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ等、 «έ¾^Π のものを使用することができる。より具体的には、シユードモナスセパシァ {Pseudomonas cepacia) 由来のリハーセ、カンンタアンタクティカ、 Candida anterctica) 由来のリパーゼ、バチルスサブチリス Bacillus subtil is) 由来のプロテアーゼゃストレプトマイセスエスピー frep(oinyces sp. 由来のプロテア一ゼ等を挙げることができる。このうち特にカンジダアンタクティカ（Candida anterct ica) 由来のリパ一ゼ、バチルスサブチリス（baci l lus subt i l is) 由来のプロテアーゼを用いることが好ましい。

化^！某としては、例えば、酸、アルカリ、ピリジン誘導体等の ¾έ¾^Πのものを棚すること力きる。より具備勺には、 P-トルエンスルホン酸、ナトリウムアルコキシド、チタニウムアルコキシド、ジメチルァミノピリジン、體、碰、酉 «、ピリジン、 4 -ピロリジノピリジン、ジシクロへキシルカルバミを挙げることがきる。上記の方法においては、酵素触媒存在下にエステル化反応させる方法が、アルブチンの 6位に対する選択性に優れる点から、好適である。特にカンジダアン夕クテイカ（Candida anterct ica) 由来のリパーゼゃバチルスサブチリス（baci l lus suM i l is) 由来のプロテア一ゼを用いる反応が好ましい。

嫌 3のような酵 ¾ ¾を用レ rアルプチンエステルを織する：^、 J¾謎は 0〜 100°C、好ましくは 30〜50°Cである。 SJ¾S#間は、 1〜340時間、好ましくは 24〜170時間である。溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、アセトン、ジォキサ^を職または 2觀以且み合わせて用いることがきる。また、原料となるカルボン酸、ジカルボン Xはそれらの誘 #ί本自体を溶媒として麵することも可能である。 ίΤ«中のアルブチンのは 1〜40 Μ*%、好ましくは 1〜 10 %である。また、酵素の翻害恰は、 ΚίΓ疆に対して、 0. 1〜20 %、好ましくは 0. 1〜1 H*%である。また、アルブチン 1モルに対して、カルボン酸、ジカルボンはそれらの誘 ^を 0.5〜10モル、好ましくは、 1〜5モル禾號翻するのが好ましい。

一方、化^ Mを用いてアルプチンェステルを sstする齢、 m^ >m 0〜100°C、好ましくは 40〜50 である。間は、 1〜48時間、好ましくは 1〜24時間である。溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、アセトン、ジォキサンを職または 2 上袓み合わせて用いること力きる。 it機中のァルブチンの濃度は 1〜40重量％、好ましくは 1〜10重量％である。また、化学匪の使用害恰は、媒に対して、 0. 1〜5≤*%、好ましくは 0. 1〜1 %である。また、アルブチン 1モルに対して、カルボン酸、ジカルボンはそれらの誘を 0.5〜10. モル、特に、 1〜5モル禾艘删するのが好ましい。

本発明においては、原料に用いるカルボン酸類として、末端に遊離のカルポキシル基を有する化合物を用いることが好ましい。末端に遊離のカルボキシル基を有する化合物は安価であり、また、エステル化反応において、副生してくる物質が水である、という利点がある。原料にエステル化合物等を用いる場合には、反応中に着色物質が生成しやすく、カラム処理などの精製処理が必要であるが、原料として末端に遊離の力ルポキシル基を有する化合物を用いる場合には、このような問題がない。

原料として末端に遊離の力ルポキシル基を有する化合物を用いて、アルブチンとエステル化反応させると、水が副生してくるが、エステル化反応は可逆的な反応であるので、効率的にエステル化反応を行うために、脱水処理を行いながら反応を行うことが、好ましい。脱水処理の方法は特に限定されず、 «公知の方法等を用いることができる。例えば、減圧により脱水処理を行う方法、乾燥した不活性ガスを通気させて脱水処理を行う方法、モレキュラーシーブスなどの無機化合物に水を選択的に吸着させて脱水処理を行う方法などを例示するこができる。反応スケールが小さい場合にはモレキュラーシーブスを用いて脱水処理を行う方法が簡単であり、好ましい。モレキユラ一シーブスの形状は特に限定されるものではなぐ例えば粉末、ペレット状のものなどを用いることができる。モレキユラ一シーブスの使用量は反応液に対して 0 . 1〜5 0重量％、好ましくは 1〜2 0重量％である。

これらの反応後、 «公知の適当な分離精製処理を施して、反応生成物から、ァルブチンの 6位に疎水性基が導入された化合物を分離することによって、本発明のアルブチンエステル化合物を取得することができる

分離精製手段としては、例えば、高速液体クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィ一のような公知のクロマトグラフィー手段を用いることができる。カラムの種類や移動相溶媒等の条件は ¾M択することができる。

また、溶勵出ゃ溶解性に基づく分別沈殿などの分離手段も用いることができる。例えば、非極性有機溶媒を用いてエステル化反応液中の未反応カルボン酸誘導体を抽出、分離した後、過剰の水を加えて未反応アルブチンを抽出、分離するともにァルブチンエステル化合物を沈殿させ、必要に応じ、これらの抽出、分離及び沈殿を行う工程を繰り返した後、沈殿したアルブチンエステル化合物を回収することによつて本発明のアルブチンエステル化合物を取得することができる。

非極性溶媒としては、例えば、シクロへキサン、ェチルエーテル、石油エーテル等が挙げられる。中でも、シクロへキサンが好ましい。

翻の水とは、原料のアルブチン化合物に対して重量で 2 0倍程度である。上記のようにして得られる "^式 (1) 〜（1 0) で表されるアルブチンエステルィ匕合物を^^^として用いることによりチロシナ一ゼ阻^ ijを得ること力きる。該チロシナ一ゼ阻害剤において、上記式 ( 1) 〜（1 0) で表されるアルプチンエステル化合物は、 1画虫で用レてもよぐまた 2觀上の混合物として用レてもよい。

チロシナーゼ阻害剤は、該_ ^式 (1) 〜 0) で表されるアルブチンエステルィ匕合物をそのまま用いて又〖纖当な担体と混合して、の方法に従って纖 ijf匕することにより得ることが、できる。

本発明のチロシナ一ゼ阻害剤は、化粧料、皮膚外用剤、医薬、食品、魚介類 ¾¾¾ 飼に配合したり、食品の麵に棚したりすることがきる。例えば、ィ匕被料に配合して美白作用を^ る化 fc¾とすることがきる。また、メラニンの «による変色を起こしやすい食品の麵防止等のため、その食品に添加したり、表面麵に棚したりすること力きる。また、該チロシナーゼ阻^！を含有させて外用剤とすることもできる。特に、外用剤、好ましくは美白用の皮膚外用剤として、鍾に用いることがきる。

本発明の皮膚外用剤においては、上述の H¾式 (1) 〜（1 0) で表されるアルブチンエステル化合物を 1種職で又は 2種以上混合して配合すること力きる。

外用剤は、上記チロシナ一ゼ阻害剤を適当な担体と混合し、の方法に従って製造することにより得ること力きる。

外用剤には、他に ~«に用いられる各難分、例えば、水性成分、粉末^ 保湿剤、界面活 f擁、防藤 IJ、増粘剤、紫外線吸及を配合することがきる。外用剤の剤型としては、例えば、軟膏剤、クリーム、乳液、リニメント剤及び口一ション剤等を挙げることがきる。

上言用剤において、アルブチンエステル化合物 (^槠恰は、チロシナーゼ阻截果を奏する有効量程度である。その含有割合は、外用剤全体に対し、 0.001〜10%重量％程度、好ましくは、 0.005〜5重量％程度である。

外用剤の適用方法は、例えば、顔、首、腕及び手等のシミ、ソバカス等のでき易い咅啦もしくは患部、日焼けし易レ^ ί立もしくは日焼けした音啦等に、 1日 1回〜数回、適当 ^flr れば良い。

本発明に係るアルブチンエステル化合物は、棘性基を導入することで皮膚吸収性が向上しており、アルブチンと j:酸してチロシ^ゼ is害活性が显藤に高められている。更に、本発明に係るアルブチンエステル化合物は、糖エステル構造に基づくと考えられるぃ擴作用、フエノール ffe酸基 ^¾づくと考えられるラジカル消去能、並びにエステ！^の ¾ ]<性とアルブチン部の HzKffi づくと考えられる界面活性作用もる。

これらの' I'頓により、本発明のアルブチンエステル化合物は、チロシナーゼ阻豁 ϋ、又は趙外用剤などの棚敝として、 i is品ゃ医毅野におい T¾¾に利用することがさる。

I I . 本発明の第 2の好ましい実施形態としては、ゥンデシレン酸またはその塩、或いはその誘を棚^^とするチロシナーゼ la 又該チロシ^ "ゼ阻舗を含 ¾τる外用剤、特に、チロシナ一ゼ阻割を含^ る美白化料が撒共される。

本発明者らは、鋭意 w ^を重ねた結果、ゥンデシレン酸またはその塩、あるいはゥンデシレン酸の糖エステルがチロシナ一ゼ is害活性を; ることを見出し、更に検討を重ねた。

本発明には、以下のチロシナーゼ阻^ U及び外用剤が含まれる。

2- 1. 下記" «¾ (20)

-«； (20)

[式中、 Rb〖¾K素または Η@の 7爐基を除いた轍錢を示す。 ]

で表されるゥンデシレン酸またはその塩あるいはそのエステル誘^/ゝらなるチロシナ —ゼ阻観 2—2. Rb力 Sの趙基を除いた膨鍾である 2— 1に記載のチロシナーゼ且

2 - 3. Rbが水素であるゥンデシレン酸またはその:！^らなる 2― 1に言 3載のチ

CIシ^ "ゼ阻

2 - 4. 2 - 1 - 2 - 3のレ f lかに記載のチロシナーゼ阻截！！を含む外用剤。

2 - 5. 外用剤が美白化料である 2— 4に記載の外用剤。以下、本発明の第 2の^形態について更に詳しく説明する。

酸またはその塩、あるいはその誘^

z酸またはその塩は^！物質である。

ゥンデシレン酸の塩としては、ゥンデシレン酸のナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ鍋塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ d I鍋塩、銅、ジェタノ一レアミン、アンモニゥム、ジメチレァミン、トリメチレアミン、 2 -ァミノ- 2-メチ J 1, 3-プロパンジオール、 2 -ァミノ- 2-メチ卜 1-プロパノール、ステアリルジメチルアミンなどの塩カ举げられる。

これらの塩は、ゥンデシレン酸とアルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、その他の鍋フ嫩化物ないし各種アミンを、水、アルコール（メタノール、ェ夕ノ —ル、イソプロパノール、ブ夕ノールなど）、 THF、エーテル、ァセトニトリルなどから選ばれる 1種以上の溶媒中で混合することにより調製することがきる。

Rbは、水素、又《H@の水酸基を除いた膨鐘を示す。 R が撅鐘である:^、

Rb_〇Hは、職、 ns、 atまたアルコールなどの糖化合物を示す。

Rb— OHで表される糖としては、グルコース、ガラク 1 ^一ス、マンノース、フルク 1 ^一ス、 N—ァセチルダルコサミン、 N—ァセチルガラクトサミン、リポース、ァラビノース、キシロース、ラムノース等の · Μ、マレ卜ース、ラクトース、イソマルト一ス、セルビオ一ス、ゲンチオビォソース、スクロース、トレハロース、イソコージピオース、ラミナリビオース、ニゲロース、サンブビオース、ネオヘスペリドース等の二糖類、マルトトリオ一ス、イソマリレトトリ才一ス、セロトリオ一ス、ラフイノース及びゲンチォトリオース等の類、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトールおよびィノシトールなどの糖アルコールカ攀げられる。好ましい糖としては、スクロース、トレノ、ロースカ举げられる。

本発明のゥンデシレン酸エステルは、特開 2 0 0 0— 6 5 2 9 0号公報に記載の方法に従い、酵^ Sの被下、ゥンデシレン酸メチルエステル、ゥンデシレン酸ェチルェステルなどのエステルを糖藤とさせて、エステルすることにより、得ることがきる。

«として用いられる酵素としては、ノチルス属由来のアル力リ性プロテアーゼ、カンジダアンタクティカ（Candida anterct ica) 由来のリパーゼなどカ举げられる。

のゥンデシレン酸またはその塩、或はそのエステル誘導体からなる群から選ばれるレずれかの化勿、またはそれらの 2觀上の混合物を機敝として用いることにより、チロシナーゼ阻豁！ Iを得ることができる。

チロシナーゼ阻害剤は、ゥンデシレン mxはその塩あるいはそのエステル誘導体の 1種または 2種を、そのまま用いて又当な担体と混合して、の細こ従つて »匕することにより得ること力きる。

また、チロシナーゼ阻害剤は、美白化粧料、医薬、食品、魚介類^ gffl飼に配合したり、食品の処理に翻したりすること力 ?きる。よわち、チロシナ一ゼ阻害によってメラニンの «を抑制することから、化觀に配合して美白作用を^ τる化などにすることがきる。また、メラニンの生成による変を起こしやすい食品の^ 防止等のため、その食品に勵口したり表面麵に麵したりすることがきる。ゥンデシレン酸は皮膚に本来含まれる^であり、その安全 I生は確立されており、ゥンデシレン酸またはその塩をる食品を嫩することにより、安心して^ Jtの美白効果を期待すること力きる。上述の一般式（2 0) で表されるゥンデシレン酸またはその塩あるいはゥンデシレン赚エステル誘ゝらなる群から選ばれる 1 @Xは 2種以上を铺とするチロシナ一ゼ阻 »Jを含有させて外用剤とすることもできる。

外用剤は、皮膚外用剤、特に美白化粧料として ¾1に用いることができる。外用剤は、の纖 11謹を用いて織することがきる。

また、外用剤には、他に"^に用いられる各 @¾、例えば、水性成分、粉末、 m , mi 増占剤、紫外線吸 TO及 ^を配合すること力きる。

外用剤に配合されるゥンデシレン酸またはその塩あるいはゥンデシレン酸糖エステル (^福恰は、チロシナ一ゼ阻截カ果を奏するである。そ福恰は、外用剤全体に対し、通常 0.001〜10 S*%、好ましくは 0.005〜5 %、より好ましくは 0.01〜 3重量％、特に好ましくは 0.1〜 1 %離である。

外用剤の形態は特に腕されず、例えば、軟膏、クリーム、乳液、リニメント剤及び口一ション剤等の形態に調製され得る。

本発明の外用剤の画方法は、し得るが、例えば、顔、首、のシミ、ソバカス等のでき易い音啦もしくは部、日焼けのし易い音敝もしくは日焼けした離に、 1日 1回〜数回、適当髓^ れば良い。

本発明は、ゥンデシレン酸と^ »のエステル体が、チロシナーゼ阻害活性をアルブチンと異なる作用で显藤に高めることを見出し、該作用によるチロシ:^ゼ阻豁 !1を提供するものである。 ¾わち、本発明において、チロシ^ "ゼ作用は、モノフエノールの 1， 2-ジフエノ一ル（カテコール）への水酸化作用とカテコールの 0-キノンへの酸化を賺しているが、アルブチンは前者のモノフエノールの水酸化を効率的に阻害し、ゥンデシレン麵ェステル〖お緒の力テコ一の謝 rosを阻射ることにより、アルブチンとは異なるメカニズムでチロシ^ "ゼを阻害していることが見出された。具働には、図 6に示されるようにアルブチンはフエノール基質の方をよく阻害しているのに対し、図 5に示されるようにゥンデシレン ¾|エステルはカテコール基質、フエノール基質を共に阻害している。これらのメカニズムを図示すると図 9のようになる。このような ί乍用により、本発明におけるゥンデシレン MXはその塩あるいはエステル誘割本を棚とするチロシナーゼ阻豁 IJは、外用剤、特に雌外用剤や美白化粧料として、化 ¾¾ゃ隨分野において織に禾拥すること力きる。 I I I . 本発明の第 3の好ましい実施形態としては、ァスコルビン mxはその誘導体を^ ¾ とするチロシ^ "ゼ活 fffi^!i、及び該チロシナ一ゼ活性ィを含る外用剤、特に白髪改善及び白髪防止に藤な効果をる外用剤が樹共される。本発明者らは、ァスコルビン酸及びァスコルビン酸誘本が、低渡において、優れたチ口シナ一ゼ活性 ί® ι果を離することを見いだし、更に鋭髓討を重ねた。本発明には、以下のチロシナーゼ活性促進剤及び該チロシナ一ゼ活性促を含有する外用剤が含まれる。

3 - 1. ァスコルビン酸及び/又はァスコルビン酸誘本を ¾成分とするチロシナ一ゼ活谢翻 _)。

3 - 2. ァスコルビン酸誘導体が、ァスコルビン翻旨肪酸エステル、ァスコルビン酸リン酸エステル又はその脂鍾エステル又はそれらの塩、ァスコルビン酸ダルコシド又はその脂脈エステル、及びプスコルピン酸碰エステル又はその脂鍾エステル又はそれらの励ゝらなる翻ゝら選ばれる少なくとも 1種である 3— 1に記載のチロシナ一ゼ活性 ί腿 IJ。

3—3. 3— 1又は 3— 2に記載のチロシナ一ゼ活性 ί腿 IJを含衬る外用剤。

3— 4. 3— 1又は 3— 2に記載のチロシナ一ゼ活性 «剤を含る外用剤。好ましくは、白髪防 ihXは白髪改善のための I ^外用剤。

3— 5. 3— 1又【ま 3— 2に記載のチロシナーゼ活性 iSl剤を含有する皮膚用外用剤。好ましくは、麟黒ィは雄の抗白斑治療のための雄用外用剤。

3 - 6. ァスコルビン酸及び/又はァスコルピン酸誘導体の含有量が外用剤全体の 0. 0 0 0 0 1〜 1 0 %である 3— 3〜 3 _ 5のいずれかに記載の外用剤。

3 - 7. チロシナーゼ活性促進剤がァスコルビン酸を有効成分とするチロシナーゼ舌性 iS^ijであって、ァスコルビン酸の含有量が外用剤全体の 0. 0 0 0 1〜1 % である 3— 3〜 3— 5のいずれかに記載の外用剤。 3 - 8. チロシナ一ゼ活性促進剤がァスコルビン酸リン酸エステル及びァスコルビン酸ダルコシドからなる群から選ばれる少なくとも 1種の化合物を裕力敝とするチロシナ一ゼ活性 iSi剤であって、該化合物の含有量が外用剤全体の 0. ο ο ι〜ι ο重量％である 3— 3〜 3— 5のいずれかに記載の外用剤。

3 - 9. チロシナ一ゼ活性鍵剤がァスコルビン酸の脂膽エステル、ァスコルビン酸リン酸エステルの脂 JI纖エステル及ぴスコルビン酸ダルコシドの脂 JI雄エステルからなる群から選ばれる少なくとも 1種の化合物を^^とするチロシナ一ゼ活性促翻』であって、該化合物の含有量が外用剤全体の 0. 0 0 0 0 1〜0. 1S*%である 3—3〜 3— 5のレれかに記載の外用剤。以下、本発明の第 3の形態について更に詳しく説明する。

本発明のチロシナ一ゼ活性は、ァスコルビン酸及び Z又はァスコルビン酸誘を機とする。該チロシナ一ゼ活性 {©^Jにおいて、ァスコルピン離び/又はァスコルビン本は、 1謹虫で用いてもよく、また 2種肚を混合して用レ r もよい。

ァスコルビン酸は、水溶性の生体内抗酸化物質であり、ビタミン Cとも呼ばれ、生体内あるいは細胞内の様々な場所で様々な標的^に対してその漏を華している。ァスコルビン酸には、 L— # D— あるが、本発明のァスコルビン酸としては、 L 用いられる。

また、ァスコルビン酸誘難としては、ァスコルビン酸の 2、 3、 5及び 6位の少なくとも 1つのフ爐基に置謹をるものであって、チロシナ一ゼ活性 l果を有するものが用いられる。

具体的に、ァスコルビン酸誘導体としては、ァスコルビン翻旨肪酸エステル、ァスコルビン酸リン酸エステル又はその脂藤エステル又はそれらの塩、ァスコルビン酸グルコシド又はその脂 J!簾エステル、及びブスコルビン酸鍾エステル又はその脂垂ェステル又はそれらの塩等力寧げられる。特に生体内に吸収された後、ァスコルビン酸を « "るもの力子ましい。ァスコルビン酸誘本における脂賺、具体的にはァスコルビン酸脂賺エステル、ァスコルビン酸リン酸エステルの脂壓エステル、ァスコルビン酸グルコシドの脂膽エステル、及ぴスコルビン酸 βエステルの脂雄エステルにおいて用いられる脂肪酸には、飽和又は不辦口の脂 Ji簾、また、麵は分樹犬の脂薩が包含されその麵は特にされない。脂腿の歸数も特に P胺さ池いが、通常歸数 1〜2 4、好ましくは 8〜2 0、より好ましくは 1 0〜1 8のものが用いられる。

ァスコルビン翻旨薩エステルとしては、ァスコルビン酸の 2、 3、 5及び 6位の少なくとも 1つの水酸基と臟纖をさせてエステル化した化合物カ犖げられる。例えば、ァスコルビン酸一 6—ノレミ 5^:· "ト、ァスコルビン酸一 2， 6—ノ\°ルミテート、ァスコルビン酸一 6—ステアレートなどカ举げられる。

ァスコルビン酸リン酸エステルとしては、例えば、ァスコルビン酸の 2位のフ嫩基にリン酸がエステル化したァスコルビン酸一 2—リン酸エステルなどカ攀げられる。

ァスコルビン酸リン酸エステルの塩としては、ァスコルビン酸リン酸エステルの塩、具働には、アルカリ鍋塩、アルカリ土類鍋塩などカ攀げられる。より具体的には、ァスコルビン酸— 2—リン酸ナトリゥム塩、ァスコルビン酸一 2 -リン酸マグネシウム塩などカ攀げられる。

ァスコルビン酸リン酸エステルの脂脈エステルとしては、ァスコルビン酸リン酸ェステルの水酸基に脂膽カ梗にエステル化した化合物、例えばスコルピン酸— 2—リン酸一 6ーノリレミテ一ト、ァスコルビン酸一 2—リン酸一 6—ラウレ一ト、ァスコルビン酸一 2—リン酸ー 6—ステアレー卜など力寧げられる。

また、ァスコルビン酸リン酸エステルの脂 J3雄エステルの塩としては、例えば、ァスコレビン酸一 2—リン酸一 6一パルミテ一トナトリゥム塩、アスコリレビン酸一 2—リン酸一 6—ラウレ一トマグネシウム塩などカ举げられる。

ァスコルビン酸ダルコシドとしては、例えば、ァスコルビン酸の 2位の水酸基にダルコースがダルコシド結合したァスコルビン酸— 2一ダルコシドなどカ举げられる。

ァスコルピン酸ダルコシドの脂藤エステルとしては、ァスコルビン酸ダルコシドに脂月簾が Ηにエステル化した化合物、例えばケスコルビン酸一 2—ダルコシド一 6—パルミテート、ァスコルビン酸— 2—ダルコシドー 6—ステアレ一ト、ァスコルビン酸一 2—ダルコシド一 6—ラウレートなどカ挲げられる。ァスコルビン酸鍾エステルとしては、例えば、ァスコルビン酸の 2位の 7嫩基に硫酸がエステル化したァスコルビン酸— 2—碰エステルなど力寧げられる。

ァスコルビン酸薩エステルの塩としては、ァスコルビン酸硫酸エステルの塩、具体的には、アルカリ鍋塩、アルカリ土類金属塩などカ举げられる。

ァスコルビン酸硫酸エステルの脂肪酸エステルとしては、ァスコルビン酸硫酸エステルの 7嫌基に脂 !«0埂にエステル化した化^!、例えば、ァスコルビン酸— 2—硫酸一 6—パルミテート、ァスコルビン酸一 2—硫酸一 6—ステアレート、ァスコルビン酸— 2—碰— 6 _ラウレートなど力攀げられる。

このうち、特にァスコルビン翻旨肪酸ェステル、ァスコルビン酸リン酸エステル、ァスコルビン酸リン酸エステルの脂肪酸エステル、ァスコルビン酸ダルコシド、及びァスコルビン酸グルコシドの脂璧エステルが、魏性カ缟く、チロシ:^ゼ活性 l作用に優れる点で好ましい。

本発明におけるチロシナーゼ活性促進剤の有効^であるァスコルビン酸及び Z又ァスコレビン〖ま、 ^量で用いることによって、優れたチロシナーゼ活性促編果を奏する。

チロシナーゼは、チロシンを基質にして、その水酸化反応と生じた DO P Aの酸化を触するが、フ嫩化反応時にァスコルビン酸又はァスコルビン酸誘導冰素供として働くことにより、チロシナ一ゼ活性をるものと考えられる。

そして、該ァスコルビン酸及び Ζ又はァスコルビン酸誘導体を含有するチロシナーゼ活性は、 «的に吸収されて ¾1謝立^ iし、メラノサイトに働いて、優れたメラニン産生謹乍用を示す。

このような性質により、本発明のァスコルビン酸及び Z又はァスコルビン酸誘を^！^とするチロシナ一ゼ活性^ は、優れたメラニン産生ィ © l果を ? "る。本発明のチロシナーゼ活性促進剤は、ァスコルビン酸及び Z又はァスコルビン酸誘 ί本を、そのまま用いて又 W¾当な担体と混合させて、 ^0の徵去に従って調ィることにより得ること力 ?きる。

また、該チロシナーゼ活性 {©1剤を含有成分として用いて外用剤を得ることもできる。外用剤は、

«31当な担体と混合することにより、得ること力 ?きる。用剤は、優れたチロシナーゼ活 ¾ί腿作用又はメラニン産生 iSi作用を有し、例えば、 g^ffl外用剤又は雄用外用剤として利用することがきる。また、中月線貭のようなメラニン麵田胞に作用するパーキンソン病の治翻外用剤としても翻することができる。

頭外用剤としては、具体的には、白髪防止、白髪改善又源觀色化のための l^ffi外用剤カ銜られる。

頭議外用剤の種類は特に P跪されず、例えば、シャンプー、リンス、ヘアコンデイシヨ^"、ヘアパック、ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアスプレー、発棚、染毛剤、等として用いること力 ?きる。外用剤の形態も特に腕されず、例えば、液状、乳灘、クリーム状、ジェル状、 m , 種々の形態で用いることがきる。皮膚用外用剤としては、具体的には、皮膚の抗白斑治療、皮藤色化又は皮膚黒化のための^ it用外用剤カ举げられる。

皮膚用外用剤の種類は、特に P跪されず、例えば、ローション、乳液、クレンジングクリ一ム、栄養クリーム、メイクアップベースクリーム、ファンデ'一シヨン、ボディローション、ハンドクリーム、レッダクリーム、、«料、ボディソープ、ボディシャンプとして用いること力きる。外用剤の形態も特に P跪されず、ローション状、液状、クリーム状、ジェル状、乳湖犬、固? m機の形態で用いることがきる。

外用剤には、チロシナ一ゼ活性 {©^!1の効力を高めるのに械な任意の助剤又は公知の励を薩己合することが^⁵きる。例えば、 «Iパラフィン、ワセリ^の炭化水素類、カリレナパ、ワックス、モクロウ等のロウ類、ォリーブ油、ホホバ油等の油 J3^l、ォク夕デシルバルミテ一ト、ネオペンチルグリコールジィソォクタネ一ト等のエステル類、ステアリン酸、パルミチンの高劂旨鍾類、セチルアルコール、ステアリルァルコ—ル等の高級アルコ、ノニオン、ァニオン、カチオン、両瞎の界面活隨！ I、天然あるいは合成の香料ゃ键、パラべ^!、ダルコン酸クロルへキシジ: ^の防翻、ビタミン E、ビタミン P等のビタミン類、 BHT等の抗酸ィ t^!j、ベンゾフエノン、アミノ安息纖等の紫外線吸糖 |J、エタノール、プロパノール等のアルコ應、クェン酸塩、酉體塩等の PH調翻、及種目的に応じた難敝などを ^iffi合することができる。

外用剤におけるチロシナーゼ '活' I生の含有害 [I合は、チロシナーゼ、活 'ί生促進 ί乍用を奏する械應艘であり、該含鶴恰は、麵態様及びに含有の翻こ応じて適 ¾される。

頭髪用外用剤として用いる場合、チロシナーゼ活性 «剤の含有量は、外用剤全体に対し、 0. 0 0 0 0 1〜1 011¾%禾 MJt、好ましくは、 0. 0 0 0 1〜0. 1重量％禾! ^ある。また趙用外用剤として用いる驗、チロシナ一ゼ活性有量は外用剤全体に対し、 0. 0 0 0 0 1〜： L 0S*%@J¾、好ましくは 0. 0 0 0 1〜0. 1籠％體である。

チロシナーゼ活性促進剤がァスコルビン酸を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤である場合、ァスコルピン酸の含有量は、外用剤全体に対し、 0. 0 0 0 1〜 1重量％程度、好ましくは 0. 0 0 1〜1重量％程度、より好ましくは 0. 0 1〜 1重量％程度、更に好ましくは 0. 1〜1重量％程度である。ァスコルビン酸は皮膚からはほとんど吸収されないため、細胞内の濃度を有効量と考えられる 1 0 _⁴M 又はそれ以下の濃度とする場合、ァスコルビン酸の、チロシナーゼ活性促進剤の組成物全体における濃度は、 0. 0 0 0 1〜 1重量％程度と考えられる。

チロシナーゼ活性促進剤がァスコルビン酸リン酸エステル及びァスコルビン酸グルコシドからなる群から選ばれる少なくとも 1種の化合物を有効成分とするチロシナ一ゼ活性促進剤である場合、該化合物の含有量は、外用剤全体に対し、 0. 0 0 1〜： L 0重量％程度、好ましくは 0. 0 1〜1 0重量％程度、より好ましくは 0. 0 1〜1重量％程度、更に好ましくは 0. 1〜1重量％程度である。ァスコルビン酸リン酸エステルやダルコシド体は、ァスコルビン酸よりも安定性が高く、ァスコルビン酸に比べて皮膚透過性乃至吸収性が増している。このため、細胞内のを活性化作用が見られる有効量と考えられる 1 0一² M〜l 0一⁴ M程度とする場合、ァスコルビン酸リン酸エステルやダルコシド体の、チロシナーゼ活性促進剤の組成物全体における濃度は、 0. 0 0 1〜 1 0重量％程度と考えられる。

またチロシナーゼ活性促進剤がァスコルビン酸の脂肪酸エステル、ァスコルビン酸リン酸エステルの脂 JI搬エステルおよびスコルビン酸ダルコシドの脂靈エステルからなる!^ゝら選ばれる少なくとも 1種の化合物を^ ¾とするチロシ^ "ゼ活性^ 1 剤である:^、該化合物の含有量は、外用剤全体に対し、 0. 0 0 0 0 1〜0. 1重量％禾艘、好ましくは 0. 0 0 0 1〜0. 1 %離、より好ましくは 0. 0 0 1〜 0. 1重量％程度、更に好ましくは 0. 0 1〜0. 1重量％程度である。ァスコルビン mxはァスコルビン騰難の脂璧エステルは、魏性ヵ槁ぐ趙腿倒おゝなり高くなつていると考えられる。このめ、細胞内の Μ¾を^!量と考えられる 1 0一⁴

M以下離とする齢、ァスコルビンはァスコルビン酸誘の脂鍾エステルの、チロシナ一ゼ活性 ©^ijの WftJ全体における? は、 0. 0 0 0 0 1〜0.

鍵と考えられる。

本発明によれば、安全性カ犒く、 i¾iコストが安価なァスコルピン酸及び Z又はァスコルビン薩を^^として、優れたチロシナ一ゼ活性 iSi作用又はメラニン産生®i作用をるチロシゼ活性及び外用剤が樹共される。

«、ァスコルビン酸又はァスコルビン酸誘導体は、メラニン生成抑制剤として用いられていたが、本発明により、ァスコルピン艇び /又はァスコルビン酸誘^^、チロシ: ^ゼ活性ィ j及びチロシ:^ゼ活性ィ©1作用を奏する纖剤の ¾ として用い得ることが明らかとなつた。

本発明に係るチロシナ一ゼ活性羅剤は、安全性がぐ安価で難することができ、優れたチロシナーゼ活 ffii匕作用及びメラニン産生 ί腿作用を奏する。また、該チロシ^ "ゼ活性 iS^lJを含^ る外用剤も、優れたチロシナ一ゼ活性化作用及びメラニン産生鍵作用を奏する。

本発明に係るチロシナーゼ活性促進剤及び該チロシナーゼ活性促進剤を含有する外用剤は、チロシナーゼ活性 IXはメラニン胜纖を目的として、ィ匕 ¾、 [^^の分野においに禾翻できる。例えば、白髪防 ihffl、白髪改善用などの外用剤、また、雄黒ィ bffl、贿の抗白斑治翻などの趙用外用剤として、棚に利用できる。

I V. 本発明の第 4の好ましい鍾形態としては、糖類ゃヌクレオシドカ河溶な溶媒中での赚によるエステル化物の法が衞共される。

本発明者らは、カンジダアン夕一クティカ (C a n d i d a a n t a r c t i c a) 由来のリパーゼタイプ Aが非プロトン性 »媒中で高い活性を衬ることを見出した。更に、質としてショ糖を用いた驗には、特に纖性の高いが行われることも見出し、これらの知見に基づき、鋭 ¾ ^討を重ねた。

即ち、本発明には、以下のエステル化物の $S ^法が含まれる。

法

4-1. カンジダアンタークティカ（Cand i d a antarc t ic a) 由来のリパーゼタイプ Aの被下、非プロトン性有漏媒中で、水藤を^ Tる化合物と Ji旨 «Xはその誘^とをエステ W匕させるエステレイ匕物の Sl^法。

4-2. 非プロトン性棚溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及びジメチルホルムアミドとジメチルホキシドとの混合溶勸ゝらなる群から選ばれるいずれかである 4一 1に記載のエステル化物の^ 法。

4— 3. 水酸基を; る化合物が類、ヌクレオシド類、糖アルコール類、又 «ΖΚ m¾をるアミノ^;ゝらなる群から選ばれる 1SXは 2種以上である 4— 1又は 4一

2に記載のエステル化物の

4—4. 水酸基をる化合物が糖類である 4— 3に記載のエステル化物の S¾t方

4-5. 7酸基をる化合物がショ糖であって、エステル化物が下記 H¾式 (2

1 ) で表される化合物である 4_ 1に記載のエステル化物の $Si ^法。

(21)

(式中、 Rcは鍵数 1〜 24の脂應錢を示す。 ) 以下、本発明の第 4の雄形態について更に詳しく説明する。

第 4の麵形態に係るエステル化物の織方法は、カンジダアンタ一クティカ（C and i da antarc t ic a) 由来のリパーゼタイプ八の &下、非プロトン性有灘媒中で、 7爐基をる化合物と脂 «Xはその誘難とをエステル化させることを «とする。

ここで、エステル化とは、エステルを合成することを意味し、エステル化反応及びエステル ¾¾¾が含まれる。具体的には、カルボン酸とアルコールとの反応 (R' - COOH+R" -OH→ R' -COO-R" ) 、エステルとアルコールとの反応 (R' - COO— R〃 +R"'-OH→ R' -COO-R'") などが含まれる。リパーゼ

該エステ w匕物の法では、酵素漏某として、カンジダアンタークティカ（C and i da ant arc t i c a) 由来のリパーゼタイプ Aを用いる。

カンジダアンタークティカ（Cand i da ant arc t i c a) 由来のリパ —ゼには、タイ

本発明者らは、このうち、リパーゼタイプ Aが、非プロトン性有 «媒中 ¾い活性を ¾ る、優れた酵^ «であることを見出した。

本発明を適用すれば、有機溶媒に溶けにくい、水酸基を有する化合物を基質とする ®aこついても、高い収率でを得ること力河能になる。

リパーゼ Aは、発酵後のリパーゼから、例えば、ゲルろ過により調製して得ることがきる。また、リパーゼ Aをコードする遺により、組み換え DNA攝を用いて産生することもできる。リパーゼタイプ Aの翻害恰は、溶媒に対して、 0. 1〜20 %禾!^、好ましくま0. 1〜： L 0 %@JSである。

リパーゼタイプ Aを用いる反応の反応 &gは贿設定し得るが、通常 10〜： L 0 0°C^ 好ましくは 30〜 50で禾 Si荬である。非プロトン性有機溶媒

本発明の方法は、非プロトン I生有漏媒中で行う。

非プロトン f生有盤媒の種類は、特に H¾されないが、例えば、ジメチルホルムァミド、ジメチルァセトアミド、ジメチルイソプロピルアミド、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、 N—メチルピロリドン、 N—メチレー 2 -ピロリジノンジプ口ピルスルホキシドあるいはそれらの混合溶媒等カ攀げられる。このうち、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又はジメチルホルムァミドとジメチルスルホキシドとの混合溶觸率カ犒ぃ点で好ましい。特にジメチルスルホキシドが好ましい。混合溶媒の割合きるが、ジメチルスルホキシドの割合が 6 0 %以上、好ましくは 8 0 %以上であるものが好ましい。フ搬基をる化合物

本発明における水酸基をる化合物としては、 ζΚ酸基を^ @以上有している化合物であれば、特に Ρ腕さい。例えば、纏、ヌクレオシド類、糖アルコール類、水酸基をするアミノ酸などをすることが、できる。

糖類としては、職、少着、多糖およびそれらの加水適生成物等の天然糖ならびに合賺カ举げられる。また、これらの纖体ゃ誘例えば、アミノ糖、ゥロンカ举げられる。また、これらの溶擬ロ物等が挙げられる。

単瞎としては、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクト一ス、又はァスコルビン酸等の炭素数 2〜 8個の化合物、好ましくは 5〜 7個の化合物カ攀げられる。

條としては、例えば、トレハロース又はその:^口物、スクロース（ショ糖）、マルト一ス、セロビオース、ラク卜ース等の、ラフイノース等の 31、マンノオリゴ糖、マルトオリゴ糖等のオリコ H力律げられる。

多糖としては、例えば、セルロース、デンプン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、マンナン、キシラン、プルラが挙げられる。

なかでも、コストや反応«媒に対する溶解性の点から、職および少着が好ましぐ少着としては特に:^!力 ¾子ましい。具体的には、グルコース、トレ八ロースおよびスクロースが好ましぐ特にスクロースが好ましい。

ヌクレオシド類としては、例えば、アデノシン、グアノシン、シトシン、チミン及びゥラシルの各驢にデォキシリポース又はリポースが!^した化合物又はその誘 (本等カ举げられる。

糖アルコール類としては、例えば、グリセロール、エリスリトール、ァラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、イノシ! ルカ挙げられる。

また、水酸基を: るアミノ酸としては、セリン、スレオニン、チロシンが挙げられる。

これらの化合物は、 1種を聘虫で用いてもよく、また 2種以上を併用して用いてもよい。

反応溶媒中の水酸基を有する化合物の濃度は、 0. 0 1〜 1 M、好ましくは 0. 1 〜0. 5 M難である。脂 j»Xはその誘本

本発明において用いられる脂肪酸又はその誘の種類は所望に応じて ¾!：設定し得る。

脂膽としては、飽和または不飽和の脂脑モノカルボン酸、ジカルボン酸、およびカルボン酸を奸内に 3個以上衬るポリカルボン酸等カ攀げられる。脂薩の藤数は、通常 1〜2 4、好ましくは、 6〜1 8である。

脂脑モノカルボン酸としては、例えば、カブロン酸，ソルビン酸，力プリル酸，力プリン酸，ラウリン酸，ミリスチン酸，パルミトレイン酸，パルミチン酸，ステアリン酸，イソステアリン酸，ォレイン酸，リノ一 J膽，リノレン酸，ペン夕デカン酸，ェィコサン酸，ドコサン酸，ドコセン酸，ァラキドン酸，リシノレイン酸，ジヒドロキシステアリン^カ举げられる。中でも、パルミチン酸，ステアリン酸、カブロン酸、力プリ ΛΜ、ラウリル酸カ赞ましい。

また、ジカルボン酸としては、例えば、アジピン酸、セバチン酸等カ举げられる。なかでも、ジビニルエステルとしたに重合性モノマーが得られることから、飽和または不辦口の脂肪族ジカルボン酸、特にアジピン酸が好ましい。

また脂薩の誘難としては、上謎副雄とアルコールとの跡から得られる脂賺エステ脂賺の醌 ¾7 などカ举げられる。脂薩エステルとしては、例えば、脂薩のビエルエステル、低級アルキルエステル、ハロゲン化碰アルキルエステリが挙げられる。なかでも、エステル^ の腿! ¾として優れていることから、ビニルエステレ；^好ましい。

なお、ここでいう「低級アルキル」とは、炭素数 1〜 6個の直鎖状または分機員状のアルキル基を意味し、「ハロゲン化纖アルキル」とは、少なくとも 1個のハロゲン原子（フッ素原子、漏原子、難原子等）で督換された鎌己纖アルキルを意味する。脂薩の誘灘の具体例としては、上記脂薩のピエルエステル、メチルエステル、ェチルエステル、トリフルォロェチルエステルおよびトリクロロェチルエステル、アジピン酸およびセバチン酸のジビニルエステルカ攀げられる。

なかでも、性の点から、カブロン酸ビエル、力プリル酸ビニル、ラウリン酸ビニル、ミリスチン酸ビエル、ノ\°ルミチン酸ビエル、ステアリン酸ビニレ、ゥンデシレン酸ビニリレ、ォレイン酸ビニル、およびアジピン酸ジビニルが好ましい。

これらの脂賺又はその誘 #ί本は、 1種職で用いてもよぐまた 2種以上を併用して用いてもよい。また、これらの脂 J«Xはその誘本は、水驢，力ルポニル墓フエエル基、ハロゲン藤の置換基で舰藤されたものでも良い。

上記脂腫又はその誘本の?艇設定し得るが、通常、水酸基を；る化合物 1モルに対して、 1〜 1 0モル、好ましくは 1. 2〜 4モル鍵である。ショ糖エステル

該エステル化物の製造方法において、 7_K酸基を有する化合物として、スクロース (ショ激を用いた齢には、スクロースの 2位の爐基が特異的にエステル化された化合物が得られる。

具体的には、カンジダアンタークティカ（C a n d i d a a n t a r c t i c a) 由来のリパーゼタイプ Aの雜下、非プロトン f生有盤媒中で、スクロースと脂肪はその誘 (本とをエステル化させた i船、下記表される化合物力られる。

(式中、 Rcは羅数 1〜 2 4の脂 Ji層幾を示す。 ) 非プロトン性有機溶媒としては、觸 3した溶媒を難使用し得るが、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及び、ジメチルホルムアミドとジメチルスルホキシドとの混合溶勸将ましく用いられる。特にジメチルスルホキシドが好ましい。脂薩又はその誘としては、嫌旨腫又はその誘難として例示した化合物などを所望に応じて航棚し得るが、特に、アジピン酸ジビニル、力プロン酸ビ二ル、力プリン酸ビニル、ラウリン酸ビニル、パルミチン酸ピニル、ステアリン酸ビニルが反応性の点で謹に用いられる。

«実用化されているショ糖エステルは化法で^ tされたもので、モノ、ジ、トリエステルの混合物である。しかもスクロースの 1 ' 位、 6位、 6 '位の"" «膽基に脂鍾エステルが纖している。このため、 ϋ7Κ性が低く、可謝匕^ ¾化における水溶 f生カ坏十分である。これに対し、本発明を用いれば、 2位の水酸基カ«的にエステル化されたモノエステル化合物カ犒収率得できる。また、本発明を用いれば、 2位の ¾7搬基のみ力鋼にエステル化されたショ糖エステルを、高有物の形で、棚な工程を要さずに取得することがきる

本発明の方法により得られる 2位の水酸基が選択的にエステル化されたショ糖エステルは、食品、化粧品、シャンプー、リンス、隨、纖洗满 IJなどの分野における孚 ^ゃ界面活' U等としてに用いること力きる。

本発明のエステル化物の法によれば、水溶性が! ¾い化合物を原料とするでも、エステル化物を効率よく取得することがきる。特に本発明に係るエステル化物の ®i ^法は、ィ [^合^)攤しく、酵素による藤的なが求められるエステル化物の^ iに、 TOに用いられる。図面の簡単な説明

図 1は、モレキュラーシーブスを、添加して、アルブチンエステルを $¾iするにおいて、アルブチン転化率（反応率）の経時変ィ匕を、モレキュラーシ一ブスの濃度を種々に変化させて、測定した結果を示す図面である。分析は HPLCを用いて行った。図 2は、 -モレキュラーシーブスを添加して、アルプチンエステルを S¾tするにおいて、アルブチン転ィ ( i ) の,観変化を、アルブチンの驢を種々に変化させて、測定した結果を示す麵である。分析は HPLCを用いて行った。図 3は、マッシュルーム由来チロシナ一ゼに対する、アルブチン及び実施例 1で得得られるアルブチンエステル化合物の阻害活性を籠した結果を示す図面である。図 4は、マウスメラノ一マ細胞を用いて、アルブチン及施例 1で得られたアルブチンエステル化合物のメラニン産 «制作用を謹した結果を示す図面である。図 5は、実施例 2― 1と実施例 2一 4で行われたピロカテコールあるいはフエノールを基質にしたときのゥンデシレン酸トレ八ロースエステルのチロシナーゼ阻害活性の諮面を示す図である。 -OCatechol (カテコール）はピロカテコールを基質にした;^、 -•-Phenol (フエノール）はフエノールを基質にした齢の測佶果を示す。図 6は、比較 2—1と比較 2 - 3で行われたカテコールあるいはフエノールを基質にした:^におけるアルブチンのチロシナーゼ阻害活性の龍を示す図である。 - OCatechol (カテコール）はピロカテコールを基質にした、 -^-Phenol (フエノール）はフエノールを基質にした驗の測結果を示す。図 7は、実施例 2— 1及び 2 _ 3と比翻 2 - 2で行われたカテコールを基質にしたときのチロシナ一ゼ阻割舌性の I 面を示す図である。図 8は、実施例 2 - 5と比較 !j 2— 4で行われたフエノールを基質にしたときのチ口シナ一ゼ阻性の S¾を示す図である。図 9は、チロシナーゼに対するアルブチン及びゥンデシレン酸の阻害活性を図示した陋である。アルブチン〖注にモノフエノールのフ顺応を阻害し、ゥンデシレン酸誘はジフエノールの酸化を阻 "る。図 1 0は、ァスコルビン酸及びァスコルビン酸誘導体のチロシナ一ゼ活性促進率を調べた結果を示した βである。図 1 1は、ショ糖 0. 25Μ、アジピン酸ジビニル 1Mを溶かした DMFあるいは DMS0に、力ンジダアンタークティカ由来リパ一ゼ夕ィプ A (CAL-A)あるいは力ンジダアンタークティ力由来リノ、。ーゼタイプ B (CAL-B)を口し、 40 °Cで 24時間した後のエステ JW本への変娜を示す醒である。〇はリバ一ゼタイプ Aの^^を、會はリパーゼ夕イブ Bのを示す。図 12の Aは、ショ糖 (0.125M)とアジピン酸ジビニル (0.5M)を含んだ DMFと DM S Oの混合溶液中にカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプ A (CAL- A)を^口し、 DMFと DMS Oの混合割合を変えて、 30 で 24時間酒半したときのスクロースェステルへの^^を示す図面である。図 12の Bは、ショ糖 (0.125M)とアジピン酸ジビニル (0.5M)を含んだ DMFと DM S Oの混合赚中に力ンジダアンタークティ力由来リパ一ゼタイプ B (CAL-B) を添加し、 DMFと DM SOの混合割合を変えて、 30°Cで 7日間辦したときのスクロースエステルへの変纏を示す図面である。図 13は、マルトース 0.25M、アジピン酸ジビニル 1Mを、ジメチルホルムアミド (DMF) 、ジメチ Jレスルホキシド（DMS0) 、 N—メチルピロリドン（NMP) の各溶媒に溶かし、カンジダアンタ一クティカ（Cand i da ant arc t i c a) 由来のリパ一ゼタイプ A(CALA)及びタイプ B (CALB) をそれぞれ 10mg ml鋤口し、 40°じで24 時間攪赚のエステル体への変醇を示す図面である。発明を^ fるための最良の形態

以下、本発明をより詳しく説明するため鎌例及び比較刺を挙げるが、本発明はこれら^ M例に!^されない。難例 1—1

アルブチン 6.8g、 10 -ゥンデシレン酸ビニルエステル 21g、水 3.8gを含むジメチルホルムアミド 72.6ml にバチルスサブチリス (Bacillus subtilis) 由来のプロテアーゼ 0.5g (ナガセケムテックス欄を添加し、 30°C、 130rpmにて ~¾間辦した。麵率は 80%であった。を TLCで調べたところ、ほぼモノエステルのみが^ ¾していることが分かった。酵素夜をろ過して、末を^ ¾した後、 Mj¾夜を E し DMFを^ ¾した。これをシリカゲル 100gを充填したカラムに添加し、クロ口ホルム：メタノール（8: 1) で溶出し、 «物を集め、謹し、 6-0-(10 -ゥンデシレノィル）アルブチンの結晶を得た。収率は 62であった。 13C-NMR:6101.6 (C1), 76.4 (C2) , 73. 2 (C3) , 70. 1 (C4) , 73.7 (C5) , 63.4 (C6) , 115.5, 117.7, 150. 2 152.4 (phenol), 172.8 (C=0) , 114. 6, 138.9 (CH=CH₂) , 24.4, 28. 3, 28.5, 28.7, 33.2, 33.6 (CH₂) Anal. Calcd for C₂₃H₃₄0₈ (438) ： C, 63.01 ; H, 7. 76, Found: C, 63. 16; H， 7.75. 同様の方法で、各種脂！^カルボン酸ビニルとアルブチンのバチルスサブチリス (Baci l lus subti l is) 由来のプロテアーゼ存在下での反応を行った。その結果を表 1 — 1に示す。表 1—1 Bacillus subtillis由来プロテアーゼによるアルブチンエステリ！^成脂 J!励ルボン酸ピニル収率 ( ) アクリル酸ビニル 6 - 0 -ァクロィルアルブチン 85 メタァクリ J膽ビニル 6 - 一メタァクロイルァルブチン 91 ジビニレアジピン酸 6-0一ビニルアジボイルアルブチン 95 アジピン酸ビエルアルブチン 6-0一アジピン酸エステル 75 メチルアジピン酸ビニル -0一メタアジボイルアルブチン 70

デセン酸ビニル 6-0ーデセノィルアルブチン 92 ォレイン酸ビニル 8-0一才レ才ィルアルブチン 82 ピハ、リン酸ビニル 6-0 -ピバリノィルアルブチン 75 ベンソ'イリレ酸ビ二 Jレ 6-0一べンゾノィルアルブチン 72

酉鍵ビニル 6-0 -ブタイルアルブチン 86 ラウリン酸ビニレ 6 - 一ラウロイルァルブチン 80 ステアリン酸ビニル 6-0ーステアロイルァルブチン 73 難例 1—2

アルブチン 2.8g、アジピン酸ジビエル 9. 5gをピリジン 40.5mlに溶解し、ストレブトマイセス XX h°- (Sireptowces sp. ) 由来のアルカリ性プロテアーゼ 5g 凍洋紡績權を励口し、 30° (、 130ΓΡΠΙにて 4日歸辦した。 « lを TLCで調べたところ、モノエステルのみが «していることが分かった。賺夜をろ過して、酵纖末を!^ ¾した後、反 j¾夜をし、ピリジンを^ ¾した。これをシリカゲル 100g を充填したカラムに鋤口し、へキサン：酢酸ェチルエステル（4:1) で溶出し、 «物を集め、謹し、 6-0- (ビニルアジボイル)アルブチンの結晶を得た。率は 85%であった。 H-腿: δΐ.556 (4H，m, - CH₂C¾ -)， 2.320(2H,m,-COCH ), 2.430 (2H, t, 一 CH₂C0— )， 3.12-3.29 (3H, m, H— 2,3,4), 3.508 (1H, m， H-5), 4.070 (1H, q, H-6), 4.310 (1H， dd, H-6), 4.640 (1H, dd, =C¾), 4.675 (1H, d， H - 1)， 4.900 (1H, dd, =C¾)， 5.11-5.32 (3H, m, OH— 2， 3， 4)， 6.66 (2H, m, φ), 6.83 (2H, ι, ), 7.21 (1H, q, -CH=)

また、 DMF、 DMS0、 N_メチ V"2-ピロリドン中でも上記と同様の反応条件で反応を行つた。原料アルブチンやかにエステル化され TLC分析からこれらの溶媒中ではモノエステルが^ として検出されたが、ピリジン中と異なり、ジ、トリ、テトラエステルもることが分かつた。難例 1—3

アルブチン 6.8g、 10 -ゥンデシレン酸ビニレエステレ 21gを含む 76.2mlに 4-ピロリジノピリジン lg ( y mmを漏口し、 80°C、 130rpmにて ¾時離辦した。 « 物を TLCで調べたところ、モノ、ジ、トリ、ポリエステルがしていることが分かつた。反 J¾夜を ffi灘宿し DMFを除去した。これをシリカゲル 100gを充填したカラムに添加し、クロ口ホルム：メタノール（8:1) で溶出し、モノエステルを集め、？纖し、 6 - 0- (10-ゥンデシレノィル）アルブチンの結晶を得た。収率は 10%であった。 13C - NMR:6101.6 (CD, 76.4 (C2), 73.2 (C3), 70.1 (C4), 73.7 (C5), 63.4 (C6)， 115.5, 117.7, 150.2 152.4 (phenol), 172.8 (C=0)， 114.6， 138.9 (CH=CH₂), 24.4, 28.3, 28.5, 28.7, 33.2, 33.6 (CH₂) Anal. Calcd for C₂₃H₃₄0₈ (438) ： C, 63.01; H, 7.76, Found: C, 63.06; H, 7.81.

同様の方法で、各翻旨«¾ルボン酸ビニルとアルブチンの 4 -ピロリジノピリジン被下でのを行った。結果を表 1—2に示す。表 1一 2 4_ピロリジノピリジンによるアルブチンエステリ t合成

脂カルポン酸ビール牛成 1 117 ( 、%) ズヮリソ | ¾ヒ一ノレりひ η一ダグ? η uノノ ϊϊレノ 11レノナノ oU 々ツマ /ソ7 Πリノ )1 J¾^Vこ—^ノ Ϊしレ 0 U— 々マ 77 Π Ϊ

リつノしレマゾノ）しレノフノ、 09 ド ϊ— ,一― ^ノレル⁰ ノ酸 α 0- Uη― CL、^―^ノ）しレ7ゾノ74^ィ 1ノ Π ゾノ Πレ'プキノノ、ノ 00 マ；レ。 Ϊし

ノノしノ^ ^レ Vノ ϊレ"ノ" ^ブノヽノ β D—ひ)ーマ-ノ！^ヽノ？^丁マノノ1しレ 1 ）ノ）しレァ, 5しノし^— ^ノ）しレ fi_ i

D u— ^々yマゾ ^ノ ^ヽィ 1ノゾノしレノキノ、 0 L9L ヤン酸ール —一デセノィ iルアルチン

ォレイン酸ビニル 6 - -ォレオイルアルブチン 43 ピバリン酸ビニル 6 - ピバリノィルアルブチン 23 ベンゾィル酸ビニル 6 - —ベンゾノィルアルプチン 22

賺ビニル 6- -ブタイルアルブチン 48 ラウリン酸ビニリレ ^0一ラウロイルァルブチン 40 ステアリン酸ビニル 6 - -ステアロイルアルブチン 41 難例 1—4

アルブチン 0. 3g、アジピン酸ジビニル lgを DMF4mlに溶解し、ジメチルァミノピリジン 10mgを添加し、 80°Cで 3時間勝した。を TLC 周べたところ、モノ、ジ、トリ、テトラエステルが «していることが分かった。夜を E薩し DMFを

^¾した。これをシリカゲル ioogを充填したカラムに m¾nし、クロ口ホルム：メタノール（8: 1) で溶出し、モノエステルを集め、漏し、 6-0- (ビニルアジボイル)アルブチンの結晶を得た。収率は 21%であった。難例 1—5

三角フラスコにアルプチン 327mg 10-ゥンデシレン酸 885mgを 4. Omlの 1, 4 -ジォキサン ZDMS0 (=9： 1) 混合溶媒に溶解し、次いで活性化したモレキュラーシ一ブス A を 0. 4g入れた後、カンジダアンタクティカ（Candida anterct ica) 由来の固定化リパ —ゼ（ノィムズ誦 40mgを励口し、 40°C 130rpmにて 1週蹄避した。なお、モレキュラーシブスの活性化は電子レンジを用いた簡便法で行った。すなわち、フラスコに入れたモレキュラーシブス 4 Aを電子レンジで 1分ほど加熱し、直後に、真空ボンフ" 室温まで方女冷し、この喿作を 3叵桑り返した。酵素物を TLCで調べたところモノエステルのみが^ ¾していることが分かった。酵素 ®S夜を βして、酵素とモレキュラーシ一ブスを^ ¾した ί臭、夜を Ε«した。これに 4mlメタノールと 2. 5mlの水を加え、さらにへキサン 5mlを漏口して未 J^のゥンデシレン酸をへキサン層に抽出した。へキサンによる抽出操作を 6 d臊り返した後、水層をエバポレー夕一にて漏した。この?膽液に 8 mLの水を励口して白^ ¾を生じさせた後、遠心分離によって上清を鶴した。この水抽出操作を 3 nr繰り返して未 SJ¾のアルブチン、および DMS0を^ ¾した。回収した白色物を E¾ し、 287mgの粉体を得た。

この精難を、 100%酉體ェチルを用レ T TLC分析した結果、未跡 10-ゥンデシレン酸がされ、単一のエステル化合物が得られていることを確認した。この精製物の NMR 、析を行ったところ、 ^例 1—1で得られたエステル化合物と同一で 6-0- (10 -ゥンデシレノイリレ)アルブチンであること力された。

得られたエステル化合物の収率は 91 %であった。また、：例の方法は、シリカゲルカラムによる精製が颜なぐ簡便であった。難例 1—6

三角フラスコにアルブチン 33mg、 10-ゥンデシレン酸 89mgを 4. 0mlの 1， 4-ジォキサンに溶解し、次いで活性化したモレキュラーシーブス 4Aを 0〜15≤*%入れた後、力ンジダアンタクティカ（Candida anterct ica) 由来の固定化リノ°ーゼ（ノ： ^ィムズ社 M) 40mgを添力 Πし、 40°C、 130rpmにて 1週離半した。なお、モレキュラーシブスの m ι - 5と同じ方法で行った。アルブチン ¾ί匕率の麟変化を HPLC分析により測定した。 HPLC分析条件は次の通りである。装置：島津 LC- 10、カラム： TSK gel Amide- 80、移動相溶媒：ァセトニトリル Z水 (=90： 10)、猶： l. OmU 検出：示麵斤。

結果を図 1に示す。脱水剤であるモレキュラーシ一ブスを添加することによって、アルブチン靴率 (mmが显藤に向上した。また、モレキュラーシ一ブスの劂ロ濃度が多くなるほど化率昇した。麵例 1一 7

アルブチンを 55mg〜872mg (0· 05Μ〜0. 8Μ)、 10-ゥンデシレン酸をアルプチンの 4 ί§ΐ I*としたことは、難例 1—6と同じ方法で酵素を行った。アルブチン転ィ [^の経時変化を HPLC分析により測定した。結果を図 2に示す。また、アルブチンの謎が多くなるほど跡避くなり、 0. 6Μ以上でわらなレ f直を示した。諮面 1：プロリンを用いたチロシナ一ゼ阻害活性諮面

本発明のアルブチンエステル化合物のチロシナーゼ阻害活性について、プロリンを用いた方法で測定した（Analyt ical Biochemistry, 179, 375-381, 1989)。 pH7. 5 の 0. 1Mリン衝液に溶解した 0. 749Mの L -プロリン 40μ1、 0. 037Μの 1， 2-ジヒドロキシベンゼン 40μ1、種々の i の ^例 1—1で得られた 6-^(10—ゥンデシレノィル)ァルブチン溜夜 1. 41mlを Pmgfflキュベット中で ϋ した。ついで、 350μβ/ηι1のチロシナ一ゼ（マッシュム由来、 SIGMA) 賺を ΙΟμΙ加え、辦下、の変化を 10 秒間 525皿で測定した。同様の条件でアルプチンについても柳淀した。結果を図 3に示す。

図 3の結果に示されるように、アルブチンの 6位の炭素における水 «がエステル化されたアルブチン化^ ¾のチロシ^ "ゼ離性は、エステル化されていないアルブチンに比べて显藤に向上していることが明らカゝとなつた。評価 2：マウスメラノ一マ細胞を用いたメラニン産^ ^:卬制作用の Ι¾Β

D-MEM 10¾FCS培地 15mlを入れた 75cm²:fg¾フラスコに 3. 6X 10⁵個のマウスメラノ一マ細胞 (B16 m を ¾¾卩、 37°c、 5%炭ス下にてー«養し τ田胞を ¾ »させた後、種々の?離の難例 1― 1で得られた 6-^(10-ゥンデシレノィル)アルブチンまたはァルブチンを溶かした 0. 1%DMSO含有 D- EM 10%FCS培地 15mlと培: ¾^換し、同条件にてさらに 2日間培養した。次いで同培地 15mlと培を行い、同条件にてさらに 2日間を行った。培窗麦、細胞を回収し、細胞のを測定した。湿重暈漏あ細胞ペレツトを Mi l 1 iQ水に懸濁、総溶量を 700 1とした。これを 15minの超音波破砕した後、 700 1の 6N 7層匕ナトリゥム水赚を励卩 ·混合し、細胞の溶解 'メラ二 ^出を行い、 . (405M) で測定を行った。尚、実験は 3回行い、結果はその平均値として求めた。細胞当たりのメラニン生産性は A405視 I淀 it/細 MM (^g) で表した。アルブチン未励 Π時の細胞当たりのメラニン趙性を 100%として各鍵のァルブチンゥンデシレン酸またはアルブチンのメラニン制作用を求めた。結果を図 4に示す。

図 4に示されるように、メラノーマ細胞を用いたメラニン産生阻割乍用を調べた結果、アルブチンゥンデシレン酸はアルブチンに比べて約 1 0 0倍高い阻割乍用を示した。雄例 2—1

ゥンデシレン賺エステルのチロシナ一ゼ阻害活性について、プロリンを用いた方法で根 IJ定した（Analytical Biochemistry, 179, 375-381, 1989) 。 ¾わち ρΗ7. 5の 0. 1Mリン薩衝液に溶解した 0. 749Mの L -プロリン 40μ1、 0. 037Μのピロカテコール 40μ1、種々ののトレハロ一スゥンデシレン酸エステル (Tre-Unde)赚 1.41ml を吸キュベット中で^した。ついで、 350μ /ιη1 のチロシナーゼ（マッシュトム由来、 SIGMA) 謙を ΙΟμΙ加え、辦下、の変化を 3分間 525mで測定し、チロシ^"ゼを阻 Τることを鶴忍した。結果を図 5に示す。難例 2— 2

実施例 2― 1で示した方法と同様の方法で、ゥンデシレン酸 (Unde)のチロシナ一ゼ阻害活性を調べ、チロシナーゼ活性を阻ることを鶴忍した。結果を図 7に示す。難例 2— 3

実施例 2— 1で示した方法と同様の方法でスークロースゥンデシレン酸エステル (Suc-Unde)のチロシナーゼ阻害活性を調べ、チロシナ一ゼ活性を阻 Τることを鶴忍した。結果を図 7に示す。比較例 2—1

実施例 2—1で示した方法と同様に、ピロカテコールを基質として、アルブチン (Arbutin)のチロシナ一ゼ阻害活性を調べ、チロシナ一ゼ活性を阻害することを確認した。結果を図 6に示す。比翻 2— 2

実施例 2 - 1で示した方法と同様にトレハロースジゥンデシレン酸エステル (Tre- di-Unde)のチロシナーゼ IS害活性を調べ、チロシナーゼ活性を阻害しないことを鶴忍した。結果を図 7に示す。難例 2— 4

ゥンデシレン赚ェステルのチロシナーゼ阻害活性について、ピロカテコールを用いた方法を改良してフエノールを基質に携淀した。 PH7. 5の 0. 1M リン酸锾衝液に溶解した 0. 749Mの L-プロリン 40μ1、 0· 037Μのフエノール 40μ1、種々の ?1¾のトレ八口一スゥンデシレン酸エステル (Tre - Unde)赚 1. 41ml を卩 MJ ffiキュベット中で辦した。ついで、 350μβ ιη1のチロシナーゼ（マッシュ Jトム由来、 SIGMA) 職を ΙΟμΙ加え、勝下、卩 J^Sの変化を 15分間 525 で測定し、卩 «mの増加を抑えること、 T¾わちチロシナーゼを阻害することを廳忍した。結果を図 5に示す。例 2— 5

実施例 2— 4で示した方法と同様にスークロ一スゥンデシレン酸エステル (Sue- Unde)のチロシナーゼ阻割舌性を調べ、チロシナ一ゼ活性を阻 Τることを騰忍した。結果を図 8に示す。比較 !12 - 3

雄例 2 - 4で示した方法と同様にアルブチン (Arbu t in)のチロシナーゼ阻害活性を調べ、チロシナ一ゼ活性を阻 Τることを鶴忍した。結果を図 6に示す。比湖 2— 4

実施例 2— 4で示した方法と同様に、フエノールを基質として、トレ八口一スォレィン酸エステル (Tre - 01 e)のチロシナーゼ阻害活性を調べ、チロシナーゼ活ゃ生を阻害しないことを礴忍した。結果を図 8に示す。難例 3—1

ァスコルビン ¾¾ぴスコルピン隱離を験物質とし、それらのチロシナ一ゼ活性化ィ腿作用について、フエノールを基質にしてプロリン雜下で測定した。

すなわち、フエノールはチロシナーゼにより水酸化されこのときに水素：を ^とする。したピロカテコールはチロシ^ゼにより酸化されてオルトキノン体をる。このオルトキノンの^ ¾をプロリン下ですることにより、チロシゼ活性を測定した。

具側には、次のように測定した。 H7.5の 0.1Mリン酸緩衝液に溶解した 0.749Mの L -プロリン 40μ1、 0.037 のフエノール 40_μ1及 Ό¾々の? 1¾の ¾験物質溜夜 1.41mlを、吸) 用キュベット中で酒半した。ついで、 350μβ/ιη1 のチロシナ一ゼ（マッシュリレーム由来、 SIGMA)謙を ΙΟμΙ加え、 tmr, の変化を 15分間 525nmで測定し、チロシナ一ゼ活性を測定した。

チロシナ一ゼ活性促進率は被験物質未添加時のチロシナーゼ活性に対して、何％阻害或いは促進したかで表した。チロシナ一ゼ活性促進率 100%とはチロシナーゼ活性が被験物質未添加時に比べて 2倍になっていることを示す。

被験物質として、ァスコルビン酸としては、 L—ァスコルビン酸（和«薬番号： 016— 04805) を用いた。ァスコルビン麵^:としては、下言髓表されるァスコルビン ^"2—グルコシド（和番号： 074— 04581) 、ァスコレビン酸一 2—リン酸エステル（ァスコレビン酸リン酸エステルマグネシウム塩 (和番号： 013— 12061) を麵）及びァスコルビン酸一 6一パルミテ ―ト（和^^ 番号： 011— 13662) を用いた。

測定した結果を図 10に示す。図 10に示されるように、ァスコルピン酸は、 10— ³M〜10— の鍵でチロシナ一ゼの阻割乍用が見られたが、 10一⁴ M以下の謎において逆にチロシナ一ゼ活性碰作用が見られた。

また、ァスコルビン酸脂エステルであるァスコルビン^ レミチン酸エステルにおいては、 10_⁴M以下の鍵でチロシナ―ゼ活性碰作用が見られた。

また、アスコレビン酸リン酸エステル、ァスコルビン酸ダルコシドでは 10一² M〜 10 -⁴ Mの藤でチロシナ―ゼ活性鍵作用が見られた。難例 4—1

スクロース 0.25M、アジピン酸ジビニル 1Mを溶かしたジメチルホルムアミド（DMF) あるいはジメチルスルホキシド（DMS0) に、カンジダアン夕一クティカ由来リパーゼ夕ィプ A (Ch i r a z yme, L5, 1 yo： CAL-A) を lOmg/ml のになるように添加し、 40 で 24時間 i¾臭のエステル体への » ^を調べた。 β¾夜の HPLC 分析よりほぼ定量的にスクロースがエステ本へ «されていることを HI忍した。 HP LCの分嫌件を以下に示す。

カラム： TSKgel Amide-80

«液：ァセトニトリル/水 (3/1)

検出：示麵折比翻 4—1

難例 1において、カンジダァンタークティカ由来リパーゼタイプ A (Ch i raz yme, L5, 1 y o : CAL-A) に代えて、カンジダアン夕一クティカ由来リパ一ゼタイブ B(Ch i r azyme, L2, 1 y o : CAL— B)を用いる β^ ま、難例 4一 1と同様の操作を行って、エステル体の変解を調べた。例 4 - 1と比較例 4一 1におけるエステル体の変 ^の結果を図 11に示す。図 11に示されるように、リパーゼタイプ Aは、 DMFや DMS0中においてリパ一ゼタイプ Bに比べて高い活性を示すことが明らかとなった。特に DMS0中において、そ (^効果あった。難例 4— 2

スクロース 0.125Mとアジピン酸ジピニリレ 0.5Mを含んだ DMFと DMS。の混合溜夜中にカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプ A (Ch i r azyme, L5, 1 yo) (lOmg/ml)を翻卩し、 DMFと DM SOの混合割合を ¾i¾えて、 30°CT24 時灘したときのスクロースエステルへの^^を調べた。夜の HP L C分析よりほぼ定量的にスクロースがエステル体へ^されていることを確認、した。

HPL Cの分嫌件を以下に示す。

カラム： TSKgel Amide-80

謹夜：ァセトニトリル Z水 (3/1)

検出：示麵折比翻 4一 2

スクロース 0.125Mとアジピン酸ジビニレ 0.5Mを含んだ DMFと DMS 0の混合溜夜中にカンジダアンタークティカ由来リパ一ゼタイプ B (Ch i r azyme, L2, 1 yo) aOmg/ml)を添加し、 DMFと DM SOの混合割合を ¾ ¾えて、 30°Cで 7日間半したときの、スクロースのエステリ！/^への^^を調べた。反夜の HPLC分析ょりほぼ的にスクロースがエステ! ί本へ «されていることを廳忍した。 HPL Cの分析条件は、 «例 4 _ 2と同様とした。実施例 4 _ 2と比較例 4— 2におけるエステル体の変^^の結果を図 12に示す。図 12に示されるように、リパーゼタイプ A (CAL-A) は、 DMFと DMS0の混合溶媒中においてリパーゼタイプ B (CAL-B) に比べて高い活性を示すことが明らかとなった。特にリパーゼタイプ Aは DMS0の混合害恰が多いほど、その効果藤であった。難例 4一 3

マルト一ス 0.25M、アジピン酸ジビ: ^レ 1Mを、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、 N—メチルピロリドン（NMP) の各溶媒に溶かし、カンジダアンタークティカ由来リパ一ゼタイプ A (Ch i r az yme, L5, 1 y o : CAL-A) を 10mg/ml 鋤口し、 40°Cで 24時間漏麦のエステル体への^^を調べた。液の HPLC 分析よりほぼ ¾¾¾にスクロースがエステル体へ建されていることを廳忍した。

HPL Cの分析条件を以下に示す。

カラム： TSKgel Amide - 80

溶離夜：ァセトニトリル Z水 (3/1)

検出：示麵折比翻 4— 3

¾ 例 4一 3において、カンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプ A (Ch i r azyme, L5, 1 y o : CAL-A) に代えて、カンジダアンタークティカ由来リパ一ゼタイプ B(Ch i r azyme, L2, 1 yo： CAL-B)を用いるは同様の操作を行つてエステル体の^ Wを調べた。

実施例 4一 3と比較例 4— 3におけるエステル体の変換率を調べた結果を図 13に示す。図 13に示されるように、マル卜一スの: ^におレ rも、リパーゼタイプ Aはタィプ Bと異なり、各非プロトン性 ¾W媒中において显藤な f&f生を示した。難例 4一 4

スクロース 6. 42g (0. 125M) およびカブロン酸ビニル 10. 7g (0. 5M) を溶かしたジメチルホルムアミド 150mlにカンジダアンタークティカ由来リパ一ゼタイプ A (Ch i r a z yme, L5, 1 yo： CAL-A) 50 Omgを加えて懸濁した。この酵素 ^JS夜を 30 にて 130 r pmで 24時曰した。 β)¾夜について、難例 4—1と同様の分析条件で HP LC分析を行い、ほぼ趕的にスクロースがエステル体へ変換されていることを ί鶴忍した。

また反 J¾夜の T L C分析から生成物は一つであることを確認、した。反液中の不溶物を ¾ϋΜで P鉄し、ポレーターで ffi灕宿後、シリカゲルカラム（クロ口ホルム：メタノール =12： 1) でエステ Λ#を製し、白色結晶として 6. 5g (収率 7 9%) を得た。 ¹³C NMR分析から、スクロースの 2位に力プロン«¾が導入されたスクロース 2—力プロン酸エステルの生忍された。

1³C NMR (DMSO_d6)： d 88. 70 (CI) 、 72. 99 (C2) 、 70. 0 5 (C3) 、 69. 83 (C4) 、 72. 56 (C5) 、 60. 31 (C6) 、 61. 14 (Cl，）、 104. 23 (C2' ) 、 75. 3 (C3' ) 、 82. 63 (C 4' ) 、 73. 75 (C5' ) 、 62. 32 (C6' ) 。難例 4— 5

スクロース 6. 42g (0. 125M) および力プリル酸ビニル 12. 8g (0. 5M) を溶かしたジメチルホルムアミド 150mlにカンジダアン夕一クティカ由来リパーゼタイプ A (Ch i r a z yme, L 5， 1 y o : CAL-A) 50 Omgを加えて懸濁した。この酵素 iS夜を 30°Cにて 130 r pmで 24時した。 lS夜について、麵例 4—1と同様の分ネ膀件で H PLC分析を行い、ほぼ趕的にスクロースがエステ本へ変換されていることを廳忍した。 m^ら不勵を麵により隨菱、

¾しシリカゲル 100 gを詰めたカラムを用いて、クロ口ホルム：メタノール（1 2： 1, v/v) で溶出した。白色結晶として 6. 8g (収率 68%) を得た。 ¹³C NMR分析から、スクロースの 2位にカプリ藤鍾が導入されたスクロース 2_力プリル酸エステルの^^カ擁認された。

¹³C NMR (DMS〇_d6) :d 88. 71 (CI) , 72. 96 (C2) 、 70. 0 5 (C3) 、 69. 85 (C4) 、 72. 55 (C5) 、 60. 35 (C6) 、 61. 13 (Cl' ) 、 104. 25 (C2' ) 、 75. 27 (C 3，）、 82. 62 (C 4，）、 73. 80 (C5，）、 62. 39 (C 6 ' ) 。難例 4— 6

スクロース 6. 42 g (0. 125M) および力プリン酸ビニル 15 g (0. 5 M) を溶かしたジメチルホルムアミド 150mlにカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプ A (Ch i r a z yme, L 5, 1 yo： CAL-A) 50 Omgを加えて懸濁した。この瞧 β«を 30°Cにて 130 r pmで 3日 |¾¾»した。 J¾夜について、例 4— 1と同様の分 ^件で HPLC分析を行い、ほぼ的にスクロースがエステリ本へ変換されていることを廳忍した。難例 4― 5と同様の方法で «物を職し、白色結晶として 6. 0g (収率 64%) を得た。 ¹³ C NMR分析から、スクロースの 2位にカプリン廠鐘が導入されたスクロース 2一力プリン酸エステルの生戯認された。

¹³C NMR (DMSO_d6) :d 88. 72 (CI) 、 72. 94 (C2) 、 70. 0 7 (C3) 、 69. 86 (C4) 、 72. 53 (C5) 、 60. 34 (C6) 、 61. 21 (CI' ) , 104. 30 (C2，）、 75. 27 (C 3 ' ) 、 82. 59 (C 4，）、 73. 78 (C5，）、 62. 37 (C6，）。錢例 4—7

スクロース 6. 42 g (0. 125M) およびラウリン酸ビニル 17 g (0. 5 M) を溶かしたジメチルホルムアミ HI 50mlにカンジダアンタークティカ由来リパ —ゼタイプ A (Ch i r a z yme, L 5, 1 yo： CAL-A) 50 Omgを加えて懸濁した。この酵素夜を 30°Cにて 130 r pmで 3日 Γ曰辦した。 ί¾夜について、 ¾例 4— 1と同様の ^ ^件で HP L C分析を行い、ほぼ的にスクロース力 nステ M本へ麵されていることを麵した。無例 4― 5と同様の方法でを職し、白色結晶として 6. 9g (収率 70%) を得た。 ¹³ C NMR分析から、スクロースの 2位にラウリン膨鐘が導入されたスクロース 2—ラウリン酸エステルの生^ ¾| した

¹³C NMR (DMS〇_d6)： d 88. 80 (CI) 、 72. 95 (C2) 、 70. 1 0 (C3) 、 69. 88 (C4) 、 72. 55 (C5) 、 60. 33 (C6) 、 61. 19 (C 1' ) 104. 30 (C2，）、 75. 31 (C3，）、 82. 62 (C 4' ) 、 73. 83 (C5' ) 、 62. 35 (C6' ) 。

»例 4— 8

スクロース 2. 14g (0. 25M) およびアジピン酸ジビニル 5 g (1M) を溶かしたジメチルスルホキシド 25m 1にカンジダアンタークティカ由来リパーゼタイプ A (Ch i r az yme, L 5， 1 yo： CAL-A) 25 Omgを加えて懸濁した。この酵素 J¾夜を 30°Cにて 130 r pmで 2日間辦した。夜について、例 4— 1 と同様の分析条件で H P L C分析を行い、

されていることを ¾ΙΜした。難例 4一 5と同様の方法で « lを聰し、白色結晶として 2. 6 g (収率 81%) を得た。 ¹³C NMR分析から、スクロースの 2位にビニルアジピン膨鍾カ導入されたスクロース 2 -ビエルアジピン酸エステルの «が癩忍された。

¹³C NMR (DMSO_d6)： d 88. 70 (CI) 、 72. 99 (C2) 、 70. 0 5 (C3) 、 69. 83 (C4) 、 72. 56 (C 5) 、 60. 31 (C6) 、 61. 14 (CI' ) , 104. 28 (C2' ) 、 75. 30 (C 3 ' ) 、 82. 63 (C 4，）、 73. 75 (C5，）、 62. 32 (C6，）、 23. 49, 32. 76, 3 3. 18 (— CH₂_) 、 98. 12， 141. 26 (— C=C— ) 、 170. 33， 172. 62 (— C=0) 。比較 — 4

実施例 4一 8において、カンジダアン夕一クティカ（Candida ant arc tica) 由来リパ一ゼタイプ A (リパーゼ A) に代えて、ムコ一ルジャバニカス (Mucor javanicus) 由来リパーゼ（リパーゼ^ M) 、ァスペルギルス二ガー (Aspergillus niger) 由来リパ一ゼ（リパーゼ A， ) 、及びカンジダシリンドラセ（Candida cylindracea) 由来リパーゼ（リパーゼ AY) を用いる ¾Wま同様の操作を行って、スクロースのエステリ淋の変麟を調べた。

実施例 4一 8と比較 !14 _ 4における各リパ一ゼを用いたのスクロース 2 - ビニルアジピン酸エステルへのを表 4— 1に示す。表 4—

表 4一 1に示されるように、他の微生物由来のリパーゼとの比較においても、カンジダアンタークティ力由来リパ一ゼ夕ィプ Aが¾な^^を示すこと力饍忍された。の利用の可能性

本発明により、チロシナ一ゼ阻害活性又は促進活性を有する化合物を有効成分とするチロシナ一ゼ活性言藤、及び窗舌性を含む外用剤が樹共される。また、該化合物の s¾g¾法力職される。

具体的には、チロシナ一ゼ阻害活性をる新規アルブチンエステル化合物、該化合物を有効成分とするチロシナーゼ阻 ^及び該阻截 |Jを含む外用剤が提供される。また、ゥンデシレン酸又はその塩或いはそのエステル誘導体を有効成分とするチロシナ—ゼ阻翻および該阻翻を含む外用剤が撤される。

また、ァスコルピン酸又はその誘導体を有効成分とするチロシナーゼ活性促進剤並

また、上記チロシナ一ゼ阻豁 I仅は碰剤の械成分となる化合物の纖に適用し得る、酵素によるエステ JW匕物の法に関する。本発明における新規アルブチンエステル化合物は、アルブチンの 6位のフ嫩基に棘性基を導入することにより、アルブチンと比較して、チロシ^ "ゼ is害活性が騰に高まっている。また、該化合物は、 ¾M生基を導入することで贿吸収性が向上している。更に、糖エステル機〖；¾づくと考えられる巾鉱ぃ擴作用、フエノール ¾嫩基に基づくと考えられるラジカル消去能、並びにエステ!/^の i l生とアルブチン部の Ι¾性に基づくと考えられる界面活性作用も有している。

そして、該化合物を有効成分とする本発明のチロシナ一ゼ阻 «I及び該阻豁 !1を含む外用剤は、赚なチロシ^ "ゼ性阻割乍用を示し、趙外用剤、美白用化翻、添加剤等として、化や医薬分野におい τ¾に禾翻すること力きる。また、本発明において、ゥンデシレン酸と =ϋのエステル体は、チロシナ一ゼ阻害活性をアルブチンと異なる作用で騰に高めることが見いだされた。 f¾わち、チロシナーゼ作用は、モノフエノールの 1， 2 -ジフエノール（カテコール）への水酸化作用とカテコールの 0-キノンへの酸化反応を腿しているが、アルブチンは前者のモノフエノ一ルのフ嫩ィ rasを効率的に阻害し、ゥンデシレン酸そのはそのエステル誘は後者のカテコールへの謝を阻ることにより、アルブチンとは異なるメカ二ズムでチロシ^"ゼを阻害していることが見いだされた。

特に、ゥンデシレン酸のエステル誘 mま、 ¾z性基を導入することで皮膚吸収性が向上している。更に、ゥンデシレン酸基に基づくと考えられる巾鉱ぃ漏作用、並びにエステの ¾ζΚ性とアルブチン部の ||7W生に基づくと考えられる界面活性作用も有する。

そして、詨隨をるゥンデシレン酸又はその塩或いはそのエステル誘を有効とする本発明のチロシナ一ゼ阻^ IIおよび該阻^ ijを含む外用剤は、化 Ιίπロロ、美白化彼料、漏卿等として、化や野におい τ¾¾に利用することがきる。また、本発明において、ァスコルビン m¾び/又はァスコルビン酸誘 #：が、優れたチロシナ一ゼ活性 i作用及びメラニン産生ィ ©1作用を有することが見出された。

«、ァスコルピン酸又はァスコルビン酸誘 ί本は、メラニン生成抑制剤として用いられていたが、本発明により、ァスコルビン m¾び/ ^又はァスコルビン酸誘 ¾#¾s、チロシナーゼ活性 ί®ι作用及びメラニン産生 I作用を^ τることがらかとなつた。また、ァスコルビン酸及び z又はァスコルビン酸誘^:は、安価で纖することができ、娃性も高い。

該性質を有するァスコルビン酸及び z又はァスコルビン酸誘導体を有カ成分とする本発明のチロシナ一ゼ活性吸ぴ箭 jを含 ¾ る外用剤は、 ^^生がぐ安すること力き、優れたチロシナ一ゼ性化作用及びメラニン; ¾ί®ι作用を奏するものである。

本発明のチロシナ一ゼ活性腿剤及び該鍵剤を含 ¾ る外用剤は、ィ匕粧品や医薬分野において有用に麵すること力き、例えば、白髪防 ihXは白髪改善のための疆用纖 I仅〖用剤、或いは、颇黒ィは^) »の抗白斑治療のための贿用飄 i仅〖用剤などとして、利用できる。また、本発明においては、水酸基を^ Tる化合物も原料に用いることができ、しかも収率の高い、エステル化物の酵素的法が見出された。

徹の酵素的エステル交蔽応は、主に性有觀媒中で行われていたが、本発明において、特定の酵素を用いることにより、 DM S O等の非プロトン性有嫌媒中で酵素によるエステル化が可能になることが見出された。このため、 7嫩基を^ る化合物を ¾τる化合物カ缟ぃ溶解 I生を; る溶媒中で、該化合物を原料に用いて、高い収率でエステル化物を得ることカ坷能になつた。

また、本発明のエステル化物の srn^法において、 ζ酸基をる化合物としてショ糖を用いることにより、ショ糖の 2位のフ嫩基力■的にエステル化されたエステル化物が得られることが明らかになつた。

縣、ショ糖脂薩エステルは、位、 6位、 6 ' 位の及水酸基がエステル化したモノ、ジ、トリエステル化合物の混^/として主に得られていたが、本発明を用いれば、 2位の∑¾7撤基のみ力戦的に舰されたショノエステル化合物を高謎 ¾ί辱することが^となる。

本発明の法を用いて得られるショ糖エステル化合物は、 HW生カ缟く、可溶ィ匕性、乳化性、 '朥において優れた特 f生を^ τるものであり、食品、化ロロ、シャンプ一、リンス、医薬、洗浄剤などの分野における乳イ^!や界面活^!』等として ¾iに用いること力きる。

本発明のエステル化物の織方法は、棘性有猶媒には溶けにくい τ酸基を ¾ る化合物を原料に用いるエステル化物の織、並びに、ィ匕学合成が灘しく、酵素による應的な反応が求められるエステル化物の織において、特に優れた手段を樹共するものである。

Claims

請求の範囲 l. -m: (1) で表されるアルブチンエステル化合物。

(1)

[式中、 Ra〖»性基を示す。 ]

2. (2) で表される請求項 1に記載のアルプチンェステル化合物。

(2)

[式中、は単^、ァレキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

3. -«； (3) で表される請求項 1に記載のアルブチンエステル化合物。

(3)

4. - ^ (4) で表される請求項 1に記載のアルブチンエステル化合物。 (4)

[式中、は単糸給、アルキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

5. ( 5) で表される請求項 1に記載のアルブチンエステル化合物。

-«： ( 5)

[式中、 R,は単！^、アルキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

6. (6) で表される請求項 1に記載のアルブチンエステル化合物。

-m (6)

[式中、は単齢、アルキレン基、又はァリーレン基を示す。 R₂はアルキル基、又はァリール基を示す。 ]

7. H¾ ( 7) で表される請求項 1に記載のアルブチンエステル化合物。

( 7 )

[式中、、 R₃、 R₄、 R₅はそれぞ姆結合、アルキレン基、又はァリ一レン基を示す。 Xは 1〜6の繰り返し単位を示す。 ]

8. H« (8) で表される請求項 1に記載のアルブチンエステル化合物。

-« (8)

[式中、は単!^、アルキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ] 9. (9) で表される請求項 1に記載のアルブチンエステル化合物。

-m,

(9)

CH OCO-R_rC₆H₅

Ό、

OH 、0- Η

ΟΗ

[式中、 R,は単!^、アルキレン基、又はァリーレン基を示す。 ] 10. (10) で表される請求項 1に記載のアルブチンエステル化合物。

(10)

中、は単!^、アルキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

1 1 · 請求項 1〜： L 0のいずれかに記載のアルブチンエステル化合物の 1 S は 2 種以上を^)^^とするチロシゼ阻豁! I。

1 2. 請求項 1 1に記載のチロシ:^ゼ阻^^を含る^ J»外用剤。

1 3. 下記 ~«式（1 1) 〜（1 9) のいずれかで表されるカルボン酸類と、アルブチンとを、エステ M ^させる工程を ¾ るアルブチンエステル化合物の Sit^法。

(1 1)

A-OCO-R_rCH=CH₂

[式中、 A «ζΚ素、置^ Xは非織のアルキル基又はビニル基を示す。 R_Lは単^^、ァリレキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

( 1 2)

A-OCO-R_rC(CH₃)=CH₂

中、 A wm, 置は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。は単給、ァレキレン基、又はァリーレン基を示す。 ]

(1 3)

A-OCO-R_rCOOCH=CH₂

中、 A お _K素、置は非纖アルキル基又はビニル基を示す。 R,は単^^、アルキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ] H¾ ( 1 4)

A-OCO-RrCOOH

中、 A〖お素、置は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。 R_Tは単!^、ァリレキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

(1 5)

A-OCO-R_rCOO-R₂

中、 A〖¾素、置は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。 R_Tは単給、ァルキレン基、又はァリーレン基を示す。 R₂はアルキル基、又はァリール基を示す。 ]

H¾ (1 6)

A-OCO-Rr [- R₃-CH=CH-R₄-]x -R₅-CH₃

中、 A Wm, 置は非置換のアルキル基又はビエル基を示す。、 R₃ 、 R₄ 、 R ₅はそれぞ姆、アルキレン基又はァリーレン基を示す。 Xは 1〜6の繰り返し単位を示す。 ]

(1 7)

A-OCO-R_rC(CH₃)₃

中、 A〖お K素、置は非置換のアルキル基又はビニル基を示す。 _Tは単!^、ァレキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

H¾ (1 8)

A-OCO-R_rC₆H₅

中、 A wm, 置は非藤のアルキル基又はビエル基を示す。 R_Tは単!^、ァリレキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

( 1 9)

A-OCO-R CH₃

[式中、 A SzK素、置は非置換のアルキル基又はビエル基を示す。 R,は単!^、ァルキレン基、又はァリ一レン基を示す。 ]

1 4. 酵¾«^¾下でエステル化反応させる請求項 1 3に記載のアルブチンエステル化合物の Si ^法。

1 5. ィ匕被下でエステル化反応させる請求項 1 3に記載のアルブチンエステル化合物の S¾ ^法。

1 6. エステル化跡させる工程が、 fi½7_麵を行いながらエステル ros;させるェ程である請求項 1 3に記載のアルブチンエステル化合物の^ 法。

1 7. エステル化 SiS 疆、エステル化夜中の未カルボン隠本を、非極 I生有猶媒を用いて抽出して分る工程、次いで、翻の水を加えて未跡アルブチンを抽出して分 it るともにアルブチンエステル化合物をさせる工程を衬る請求項 1 3に記載のアルブチンエステル化合物の ¾^法。

1 8. 下記 H« (2 0)

-«； (2 0)

[式中、 Rbは水素または一個の水酸基を除いたを示す。 ]

で表されるゥンデシレン酸またはその塩あるいはそのエステル誘 # ^ゝらなるチロシナ —ゼ阻

1 9. Rbが Η@のフ嫩基を除いた糖歹遠である請求項 1 8に記載のチロシ: ^ゼ阻翻。

2 0. Rbが水素であるゥンデシレン酸またはその塩からなる請求項 1 8に記載のチロシ^ _ゼ阻雄

2 1. 請求項 1 8に記載のチロシ^ "ゼ阻翻を含む外用剤。 2 2. 外用剤が美白化彼料である請求項 2 1に記載の外用剤。

2 3. ァスコルビン酸及び Z又はァスコルピン酸誘導体を有効成分とするチロシナ —ゼ活性腿 |J。 2 4. ァスコルビン酸 ^が、ァスコルビン翻旨肪酸エステル、ァスコルビン酸リン酸エステル又はその脂 JMエステル又はそれらの塩、ァスコルビン酸ダルコシド又はその脂膽エステル、及びプスコルビン酸鍾エステル又はその脂膽エステル又はそれらの^^らなる群から選ばれる少なくとも 1種である請求項 2 3に記載のチロシナ —ゼ活性腳】。

2 5. 請求項 2 3に記載のチロシナ一ゼ活性 ί腿 IJを含 # "る外用剤。

2 6. ««外用剤である請求項 2 5に記載の外用剤。 2 7. 用外用剤である請求項 2 5に記載の外用剤。

2 8. ァスコルビン酸及び Ζ又はァスコルビン酸誘導体の含有量が外用剤全体の 0 · 0 0 0 0 1- 1 0SM%である請求項 2 5に言 3載の外用剤。 2 9. チロシナ一ゼ活性促進剤がァスコルビン酸を有効成分とするチロシナ一ゼ活性 ί©^ι』であって、ァスコルビン酸有量力■剤全体の 0. 0 0 0 1〜1^*%である請求項 2 5に記載の外用剤。

3 0. チロシナーゼ活性促がァスコルピン酸リン酸エステル及びァスコルビン酸ダルコシドからなる群から選ばれる少なくとも 1種の化合物を^^とするチロシナーゼ活性 »^であって、該化合物の含有量が外用剤全体の。. 0 0 1〜1 0S»% である請求項 2 5に記載の外用剤。

3 1. チロシナ一ゼ活性促進剤がァスコルビン酸の脂肪酸エステル、アスコレビン酸リン酸ェステルの脂鍾エステル及びプスコルビン酸ダルコシドの脂璧エステルからなる群から選ばれる少なくとも 1種の化合物を^^とするチロシ:^ゼ活性 iSt 剤であって、該化合物の含有量が外用剤全体の 0. 0 0 0 0 1〜0. である請求項 2 5に記載の外用剤。

3 2. カンジダアンタークティカ（C a n d i d a a n t a r c t i c a) 由来のリバ—ゼタイプ Aの被下、非プロトン 1生有盤媒中で、 7嫩基を^ る化合物と脂

£¾ はその誘割本とをエステル化させるエステル化物の法。

3 3. 非プロトン 1生有嫌媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及びジメチルホルムアミドとジメチルホキシドとの混合溶猶ゝらなる群から選ばれるいずれかである請求項 3 2に記載のエステル化物の法。

3 4. 水酸基を ¾ る化合物が、糖類、ヌクレオシド類、糖アルコール類、及び水酸基を^るァミノらなる群から選ばれるは 2種以上である請求項 3 2に記載のエステル化物の i¾tm

3 5. 水醒をる化合物が糖類である請求項 3 4に記載のエステル化物の纖方法。

3 6. 水酸基を有する化合物がショ糖であって、エステル化物が下記一般式 (2 1) で表される化合物である請求項 3 2に記載のエステル化物の ϋ¾法。

-m. (2 1 )

(式中、 Rcは歸数 1〜2 4の脂應鐘を示す。 )