WO2004018664A1 - 核酸分析チップと核酸分析装置 - Google Patents

核酸分析チップと核酸分析装置 Download PDF

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acid analysis
culture
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Kenji Yasuda
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Japan Science And Technology Agency
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Definitions

  • the invention of this application relates to a nucleic acid analysis chip and a nucleic acid analyzer using the same. More specifically, the invention of this application relates to the field of biotechnology research using microorganisms and cells. The present invention relates to a new nucleic acid analysis chip capable of analyzing nucleic acid components and an analyzer using the same. Background art
  • the micro-chamber realized by the inventor of this application performs measurement while completely controlling the environment on a cell basis.
  • this is a culture technology that makes it possible, it is necessary to quantitatively measure the amount of expressed mRNA in cells in order to measure changes in cells such as response to drugs.
  • no nucleic acid analysis technology optimized for the system has been developed.
  • an object of the invention of this application is to provide a new technical means for analyzing a nucleic acid component of each cell cultured in a cell culture micro-champer based on the above background.
  • the invention of this application directly measures quantitative analysis of nucleic acid components of cells in each container in the cell culture micro-chamber developed by the inventors of the present application as described above.
  • a nucleic acid analysis chip having means for performing the above and a nucleic acid analyzer using the same.
  • the invention of the present application is, firstly, that a plurality of holes capable of completely enclosing a single cell are arranged as a culture vessel on a substrate, and an aqueous solution is left in each of these holes. It has an upper region that can be filled with a liquid having a lower specific gravity than the aqueous solution without mixing the upper part of the hole with the aqueous solution.
  • a nucleic acid analysis chip for performing analysis.
  • the invention of the present application provides a nucleic acid analyzer using a nucleic acid analysis chip, which comprises means for optically measuring each container in the microchamber, optical means, There is a means for heating the solution, a means for introducing the reaction solution into each container in the microchamber, a means for preventing the reaction solution in each container from diffusing and evaporating.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the basic configuration of the nucleic acid analysis chip of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of a device configuration for observing the nucleic acid analysis chip shown in FIG. 1 and locally heating the focused light.
  • the symbols in FIG. 1 indicate the following.
  • a nucleic acid analysis chip is capable of recovering a nucleic acid component from a hole after the introduction of a reaction solution.
  • Various forms such as a sealing material, for example, a semi-permeable membrane interposed between the and the upper region are adopted.
  • a semi-permeable membrane 107 is sealed on the upper surface of the substrate 101 so that the culture solution can be exchanged, and that the cells 103 do not escape from the container or contain impurities such as bacteria.
  • the cells can be continuously cultured in the same manner.
  • a lighter liquid for example liquid paraffin or silicone oil, is introduced into the upper region 105.
  • each container 102 is isolated by a liquid such as liquid paraffin.
  • the semi-permeable membrane 107 on the upper surface of the container 102 is broken using a micropipet 104 to introduce a PCR reaction solution.
  • a fluorescent dye that can optically measure the PCR reaction for example, Taq Man Probe (Amersham, USA), and nucleic acid quantitative measurement using the fluorescence energy transfer method Becomes possible.
  • the amount of fluorescence it is possible to measure the fluorescence collected by the objective lens 106.
  • it is possible to perform heating necessary for the PCR reaction by irradiating infrared light through the objective lens 106.
  • nucleic acid components recovered from each container 102 by micropipette 104 can be analyzed comprehensively and quantitatively using capillary electrophoresis. is there.
  • the PCR reaction can be performed by an existing heating / cooling device such as a thermal cycler.
  • FIG. 2 shows an example of the configuration of an apparatus of the cell culture microchamber 100 for heating the vessel 102 and introducing focused light for causing a PCR reaction.
  • cells in nucleic acid analysis chip 100 It has a microscope observation system for observing changes in the sample and the amount of fluorescence, and has an infrared focused light irradiation system for heating the aqueous solution in the container at the same time.
  • the nucleic acid analysis chip 100 is arranged on the optical path of the microscopic observation optical system.
  • the microscopic observation optical system has the following configuration.
  • the light emitted from the light source 201 is adjusted to a specific wavelength by the fill-in filter 202, collected by the condenser lens 203, and irradiated to the nucleic acid analysis chip 100.
  • the irradiated light is used for observation with an objective lens 205 as transmitted light.
  • the transmitted light image inside the nucleic acid analysis chip 100 passes through the filter 212 by the mirror 211, is guided to the camera 213, and forms an image on the light receiving surface of the camera. Therefore, it is desirable that the material of the chip 100 is a material that is optically transparent to the light having the wavelength selected by the filter 202.
  • glass such as borosilicate glass or quartz glass, resin or plastic such as polystyrene, or a solid substrate such as a silicon substrate is used.
  • a silicon substrate it is desirable to use light having a wavelength of 900 nm or more for observation.
  • the excitation light for fluorescence observation emitted from the light source 208 is guided to the objective lens 205 by the dichroic mirror 210 after the wavelength is selected by the filter 209. Used as excitation light for fluorescence observation inside the nucleic acid analysis chip 100.
  • the fluorescence emitted from the chip 100 is collected again by the objective lens 205, and only the fluorescence and transmitted light after the excitation light is turned on by the filter 212 can be observed with the camera 211. You.
  • the combination of the filters 202, 209, and 212 only the transmitted light can be observed with the camera 21 or only the fluorescent light, or the transmitted light image and The fluorescent image can be observed at the same time.
  • This laser light is focused by the objective lens 205, and can locally heat the nucleic acid analysis chip 100.
  • Focus point In the case of moving, by moving the movable dichroic mirror, it is possible to move the focusing position of the laser light in the nucleic acid analysis chip 100.
  • the wavelength of this laser beam is preferably a wavelength that has water absorption but has no photochemical action and has little absorption to the substrate. For example, in the case of light having a wavelength of 150 nm, laser light is effectively absorbed by water, and the reaction solution locally generates heat in the container in which the light is absorbed.
  • the image data obtained by the camera is analyzed by the image processing / analysis device 214, and the movable dichroic mirror 206 and the nucleic acid analysis chip 100 are mounted on the basis of various analysis results.
  • a stage movement motor 215 that can freely move in the X-Y direction can be driven.
  • the measurement is performed using one camera.
  • a change in the fluorescence intensity at at least one different wavelength is measured by adding a dichroic mirror. Quantitative analysis by the energy transfer method can be performed.

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Abstract

細胞培養マイクロチャンバー内の各培養容器102としての穴の中の細胞103の核酸成分の定量解析を直接的に行う手段として、マイクロチャンバー内の各容器102を光学的に計測する手段と、光学的に加熱する手段と、マイクロチャンバ中の各容器102に反応液を導入する手段と、各容器102内の反応液が拡散、蒸発しない手段を有するものであり、単一細胞培養マイクロチャンバー中で培養した各々の細胞の核酸成分を分析することを可能とする。

Description

核酸分析チップと核酸分析装置 技術分野
この出願の発明は、 核酸分析チップとこれを用いた核酸分析装置に関 するものである。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 微生物、 細胞を 用いたバイオテクノロジーの研究分野において、 特定の細胞を顕微鏡観 察しながら、 1細胞単位で培養する、 細胞培養マイクロチャンパ一内で 培養した細胞の核酸成分を分析することのできる、 新しい核酸分析チッ プとこれを用いた分析装置に関するものである。 背景技術
従来の生物学、 医学、 薬学の分野では、 細胞の状態の変化、 あるいは 細胞の薬物等に対する応答を観察するのに、 細胞集団の値の平均値をあ たかも一細胞の特性であるかの様に観察してきた。 しかし、 実際には細 胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、 各々の細胞 が異なった周期でタンパク質を発現している。 これらの問題を解決する ベく、 発明者らは、 新たに特定の一細胞のみを選択し、 その一細胞を細 胞株として培養する技術、 および細胞を観察する場合に、 細胞の溶液環 境条件を制御し、 かつ、 容器中での細胞濃度を一定に制御する技術、 あ るいは相互作用する細胞を特定しながら培養観察する技術を発明し特 願 2 0 0 0— 3 5 6 8 2 7として出願した。細胞の 1 細胞単位の計測は、 これによつて可能とされた。 発明の開示
しかしながら、 上記のとおりのこの出願の発明者によって実現された マイクロチャンバ一は、 1 細胞単位で完全に環境を制御しながら計測を 可能にする培養技術であるが、 薬物に対する応答など、 細胞の変化を計 測するためには細胞中の発現 m R N A量を定量的に計測する必要があ り、 この観点においては、 1細胞培養系に最適化された核酸分析技術は 開発されていないのが実情であった。
そこで、 この出願の発明は、 以上のとおりの背景に基づいて、 細胞培 養マイクロチャンパ一中で培養した各々の細胞の核酸成分を分析する 新しい技術手段を提供することを課題としている。
この出願の発明は、 上記の課題を解決するために、 上記のとおりのこ の出願の発明者らが開発した細胞培養マイクロチャンパ一内の各容器 中の細胞の核酸成分の定量解析を直接計測する手段を有する核酸分析 チップとこれを用いた核酸分析装置を提供する。
すなわち、 この出願の発明は、 第 1には、 基板上に、 単一の細胞を完 全に封入することが可能な穴が培養容器として複数配置され、 この各々 の穴に水溶液を残しながら、 穴の上部を水溶液と混合することなく、 し かも水溶液より比重の軽い液体で満たすことのできる上部領域を有し、 前記の穴には反応液が導入可能とされて、 光学的に細胞の核酸分析が行 われるようにした核酸分析チップを提供する。
また、 第 2には、 この出願の発明は、 核酸分析チップを用いた核酸分 析装置を提供し、 この分析装置は、 マイクロチャンバ一内の各容器を光 学的に計測する手段や、 光学的に加熱する手段、 マイクロチャンバ中の 各容器に反応液を導入する手段、 各容器内の反応液が拡散、 蒸発しない 手段等を有する。 図面の簡単な説明
図 1は、 この出願の発明の核酸分析チップの基本構成の一例を示す模 式図である。
図 2は、 図 1で示した核酸分析チップを観察し集束光局所過熱する装 置構成の一例を示す模式図である。 なお、 1図中の符号は次のものを示す。
1 0 0 核酸分析チップ
1 0 1 光学的に透明な基板
1 0 2 培養容器
1 0 3 細胞
1 0 4 マイク口ピぺット
1 0 5 上部領域
1 0 6 対物レンズ
1 0 7 半透膜
2 0 1 光源
2 0 2 、 2 0 9、 2 1 2 フィルタ、
2 0 3 コンデンサレンズ
2 0 4 温調機能付ステージ
2 0 5 対物レンズ
2 0 6 可動ダイクロイック · ミラ
2 0 8 光源
2 1 0 タイク ΠΠイツク · ミラー
2 1 1 ミラー
2 1 3 カメラ
2 1 4 画像処理解析装置
2 1 5 ステージ移動用モーター 発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、 その実施 においては、 たとえば、 核酸分析チップは、 反応液の導入後に穴から核 酸成分の回収可能とされていることや、 穴と上部領域との間にはシール 材、 たとえば半透膜が介在されている等の様々な形態が採用されること になる。 まず、この出願の発明の核酸分析チップの基本構成の一例を図 1 の実 施例を用いて説明する。 核酸分析チップ 1 0 0の基本構成は、 前記細胞 培養マイクロチャンパと同一である。 すなわち、 光学的に透明な基板 1 0 1に複数の細胞培養容器 1 0 2が構成されており、 各容器 1 0 2中に、 細胞 1 0 3を入れて培養することができる。 この基板 1 0 1の上面には 半透膜 1 0 7がシールされており、 培養液の交換が可能であり、 また、 細胞 1 0 3が容器から逃げたり、 バクテリア等の不純物が混入しないよ うにしながら細胞を連続培養することができる。 培養中に、 細胞内の核 酸成分の情報を明らかにする場合には、 前記容器 1 0 2の上面にある培 養液をすベて除去し、 その部分に水溶液と混ざらず、 かつ、 水より比重 の軽い液体、 たとえば流動パラフィンやシリコンオイルを上部領域 1 0 5に導入する。 すると流動パラフィン等の液体によって各容器 1 0 2は 隔離される。 その状態でマイクロピぺット 1 0 4を用いて前記容器 1 0 2上面の半透膜 1 0 7を破って P C R反応液を導入する。 ここには、 例 えば光学的に P C R反応を計測できる蛍光色素、 たとえば T a q M a n P r o b e (アマシャム、 U . S . A . ) を加えることでと蛍光ェメル ギー移動法を利用した核酸定量計測が可能となる。 蛍光量の計測を行う 場合には、 対物レンズ 1 0 6で集光された蛍光を計測することが可能で ある。 また、 各容器を加熱するためには、 対物レンズ 1 0 6を通じて赤 外光を照射することで P C R反応に必要な加熱をすることが可能であ る。 また、 未知の核酸成分の解析には、 マイクロピペット 1 0 4によつ て各容器 1 0 2から回収した核酸成分を、 キヤピラリー電気泳動を用い て網羅的かつ定量的に解析することも可能である。 この場合には、 核酸 分析チップを光学的に加熱する必要は無いので、 サーマルサイクラ一な ど既存の加熱冷却装置によって P C R反応を行うことができる。
図 2は、 細胞培養マイクロチヤンバー 1 0 0の、 容器 1 0 2を加熱し て P C R反応を起こすための集束光を導入するための装置の構成の一 例を示したものである。 この装置では核酸分析チップ 1 0 0中の細胞等 の試料や蛍光量の変化を観察するために、 顕微鏡観察系を有し、 また、 同時に容器中の水溶液を加熱させるために赤外集束光照射系を有して いる。 図 2からもわかるように顕微観察光学系の光路上に核酸分析チッ プ 1 0 0を配置することになる。 まず、 顕微観察光学系は、 以下のよう な構成になっている。 光源 2 0 1から照射された光は、 フィル-夕一 2 0 2で特定の波長に調整され、 コンデンサレンズ 2 0 3によって集光され て、 核酸分析チップ 1 0 0に照射される。 照射された光は、 透過光とし て対物レンズ 2 0 5での観察に用いられる。 核酸分析チップ 1 0 0内部 の透過光像は、 ミラ一 2 1 1によってフィルタ 2 1 2通過後、 カメラ 2 1 3に誘導され、 カメラの受光面に結像する。 従って、 チップ 1 0 0の 素材は、 フィルタ 2 0 2で選択された波長の光に対して、 光学的に透明 な素材であることが望ましい。 具体的には、 ホウケィ酸ガラス、 石英ガ ラス等のガラスや、 ポリスチレン等の樹脂やプラスチック、 あるいはシ リコン基板等の固体基板を用いる。 また特にシリコン基板を用いる場合 は波長 9 0 0 n m以上の波長の光を観測に用いることが望ましい。
そしてまた、 光源 2 0 8から照射された蛍光観察用励起光も、 フィル 夕一 2 0 9で波長選択された後に、 ダイクロイツク 'ミラー 2 1 0によ つて対物レンズ 2 0 5に誘導され、 核酸分析チップ 1 0 0内部の蛍光観 察の励起光として用いられる。 チップ 1 0 0から発した蛍光は再度対物 レンズ 2 0 5によって集光され、 フィルター 2 1 2によって励起光を力 ットした後の蛍光と透過光のみをカメラ 2 1 3で観察することができ る。 このとき、 フィルタ一 2 0 2、 2 0 9、 2 1 2の組み合わせを調整 することで、 透過光のみをカメラ 2 1 3で観察したり、 あるいは蛍光の みを観察したり、 透過光像と蛍光像を同時に観察することもできる。 光 路内には、 赤外レーザー光源 2 0 7で発生させたレーザー光を可動ダイ クロイツク 'ミラ一 2 0 6によって対物レンズ 2 0 5に導入する機構も 備わっている。 このレーザー光は対物レンズ 2 0 5によって集束光とな り、 核酸分析チップ 1 0 0を局所的に加熱することができる。 集光点を 移動させる場合には、可動ダイクロイック ·ミラ一を移動させることで、 核酸分析チップ 1 0 0内でのレーザー光の集束位置を動かすことが可 能である。 このレーザ一光の波長としては、 水の吸収を持つが、 光化学 作用を持たず、 かつ、 基板への吸収が少ない波長が望ましい。 たとえ 1 5 0 0 n mの波長の光などでは、 水で効果的にレーザー光吸収が起こり、 光が吸収された容器内で反応液が局所的に発熱する。
また、 カメラで得られた画像データは画像処理解析装置 2 1 4によつ て解析され、 さまざまな解析結果を基に可動ダイクロイツク ·ミラー 2 0 6や、 核酸分析チップ 1 0 0が載っている温調機能付可動 X Yステー ジ 2 0 4の位置を制御するために X— Y方向に自在に移動させるステ ージ移動用モータ一 2 1 5を駆動することが出来る。 また、 この温調装 置でチップ全体を P C R反応させることも可能である。
なお、 以上の実施例では 1つのカメラを用いて計測を行っているが、 この出願の発明では、 たとえば、 ダイクロイツクミラーを加えて少なく とも異なる 1 波長での蛍光強度の変化を計測することで、前記エネルギ 一移動法による定量解析を行うことができる。
もちろん、 この出願の発明は以上の例示に限定されることなくその構 成の細部において様々な形態が可能であることは言うまでもない。 産業上の利用可能性
以上記述したように、 この出願の発明によって、 単一細胞培養マイク 口チャンパ一内で培養した各々の細胞の核酸成分の解析が可能となる。

Claims

請求の範囲
1 . 基板上に、 単一の細胞を完全に封入することが可能な複数の穴が 培養容器として配置され、 この各々の穴に水溶液を残しながら、 穴の上 部を水溶液と混合することなく、 しかも水溶液より比重の軽い液体で満 たすことのできる上部領域を有し、 前記の穴には反応液が導入可能とさ れて、 光学的に細胞の核酸分析が行われるようにしたことを特徴とした 核酸分析チップ。
2 . 反応液の導入後に穴から核酸成分の回収が可能とされていること を特徴とする請求項 1の核酸分析チップ。
3 . 培養容器としての穴と上部領域との間には穴への反応液の導入、 さらには穴からの核酸成分の回収が可能とされるシール材が介在され ていることを特徴とする請求項 1または 2の核酸分析チップ。
4 . シール材は、 培養液の交換が可能とされる半透膜であることを特 徴とする請求項 3の核酸分析チップ。
5 . 請求項 1ないし 4のいずれかの核酸分析チップを用いる核酸分析 装置であって、 培養容器としての穴での反応を光学的に計測する手段を 備えていることを特徴とする核酸分析装置。
6 . 特定の波長の蛍光量の変化を計測する手段を備えていることを特 徴とする請求項 5の核酸分析装置。
7 . 水の吸収があり、 容器中の水溶液を加熱することが可能である波 長の集束光を照射する手段を有することを特徴とする請求項 5または 6の核酸分析装置。
8 . 穴に反応液を導入する手段と穴から核酸成分を抽出する手段とを 有することを特徴とする請求項 5ないし 7のいずれかの核酸分析装置。
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