WO2004011493A1

WO2004011493A1 - Facteur de transcription de type bzipm du mais et gene codant, et utilisation de ceux-ci

Info

Publication number: WO2004011493A1
Application number: PCT/CN2003/000599
Authority: WO
Inventors: Jun Zhao; Lei Wang; Yunliu Fan
Original assignee: Institute Of Biotechnology, The Chinese Academy Ofagricultural Sciences
Priority date: 2002-07-30
Filing date: 2003-07-28
Publication date: 2004-02-05
Also published as: CN1273483C; CN1296382C; US20080060098A1; US7323339B2; AU2003257774A1; CN1472223A; US20080060097A1; US20060021091A1; CN1671738A

Description

玉米 bZIP类转录因子及其编码基因与应用技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中的转录因子及其编码基因与应用，特别是玉米 bZIP类转录因子、及其编码基因与应用。

背景技术

在干旱、高盐和低温等非生物逆境条件下，植物并不仅仅是被动的接受，而是积极地调动体内的防卫体系来对抗外来的逆境，这时在植物体内发生很多变化，如新蛋白质的合成，代谢的转变，抗逆境物质的积累等等（Hans J. Plant cell. 1995, 7: 1099-1111 )。其中很多蛋白参与了植物对非生物逆境的反应 (Ashwani Pareek. Current Science. 1998, 75: 1170-1174), 它们协同调节植物生理生化以及代谢的变化，提高植物对非生物逆境的抗性。研究表明植物对非生物逆境的抵抗并不是依靠某一两个功能基因就能成的。

在非生物逆境条件下，植物体内被诱导产生的蛋白中有许多与植物抗逆境密切相关，其中的一些蛋白的编码基因已被克隆（Anil Grover. Current Science. 1998, 75: 689-695 )。为了提高植物的抗寒、抗旱和抗盐等非生物逆境的能力，许多其它不同来源的抗逆相关基因被克隆，并转化到植物中 ( Shavindra Bajaj. Molecular Breeding. 1999, 5:493-503 )。其编码的蛋白可分为三类： 1 )合成渗透调节因子的酶类：如向烟草转入来自 Ε· coli的 t/Z)基因，可提高植物的甘露醇含量；向烟草、水稻转入 P5CS，可提高植物的脯氨酸含量；向拟南芥、水稻转入 coi¾，可提高植物甜菜碱的含量 (Sakamoto A. PMB. .1998,38: 1011-1019) ο. 2 ) UEA_及其相关蛋白：.如向 ¾窗芥转—入 corl5a ¾@ (Steponkus PL. PNAS. 1998, 95: 14570-14575)。 3 )氧化逆境相关蛋白：如向苜蓿中转入 Mn-SOD(Mckersic BD. Plant Physiol. 1999,111 : 1177-1181)；向烟草中转入 GST。这些功能基因转入到植物体后，在实验室条件下，植株在某一方面的抗逆性有所提高，但所取得的效果并不理想。最近，有人向拟南芥中转入抗逆相关的转录因子 CBFl(C-repeat Binding Factor)的基因， CBF1可调控一系列抗寒相关基因的表达，与上述单功能基因相比， CBF1明显提高拟南芥的抗寒性能 (Kirsten R. Science. 1998, 280:104-106)。同样，向拟南芥转入 DREB1A因子的基因，可调控与抗非生物逆境相关的多个基因的表达，明显提高了植株的抗盐、抗寒、抗旱的能力 (Mie Kasuga. Nature Biotechnology. 1999,17: 287- 291)。

已有研究表明在干早、盐渍和低温等逆境条件下，植物体内会产生大量的活性氧，形成氧化逆境 (Zhu J K.. Trends Plant Sci. 2001,6:66-71 )。由于活性氧具有非常活泼的化学性质，它会对细胞造成严重的伤害，如损伤细胞膜、使重要的酶类失活及 DNA断裂等，因此活性氧的及时清除对植物抗非生物逆境能力的提高具有重要意义。在活性氧的清除过程中，过氧化氢酶 CAT1 起着重要作用，但在逆境条件下，植物本身的抗氧化***受诱导表达的能力比较弱，不能及时地清除体内的活性氧，影响了植物抗逆性的进一步提高。因此，克隆调控 Catl表达的转录因子编码基因不仅有助于对 ROS信号传导路径的理解，而且对培育具有抗旱、抗盐、抗寒等逆境能力的作物具有重要的指导意义，因为这样的反式因子不仅能够调控 C«t7基因的表达，还能调控其它一系列的抗氧化基因和抗非生物逆境基因的表达。

ABRE是存在于许多逆境响应基因启动子区的 ABA 响应元件（ABA Responsive elelment) , 其特征序列是 (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C) (Chen WQ. Plant Cell. 2001,14:559-574)。 Catl基因的启动子区含有与逆境相关的重要的顺式调控元件 AJBRE1 和 ABRE2 ，缺失分析表明 ABRE2 (5'-GAAGTCCACGTGGAGGTGG)是 Catl基因响应 ABA调控所必需的顺式元件。在玉米幼胚的发育过程中，随着 ABA含量的升高，基因的表达也随之增强。胚发育的过程就是有机物质不断积累、细胞不断脱水的过程，也是细胞抗逆境能力不断提高的过程。研究表明在玉米幼胚的发育过程中，细胞中存在着能够与 ABRE2相互作用的反式因子，可分为两类：一类是依赖于 ABA的能够与 Catl基因 ABRE2元件相互作用的反式因子（命名为 Catl promoter Binding Factor 1, CBF1 )，另一类是不依赖于 ABA的能够与 Catl基因 ABRE2元件相互作用的反式因子（命名为 Catl promoter Binding Factor 2, CBF2 ) (Lingqing M. Guan. The Plant Journal. 2000, 22(2):87-95 )。目前还没有关于这两类重要调控因子的报道。

发明公开

本发明的目的是提供玉米 bZIP类转录因子及其编码基因。

本发明所提供的玉米 bZIP类转录因子来源于玉米，分别命名为 ABRE 结合蛋白 ABP2、 ABP4、 ABP9 (ABRE Binding Protein), 它们分别是具有序列表中序列 2、 4、 6的氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列 2、 4、 6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列 2、 4、 6的氨基酸残基序列相同活性的由序列 2、 4、 6衍生的蛋白质。

ABP2优选的是具有序列表中序列 2氨基酸残基序列的蛋白质，由 351个氨基酸残基组成。

ABP4优选的是具有序列表中序列 4氨基酸残基序列的蛋白质，由 360个氨基酸残基组成。 .

ABP6优选的是具有序列表中序列 6氨基酸残基序列的蛋白质，由 385个氨基酸残基组成。

把本发明所得到的 ABP2、 ABP4、 ABP9的蛋白序列输入到 GenBank中进行 BLAST分析，结果表明 ABP2、 ABP4、 ABP9属于 bZIP类转录因子，与已报道的 bZIP类转录因子相比， ABP2、 ABP4、 ABP9与它们之间的同源性均很低。

本发明以 Not I adapter: 5 ' -pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCC C(T)₁₅-3' 为引物构建了玉米授粉后 17天（17dpp)幼胚的 cDNA文库，该文库的库容量为 5.2 X 10⁶ cfo。

本发明设计合成了下述引物：

用于反转录的引物： ABP2 rv2: 5 '-GCG ACA GCG ACG ACA GAT CA-3 '

ABP4 rv2: 5'-AGC GCC AGAAGC GGA GGC CA-3' ABP9 rv2: 5'-CCT TCA CCA GGAAGT CCT CCA-3' 用于 PCR的引物： AUAP fw: 5，-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3，

ABP2 rv3： 5，-AGG AAC TCC TCC AGA GTC AT-3 ' ABP4 rv3： 5' -TCG TCG AAC GTC AAC GAG TAG -3 ' ABP9 rv3: 5' -AAC CAA TCC TCC GTT CTC ACC-3' 通过 RT- PCR及 RACE方法从玉米幼胚中克隆玉米 bZIP类转录因子基因。玉米 bZIP类转录因子 ABP2、 ABP4、 ABP9的编码基因 ABP2、 ABP4、 ABP9, 分别是与序列表中 SEQ ID No _: 1、 3、 5限定的 DNA序列具有 90 %以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 D 序列。

优选的是序列表中序列 1的 DNA序列，由 1485bp碱基组成，该基因的读码框为自 5' 端第 114位到第 1056位碱基的 DNA序列。 ^9 ¾优选的是序列表中序列 3的 DNA序列，由 1835bp碱基组成，该基因的读码框为自 5' 端第 93位到第 1175位碱基的 DNA序列。

^^P 优选的是序列表中序列 5的 DNA序列，由 1510bp碱基组成，该基因的读码框为自 5' 端第 45位到第 1202位碱基的 DNA序列。

将所克隆的 ABP2、 ABP4、 ABP9基因分别构建到酵母表达载体 pPC86 上，研究了 ABP2、ABP4、ABP9与 ABRE的体内结合特异性，结果表明 ΑΒΡ2、 ΑΒΡ4、 ^ΒΡΡ基因产物在酵母体内具有 ABRE结合特异性。

将所克隆的 ABP2、ABP4 S ^基因分别构建到原核表达载体 pGEX4T-l 上，研究了 ABP2、ABP4、ABP9与 ABRE的体外结合特异性，结果表明 ABP2、 ABP4、 ^BRP基因产物在体外具有 ABRE结合特异性，能够特异作用于含有核心元件序列为 (C/G/T) ACGTG (G/T) (A/C)的 ABRE顺式元件。

将所克隆的 ^SP2、 ABP4、 ^SRP基因分别构建到酵母表达载体 YepGAP 和植物表达载体 pBI121上，研究了 ABP2、 ABP4、 ABP9在酵母体内和玉米细胞中的 ABRE结合特异性及转录激活功能。结果表明^ δΡ2、 ΑΒΡ4、 ΑΒΡ9 基因产物在酵母和玉米悬浮细胞中均具有 ABRE 结合特异性和转录激活功能。因此， ABP2、 ABP4 , ^SPP基因产物是具有 ABRE结合特异性和转录激活功能的转录因子。且^^ P2、 ABP4, 基因受到盐、干旱、过氧化氢、

ABA等逆境条件的诱导表达。

把 ABP2、 ABP4, ABP9基因构建到植物转化载体 pBI121及 pZP212上得到 pZP212-ABP2、 pZP212-ABP4、 pBI121-ABP9, 并转化到农杆菌中，用农杆菌转化拟南芥并获得了转基因植株。对转基因植株在不同的逆境条件下进行处理，结果证明^ δΡ2、 ΑΒΡ4、 ^δΡΡ能够提高转基因植物的抗寒、抗盐和抗旱等非生物逆境的能力。

含有本发明 ^^2、 ΑΒΡ4 , ^ΒΡΡ基因的表达载体和细胞系，以及含有该类基因的抗非生物逆境植物品种均为本发明的保护范围。

本发明成功地从玉米中分离、克隆到了具有 ABRE结合特异性的转录调控因子的编码基因 ABP2、 ABP4、 ABP9, 不仅有助于对 ROS信号传导路径的理解，而且对培育具有抗旱、抗盐、抗寒等逆境能力的作物具有重要的指导意义。由该类基因表达的调控因子可作用于多个抗非生物逆境相关基因启动子区的 ABRE顺式作用元件，调控抗非生物逆境相关基因的表达，提高植物对非生物逆境的抵抗能力。

附图说明

图 1为酵母的生长情况，显示 ABP2、 ABP4、 ABP9与 ABRE的体内结合特异性。

图 2为非变性聚丙烯酰胺电泳图谱，显示 ABP2、 ABP4、 ABP9与 ABRE的体外结合特异性。

图 3为酵母的生长情况，显示 ABP2、 ABP4、 ABP9在酵母体内的 ABRE 结合特异性及转录激活功能。 .

图 4为转化的玉米悬浮细胞，显示 ABP2、 ABP4、 ABP9在玉米细胞中的 ABRE结合特异性及转录激活功能。

图 5为 PCR结果的电泳图谱，显示 ABP2、 ABP4、 ABP9在盐、干旱、过氧化氢、 ABA、低温等逆境条件下的表达。

图 6为 ABP2、 ABP4、 ABP9转基因表达载体的构建示意物理图谱。图 7为转 ABP2、 ABP4、 ABP9基因拟南芥的抗盐试验结果。 .

图 8为转 ABP2、 ABP4、 ABP9基因拟南芥的抗寒试验结果。

图 9为转 ^δΡ2、 ΑΒΡ4、 ^δΡΡ基因拟南芥的抗旱试验结果。

实施发明的最佳方式

实施例 1、玉米 bZIP类转录因子编码基因的克隆与筛选

材料与方法

1 ) 玉米材料：玉米选用齐 319授粉后 17天（17dpp) 的幼胚。

2 )菌种：大肠杆菌£ ^' 011501， DH10B、 JM109及酵母菌株 yWAM2 (Leu",His",Trp") o

3 ) 载体： pBSK+、 pRS315及 pPC86。

4 ) 工具酶和修饰酶：各种限制性内切酶和修饰酶购自 Promega公司， New England Biola 公司和 Gibco公司。

5 ) 化学试剂：酵母培养用试剂均购自 Sigma公司和 Oxford公司；其它化学药品均为国产分析纯。

6 )试剂盒：质粒 DNA提取用 Promega公司的 Wizard™ Minipreps DNA Purification System和 Wizard™ Maxipreps DNA Purification System; 回收 DNA用鼎国公司的 DNA片段快速纯化 /回收试剂盒； RNA提取用 Promega 公司的 RNAgents Total RNA Isolation System kit 和 PolyATtract mRNA Isolation System; 文库构建用 GibcoBRL公司的 Superscript™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning kit。

7 )引物合成：由北京赛百盛生物工程公司和上海博亚生物技术有限公司合成。

8 ) 测序：由上海博亚生物技术有限公司完成。

实验步骤

1 ) 总 RNA的提取和 mRNA的分离：

总 RNA的提取和 mRNA的分离分别按 Promega公司的 RNAgents Total RNA Isolation System kit和 PolyATtract mRNA Isolation System进行。取玉米 17dpp幼胚 lg，提取总 RNA 2.834mg，共分离出 mRNA 43.7 μ g。取玉米 21dpp 幼胚 lg，提取总 RNA 2.427mg，共分离出 mRNA 41.6 μ g。

2 ) 玉米幼胚 17dpp、 21dpp cDNA文库的构建：

按 GibcoBRL公司的 Superscript™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning kit进行。取出 5 μ g 17dpp的 mRNA用于 cDNA文库构建，反转录引物用：

Not I adapter: 5'-pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)₁₅-3' , 双链合成后加 Sa/ 1 adapter: 5'-TCGACCCACGCGTCCG-3 '；

3'-GGGTGCGCAGGCp-5'；

再用 Not I酶切，构建到经 Sal I和 Not I酶切纯化后的 pPC86载体上

(Trp⁺) o 转化 E.coli. DH10B , 得到库容量为 5.2 X 10⁶ cfu的 cDNA文库。

3 ) cDNA文库的扩增：

配 2 X LB培养基 4L(Bacto-胰蛋白胨， 20g/L, Bacto-酵母膏 10g/L， NaCl 10g/L, SeaPrep 琼脂糖 3g/L， H 7.0)， 121 °C灭菌 30min后， 37°C温育 2小时；加入氨苄青霉素至终浓度 200mg/L_; 加入文库至 10⁶ cfb/L_; 混匀后，分装 20~30mL到 50mL的培养管中；冰浴 1小时； 30°C培养 40小时； 8000rpm 离心 10min，收集菌体；弃上清，加入 200mL 2 XLB (含甘袖 12.5%)悬浮细胞，分装成 10mL—份于 -70Ό保存备用。

4) 4mer ABRE诱饵载体及 4mer mutant ABRE (mABRE) 挽救载体的构建合成引物 ABRE(+): 5'GAAGTCCACGTGGAGGTGG3' 和 ABRE(-): 5 CCCACCTCCACGTGGACT3'，各取 20 μ 1(1 μ g/ μ 1)的 ABRE(+)和 ABRE(-), 混匀，加 4 μ 1 3M的 NaOAc和 100 μ 1的无水乙醇， -20°C， 30分钟后 12000 rpm离心，沉淀 DNA， 70%乙醇洗一次，干燥，力 Π 6.5 μ 1无菌水， 1 μ 1 10 X的 Τ4 多核苷酸激酶缓冲液，退火：条件是 88°C， 2min; 65 °C， lOmin; 37°C， lOmin; 25 °C , 5min; 力卩 1.5 μ 1 20mM的 ATP和 1 μ 1 T4 多核苷酸激酶， 37°C反应 2小时，加苯酚一氯仿和氯仿各抽提一次,用无水乙醇沉淀 DNA。再加 2 μ 1 10 X 连接酶缓冲液， Ι μ ΐ连接酶 (5units/ w l)， 17 μ 1无菌水， 16°C 连接过夜，用 2%的琼脂糖电泳，分离大小约为 80bp的 DNA片段，克隆到 pBSK+载体上 (经 S e l 酶切，补平)，测序，获得 pA4质粒。

合成引物 mABRE(+): 5'-GAAGTAACATGTTCGGTGG-3'；

mABRE (-)： 5' TCCCACCGAACATGTTACT 3'，方法同上，获得 pmA4质粒。

pRS315His(Leu+)载体及 pA4和 pmA4质粒均用 BamIH、 Xba I双切后纯化，把 4mer ABRE 和 4mer mABRE 克隆到 pRS315His，得到诱饵载体 pRSA4(Leu⁺)和挽救载体 pRSmA4(Leu+)质粒。

5 ) 玉米幼胚 17dpp cDNA文库的筛选：

制备 yWAM2感受态细胞，把 pRSA4转化到酵母菌株 yWAM2 LeiT, His―， Trp_)中，转化方法参照 Two Hybrid System TRAFO Protocol进行。获得含有 pRSA4的酵母菌株 yA4(His'， Trp')。用含有诱饵载体的 yA4酵母对文库进行筛选，转化方法同上，将转化细胞涂到 1¾_选择培养基上， 28°C培养 3~5天。待酵母长出后，提酵质粒，提取方法参照 Method I: Quick Plasmid DNA Preparations from Yeast(Christine Guthrie 1991)。将酵母质粒转化 Co/ζ· DH5 α，从中提取质粒，酶切分析，测序可知所获得的阳性克隆的 DNA序列，再对序列进行分析。

6) ABP2、 ABP4、 ^B ^全长 cDNA序列的获得：

采用 5'RACE的方法得到了 ABP2、ABP4、ABP9基因的全长 cDNA序列，按 GibcoBRL公司 5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version2.0 kit操作。

用于反转录的引物: ABP2 rv2: 5'-GCGACAGCGACGACAGATCA-3 '

ABP4 rv2: 5 ' - AGCGCC AGAAGCGGAGGCC A-3 ' ABP9 rv2: 5 ' -CCTTC ACC AGGAAGTCCTCC A-3 ' 用于 PCR的引物： AUAP fw: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3 '

ABP2 rv3: 5 '-AGGAACTCCTCCAGAGTCAT-3 '

ABP4 rv3: 5 ' -TCGTCGAACGTCAACGAGTAG -3' ABP9 rv3: 5'-AACCAATCCTCCGTTCTCACC-3'

PCR条件是： 94°C， 3min; 94 °C , 30sec; 60V , 30sec; 72°C,lmin, 35个循环； 72°C， 5min。把扩增出 DNA片段用 1 %的琼脂糖胶分离、回收并连接到 pGEM-T easy vector, 转化 co/ . JM109, 酶切鉴定后测序，获得 ABP2, ABP4 , ^B P基因的全长 cDNA序列，分别为序列表中的序列 1、 3、 5，根据 cDNA序列推测出其蛋白序列为序列 2、 4、 6。

实施例 2、 ABP2、 ABP4、 ABP9的 ABRE体内结合特异性分析将 yA4和 ymA4转化到 yWAM2酵母中，得到 yA4和 ymA4菌株，把筛库得到的 ABP2、 ABP4、 ABP9质粒分别转化 yA4和 ymA4酵母， 28°C在 His— 选择培养基上培养 3~5天，只有用 ABP2、 ABP4、 ABP9质粒转化的 yA4酵母能够生长，而 ABP2、 ABP4、 ABP9质粒转化的 ymA4酵母不能够生长，说明 ABP2、 ABP4、 ABP9在酵母体内能够特异结合 ABRE元件，激活了报告基因 H/S3基因的 *达，故能够在选择培养基上生长 (图 1B)，相反由于 ABP2, ABP4、 ABP9不能与 mABRE结合，不能激活报告基因 H/S3基因的表达，在 His_选择培养基上也不能生长 (图 1A)，因此， ABP2、 ABP4、 ABP9 在酵母体内具有 ABRE结合特异性。

实施例 3 . ABP2, ABP4、 ABP9.的 ABRE体外结合特异性分析（EMSA 实验）

1) ABP2, ABP4、 ABP9蛋白的纯化：

^ ABP2, ABP4、 ^8R 的全长基因克隆到 pGEX4T-l原核表达载体上，然后转化到 BL21菌株中，用 37°C， 0.3mM IPTG诱导表达 2〜3小时， SDS-PAGE 电泳，有特异的 ABP2、 ABP4、 ABP9表达条带。 ABP2、 ABP4、 ABP9蛋白纯化的操作方法按照 Pharmacia公司的 MicroSpin™ GST Purification ModuLe protocol进行，纯化的蛋白用于 EMSA实验。

2) 同位素标记 ABRE和 mABRE:

采用 Promega 公司的 DNA 5' End-Labeling System , 反应体系是： ABRE (或 mABRE)l μ 1， T₄ PNK 10 X buffer 5 μ 1， Y -³²P-ATP 3 μ 1, T₄ ΡΝΚ (10U/ U 1) 2 1, Η₂0 39 μ ΐ; 37°C 20分钟；力 Β 2 μ 1 0.5Μ EDTA， 68 °C 10 分钟灭活； 37°C 10分钟； 4°C保存备用。

3) ABP2s ABP4、 ABP9蛋白与 DNA结合反应：

5 X binding buffer (125mM HEPES-KOH pH7,6； 50%甘油； 250mM KC1) 4 μ 1； ABP2、 ABP4、 ABP9和 GST蛋白各约 4 μ g (9 μ 1); 1Μ DTT 1 μ 1; 上述标记的 ABRE (或 mABRE)探针 1 μ 1; Η₂Ο 4 μ 1; 冰上结合 30分钟，加 3 μ 1上样缓冲液 (含 0.025%溴酚蓝的无菌水)，进行聚丙烯酰胺电泳分析。

4 ) 非变性聚丙烯酰胺电泳：

配制聚丙烯酰胺胶 (5.4%): 30%丙烯酰胺 9ml_; 10 X电泳缓冲液 5ml (甘氨酸 142.7g/L， EDTA 3.92g/L, Tris 30.28g/L); 50%甘油 2.5ml; 去离子水 33ml; 10%APS 400 μ 1； TEMED 25 μ 1。待胶凝后，用 1 X电泳缓冲液电泳，预电泳 10分钟 (300V); 上样，电泳 1小时 (300V) ; 用滤纸粘下胶，保鲜膜封好后，压 X光片 1小时；洗片，显影 2分钟，定影 5分钟。结果表明有明显的被 ΑΒΡ2、 ΑΒΡ4、 ΑΒΡ9蛋白阻滞 ABRE的电泳条带（图 2)，相反， mABRE 则不被阻滞，说明 ABP2、 ABP4, ABP9基因产物在体外同样具有 ABRE结合特异性。

实施例 4、 ABP2、 ABP4、 ABP9在酵母和玉米细胞中的 ABRE结合特异性及转录激活功能

1 ) 酵母细胞中转录激活试验

把 AS ABP4, 勾建到 YepGAP (Trp+)载体上，得到含有 SP ABP4 5*/¾基因全长 cDNA的酵母表达载体 YepGAPABP- 2、 YepGAPABP- 4、 YepGAPABP- 9 质粒，将其转化到 yA4和 ymA4酵母中，在 His—选择培养基上 28 °C培养: Γ5天，结果表明用 YepGAPABP- 2、 YepGAPABP_4、 YepGAPABP- 9质粒转化的 yA4能够生长（图 3B、 D、 F)，而 ymA4不能生长（图 3A、 C、 E)，因此 ABP2、 ABP4、 ABP9 在酵母细胞内不但具有 ABRE结合特异性，而且具有转录激活功能。图 3中， A : ymA4 + ABP2 ； B : yA4 + ABP2 ; C : ymA4 + ABP4; D : yA4 + ABP4; E : ymA4 + ABP9; F : yA4 + ABP9。

2 ) 玉米细胞中的转录激活功能试验

报告载体的构建： PIG46 载体用 Xho I 酶切， T4 DNA 聚合酶补平， pBluescript II SK+载体上的 4mer ABRE用 S I、 £c 136 II酶切，回收约 80bp的 DNA片段与载体连接，转化 .co/_Z' DH5a，提质粒，酶切鉴定，测序表明 ABRE已连在 35S mini启动子上游。

ABP2、 ABP4、 ABP9瞬时表达载体的构建：把 2、 ABP4、 ABP9{Xba I， Xho I)基因的全长 cDNA构建到植物瞬时表达载体 pBI221 上，得到 PBI221-ABP2, ABP4、 ABP9质粒，釆用基因枪的方法共转化报告质粒和目的基因，转化材料为玉米悬浮细胞，转化方法参照 B.R.格利克和 J.E. 汤普森主编的《植物分子生物学及生物技术的实用方法》，结果表明单独转化 pIG46质粒，没有报告基因的表达（图 4A)，把 pIG46和 pBI221-ABP2、 ABP4、 ABP9共转化时，有明显的报告基因的表达（图 4B、 C、 D)，因此 ABP2、 ABP4、 ABP9在玉米细胞内不但具有 ABRE结合特异性，而且具有转录激活功能。

实施例 5、 ABP2、 ABP4、 ABP9在非生物逆境条件下的表达特异性分析 1 ) 玉米材料的处理：取玉米种子，吸胀 24hr，种植于花盆中， 28°C， 12hr光照培养约 20天，待长出三叶一芯，进行不同条件的处理。

①冷害处理：将玉米苗置于 2Ό培养箱， 12hr光照培养 48hr，取出并洗去根上的土，用液氮速冻， -80Ό保存备用。

②盐渍处理：分别将玉米苗置于 0.6%， 0.8%, 1%的 NaCl溶液中， 12hr 光照培养 3天，取出并洗去根上的土，用液氮速冻， -80Ό保存备用。

③干旱处理:分别将玉米苗置于含水量为 8% (混和 920g干土和 80mL水)， 10%, 13%的土: 中 12hr光照培养 3天，取出并去根上的土，用液氮速冻 ^ -80°C保存备用。

④ ABA处理：分别将玉米苗置于 10·⁴Μ、 10·⁵Μ、 10'⁶Μ的 ABA溶液中 (取 5mg ABA用 0.1N KOH溶解后，定容至 95mL水中即为 10_⁴M)， 12hr光照培养 24hr，取出并洗去根上的土，用液氮速冻， -80°C保存备用。

⑤ ¾0₂处理：分别将玉米苗置于 10mM H₂O₂ (1.13ml 30% H₂O₂/l), 60mM H₂0₂ (6.78mL 30% H₂O₂/L), 150mM H₂O₂ (14.95mL 30% ¾O₂/L)的水溶液中， 12hr光照培养 24hr，取出并洗去根上的土，用液氮速冻， -80Ό保存备用。

⑥水处理：将玉米苗直接置于水中 12hr光照培养 24hr， -80°C冻存。

⑦对照的处理：直接取未经任何处理的苗 -80°C冻存作为对照。 2) RNA的提取及 DNA的去除：

①取约 200mg 处理的玉米材料，液氮研磨，提取 RNA 的方法按照 Promega公司的 RNAgents Total RNA Isolation System kit进行。

②将 RNA溶于 85 μ 1水中，加入 10 X buffer 10 μ 1和 5 μ 1 RQl RNA Free DNase(lU/ l), 37°C， 15min，以去除 DNA的污染。

③加入 100 μ 1的酚氯仿抽提一次，取上清，用等体积的异丙醇沉淀 RNA， 70%的乙醇洗一次，溶于 50μ1的水中。

④定量 RNA的浓度为 1 μ g/ μ 1。

3) RT-PCR:

取 Oligo dT₁₈1 μ 1 (0.5 μ g/μ 1)， RNA 5 μ 1(1 μ g/μ 1)， dNTP 1 μ l(10mM),

Η₂027 μΐ; 65。C， 5min; 0°C, 2min; 加入 5X buffer 10 l, DTT (lOOmM) 5 μ 1, RNase Inhibitor 10U(40U/ μ 1); 42。C， 2〜5min;加入 SuperScipt II 1 μ l(200u/ l); 42 °C, 50min; 70 °C, 15min灭活，备用。

模板 cDNA的相对定量及内标引物的设计：根据 GenBank上登录的玉米肌动蛋白基因 (Maize cftW gene: Accession NO. J01238)设计如下引物：

mActl F: 5'-CACCTTCTACAACGAGCTCCG-3'

mActl R: 5'-TAATCAAGG GCAACGTAGGCA-3 '

用该引物进行扩增，如果是 cDNA可扩增出 405bp的条带，如果是基因组 DNA可扩增出 512bp的条带 (有 107bp的内含子：)。

PCR反应体系：模板 1μ1， 2XPCR缓冲液 10μ1， 10mM dNTP 1 μ 1,

10 μ Μ mActl F 1μ.1， 10 Μ mActl R 1 μ 1, Taq 1U，灭菌水 6μ1。

PCR条件： 94 °C, 2min; 94V, 30sec; 55°C， 30sec_; 72 °C, 30sec; 30 cycle; 72 °C, 5min。

根据 PCR产物的电泳结果对模板 DNA进行稀释，调整模板 DNA的用量，直到用 mActl F和 mActl R引物扩增出的 DNA条带的量基本一致，使每微升溶液中模板 cDNA的含量基本一致。

4) ABP2, ABP4、基因的 PCR扩增：

ΦΑΒΡ2, 设计 PCR扩增的引物如下 (扩增 548bp):

FW1 5 ' -TGATCTGTCGTCGCTGTCGC-3 '

RV 5 '-ACTCCAGGTTACTTGCATTAT-3 ' PGR体系：模板 1 μ 1， 2 XPCR缓冲液 10 μ 1， 10mM dNTP 1 μ 1， lOuM mActl F 1 μ 1， lOuM mActl R 1 μ 1， Taq 1U，灭菌水 6 μ 1。

PCR条件： 94。C， 2min; 94 °C , 30sec; 55°C， 30sec; 72 °C , 30sec; 30 cycle; 72 °C , 5min。

② ABP4, 设计 PCR扩增的引物如下 (扩增 632bp):

W1R 5， -TCGGTTATTCCCAATACACA-3 '

W2F 5 ' -AGC AGCGGTGAACCAGCTTG-3 '

PCR体系：模板 1 μ 1, 2 XPCR buffer 10 μ 1， lOmM dNTP 1 μ 1， lOuM mActl F 1 μ 1， lOuM mActl R 1 μ 1， Taq 1U，灭菌水 6 μ 1。

PCR条件： 94。C， 2min; 94 "C , 30sec; 55°C， 30sec; 72 °C , 30sec; 30 cycle;

72 °C , 5min。

③ ABP9, 设计 PCR扩增的引物如下 (扩增 937bp):

FW1 5 ' -C ATGACGCTGGAGGACTTCCT-3 '

RV 5 ' -TTGACGAAAAC AC AGAGC-3 '

PCR体系：模板 1 μ 1， 2 X PCR缓冲液 10 μ 1， 10mM dNTP 1 μ 1， lOuM mActl F 1 μ 1， lOuM mActl R 1 μ 1， Taq 1U，灭菌水 6 μ 1。

PCR条件： 94 °C , 2min; 94 °C , 30sec_; 55 °C , 30sec; 72°C， 50sec_; 30 cycle; 72 °C , 5min。电泳结果表明 ABP2、 ABP4、 ABP9基因受盐渍（图 5A、 B、 C)、干旱（图 5J、 K)、 ABA (L、 M、 N)、过氧化氢（F、 G)等逆境条件的诱导表达。图 5中， A: CK1 B: l%NaCl C: 0.8%NaCl D: 0.6%NaCl E: 150mM H₂O₂ F: 60mM H₂O₂ G: 10mM H₂O₂ H: H₂O I： 13% O J: 10% H₂O K: 8% H₂O L: 10-⁶MABA M: 10^_5M ABA N: 10^_4M ABA 0： 4°C P: CK2

实施例 6、 ABP2、 ABP4、 ABP9转基因表达载体的构建

1 ) ABP2 , ABP4、 9基因的拟南芥转化：

拟南芥的培养：拟南芥种子在 4°C进行 2-3天的春化处理，每盆播种 7~10 粒种子 (营养土和蛭石按 2： 1); 放于温室中培养 (22 °C，光照 16h); 待拟南芥抽出初生苔后，剪去初生苔，待其抽出更多的次生苔，且少数开始结荚时，可用于转化。

农杆菌的培养：挑农杆菌单菌落接种在 3mlYEB(Kan50mg/L，利福平 50mg/l)， 28 °C， 250rpm培养 30 小时；按 1 :400 转接入 200ml 新鲜的 YEB(Kan50mg/l,利福平 50mg/L)中， 28°C， 250rpm培养约 14小时，测 OD600 ^ 1.5； 7500rpm,4°C,10min离心收集菌体；重悬菌体于二倍体积 (400ml)的渗透液 (1/2 MS盐 +5%蔗糖， ρΗ5.7， 121 Ό,15πώι灭菌；用之前加 6-ΒΑ至终浓度为 0.044uM， VB6终浓度为 lmg/l， VB 1终浓度为 10mg/l， SILWET 0.02%。

①载体构建及农杆菌转化：把 ABP2、ABP4、ABJP构建到 pBI121及 pZP212 载体上得到 pZP212-ABP2、pZP212-ABP4、pBI121-ABP9 (图 6)，转化 JM109 , 提质粒，酶切鉴定，挑出所需克隆，测序，并将其转化到农杆菌 LBA4404中。

②拟南芥转化：把拟南芥的花蕾浸入渗透液中，抽真空 (25 IN Hg，保持 5分钟)；转化完毕后，花盆外套上塑料袋，水平放置，使其在低光强度下生长 24-48小时后，即可正常培养。

③收集种子，进行筛选：称 25-30mg种子放入 1.5mL离心管，加 1ml 75% 的乙醇 (含 0.05% Tween 20)，于摇床上摇 10分钟 (300rpm)，离心，去上清；力口 1ml 95%的乙醇洗一次，离心，去上清；重复一次；在超净台中加 0.3ml 的 100%乙醇，移到无菌滤纸上，吹干；把吹干的种子撒到 1/2MS平板 (Kan50mg/1)上； 4°C，放 2天后， 22°C， 16h光照培养；将阳性植株 (TO代) 移栽到盆中培养，并收集种子进行 T1代筛选。

2)转基因拟南芥基因组 DNA的提取：

①在液氮中研磨 0.1-0.2g植物叶片，转移至 1.5ml离心管中。

②加入 0.7ml CTAB (Tris lOOmM, NaCl 1.4M, 20mM EDTA, CTAB 2%, 巯基乙醇 0.1%)， 60V , _ 30分钟。每隔 10分钟，颠倒一次。

③加 0.7ml酚：氯仿 (1： 1)，颠倒几次， 10000 rpm离心 5分钟，转移上清至一新的离心管，加等体积的氯仿：异戊醇 (24： 1)，混匀， 10000 rpm离心 5分钟。转移上清至一新的离心管。

④加等体积的异丙醇，颠倒混匀， 10000 rpm离心 10分钟，除去上清，

70%乙醇洗一次，抽干，溶于 50 μ ΐ的无菌水中，用于 PCR检测。

3 )转基因拟南芥 PCR检测：

正向引物： 35S启动子： 5，-TCTGCCGACAGTGGTCCCAA-3，反向引物： ABP2 rv3: 5'-AGG AAC TCC TCC AGA GTC AT-3'

ABP4 rv3: 5'-TCG TCG AAC GTC AAC GAG TAG -3 ' ABP9 rv3: 5'-AAC CAATCC TCC GTT CTC ACC-3' 反应体系 (20 μ ΐ): 转基因植株 DNA l l(20ng~50ng); 10 X buffer 2 1； MgCl₂(2.5mM) 2 μ 1; Taq酶 0.2 μ 1； dNTP(2.5mM) 2 μ 1;. 引物各加 10 μ Μ; 加无菌水至 20 μ 1。

反应条件： 94Ό， 5分钟； 94 45秒； 60°C， 45秒； 72°C， 45秒； 35 个循环； 72°C延伸 5分钟。筛选出 PCR阳性植株。

实施例 7、 ABP2, ABP4、 ABP9转基因植株的生理分析实验

1)抗寒实验：把转基因植株与未转基因植株置于 -6°C，保持 6小时；转移到正常的生长条件下继续培养，结果表明：转基因植株的存活率为 80%，未转基因的植株存活率为 10%， ABP2, ABP4, ABP9 能够明显提高植株的抗寒性能，结果如图 7所示。

2)抗盐实验：把转基因植株与未转基因植株置于 600mM的 NaCl中浸泡 3小时； 22°C，光照培养 24小时；转移到拟南芥正常的生长条件下继续培养，结果表明：转基因植株的存活率为 80%，未转基因的植株存活率为 15%， ABP2、 ABP4 ABP9能够明显提高植株的抗盐性能，结果如图 8所示。

3)抗旱实验：把转基因植株与未转基因植株置于拟南芥正常的生长条件下不给水连续培养 15~20天。结果表明：转基因植株的存活率为 90%，未转基因的植株存活率为 5%， ABP2、 ABP4、 ABP9能够明显提高植株的抗旱性能，结果如图 9所示，其中 A为未转基因的植株， B为转基因植株。

工农业应用

本发明成功地克隆到了玉米 bZIP类转录因子 ABP2、 ABP4、 ABP9的编码基因，并成功地将其导入拟南芥中，得到了抗非生物逆境的拟南芥，对于培育抗非生物逆境植物品种具有重要的理论及现实意义。

Claims

权利要求书

1、玉米 bZIP类转录因子 ABP2、 ABP4、 ABP9, 它们分别是具有序列表中序列 2、 4、 6的氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列 2、 4、 6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列 2、 4、 6的氨基酸残基序列相同活性的由序列 2、 4、 6衍生的蛋白质。

2、根据权利要求 1所述的转录因子 ABP2、 ABP4、 ABP9, 其特征在于：它们分别是具有序列表中序列 2、 4、 6氨基酸残基序列的蛋白质。

3、玉米 bZIP类转录因子 ABP2、 ABP4、 ABP9的编码基因 ABP2、 ABP4、 ABP9, 分别是与序列表中 SEQ ID Ns : 1、 3、 5限定的 DNA序列具有 90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA序列。

4、根据权利要求 3所述的基因，其特征在于：所述玉米 bZIP类转录因子 ABP2、 ABP4、 ABP9的编码基因^ ¾"、 ABP4, 分别是序列表中序列 1、 3、 5的 DNA序列。

5、根据权利要求 4所述的基因，其特征在于：所述玉米 bZIP类转录因子 ABP2、 ABP4、 ABP9的编码基因 ABP2、 ABP4、的读码框分别为自 5，端第 11 位到第 1056碱基、第 93位到第 1175位碱基、第 45位到第 1202位碱基的 DNA序列。

6、含有权利要求 3或 4所述基因的表达载体。

7、根据权利要求 6所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体分别为 pZP212-ABP2、 pZP212-ABP4、 ρΒΙ121-ΑΒΡ9。

8、含有权利要求 3或 4所述基因的细胞系。

9、权利要求 3或 4所述基因在培育抗非生物逆境植物品种中的应用。

10、根据权利要求 9所述的应用，其特征在于：所述非生物逆境为寒害、旱害和盐害。