玉米 bZIP类转录因子及其编码基因与应用 技术领域
本发明涉及植物基因工程领域中的转录因子及其编码基因与应用, 特别 是玉米 bZIP类转录因子、 及其编码基因与应用。
背景技术
在干旱、高盐和低温等非生物逆境条件下,植物并不仅仅是被动的接受, 而是积极地调动体内的防卫体系来对抗外来的逆境, 这时在植物体内发生很 多变化, 如新蛋白质的合成, 代谢的转变, 抗逆境物质的积累等等 (Hans J. Plant cell. 1995, 7: 1099-1111 )。其中很多蛋白参与了植物对非生物逆境的反应 (Ashwani Pareek. Current Science. 1998, 75: 1170-1174), 它们协同调节植物生 理生化以及代谢的变化, 提高植物对非生物逆境的抗性。 研究表明植物对非 生物逆境的抵抗并不是依靠某一两个功能基因就能 成的。
在非生物逆境条件下, 植物体内被诱导产生的蛋白中有许多与植物抗逆 境密切相关, 其中的一些蛋白的编码基因已被克隆 (Anil Grover. Current Science. 1998, 75: 689-695 )。为了提高植物的抗寒、抗旱和抗盐等非生物逆境 的能力, 许多其它不同来源的抗逆相关基因被克隆, 并转化到植物中 ( Shavindra Bajaj. Molecular Breeding. 1999, 5:493-503 )。其编码的蛋白可分为 三类: 1 )合成渗透调节因子的酶类: 如向烟草转入来自 Ε· coli的 t/Z)基因, 可提高植物的甘露醇含量; 向烟草、水稻转入 P5CS, 可提高植物的脯氨酸含 量; 向拟南芥、 水稻转入 coi¾, 可提高植物甜菜碱的含量 (Sakamoto A. PMB. .1998,38: 1011-1019) ο. 2 ) UEA_及其相关蛋白:.如向 ¾窗芥转—入 corl5a ¾@ (Steponkus PL. PNAS. 1998, 95: 14570-14575)。 3 )氧化逆境相关蛋白: 如向苜 蓿中转入 Mn-SOD(Mckersic BD. Plant Physiol. 1999,111 : 1177-1181);向烟草中 转入 GST。 这些功能基因转入到植物体后, 在实验室条件下, 植株在某一方 面的抗逆性有所提高, 但所取得的效果并不理想。 最近, 有人向拟南芥中转 入抗逆相关的转录因子 CBFl(C-repeat Binding Factor)的基因, CBF1可调控 一系列抗寒相关基因的表达,与上述单功能基因相比, CBF1明显提高拟南芥 的抗寒性能 (Kirsten R. Science. 1998, 280:104-106)。 同样, 向拟南芥转入 DREB1A因子的基因, 可调控与抗非生物逆境相关的多个基因的表达, 明显 提高了植株的抗盐、 抗寒、 抗旱的能力 (Mie Kasuga. Nature Biotechnology.
1999,17: 287- 291)。
已有研究表明在干早、 盐渍和低温等逆境条件下, 植物体内会产生大量 的活性氧, 形成氧化逆境 (Zhu J K.. Trends Plant Sci. 2001,6:66-71 )。 由于活性 氧具有非常活泼的化学性质, 它会对细胞造成严重的伤害, 如损伤细胞膜、 使重要的酶类失活及 DNA断裂等, 因此活性氧的及时清除对植物抗非生物 逆境能力的提高具有重要意义。 在活性氧的清除过程中, 过氧化氢酶 CAT1 起着重要作用, 但在逆境条件下, 植物本身的抗氧化***受诱导表达的能力 比较弱, 不能及时地清除体内的活性氧, 影响了植物抗逆性的进一步提高。 因此, 克隆调控 Catl表达的转录因子编码基因不仅有助于对 ROS信号传导 路径的理解, 而且对培育具有抗旱、 抗盐、 抗寒等逆境能力的作物具有重要 的指导意义, 因为这样的反式因子不仅能够调控 C«t7基因的表达,还能调控 其它一系列的抗氧化基因和抗非生物逆境基因的表达。
ABRE是存在于许多逆境响应基因启动子区的 ABA 响应元件 (ABA Responsive elelment) , 其特征序列是 (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C) (Chen WQ. Plant Cell. 2001,14:559-574)。 Catl基因的启动子区含有与逆境相关的重要的 顺式调控元件 AJBRE1 和 ABRE2 , 缺失分析表 明 ABRE2 (5'-GAAGTCCACGTGGAGGTGG)是 Catl基因响应 ABA调控所必需的顺式 元件。 在玉米幼胚的发育过程中, 随着 ABA含量的升高, 基因的表达 也随之增强。 胚发育的过程就是有机物质不断积累、 细胞不断脱水的过程, 也是细胞抗逆境能力不断提高的过程。 研究表明在玉米幼胚的发育过程中, 细胞中存在着能够与 ABRE2相互作用的反式因子, 可分为两类: 一类是依 赖于 ABA的能够与 Catl基因 ABRE2元件相互作用的反式因子(命名为 Catl promoter Binding Factor 1, CBF1 ), 另一类是不依赖于 ABA的能够与 Catl基 因 ABRE2元件相互作用的反式因子 (命名为 Catl promoter Binding Factor 2, CBF2 ) (Lingqing M. Guan. The Plant Journal. 2000, 22(2):87-95 )。 目前还没有 关于这两类重要调控因子的报道。
发明公开
本发明的目的是提供玉米 bZIP类转录因子及其编码基因。
本发明所提供的玉米 bZIP类转录因子来源于玉米, 分别命名为 ABRE 结合蛋白 ABP2、 ABP4、 ABP9 (ABRE Binding Protein), 它们分别是具有序
列表中序列 2、 4、 6的氨基酸残基序列的蛋白质, 或者是将序列 2、 4、 6的 氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、 缺失或添加且具有与序 列 2、 4、 6的氨基酸残基序列相同活性的由序列 2、 4、 6衍生的蛋白质。
ABP2优选的是具有序列表中序列 2氨基酸残基序列的蛋白质,由 351个 氨基酸残基组成。
ABP4优选的是具有序列表中序列 4氨基酸残基序列的蛋白质, 由 360个 氨基酸残基组成。 .
ABP6优选的是具有序列表中序列 6氨基酸残基序列的蛋白质, 由 385个 氨基酸残基组成。
把本发明所得到的 ABP2、 ABP4、 ABP9的蛋白序列输入到 GenBank中 进行 BLAST分析, 结果表明 ABP2、 ABP4、 ABP9属于 bZIP类转录因子, 与已报道的 bZIP类转录因子相比, ABP2、 ABP4、 ABP9与它们之间的同源 性均很低。
本发明以 Not I adapter: 5 ' -pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCC C(T)15-3' 为引物构建了玉米授粉后 17天(17dpp)幼胚的 cDNA文库, 该文 库的库容量为 5.2 X 106 cfo。
本发明设计合成了下述引物:
用于反转录的引物: ABP2 rv2: 5 '-GCG ACA GCG ACG ACA GAT CA-3 '
ABP4 rv2: 5'-AGC GCC AGAAGC GGA GGC CA-3' ABP9 rv2: 5'-CCT TCA CCA GGAAGT CCT CCA-3' 用于 PCR的引物: AUAP fw: 5,-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3,
ABP2 rv3: 5,-AGG AAC TCC TCC AGA GTC AT-3 ' ABP4 rv3: 5' -TCG TCG AAC GTC AAC GAG TAG -3 ' ABP9 rv3: 5' -AAC CAA TCC TCC GTT CTC ACC-3' 通过 RT- PCR及 RACE方法从玉米幼胚中克隆玉米 bZIP类转录因子基因。 玉米 bZIP类转录因子 ABP2、 ABP4、 ABP9的编码基因 ABP2、 ABP4、 ABP9, 分别是与序列表中 SEQ ID No : 1、 3、 5限定的 DNA序列具有 90 %以上同源 性, 且编码相同功能蛋白质的 D 序列。
优选的是序列表中序列 1的 DNA序列, 由 1485bp碱基组成,该基 因的读码框为自 5' 端第 114位到第 1056位碱基的 DNA序列。
^9 ¾优选的是序列表中序列 3的 DNA序列, 由 1835bp碱基组成, 该基 因的读码框为自 5' 端第 93位到第 1175位碱基的 DNA序列。
^^P 优选的是序列表中序列 5的 DNA序列, 由 1510bp碱基组成, 该基 因的读码框为自 5' 端第 45位到第 1202位碱基的 DNA序列。
将所克隆的 ABP2、 ABP4、 ABP9基因分别构建到酵母表达载体 pPC86 上,研究了 ABP2、ABP4、ABP9与 ABRE的体内结合特异性,结果表明 ΑΒΡ2、 ΑΒΡ4、 ^ΒΡΡ基因产物在酵母体内具有 ABRE结合特异性。
将所克隆的 ABP2、ABP4 S ^基因分别构建到原核表达载体 pGEX4T-l 上,研究了 ABP2、ABP4、ABP9与 ABRE的体外结合特异性,结果表明 ABP2、 ABP4、 ^BRP基因产物在体外具有 ABRE结合特异性, 能够特异作用于含有 核心元件序列为 (C/G/T) ACGTG (G/T) (A/C)的 ABRE顺式元件。
将所克隆的 ^SP2、 ABP4、 ^SRP基因分别构建到酵母表达载体 YepGAP 和植物表达载体 pBI121上, 研究了 ABP2、 ABP4、 ABP9在酵母体内和玉米 细胞中的 ABRE结合特异性及转录激活功能。 结果表明^ δΡ2、 ΑΒΡ4、 ΑΒΡ9 基因产物在酵母和玉米悬浮细胞中均具有 ABRE 结合特异性和转录激活功 能。 因此, ABP2、 ABP4 , ^SPP基因产物是具有 ABRE结合特异性和转录激 活功能的转录因子。 且^^ P2、 ABP4, 基因受到盐、 干旱、 过氧化氢、
ABA等逆境条件的诱导表达。
把 ABP2、 ABP4, ABP9基因构建到植物转化载体 pBI121及 pZP212上 得到 pZP212-ABP2、 pZP212-ABP4、 pBI121-ABP9, 并转化到农杆菌中, 用 农杆菌转化拟南芥并获得了转基因植株。 对转基因植株在不同的逆境条件下 进行处理, 结果证明^ δΡ2、 ΑΒΡ4、 ^δΡΡ能够提高转基因植物的抗寒、 抗盐 和抗旱等非生物逆境的能力。
含有本发明 ^^2、 ΑΒΡ4 , ^ΒΡΡ基因的表达载体和细胞系, 以及含有该 类基因的抗非生物逆境植物品种均为本发明的保护范围。
本发明成功地从玉米中分离、克隆到了具有 ABRE结合特异性的转录调 控因子的编码基因 ABP2、 ABP4、 ABP9, 不仅有助于对 ROS信号传导路径 的理解, 而且对培育具有抗旱、 抗盐、 抗寒等逆境能力的作物具有重要的指 导意义。 由该类基因表达的调控因子可作用于多个抗非生物逆境相关基因启 动子区的 ABRE顺式作用元件, 调控抗非生物逆境相关基因的表达, 提高植
物对非生物逆境的抵抗能力。
附图说明
图 1为酵母的生长情况, 显示 ABP2、 ABP4、 ABP9与 ABRE的体内结合特 异性。
图 2为非变性聚丙烯酰胺电泳图谱, 显示 ABP2、 ABP4、 ABP9与 ABRE的 体外结合特异性。
图 3为酵母的生长情况,显示 ABP2、 ABP4、 ABP9在酵母体内的 ABRE 结合特异性及转录激活功能。 .
图 4为转化的玉米悬浮细胞, 显示 ABP2、 ABP4、 ABP9在玉米细胞中 的 ABRE结合特异性及转录激活功能。
图 5为 PCR结果的电泳图谱, 显示 ABP2、 ABP4、 ABP9在盐、 干旱、 过氧化氢、 ABA、 低温等逆境条件下的表达。
图 6为 ABP2、 ABP4、 ABP9转基因表达载体的构建示意物理图谱。 图 7为转 ABP2、 ABP4、 ABP9基因拟南芥的抗盐试验结果。 .
图 8为转 ABP2、 ABP4、 ABP9基因拟南芥的抗寒试验结果。
图 9为转 ^δΡ2、 ΑΒΡ4、 ^δΡΡ基因拟南芥的抗旱试验结果。
实施发明的最佳方式
实施例 1、 玉米 bZIP类转录因子编码基因的克隆与筛选
材料与方法
1 ) 玉米材料: 玉米选用齐 319授粉后 17天 (17dpp) 的幼胚。
2 )菌种: 大肠杆菌£ ^' 011501, DH10B、 JM109及酵母菌株 yWAM2 (Leu",His",Trp") o
3 ) 载体: pBSK+、 pRS315及 pPC86。
4 ) 工具酶和修饰酶: 各种限制性内切酶和修饰酶购自 Promega公司, New England Biola 公司和 Gibco公司。
5 ) 化学试剂: 酵母培养用试剂均购自 Sigma公司和 Oxford公司; 其 它化学药品均为国产分析纯。
6 )试剂盒:质粒 DNA提取用 Promega公司的 Wizard™ Minipreps DNA Purification System和 Wizard™ Maxipreps DNA Purification System; 回收 DNA用鼎国公司的 DNA片段快速纯化 /回收试剂盒; RNA提取用 Promega
公司的 RNAgents Total RNA Isolation System kit 和 PolyATtract mRNA Isolation System; 文库构建用 GibcoBRL公司的 Superscript™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning kit。
7 )引物合成: 由北京赛百盛生物工程公司和上海博亚生物技术有限公 司合成。
8 ) 测序: 由上海博亚生物技术有限公司完成。
实验步骤
1 ) 总 RNA的提取和 mRNA的分离:
总 RNA的提取和 mRNA的分离分别按 Promega公司的 RNAgents Total RNA Isolation System kit和 PolyATtract mRNA Isolation System进行。 取玉米 17dpp幼胚 lg,提取总 RNA 2.834mg,共分离出 mRNA 43.7 μ g。取玉米 21dpp 幼胚 lg, 提取总 RNA 2.427mg, 共分离出 mRNA 41.6 μ g。
2 ) 玉米幼胚 17dpp、 21dpp cDNA文库的构建:
按 GibcoBRL公司的 Superscript™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning kit进行。 取出 5 μ g 17dpp的 mRNA用于 cDNA文库构 建, 反转录引物用:
Not I adapter: 5'-pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)15-3' , 双链合成后加 Sa/ 1 adapter: 5'-TCGACCCACGCGTCCG-3 ';
3'-GGGTGCGCAGGCp-5';
再用 Not I酶切, 构建到经 Sal I和 Not I酶切纯化后的 pPC86载体上
(Trp+) o 转化 E.coli. DH10B , 得到库容量为 5.2 X 106 cfu的 cDNA文库。
3 ) cDNA文库的扩增:
配 2 X LB培养基 4L(Bacto-胰蛋白胨, 20g/L, Bacto-酵母膏 10g/L, NaCl 10g/L, SeaPrep 琼脂糖 3g/L, H 7.0), 121 °C灭菌 30min后, 37°C温育 2小 时; 加入氨苄青霉素至终浓度 200mg/L; 加入文库至 106 cfb/L; 混匀后, 分 装 20~30mL到 50mL的培养管中; 冰浴 1小时; 30°C培养 40小时; 8000rpm 离心 10min,收集菌体;弃上清,加入 200mL 2 XLB (含甘袖 12.5%)悬浮细胞, 分装成 10mL—份于 -70Ό保存备用。
4) 4mer ABRE诱饵载体及 4mer mutant ABRE (mABRE) 挽救载体的 构建
合成引物 ABRE(+): 5'GAAGTCCACGTGGAGGTGG3' 和 ABRE(-): 5 CCCACCTCCACGTGGACT3', 各取 20 μ 1(1 μ g/ μ 1)的 ABRE(+)和 ABRE(-), 混匀, 加 4 μ 1 3M的 NaOAc和 100 μ 1的无水乙醇, -20°C, 30分 钟后 12000 rpm离心, 沉淀 DNA, 70%乙醇洗一次, 干燥, 力 Π 6.5 μ 1无菌水, 1 μ 1 10 X的 Τ4 多核苷酸激酶缓冲液,退火:条件是 88°C, 2min; 65 °C, lOmin; 37°C, lOmin; 25 °C , 5min; 力卩 1.5 μ 1 20mM的 ATP和 1 μ 1 T4 多核苷酸激 酶, 37°C反应 2小时,加苯酚一氯仿和氯仿各抽提一次,用无水乙醇沉淀 DNA。 再加 2 μ 1 10 X 连接酶缓冲液, Ι μ ΐ连接酶 (5units/ w l), 17 μ 1无菌水, 16°C 连接过夜, 用 2%的琼脂糖电泳, 分离大小约为 80bp的 DNA片段, 克隆到 pBSK+载体上 (经 S e l 酶切, 补平), 测序, 获得 pA4质粒。
合成引物 mABRE(+): 5'-GAAGTAACATGTTCGGTGG-3';
mABRE (-): 5' TCCCACCGAACATGTTACT 3', 方法同上, 获得 pmA4质粒。
pRS315His(Leu+)载体及 pA4和 pmA4质粒均用 BamIH、 Xba I双切后纯 化, 把 4mer ABRE 和 4mer mABRE 克隆到 pRS315His, 得到诱饵载体 pRSA4(Leu+)和挽救载体 pRSmA4(Leu+)质粒。
5 ) 玉米幼胚 17dpp cDNA文库的筛选:
制备 yWAM2感受态细胞,把 pRSA4转化到酵母菌株 yWAM2 LeiT, His―, Trp_)中, 转化方法参照 Two Hybrid System TRAFO Protocol进行。 获得含有 pRSA4的酵母菌株 yA4(His', Trp')。 用含有诱饵载体的 yA4酵母对文库进行 筛选, 转化方法同上, 将转化细胞涂到 1¾_选择培养基上, 28°C培养 3~5天。 待酵母长出后, 提酵 质粒, 提取方法参照 Method I: Quick Plasmid DNA Preparations from Yeast(Christine Guthrie 1991)。 将酵母质粒转化 Co/ζ· DH5 α, 从中提取质粒, 酶切分析, 测序可知所获得的阳性克隆的 DNA序列, 再对序列进行分析。
6) ABP2、 ABP4、 ^B ^全长 cDNA序列的获得:
采用 5'RACE的方法得到了 ABP2、ABP4、ABP9基因的全长 cDNA序列, 按 GibcoBRL公司 5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version2.0 kit操作。
用于反转录的引物: ABP2 rv2: 5'-GCGACAGCGACGACAGATCA-3 '
ABP4 rv2: 5 ' - AGCGCC AGAAGCGGAGGCC A-3 '
ABP9 rv2: 5 ' -CCTTC ACC AGGAAGTCCTCC A-3 ' 用于 PCR的引物: AUAP fw: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3 '
ABP2 rv3: 5 '-AGGAACTCCTCCAGAGTCAT-3 '
ABP4 rv3: 5 ' -TCGTCGAACGTCAACGAGTAG -3' ABP9 rv3: 5'-AACCAATCCTCCGTTCTCACC-3'
PCR条件是: 94°C, 3min; 94 °C , 30sec; 60V , 30sec; 72°C,lmin, 35个循环; 72°C, 5min。 把扩增出 DNA片段用 1 %的琼脂糖胶分离、 回收 并连接到 pGEM-T easy vector, 转化 co/ . JM109, 酶切鉴定后测序, 获得 ABP2, ABP4 , ^B P基因的全长 cDNA序列, 分别为序列表中的序列 1、 3、 5, 根据 cDNA序列推测出其蛋白序列为序列 2、 4、 6。
实施例 2、 ABP2、 ABP4、 ABP9的 ABRE体内结合特异性分析 将 yA4和 ymA4转化到 yWAM2酵母中, 得到 yA4和 ymA4菌株, 把筛 库得到的 ABP2、 ABP4、 ABP9质粒分别转化 yA4和 ymA4酵母, 28°C在 His— 选择培养基上培养 3~5天, 只有用 ABP2、 ABP4、 ABP9质粒转化的 yA4酵 母能够生长, 而 ABP2、 ABP4、 ABP9质粒转化的 ymA4酵母不能够生长, 说明 ABP2、 ABP4、 ABP9在酵母体内能够特异结合 ABRE元件, 激活了报 告基因 H/S3基因的 *达, 故能够在 选择培养基上生长 (图 1B), 相反由于 ABP2, ABP4、 ABP9不能与 mABRE结合, 不能激活报告基因 H/S3基因的 表达, 在 His_选择培养基上也不能生长 (图 1A), 因此, ABP2、 ABP4、 ABP9 在酵母体内具有 ABRE结合特异性。
实施例 3 . ABP2, ABP4、 ABP9.的 ABRE体外结合特异性分析(EMSA 实验)
1) ABP2, ABP4、 ABP9蛋白的纯化:
^ ABP2, ABP4、 ^8R 的全长基因克隆到 pGEX4T-l原核表达载体上, 然后转化到 BL21菌株中,用 37°C, 0.3mM IPTG诱导表达 2〜3小时, SDS-PAGE 电泳, 有特异的 ABP2、 ABP4、 ABP9表达条带。 ABP2、 ABP4、 ABP9蛋白 纯化的操作方法按照 Pharmacia公司的 MicroSpin™ GST Purification ModuLe protocol进行, 纯化的蛋白用于 EMSA实验。
2) 同位素标记 ABRE和 mABRE:
采用 Promega 公司的 DNA 5' End-Labeling System , 反应体系是:
ABRE (或 mABRE)l μ 1, T4 PNK 10 X buffer 5 μ 1, Y -32P-ATP 3 μ 1, T4 ΡΝΚ (10U/ U 1) 2 1, Η20 39 μ ΐ; 37°C 20分钟; 力 Β 2 μ 1 0.5Μ EDTA, 68 °C 10 分钟灭活; 37°C 10分钟; 4°C保存备用。
3) ABP2s ABP4、 ABP9蛋白与 DNA结合反应:
5 X binding buffer (125mM HEPES-KOH pH7,6; 50%甘油; 250mM KC1) 4 μ 1; ABP2、 ABP4、 ABP9和 GST蛋白各约 4 μ g (9 μ 1); 1Μ DTT 1 μ 1; 上 述标记的 ABRE (或 mABRE)探针 1 μ 1; Η2Ο 4 μ 1; 冰上结合 30分钟, 加 3 μ 1上样缓冲液 (含 0.025%溴酚蓝的无菌水), 进行聚丙烯酰胺电泳分析。
4 ) 非变性聚丙烯酰胺电泳:
配制聚丙烯酰胺胶 (5.4%): 30%丙烯酰胺 9ml; 10 X电泳缓冲液 5ml (甘 氨酸 142.7g/L, EDTA 3.92g/L, Tris 30.28g/L); 50%甘油 2.5ml; 去离子水 33ml; 10%APS 400 μ 1; TEMED 25 μ 1。待胶凝后, 用 1 X电泳缓冲液电泳, 预电泳 10分钟 (300V); 上样, 电泳 1小时 (300V) ; 用滤纸粘下胶, 保鲜膜封 好后, 压 X光片 1小时; 洗片, 显影 2分钟, 定影 5分钟。 结果表明有明显 的被 ΑΒΡ2、 ΑΒΡ4、 ΑΒΡ9蛋白阻滞 ABRE的电泳条带(图 2),相反, mABRE 则不被阻滞, 说明 ABP2、 ABP4, ABP9基因产物在体外同样具有 ABRE结 合特异性。
实施例 4、 ABP2、 ABP4、 ABP9在酵母和玉米细胞中的 ABRE结合特异性及 转录激活功能
1 ) 酵母细胞中转录激活试验
把 AS ABP4, 勾建到 YepGAP (Trp+)载体上, 得到含有 SP ABP4 5*/¾基因全长 cDNA的酵母表达载体 YepGAPABP- 2、 YepGAPABP- 4、 YepGAPABP- 9 质粒, 将其转化到 yA4和 ymA4酵母中, 在 His—选择培养基上 28 °C培养: Γ5天, 结果表明用 YepGAPABP- 2、 YepGAPABP_4、 YepGAPABP- 9质粒转化的 yA4能够生 长(图 3B、 D、 F), 而 ymA4不能生长 (图 3A、 C、 E), 因此 ABP2、 ABP4、 ABP9 在酵母细胞内不但具有 ABRE结合特异性, 而且具有转录激活功能。 图 3中, A : ymA4 + ABP2 ; B : yA4 + ABP2 ; C : ymA4 + ABP4; D : yA4 + ABP4; E : ymA4 + ABP9; F : yA4 + ABP9。
2 ) 玉米细胞中的转录激活功能试验
报告载体的构建: PIG46 载体用 Xho I 酶切, T4 DNA 聚合酶补平,
pBluescript II SK+载体上的 4mer ABRE用 S I、 £c 136 II酶切, 回收约 80bp的 DNA片段与载体连接, 转化 .co/Z' DH5a, 提质粒, 酶切鉴定, 测 序表明 ABRE已连在 35S mini启动子上游。
ABP2、 ABP4、 ABP9瞬时表达载体的构建:把 2、 ABP4、 ABP9{Xba I, Xho I)基因的全长 cDNA构建到植物瞬时表达载体 pBI221 上, 得到 PBI221-ABP2, ABP4、 ABP9质粒, 釆用基因枪的方法共转化报告质粒和目 的基因, 转化材料为玉米悬浮细胞, 转化方法参照 B.R.格利克和 J.E. 汤普 森主编的 《植物分子生物学及生物技术的实用方法》, 结果表明单独转化 pIG46质粒,没有报告基因的表达(图 4A),把 pIG46和 pBI221-ABP2、 ABP4、 ABP9共转化时, 有明显的报告基因的表达(图 4B、 C、 D), 因此 ABP2、 ABP4、 ABP9在玉米细胞内不但具有 ABRE结合特异性, 而且具有转录激活 功能。
实施例 5、 ABP2、 ABP4、 ABP9在非生物逆境条件下的表达特异性分析 1 ) 玉米材料的处理: 取玉米种子, 吸胀 24hr, 种植于花盆中, 28°C, 12hr光照培养约 20天, 待长出三叶一芯, 进行不同条件的处理。
①冷害处理: 将玉米苗置于 2Ό培养箱, 12hr光照培养 48hr, 取出并洗 去根上的土, 用液氮速冻, -80Ό保存备用。
②盐渍处理: 分别将玉米苗置于 0.6%, 0.8%, 1%的 NaCl溶液中, 12hr 光照培养 3天, 取出并洗去根上的土, 用液氮速冻, -80Ό保存备用。
③干旱处理:分别将玉米苗置于含水量为 8% (混和 920g干土和 80mL水), 10%, 13%的土: 中 12hr光照培养 3天, 取出并 去根上的土, 用液氮速冻 ^ -80°C保存备用。
④ ABA处理:分别将玉米苗置于 10·4Μ、 10·5Μ、 10'6Μ的 ABA溶液中 (取 5mg ABA用 0.1N KOH溶解后, 定容至 95mL水中即为 10_4M), 12hr光照培 养 24hr, 取出并洗去根上的土, 用液氮速冻, -80°C保存备用。
⑤ ¾02处理:分别将玉米苗置于 10mM H2O2 (1.13ml 30% H2O2/l), 60mM H202 (6.78mL 30% H2O2/L), 150mM H2O2 (14.95mL 30% ¾O2/L)的水溶液中, 12hr光照培养 24hr, 取出并洗去根上的土, 用液氮速冻, -80Ό保存备用。
⑥水处理: 将玉米苗直接置于水中 12hr光照培养 24hr, -80°C冻存。
⑦对照的处理: 直接取未经任何处理的苗 -80°C冻存作为对照。
2) RNA的提取及 DNA的去除:
①取约 200mg 处理的玉米材料, 液氮研磨, 提取 RNA 的方法按照 Promega公司的 RNAgents Total RNA Isolation System kit进行。
②将 RNA溶于 85 μ 1水中,加入 10 X buffer 10 μ 1和 5 μ 1 RQl RNA Free DNase(lU/ l), 37°C, 15min, 以去除 DNA的污染。
③加入 100 μ 1的酚氯仿抽提一次,取上清,用等体积的异丙醇沉淀 RNA, 70%的乙醇洗一次, 溶于 50μ1的水中。
④定量 RNA的浓度为 1 μ g/ μ 1。
3) RT-PCR:
取 Oligo dT181 μ 1 (0.5 μ g/μ 1), RNA 5 μ 1(1 μ g/μ 1), dNTP 1 μ l(10mM),
Η2027 μΐ; 65。C, 5min; 0°C, 2min; 加入 5X buffer 10 l, DTT (lOOmM) 5 μ 1, RNase Inhibitor 10U(40U/ μ 1); 42。C, 2〜5min;加入 SuperScipt II 1 μ l(200u/ l); 42 °C, 50min; 70 °C, 15min灭活, 备用。
模板 cDNA的相对定量及内标引物的设计:根据 GenBank上登录的玉米 肌动蛋白基因 (Maize cftW gene: Accession NO. J01238)设计如下引物:
mActl F: 5'-CACCTTCTACAACGAGCTCCG-3'
mActl R: 5'-TAATCAAGG GCAACGTAGGCA-3 '
用该引物进行扩增, 如果是 cDNA可扩增出 405bp的条带, 如果是基因 组 DNA可扩增出 512bp的条带 (有 107bp的内含子:)。
PCR反应体系: 模板 1μ1, 2XPCR缓冲液 10μ1, 10mM dNTP 1 μ 1,
10 μ Μ mActl F 1μ.1, 10 Μ mActl R 1 μ 1, Taq 1U, 灭菌水 6μ1。
PCR条件: 94 °C, 2min; 94V, 30sec; 55°C, 30sec; 72 °C, 30sec; 30 cycle; 72 °C, 5min。
根据 PCR产物的电泳结果对模板 DNA进行稀释, 调整模板 DNA的用 量, 直到用 mActl F和 mActl R引物扩增出的 DNA条带的量基本一致, 使 每微升溶液中模板 cDNA的含量基本一致。
4) ABP2, ABP4、 基因的 PCR扩增:
ΦΑΒΡ2, 设计 PCR扩增的引物如下 (扩增 548bp):
FW1 5 ' -TGATCTGTCGTCGCTGTCGC-3 '
RV 5 '-ACTCCAGGTTACTTGCATTAT-3 '
PGR体系: 模板 1 μ 1, 2 XPCR缓冲液 10 μ 1, 10mM dNTP 1 μ 1, lOuM mActl F 1 μ 1, lOuM mActl R 1 μ 1, Taq 1U, 灭菌水 6 μ 1。
PCR条件: 94。C, 2min; 94 °C , 30sec; 55°C, 30sec; 72 °C , 30sec; 30 cycle; 72 °C , 5min。
② ABP4, 设计 PCR扩增的引物如下 (扩增 632bp):
W1R 5, -TCGGTTATTCCCAATACACA-3 '
W2F 5 ' -AGC AGCGGTGAACCAGCTTG-3 '
PCR体系: 模板 1 μ 1, 2 XPCR buffer 10 μ 1, lOmM dNTP 1 μ 1, lOuM mActl F 1 μ 1, lOuM mActl R 1 μ 1, Taq 1U, 灭菌水 6 μ 1。
PCR条件: 94。C, 2min; 94 "C , 30sec; 55°C, 30sec; 72 °C , 30sec; 30 cycle;
72 °C , 5min。
③ ABP9, 设计 PCR扩增的引物如下 (扩增 937bp):
FW1 5 ' -C ATGACGCTGGAGGACTTCCT-3 '
RV 5 ' -TTGACGAAAAC AC AGAGC-3 '
PCR体系: 模板 1 μ 1, 2 X PCR缓冲液 10 μ 1, 10mM dNTP 1 μ 1, lOuM mActl F 1 μ 1, lOuM mActl R 1 μ 1, Taq 1U, 灭菌水 6 μ 1。
PCR条件: 94 °C , 2min; 94 °C , 30sec; 55 °C , 30sec; 72°C, 50sec; 30 cycle; 72 °C , 5min。 电泳结果表明 ABP2、 ABP4、 ABP9基因受盐渍 (图 5A、 B、 C)、 干旱(图 5J、 K)、 ABA (L、 M、 N)、 过氧化氢 (F、 G)等逆境条件的 诱导表达。图 5中, A: CK1 B: l%NaCl C: 0.8%NaCl D: 0.6%NaCl E: 150mM H2O2 F: 60mM H2O2 G: 10mM H2O2 H: H2O I: 13% O J: 10% H2O K: 8% H2O L: 10-6MABA M: 10_5M ABA N: 10_4M ABA 0: 4°C P: CK2
实施例 6、 ABP2、 ABP4、 ABP9转基因表达载体的构建
1 ) ABP2 , ABP4、 9基因的拟南芥转化:
拟南芥的培养:拟南芥种子在 4°C进行 2-3天的春化处理,每盆播种 7~10 粒种子 (营养土和蛭石按 2: 1); 放于温室中培养 (22 °C, 光照 16h); 待拟南芥 抽出初生苔后, 剪去初生苔, 待其抽出更多的次生苔, 且少数开始结荚时, 可用于转化。
农杆菌的培养: 挑农杆菌单菌落接种在 3mlYEB(Kan50mg/L, 利福平
50mg/l), 28 °C, 250rpm培养 30 小时; 按 1 :400 转接入 200ml 新鲜的 YEB(Kan50mg/l,利福平 50mg/L)中, 28°C, 250rpm培养约 14小时,测 OD600 ^ 1.5; 7500rpm,4°C,10min离心收集菌体; 重悬菌体于二倍体积 (400ml)的渗 透液 (1/2 MS盐 +5%蔗糖, ρΗ5.7, 121 Ό,15πώι灭菌; 用之前加 6-ΒΑ至终浓 度为 0.044uM, VB6终浓度为 lmg/l, VB 1终浓度为 10mg/l, SILWET 0.02%。
①载体构建及农杆菌转化:把 ABP2、ABP4、ABJP构建到 pBI121及 pZP212 载体上得到 pZP212-ABP2、pZP212-ABP4、pBI121-ABP9 (图 6),转化 JM109 , 提质粒,酶切鉴定,挑出所需克隆,测序,并将其转化到农杆菌 LBA4404中。
②拟南芥转化: 把拟南芥的花蕾浸入渗透液中, 抽真空 (25 IN Hg, 保持 5分钟); 转化完毕后, 花盆外套上塑料袋, 水平放置, 使其在低光强度下生 长 24-48小时后, 即可正常培养。
③收集种子,进行筛选:称 25-30mg种子放入 1.5mL离心管,加 1ml 75% 的乙醇 (含 0.05% Tween 20), 于摇床上摇 10分钟 (300rpm), 离心, 去上清; 力口 1ml 95%的乙醇洗一次, 离心, 去上清; 重复一次; 在超净台中加 0.3ml 的 100%乙醇, 移到无菌滤纸上, 吹干; 把吹干的种子撒到 1/2MS平板 (Kan50mg/1)上; 4°C, 放 2天后, 22°C, 16h光照培养; 将阳性植株 (TO代) 移栽到盆中培养, 并收集种子进行 T1代筛选。
2)转基因拟南芥基因组 DNA的提取:
①在液氮中研磨 0.1-0.2g植物叶片, 转移至 1.5ml离心管中。
②加入 0.7ml CTAB (Tris lOOmM, NaCl 1.4M, 20mM EDTA, CTAB 2%, 巯基乙醇 0.1%), 60V , _ 30分钟。 每隔 10分钟, 颠倒一次。
③加 0.7ml酚:氯仿 (1: 1), 颠倒几次, 10000 rpm离心 5分钟, 转移上 清至一新的离心管, 加等体积的氯仿:异戊醇 (24: 1), 混匀, 10000 rpm离 心 5分钟。 转移上清至一新的离心管。
④加等体积的异丙醇, 颠倒混匀, 10000 rpm离心 10分钟, 除去上清,
70%乙醇洗一次, 抽干, 溶于 50 μ ΐ的无菌水中, 用于 PCR检测。
3 )转基因拟南芥 PCR检测:
正向引物: 35S启动子: 5,-TCTGCCGACAGTGGTCCCAA-3, 反向引物: ABP2 rv3: 5'-AGG AAC TCC TCC AGA GTC AT-3'
ABP4 rv3: 5'-TCG TCG AAC GTC AAC GAG TAG -3 '
ABP9 rv3: 5'-AAC CAATCC TCC GTT CTC ACC-3' 反应体系 (20 μ ΐ): 转基因植株 DNA l l(20ng~50ng); 10 X buffer 2 1; MgCl2(2.5mM) 2 μ 1; Taq酶 0.2 μ 1; dNTP(2.5mM) 2 μ 1;. 引物各加 10 μ Μ; 加无菌水至 20 μ 1。
反应条件: 94Ό, 5分钟; 94 45秒; 60°C, 45秒; 72°C, 45秒; 35 个循环; 72°C延伸 5分钟。 筛选出 PCR阳性植株。
实施例 7、 ABP2, ABP4、 ABP9转基因植株的生理分析实验
1)抗寒实验: 把转基因植株与未转基因植株置于 -6°C, 保持 6小时; 转 移到正常的生长条件下继续培养, 结果表明: 转基因植株的存活率为 80%, 未转基因的植株存活率为 10%, ABP2, ABP4, ABP9 能够明显提高植株的 抗寒性能, 结果如图 7所示。
2)抗盐实验: 把转基因植株与未转基因植株置于 600mM的 NaCl中浸泡 3小时; 22°C,光照培养 24小时; 转移到拟南芥正常的生长条件下继续培养, 结果表明: 转基因植株的存活率为 80%, 未转基因的植株存活率为 15%, ABP2、 ABP4 ABP9能够明显提高植株的抗盐性能, 结果如图 8所示。
3)抗旱实验: 把转基因植株与未转基因植株置于拟南芥正常的生长条件 下不给水连续培养 15~20天。 结果表明: 转基因植株的存活率为 90%, 未转 基因的植株存活率为 5%, ABP2、 ABP4、 ABP9能够明显提高植株的抗旱性 能, 结果如图 9所示, 其中 A为未转基因的植株, B为转基因植株。
工农业应用
本发明成功地克隆到了玉米 bZIP类转录因子 ABP2、 ABP4、 ABP9的编 码基因, 并成功地将其导入拟南芥中, 得到了抗非生物逆境的拟南芥, 对于 培育抗非生物逆境植物品种具有重要的理论及现实意义。