WO2003060504A1 - Method, device for carrying out this method, and separating means for separating particles in free-flow electrophoresis - Google Patents

Method, device for carrying out this method, and separating means for separating particles in free-flow electrophoresis Download PDF

Info

Publication number
WO2003060504A1
WO2003060504A1 PCT/CH2003/000035 CH0300035W WO03060504A1 WO 2003060504 A1 WO2003060504 A1 WO 2003060504A1 CH 0300035 W CH0300035 W CH 0300035W WO 03060504 A1 WO03060504 A1 WO 03060504A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
particles
charge
ffe
medium
separating
Prior art date
Application number
PCT/CH2003/000035
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Christoph Eckerskorn
Hans-Jörg Grill
Gerhard Weber
Peter Weber
David Yost
Original Assignee
Tecan Trading Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tecan Trading Ag filed Critical Tecan Trading Ag
Priority to EP20030729400 priority Critical patent/EP1468279A1/en
Priority to AU2003201253A priority patent/AU2003201253A1/en
Publication of WO2003060504A1 publication Critical patent/WO2003060504A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44795—Isoelectric focusing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • G01N27/44726—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means using specific dyes, markers or binding molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44769—Continuous electrophoresis, i.e. the sample being continuously introduced, e.g. free flow electrophoresis [FFE]

Definitions

  • the invention relates to a method and an apparatus for performing the method and separating means for separating particles in a free-flow electrophoresis device, in particular for separating cells or complexes of the same cell components, organelles or biomolecules, or of parts or complexes thereof, according to the The preamble of independent claims 1, 18, 26 and 27.
  • Free-flow electrophoresis is one of the most promising technologies for the separation of all possible particles [cf. Krivanova L. & Bocek P. (1998) "Continuous Free-Flow Electrophoresis” Electrophoresis 19: 1064-1074].
  • the FFE is the technology of choice for the pre-division of complex protein samples in relation to their different pl value (degree of ionization).
  • the FFE separates cells based on the electrophoretic mobility of the cells.
  • the corresponding principles have already been thoroughly characterized [cf. e.g. Bondy B., Bauer J., Seuffert I. and Weber G.
  • ASECS Antigen-specific electriophoretic cell separation
  • a generic FFE method is described in the international patent application PCT / EP01 / 14408. It is an electrophoresis se method in a device with a separation space through which a separation medium flows, which is delimited by a base and a cover and by these two spacers which are spaced apart from one another.
  • this FFE device comprises a pump for feeding the separation medium, which enters the separation space via media feeds and leaves it again via outlets.
  • the FFE device also includes electrodes for applying an electrical field in the separation medium and sample application points for adding a mixture of particles or analytes to be separated and fractionation points for removing particles separated by the FFE in the separation medium. These separated particles can be sent for analysis or further preparative processing.
  • two or more separate delivery channels of a metering pump are connected to the separation space in the region of the fractionation outlets near the electrodes in order to add medium.
  • U.S. Patent 5,948,231 discloses compounds, methods and devices for performing ultra-fast binding assays in capillary electrophoresis or in other electro-separation techniques such as e.g. in free flow electrophoresis.
  • the object of the present invention is to further improve the preparative or analytical isolation of particles, such as cells, organelles and biomolecules (e.g. protein complexes) and the like, or of bioparticles or biopolymers in the FFE.
  • particles such as cells, organelles and biomolecules (e.g. protein complexes) and the like, or of bioparticles or biopolymers in the FFE.
  • this object is achieved, according to a first aspect, by a free-flow electrophoresis method for separating particles, in particular for separating cells, cell components, organelles or biomolecules or parts or complexes thereof, with the features of independent claim 1 is proposed.
  • this object is achieved - according to a second aspect - by a free-flow electrophoresis device for carrying out the method for separating particles, in particular for separating cells, cell components, organelles or biomolecules or parts or complexes thereof , with the features of independent claim 18 is proposed.
  • this object is achieved - according to a third aspect - by separating means for separating particles, in particular for separating cells, cell components, organelles or biomolecules or parts or complexes thereof in a free-flow electrophoresis device, according to the features of independent claims 26 and 27, respectively.
  • particles are considered to be e.g. all particulate mass units, preferably of biological origin, such as cells, viruses, cell organelles, vesicles, cell nuclei and membranes, and parts or aggregates thereof; also biomolecules, such as lipids, proteins, DNA, RNA and sugar, and complexes or aggregates of biomolecules, such as lipoproteins, glycoproteins, lipopolysaccharides, etc.
  • biomolecules such as lipids, proteins, DNA, RNA and sugar, and complexes or aggregates of biomolecules, such as lipoproteins, glycoproteins, lipopolysaccharides, etc.
  • These particles also include organic and inorganic molecules, such as pharmaceuticals, polymers and the like.
  • a method according to the invention for separating such particles on the basis of the selectively modified surface charge - in particular for separating cells or cell components, organelles or biomolecules, or parts or complexes thereof, using the free-flow electrophoresis technique comprises the following advantages: • Magnetic beads are not suitable for the preparative separation of particles; in addition , only a single type of particle can be isolated with magnetic beads. Magnetic bead applications can therefore be replaced by the FFE according to the invention, if positive and negative charged carriers are used at the same time.
  • the FFE according to the invention allows simultaneous isolation of at least two types of particles with maximum efficiency, because the individual electrophoretic mobility of the particles is increased significantly and selectively.
  • living cells can be isolated qualitatively and quantitatively or on a preparative or analytical scale thanks to the specificity of the antibodies used and the separating power of the FFE.
  • the proposed free flow electrophoresis (FFE) device enables different separation techniques to be carried out with different and selective separation parameters.
  • the proposed FFE method enables not only the isolation but also the selective depletion of particles from a particle mixture, e.g. a depletion of abundant proteins (e.g. separation of serum albumin from body fluids, e.g. blood plasma).
  • a depletion of abundant proteins e.g. separation of serum albumin from body fluids, e.g. blood plasma.
  • Fig. IC are equipped with three epitopes of a second type
  • FIG. 3A the two epitopes of the first type are negatively charged, which makes the net surface charge of the cells strongly negative, and in FIG. 3B the three epitopes of the second type are positively marked, which makes the net surface charge of the cells strongly positive;
  • FIG. 4 shows a basic diagram of a device according to the invention for the simultaneous separation of two charge-marked cell types
  • Fig. 5 is a schematic representation of usable according to the invention
  • FIG. 6 shows schematic top views of devices according to the invention, wherein:
  • 6A and 6D show a CHIEF device with a linear pH gradient and a homogeneous field
  • 6B and 6E show a PZE device with a homogeneous pH value and a homogeneous field
  • Figures 6C and 6F show a CITP device with a pH gradient and a field gradient
  • Figure 1 shows cells to be separated as an example of particles 1, 1 ', 1 "to be separated. These cells can be equipped without specific epitopes (see FIG. 1A). Such cells have a relatively low negative net surface charge and are very difficult to separate in the FFE. However, if the cells have epitopes of a first type 2 '(FIG. 1B) or a second type 2 "(FIG. IC), these cells can be labeled epitope-specifically with charge-carrying molecules or charge carriers.
  • the net Surface charge of particles can be changed selectively by binding charged binding molecules to these particles. This binding can be based on an antigen-antibody interaction.Other interactions which can be used for the inventive modification of the net surface charge of particles for coupling binding molecules to the separating particles also include receptor-ligand, enzyme-substrate and protein-protein interactions, including chelation or binding based on general molecular interactions, be it ionic or based on Van der Waals forces or hydrogen bonds , but a covalent bond can also be used for this purpose.
  • relevant cells can be extracted from body fluids (eg disseminated tumor cells from blood, sputum, ascites, urine, lavage etc.) or from tissue homogenates (eg solid tumors in the kidney, thymus) etc.) or organelles from cell homogenates (eg calciosomes, coated vesicles, endosomes, endopiasmatic reticulum, Golgi cisterns, lysosomes, peroxisomes and mitochondria) and proteins from proteomes or expression systems.
  • body fluids eg disseminated tumor cells from blood, sputum, ascites, urine, lavage etc.
  • tissue homogenates eg solid tumors in the kidney, thymus
  • organelles from cell homogenates eg calciosomes, coated vesicles, endosomes, endopiasmatic reticulum, Golgi cisterns, lysosomes, peroxisomes and mitochondria
  • FIG. 2 shows an epitope-specific antibody and two monomeric or polymeric charge carriers or “charge labels” (cf. “CL” in FIG. 5) in the form of cations 4 or anions 5.
  • a charge carrier 4, 5 is a at a given pH -Value ionized molecule. It can be anionic or cationic, monomeric or polymeric. With the help of such charge carriers 4, 5, the net surface charge of particles can be changed in a targeted manner. Charged particles such as beads can also be used as charge carriers.
  • anionic charge carriers 5 are: polyglutamic acid (PGA); anionic or derivatized proteins such as albumin; anionic polysaccharides such as heparin or alginic acid, polyaspartic acid, polyacrylic acid and polyamic acids with a net negative charge at a usable pH (for example in the range from pH 4 to 10).
  • Anionic polymers with a molecular weight of 500 to about 500,000 Daltons are preferred.
  • Several monomeric or polymeric charge carriers can also be bound to a specific binding molecule in order to further develop the net surface charge of the particles to be separated.
  • Examples of preferred cationic charge carriers 4 include homopolymeric or copolymeric proteins with a preferred molecular weight of 500-5000000 daltons; quaternary ammonium compounds with between 1% and 10% nitrogen content (without counter ion).
  • Commercially available quaternary ammonium polymer compounds include, for example, the products MERQUAT.RTM. (Calgon, Pittsburgh, PA, USA), CELQUAT.RTM. (National Starch and Chemical Corp., Bridgewater, NJ, USA), GAFQUAT.RTM.
  • binding molecule 3 Such an antibody (cf. FIG. 2) is referred to below as binding molecule 3 or “binding molecule”.
  • the bond between a binding molecule 3 and a particle 1 ′, 1 ′′ and the bond between a charge carrier 4, 5 and the binding molecule 3 can be covalent or non-covalent (eg adsorptive, on Van der Waals forces or hydrogen bonds, on one Biotin-streptavidin interaction, etc.)
  • the binding molecule 3 can be, for example, an antibody (cf. FIG.
  • FIG. 3 shows cells to be separated with corresponding epitopes 2 ', 2 ".
  • the two epitopes of the first type 2' are negative in FIG. 3A and the three epitopes of the second type 2" are positively marked in FIG. 3B.
  • the net surface charge of the marked cells is therefore greatly changed, so that these cells behave differently with their specifically changed net surface charge in the FFE.
  • the net surface charge of the cells is preferably changed such that a cell type in a separation medium 8 of a device according to the invention against the cathode 9 and the other cell type moves against the anode 10, as shown in the schematic diagram of Figure 4.
  • the two groups of charge-modified particles 7 ', 7 "and the two charge-modified cell types 7', 7” move away essentially simultaneously of the unmarked or non-charge-modified background cells 7, which move essentially in the middle (or at least at a great distance from the electrodes 9, 10 in the separation medium 8 of the device according to the invention.
  • the arrow indicates the main flow direction of the separation medium 8
  • the various, separate cell types are collected and collected in a collecting area 11 he forwarded for further use. Collecting takes place in a manner known per se via discharge openings arranged in a row.
  • the resolution of the FFE is essentially determined by the migration behavior of the particles 7, 7 ', 7 "and the size and number of the outlet openings.
  • the separation space 14 comprises the space for the separation medium 8 and the two lateral areas 19 near the electrodes for the the focusing cushion 12, 13 formed by the cushion medium 20 (cf. also FIG. 7).
  • one focusing pad 12, 13 is preferably used a likewise flowable, electrically highly conductive separating material, provided in the immediate vicinity of the electrodes 9, 10. Due to its high electrical conductivity, this focusing pad 12, 13 prevents the charge-modified particles 7 ', 7 "from being able to diffuse all the way to the respective electrode.
  • a concentration of the charge-modified particles occurs at the boundary between the separation medium 8 and the pad medium 20 7 ', 7 "as shown in Fig. 7B. Separating medium 8 and cushion medium 20 preferably flow in the same direction.
  • FIG. 5 shows a schematic illustration of separating agents which can be used according to the invention in a possible arrangement and interaction with a particle to be separated.
  • the charge-modified particle 7 ', 7 “here consists of a protein P to which a chain of histidine molecules H (a so-called” His tag ”) has been attached in a manner known per se.
  • a charged binding molecule 6 is bound to this His tag
  • This charged binding molecule 6 consists of nickel-nitrilo-tetraacetic acid (Ni-NTA), which binds to two histidine molecules, here the anionic charge carrier 5 is covalently bound to the nickel-nitrilo-tetraacetic acid, the binding molecule 3.
  • Ni-NTA nickel-nitrilo-tetraacetic acid
  • FIG. 6 shows schematic top views of devices according to the invention.
  • This free-flow electrophoresis device comprises at least one separation space 14 through which a separation medium 8 can flow.
  • This separation space is delimited by a base and a cover and by these two spacers which are spaced apart from one another.
  • This FFE device also includes a metering pump (not shown) for conveying the separating medium 8, which enters the separating space 14 via media feeds 15, 15 'and leaves it again via outlets 16.
  • the FFE device comprises electrodes 9, 10 for applying an electric field in the separation medium 8 as well as sample application points 17 for adding a mixture of particles 7, 7 ', 7 "to be separated and fractionation points 18 for removing particles separated by the FFE in the separation medium 8
  • Two separate delivery channels 15 'of the metering pump are connected to the separating space 14 in the area of the electrode hen fractionation outlets 16 'connected to add medium.
  • These two separate delivery channels of the metering pump are preferably used to form an electrically highly conductive focusing or guide cushion for the charge-modified particles 7 ', 7 "in the regions 19 of the separation medium 8 near the electrodes and are provided with a separate medium container (not shown) for providing an electrical one highly conductive pillow media.
  • the FFE separation technique of continuous isoelectric focusing is based on the different pI value of the particles to be separated.
  • This pI value corresponds to the pH of the surrounding, inhomogeneous medium, against which the particles appear neutral.
  • the FFE of particles due to their different isoelectric point enables the isolation of analytes or particles with the smallest differences in their pI values.
  • the total charge or net surface charge is at the isoelectric point p 1 (ie at the location of the separation medium 8 which has just the pH at which the number of negative and positive charges is the same for a given particle (for example a protein molecule)) of this particle is zero.
  • the focusing effect inherent in the separation medium 8 of a CHIEF device has the effect that a particle l ', l "which diffuses away from the pl automatically receives a (positive or negative) net surface charge again and is moved back to the pl by the electric field.
  • the process of continuous isoelectric focusing is particularly suitable for the micro-preparative to preparative isolation of biopolymers in general and of bioparticles whose biological function or integrity is ensured in the range of the selected pH gradient in the separation medium. This applies in the case of many representatives of viruses, bacteria, cell organelles and membrane domains, as a result of Addition of "osmotic expanders" can ensure the maintenance of an ideal osmotic pressure: By adding uncharged substances (e.g.
  • osmotic pressure is generated for a cell type, ie isomolar conditions are generated (eg for mammalian cells 250-310 mosmol).
  • FIG. 6 shows an inventive device for separating charge-modified particles 7 ', 7 "from non-charge-modified particles 7 in a separation medium 8 which flows in a separation space 14 between two electrodes 9, 10 (large arrow, 8).
  • the separation space 14 comprises the space for the separation medium 8 and two lateral regions 19 near the electrodes for the guide or focusing cushions formed with the cushion medium 20.
  • the electrodes 9, 10 are preferably designed as electrode spaces, from an electrode buffer contacted by an electrical lead 23, 23 ' 24 flow through and have a preferably semi-permeable membrane 25 in relation to the separation space 14.
  • the electrode buffer 24 is introduced into the electrode spaces via separate feed lines 26, 26 '(only partially shown in FIG. 6) and also leaves them via separate outlets 27, 27'.
  • An additional one is preferably used for circulating and, if appropriate, also for cooling the electrode buffer he pumping device (not shown) is used.
  • FIG. 6A shows such a CHIEF device with a linear pH gradient.
  • a separation medium 8 flows in a laminar movement (preferably from the bottom upwards in an inclined separation space) between the two electrodes (large arrow), is braked in the area of the outlet openings by a counterflow of separation medium (small arrow) and leaves the separation space 14 in fractions via the outlet openings.
  • a sample with three particle groups to be separated is added to the separation medium via the sample inlet and moved with the laminar flow of the separation medium. The three particle groups are continuously separated, focused and collected in separate fractions in the pH gradient, which is generated by the electric field generated between the electrodes in the separation medium.
  • the electrical conductivity of the separation medium 8 between the two preferably provided focusing pads 12, 13 - with high conductivity in the regions 19 near the electrodes - is relatively low and homogeneous.
  • the pH gradient is built up in the separation medium 8 between the two focusing pads.
  • FFE separation technique of continuous FFE zone electrophoresis is based on the difference in the value of the electrophoretic mobility of the particles to be separated compared to the separation medium used. FFE zone electrophoresis thus enables the isolation of analytes or particles on the basis of their different sizes and / or shapes and / or net surface charge.
  • the process of continuous FFE-PZE is particularly suitable in the case of the separation of "sensitive" bioparticles and complexes, the separation of which has to meet special requirements for the separation medium. This is particularly the case if the biological function and integrity of these particles should also be guaranteed after the separation. In these cases, special requirements apply: narrowly limited pH range of the separation media, good buffer capacity of the separation media, physiological tolerance of the buffer substances used, minimum contents of various "essential" cations and anions etc. Although the usual cell culture media are not very compatible with all techniques of Apply electrophoresis, the successful separation of cells with FFE-PZE is possible.
  • FIG. 6B shows such a PZE device, in which the samples are separated on the basis of their charge and to a lesser extent on the basis of their shape and size.
  • the electrical conductivity of the Separating medium 8 between the two focusing pads 12, 13 - with high conductivity in the regions 19 near the electrodes - is relatively small and homogeneous.
  • the pH value is the same in the entire separation medium.
  • the FFE separation technique of continuous isotachophoresis is also based on the difference in the value of the electrophoretic mobility of the particles to be separated.
  • the separation takes place in inhomogeneous separation media and offers a better resolution due to an inherent "focusing effect": If individual ponds diffuse away from a separated band of particles (eg proteins) during CITP, these particles enter into one Medium with different electric field strength, which accelerates or slows the particles.
  • the inherent focusing effect means that the slower or faster migrating particles find their way back into the main fraction.
  • This FFE separation technique is suitable in principle for bioparticles and cells whose separation in media without special "essential cations” (eg Mg ++ or Ca ++ ) or ' “essential anions” (eg CI " ), which are responsible for stability and Cell vitality is important, is not possible.
  • essential cations eg Mg ++ or Ca ++
  • essential anions eg CI "
  • FIG. 6C shows such a CITP device in which so-called "discrete spacers" are used.
  • discrete spacers are ions with well-known, defined mobility which crowd in the ISCO between particles to be separated and contribute to the 'separation to proceed efficiently. Precisely defined ampholytes can also be used as such discrete spacers.
  • the electrical conductivity of the separating medium 8 between the two focusing pads 12, 13 - with high conductivity in the regions 19 near the electrodes - is at least partially gradient-like and inhomogeneous.
  • Separating medium 8 is built up between the two focusing pads 12, 13, the areas of the two gradients essentially coinciding and both pH values and the electrical conductivity in the area of the focusing pads 12, 13 are each of different heights.
  • CHIEF and FFE-PZE or CHIEF and CITP are possible.
  • Different separation media are used at the same time in the separation area of the FFE apparatus and thus different separation parameters are used at the same time.
  • the device proposed according to the invention and the method proposed according to the invention allow continuous operating modes to be carried out, in which the separation of the particles 7, 7, ', 7 "is carried out with continuous flow of separation medium, permanent application of the electric field during the entire separation and continuous collection.
  • continuously preparative sample is added continuously with the same separation conditions
  • semi-preparative / analytical discontinuous sample addition with the same separation conditions.
  • the separating medium 8 flows continuously: the sample application takes place when the high voltage is switched off; After stopping the sample application, the medium transport is switched off or greatly reduced or reduced. The high voltage is then switched on until the sample has been separated. After a predetermined time, the voltage is switched off and the separated sample is eluted from the separation chamber with an increased medium flow and collected.
  • FIG. 7 shows the effect of the focusing pillows 12, 13, the boundary of the focusing pillow with the electrically highly conductive pillow medium 20, which runs essentially parallel to the electrode 9, 10, being indicated by dashed lines. If a focusing pad is not produced (FIG. 7A), a normal distribution (hatched) of the particles separated from a rest of a sample by means of the selectively changed net surface charge is obtained.
  • a substantially larger quantity of these particles can be removed in a higher concentration from the FFE device and used for further use;
  • the use of such a focusing pad 12, 13 represents a significant improvement -
  • the use of a focusing pad for the fine separation of identical subunits biomolecules or their complexes appears to be less advantageous.
  • the guide or focusing pads 12, 13 are thus formed by a buffer 20, which has a greatly increased electrical conductivity compared to the separation medium 8.
  • the electrophoretic separating power in the focusing pads 12, 13 decreases so much that the charge-modified particles 7 ', 7 "on the Interface between the separation medium 8 and the focusing pads 12, 13 are focused.
  • EPG epidermaal glycoprotein
  • This EPG is also expressed by tumor cells of epithelial tumors (Moldenhauer G, Momburg F, Möller P, Schwartz R, Hämmerling GJ. Epithelium-specific surface glycoprotein of Mr 34,000 is widely distributed carcinoma marker. BrJ Cancer 1987; 56: 714-21).
  • This monoclonal antibody is modified for immune FFE in two ways:
  • a charge carrier 4, 5 is directly and covalently coupled to the antibody (the binding molecule 3).
  • Streptavidin is covalently coupled to the antiserum. Freely selectable, biotinylated charge carriers 4,5 are then bound to the streptavidin.
  • citrated or heparin whole blood from patients with, for example, breast, ovarian or colon carcinoma is either used directly or prepared as follows:
  • Electrophoresis 16 92-97
  • Peroxysomes are cell organelles that carry out oxidative reactions with molecular oxygen. They generate oxygen peroxide for oxidative purposes.
  • Highly enriched peroxysomes can e.g. from rat liver via an elaborate density gradient centrifugation using the method of Lüers et al. Isolation (Lüers GH, Hartig R, Mohr H, Hausmann M, Fahimi HD, Cremer C, Völkl A. Immuno-isolation of highly purified peroxisomes using magnetic beads and continuous immunomagnetic sorting. Electrophoresis 1998; 19: 1205-210): 1 Homogenization of rat liver using methods known per se.
  • the supernatant is incubated with an antibody modified with charge carriers 4.5 against a membrane protein of the peroxysomes (e.g. PMP70; 70 kDa cytoplasmic membrane protein of peroxysomes, antibodies against the C-terminal, eleven amino acids long, cytoplasmic end).
  • a membrane protein of the peroxysomes e.g. PMP70; 70 kDa cytoplasmic membrane protein of peroxysomes, antibodies against the C-terminal, eleven amino acids long, cytoplasmic end.
  • the separation with immuno-FFE was carried out as by A. Völkl, H. Mohr, G. Weber and H.D. Fahimi described (Electrophoresis 1998, 19, 1140-1144), at a separation medium temperature of 4 ° C and at a pH of 8.0 in an electric field of 100,000 V and 100 mA and a separation medium flow rate of about 5 ml / Fraction per hour.
  • the samples were introduced into the separation chamber at about 2 ml / hour and the separated fractions were collected using a 96-channel peristaltic pump. Each individual separation attempt took about 60 to 90 minutes.
  • Example C Isolation of recombinant proteins
  • vectors which can attach a cassette of 5-10 histidines to the protein to be expressed at the 5 'or 3' end of a construct (His tags, see FIG. 5). These additional histidines are used for later purification of the expressed proteins.
  • Other vectors contain, for example, glutathione-S-transferase as an additional element. These vectors are suitable for the expression of recombinant proteins, for example in E. coli, baculovirus-infected bacteria and mammalian cells. Appropriate methods for producing recombinant proteins are known to the person skilled in the art.
  • Ni-NTA nickel nitrilotriacetic acid
  • the solid phase can be packed in preparative purifications in chromatography columns (e.g. Ni-NTA agarose), for analytical applications (e.g. Ni-NTA) magnetic particles are available.
  • the immune FFE according to the invention shown in FIG. 5, which comprises the following steps, is particularly suitable for the purification of recombinant proteins:
  • Lysis of the cells e.g. yeast, bacteria, mammalian cells
  • Binding of charge carriers 4,5 to the His-tagged proteins Variant 1: Binding of the charge carriers 4, 5 to a binding molecule 3 in the form of Ni-NTA and binding of this charged binding molecule 6 to the His tags; or
  • Variant 2 Binding of the charge carriers 4,5 to a binding molecule 3 in
  • His-tagged proteins can either now be used directly or the His-Tags are cleaved off enzymatically before further use.
  • variant 1 For variant 1: a) detachment of the chelate by known incubation with imidazole and, if necessary, renewed purification of the protein for FFE; b) Known enzymatic cleavage of the His tag with thrombin or exoprotease and, if necessary, renewed purification of the isolated protein for FFE.
  • variant 2 For variant 2: c) Detach the antibodies using methods known per se, for example by changing the salt concentration or the pH. d) Enzymatic cleavage of the His tags using methods known per se. e) Clean again with FFE.
  • the charge label or the charge carriers or the agent carrying the charge carrier can also be additionally marked (e.g. with a dye). This enables detection during or after the FFE.
  • Charge carriers could also be all types of particles (e.g. beads of all types, such as latex, agarose particles, colloids, etc.).
  • Charge carriers can also be virtually any combination of beads and / or antibodies and / or charge-carrying molecules and / or fluorescent markers and / or dyes.
  • Beads can e.g. be colored with fluorescent or other dyes. Beads can carry a fluorescent label (inside or outside), the charge label and the binding molecule (e.g. antibody or Ni-NTA) at the same time.
  • beads that have an enzymatically cleavable bridge, then after cleaning (e.g. cleaning of recombinant proteins with Ni-NTA) the beads can be cleaved from the purified molecule.
  • Beads that are fluorescent and that are provided on the surface with charge carriers and binding molecules are particularly preferred.
  • the separation of particles according to the invention enables concentrated collection or enrichment of biologically relevant particles, the analysis or use of which in diagnostic or therapeutic processes has not previously been possible because of the background of too many related but irrelevant particles present at the same time.
  • the FFE methods and devices presented thus enable isolation and consequently the use of particles naturally present in extremely low concentrations or the provision of their biologically relevant information for use in diagnostic or therapeutic processes.
  • the isolated particles can be used to find and characterize targets for the development of medicaments, targets for use in diagnostics, therapy selection and therapy monitoring both for humans and for animals and plants.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Electrostatic Separation (AREA)

Abstract

The invention relates to a method, a device for carrying out this method, and to separating means for separating particles in free-flow electrophoresis (FFE). To this end, this free-flow electrophoresis (FFE) method, while using, in particular, a free-flow electrophoresis device having a separating space (14), a dosing pump for delivering a separating medium (8), electrodes (9, 10) for applying an electrical field to the separating medium (8), sample feeding locations (17) for adding a mixture of particles that is to be separated, and fractionating locations (18) for carrying away particles (1, 1', 1'') in the separating medium (8) that are separated using the FFE method, comprises the following steps: providing a separating medium (8); delivering the separating medium (8) by means of a dosing pump via media supply lines (15, 15') into the separating space (14); passing the separating medium (8) through the separating space (14); letting the separating medium (8) flow out via outlets (16); applying an electrical field to the separating medium (8); combining a particle (1', 1 ) to be separated with selectable charge carries (4, 5) for producing charge-modified particles (7', 7 ) that due to their selectively modified net-surface charge have, during the FFE, a different migration behavior than non-charge-modified particles (7); adding a mixture of particles (1, 1', 1'') that is to be separated to the separating medium (8) in the separating space (14) via the sample feeding locations (17); carrying away particles (1, 1', 1''), which are separated using the FFE method and contained in the separating medium, via fractionating locations (18), and; collecting the fractions with the separated particles. The inventive method is characterized in that guiding or focussing pads (12, 13) are formed between the separating medium (8) and at least one electrode (9, 10) by a pad medium (20), whereby this pad medium (20) has an electrical conductivity that is much greater than that of the separating medium (8) and is supplied via separate channels (15') to said focussing pads (12, 13).

Description

Verfahren sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens und Trennmittel zum Trennen von Teilchen in der Free-Flow-Elektrophorese Method and device for carrying out the method and separating means for separating particles in free-flow electrophoresis
Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens und Trennmittel zum Trennen von Teilchen in einer Free-Flow- Elektrophoresevorrichtung, insbesondere zum Auftrennen von Zellen oder Komplexen derselben Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen, bzw. von Teilen oder Komplexen derselben, entsprechend dem Oberbegriff der unabhängigen Ansprüche 1, 18, 26 und 27.The invention relates to a method and an apparatus for performing the method and separating means for separating particles in a free-flow electrophoresis device, in particular for separating cells or complexes of the same cell components, organelles or biomolecules, or of parts or complexes thereof, according to the The preamble of independent claims 1, 18, 26 and 27.
Eine wichtige Problematik in der Diagnostik und in der Forschung betrifft die exakt definierte Probenpräparation. Die heute gebräuchlichen Technologien, wie z.B. Zentrifugation, Filtrierung, Magnetseparation und FACS (Fluorescence Acti- vated Cell Sorting) haben verschiedenste Nachteile, wie eingeschränkte Spezi- fität, niedrige Durchsatzrate, geringes Reinigungsvermögen oder auch teure Vorrichtungen zur Isolierung und Reinigung von Zellen, Organellen oder Biomo¬ lekülen (z.B. Proteinkomplexen). Die wichtigsten Anwendungen für die Reinigung von Zellen, Organellen und Biomolekülen (z.B. Proteinkomplexen)finden sich in Bereichen der Biopharmazie, Biotechnologie, Umweltanalytik, Lebensmitteltechnologie und in der Medizin. Die angewandten Techniken sind entweder präparativ (Biopharmazie und Biotechnologie) oder analytisch (Umweltanalytik, Lebens-mitteltechnologie und in der Medizin) ausgerichtet.An important problem in diagnostics and in research concerns the precisely defined sample preparation. The technologies currently in use such as centrifugation, filtration, magnetic separation and FACS (fluorescence activated cell sorting) have various disadvantages, such as restricted specifications. fität, low throughput, low detergency or expensive apparatus for the isolation and purification of cells, organelles or Biomo ¬ lekülen (eg protein complexes). The most important applications for the cleaning of cells, organelles and biomolecules (eg protein complexes) can be found in the areas of biopharmaceuticals, biotechnology, environmental analysis, food technology and in medicine. The techniques used are either preparative (biopharmaceutical and biotechnology) or analytical (environmental analysis, food technology and in medicine).
Die Free-Flow-Elektrophorese (FFE) ist eine der vielversprechendsten Technologien für die Auftrennung aller möglicher Teilchen [vgl. Krivanova L. & Bocek P. (1998) "Continuous free-flow electrophoresis" Electrophoresis 19 : 1064-1074]. Im Proteomics-Bereich ist die FFE die Technologie der Wahl für die definierte Voraufteilung von komplexen Proteinproben in Bezug auf deren unterschiedli- chen pl-Wert (Ionisierungsgrad). Die Auftrennung von Zellen durch die FFE erfolgt auf Grund der elektrophoretischen Mobilität der Zellen. Die entsprechenden Prinzipien wurden bereits gründlich charakterisiert [vgl. z.B. Bondy B., Bauer J., Seuffert I. und Weber G. (1995) "Sodium Chloride in Separation medium enhances cell compatibility of free-flow electrophoresis", Electrophoresis 16 : 92-97], hingegen wurde die FFE bislang nur wenig akzeptiert, weil die meisten Zeil-Typen sich in ihrer Oberflächenladung nur geringfügig unterscheiden und eine Auftrennung dieser Zelltypen deshalb schwierig ist. Eine erste Verbesserung brachte die Einführung der Immuno-FFE, bei der spezifische Antikörper an definierte Oberflächenepitope der aufzutrennenden Zellen gebunden werden und so über eine veränderte Nettoladung der Zelloberfläche eine modifizierte elekrophoretische Mobilität dieser Zellen in der FFE erzielt werden konnte [vgl. z.B. Hansen E. und Hannig K. (1982) "Antigen-specific electriophoretic cell Separation (ASECS) : Isolation of human T and B lymphocyte subpopulations by free-flow electrophoresis after reaction with antibodies", J. Immunol. Methods 11, 51 : 197-208].Free-flow electrophoresis (FFE) is one of the most promising technologies for the separation of all possible particles [cf. Krivanova L. & Bocek P. (1998) "Continuous Free-Flow Electrophoresis" Electrophoresis 19: 1064-1074]. In the field of proteomics, the FFE is the technology of choice for the pre-division of complex protein samples in relation to their different pl value (degree of ionization). The FFE separates cells based on the electrophoretic mobility of the cells. The corresponding principles have already been thoroughly characterized [cf. e.g. Bondy B., Bauer J., Seuffert I. and Weber G. (1995) "Sodium Chloride in Separation medium enhances cell compatibility of free-flow electrophoresis", Electrophoresis 16: 92-97], however the FFE has so far been little accepted , because most Zeil types differ only slightly in their surface charge and it is therefore difficult to separate these cell types. The first improvement was the introduction of the Immuno-FFE, in which specific antibodies are bound to defined surface epitopes of the cells to be separated and thus a modified electrophoretic mobility of these cells in the FFE could be achieved by changing the net charge of the cell surface [cf. e.g. Hansen E. and Hannig K. (1982) "Antigen-specific electriophoretic cell separation (ASECS): Isolation of human T and B lymphocyte subpopulations by free-flow electrophoresis after reaction with antibodies", J. Immunol. Methods 11, 51: 197-208].
Ein gattungsgemässes FFE-Verfahren wird in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP01/14408 beschrieben. Es handelt sich dabei um ein Elektrophore- se-Verfahren in einer Vorrichtung mit einem von einem Trennmedium durch- flossenen Trennraum, der durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt ist. Zudem umfasst diese FFE-Vorrichtung eine Pumpe zum Zuführen des Trennme- diums, welches über Medienzuführungen in den Trennraum gelangt und diesen über Auslässe wieder verlässt. Die FFE-Vorrichtung umfasst ausserdem Elektroden zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium sowie Probeaufgabestellen zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen bzw. Analyten und Fraktionierstellen zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen im Trennmedium. Diese abgetrennten Teilchen können einer Analyse oder einer präparativen Weiterverarbeitung zugeführt werden. Zum Beeinflussen des Strömungsprofils des Trennmediums kann vorgesehen sein, dass zwei oder mehrere separate Förderkanäle einer Dosierpumpe mit dem Trennraum im Bereich der elektrodennahen Fraktionierauslässe verbunden sind, um Medium zuzugeben.A generic FFE method is described in the international patent application PCT / EP01 / 14408. It is an electrophoresis se method in a device with a separation space through which a separation medium flows, which is delimited by a base and a cover and by these two spacers which are spaced apart from one another. In addition, this FFE device comprises a pump for feeding the separation medium, which enters the separation space via media feeds and leaves it again via outlets. The FFE device also includes electrodes for applying an electrical field in the separation medium and sample application points for adding a mixture of particles or analytes to be separated and fractionation points for removing particles separated by the FFE in the separation medium. These separated particles can be sent for analysis or further preparative processing. To influence the flow profile of the separation medium, it can be provided that two or more separate delivery channels of a metering pump are connected to the separation space in the region of the fractionation outlets near the electrodes in order to add medium.
Das Patent US 5,948,231 offenbart Verbindungen, Verfahren und Vorrichtungen zum Ausführen von ultraschnellen Bindungs-Assays in der Kapillar-Elektropho- rese oder in anderen Elektroseparations-Techniken wie z.B. in der Free Flow Elektrophorese.U.S. Patent 5,948,231 discloses compounds, methods and devices for performing ultra-fast binding assays in capillary electrophoresis or in other electro-separation techniques such as e.g. in free flow electrophoresis.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die präparative bzw. analytische Isolation von Teilchen, wie Zellen, Organellen und Biomolekülen (z.B. Proteinkomplexen)und dergleichen, bzw. von Biopartikeln oder Biopoly- eren in der FFE weiter zu verbessern.The object of the present invention is to further improve the preparative or analytical isolation of particles, such as cells, organelles and biomolecules (e.g. protein complexes) and the like, or of bioparticles or biopolymers in the FFE.
Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe - gemäss einem ersten Aspekt - gelöst, indem ein Free-Flow-Elektrophorese-Verfahren zum Trennen von Teilchen, insbesondere zum Auftrennen von Zellen, Zellbestandteilen, Organellen oder Bio- molekülen bzw. von Teilen oder Komplexen derselben, mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 1 vorgeschlagen wird. Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe - gemäss einem zweiten Aspekt - gelöst, indem eine Free-Flow-Elektrophorese-Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zum Trennen von Teilchen, insbesondere zum Auftrennen von Zellen, Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen bzw. von Teilen oder Komple- xen derselben, mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 18 vorgeschlagen wird.According to the invention, this object is achieved, according to a first aspect, by a free-flow electrophoresis method for separating particles, in particular for separating cells, cell components, organelles or biomolecules or parts or complexes thereof, with the features of independent claim 1 is proposed. According to the invention, this object is achieved - according to a second aspect - by a free-flow electrophoresis device for carrying out the method for separating particles, in particular for separating cells, cell components, organelles or biomolecules or parts or complexes thereof , with the features of independent claim 18 is proposed.
Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe - gemäss einem dritten Aspekt - gelöst, indem Trennmittel zum Trennen von Teilchen, insbesondere zum Auftrennen von Zellen, Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen bzw. von Teilen oder Komplexen derselben in einer Free-Flow-Elektrophorese-Vorrichtung, entsprechend den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 26 bzw. 27 vorgeschlagen werden.According to the invention, this object is achieved - according to a third aspect - by separating means for separating particles, in particular for separating cells, cell components, organelles or biomolecules or parts or complexes thereof in a free-flow electrophoresis device, according to the features of independent claims 26 and 27, respectively.
Weitere bevorzugte Merkmale ergeben sich jeweils aus den abhängigen Ansprüchen.Further preferred features result from the dependent claims.
Als Teilchen oder "particle" gelten im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung z.B. alle partikulären Masseneinheiten vorzugsweise biologischen Ur- sprungs, wie Zellen, Viren, Zellorganellen, Vesikel, Zellkerne und Membranen sowie Teile oder Aggregate derselben; zudem Biomoleküle, wie Lipide, Proteine, DNA, RNA und Zucker, sowie Komplexe oder Aggregate von Biomolekülen, wie Lipoproteine, Glykoproteine, Lipopolysaccharide usw.. Zu diesen Teilchen zählen auch organische und anorganische Moleküle, wie Pharmaka, Polymere und der- gleichen.In the context of the present invention, particles are considered to be e.g. all particulate mass units, preferably of biological origin, such as cells, viruses, cell organelles, vesicles, cell nuclei and membranes, and parts or aggregates thereof; also biomolecules, such as lipids, proteins, DNA, RNA and sugar, and complexes or aggregates of biomolecules, such as lipoproteins, glycoproteins, lipopolysaccharides, etc. These particles also include organic and inorganic molecules, such as pharmaceuticals, polymers and the like.
Ein erfindungsgemässes Verfahren zum Trennen von solchen Teilchen auf Grund der selektiv modifizierten Oberflächenladung - insbesondere zum Auftrennen von Zellen oder Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen, bzw. von Tei- len oder Komplexen derselben mittels der Free-Flow-Elektrophorese-Technik umfasst folgende Vorteile: • Magnet-Beads eignen sich nicht zur präparativen Trennung von Teilchen; zu¬ dem kann mit Magnet-Beads nur jeweils ein einziger Teilchentypus isoliert werden. Magnet-Bead-Anwendungen können deshalb - falls gleichzeitig positiv und negative geladene Ladungsträger verwendet werden - durch die er- findungsgemässe FFE ersetzt werden. Die erfindungsgemässe FFE erlaubt eine simultane Isolation von mindestens zwei Teilchentypen mit einer maximalen Effizienz, weil die individuelle elektrophoretische Mobilität der Teilchen wesentlich und selektiv erhöht wird.A method according to the invention for separating such particles on the basis of the selectively modified surface charge - in particular for separating cells or cell components, organelles or biomolecules, or parts or complexes thereof, using the free-flow electrophoresis technique comprises the following advantages: • Magnetic beads are not suitable for the preparative separation of particles; in addition , only a single type of particle can be isolated with magnetic beads. Magnetic bead applications can therefore be replaced by the FFE according to the invention, if positive and negative charged carriers are used at the same time. The FFE according to the invention allows simultaneous isolation of at least two types of particles with maximum efficiency, because the individual electrophoretic mobility of the particles is increased significantly and selectively.
• Viele FACS-Anwendungen können durch FFE-Anwendungen ersetzt und mit wesentlich kostengünstigeren und schnelleren Vorrichtungen, nach Wunsch auch automatisiert, durchgeführt werden.• Many FACS applications can be replaced by FFE applications and can be carried out with much cheaper and faster devices, if required also automated.
• Spezifisch ausgewählte, lebende Zellen können dank der Spezifität der ver- wendeten Antikörper und der Trennkraft der FFE qualitativ und quantitativ bzw. im präparativen oder analytischen Massstab isoliert werden.• Specifically selected, living cells can be isolated qualitatively and quantitatively or on a preparative or analytical scale thanks to the specificity of the antibodies used and the separating power of the FFE.
• Erstmals wird es möglich, eine sanfte Präparation zur Gewinnung einer hochreinen Population von Organellen auszuführen.• For the first time, it is possible to carry out a gentle preparation to obtain a highly pure population of organelles.
• Im präparativen bzw. analytischen Massstab können Teilchengemische in relativ grosser Menge innerhalb kurzer Zeit exakt getrennt werden. Als ein Beispiel dient die Aufreinigung zirkulierender Tumorzellen aus Vollblut (Tumorzellen kommen im Verhältnis von 1 : 106 bis 1 : 108 in Vollblut vor) : Aus hepari- nisiertem Vollblut wurden die weissen Blutkörperchen (2 ml MNC-Fraktion aus• On a preparative or analytical scale, particle mixtures in a relatively large amount can be separated precisely within a short time. An example is the purification of circulating tumor cells from whole blood (tumor cells occur in the ratio of 1:10 6 to 1: 10 8 in whole blood): The white blood cells (2 ml MNC fraction) were removed from heparinized whole blood
10 ml Vollblut) inkl. der Tumorzellen mittels eines Dichtegradienten von den roten Blutkörperchen abgetrennt und nach entsprechender Markierung der Tumorzellen (Inkubation mit epitopspezifischen Antikörpern mit "charge labeis") auf die FFE zur Trennung aufgegeben. Die Zugabe erfolgte mit 4 bis 10 ml/Stunde. Die gereinigten Tumorzellen konnten in 2-8 ml Endvolumen gewonnen werden. • Die vorgeschlagene Free Flow Elektrophorese (FFE) - Vorrichtung ermöglicht die Durchführung verschiedener Trenntechniken mit unterschiedlichen und selektiven Trenn parametern.10 ml of whole blood) including the tumor cells were separated from the red blood cells using a density gradient and, after appropriate labeling of the tumor cells (incubation with epitope-specific antibodies with "charge labeis"), were applied to the FFE for separation. The addition took place at 4 to 10 ml / hour. The purified tumor cells could be obtained in a final volume of 2-8 ml. • The proposed free flow electrophoresis (FFE) device enables different separation techniques to be carried out with different and selective separation parameters.
• Das vorgeschlagene FFE-Verfahren ermöglicht nicht nur die Isolation sondern auch die selektive Depletion von Teilchen aus einem Teilchengemisch, wie z.B. eine Abreicherung von abundanten Proteinen (z.B. Trennen von Serumalbumin aus Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blutplasma).The proposed FFE method enables not only the isolation but also the selective depletion of particles from a particle mixture, e.g. a depletion of abundant proteins (e.g. separation of serum albumin from body fluids, e.g. blood plasma).
• Das Festsetzen von auf Grund ihrer besonderen biologischen Relevanz abgetrennten Teilchen an den Elektroden und daraus resultierende, wesentliche Verluste dieser Teilchen, können mit einem Fokussierkissen aus einem elektrisch hoch-leitenden Kissenmedium erfolgreich verhindert werden.• The setting of particles separated on the electrodes due to their special biological relevance and the resulting substantial losses of these particles can be successfully prevented with a focusing pad made of an electrically highly conductive pad medium.
Bevorzugte und beispielhafte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens bzw. der erfindungsgemässen Vorrichtung zum trennen von Teilchen auf Grund ihrer selektiv veränderten Netto-Oberflächenladung - insbesondere zum Auftrennen von Zellen oder Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen, bzw. von Teilen oder Komplexen derselben mittels der Free-Flow- Elektrophorese-Technik - werden im Folgenden an Hand von schematischen Zeichnungen - welche die Erfindung lediglich veranschaulichen, deren Umfang aber nicht einschränken - näher erläutert. Dabei zeigen :Preferred and exemplary embodiments of the method according to the invention and the device according to the invention for separating particles on the basis of their selectively changed net surface charge - in particular for separating cells or cell components, organelles or biomolecules, or parts or complexes thereof by means of the free flow Electrophoresis technology - are explained in more detail below with the aid of schematic drawings - which merely illustrate the invention but do not restrict the scope thereof. Show:
Fig. 1 zu trennende Zellen, welche:1 cells to be separated, which:
Fig. 1A ohne bestimmte Epitope,1A without certain epitopes,
Fig. 1B mit zwei Epitopen eines ersten Typs,1B with two epitopes of a first type,
Fig. IC mit drei Epitopen eines zweiten Typs ausgestattet sind;Fig. IC are equipped with three epitopes of a second type;
Fig. 2 einen epitop-spezifischen Antikörper und ladungstragende Moleküle; Fig. 3 zu trennende Zellen mit entsprechenden Epitopen, wobei in:2 shows an epitope-specific antibody and charge-carrying molecules; 3 cells to be separated with corresponding epitopes, in which:
Fig. 3A die beiden Epitope des ersten Typs negativ ladungsmarkiert sind, wodurch die Netto-Oberflächenladung der Zellen stark negativ wird, und in Fig. 3B die drei Epitope des zweiten Typs positiv ladungsmarkiert sind, wodurch die Netto-Oberflächenladung der Zellen stark positiv wird;FIG. 3A the two epitopes of the first type are negatively charged, which makes the net surface charge of the cells strongly negative, and in FIG. 3B the three epitopes of the second type are positively marked, which makes the net surface charge of the cells strongly positive;
Fig. 4 ein Prinzipschema einer erfindungsgemässe Vorrichtung zum gleich- zeitigen Trennen von zwei ladungsmarkierten Zelltypen;4 shows a basic diagram of a device according to the invention for the simultaneous separation of two charge-marked cell types;
Fig. 5 eine schematische Darstellung von erfindungsgemäss verwendbarenFig. 5 is a schematic representation of usable according to the invention
Trennungsmitteln in einer möglichen Anordnung und Wechselwirkung mit einem zu trennenden Teilchen;Separation means in a possible arrangement and interaction with a particle to be separated;
Fig. 6 schematisierte Draufsichten auf erfindungsgemässe Vorrichtungen, wobei :6 shows schematic top views of devices according to the invention, wherein:
Fig. 6A und 6D eine CHIEF-Vorrichtung mit einem linearen pH-Gradienten und einem homogenem Feld; Fig. 6B und 6E eine PZE-Vorrichtung mit einem homogenen pH-Wert und einem homogenen Feld; und Fig. 6C und 6F eine CITP-Vorrichtung mit einem pH-Gradienten und einem Feld-Gradienten zeigen;6A and 6D show a CHIEF device with a linear pH gradient and a homogeneous field; 6B and 6E show a PZE device with a homogeneous pH value and a homogeneous field; and Figures 6C and 6F show a CITP device with a pH gradient and a field gradient;
Fig. 7 eine schematische Mengen-Verteilung von ladungstragenden Zellen gleichen Typs:7 shows a schematic quantity distribution of charge-carrying cells of the same type:
Fig. 7A ohne Verwendung, und7A without use, and
Fig. 7B mit Verwendung eines erfindungsgemässen Fokussier- kissens.7B using a focusing cushion according to the invention.
Figur 1 zeigt zu trennende Zellen als Beispiel für zu trennende Teilchen 1,1', 1". Diese Zellen, können ohne bestimmte Epitope (vgl. Fig. 1A) ausgestattet sein. Solche Zellen weisen eine relativ geringe negative Netto-Oberflächenladung auf und sind in der FFE nur sehr schwer zu trennen. Weisen die Zellen aber Epitope eines ersten Typs 2' (Fig. 1B) oder eines zweiten Typs 2" (Fig. IC) auf, so können diese Zellen mit ladungstragenden Molekülen bzw. Ladungsträgern epitop- spezifisch markiert werden. Allgemein kann somit die Netto-Oberflächenladung von Teilchen selektiv verändert werden, indem geladene Bindungsmoleküle an diese Teilchen gebunden werden. Diese Bindung kann auf einer Antigen-Anti- körper-Wechselwirkung beruhen. Weitere, zur erfindungsgemässen Modifikation der Netto-Oberflächenladung von Teilchen verwendbare Wechselwirkungen zum Ankoppeln von Bindungsmolekülen an die zu trennenden Teilchen umfassen auch Rezeptor-Ligand-, Enzym-Substrat- und Protein-Protein-Wechselwirkungen. Auch eine Chelatbildung oder eine auf allgemeinen Molekül-Wechselwirkungen beruhende Bindung, sei diese ionisch oder auf Van-der-Waals-Kräften bzw. auf Wasserstoffbrücken beruhend, aber auch eine kovalente Bindung kann für diesen Zweck verwendet werden.Figure 1 shows cells to be separated as an example of particles 1, 1 ', 1 "to be separated. These cells can be equipped without specific epitopes (see FIG. 1A). Such cells have a relatively low negative net surface charge and are very difficult to separate in the FFE. However, if the cells have epitopes of a first type 2 '(FIG. 1B) or a second type 2 "(FIG. IC), these cells can be labeled epitope-specifically with charge-carrying molecules or charge carriers. In general, the net Surface charge of particles can be changed selectively by binding charged binding molecules to these particles.This binding can be based on an antigen-antibody interaction.Other interactions which can be used for the inventive modification of the net surface charge of particles for coupling binding molecules to the separating particles also include receptor-ligand, enzyme-substrate and protein-protein interactions, including chelation or binding based on general molecular interactions, be it ionic or based on Van der Waals forces or hydrogen bonds , but a covalent bond can also be used for this purpose.
Mit der erfindungsgemässen FFE-Vorrichtung bzw. mit dem erfindungsgemässen FFE-Verfahren können relevante Zellen aus Körperflüssigkeiten (z.B. dissemi- nierte Tumorzellenn aus Blut, Sputum, Ascites, Urin, Lavagen etc.) bzw. aus Gewebehomogenaten (z.B. solide Tumoren in Niere, Thymus etc.) oder Organellen aus Zellhomogenaten (z.B. Calciosomen, "coated vesicles", Endosomen, Endopiasmatisches Retikulum, Golgi-Zisternen, Lysosomen, Peroxisomen und Mitochondrien) sowie Proteine aus Proteomen oder Expressionssystemen isoliert werden.With the FFE device according to the invention or with the FFE method according to the invention, relevant cells can be extracted from body fluids (eg disseminated tumor cells from blood, sputum, ascites, urine, lavage etc.) or from tissue homogenates (eg solid tumors in the kidney, thymus) etc.) or organelles from cell homogenates (eg calciosomes, coated vesicles, endosomes, endopiasmatic reticulum, Golgi cisterns, lysosomes, peroxisomes and mitochondria) and proteins from proteomes or expression systems.
Figur 2 zeigt einen epitop-spezifischen Antikörper sowie zwei monomerische oder polymerische Ladungsträger oder "charge label" (vgl. "CL" in Fig. 5) in Form von Kationen 4 oder Anionen 5. Ein Ladungsträger 4,5 ist ein bei einem gegebenen pH-Wert ionisiertes Molekül. Es kann anionisch oder kationisch, mo- nomer oder polymer sein. Mit Hilfe von solchen Ladungsträgern 4,5 kann die Netto-Oberflächenladung von Teilchen gezielt verändert werden. Geladene Partikel, wie z.B. Beads können auch als Ladungsträger verwendet werden. Beispiele von anionischen Ladungsträgern 5 sind : Polyglutaminsäure (PGA); anionische oder derivatisierte Proteine, wie Albumin; anionische Polysaccharide, wie Heparin oder Algininsäure, Polyasparaginsäure, Polyacrylsäure und Polya- minsäuren mit einer negativen Netto-Ladung bei einem brauchbaren pH (z.B. im Bereich von pH 4 bis 10). Anionische Polymere mit einem Molekulargewicht von 500 bis etwa 500O00 Dalton werden bevorzugt. An ein spezifisches Bindungsmolekül können auch mehrere monomerische oder polymerische Ladungsträger gebunden werden, um die Netto-Oberflächenladung der zu trennenden Teilchen noch stärker auszubilden. Beispiele von bevorzugten kationischen Ladungsträ- gern 4 umfassen homopolymere oder copolymere Proteine mit einem bevorzugten Molekulargewicht von 500-500O00 Dalton; quaternäre Ammoniumverbindungen mit zwischen 1 % bis 10 % Stickstoffanteil (ohne Gegenion). Kommerziell erhältliche quaternäre Ammonium-Polymerverbindungen umfassen z.B. die Produkte MERQUAT.RTM. (Calgon, Pittsburgh, PA, USA), CELQUAT.RTM. (National Starch and Chemical Corp., Bridgewater, NJ, USA) , GAFQUAT.RTM. (GAF Corp., Wayne, NJ, USA)und MAGNIFLOC.RTM (CYTEC Ind., Indianapolis, IN, USA) sowie Hexadimetrinbromid (POLYBRENE.RTM) und Diethylaminoethyl- Dextran (beide von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA). Diese und weitere anionischen und kationischen Ladungsträger sind im Patent US 5,670,381 beschrieben, auf welches hier ausdrücklich Bezug genommen wird.FIG. 2 shows an epitope-specific antibody and two monomeric or polymeric charge carriers or “charge labels” (cf. “CL” in FIG. 5) in the form of cations 4 or anions 5. A charge carrier 4, 5 is a at a given pH -Value ionized molecule. It can be anionic or cationic, monomeric or polymeric. With the help of such charge carriers 4, 5, the net surface charge of particles can be changed in a targeted manner. Charged particles such as beads can also be used as charge carriers. Examples of anionic charge carriers 5 are: polyglutamic acid (PGA); anionic or derivatized proteins such as albumin; anionic polysaccharides such as heparin or alginic acid, polyaspartic acid, polyacrylic acid and polyamic acids with a net negative charge at a usable pH (for example in the range from pH 4 to 10). Anionic polymers with a molecular weight of 500 to about 500,000 Daltons are preferred. Several monomeric or polymeric charge carriers can also be bound to a specific binding molecule in order to further develop the net surface charge of the particles to be separated. Examples of preferred cationic charge carriers 4 include homopolymeric or copolymeric proteins with a preferred molecular weight of 500-5000000 daltons; quaternary ammonium compounds with between 1% and 10% nitrogen content (without counter ion). Commercially available quaternary ammonium polymer compounds include, for example, the products MERQUAT.RTM. (Calgon, Pittsburgh, PA, USA), CELQUAT.RTM. (National Starch and Chemical Corp., Bridgewater, NJ, USA), GAFQUAT.RTM. (GAF Corp., Wayne, NJ, USA) and MAGNIFLOC.RTM (CYTEC Ind., Indianapolis, IN, USA) as well as hexadimetrin bromide (POLYBRENE.RTM) and diethylaminoethyl dextran (both from Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, UNITED STATES). These and other anionic and cationic charge carriers are described in US Pat. No. 5,670,381, to which reference is expressly made here.
Ein solcher Antikörper (vgl. Fig. 2) wird in der Folge als Bindungsmolekül 3 oder "binding molecule" bezeichnet. Die Bindung zwischen einem Bindungsmolekül 3 und einem Teilchen l',l" sowie die Bindung zwischen einem Ladungsträger 4,5 und dem Bindungsmolekül 3 kann kovalent oder nicht-kovalent (z.B. adsorptiv, auf Van-der-Waals-Kräften oder Wasserstoffbrücken, auf einer Biotin-Streptavi- din-Wechselwirkung etc. beruhend) sein. Das Bindungsmolekül 3 kann z.B. ein Antikörper (vgl. Fig. 2), Streptavidin, Biotin, Rezeptor, Ligand, Cheiatbildner (z.B. Nickel-Nitrilo-Tetraessigsäure = Ni-NTA), ein niedrig-affiner Binder (Pro- tein-Protein-Wechselwirkung) oder ein chemisch aktiviertes Molekül (z.B. aktivierter Ester, Affinitätslabel) sein. Den Komplex bestehend aus Bindungsmolekül 3 und Ladungsträger 4 bzw. 5 nennen wir geladenes Bindungsmolekül 6 oder "charge label binding molecule". Figur 3 zeigt zu trennende Zellen mit entsprechenden Epitopen 2', 2". Dabei sind in Fig. 3A die beiden Epitope des ersten Typs 2' negativ und in Fig. 3B die drei Epitope des zweiten Typs 2" positiv ladungsmarkiert. Die Netto-Oberflächenladung der markierten Zellen ist deshalb stark verändert, so dass sich diese Zellen mit ihrer spezifisch veränderten Netto-Oberflächenladung in der FFE unterschiedlich verhalten. Den Komplex aus Teilchen 3 und geladenem Bindungsmolekül 6 nennen wir ladungsmodifiziertes Teilchen 7', 7" oder "charge modified particle". Vorzugsweise wird die Netto-Oberflächenladung der Zellen so verändert, dass sich ein Zelltyp in einem Trennmedium 8 einer erfindungsgemässen Vorrichtung gegen die Kathode 9 und der andere Zelltyp gegen die Anode 10 bewegt, wie dies im Prinzipschema von Figur 4 dargestellt ist. Dabei entfernen sich die zwei Gruppen ladungsmodifizierter Teilchen 7', 7" bzw. die zwei ladungs- modifizierten Zelltypen 7',7" im Wesentlichen gleichzeitig von den unmarkierten bzw. nicht-ladungsmodifizierten Hintergrundzellen 7, welche sich im Wesentli- chen in der Mitte (oder zumindest in einer grossen Entfernung von den Elektroden 9,10 im Trennmedium 8 der erfindungsgemässen Vorrichtung bewegen. Der Pfeil gibt dabei die Hauptfliessrichtung des Trennmediums 8 an. In einem Sammelbereich 11 werden die verschiedenen, von einander getrennten Zelltypen aufgesammelt und einer Weiterverwendung zugeleitet. Das Sammeln ge- schieht in an sich bekannter Weise über in einer Reihe angeordnete Ablassöffnungen. Die Auflösung der FFE wird im Wesentlichen durch das Migrationsverhalten der Teilchen 7,7', 7" und die Grosse und Anzahl der Ablassöffnungen bestimmt. Der Trennraum 14 umfasst dabei den Raum für das Trennmedium 8 und die beiden seitlichen, elektrodennahen Bereiche 19 für die mit dem Kissen- medium 20 gebildeten Fokussierkissen 12,13 (vgl. auch Fig. 7).Such an antibody (cf. FIG. 2) is referred to below as binding molecule 3 or “binding molecule”. The bond between a binding molecule 3 and a particle 1 ′, 1 ″ and the bond between a charge carrier 4, 5 and the binding molecule 3 can be covalent or non-covalent (eg adsorptive, on Van der Waals forces or hydrogen bonds, on one Biotin-streptavidin interaction, etc.) The binding molecule 3 can be, for example, an antibody (cf. FIG. 2), streptavidin, biotin, receptor, ligand, chiating agent (eg nickel-nitrilo-tetraacetic acid = Ni-NTA), a low-affinity binder (protein-protein interaction) or a chemically activated molecule (eg activated ester, affinity label). We call the complex consisting of binding molecule 3 and charge carrier 4 or 5 a charged binding molecule 6 or "charge label binding" molecule ". FIG. 3 shows cells to be separated with corresponding epitopes 2 ', 2 ". The two epitopes of the first type 2' are negative in FIG. 3A and the three epitopes of the second type 2" are positively marked in FIG. 3B. The net surface charge of the marked cells is therefore greatly changed, so that these cells behave differently with their specifically changed net surface charge in the FFE. We call the complex of particle 3 and charged binding molecule 6 charge-modified particle 7 ', 7 "or" charge modified particle ". The net surface charge of the cells is preferably changed such that a cell type in a separation medium 8 of a device according to the invention against the cathode 9 and the other cell type moves against the anode 10, as shown in the schematic diagram of Figure 4. The two groups of charge-modified particles 7 ', 7 "and the two charge-modified cell types 7', 7" move away essentially simultaneously of the unmarked or non-charge-modified background cells 7, which move essentially in the middle (or at least at a great distance from the electrodes 9, 10 in the separation medium 8 of the device according to the invention. The arrow indicates the main flow direction of the separation medium 8 The various, separate cell types are collected and collected in a collecting area 11 he forwarded for further use. Collecting takes place in a manner known per se via discharge openings arranged in a row. The resolution of the FFE is essentially determined by the migration behavior of the particles 7, 7 ', 7 "and the size and number of the outlet openings. The separation space 14 comprises the space for the separation medium 8 and the two lateral areas 19 near the electrodes for the the focusing cushion 12, 13 formed by the cushion medium 20 (cf. also FIG. 7).
Die Masse der ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" wird durch die FFE in etwa in einer Normalverteilung den Ablassöffnungen zugeleitet, wenn man von einem (ungewollten) Anhaften von ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" an den Oberflä- chen der Elektroden 9, 10 absieht. In Fig. 7A ist so eine Normalverteilung in einer schematischen Querschnittsansicht dargestellt. Weil aber dieses Migrationsverhalten der ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" zu einer schlechten Auflösung der FFE führen kann, wird vorzugsweise je ein Fokussierkissen 12,13 aus einem ebenfalls fliessfähigen elektrisch hoch-leitenden Trennmaterial, in der unmittelbaren Nähe der Elektroden 9,10 vorgesehen. Dieses Fokussierkissen 12,13 verhindert durch seine hohe elektrische Leitfähigkeit, dass die ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" bis ganz zur jeweiligen Elektrode diffundieren kön- nen. An der Grenze zwischen dem Trennmedium 8 und dem Kissenmedium 20 kommt es zu einer Konzentration der ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7", wie dies in Fig. 7B dargestellt ist. Vorzugsweise fliessen dabei Trennmedium 8 und Kissenmedium 20 in die gleiche Richtung.The mass of the charge-modified particles 7 ', 7 "is fed through the FFE in approximately a normal distribution to the discharge openings, with the exception of an (unwanted) adherence of charge-modified particles 7', 7" to the surfaces of the electrodes 9, 10 , 7A shows a normal distribution in a schematic cross-sectional view. However, because this migration behavior of the charge-modified particles 7 ', 7 "can lead to poor resolution of the FFE, one focusing pad 12, 13 is preferably used a likewise flowable, electrically highly conductive separating material, provided in the immediate vicinity of the electrodes 9, 10. Due to its high electrical conductivity, this focusing pad 12, 13 prevents the charge-modified particles 7 ', 7 "from being able to diffuse all the way to the respective electrode. A concentration of the charge-modified particles occurs at the boundary between the separation medium 8 and the pad medium 20 7 ', 7 "as shown in Fig. 7B. Separating medium 8 and cushion medium 20 preferably flow in the same direction.
Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung von erfindungsgemäss verwendbaren Trennungsmitteln in einer möglichen Anordnung und Wechselwirkung mit einem zu trennenden Teilchen. Das ladungsmodifizierte Teilchen 7', 7" besteht hier aus einem Protein P an welches in an sich bekannter Weise eine Kette von Histidinmolekülen H (ein sogenanntes "His Tag") angehängt worden ist. An die- ses His Tag gebunden ist ein geladenes Bindungsmolekül 6. Dieses geladene Bindungsmolekül 6 besteht aus Nickel-Nitrilo-Tetraessigsäure = Ni-NTA), welches an zwei Histidinmoleküle bindet. Der anionische Ladungsträger 5 ist hier kovalent an die Nickel-Nitrilo-Tetraessigsäure, das Bindungsmolekül 3 gebunden.FIG. 5 shows a schematic illustration of separating agents which can be used according to the invention in a possible arrangement and interaction with a particle to be separated. The charge-modified particle 7 ', 7 "here consists of a protein P to which a chain of histidine molecules H (a so-called" His tag ") has been attached in a manner known per se. A charged binding molecule 6 is bound to this His tag This charged binding molecule 6 consists of nickel-nitrilo-tetraacetic acid (Ni-NTA), which binds to two histidine molecules, here the anionic charge carrier 5 is covalently bound to the nickel-nitrilo-tetraacetic acid, the binding molecule 3.
Figur 6 zeigt schematisierte Draufsichten auf erfindungsgemässe Vorrichtungen. Diese Free-Flow-Elektrophoresevorrichtung umfassen zumindest einen mit einem Trennmedium 8 durchfliessbaren Trennraum 14. Dieser Trennraum ist durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt. Diese FFE-Vorrichtung umfasst zudem eine Dosierpumpe (nicht dargestellt) zum Fördern des Trennmediums 8, welches über Medienzuführungen 15,15' in den Trennraum 14 gelangt und diesen über Auslässe 16 wieder verlässt. Des Weiteren umfasst die FFE-Vorrichtung Elektroden 9,10 zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium 8 sowie Probeaufgabestellen 17 zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen 7, 7', 7" und Fraktionierstellen 18 zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen im Trennmedium 8. Zwei separate Förderkanäle 15' der Dosierpumpe sind mit dem Trennraum 14 im Bereich der elektrodenna- hen Fraktionierauslässe 16' verbunden, um Medium zuzugeben. Diese zwei separaten Förderkanäle der Dosierpumpe dienen vorzugsweise zum Ausbilden je eines elektrisch hoch-leitenden Fokussier oder Führungskissens für die ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" in den elektrodennahen Bereichen 19 des Trennmediums 8 und sind mit einem separaten Mediumbehälter (nicht dargestellt) zum Bereitstellen eines elektrisch hoch-leitenden Kissenmediums verbunden.FIG. 6 shows schematic top views of devices according to the invention. This free-flow electrophoresis device comprises at least one separation space 14 through which a separation medium 8 can flow. This separation space is delimited by a base and a cover and by these two spacers which are spaced apart from one another. This FFE device also includes a metering pump (not shown) for conveying the separating medium 8, which enters the separating space 14 via media feeds 15, 15 'and leaves it again via outlets 16. Furthermore, the FFE device comprises electrodes 9, 10 for applying an electric field in the separation medium 8 as well as sample application points 17 for adding a mixture of particles 7, 7 ', 7 "to be separated and fractionation points 18 for removing particles separated by the FFE in the separation medium 8 Two separate delivery channels 15 'of the metering pump are connected to the separating space 14 in the area of the electrode hen fractionation outlets 16 'connected to add medium. These two separate delivery channels of the metering pump are preferably used to form an electrically highly conductive focusing or guide cushion for the charge-modified particles 7 ', 7 "in the regions 19 of the separation medium 8 near the electrodes and are provided with a separate medium container (not shown) for providing an electrical one highly conductive pillow media.
Die FFE-Trenntechnik der kontinuierlichen isoelektrischen Fokussierung (CHIEF) beruht auf dem unterschiedlichen pl-Wert der zu trennenden Teilchen. Dabei entspricht dieser pl-Wert den pH-Wert des umgebenden, inhomogenen Mediums, gegenüber dem die Teilchen neutral erscheinen. Die FFE von Teilchen auf Grund ihres unterschiedlichen isoelektrischen Punktes ermöglicht die Isolierung von Analyten bzw. Teilchen mit geringsten Differenzen in ihren pl- Werten. Am isoelektrischen Punkt pl (d.h. an der Stelle des Trennmediums 8, welche gerade den pH-Wert aufweist, bei dem für ein gegebenes Teilchen (z.B. ein Proteinmolekül) die Anzahl negativer und positiver Ladungen gleich gross ist) ist die Gesamtladung bzw. Netto-Oberflächenladung dieses Teilchens gleich null. Der im Trennmedium 8 einer CHIEF-Vorrichtung inhärente Fokussiereffekt bewirkt, dass ein Teilchen l',l", welches vom pl wegdiffundiert, automatisch wieder eine (positive oder negative) Netto-Oberflächenladung erhält und durch das elektrische Feld wieder zum pl hin bewegt wird.The FFE separation technique of continuous isoelectric focusing (CHIEF) is based on the different pI value of the particles to be separated. This pI value corresponds to the pH of the surrounding, inhomogeneous medium, against which the particles appear neutral. The FFE of particles due to their different isoelectric point enables the isolation of analytes or particles with the smallest differences in their pI values. The total charge or net surface charge is at the isoelectric point p 1 (ie at the location of the separation medium 8 which has just the pH at which the number of negative and positive charges is the same for a given particle (for example a protein molecule)) of this particle is zero. The focusing effect inherent in the separation medium 8 of a CHIEF device has the effect that a particle l ', l "which diffuses away from the pl automatically receives a (positive or negative) net surface charge again and is moved back to the pl by the electric field.
Auf Grund der Wechselwirkung von Analyten bzw. Teilchen mit einem einzigen Bindungsmolekül oder "binding molecule" mit hoher Ladungsdichte ist eine wesentliche Veränderung des pl-Wertes und somit eine schnelle und vollständige Trennung des Komplexes aus Teilchen und Bindungsmolekül von den übrigen Spezies der Probe zu erwarten. Das Verfahren der kontinuierlichen isoelektrischen Fokussierung ist besonders geeignet zur mikropräparativen bis präparati- ven Isolierung von Biopolymeren allgemein und von Biopartikeln, deren biologische Funktion bzw. deren Integrität im Bereich der gewählten Spannbreite des pH-Gradienten im Trennmedium gesichert ist. Dies gilt im Fall von vielen Vertretern der Viren, Bakterien, Zellorganellen und Membrandomänen, da durch Zugabe von "osmotischen Expandern" die Erhaltung eines idealen osmotischen Druckes gesichert werden kann : Durch Zugabe von ungeladenen Substanzen (z.B. Zucker, als nicht-ionischer, osmotischer Expander) und/oder von Salzen (z.B. NaCI, als ionischer, osmotischer Expander) kann ein für einen Zelltyp op- timaler osmotischer Druck, d.h. isomolale Konditionen erzeugt werden (z.B. für Säugerzellen 250-310 mosmol).Due to the interaction of analytes or particles with a single binding molecule or "binding molecule" with a high charge density, a significant change in the pI value and thus a rapid and complete separation of the complex of particles and binding molecule from the other species of the sample can be expected , The process of continuous isoelectric focusing is particularly suitable for the micro-preparative to preparative isolation of biopolymers in general and of bioparticles whose biological function or integrity is ensured in the range of the selected pH gradient in the separation medium. This applies in the case of many representatives of viruses, bacteria, cell organelles and membrane domains, as a result of Addition of "osmotic expanders" can ensure the maintenance of an ideal osmotic pressure: By adding uncharged substances (e.g. sugar, as a non-ionic, osmotic expander) and / or salts (e.g. NaCI, as an ionic, osmotic expander) one can optimal osmotic pressure is generated for a cell type, ie isomolar conditions are generated (eg for mammalian cells 250-310 mosmol).
Figur 6 zeigt eine erfindungsgemässe Vorrichtung zur Trennung von ladungsmodifizierten Teilchen 7',7" von nicht-ladungsmodifizierten Teilchen 7 in einem Trennmedium 8, welches in einem Trennraum 14 zwischen zwei Elektroden 9,10 fliesst (grosser Pfeil, 8). Der Trennraum 14 umfasst dabei den Raum für das Trennmedium 8 und zwei seitliche, elektrodennahen Bereiche 19 für die mit dem Kissenmedium 20 gebildeten Führungs- bzw. Fokussierkissen. Die Elektroden 9,10 sind vorzugsweise als Elektrodenräume ausgebildet, von einem durch eine elektrische Zuleitung 23,23' kontaktierten Elektrodenpuffer 24 durchflössen und weisen gegenüber dem Trennraum 14 eine vorzugsweise semipermeable Membran 25 auf. Der Elektrodenpuffer 24 wird über separate Zuleitungen 26,26' in die Elektrodenräume eingeleitet (in Fig. 6 nur teilweise gezeigt) und verlässt diese auch über separate Auslässe 27,27'. Zum Umwälzen und gegebe- nenfalls auch zum Kühlen des Elektrodenpuffers wird vorzugsweise eine zusätzliche Pumpvorrichtung (nicht gezeigt) verwendet.FIG. 6 shows an inventive device for separating charge-modified particles 7 ', 7 "from non-charge-modified particles 7 in a separation medium 8 which flows in a separation space 14 between two electrodes 9, 10 (large arrow, 8). The separation space 14 comprises the space for the separation medium 8 and two lateral regions 19 near the electrodes for the guide or focusing cushions formed with the cushion medium 20. The electrodes 9, 10 are preferably designed as electrode spaces, from an electrode buffer contacted by an electrical lead 23, 23 ' 24 flow through and have a preferably semi-permeable membrane 25 in relation to the separation space 14. The electrode buffer 24 is introduced into the electrode spaces via separate feed lines 26, 26 '(only partially shown in FIG. 6) and also leaves them via separate outlets 27, 27'. An additional one is preferably used for circulating and, if appropriate, also for cooling the electrode buffer he pumping device (not shown) is used.
Figur 6A zeigt eine solche CHIEF-Vorrichtung mit einem linearen pH-Gradienten. Ein Trennmedium 8 fliesst in laminarer Bewegung (vorzugsweise von unten nach oben in einem schräg gehaltenen Trennraum) zwischen den beiden Elektroden (grosser Pfeil), wird im Bereich der Auslassöffnungen durch einen Ge- genfluss von Trennmedium (kleiner Pfeil) abgebremst und verlässt den Trennraum 14 in Fraktionen über die Auslassöffnungen. Eine Probe mit drei zu trennenden Teilchengruppen wird über den Probeneinlass dem Trennmedium zuge- geben und durch den laminaren Fluss des Trennmediums mitbewegt. Die drei Teilchengruppen werden im pH-Gradienten, welcher durch das zwischen den Elektroden im Trennmedium erzeugte elektrische Feld erzeugt wird, kontinuierlich aufgetrennt, fokussiert und in getrennten Fraktionen gesammelt. Wie aus Fig. 6D ersichtlich, ist die elektrische Leitfähigkeit des Trennmediums 8 zwischen den beiden vorzugsweise vorgesehenen Fokussierkissen 12,13 - mit hoher Leitfähigkeit in den elektrodennahen Bereichen 19 - relativ gering und homogen. Der pH-Gradient wird im Trennmedium 8 zwischen den beiden Fokus- sierkissen aufgebaut.FIG. 6A shows such a CHIEF device with a linear pH gradient. A separation medium 8 flows in a laminar movement (preferably from the bottom upwards in an inclined separation space) between the two electrodes (large arrow), is braked in the area of the outlet openings by a counterflow of separation medium (small arrow) and leaves the separation space 14 in fractions via the outlet openings. A sample with three particle groups to be separated is added to the separation medium via the sample inlet and moved with the laminar flow of the separation medium. The three particle groups are continuously separated, focused and collected in separate fractions in the pH gradient, which is generated by the electric field generated between the electrodes in the separation medium. How from 6D, the electrical conductivity of the separation medium 8 between the two preferably provided focusing pads 12, 13 - with high conductivity in the regions 19 near the electrodes - is relatively low and homogeneous. The pH gradient is built up in the separation medium 8 between the two focusing pads.
Die FFE-Trenntechnik der kontinuierlichen FFE-Zonenelektrophorese (PZE) beruht auf dem Unterschied im Wert der elektrophoretischen Mobilität der zu trennenden Teilchen gegenüber dem verwendeten Trennmedium. Die FFE-Zonenelektrophorese ermöglicht somit die Isolierung von Analyten bzw. Teilchen auf Grund ihrer unterschiedlichen Grosse und/oder Form und/oder Netto-Oberflächenladung.The FFE separation technique of continuous FFE zone electrophoresis (PZE) is based on the difference in the value of the electrophoretic mobility of the particles to be separated compared to the separation medium used. FFE zone electrophoresis thus enables the isolation of analytes or particles on the basis of their different sizes and / or shapes and / or net surface charge.
Auf Grund der Wechselwirkung von Teilchen mit einem einzigen Bindungsmolekül mit hoher Ladungsdichte ist eine wesentliche Veränderung des Wertes der elektrophoretischen Mobilität und damit eine schnelle und vollständige Trennung des Komplexes aus Teilchen und Bindungsmolekül 3 von den übrigen Spezies der Probe zu erwarten. Das Verfahren der kontinuierlichen FFE-PZE ist beson- ders geeignet im Fall der Trennung von "empfindlichen" Biopartikeln und Komplexen, bei deren Trennung besondere Anforderungen an das Trennmedium gestellt werden müssen. Dies insbesondere dann, wenn die biologische Funktion und Integrität dieser Teilchen auch nach der Trennung gewährleistet sein sollen. Als besondere Anforderungen gelten in diesen Fällen : Eng begrenzter pH- Bereich der Trennmedien, gute Pufferkapazität der Trennmedien, physiologische Verträglichkeit der verwendeten Puffersubstanzen, Mindestgehalte von diversen "essentiellen" Kationen und Anionen etc.. Obwohl die üblichen Zellkulturmedien als wenig kompatibel mit allen Techniken der Elektrophorese gelten, ist die erfolgreiche Trennung von Zellen mit FFE-PZE möglich.Due to the interaction of particles with a single binding molecule with a high charge density, a significant change in the value of the electrophoretic mobility and thus a rapid and complete separation of the complex of particles and binding molecule 3 from the other species of the sample can be expected. The process of continuous FFE-PZE is particularly suitable in the case of the separation of "sensitive" bioparticles and complexes, the separation of which has to meet special requirements for the separation medium. This is particularly the case if the biological function and integrity of these particles should also be guaranteed after the separation. In these cases, special requirements apply: narrowly limited pH range of the separation media, good buffer capacity of the separation media, physiological tolerance of the buffer substances used, minimum contents of various "essential" cations and anions etc. Although the usual cell culture media are not very compatible with all techniques of Apply electrophoresis, the successful separation of cells with FFE-PZE is possible.
Figur 6B zeigt eine solche PZE-Vorrichtung, in welcher die Proben an Hand ihrer Ladung und zu einem geringeren Mass an Hand ihrer Form und Grosse aufgetrennt werden. Wie aus Fig. 6E ersichtlich, ist die elektrische Leitfähigkeit des Trennmediums 8 zwischen den beiden Fokussierkissen 12,13 - mit hoher Leitfähigkeit in den elektrodennahen Bereichen 19 - relativ gering und homogen. Der pH-Wert ist im ganzen Trennmedium gleich.FIG. 6B shows such a PZE device, in which the samples are separated on the basis of their charge and to a lesser extent on the basis of their shape and size. As can be seen from Fig. 6E, the electrical conductivity of the Separating medium 8 between the two focusing pads 12, 13 - with high conductivity in the regions 19 near the electrodes - is relatively small and homogeneous. The pH value is the same in the entire separation medium.
Die FFE-Trenntechnik der kontinuierlichen Isotachophorese (CITP) beruht ebenfalls auf dem Unterschied im Wert der elektrophoretischen Mobilität der zu trennenden Teilchen. Im Unterschied zur FFE-PZE erfolgt die Trennung in inhomogenen Trennmedien und bietet wegen eines inhärenten "Fokussierungsef- fektes" eine bessere Auflösung : Wenn während der CITP aus einer aufgetrennten Bande von Teilchen (z.B. Proteinen) einzelne Teichen wegdiffundieren, so gelangen diese Teilchen in ein Medium mit unterschiedlicher elektrischer Feldstärke, wodurch die Teilchen beschleunigt oder verlangsamt werden. Der inhärente Fokussiereffekt bedingt, dass die langsamer oder schneller wandernden Teilchen wieder in der Hauptfraktion einfinden.The FFE separation technique of continuous isotachophoresis (CITP) is also based on the difference in the value of the electrophoretic mobility of the particles to be separated. In contrast to the FFE-PZE, the separation takes place in inhomogeneous separation media and offers a better resolution due to an inherent "focusing effect": If individual ponds diffuse away from a separated band of particles (eg proteins) during CITP, these particles enter into one Medium with different electric field strength, which accelerates or slows the particles. The inherent focusing effect means that the slower or faster migrating particles find their way back into the main fraction.
Diese FFE-Trenntechnik ist prinzipiell für Biopartikel und Zellen geeignet, deren Trennung in Medien ohne spezielle "essentielle Kationen" (z.B. Mg++ oder Ca++) bzw.' "essentielle Anionen" (z.B. CI"), die für die Stabilität und Vitalität von Zel- len wichtig sind, nicht möglich ist.This FFE separation technique is suitable in principle for bioparticles and cells whose separation in media without special "essential cations" (eg Mg ++ or Ca ++ ) or ' "essential anions" (eg CI " ), which are responsible for stability and Cell vitality is important, is not possible.
Figur 6C zeigt eine solche CITP-Vorrichtung, in welcher sogenannte "diskrete Spacer" verwendet werden. Solche diskrete Spacer sind Ionen mit wohlbekannter, definierter Mobilität, welche sich in der CITP zwischen zu trennende Teilchen drängen und dazu beitragen, dass die'Trennung effizient abläuft. Als solche diskrete Spacer lassen sich auch exakt definierte Ampholyte einsetzen. Wie aus Fig. 6F ersichtlich, ist die elektrische Leitfähigkeit des Trennmediums 8 zwischen den beiden Fokussierkissen 12,13 - mit hoher Leitfähigkeit in den elektrodennahen Bereichen 19 - zumindest teilweise gradientenartig ausgebildet und inhomogen. Zusätzlich wird ein zumindest teilweiser pH-Gradient imFIG. 6C shows such a CITP device in which so-called "discrete spacers" are used. Such discrete spacers are ions with well-known, defined mobility which crowd in the ISCO between particles to be separated and contribute to the 'separation to proceed efficiently. Precisely defined ampholytes can also be used as such discrete spacers. As can be seen from FIG. 6F, the electrical conductivity of the separating medium 8 between the two focusing pads 12, 13 - with high conductivity in the regions 19 near the electrodes - is at least partially gradient-like and inhomogeneous. In addition, an at least partial pH gradient in the
Trennmedium 8 zwischen den beiden Fokussierkissen 12,13 aufgebaut, wobei sich die Bereiche der beiden Gradienten im Wesentlichen decken und sowohl die pH-Werte als auch die elektrische Leitfähigkeit im Bereich der Fokussierkissen 12,13 jeweils unterschiedlich hoch sind.Separating medium 8 is built up between the two focusing pads 12, 13, the areas of the two gradients essentially coinciding and both pH values and the electrical conductivity in the area of the focusing pads 12, 13 are each of different heights.
Diverse Kombinationen dieser Trenntechniken (CHIEF und FFE-PZE bzw. CHIEF und CITP) sind möglich. So können z.B. verschiedene Trennmedien gleichzeitig im Trennraum der FFE-Apparatur verwendet und damit auch gleichzeitig unterschiedliche Trennparameter genutzt werden.Various combinations of these separation techniques (CHIEF and FFE-PZE or CHIEF and CITP) are possible. For example, Different separation media are used at the same time in the separation area of the FFE apparatus and thus different separation parameters are used at the same time.
Die erfindungsgemäss vorgeschlagene Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäss vorgeschlagene Verfahren erlauben die Durchführung von kontinuierlichen Betriebsarten, bei denen die Trennung der Teilchen 7, 7, ',7" bei kontinuierlichem Trennmediumfluss, permanenter Anwendung des elektrischen Feldes während der gesamten Trennung und kontinuierlichem Sammeln durchgeführt wird. Dabei wird zwischen kontinuierlich präparativen (Probe wird kontinuierlich bei gleichbleibenden Trennbedingungen zugegeben) und semipräparativ/analyti- schen (diskontinuierliche Probenzugabe bei gleichbleibenden Trennbedingungen) unterschieden.The device proposed according to the invention and the method proposed according to the invention allow continuous operating modes to be carried out, in which the separation of the particles 7, 7, ', 7 "is carried out with continuous flow of separation medium, permanent application of the electric field during the entire separation and continuous collection. A distinction is made between continuously preparative (sample is added continuously with the same separation conditions) and semi-preparative / analytical (discontinuous sample addition with the same separation conditions).
Bei einer ebenfalls möglichen, diskontinuierlichen Betriebsart strömt das Trenn- medium 8 kontinuierlich : Die Probenaufgabe erfolgt bei abgeschalteter Hochspannung; nach dem Stoppen der Probenaufgabe wird der Mediumtransport abgeschaltet bzw. stark gedrosselt bzw. reduziert. Darauf wird die Hochspannung eingeschaltet, bis die Probenauftrennung erfolgt ist. Nach einer vorgegebenen Zeit wird die Spannung ausgeschaltet und die aufgetrennte Probe mit erhöhtem Mediumdurchfluss aus der Trennkammer eluiert und gesammelt.In a discontinuous mode of operation, which is also possible, the separating medium 8 flows continuously: the sample application takes place when the high voltage is switched off; After stopping the sample application, the medium transport is switched off or greatly reduced or reduced. The high voltage is then switched on until the sample has been separated. After a predetermined time, the voltage is switched off and the separated sample is eluted from the separation chamber with an increased medium flow and collected.
Es kann zudem vorgesehen sein, dass mittels einer weiteren Dosierpumpe bzw. separaten Förderkanälen der Mediumpumpe - vorzugsweise am den Medienzuführungen 15,15' entgegengesetzten Ende der FFE-Vorrichtung - ein Hilfsmedi- um 21 über Hilfsmediumzuführungen 22 in die Trennkammer 14 geleitet und gemeinsam mit dem Trennmedium 8 über die Fraktionierstellen 18 abgeführt (vgl. Figuren 6A bis 6C) wird. Figur 7 zeigt den Effekt der Fokussierkissen 12,13, wobei die Grenze des Fokussierkissens mit dem elektrisch hoch-leitenden Kissenmedium 20, welches im Wesentlichen parallel zu der Elektrode 9,10 verläuft, gestrichelt angedeutet ist. Wird kein Fokussierkissen erzeugt (Fig. 7A), so stellt sich in etwa eine Normal- Verteilung (schraffiert) der an Hand der selektiv veränderten Netto-Oberflächenladung von einem Rest einer Probe abgetrennten Teilchen ein. Es kann auch vorkommen, dass sich Teilchen an der Elektrode 9,10 festsetzen (nicht gezeigt), so dass zum Teil wesentliche Verluste an diesen, z.B. auf Grund ihrer besonderen biologischen Relevanz abgetrennten Teilchen, eintreten. Dies kann mit ei- nem Fokussierkissen 12,13 aus einem elektrisch hoch-leitenden Kissenmedium 20 erfolgreich verhindert werden (vgl. Fig. 7B) : Dank der hohen elektrischen Leitfähigkeit verhält sich das Fokussierkissen wie eine Elektrode 9,10, wobei - dank der hohen elektrischen Leitfähigkeit des Kissenmediums 20 - verhindert wird, dass Teilchen bis zur tatsächlichen Elektrode 9,10 gelangen können. Wie in Fig. 7B gezeigt, bildet sich an der Kissengrenze eine Konzentration der isolierten Teilchen (schraffiert) aus, welche das Mass einer Normalverteilung (gestrichelt dargestellt) bei Weitem übertrifft. Über eine Fraktionierstelle 18, die gerade in diesem Bereich positioniert ist, kann somit eine wesentlich grössere Menge dieser Teilchen in höherer Konzentration der FFE-Vorrichtung entnom- men und der Weiterverwendung zugeführt werden; Insbesondere für die Isolierung von Zellen, Organellen, Membranteilen oder Komplexen von Biomolekülen, welche an Hand ihrer selektiv veränderten Netto-Oberflächenladung mittels der FFE vom Rest einer Probe abgetrennt werden sollen, stellt die Verwendung eines solchen Fokussierkissens 12,13 eine wesentliche Verbesserung dar. Hin- gegen erscheint die Verwendung eines Fokussierkissens bei der Feintrennung von identische Untereinheiten aufweisenden Biomolekülen bzw. derer Komplexe als weniger vorteilhaft. Die Führungs- oder Fokussierkissen 12,13 werden somit durch einen Puffer 20 gebildet, der im Vergleich zum Trennmedium 8 eine stark erhöhte elektrische Leitfähigkeit aufweist. Da die elektrophoretische Trennlei- stung abhängig von der Feldstärke ist, und sich umgekehrt proportional zur Leitfähigkeit verhält, nimmt die elektrophoretische Trennleistung in den Fokussierkissen 12,13 so stark ab, dass die ladungsmodifizierten Teilchen 7',7" an der Grenzfläche zwischen dem Trennmedium 8 und den Fokussierkissen 12,13 fo- kussiert werden.It can also be provided that by means of a further metering pump or separate delivery channels of the medium pump - preferably at the end of the FFE device opposite the media feeds 15, 15 '- an auxiliary medium 21 is fed into the separation chamber 14 via auxiliary medium feeds 22 and together with the Separation medium 8 is removed via the fractionation points 18 (see FIGS. 6A to 6C). FIG. 7 shows the effect of the focusing pillows 12, 13, the boundary of the focusing pillow with the electrically highly conductive pillow medium 20, which runs essentially parallel to the electrode 9, 10, being indicated by dashed lines. If a focusing pad is not produced (FIG. 7A), a normal distribution (hatched) of the particles separated from a rest of a sample by means of the selectively changed net surface charge is obtained. It can also happen that particles adhere to the electrode 9, 10 (not shown), so that in some cases substantial losses occur on these particles, for example because of their particular biological relevance. This can be successfully prevented with a focusing pad 12, 13 made of an electrically highly conductive pad medium 20 (cf. FIG. 7B): thanks to the high electrical conductivity, the focusing pad behaves like an electrode 9, 10, whereby - thanks to the high electrical conductivity of the cushion medium 20 - it is prevented that particles can reach the actual electrode 9, 10. As shown in FIG. 7B, a concentration of the isolated particles (hatched) forms at the cushion boundary, which far exceeds the measure of a normal distribution (shown in broken lines). Via a fractionation point 18, which is positioned precisely in this area, a substantially larger quantity of these particles can be removed in a higher concentration from the FFE device and used for further use; In particular for the isolation of cells, organelles, membrane parts or complexes of biomolecules, which are to be separated from the rest of a sample by means of the FFE on the basis of their selectively changed net surface charge, the use of such a focusing pad 12, 13 represents a significant improvement - On the other hand, the use of a focusing pad for the fine separation of identical subunits biomolecules or their complexes appears to be less advantageous. The guide or focusing pads 12, 13 are thus formed by a buffer 20, which has a greatly increased electrical conductivity compared to the separation medium 8. Since the electrophoretic separating power is dependent on the field strength and is inversely proportional to the conductivity, the electrophoretic separating power in the focusing pads 12, 13 decreases so much that the charge-modified particles 7 ', 7 "on the Interface between the separation medium 8 and the focusing pads 12, 13 are focused.
Im Folgenden werden drei Ausführungsbeispiele für Immun-FFE vorgestellt:Three exemplary embodiments of immune FFE are presented below:
Beispiel A: Reinigung von zirkulierenden Tumorzellen aus VollblutExample A: Purification of Circulating Tumor Cells from Whole Blood
Eine Zusammenfassung der Wertigkeit von disseminierten Tumorzellen findet sich in : Bockmann B, Grill HJ, Giesing M. Molecular characterization of minimal residual cancer cells in patients with solid tumors. Biomol. Eng. 2001;17:95- 111.A summary of the value of disseminated tumor cells can be found in: Bockmann B, Grill HJ, Giesing M. Molecular characterization of minimal residual cancer cells in patients with solid tumors. Biomol. Closely. 2001; 17: 95-111.
Als Zelloberflächenmarker wird das für Epithelzellen spezifische Membranprotein "Epitheliales Glycoprotein" (EGP) verwendet. Dieses EPG wird auch von Tumorzellen epithelialer Tumoren exprimiert (Moldenhauer G, Momburg F, Möller P, Schwartz R, Hämmerling GJ. Epithelium-specific surface glycoprotein of Mr 34,000 is widely distributed carcinoma marker. BrJ Cancer 1987;56:714-21).The membrane protein "epithelial glycoprotein" (EGP), which is specific for epithelial cells, is used as the cell surface marker. This EPG is also expressed by tumor cells of epithelial tumors (Moldenhauer G, Momburg F, Möller P, Schwartz R, Hämmerling GJ. Epithelium-specific surface glycoprotein of Mr 34,000 is widely distributed carcinoma marker. BrJ Cancer 1987; 56: 714-21).
Gegen ein Epitop des EGP gibt es einen in der Literatur gut beschriebenen monoklonalen Antikörper mit der Bezeichnung Ber-EP4 (Latza U, Niedobitek G, Schwarting R, Nekarda H, Stein H. Ber-EP4: new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from mesothelia. J Clin Pathol 1990;43:213-9).Against an epitope of the EGP there is a monoclonal antibody with the name Ber-EP4 (Latza U, Niedobitek G, Schwarting R, Nekarda H, Stein H. Ber-EP4: new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from mesothelia). J Clin Pathol 1990; 43: 213-9).
Dieser monoklonale Antikörper wird auf 2 Arten für die Immun-FFE modifiziert:This monoclonal antibody is modified for immune FFE in two ways:
A) Ein Ladungsträger 4,5 wird direkt und kovalent an den Antikörper (das Bindungsmolekül 3) gekoppelt.A) A charge carrier 4, 5 is directly and covalently coupled to the antibody (the binding molecule 3).
B) An das Antiserum wird kovalent Streptavidin gekoppelt. An das Streptavidin werden dann, frei wählbar, biotinylierte Ladungsträger 4,5 gebunden. Zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen wird Citrat- oder Heparin-Vollblut von Patient(inn)en mit z.B. Mamma-, Ovarial- oder Colonkarzinom entweder direkt eingesetzt oder wie folgt vorbereitet:B) Streptavidin is covalently coupled to the antiserum. Freely selectable, biotinylated charge carriers 4,5 are then bound to the streptavidin. To isolate circulating tumor cells, citrated or heparin whole blood from patients with, for example, breast, ovarian or colon carcinoma is either used directly or prepared as follows:
1. Isolierung der weissen Blutkörperchen (Mononuclear Cells, MNC) über einen Dichtegradienten, mittels an sich bekannter Methoden.1. Isolation of the white blood cells (mononuclear cells, MNC) via a density gradient, using methods known per se.
2. Zugabe der entsprechend, mit Ladungsträgern 4,5 modifizierten Antikörper.2. Add the correspondingly modified antibodies with charge carriers 4,5.
3. Inkubation mittels an sich bekannter Methoden.3. Incubation using methods known per se.
4. Auftrennung der Zellen in der Immun-FFE:4. Separation of the cells in the immune FFE:
In einem ersten Versuch wurden Trennbedingungen und Trennmedium ge- wählt, wie sie aus Bondy B., Bauer J., Seuffert I. and Weber G. (1995) "So- dium Chloride in the Separation medium enhances cell compatibility of FreeIn a first experiment, separation conditions and separation medium were selected, as described in Bondy B., Bauer J., Seuffert I. and Weber G. (1995) "Sodium Chloride in the Separation medium enhances cell compatibility of Free
Flow Electrophoresis", Electrophoresis 16: 92-97 bekannt sind. Auf dieseFlow Electrophoresis ", Electrophoresis 16: 92-97
Publikation wird hier ausdrücklich Bezug genommen.Publication is expressly referred to here.
In einem weiteren Versuch wurde ein Trennmedium verwendet, wie es in der internationalen Anmeldung PCT/EP01/10036 beschrieben ist. Auf dieseIn a further experiment, a separation medium was used, as described in the international application PCT / EP01 / 10036. To this
Anmeldung wird hier ausdrücklich Bezug genommen.Registration is expressly referred to here.
Beispiel B: Isolierung von PeroxysomenExample B: Isolation of Peroxysomes
Peroxysomen sind Zellorganellen, die oxidative Reaktionen mit molekularem Sauerstoff durchführen. Sie generieren Sauerstoffperoxid für oxidative Zwecke.Peroxysomes are cell organelles that carry out oxidative reactions with molecular oxygen. They generate oxygen peroxide for oxidative purposes.
Hoch-angereicherte Peroxysomen könne z.B. aus Rattenleber über eine auf- wendige Dichtegradienten-Zentrifugation nach der Methode von Lüers et al. Isoliert werden (Lüers GH, Hartig R, Mohr H, Hausmann M, Fahimi HD, Cremer C, Völkl A. Immuno-isolation of highly purified peroxisomes using magnetic beads and continuous immunomagnetic sorting. Electrophoresis 1998; 19: 1205- 210): 1. Homogenisierung der Rattenleber mit an sich bekannten Methoden.Highly enriched peroxysomes can e.g. from rat liver via an elaborate density gradient centrifugation using the method of Lüers et al. Isolation (Lüers GH, Hartig R, Mohr H, Hausmann M, Fahimi HD, Cremer C, Völkl A. Immuno-isolation of highly purified peroxisomes using magnetic beads and continuous immunomagnetic sorting. Electrophoresis 1998; 19: 1205-210): 1 Homogenization of rat liver using methods known per se.
2. Zentrifugation des Homogenisats bei 1,900 x g zur Entfernung von Zellkernen, Zelldebris, Mitochondrien und noch intakten Zellen.2. Centrifugation of the homogenate at 1,900 x g to remove cell nuclei, cell debris, mitochondria and cells that are still intact.
3. Zentrifugation des Überstandes bei 25,000 x g. 4. Das resultierende Pellet enthält dann die sogenannte "light microsomal frac- tion" (inkl. Peroxysomen, Mikrosomen und einige Mitochondrien mit Lyso- somen) und stellt somit eine Mischung dar, welche auch die Peroxysomen umfasst.3. Centrifuge the supernatant at 25,000 x g. 4. The resulting pellet then contains the so-called "light microsomal fraction" (including peroxysomes, microsomes and some mitochondria with lysosomes) and thus represents a mixture which also includes the peroxysomes.
Zur Anreicherung von Peroxysomen mit einer modifizierten Immun-FFE gibt es bereits eine Methode (Voelkl A, Mohr H, Weber G, Fahimi HD. Isolation of pero- xisome subpopulations from rat liver by means of immune free-flow electro- phoresis. Electrophoresis 1998; 19: 1140-1144). Diese bekannte Methode zur Anreicherung von Peroxysomen mit Immun-FFE wird jedoch durch das Einführen von Ladungsträgern 4,5 wie folgt modifiziert:There is already a method for enriching peroxysomes with a modified immune FFE (Voelkl A, Mohr H, Weber G, Fahimi HD. Isolation of peroxisome subpopulations from rat liver by means of immune free-flow electrophoresis. Electrophoresis 1998 ; 19: 1140-1144). However, this known method for enriching peroxysomes with immune FFE is modified as follows by introducing charge carriers 4, 5:
1. Homogenisierung der Rattenleber wie bekannt.1. Homogenization of the rat liver as known.
2. Zentrifugation bei 400 x g zur Entfernung von Zellkernen, Zelldebris, und noch intakten Zellen.2. Centrifugation at 400 x g to remove cell nuclei, cell debris and cells that are still intact.
3. Der Überstand wird mit einem mit Ladungsträgern 4,5 modifizierten Antikörper gegen ein Membranprotein der Peroxysomen (z.B. PMP70; 70 kDa grosses cytoplasmatisches Membranprotein von Peroxysomen, Antikörper gegen das C-terminale, elf Aminosäuren lange, cytoplasmatische Ende) in- kubiert.3. The supernatant is incubated with an antibody modified with charge carriers 4.5 against a membrane protein of the peroxysomes (e.g. PMP70; 70 kDa cytoplasmic membrane protein of peroxysomes, antibodies against the C-terminal, eleven amino acids long, cytoplasmic end).
4. Die Auftrennung mit Immun-FFE erfolgte, wie durch A. Völkl, H. Mohr, G. Weber und H.D. Fahimi beschrieben (Electrophoresis 1998, 19, 1140-1144), bei einer Trennmedium-Temperatur von 4°C und bei einem pH von 8.0 in einem elektrischen Feld von l'OOO V und 100 mA sowie einer Trennmedium- Flussgeschwindigkeit von ca. 5 ml/Fraktion pro Stunde. Die Proben wurden mit etwa 2 ml/Stunde in die Trennkammer eingeführt und die aufgetrennten Fraktionen wurden mit Hilfe einer 96-Kanal-Peristaltikpumpe gesammelt. Jeder einzelne Trennversuch dauerte etwa 60 bis 90 Minuten.4. The separation with immuno-FFE was carried out as by A. Völkl, H. Mohr, G. Weber and H.D. Fahimi described (Electrophoresis 1998, 19, 1140-1144), at a separation medium temperature of 4 ° C and at a pH of 8.0 in an electric field of 100,000 V and 100 mA and a separation medium flow rate of about 5 ml / Fraction per hour. The samples were introduced into the separation chamber at about 2 ml / hour and the separated fractions were collected using a 96-channel peristaltic pump. Each individual separation attempt took about 60 to 90 minutes.
Beispiel C: Isolierung von rekombinanten Proteinen Zur Expression rekombinanter Proteine gibt es Vektoren, die am 5' oder 3' Ende eines Konstruktes eine Kassette von 5-10 Histidinen an das zu exprimierende Protein anhängen können (His-Tags, vgl. Fig. 5). Diese zusätzlichen Histidine werden zur späteren Reinigung der exprimierten Proteine verwendet. Andere Vektoren enthalten z.B. Glutathion-S-Transferase als zusätzliches Element. Diese Vektoren eignen sich zur Expression rekombinanter Proteine z.B. in E. coli, Baculovirus-infizierten Bakterien und Säugerzellen. Entsprechende Methoden zur Herstellung rekombinanter Proteine sind dem Fachmann bekannt.Example C: Isolation of recombinant proteins For the expression of recombinant proteins, there are vectors which can attach a cassette of 5-10 histidines to the protein to be expressed at the 5 'or 3' end of a construct (His tags, see FIG. 5). These additional histidines are used for later purification of the expressed proteins. Other vectors contain, for example, glutathione-S-transferase as an additional element. These vectors are suitable for the expression of recombinant proteins, for example in E. coli, baculovirus-infected bacteria and mammalian cells. Appropriate methods for producing recombinant proteins are known to the person skilled in the art.
Die derzeitigen Möglichkeiten zur Aufreinigung von rekombinant exprimierten Proteinen beruhen hauptsächlich auf affinitätschromatographischen Methoden. Diese Methoden sind relativ leicht anwendbar und - je nach Menge der zu reinigenden Proteine - skalierbar. Die affinitätschromatographische Reinigung rekombinanter Proteine hat jedoch mehrere signifikante Nachteile: 1. Ausbluten der AffinitätsmatrixThe current possibilities for the purification of recombinantly expressed proteins are mainly based on affinity chromatography methods. These methods are relatively easy to use and - depending on the amount of proteins to be purified - scalable. However, affinity-chromatographic purification of recombinant proteins has several significant disadvantages: 1. Bleeding out of the affinity matrix
2. Verstopfen der Säulen bedingt durch die Probenmatrix (Zell-Lysate)2. Clogging of the columns due to the sample matrix (cell lysates)
3. Unspezifische Bindung von Proteinen3. Unspecific binding of proteins
4. Enzymatische Lyse von Proteinen (Proteolyse)4. Enzymatic Lysis of Proteins (Proteolysis)
Die Reinigung von rekombinanten Proteinen mit poly-His-Tags mittels immobilisierten Ni-NTA (Nickel Nitrilotriacetic Acid) Chelaten ist dem Fachmann bekannt. Die feste Phase kann für präparative Reinigungen in Chromatographiesäulen gepackt sein (z.B. Ni-NTA-Agarose), für analytische Anwendungen stehen (z.B. Ni-NTA) Magnetpartikel zur Verfügung.The person skilled in the art is familiar with the purification of recombinant proteins using poly-His tags using immobilized Ni-NTA (nickel nitrilotriacetic acid) chelates. The solid phase can be packed in preparative purifications in chromatography columns (e.g. Ni-NTA agarose), for analytical applications (e.g. Ni-NTA) magnetic particles are available.
Besonders geeignet für die Reinigung rekombinanter Proteine ist die in Fig. 5 dargestellte, erfindungsgemässe Immun-FFE, die folgende Schritte umfasst:The immune FFE according to the invention shown in FIG. 5, which comprises the following steps, is particularly suitable for the purification of recombinant proteins:
1. Lyse der Zellen (z.B. Hefen, Bakterien, Säugerzellen) nach an sich bekann- ter Methode.1. Lysis of the cells (e.g. yeast, bacteria, mammalian cells) according to a known method.
2. Bindung von Ladungsträgern 4,5 an die His-tagged Proteine: Variante 1 : Bindung der Ladungsträger 4,5 an ein Bindungsmolekül 3 in Form von Ni-NTA und Bindung dieses geladenen Bindungsmoleküls 6 an die His-Tags; oder2. Binding of charge carriers 4,5 to the His-tagged proteins: Variant 1: Binding of the charge carriers 4, 5 to a binding molecule 3 in the form of Ni-NTA and binding of this charged binding molecule 6 to the His tags; or
Variante 2: Bindung der Ladungsträger 4,5 an ein Bindungsmolekül 3 inVariant 2: Binding of the charge carriers 4,5 to a binding molecule 3 in
Form eines anti-poly-His Antikörpers und Bindung dieses geladenen Bindungsmoleküls 6 an die His-Tags.Form of an anti-poly-His antibody and binding of this charged binding molecule 6 to the His tags.
3. Inkubation nach an sich bekannter Methode.3. Incubation according to a known method.
4. Separation mittels FFE (qualitativ aber auch quantitativ möglich) : In einem ersten Versuch wurden Trennbedingungen und Trennmedium gewählt, wie sie aus Bondy B., Bauer J., Seuffert I. and Weber G. (1995) "So- dium Chloride in the Separation medium enhances cell compatibility of Free Flow Electrophoresis", Electrophoresis 16: 92-97 bekannt sind. Auf diese Publikation wird hier ausdrücklich Bezug genommen. In einem weiteren Versuch wurde ein Trennmedium verwendet, wie es in der internationalen Anmeldung PCT/EP01/10036 beschrieben ist. Auf diese Anmeldung wird hier ausdrücklich Bezug genommen.4. Separation by means of FFE (qualitatively but also quantitatively possible): In a first experiment, separation conditions and separation medium were selected, as described in Bondy B., Bauer J., Seuffert I and Weber G. (1995) "Sodium Chloride in the Separation medium enhances cell compatibility of Free Flow Electrophoresis ", Electrophoresis 16: 92-97 are known. This publication is expressly referred to here. In a further experiment, a separation medium was used, as described in the international application PCT / EP01 / 10036. This application is expressly referred to here.
5. Sammeln der isolierten His-tagged Proteine5. Collect the isolated His-tagged proteins
Die His-tagged Proteine können entweder nun direkt verwendet werden oder die His-Tags werden vor der weiteren Verwendung enzymatisch abgespalten.The His-tagged proteins can either now be used directly or the His-Tags are cleaved off enzymatically before further use.
Zum Abtrennen der His-Tags von den Proteinen gibt es mehrere Möglichkeiten :There are several ways to separate the His tags from the proteins:
Für Variante 1 : a) Ablösen des Chelats durch an sich bekannte Inkubation mit Imidazol und ggf. erneute Reinigung des Proteins auf FFE; b) An sich bekannte enzymatische Abspaltung des His-Tags mit Thrombin oder Exoprotease und ggf. erneute Reinigung des isolierten Proteins auf FFE.For variant 1: a) detachment of the chelate by known incubation with imidazole and, if necessary, renewed purification of the protein for FFE; b) Known enzymatic cleavage of the His tag with thrombin or exoprotease and, if necessary, renewed purification of the isolated protein for FFE.
Für Variante 2: c) Ablösen der Antikörper mit an sich bekannten Methoden, z.B. durch Verändern der Salzkonzentration oder des pH. d) Enzymatische Abspaltung der His-Tags mit an sich bekannten Methoden. e) Erneute Reinigung mit FFE.For variant 2: c) Detach the antibodies using methods known per se, for example by changing the salt concentration or the pH. d) Enzymatic cleavage of the His tags using methods known per se. e) Clean again with FFE.
Der Charge Label bzw. die Ladungsträger oder das den Ladungsträger tragende Agens (z.B. Biomolekül) kann auch zusätzlich (z.B. mit einem Farbstoff) markiert sein. Dadurch wird eine Detektion während oder nach der FFE möglich. Ladungsträger könnten auch alle Arten von Partikeln sein (z.B. Beads aller Art, wie Latex, Agarosepartikel, Kolloide, etc.). Ladungsträger können auch praktisch beliebige Kombinationen von Beads und/oder Antikörpern und/oder ladungstragenden Molekülen und/oder Fluoreszenzmarkern und/oder Farbstoffen sein. Beads können z.B. mit Fluoreszenz- oder anderen Farbstoffen gefärbt sein. Beads können gleichzeitig eine Fluoreszenzmarkierung (innen oder aussen), den Charge Label und das Bindungsmolekül (z.B. Antikörper oder Ni-NTA) tragen. Falls Beads verwendet werden, welche eine enzymatisch spaltbare Brücke besitzen, dann können nach erfolgter Reinigung (z.B. Reinigung von rekombinanten Proteinen mit Ni-NTA) die Beads vom gereinigten Molekül abgespalten werden. Besonders bevorzugt werden Beads, welche fluoreszierend sind und an der Oberfläche mit Ladungsträgern und Bindungsmolekülen versehen sind.The charge label or the charge carriers or the agent carrying the charge carrier (e.g. biomolecule) can also be additionally marked (e.g. with a dye). This enables detection during or after the FFE. Charge carriers could also be all types of particles (e.g. beads of all types, such as latex, agarose particles, colloids, etc.). Charge carriers can also be virtually any combination of beads and / or antibodies and / or charge-carrying molecules and / or fluorescent markers and / or dyes. Beads can e.g. be colored with fluorescent or other dyes. Beads can carry a fluorescent label (inside or outside), the charge label and the binding molecule (e.g. antibody or Ni-NTA) at the same time. If beads are used that have an enzymatically cleavable bridge, then after cleaning (e.g. cleaning of recombinant proteins with Ni-NTA) the beads can be cleaved from the purified molecule. Beads that are fluorescent and that are provided on the surface with charge carriers and binding molecules are particularly preferred.
Mögliche Maßnahmen zur Erhaltung der biologischen Aktivität bzw. Vitalität von Biopartikeln bei den verschiedenen FFE-Trenntechniken ergeben sich aus der folgenden Tabelle 1 :Possible measures for maintaining the biological activity or vitality of bioparticles in the various FFE separation techniques are shown in Table 1 below:
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Erklärungen: PZE: kontinuierliche Free Flow ZonenelektrophoreseExplanations: PZE: continuous free flow zone electrophoresis
CITP: kontinuierliche Free Flow IsotachophoreseCITP: continuous free flow isotachophoresis
CHIEF: kontinuierliche isoelektrische FokussierungCHIEF: continuous isoelectric focusing
+ + + = uneingeschränkte Anwendung+ + + = unlimited use
++ = nur geringfügig eingeschränkte Anwendung++ = only slightly restricted application
+ = nur in Sonderfällen anwendbar+ = only applicable in special cases
= Anwendung nicht möglich= Application not possible
Die erfindungsgemässe Auftrennung von Teilchen ermöglicht ein konzentriertes Sammeln bzw. eine Anreicherung von biologisch relevanten Teilchen, deren Analyse bzw. deren Verwendung in diagnostischen oder therapeutischen Verfahren wegen des zu hohen Hintergrundes an gleichzeitig anwesenden, verwandten, aber irrelevanten Teilchen bisher nicht zugänglich war. Die vorgestellte FFE-Methoden und Vorrichtungen ermöglichen somit Isolation und demzufolge die Nutzung von naturgemäss in äusserst geringen Konzentrationen vorliegenden Teilchen bzw. die Bereitstellung derer biologisch relevanten Informationen zur Verwendung in diagnostischen oder therapeutischen Verfahren. Zudem können die isolierten Teilchen zum Auffinden und Charakterisieren von Targets für die Entwicklung von Medikamenten, von Targets für die Anwendung in der Diagnostik, der Therapie-Auswahl und dem Therapiemonitoring sowohl für Menschen, als auch für Tiere und Pflanzen dienen.The separation of particles according to the invention enables concentrated collection or enrichment of biologically relevant particles, the analysis or use of which in diagnostic or therapeutic processes has not previously been possible because of the background of too many related but irrelevant particles present at the same time. The FFE methods and devices presented thus enable isolation and consequently the use of particles naturally present in extremely low concentrations or the provision of their biologically relevant information for use in diagnostic or therapeutic processes. In addition, the isolated particles can be used to find and characterize targets for the development of medicaments, targets for use in diagnostics, therapy selection and therapy monitoring both for humans and for animals and plants.
Anwendungen der erzielten Ergebnisse umfassen z.B. aus Vollblut isolierte Tumorzellen zur Target-Identifikation in der Entwicklung von Medikamenten gegen migrierende Tumorzellen.Applications of the results achieved include e.g. Tumor cells isolated from whole blood for target identification in the development of drugs against migrating tumor cells.
Für die gleichen Merkmale gelten in allen Figuren die identischen Bezugszei- chen, auch wenn diese nicht ausdrücklich zitiert sind. Die offenbarten, erfindungsgemässen Verfahren eignen sich - gegebenenfalls nach entsprechender Anpassung - auch für die Anwendung in verschiedensten Gebieten der Chromatographie, wie beispielsweise in der Affinitätschromatographie von organischen oder anorganischen Molekülen und Polymeren. The same reference numerals apply to the same features in all the figures, even if they are not expressly cited. The disclosed methods according to the invention are - if appropriate after appropriate adaptation - also suitable for use in a wide variety of areas of chromatography, for example in the affinity chromatography of organic or inorganic molecules and polymers.

Claims

Patentansprücheclaims
1. Verfahren zum Trennen von Teilchen (1,1', 1") - insbesondere zum Auf- trennen von Zellen, Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen bzw. von Teilen oder Komplexen derselben - insbesondere unter Verwendung einer Free-Flow-EIektrophoresevorrichtung, welche einen Trennraum (14), der durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt ist, eine Do- sierpumpe zum Fördern eines Trennmediums (8), welches über Medienzuführungen (15,15') in den Trennraum (14) gelangt und diesen über Auslässe (16) wieder verlässt, Elektroden (9,10) zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium (8) sowie Probeaufgabestellen (17) zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen und Fraktio- niersteilen (18) zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen1. A method for separating particles (1,1 ', 1 ") - in particular for separating cells, cell components, organelles or biomolecules or parts or complexes thereof - in particular using a free-flow electrophoresis device, which one Separation space (14), which is delimited by a base and a cover and by these two spacers which are spaced apart from one another, a metering pump for conveying a separation medium (8) which is fed into the separation space via media feeds (15, 15 ') (14) arrives and leaves it again via outlets (16), electrodes (9, 10) for applying an electric field in the separation medium (8) and sample application points (17) for adding a mixture of particles and fractionation parts (18) to be separated Removal of particles separated by the FFE
(1,1', 1") im Trennmedium (8) umfasst, welches folgende Schritte umfasst:(1,1 ', 1 ") in the separation medium (8), which comprises the following steps:
• Bereitstellen eines Trennmediums (8)• Providing a separation medium (8)
• Fördern des Trennmediums (8) mittels der Dosierpumpe über die Medienzuführungen (15,15') in den Trennraum (14); • Durchfliessen des Trennraums (14) mit dem Trennmedium (8);• conveying the separation medium (8) by means of the metering pump via the media feeds (15, 15 ') into the separation space (14); • Flow through the separation space (14) with the separation medium (8);
• Fraktionieren des Trennmediums (8) über diskrete Auslässe (16);• fractionation of the separation medium (8) via discrete outlets (16);
• Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium (8);• application of an electric field in the separation medium (8);
• Kombinieren eines zu trennenden Teilchens (l',l") mit selektiv wählbaren Ladungsträgern (4,5) zum Erzeugen von ladungsmodifizierten Teilchen (7', 7"), die - wegen ihrer selektiv veränderten Netto-Combining a particle to be separated (1 ', 1 ") with selectively selectable charge carriers (4, 5) to produce charge-modified particles (7', 7") which - because of their selectively changed net
Oberflächenladung - in der FFE ein anderes Migrationsverhalten aufweisen, als nicht-ladungsmodifizierte Teilchen (7);Surface charge - in which FFE show a different migration behavior than non-charge-modified particles (7);
• Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen (1,1', 1") zum Trennmedium (8) im Trennraum (14) über die Probeaufgabestel- len (17);• adding a mixture of particles (1, 1 ', 1 ") to be separated to the separation medium (8) in the separation space (14) via the sample application points (17);
• Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen (1,1',1") im Trennmedium (8) über Fraktionierstellen (18) ;• Removing particles (1,1 ', 1 ") separated by means of the FFE in the separation medium (8) via fractionation points (18);
• Sammeln der Fraktionen mit den abgetrennten Teilchen; dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Trennmedium (8) und mindestens einer Elektrode (9,10) Führungs- oder Fokussierkissen (12,13) mit einem Kissenmedium (20) erzeugt werden, wobei dieses Kissenmedium (20) eine gegenüber dem Trennmedium (8) stark erhöhte elektrische Leitfähigkeit aufweist und über separate Kanäle (15') zu diesen Fokussierkissen (12,13) zugeführt wird.Collecting the fractions with the separated particles; characterized in that guiding or focusing cushions (12, 13) with a cushion medium (20) are produced between the separation medium (8) and at least one electrode (9, 10), this cushion medium (20) being one opposite the separation medium (8) has greatly increased electrical conductivity and is supplied to these focusing pads (12, 13) via separate channels (15 ').
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Netto- Oberflächenladung der Teilchen (1,1', 1") während dem Betrieb der FFE- Vorrichtung an die Stärke des elektrischen Feldes angepasst wird oder dass die Stärke des elektrischen Feldes an die veränderte Oberflächenladung der Teilchen (1,1', 1") angepasst wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the net surface charge of the particles (1,1 ', 1 ") is adapted to the strength of the electric field during the operation of the FFE device or that the strength of the electric field to the changed surface charge of the particles (1,1 ', 1 ") is adjusted.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorgängig zum Betrieb der FFE-Vorrichtung die Netto-Oberflächenladu'ng der Teilchen3. The method according to claim 1, characterized in that previously to the operation of the FFE device, the net Oberflächenladu 'ng of the particles
(1,1',1") an die Stärke des elektrischen Feldes angepasst wird oder dass die Stärke des elektrischen Feldes vorgängig zum Betrieb der FFE- Vorrichtung an die veränderte Oberflächenladung der Teilchen (1,1', 1") angepasst wird.(1,1 ', 1 ") is adapted to the strength of the electric field or that the strength of the electric field is adjusted to the changed surface charge of the particles (1,1', 1") beforehand to operate the FFE device.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass diese selektive Veränderung der Netto-Oberflächenladung mit an Bindungsmoleküle (3) gebundenen Ladungsträgern (4,5) erzeugt wird.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that this selective change in the net surface charge is generated with charge carriers (4, 5) bound to binding molecules (3).
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als ein geladenes Bindungsmolekül (6) ein epitop-spezifischer Antikörper oder ein Ni-NTA verwendet wird, die an entsprechenden Epitopen (2', 2") auf den Teilchenoberflächen immobilisiert werden.5. The method according to claim 4, characterized in that an epitope-specific antibody or a Ni-NTA is used as a charged binding molecule (6), which are immobilized on corresponding epitopes (2 ', 2 ") on the particle surfaces.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Ladungsträger (4,5) eine stark positive oder negative Ladung aufweist, als Bead, Latex- oder Agarosepartikel, Molekül und dergleichen ausgebildet ist. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the charge carrier (4,5) has a strongly positive or negative charge, is designed as a bead, latex or agarose particles, molecule and the like.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass einer oder mehrere Ladungsträger (4,5) oder Polymere derselben ausgewählt werden aus einer Gruppe umfassend : Lysin, Arginin, Histidin, Aspartat und Glutamat.7. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that one or more charge carriers (4,5) or polymers thereof are selected from a group comprising: lysine, arginine, histidine, aspartate and glutamate.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Ladungsträger (4,5) kovalent an den epitop-spezifischen Antikörper oder an ein Ni-NTA-Molekül gebunden wird.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the charge carrier (4,5) is covalently bound to the epitope-specific antibody or to a Ni-NTA molecule.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es die Verwendung eines oder mehrere Bindungsmoleküle (3) umfasst, die ausgewählt sind aus einer Gruppe umfassend : Neutravidin-, Streptavidin/Biotin- und sekundäre Antikörper-Systeme sowie Chelatbild- ner.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that it comprises the use of one or more binding molecules (3) which are selected from a group comprising: neutravidin, streptavidin / biotin and secondary antibody systems and chelating ner.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste, eine negative Netto-Oberflächenladung aufweisende Teilchengruppe im elektrischen Feld des Trennmediums (8) in Richtung gegen die Anode (10) und - im Wesentlichen synchron dazu - eine zweite, eine positive Netto-Oberflächenladung aufweisende Teilchengruppe im elektrischen Feld des Trennmediums (8) in Richtung gegen die Kathode (9) bewegt wird.10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that a first group of particles having a negative net surface charge in the electrical field of the separation medium (8) in the direction towards the anode (10) and - substantially synchronously to this - a second , a positive net surface charge particle group is moved in the electric field of the separation medium (8) towards the cathode (9).
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass während dem Betrieb der FFE-Vorrichtung im Kissenmedium (20) mit den Bereichen (19) in der Nähe von Anode (10) und Kathode (9) eine schnellere erste Fliessbewegung als im zwischen den Bereichen (19) liegenden Trennmedium (8) erzeugt wird, wobei die beiden Fliessbewegungen gleichgerichtet sind.11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that during operation of the FFE device in the cushion medium (20) with the areas (19) in the vicinity of the anode (10) and cathode (9) a faster first flow movement than is generated in the separating medium (8) lying between the regions (19), the two flow movements being in the same direction.
12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass durch Einstellen eines bestimmten pH-Wertes im Trennmedium (8) bzw. in Teilen desselben mit einem Puffer-System auf den Ladungsträgern (4) oder Polymeren derselben, welche ausgewählt sind aus einer Gruppe umfassend: Lysin, Arginin und Histidin, eine positive Ladung ausgeprägt wird.12. The method according to one or more of claims 1 to 11, characterized in that by setting a certain pH in the separation medium (8) or in parts thereof with a buffer system the charge carriers (4) or polymers thereof, which are selected from a group comprising: lysine, arginine and histidine, a positive charge is pronounced.
13. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass durch Einstellen eines bestimmten pH-Wertes im Trennmedium (8) bzw. in Teilen desselben mit einem Puffer-System auf den Ladungsträgern (5) oder Polymeren derselben, welche ausgewählt sind aus einer Gruppe umfassend : Aspartat und Glutamat, eine negative Ladung ausgeprägt wird.13. The method according to one or more of claims 1 to 12, characterized in that by setting a certain pH in the separation medium (8) or in parts thereof with a buffer system on the charge carriers (5) or polymers thereof, which are selected from a group comprising: aspartate and glutamate, a negative charge is pronounced.
14. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 4 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass zum kovalenten Binden an die Bindungsmoleküle (3) Biomoleküle verwendet werden, welch aus der Gruppe ausgewählt sind, welche primäre, sekundäre Antikörper, Avidine, Rezeptoren sowie14. The method according to one or more of claims 4 to 13, characterized in that for covalent binding to the binding molecules (3) biomolecules are used, which are selected from the group consisting of primary, secondary antibodies, avidins, receptors and
Enzyme umfasst.Encompasses enzymes.
15. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 4 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass zum kovalenten Binden an die Bindungsmoleküle (3) Liganden verwendet werden, welch aus der Gruppe ausgewählt sind, welche Biotin, Steroide und Enzymsubstrate umfasst.15. The method according to one or more of claims 4 to 13, characterized in that for covalent binding to the binding molecules (3) ligands are used, which are selected from the group comprising biotin, steroids and enzyme substrates.
16. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass mit diesem Verfahren Teilchen (1,1',1") isoliert werden, welche zur Charakterisierung bzw. Darstellung von Targets für die16. The method according to one or more of claims 1 to 15, characterized in that with this method particles (1,1 ', 1 ") are isolated which are used to characterize or represent targets for the
Entwicklung von Medikamenten bzw. für die Anwendung in der Diagnostik und/oder der Therapie-Auswahl und/oder dem Therapiemonitoring für Menschen, Tiere oder Pflanzen dienen.Development of drugs or for use in diagnostics and / or therapy selection and / or therapy monitoring for humans, animals or plants.
17. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass mit diesem Verfahren eine selektive Abreicherung bzw. Depletion von Teilchen aus einem Teilchengemisch erzeugt wird. 17. The method according to one or more of claims 1 to 16, characterized in that a selective depletion or depletion of particles from a particle mixture is generated with this method.
18. Vorrichtung zum Auftrennen von Teilchen, wie Zellen, Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen bzw. von Teilen oder Komplexen derselben - insbesondere Free-Flow-Elektrophoresevorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zum Trennen von Teilchen (1,1',1") gemäss einem der Ansprü- ehe 1 bis 17 - mit zumindest einem mit einem Trennmedium (8) durch- fliessbaren Trennraum (14), der durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt ist, wobei diese FFE-Vorrichtung zudem eine Dosierpumpe zum Fördern des Trennmediums (8), welches über Medienzuführungen (15,15') in den Trennraum (14) gelangt und diesen über Auslässe (16) wieder verlässt, Elektroden (9,10) zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium (8) sowie Probeaufgabestellen (17) zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen (1,1', 1") und Fraktionierstellen (18) zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen im Trennmedium (8) umfasst, wobei die Vorrichtung selektiv wählbare Ladungsträger (4,5) zum Kombinieren mit zu trennenden Teilchen (l',l") und zum Erzeugen von ladungsmodifizierten Teilchen (7', 7"), die - wegen ihrer selektiv veränderten Netto-Oberflächenladung - in der FFE ein anderes Migrationsverhalten aufweisen, als nicht-ladungsmodifizierte Teilchen (7), umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zwischen dem Trennmedium (8) und mindestens einer Elektrode (9,10) angeordnete Führungs- oder Fokussierkissen (12,13) umfasst, wobei diese Fokussierkissen (12,13) aus einem Kissenmedium (20) bestehen, welches eine gegenüber dem Trennmedium (8) stark erhöhte elektrische Leitfähigkeit auf- weist und wobei diese Vorrichtung separate Kanäle (15') zum Zuführen dieses Kissenmediums (20) zu den Fokussierkissen (12,13) umfasst.18. Device for separating particles, such as cells, cell components, organelles or biomolecules or parts or complexes thereof - in particular free-flow electrophoresis device for carrying out the method for separating particles (1,1 ', 1 ") according to one of the Claims 1 to 17 - with at least one separation space (14) through which a separation medium (8) can flow and which is delimited by a base and a cover and by these two spacers which are spaced apart from one another, this FFE device in addition, a metering pump for conveying the separation medium (8), which enters the separation space (14) via media feeds (15, 15 ') and leaves it again via outlets (16), electrodes (9, 10) for applying an electrical field in the separation medium (8) and sample application points (17) for adding a mixture of particles (1,1 ', 1 ") to be separated and fractionation points (18) for removing particles separated by means of the FFE in the separation medium um (8), wherein the device selectively selectable charge carriers (4,5) for combining with particles to be separated (l ', l ") and for generating charge-modified particles (7', 7"), which - because of their selectively changed Net surface charge - in which FFE have a different migration behavior than non-charge-modified particles (7), characterized in that the device has guide or focusing cushions arranged between the separation medium (8) and at least one electrode (9, 10) ( 12, 13), wherein these focusing cushions (12, 13) consist of a cushion medium (20), which has a greatly increased electrical conductivity compared to the separation medium (8), and this device has separate channels (15 ') for feeding it Cushion medium (20) to the focusing pillow (12,13).
19. FFE-Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass im19. FFE device according to claim 18, characterized in that in
Kissenmedium (20) mit den Bereichen (19) in der Nähe von Anode (10) und Kathode (9) eine schnellere erste Fliessbewegung als im zwischen denCushion medium (20) with the areas (19) near the anode (10) and cathode (9) a faster first flow movement than in between
Bereichen (19) liegenden Trennmedium (8) erzeugbar ist, wobei die beiden Fliessbewegungen gleichgerichtet sind. Areas (19) lying separating medium (8) can be generated, the two flow movements being rectified.
20. FFE-Vorrichtung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke des mit dieser Vorrichtung erzeugten elektrischen Feldes während dem Betrieb der FFE-Vorrichtung an eine selektiv veränderte Netto-Oberflächenladung der zu trennenden Teilchen (1,1', 1") anpassbar ist.20. FFE device according to claim 18 or 19, characterized in that the strength of the electric field generated with this device during the operation of the FFE device to a selectively changed net surface charge of the particles to be separated (1,1 ', 1 " ) is customizable.
21. FFE-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie Trennmittel umfasst, mit denen die Netto-Oberflächenladung der zu trennenden Teilchen (1,1', 1") vorgängig zum Betrieb der FFE-Vorrichtung an die Stärke des mit dieser Vorrichtung erzeugbaren elektrischen Feldes anpassbar ist.21. FFE device according to one of claims 18 to 20, characterized in that it comprises separating means with which the net surface charge of the particles to be separated (1,1 ', 1 ") prior to the operation of the FFE device on the starch of the electric field that can be generated with this device is adaptable.
22. FFE-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass sie Trennmittel umfasst, mit welchen die Netto- Oberflächenladung der Teilchen (1,1', 1") zum im Wesentlichen gleichzeitigen, selektiven Bewegen einer ersten Fraktion dieser Teilchen in Richtung zu der Kathode (9) hin und einer zweiten Fraktion in Richtung zu der Anode (10) hin veränderbar ist.22. FFE device according to one of claims 18 to 21, characterized in that it comprises separating means with which the net surface charge of the particles (1,1 ', 1 ") for essentially simultaneously, selectively moving a first fraction of these particles in the direction of the cathode (9) and a second fraction in the direction of the anode (10).
23. FFE-Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass diese Trennmittel an Bindungsmoleküle (3) gebundene Ladungsträger (4,5) umfassen, welche eine stark positive oder negative Ladung aufweisen.23. FFE device according to claim 21 or 22, characterized in that these separating means comprise charge carriers (4, 5) bound to binding molecules (3) and having a strongly positive or negative charge.
24. FFE-Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die24. FFE device according to claim 23, characterized in that the
Ladungsträger (4,5) kovalent an die Bindungsmoleküle (3) gebunden sind.Charge carriers (4,5) are covalently bound to the binding molecules (3).
25. FFE-Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Dosierpumpe zusätzliche Förderka- näle, bzw. dass die FFE-Vorrichtung eine weitere Dosierpumpe zum Fördern eines Hilfsmediums (21) umfasst, welches über Hilfsmedienzuführun- gen (22) in den Trennraum (14) gelangt und diesen über Fraktionierstellen (18) und Auslässe (16) wieder verlässt. 25. FFE device according to one of the preceding claims 18 to 24, characterized in that the metering pump comprises additional delivery channels, or in that the FFE device comprises a further metering pump for conveying an auxiliary medium (21) which is supplied via auxiliary medium feeds ( 22) enters the separation space (14) and leaves it again via fractionation points (18) and outlets (16).
6. Trennmittel zum Trennen von Teilchen (1,1', 1") - insbesondere zum Auftrennen von Zellen, Zeilbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen bzw. von Teilen oder Komplexen derselben mittels der Free-Flow-Elektropho- rese-Technik in einem FFE-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 und unter Verwendung einer FFE-Vorrichtung, insbesondere nach einem der Ansprüche 18 bis 25, mit zumindest einem mit einem Trennmedium (8) durchfliessbaren Trennraum (14), der durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt ist, wobei diese FFE-Vorrichtung zudem eine Dosierpumpe zum Fördern des Trennmediums (8), welches über Medienzuführungen (15,15') in den Trennraum (14) gelangt und diesen über Auslässe (16) wieder verlässt, Elektroden (9,10) zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium (8) sowie Probeaufgabestellen (17) zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen (1,1', 1") und6. Separating agent for separating particles (1,1 ', 1 ") - in particular for separating cells, cell components, organelles or biomolecules or parts or complexes thereof using the free-flow electrophoresis technique in an FFE- Method according to one of Claims 1 to 17 and using an FFE device, in particular according to one of Claims 18 to 25, with at least one separation space (14) through which a separation medium (8) can flow, which through a base and a cover and through these two spacers which are kept at a distance from one another, this FFE device also having a metering pump for conveying the separation medium (8), which enters the separation space (14) via media feeds (15, 15 ') and the latter via outlets (16) leaves again, electrodes (9, 10) for applying an electrical field in the separation medium (8) and sample application points (17) for adding a mixture of particles (1, 1 ', 1 ") and
Fraktionierstellen (18) zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen im Trennmedium (8) umfasst, wobei die Vorrichtung selektiv wählbare Ladungsträger (4,5) zum Kombinieren mit zu trennenden Teilchen (l',l") und zum Erzeugen von ladungsmodifizierten Teilchen (7', 7"), die - wegen ihrer selektiv veränderten Netto-Oberflächenladung - in der FFE ein anderes Migrationsverhalten aufweisen, als nicht-ladungsmodifizierte Teilchen (7), umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass es ein gegenüber dem Trennmedium (8) eine stark erhöhte elektrische Leitfähigkeit aufweisendes, elektrisch hoch-leitendes Kissenmedium (20) ist, welches über se- paraten Förderkanäle (15') zum Ausbilden zumindest eines elektrisch hoch-leitenden Führungs- oder Fokussierkissens (12,13) für die ladungsmodifizierten Teilchen (7', 7") zwischen den Elektroden (9,10) und dem Trennmedium (8) in den elektrodennahen Bereichen (19) des Trennmediums (8) einleitbar ist. Fractionation points (18) for removing particles separated by means of the FFE in the separation medium (8), wherein the device selectively selectable charge carriers (4,5) for combining with particles to be separated (l ', l ") and for generating charge-modified particles ( 7 ', 7 "), which - because of their selectively changed net surface charge - have a different migration behavior in the FFE than non-charge-modified particles (7), characterized in that it is strongly compared to the separation medium (8) is an electrically high-conductive cushion medium (20) which has increased electrical conductivity and which via separate delivery channels (15 ') for forming at least one electrically high-conductive guide or focusing cushion (12, 13) for the charge-modified particles (7', 7 ") between the electrodes (9, 10) and the separating medium (8) in the regions (19) of the separating medium (8) near the electrodes.
7. Trennmittel zum Trennen von Teilchen, insbesondere zum Auftrennen von Zellen, Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen bzw. von Teilen oder Komplexen derselben in einem Free-Flow-Elektrophorese-Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 17, in einer FFE-Vorrichtung, insbesondere nach einem der Ansprüche 18 bis 25, mit zumindest einem mit einem Trennmedium (8) durchfliessbaren Trennraum (14), der durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt ist, wobei diese FFE-Vorrichtung zudem eine Dosierpumpe zum Fördern des Trennmediums (8), welches über Medienzuführungen (15,15') in den Trennraum (14) gelangt und diesen über Auslässe (16) wieder verlässt, Elektroden (9,10) zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium (8) sowie Probeaufgabestellen (17) zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen (1,1', 1") und Fraktionierstellen (18) zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen im Trennmedium (8) umfasst, wobei die Vorrichtung selektiv wählbare Ladungsträger (4,5) zum Kombinieren mit zu trennenden Teilchen (l',l") und zum Erzeugen von ladungsmodifizierten Teilchen (7', 7"), die - wegen ihrer selektiv veränderten Netto-Oberflächenladung - in der FFE ein anderes Migrationsverhalten aufweisen, als nicht-ladungsmodifizierte Teilchen (7), sowie ein gegenüber dem Trennmedium (8) eine stark erhöhte elektrische Leitfähigkeit aufweisendes, elektrisch hoch-leitendes Kissenmedium (20) umfasst, wobei dieses Kissenmedium (20) über separaten Förderkanäle (15') zum Ausbilden zumindest eines elektrisch hoch-leitenden Führungs- oder Fokussierkissens (12,13) für die ladungsmodifizierten Teilchen (7 7") zwischen den Elektroden (9,10) und dem Trennmedium (8) in den elektrodennahen Bereichen (19) des Trennmediums (8) einleitbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass es ein geladenes Bindungsmolekül (6) ist, mit welchem die Netto-Oberflächenladung der Teilchen (1,1', 1") zum im Wesentlichen gleichzeitigen, selektiven Bewegen einer ersten Fraktion dieser Teilchen in Richtung zu der Kathode (9) hin bzw. einer zweiten Fraktion in Richtung zu der Anode (10) hin, veränderbar ist. 7. Separating agent for separating particles, in particular for separating cells, cell components, organelles or biomolecules or parts or complexes thereof in a free-flow electrophoresis method according to one of claims 1 to 17, in an FFE device, in particular according to one of claims 18 to 25, with at least one separation space (14) through which a separation medium (8) can flow, which is delimited by a base and a cover and by these two spacers which are spaced apart from one another, this FFE device also a metering pump for conveying the separation medium (8), which enters the separation space (14) via media feeds (15, 15 ') and leaves it again via outlets (16), electrodes (9, 10) for applying an electrical field in the separation medium ( 8) and sample feed points (17) for adding a mixture of particles (1,1 ', 1 ") to be separated and fractionation points (18) for removing TFE separated by means of the FFE violet in the separation medium (8), the device selectively selectable charge carriers (4,5) for combining with particles to be separated (1 ', 1 ") and for generating charge-modified particles (7', 7") which - because of their selectively changed net surface charge - in which the FFE have a different migration behavior than non-charge-modified particles (7), and an electrically highly conductive cushion medium (20) which has a greatly increased electrical conductivity compared to the separation medium (8), this Cushion medium (20) via separate delivery channels (15 ') for forming at least one electrically highly conductive guide or focusing cushion (12, 13) for the charge-modified particles (7 7 ") between the electrodes (9, 10) and the separation medium (8 ) can be introduced into the regions (19) of the separation medium (8) near the electrodes, characterized in that it is a charged binding molecule (6) with which the net surface charge of the particles (1, 1 ', 1 ") for essentially simultaneous, selective movement of a first fraction of these particles in the direction of the cathode (9) or a second fraction in the direction of the anode (10).
28. Trennmittel nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das geladene Bindungsmolekül (6) ein Bindungsmolekül (3) und einen Ladungsträger (4,5) mit einer stark positiven oder negativen Ladung umfasst.28. Release agent according to claim 27, characterized in that the charged binding molecule (6) comprises a binding molecule (3) and a charge carrier (4, 5) with a strongly positive or negative charge.
29. Trennmittel nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Ladungsträger (4,5) als Bead, Latex- oder Agarosepartikel, Molekül und dergleichen ausgebildet und an das Bindungsmolekül (3) gebunden ist.29. Release agent according to claim 28, characterized in that the charge carrier (4, 5) is designed as a bead, latex or agarose particle, molecule and the like and is bound to the binding molecule (3).
30. Trennmittel nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindungsmolekül (3) ein epitop-spezifischer Antikörper oder ein Ni- NTA-Molekül ist, welche auf den Teilchenoberflächen immobilisierbar sind.30. Release agent according to claim 28 or 29, characterized in that the binding molecule (3) is an epitope-specific antibody or a Ni-NTA molecule which can be immobilized on the particle surfaces.
31. Trennmittel nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeich- net, dass das geladene Bindungsmolekül (6) bzw. das Bindungsmolekül31. Release agent according to one of claims 27 to 30, characterized in that the charged binding molecule (6) or the binding molecule
(3) eine detektierbare Markierung, insbesondere einen Färb- oder Leuchtstoff, zur Detektion der aktuellen Position der ladungsmodifizierten Teilchen (7',7") im Trennmedium (8) umfasst.(3) comprises a detectable marking, in particular a dye or phosphor, for detecting the current position of the charge-modified particles (7 ', 7 ") in the separation medium (8).
32. Trennmittel nach einem der Ansprüche 27 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das geladene Bindungsmolekül (6) einen oder mehrere Ladungsträger (4,5) oder Polymere derselben umfasst, welche ausgewählt sind aus einer Gruppe umfassend : Lysin, Arginin, Histidin, Aspartat und Glutamat.32. Release agent according to one of claims 27 to 31, characterized in that the charged binding molecule (6) comprises one or more charge carriers (4,5) or polymers thereof, which are selected from a group comprising: lysine, arginine, histidine, aspartate and glutamate.
33. Trennmittel nach einem der Ansprüche 28 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass der Ladungsträger (4,5) kovalent an das Bindungsmolekül (3) gebunden ist.33. Release agent according to one of claims 28 to 32, characterized in that the charge carrier (4,5) is covalently bound to the binding molecule (3).
34. Trennmittel nach einem oder mehreren der Ansprüche 28 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindungsmolekül (3) ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend: Neutravidin-, Streptavidin/Biotin- und sekundäre Antikörper-Systeme sowie Chelatbildner. 34. Release agent according to one or more of claims 28 to 33, characterized in that the binding molecule (3) is selected from a group comprising: neutravidin, streptavidin / biotin and secondary antibody systems and chelating agents.
PCT/CH2003/000035 2002-01-21 2003-01-20 Method, device for carrying out this method, and separating means for separating particles in free-flow electrophoresis WO2003060504A1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20030729400 EP1468279A1 (en) 2002-01-21 2003-01-20 Method, device for carrying out this method, and separating means for separating particles in free-flow electrophoresis
AU2003201253A AU2003201253A1 (en) 2002-01-21 2003-01-20 Method, device for carrying out this method, and separating means for separating particles in free-flow electrophoresis

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH872002 2002-01-21
CH87/02 2002-01-21
US35231302P 2002-01-28 2002-01-28
US60/352,313 2002-01-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003060504A1 true WO2003060504A1 (en) 2003-07-24

Family

ID=25703688

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CH2003/000035 WO2003060504A1 (en) 2002-01-21 2003-01-20 Method, device for carrying out this method, and separating means for separating particles in free-flow electrophoresis

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1468279A1 (en)
AU (1) AU2003201253A1 (en)
WO (1) WO2003060504A1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006118996A3 (en) * 2005-04-29 2007-04-05 Becton Dickinson Co Method for electrophoresis involving parallel and simultaneous separation
WO2007147862A1 (en) * 2006-06-20 2007-12-27 Becton, Dickinson & Company Method and device for separation and depletion of certain proteins and particles using electrophoresis

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0103965A2 (en) * 1982-08-20 1984-03-28 Imperial Chemical Industries Plc Electrofocusing apparatus
US4465582A (en) * 1982-05-24 1984-08-14 Mcdonnell Douglas Corporation Continuous flow electrophoresis apparatus
DE4139472C1 (en) * 1991-11-29 1993-03-11 Gerhard Dr. 8011 Kirchheim De Weber
US5284558A (en) * 1990-07-27 1994-02-08 University Of Iowa Research Foundation Electrophoresis-based sequencing of oligosaccharides
US5948231A (en) * 1995-04-20 1999-09-07 Perseptive Biosystems, Inc. Compositions, methods and apparatus for ultrafast electroseparation analysis
US20010015320A1 (en) * 1997-06-24 2001-08-23 Large Scale Biology Corporation Automated system for two-dimensional electrophoresis
US20010027918A1 (en) * 2000-01-14 2001-10-11 J. Wallace Parce Method for monitoring flow rate using fluorescent markers
WO2001077655A1 (en) * 2000-04-10 2001-10-18 Invitrogen Corporation Methods, articles and kits for labeling polymer gels

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4465582A (en) * 1982-05-24 1984-08-14 Mcdonnell Douglas Corporation Continuous flow electrophoresis apparatus
EP0103965A2 (en) * 1982-08-20 1984-03-28 Imperial Chemical Industries Plc Electrofocusing apparatus
US5284558A (en) * 1990-07-27 1994-02-08 University Of Iowa Research Foundation Electrophoresis-based sequencing of oligosaccharides
DE4139472C1 (en) * 1991-11-29 1993-03-11 Gerhard Dr. 8011 Kirchheim De Weber
US5948231A (en) * 1995-04-20 1999-09-07 Perseptive Biosystems, Inc. Compositions, methods and apparatus for ultrafast electroseparation analysis
US20010015320A1 (en) * 1997-06-24 2001-08-23 Large Scale Biology Corporation Automated system for two-dimensional electrophoresis
US20010027918A1 (en) * 2000-01-14 2001-10-11 J. Wallace Parce Method for monitoring flow rate using fluorescent markers
WO2001077655A1 (en) * 2000-04-10 2001-10-18 Invitrogen Corporation Methods, articles and kits for labeling polymer gels

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1468279A1 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006118996A3 (en) * 2005-04-29 2007-04-05 Becton Dickinson Co Method for electrophoresis involving parallel and simultaneous separation
CN101184991B (en) * 2005-04-29 2011-12-21 贝克顿·迪金森公司 Method for electrophoresis involving parallel and simultaneous separation
WO2007147862A1 (en) * 2006-06-20 2007-12-27 Becton, Dickinson & Company Method and device for separation and depletion of certain proteins and particles using electrophoresis
JP2009541726A (en) * 2006-06-20 2009-11-26 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー Method and apparatus for separating and depleting certain proteins and particles using electrophoresis
AU2007263005B2 (en) * 2006-06-20 2013-07-25 Becton, Dickinson And Company Method and device for separation and depletion of certain proteins and particles using electrophoresis
CN101512334B (en) * 2006-06-20 2013-08-07 贝克顿迪肯森公司 Method and device for separation and depletion of certain proteins and particles using electrophoresis

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003201253A1 (en) 2003-07-30
EP1468279A1 (en) 2004-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60112276T2 (en) ELECTROPHORETIC SEPARATION OF COMPOUNDS
DE69927359T2 (en) CONTINUOUS MAGNETIC SEPARATION OF COMPONENTS FROM A MIXTURE
DE69636653T2 (en) Method and apparatus for rapid electroseparation analysis
EP1287348B1 (en) Method and device for the qualitative and/or quantitative analysis of a protein and/or peptide pattern of a liquid sample that is derived from the human or animal body
US7169275B2 (en) Method for separating particles in free flow electrophoresis
DE202012013668U1 (en) enzyme quantification
Ma et al. Indirect photometric detection of polyamines in biological samples separated by high-performance capillary electrophoresis
JPS63263457A (en) Isoelectric-point electrophoretic method and device therefor
US7169278B2 (en) Apparatus and separation media for separating particles in free-flow electrophoresis
WO2002040983A1 (en) Method for separating and detecting proteins by means of electrophoresis
DE69723460T2 (en) METHOD AND DEVICE FOR SEPARATING PARTICLES OR MOLECULES BY MIGRATION OVER A FERROFLUID
DE3856583T2 (en) Automatic capillary electrophoresis device
JPH02107960A (en) Method and device for separating, purifying and concentrating charge or polarizable giant molecule by electrophoresis
DE3444939A1 (en) MAGNETIC MICROSPHERES
EP1155315A1 (en) Utilization of supporting material in capillary electrochromatography
DE102005013608A1 (en) Apparatus and method for cell-free analytical and preparative protein synthesis
DE60115103T2 (en) BIOMOLECULTURALYSIS ON ARRAY BASIS
WO2003060504A1 (en) Method, device for carrying out this method, and separating means for separating particles in free-flow electrophoresis
WO2003060503A1 (en) Device, use of said device, and separation agent for separating particles by means of free flow electrophoresis
WO1995035492A2 (en) Process and device for selectively extracting components from complex mixtures
DE212005000044U1 (en) Electrophoretic separation in a moving fluid
EP1102983A1 (en) Method and device for separating biomolecules
DE10321809A1 (en) Process for printing biomolecules
DE2736527A1 (en) METHOD AND DEVICE FOR DETECTION OF A SPECIFIC BINDING PROTEIN OR A SUBSTANCE THAT CAN BE BINDED WITH IT
EP3566045B1 (en) Method for two-dimensional protein separation and protein-separating device

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003729400

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003729400

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2003729400

Country of ref document: EP