WO2003046213A2 - Verfahren zur anreicherung und zum nachweis von hiv - Google Patents

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WO2003046213A2
WO2003046213A2 PCT/EP2002/011931 EP0211931W WO03046213A2 WO 2003046213 A2 WO2003046213 A2 WO 2003046213A2 EP 0211931 W EP0211931 W EP 0211931W WO 03046213 A2 WO03046213 A2 WO 03046213A2
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WO
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solid phase
sample
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viruses
nucleic acids
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Uwe Michelsen
Achim SCHWÄMMLE
Willi Roth
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Merck Patent Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the invention relates to a method and a test kit for the enrichment and detection of lentiviruses in complex biological samples such as e.g. Body fluids.
  • the viruses are bound to solid phases and isolated under suitable conditions. The viruses can then be lysed and detected.
  • Viruses in body fluids can be detected by highly sensitive detection based on the viral nucleic acids or alternatively with the help of specific antibodies.
  • detection of viral nucleic acids e.g. known nucleic acid amplification techniques, e.g. Polymerase chain reaction (PCR), branched-DNA detection (bDNA) or nucleic acid sequence based amplification (NASBA) are used.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • bDNA branched-DNA detection
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • a prerequisite for successful and sensitive detection of viral particles in body fluids using the nucleic acid amplification techniques mentioned is the efficient, quantitative isolation of the viral nucleic acids (DNA or RNA) in as pure and native a form as possible.
  • No. 5,234,809 describes a method in which the nucleic acids are bound to a silica solid phase in the presence of chaotropic agents such as guanidinium salts.
  • WO 91/12079 describes a method for precipitating long-chain nucleic acids onto the surface of solid phases. Here alcohols and salts are used as precipitation reagents.
  • the detection limit of the commercially available test systems is around 100 to 400 RNA copies per ml of plasma. Most commercial test systems are only for one virus type and are designed for the use of relatively small volumes (100-200 ⁇ l plasma).
  • the human immunodeficiency virus HIV
  • the method should be highly sensitive, if possible record all viral DNA or RNA molecules present in a sample and make it possible to use a large sample volume as the starting material for the detection reaction.
  • HIV viruses from complex biological samples despite the disruptive influence of other substances contained in these samples, such as proteins, lipids, carbohydrates, under certain conditions, ie at a certain pH value and addition a certain amount of binding buffer, can be bound to a solid phase and can thus be separated from the rest of the sample.
  • the isolated viruses can then be lysed and the nucleic acids released can be purified and detected under suitable conditions.
  • the present invention makes it possible to isolate a small number of viruses from a large volume of a complex sample and to detect them in a suitable manner with relatively simple and inexpensive manipulations.
  • the nucleic acid can be extracted in a native, highly pure state for the detection reaction by means of PCR, NASBA and other methods.
  • the present invention therefore relates to a method for the detection of lentiviruses in complex biological samples, characterized by the following steps a) acidifying the sample with a virus binding buffer, the pH being adjusted to a value of less than or equal to 4 and the sample with the virus binding buffer is mixed in a volume ratio (sample: binding buffer) between 1: 0.3 and 1: 2, adding a solid phase and incubating the mixture; b) separation of the solid phase with the bound viruses c) detection of the viruses.
  • a pH of between 1 and 3 is set in step a) with the virus binding buffer, i.e. the sample is acidified to a pH between 1 and 3 with the binding buffer.
  • step a) the sample is mixed with the virus binding buffer in a volume ratio of sample to binding buffer of 1: 0.5 to 1: 1.5.
  • aqueous hydrochloric acid is used as the virus binding buffer in step a).
  • the incubation time in step a) is 1 to 5 minutes.
  • magnetic silica particles are used as the solid phase in step a).
  • the solid phase with the bound virus particles is separated off by centrifuging, filtering or applying a magnetic field.
  • the viral is isolated
  • step c2 Nucleic acids in step c2) by binding to a solid phase.
  • the viral nucleic acids are isolated in step c2) by binding to the same type of solid phase as was used in step a).
  • the viral nucleic acids are detected in step c3) by nucleic acid amplification techniques.
  • the present invention also relates to a test kit for carrying out the method according to the invention at least comprising a solid phase and a virus binding buffer.
  • viruses includes all lentiviruses, including defective or incomplete viruses.
  • Lentiviruses are a subfamily of retroviruses. The main representatives are the SIV and HIV viruses that cause immunodeficiency.
  • the method according to the invention is particularly suitable for isolating or detecting HIV.
  • Complex biological samples in the sense of the present invention are all samples of biological origin, in particular human and animal body fluids such as blood, plasma, serum, urine, feces and cerebrospinal fluid.
  • the present invention is particularly suitable for the detection of lentiviruses, in particular HIV, in blood, plasma or serum or for the purification of nucleic acids of the lentiviruses from blood, plasma or serum.
  • a material which carries metal hydroxide groups on the surface can be used as the solid phase.
  • Suitable materials are, for example, silica gel, silicates, metal oxides such as iron hydroxides, hydroxyapatite or glass.
  • Such solid phases can, for example, be porous or non-porous, in the form of, for example, particles, fibers, membranes, filters or simply appropriately modified vessel walls. Particulate materials are generally preferred because they have a greater binding capacity and kinetics, especially in larger sample volumes. Magnetizable particles are particularly preferred because their separation from a suspension is easy to automate.
  • particularly suitable solid phase are MagPrep ® silica particles (Merck KGaA, Darmstadt).
  • the method according to the invention for isolating viral nucleic acids from complex biological samples comprises the following steps:
  • the biological sample is brought to a pH less than or equal to 4 by adding a virus binding buffer, mixed with the solid phase and incubated for a short time.
  • the sample is preferably brought to a pH between 1 and 3.
  • any aqueous buffer which does not undesirably change the sample or which interferes with the binding of the virus particles is suitable as the virus binding buffer.
  • the virus binding buffer for example, citrate or acetic acid buffers or a dilute acid such as 0.1 to 0.3 molar hydrochloric acid are suitable. Dilute hydrochloric acid is particularly preferably used as the virus binding buffer.
  • the mixing ratio between sample and virus binding buffer should be between 1: 0.25 and 1: 3, preferably between 1: 0.3 and 1: 2, particularly preferably between 1: 0.5 and 1: 1.5. Particularly good results can be achieved with a mixing ratio of 1: 1.
  • the suitable pH value and the suitable mixing ratio between the sample and the binding buffer is an optimal binding of the viruses to the solid phase achieved. This is illustrated by Examples 2 and 3.
  • the optimal extraction conditions can easily be within the specified range vary.
  • the viruses are then bound to the solid phase, surprisingly, very selectively and effectively, despite the proteins, in particular glycoproteins, and other biological materials contained in the sample.
  • the solid phase can be added to the sample before or preferably after the addition of the virus binding buffer or at the same time as the binding buffer.
  • the mixture or suspension of solid phase, sample and virus binding buffer is then incubated for a short time. Usually 10 minutes, preferably 1 to 5 minutes are sufficient.
  • the solid phase with the viruses bound to it is separated from the mixture. This can e.g. Depending on the properties of the solid phase, centrifugation, filtration, application of a magnetic field or other physical methods are used. Magnetic particles are preferably used according to the invention, which are separated with the aid of a magnetic field.
  • the viruses are then detected. This can be done by various methods, for example by means of immunological detection methods or by detection of the viral nucleic acids.
  • the solid phase A irus complex can either be directly mixed with a lysis buffer A which contains substances which allow the release of the viral nucleic acids and, if necessary, their subsequent purification, or the complex can be taken up in a suitable buffer which for example, immunological detection reactions allowed.
  • the solid phase / irus complex can also first be washed as an intermediate step with a suitable buffer.
  • the lysis of the viruses bound to the separated solid phase and the subsequent purification of the viral nucleic acids can be carried out according to known methods. Suitable methods are described, for example, in US Pat. No. 5,234,809 (binding of the nucleic acids to silica solid phases under chaotropic conditions) or WO 99/40098 (binding of the nucleic acids to solid phases under acidic conditions).
  • a suitable resuspension buffer can be pure water or consist of an aqueous buffer solution familiar to the person skilled in the art, e.g. Tris-HCI.
  • the resuspension buffer can contain reagents that remove or inactivate interfering substances.
  • a virus-lysing and free nucleic acid-binding buffer is preferably added, which contains a chaotropic salt such as e.g. Contains guanidinium thiocyanate in high molar concentration (> 2M) and a non-ionic detergent.
  • the binding buffer can also contain alcohol. The suspension of binding buffer and particles is mixed well and briefly incubated. Usually 1 to 5 minutes are sufficient.
  • the solid phase is removed from the mixture by suitable means and the supernatant is discarded.
  • the solid phase is washed (for example with 70% ethanol) and the nucleic acids are released with an elution buffer (for example with Tris-HCl pH 8.0).
  • the released viral nucleic acids can then be fed directly, without further purification steps, for example to the known nucleic acid amplification techniques, such as polymerase chain reaction (PCR), branched DNA detection (bDNA) or nucleic acid sequence based amplification (NASBA).
  • PCR polymerase chain reaction
  • bDNA branched DNA detection
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • the method according to the invention opens up the possibility of isolating viruses from complex biological samples quickly and quantitatively using very simple techniques.
  • the detection of lentiviruses, in particular HIV, in complex biological materials is greatly simplified and the sensitivity to detection is increased, particularly when enriched from large-volume samples.
  • the five-fold diluted sample has the same signal strength as the undiluted sample of direct extraction.
  • the viral nucleic acids can therefore be isolated quantitatively and representatively and used directly for detection in suitable methods.
  • the method according to the invention is very sensitive and can also be used by blood banks which form mini pools from several donor samples to detect viruses.
  • the present invention furthermore relates to a test kit for carrying out the method according to the invention.
  • the test kit contains at least one solid phase, preferably a silica solid phase, and a virus binding buffer.
  • HIV positive plasma EDTA or citrate plasma
  • the silica particles are separated magnetically and the supernatant is discarded.
  • the adsorbed viruses can subsequently be lysed and viral RNA can be extracted in a suitable manner by, for example, the following various methods.
  • A) The silica particles are resuspended in 400 ⁇ l binding buffer X (5M guanidinium thiocyanate, 1% Triton X 100) and then 400 ⁇ l ethanol is added. Binding buffer X also contains silica particles and an internal control RNA. After 10 minutes of incubation and subsequent magnetization, the supernatant is separated off and the
  • Silica particles washed twice with 70% ethanol.
  • the viral RNA is eluted from the particles after incubation in 10 mM Tris / HCl pH 8.5 at 80 ° C. after 10 minutes.
  • binding buffer Y (10OmM acetate-Tris pH 4.0, 0.5% NP40, 200mM ammonium sulfate). Binding buffer Y also contains silica particles and an internal control RNA. After 10 minutes of incubation and subsequent magnetization, the supernatant is separated off and the particles are washed twice with washing buffer (10 mM Tris-HCl pH 5 6.6; 0.5 mg / ml proteinase K). The viral RNA is eluted from the particles after incubation in 10 mM Tris / HCl pH 8.5 at 80 ° C. after 10 minutes.
  • RNA of the eluates obtained by means of variant A) or B) is amplified and detected by RT PCR and suitable gene probes (for example using a thermal cycler such as TaqMan ® from Perkin Eimer or LightCycler ® from Röche).
  • the silica particles are separated off as described in Example 1, the liquid supernatants are discarded, and the RNA is extracted.
  • the result of this example is shown in Fig.1.
  • the y-axis shows the percentage of viruses detected, the amplification signal achieved being set to 100% for a direct RNA extraction (without upstream enrichment of the virus particles) from the HIV-positive plasma sample (100 ⁇ l, 200 copies).
  • Proportion of the detected viruses, the amplification signal achieved being set to 100% for a direct RNA extraction (without upstream enrichment of the virus particles) from the HIV-positive plasma sample (100 ⁇ l, 200 copies).
  • N denotes an undiluted sample on the x-axis.
  • RNA is extracted.
  • the result is shown in Fig. 3.
  • the y-axis shows the percentage of viruses detected, the amplification signal achieved being set to 100% for a direct RNA extraction (without upstream enrichment of the virus particles) from the HIV-positive plasma sample (100 ⁇ l, 200 copies).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Test-Kit zur Anreicherung und zum Nachweis von Lentiviren, insbesondere HIV (Humanen Immundefizienz Viren), in komplexen biologischen Proben wie z.B. Körperflüssigkeiten. Die Viren werden unter geeigneten Bedingungen an eine Festphase gebunden, isoliert, lysiert und anschliessend die viralen Nukleinsäuren abgetrennt und gegebenenfalls nachgewiesen.

Description

Verfahren zur Anreicherung und zum Nachweis von HIV
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Test-Kit zur Anreicherung und zum Nachweis von Lentiviren in komplexen biologischen Proben wie z.B. Körperflüssigkeiten. Die Viren werden unter geeigneten Bedingungen an Festphasen gebunden und isoliert. Anschließend können die Viren lysiert und nachgewiesen werden.
Der Nachweis von Viren in Körperflüssigkeiten kann durch einen hochsensitiven Nachweis auf Basis der viralen Nukleinsäuren erfolgen oder alternativ mit Hilfe von spezifischen Antikörpern. Für den Nachweis der viralen Nukleinsäuren werden z.B. bekannte Nukleinsäureamplifikations- techniken, wie z.B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR), branched-DNA Detection (bDNA) oder Nucleic Acid Sequence based Amplification (NASBA) verwendet.
Voraussetzung für einen erfolgreichen und sensitiven Nachweis viraler Partikel in Körperflüssigkeiten über die genannten Nukleinsäure- amplifikationstechniken ist die effiziente, quantitative Isolierung der viralen Nukleinsäuren (DNA oder RNA) in möglichst reiner und nativer Form.
Während es für die Isolierung von Viren und den nachfolgenden Nachweis von viraler RNA/DNA aus Wasser verschiedene effektive Methoden gibt (z.B. Pallin et al.; Journal of Virological Methods 67 (1997) 57-67 oder Leisinger et al.; Zentralblatt für Hygiene und Umweltmedizin 200 (1997), 283-296), ist die Isolierung von viralen Nukleinsäuren aus komplexen biologischen Ausgangsmaterialien wie Blut oder Plasma mit hohem Anteil an Proteinen, Lipiden und anderen niedermolekularen Substanzen bislang sehr aufwendig und wenig effektiv.
Klassische Methoden für die Isolierung von Nukleinsäuren aus komplexen Proben starten direkt mit der Lyse des biologischen Materials mittels eines Detergenz und/oder eines chaotropen Salzes. Diese Substanzen ermöglichen die Inaktivierung und Denaturierung von Proteinen und Enzymen. Nachfolgend werden mittels organischer Lösungsmittel z.B. Phenol und/oder Chloroform, Ethanolfällung und Zentrifugationsschritten die Nukleinsäuren gereinigt . Diese Methoden sind nicht nur sehr arbeitsintensiv und zeitaufwendig, sondern auch schwer zu automatisieren.
Kürzlich wurden andere Methoden vorgeschlagen, die auf dem Gebrauch von Festphasen basieren. In US 5, 234,809 wird eine Methode beschrieben, bei der die Nukleinsäuren in Gegenwart von chaotropen Agentien wie Guanidiniumsalzen an eine Silica Festphase gebunden werden. WO 91/12079 beschreibt eine Methode zur Fällung von langkettigen Nukleinsäuren auf die Oberfläche von Festphasen. Hierbei werden Alkohole und Salze als Fällungsreagenzien genutzt.
Während Festphasenextraktionsmethoden wie die Beschriebenen, die Einfachheit und die Automatisierbarkeit des Nukleinsäure- separationsprozesses erhöhen, besteht nachwievor der Bedarf, die Viren selbst schnell und einfach, aber auch möglichst quantitativ aus einer Probe zu isolieren. Insbesondere dann, wenn die Probe biologischen Ursprungs ist und nur sehr wenige der nachzuweisenden Viren bzw. entsprechend auch sehr wenige der nachzuweisenden Nukleinsäuren enthält, wie es für manche Viruserkrankungen der Fall ist.
Für alle Isolierungs- und Nachweismethoden, die aus Körperflüssigkeiten virale Nukleinsäuren isolieren wollen, ist es wesentlich, alle Viruspartikel einer Probe zu erfassen, um eine hohe Sensitivität zu erlangen. Gegenwärtig werden hierzu Zellen oder Viren aus eine Probe über Filtration, Ultrahochzentrifugation oder über Affinitätsbindung an Antikörper, die an einer Festphase gebunden sind, angereichert. Nach diesem Konzentrierungsschritt wird die DNA oder RNA aufgereinigt. Die bisher bekannten Konzentrierungsverfahren sind sehr arbeitsaufwendig und/oder sie benutzen sehr kostspielige und empfindliche Festphasen, wie z.B. Antikörper-Beads.
Die Nachweisgrenze der kommerziell erhältlichen Testsysteme liegt bei etwa 100 bis 400 RNA-Kopien pro ml Plasma. Die meisten kommerziellen Testsyteme sind nur für einen Virustyp und auf den Einsatz von relativ kleinen Volumina ausgerichtet (100-200 μl Plasma).
In diesem Zusammenhang stellt die Nachweisgrenze der bekannten Tests insbesondere für zwei wichtige Anwendungsfelder ein Problem dar: 1.) Blutbanken, die durch die hohen Probenaufkommen und Kostendruck bedingt, sogenannte Mini-Pools bilden (aus bis zu 100 Spenderproben) müssen die potenziell aus einem einzelnen Serum herrührenden Viren im Pool erfassen.
2.) Die Therapie von AIDS-Kranken erfordert das hochsensitive Monitoring der Viruskonzentration im Blut, da dieses Virus in sehr geringer Kopienzahl trotz Therapie persistieren kann und deren Nachweis für die Therapiefortsetzung entscheidend ist.
Demnach besteht insbesondere für den Nachweis des AIDS-Erregers, des Humanimmundefizienz-Virus (HIV), der Bedarf an verbesserten Verfahren zur Detektion dieser Viren in komplexen biologischen Materialien. Das Verfahren sollte hochempfindlich sein, möglichst alle in einer Probe vorhandenen viralen DNA- oder RNA Moleküle erfassen und es ermöglichen, ein grosses Probenvolumen als Ausgangsmaterial für die Nachweisreaktion einzusetzen.
Es wurde nun gefunden, dass HIV-Viren aus komplexen biologischen Proben trotz des störenden Einflusses anderer in diesen Proben enthaltener Stoffe wie z.B. Proteine, Lipide, Kohlenhydrate unter bestimmten Bedingungen, d.h. bei einem bestimmten pH-Wert und Zusatz einer bestimmten Menge an Bindepuffer, an eine Festphase gebunden werden können und auf diese Weise von der restlichen Probe abgetrennt werden können. Die isolierten Viren können hernach lysiert werden und die freiwerdenden Nukleinsäuren unter geeigneten Bedingungen aufgereinigt und nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, mit relativ einfachen und kostengünstigen Handhabungen eine geringe Anzahl von Viren aus einem grossen Volumen einer komplexen Probe zu isolieren und in geeigneter Weise nachzuweisen. So kann beispielsweise nach Lyse der Virushülle die Nukleinsäure in einem nativen hochreinen Zustand für die Nachweisreaktion mittels PCR, NASBA und anderen Verfahren extrahiert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis von Lentiviren in komplexen biologischen Proben, gekennzeichnet durch folgende Schritte a) Ansäuern der Probe mit einem Virus-Bindepuffer, wobei der pH-Wert auf einen Wert von kleiner gleich 4 eingestellt wird und die Probe mit dem Virus-Bindepuffer in einem Volumenverhältnis (Probe: Bindepuffer) zwischen 1:0,3 und 1:2 gemischt wird, Zugabe einer Festphase und Inkubation der Mischung; b) Abtrennen der Festphase mit den gebundenen Viren c) Nachweis der Viren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt a) mit dem Virus- Bindepuffer ein pH-Wert zwischen 1 und 3 eingestellt, d.h. die Probe wird mit dem Bindepuffer auf einen pH-Wert zwischen 1 und 3 angesäuert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt a) die Probe mit dem Virus-Bindepuffer in einem Volumenverhältnis von Probe zu Bindepuffer von 1 :0,5 bis 1:1,5 gemischt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird als Virus- Bindepuffer in Schritt a) wässrige Salzsäure verwendet.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform beträgt die Inkubationszeit in Schritt a) 1 bis 5 Minuten.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden in Schritt a) als Festphase magnetische Silica-Partikel eingesetzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Abtrennung der Festphase mit den gebundenen Virus-Partikeln durch Zentrifugieren, Filtern oder Anlegen eines magnetischen Feldes.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt in Schritt c) der Nachweis der
Viren durch d ) Lyse der Viren; c2) Isolierung der viralen Nukleinsäuren aus dem Lysat; c3) Nachweis der viralen Nukleinsäuren;
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Isolierung der viralen
Nukleinsäuren in Schritt c2) durch Bindung an eine Festphase.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Isolierung der viralen Nukleinsäuren in Schritt c2) durch Bindung an die gleiche Art von Festphase, wie sie auch in Schritt a) eingesetzt wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis der viralen Nukleinsäuren in Schritt c3) durch Nukleinsäureamplifikationstechniken. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Test-Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zumindest enthaltend eine Festphase und einen Virus-Bindepuffer.
Nähere Erläuterungen zu den Abbildungen 1 bis 3 finden sich in den
Beispielen 2 bis 4.
Der Begriff Viren umfaßt erfindungsgemäß alle Lentiviren, auch defekte oder unvollständige Viren. Lentiviren sind eine Subfamilie der Retroviren. Die wichtigsten Vertreter sind die Immundefiziens verursachenden Viren SIV und HIV.
Besonders geeignet ist das erfindungsgemässe Verfahren zur Isolierung bzw. zum Nachweis von HIV.
Komplexe biologische Proben im Sinne der vorliegenden Erfindung sind alle Proben biologischen Ursprungs, insbesondere humane und tierische Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Urin, Feces und cerebrospinale Flüssigkeit. Besonders geeignet ist die vorliegende Erfindung zum Nachweis von Lentiviren, insbesondere HIV, in Blut, Plasma oder Serum bzw. zur Aufreinigung von Nukleinsäuren der Lentiviren aus Blut, Plasma oder Serum.
Als Festphase kann erfindungsgemäß ein Material verwendet werden, das an der Oberfläche metallhydroxidische Gruppen trägt. Geeignete Materialien sind z.B. Silikagel, Silikate, Metalloxide wie Eisenhydroxide , Hydroxylapatit oder Glas. Solche Festphasen können z.B. porös oder unporös sein, in Form von z.B. Partikeln, Fasern, Membranen, Filtern oder einfach entsprechend modifizierte Gefässwände. Partikuläre Materialien werden im allgemeinen bevorzugt, da sie eine grössere Bindungskapazität und -kinetik insbesondere in grösseren Probenvolumina aufweisen. Besonders bevorzugt werden magnetisierbare Partikel, da deren Abtrennung aus einer Suspension einfach zu automatisieren ist. Eine erfindungsgemäß besonders gut geeignete Festphase sind MagPrep® Silica Partikel (Merck KGaA, Darmstadt).
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von viralen Nukleinsäuren aus komplexen biologischen Proben umfaßt die folgenden Schritte: a)
Die biologische Probe wird durch Zugabe eines Viren-Bindepuffers auf einen pH kleiner oder gleich 4 gebracht, mit der Festphase versetzt und für kurze Zeit inkubiert Bevorzugt wird die Probe auf einen pH-Wert zwischen 1 und 3 gebracht.
Als Viren-Bindepuffer ist jeder wässrige Puffer geeignet, der die Probe nicht unerwünscht verändert oder die Bindung der Viren-Partikel stört. Geeignet sind beispielsweise Citrat- oder Essigsäure- Puffer oder eine verdünnte Säure wie 0,1 bis 0,3 molare Salzsäure. Besonders bevorzugt wird als Viren-Bindepuffer verdünnte Salzsäure verwendet.
Das Mischungsverhältnis zwischen Probe und Viren-Bindepuffer sollte zwischen 1 : 0,25 und 1 :3, bevorzugt zwischen 1 : 0,3 und 1 : 2, besonders bevorzugt zwischen 1 : 0,5 und 1 : 1 ,5 liegen. Besonders gute Ergebnisse lassen sich mit einem Mischungsverhältnis von 1:1 erzielen.
Die Menge der zugesetzten Festphase beträgt bei partikulären Materialien, wie z.B. MagPrep® Silica Partikeln, typischerweise 5 bis 100 μl Partikelsuspension (MagPrep® Silica Partikel: c= 50 mg/ml) pro ml Probe.
Es wurde gefunden, dass erst durch die Auswahl des geeigneten pH- Wertes und des geeigneten Mischungsverhältnisses zwischen Probe und Bindepuffer eine optimale Bindung der Viren an die Festphase erreicht wird. Dies wird durch die Beispiele 2 und 3 verdeutlicht. In Abhängigkeit von der Art der Probe, des Bindepuffers oder der Festphase können die optimalen Extraktionsbedingungen im angegebenen Rahmen leicht variieren. Die Bindung der Viren an die Festphase erfolgt dann überraschenderweise trotz der in der Probe enthaltenen Proteine, insbesondere Glykoproteine, und anderen biologischen Materialien sehr selektiv und effektiv.
Die Festphase kann vor oder bevorzugt nach Zugabe des Viren- Bindepuffers oder zur gleichen Zeit wie der Bindepuffer zu der Probe zugegeben werden. Die Mischung bzw. Suspension aus Festphase, Probe und Viren-Bindepuffer wird dann kurze Zeit inkubiert. Zumeist sind 10 Minuten, bevorzugt 1 bis 5 Minuten ausreichend.
b)
Nach der Inkubation wird die Festphase mit den daran gebundenen Viren von der Mischung abgetrennt. Dies kann z.B. je nach Eigenschaft der Festphase durch Zentrifugation, Filtration, Anlegen eines magnetischen Feldes oder sonstige physikalische Methoden erfolgen. Bevorzugt werden erfindungsgemäß magnetische Partikel verwendet, die mit Hilfe eines Magnetfeldes abgetrennt werden.
c)
Anschließend erfolgt der Nachweis der Viren. Dies kann nach verschiedenen Methoden erfolgen, z.B. mittels immunologischer Nachweismethoden oder durch Nachweis der viralen Nukleinsäuren. Je nach beabsichtigter Nachweismethode kann der FestphaseA irus- Komplex entweder direkt mit einem Lyse-Puffer A versetzt werden, der Substanzen enthält, die die Freisetzung der viralen Nukleinsäuren und wenn nötig deren nachfolgenden Aufreinigung erlauben oder der Komplex kann in einem geeigneten Puffer aufgenommen werden, der beispielsweise immunologische Nachweisreaktionen erlaubt. Der FestphaseΛ/irus-Komplex kann auch zunächst als Zwischenschritt mit einem geeigneten Puffer gewaschen werden. Die Lyse der an die abgetrennte Festphase gebundenen Viren und die nachfolgende Aufreinigung der viralen Nukleinsäuren kann nach bekannten Methoden durchgeführt werden. Geeignete Methoden sind z.B. in US 5,234,809 (Bindung der Nukleinsäuren an Silica-Festphasen unter chaotropen Bedingungen) oder WO 99/40098 (Bindung der Nukleinsäuren an Festphasen unter sauren Bedingungen) beschrieben.
Im folgenden wird beispielhaft eine mögliche Verfahrensweise zur Lyse der Viren und Aufreinigung der viralen Nukleinsäuren beschrieben:
Die abgetrennte Festphase mit den daran gebundenen Viren kann entweder direkt der Nukleinsäureisolierung zugeführt werden oder kann als Zwischenschritt in einem Resuspensionspuffer aufgenommen werden. Ein geeigneter Resuspensionspuffer kann im einfachsten Falle reines Wasser sein oder aus einer dem Fachmann geläufigen wässrigen Pufferlösungen bestehen wie z.B. Tris-HCI. Der Resuspensionspuffer kann Reagenzien enthalten, die störende Substanzen entfernen oder inaktivieren.
Anschließend wird vorzugsweise ein die Viren lysierender und die freie Nukleinsäure bindender Puffer zugegeben, der ein chaotropes Salz wie z.B. Guanidiniumthiocyanat in hochmolarer Konzentration (>2M) enthält und ein nichtionisches Detergenz. Der Bindepuffer kann zudem Alkohol enthalten. Die Suspension aus Bindepuffer und Partikeln wird gut durchmischt und kurz inkubiert. Zumeist sind 1 bis 5 Minuten ausreichend. Zur Isolierung und Aufreinigung der viralen Nukleinsäuren aus dem
Gemisch wird die Festphase mit geeigneten Mitteln aus dem Gemisch entfernt und der Überstand verworfen.
Die Festphase wird gewaschen (z.B. mit 70%igen Ethanol) und die Nukleinsäuren mit einem Elutionspuffer (z.B. mit Tris-HCI pH 8,0) freigesetzt. Die freigesetzten viralen Nukleinsäuren können dann direkt, ohne weitere Reinigungsschritte z.B. den bekannten Nukleinsäureamplifikations- techniken, wie z.B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR), branched-DNA Detection (bDNA) oder Nucleic Acid Sequence based Amplification (NASBA) zugeführt werden.
Somit eröffnet das erfindungsgemäße Verfahren erstmals die Möglichkeit, Viren aus komplexen biologischen Proben mit Hilfe sehr einfacher Techniken schnell und quantitativ zu isolieren. Auf diese Weise wird der Nachweis von Lentiviren, insbesondere HIV, in komplexen biologischen Materialien stark vereinfacht und die Nachweisempfindlichkeit insbesondere bei Anreicherung aus grossvolumigen Proben erhöht. Wie in Abbildung 4 dargestellt, weist die fünffach verdünnte Probe die gleiche Signalstärke auf wie die unverdünnte Probe der direkten Extraktion. Die viralen Nukleinsäuren können demzufolge quantitativ und repräsentativ isoliert werden und direkt zum Nachweis in geeigneten Verfahren eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr empfindlich und kann auch von Blutbanken, die aus mehreren Spenderproben Mini-Pools bilden, zum Nachweis von Viren eingesetzt werden kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Test-Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Der Test-Kit enthält zumindest eine Festphase, bevorzugt eine Silica-Festphase, und einen Virus-Bindepuffer.
Weitere optionale Bestandteile sind
- ein Reagenz zum Resuspendieren des Festphase/Virenpartikel- Kompiexes
- ein Reagenz zum Lysieren der Viren - ein Reagenz zum Binden der freiwerdenden viralen Nukleinsäuren an die Festphase - ein Reagenz zum Waschen der an die Silica-Festphase gebundenen Nukleinsäuren
- ein Reagenz zum Ablösen der gebundenen viralen Nukleinsäuren von der Festphase - eine Anleitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.
Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, insbesondere der korrespondierenden Anmeldung DE 101 57624, eingereicht am 28.11.2001, ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.
Beispiele
1. Basisprotokolle zur Isolierung von viralen Nukleinsäuren
500μl HIV positives Plasma (EDTA- oder Citrat-Plasma) werden mit 500μl
0.2N HCI auf pH 2 eingestellt und dabei 1:1 verdünnt. Nach Zugabe von 30μ| Partikelsuspension (MagPrep® Silica, Merck KGaA) wird der Ansatz gemischt und 2-3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Silica Partikel werden magnetisch abgetrennt und der Überstand verworfen.
Nachfolgend werden kann die adsorbierten Viren lysiert und virale RNA durch beispielsweise folgende verschiedene Verfahren in geeigneter Weise extrahiert werden. A) Die Silica Partikel werden in 400μl Bindepuffer X (5M Guanidiniumthiocyanat, 1% Triton X 100) resuspendiert und anschließend mit 400μl Ethanol versetzt. Der Bindepuffer X enthält zudem Silica Partikel und eine interne Kontroll-RNA. Nach 10 Minuten Inkubation und anschließender Magnetisierung wird der Überstand abgetrennt und die
Silica-Partikel mit 70%igem Ethanol zweimal gewaschen. Die Elution der viralen RNA von den Partikeln erfolgt bei Inkubation in 10mM Tris/HCI pH 8,5 bei 80°C nach 10 Minuten.
0 B) Die Silica Partikel werden in ΘOOμl Bindepuffer Y ( 10OmM Acetat-Tris pH 4.0, 0,5% NP40, 200mM Ammoniumsulfat) resuspendiert. Der Bindepuffer Y enthält zudem Silica Partikel und eine interne Kontroll-RNA. Nach 10 Minuten Inkubation und anschließender Magnetisierung wird der Überstand abgetrennt und die Partikel mit Waschpuffer (10mM Tris-HCI pH 5 6.6; 0,5mg/ml Proteinase K ) zweimal gewaschen. Die Elution der viralen RNA von den Partikeln erfolgt bei Inkubation in 10mM Tris/HCI pH 8,5 bei 80°C nach 10 Minuten.
Die RNA der mittels Verfahren Variante A) oder B) gewonnenen Eluate wird 0 durch RT PCR und geeigneter Gensonden amplifiziert und nachgewiesen (z.B. mit Hilfe eines Thermocyclers wie der TaqMan® der Firma Perkin Eimer oder der LightCycler® der Firma Röche).
2. Auswirkung des pH-Wertes auf die Bindung von HIV an die Festphase 5 100μl HIV positives Plasma (200 Kopien) wird mit 400μl virusfreiem Plasma gemischt und 1:1 in Wasser verdünnt. Nach Zugabe der Festphase wird der pH mit konzentrierter HCI auf den gewünschten Wert eingestellt und die viralen Partikel an die Festphase adsorbiert.
Die Silica Partikel werden wie in Beispiel 1 beschrieben abgetrennt, die ° flüssigen Überstände verworfen, und die RNA extrahiert. Das Ergebnis dieses Beispiels ist in Fig.1 dargestellt. Die y-Achse zeigt den prozentualen Anteil der nachgewiesenen Viren an, wobei das erreichte Amplifikationssignal einer direkten RNA-Extraktion (ohne vorgeschaltete Anreicherung der Virus-Partikel) aus der HIV-positiven Plasmaprobe (1 OOμl, 200 Kopien) gleich 100% gesetzt wurde.
3. Auswirkung des Mischungsverhältnisses mit dem Bindepuffer auf die Bindung von HIV an die Festphase
100μl HIV positives Plasma (200 Kopien) wird mit 400μl virusfreiem Plasma gemischt und in dem angegebenen Verhältnis mit HCI saurem Wasser verdünnt, wobei sich ein pH-Wert von 2 einstellt. Wie in Beispiel 1 beschrieben, adsorbieren die viralen Partikel an die Festphase, die Silica Partikel werden abgtrennt, die flüssigen Überstände verworfen, und die RNA extrahiert Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt. Die y-Achse zeigt den prozentualen
Anteil der nachgewiesenen Viren an, wobei das erreichte Amplifikationssignal einer direkten RNA-Extraktion (ohne vorgeschaltete Anreicherung der Virus-Partikel) aus der HIV-positiven Plasmaprobe (100μl, 200 Kopien) gleich 100% gesetzt wurde. Auf der x-Achse bezeichnet „n" eine unverdünnte Probe.
4. Mehrfachanal vse der Virusanreicherunq aus 1 ml Plasma
Drei Ansätze zu je 100μl Plasma (Probe 2 - 4) mit HIV Partikeln (200 Kopien) werden mit 400μl virusfreiem Plasma gemischt und gemäss dem Basisprotokoll (Beispiel 1) an die Festphase adsorbiert. Die Silica Partikel werden abgetrennt, die flüssigen Überstände verworfen, und die RNA extrahiert. Das Ergebnis ist in Fig. 3 dargestellt. Die y-Achse zeigt den prozentualen Anteil der nachgewiesenen Viren an, wobei das erreichte Amplifikationssignal einer direkten RNA-Extraktion (ohne vorgeschaltete Anreicherung der Virus-Partikel) aus der HIV-positiven Plasmaprobe (100μl, 200 Kopien) gleich 100% gesetzt wurde.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von Lentiviren in komplexen biologischen Proben, gekennzeichnet durch folgende Schritte a) Ansäuern der Probe mit einem Virus-Bindepuffer, wobei der pH-Wert auf einen Wert von kleiner gleich 4 eingestellt wird und die Probe mit dem Virus-Bindepuffer in einem Volumenverhältnis (Probe : Bindepuffer) zwischen 1: 0,3 und 1: 2 gemischt wird, Zugabe einer Festphase und Inkubation der Mischung; b) Abtrennen der Festphase mit den gebundenen Viren; c) Nachweis der Viren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) die Probe mit dem Bindepuffer auf einen pH-Wert zwischen 1 und 3 angesäuert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) die Probe mit dem Virus-Bindepuffer in einem Volumenverhältnis von Probe zu Bindepuffer von 1 :0,5 bis 1 :1 ,5 gemischt wird.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Virus-Bindepuffer in Schritt a) wässrige Salzsäure verwendet wird.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) als Festphase magnetische Silica- Partikel eingesetzt werden.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) der Nachweis der Viren durch d ) Lyse der Viren c2) Isolierung der viralen Nukleinsäuren aus dem Lysat c3) Nachweis der viralen Nukleinsäuren erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung der viralen Nukleinsäuren in Schritt c2) durch Bindung an eine
Festphase erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der viralen Nukleinsäuren in Schritt c3) durch Nukleinsäureamplifikationstechniken erfolgt.
9. Test-Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 zumindest enthaltend eine Festphase und einen Virus-Bindepuffer.
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