WO2003028856A1 - Method and device for separating marked particles suspended in a viscous medium and use thereof in microbiological processes - Google Patents

Method and device for separating marked particles suspended in a viscous medium and use thereof in microbiological processes Download PDF

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WO2003028856A1
WO2003028856A1 PCT/FR2002/003192 FR0203192W WO03028856A1 WO 2003028856 A1 WO2003028856 A1 WO 2003028856A1 FR 0203192 W FR0203192 W FR 0203192W WO 03028856 A1 WO03028856 A1 WO 03028856A1
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WO
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particles
marked
flow
unmarked
viscous medium
Prior art date
Application number
PCT/FR2002/003192
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French (fr)
Inventor
Jorge Kurchan
José IGUAIN
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.)
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Publication date
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C5/00—Separating dispersed particles from liquids by electrostatic effect
    • B03C5/02—Separators
    • B03C5/022—Non-uniform field separators
    • B03C5/028—Non-uniform field separators using travelling electric fields, i.e. travelling wave dielectrophoresis [TWD]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/23—Magnetic separation acting directly on the substance being separated with material carried by oscillating fields; with material carried by travelling fields, e.g. generated by stationary magnetic coils; Eddy-current separators, e.g. sliding ramp
    • B03C1/24—Magnetic separation acting directly on the substance being separated with material carried by oscillating fields; with material carried by travelling fields, e.g. generated by stationary magnetic coils; Eddy-current separators, e.g. sliding ramp with material carried by travelling fields

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for separating labeled particles in a viscous medium and their application to microbiological processes, such as the separation of magnetically labeled cells.
  • the aforementioned article describes an apparatus and a method in which magnetically marked particles (cells) are subjected to a stationary force field, invariable in time, by means of a quadrupolar, fixed and stationary magnetic field.
  • the flow of particles, marked and unmarked circulates in a substantially annular channel, formed between two vertical concentric cylinders.
  • the marked and unmarked particles and the carrier fluid are introduced through radially opposite intake pipes and placed in the upper part of the channel.
  • the particles above are transported by convection and gravity to the lower part of the channel.
  • the application of a substantially axial magnetic field and of stationary amplitude makes it possible to divert the magnetically marked particles towards the internal wall of the external cylinder materializing the channel, in the absence of drift of the unmarked particles.
  • a first and a second outlet pipe each placed in the lower part of the channel in the vicinity of the inner wall of the outer cylinder respectively of the wall of the inner cylinder, make it possible to collect the particles marked by elution, on the one hand, and the particles not marked by gravity, on the other hand.
  • the tests carried out within the framework of the implementation of the above-mentioned method and apparatus have given satisfaction.
  • the separation process is highly dependent on the operating conditions, such as the amplitude of the force field, and therefore of the magnetic field applied, and that the relative flow rate of particles and of carrier fluid introduced.
  • the concentration of particles in the assembly must, in principle, be limited to a concentration value of less than 1%, to avoid interactions between particles. These interactions are likely to disrupt, if not oppose, the separation process described above.
  • a drawback of the method and of the apparatus described in the aforementioned article therefore lies in the strong dependence of the separation efficiency on the conditions for carrying out the separation process by application of a described stationary magnetic field.
  • Another drawback of the method and the apparatus described in the above-mentioned article results from the condition limiting the concentration of the particles to a low value.
  • Such a limitation prohibits, in practice, an application of such a separation process to large quantities of particles, that is to say in a real or natural situation, when, even in the presence of a small quantity of marked particles or cells assumed to be pathogenic, for example, there are a large number of unmarked particles or cells, non-pathogenic, capable of causing interactions, detrimental to the proper functioning of the separation process.
  • the subject of the present invention is the implementation of a method and a device for separating marked particles in a viscous medium, in which the abovementioned limitations and disadvantages are substantially eliminated.
  • an object of the present invention is the implementation of a method and a device for separating marked particles in a viscous medium capable of being implemented in the presence of a large number of particles and d 'a large volume of this medium.
  • Another object of the present invention is the implementation of a method and a device for separating particles in a viscous medium capable of being implemented in the presence of a large number of unlabeled particles, on the one hand, and, simultaneously, in the presence of a small or very small number of marked particles, on the other hand, these marked particles thus appearing in low or very low concentration in all of the particles.
  • Another object of the present invention is therefore, given the low or very low concentration of the labeled particles in all of the particles, the application of this method and this device to the early detection of foreign elements or differentiated, in particular when these elements are cells, having a pathogenic or non-pathogenic character.
  • the method of separating marked particles in a viscous medium applies to any viscous medium having a Reynolds number close to zero or greater and comprising in suspension marked particles and particles not marked, subject to a diffusion phenomenon.
  • the device for separating marked particles in a viscous medium comprising magnetically marked particles and unmarked particles comprises at least one container containing the viscous liquid, this container comprising an inlet window for a flow of the viscous liquid containing marked and unmarked particles in suspension, an outlet window, placed substantially opposite the inlet window in the direction of flow and the lateral outlet windows placed in the vicinity of the internal wall of the container, near the exit window.
  • Circuits for applying a non-stationary magnetic field oriented in a plane of symmetry of the container are provided.
  • the exit window makes it possible to collect the particles not marked magnetically and the side windows make it possible to collect the particles marked magnetically during the application of the non-stationary magnetic field.
  • the method and the device for separating labeled particles in a viscous medium find application in any laboratory or industrial operation or technique of liquid chromatography, or continuous separation, to techniques for separating labeled cells in any laboratory or industrial operation or technique in the field of biotechnology, microbiology or other processes, such as mineralogy.
  • the step consisting in subjecting the marked particles to a non-stationary force field can consist in applying to these particles a variable magnetic field; this makes it possible to generate a plurality of elementary flows of viscous fluid in the vicinity of the particles marked in rotation about an axis substantially orthogonal to the plane containing the direction of the variable magnetic field, the elementary flows of viscous liquid causing the hydrodynamic interaction.
  • FIG. 1a shows, by way of illustration, a flow diagram of the essential steps allowing the implementation of the method which is the subject of the present invention
  • - Figure 1b shows, by way of illustration, an illustrative diagram of the hydrodynamic interaction between marked particles, fluid constituting the viscous medium and unmarked particles, implemented in the context of the process which is the subject of the present invention
  • - Figures 2a, 2b and 2c show, by way of illustration, different variants of implementation of the hydrodynamic interaction of Figure 1b, these different variants of implementation corresponding, advantageously, to different contexts of implementation but complementary, allowing to induce separate separation mechanisms
  • - Figure 3 shows, by way of illustration, a preferred non-limiting mode of implementation of a non-stationary force field by means of a variable, non-stationary magnetic field, when the particles or cells to be separated are magnetically marked;
  • FIGS. 4a to 4c show, by way of illustration, the evolution of a viscous medium containing marked and unmarked particles randomly distributed in this viscous medium, the separation of the marked particles, in such a situation, occurring essentially according to a process buoyancy;
  • FIG. 5a shows a probability diagram of the presence per unit volume, as a function of the distance, of two particles in a viscous medium under the effect of a non-stationary magnetic field, in the absence of gravity, the particles being unmarked, according to curve A, one of the particles being magnetically marked, according to curve B;
  • FIGS. 1a, 1b and the following figures show, by way of illustration, a top view of the trajectory of non-magnetically marked particles and of marked particles respectively introduced by a flow of the viscous medium when these particles are subjected to the process which is the subject of the present invention
  • - Figure 6 shows, by way of illustration, in top view, a separator device for magnetically marked particles contained in a flow of marked and unmarked particles, the non-stationary force field being generated by application of a rotating magnetic field.
  • the particles marked PM and not marked PNM are in suspension in this viscous medium and whether or not they are subjected to a phenomenon of diffusion in the aforementioned viscous medium.
  • the diffusion phenomenon can be a very slow diffusion phenomenon, such as a sedimentation phenomenon, when the marked and unmarked particles are subjected only to the forces of gravity in the viscous medium or, on the contrary , to a specific flow when these marked and unlabeled particles are introduced in the form of a flow in the viscous medium.
  • the marked or unmarked particles are not subjected to any diffusion phenomenon when, for example, the marked or unmarked particles are introduced into the viscous medium and subjected to only convection movements, during this introduction, in the absence of a really perceptible diffusion phenomenon. In this case, we consider a substantially zero diffusion speed.
  • the process which is the subject of the invention consists in subjecting the particles marked PM to a field of forces not stationary F (t) to generate a continuous or alternating rotational MR movement of particles marked MR-PM or marking elements within the viscous medium in step A, then in step B, to maintain the force field non-stationary to maintain the continuous or alternating rotational movement of the marked particles within the viscous medium and to generate, by hydrodynamic interaction with the marked and unmarked particles in the vicinity of the marked particles, an increase in diffusivity of the particles.
  • This process makes it possible to generate, in an area of low density of particles in the medium, an area enriched with particles marked PM.
  • step B represents the hydrodynamic interaction between the viscous fluid and the marked and unlabeled particles causing the increase in diffusivity denoted D of the marked particles.
  • the operating mode of the hydrodynamic interaction process is as follows: the non-stationary force field is used to produce a setting in motion on themselves of the marked particles, this setting in motion having the effect of generating, by hydrodynamic interaction, viscous liquid flows in the vicinity of the marked particles. These viscous liquid flows themselves have the effect of causing the movement of the particles in the vicinity, as will be described in the description.
  • This movement of the neighboring particles of each marked particle generates, in turn, a modification of the fluxes around each particle marked PM, this modification generating an erratic movement increasing the diffusivity of each particle marked PM.
  • FIG. 1b there is shown in more detail the above process.
  • the particles marked PM subjected to the non-stationary force field entrained in continuous or alternating rotation generate, B1, a flow of the viscous medium in their vicinity.
  • These fluxes themselves generate, B2, a movement of the particles in the vicinity.
  • the flux is modified, B3, at the surface of the marked particles.
  • An erratic "diffusive" movement of particles marked PM and neighboring particles is generated, B4.
  • each particle marked PM makes it possible to generate, in the vicinity of each particle marked PM, a region with low particle density, each region with low particle density and the particle marked PM associated with the latter then being subjected to a buoyancy phenomenon, due to the low density of particles in the aforementioned region. This makes it possible to separate the particles marked in an area of reduced density into particles from the viscous medium.
  • the assembly constituted by the region with low particle density and the marked particle associated with the latter and situated substantially in the center of the aforementioned area is subjected to the buoyancy phenomenon, which causes the transfer of this assembly in the opposite direction to the gravitational or centripetal field in the case of a system subjected to centrifugation.
  • a second variant of implementation of the hydrodynamic interaction corresponds, as shown in FIG. 2b, to the more specific case where the viscous medium comprises an area with a relative density lower in particles, in particular in the case where the viscous medium, comprising the marked and unmarked particles in suspension, is subjected to a phenomenon of sedimentation for example.
  • the hydrodynamic interaction makes it possible to generate a migration of each particle marked PM towards the zone with lower relative density.
  • the diffusivity generated by the hydrodynamic interaction is lower in the regions of lower density and that, according to the general fact known as such, the particles migrate towards the regions of lower diffusivity.
  • This hydrodynamic interaction process makes it possible to separate the marked particles in the zone with a relative density lower in particles.
  • the aforementioned second variant can be used implemented in combination with the first variant described in connection with Figure 2a.
  • the container can be filled with the viscous liquid.
  • the unmarked particles PNM contained in the container then behave as a substantially random obstacle to the flow of the flow E.
  • the process which is the subject of the invention also consists, during the maintenance of the non-stationary force field, in subjecting the flow E of marked and unmarked particles to an obstacle or a series of random obstacles interposed on the path of the flow.
  • This type of obstacle OBS can consist of a matrix of fixed obstacles, a porous medium or the like.
  • This procedure makes it possible to subject the marked particles to an amplified lateral diffusion phenomenon.
  • the amplified lateral diffusion is thus generated on the particles marked in a direction substantially perpendicular to the flow E. Due to the aforementioned lateral diffusion phenomenon, the marked particles are thus deflected towards the lateral zones adjacent to the flow E, peripheral zones of the latter, while the unmarked particles are substantially maintained in the central zone of the aforementioned flow. .
  • This procedure makes it possible to separate the marked and unmarked particles.
  • the marked particles can advantageously be formed by magnetically marked particles.
  • the process which is the subject of the invention is implemented for the separation of cells, such as pathogenic cells for example, these can be labeled by means of magnetic beads in a manner known per se.
  • the magnetic balls can be ferro-magnetic or super-paramagnetic balls.
  • the magnetic particles are attached to the cells by means of antibodies which react with the surface antigens of the abovementioned cells. Under these conditions, each labeled particle or each labeled cell is capable of acquiring, at least in the presence of the application of a magnetic field, a magnetic moment denoted P.
  • the process which is the subject of the invention can consist, in step A of FIG. 1a, in applying, to the magnetically marked particles, a variable magnetic field B (t) in order to make it possible to generate a continuous or alternating rotational movement of the particles marked PM, which in turn causes a plurality of elementary flows of viscous fluid rotating in the vicinity of the marked particles around axes of rotation substantially orthogonal to the plane containing the variable magnetic field.
  • the elementary flows of viscous liquid then induce the hydrodynamic interaction under the conditions previously mentioned in the description.
  • the magnetic field is a rotating magnetic field of substantially fixed amplitude.
  • the particles marked PM are put into continuous or alternating rotation via the aforementioned magnetic field when the latter is a rotating field or a variable field.
  • the separation process is then produced by the interaction between repellant, friction, or hydrodynamic particles via neighboring flows of viscous liquid.
  • the fundamental parameter which governs the method object of the present invention is the ratio of the speed of rotation of each marked particle, speed of rotation equal to ⁇ xa where ⁇ denotes the angular speed of rotation of the particles and a denotes the mean radius of each particle, for each marked particle taken in isolation and subjected to the rotating magnetic field, at the speed of sedimentation designated U and represented by a vertical downward arrow in FIG. 2a.
  • FIGS. 4a, 4b and 4c correspond not to simple illustrative diagrams, but on the contrary to successive results of a numerical simulation carried out by means of the dynamics of STOKES, from a simulation program based on the principles of '' such a dynamic called STOKESIAN DYNAMICS in Anglo-Saxon language.
  • FIG. 5a represents a probability diagram per unit of volume of finding a pair of particles in the viscous medium in the absence of gravity.
  • Curve A represents, for unmarked particles, the value of this probability p as a function of distance.
  • the probability is substantially zero.
  • the curves A and B of FIG. 5a obtained likewise by simulation from the dynamics of STOKES, thus show that during the implementation of the process which is the subject of the present invention on marked particles, there always exists, in the vicinity of the latter, when they are subjected to a continuous or alternating rotational movement for example, a distance X constituting the vicinity of each marked particle and the region with low particle density.
  • This region constitutes, as mentioned previously in the description, with the marked particle associated with the latter, the zone subjected to the buoyancy phenomenon making it possible to separate the marked particles by use of the gravitational field or of centrifugation.
  • FIGS. 5b and 5c similarly obtained by simulation from the dynamics of STOKES make it possible to understand the operating mode of the method which is the subject of the present invention, as illustrated in FIG. 2c.
  • FIG. 5b shows a top view of a viscous medium into which is introduced a flow E constituted by a fluid of the same nature as the viscous medium and comprising unmarked particles and a series of fixed random obstacles, not shown in the drawing. The trajectories of the unmarked particles are shown in FIG. 5b over the entire length L of the container containing the viscous fluid.
  • the particles have a low degree of lateral diffusivity, the particles slightly deviating, by a few millimeters, from the trajectory or mean direction of the flow E, in a direction perpendicular to this flow.
  • the diffusivity phenomenon is qualified as lateral due to the fact that any sedimentation or gravity phenomenon is not taken into account, which, in the case of FIG. 5b, would be likely to be exerted in a direction orthogonal to the plane of the figure. 5b.
  • the spreading of the trajectories over the trajectory spreading distance D N ⁇ st of a few millimeters.
  • the unmarked particles which are not subjected to the variation of the magnetic field, and therefore to the non-stationary force, have a lateral diffusion of low value, while the marked particles, subjected to the process object of the present invention, show a much more pronounced lateral diffusion in the aforementioned report.
  • ⁇ and a represent the angular velocity of an isolated particle subjected to the magnetic field and the mean radius of each marked particle.
  • the mean quadratic value of the lateral diffusion, under these conditions for a given geometry and series of obstacles, is a function of n 2 , rotation ratio, the drift due to gravity being furthermore neglected in order to be placed in the least favorable comparison case.
  • the value of the rotation ratio parameter n 2 can be chosen at will by increasing or decreasing the speed of the flow Ud.
  • the separation speed in number of rotations is proportional to Ud and inversely proportional to the length L of the separator.
  • ⁇ denotes the value of the viscosity of the viscous fluid and n 2 denotes the value of the rotation ratio previously mentioned in the description.
  • P denotes the value of the magnetic moment and B denotes the value or amplitude of the magnetic field.
  • the same parameters designate the same entities as in the previous relationships relating to flow 1, the entity V2? designating the gradient of the magnetic field, in the direction perpendicular to the direction of flow.
  • the ratio of the fluxes of particles is written flux1 / flux2 of the form: a _ B_ (6) flux2 a B '
  • the method which is the subject of the present invention makes it possible to work on much larger samples and, ultimately, on a much larger number. important of marked and unlabeled cells.
  • the number of labeled cells in particular when these cells are pathogenic for example, can be very low, this makes it possible to carry out a separation of marked cells, while the number of labeled cells and therefore pathogenic is still very low in proportion, compared to unlabeled cells.
  • the separator comprises a container 1.
  • the container 1 comprises an inlet window F ⁇ for admitting the flow E.
  • the container 1 has a length L and a width / in the direction perpendicular to the flow E.
  • An outlet window FS is provided opposite the inlet window F ⁇ and substantially opposite the latter.
  • Lateral nozzles denoted FL1, FL2 are provided, which connect the interior of the container 1 with outlet orifices, the lateral nozzles FL1 and FL2 having their inlet placed near the periphery of the container 1, at the height of the window FS output.
  • the length L of the container 1 can be 1 to 2 cm for example and the width / a few millimeters.
  • solenoids S1, S2 and S3, S4 are arranged in opposition and offset by ⁇ / 2 in the plane of FIG. 6, the solenoids S1, S2 and S3, S4 being supplied by an alternating voltage so as to generate a rotating magnetic field B (t), which is for example in the plane of FIG. 6.
  • an OBS obstacle such as a porous matrix or, if necessary, a brush provided with bristles orthogonal to the plane of FIG. 6 , can also be introduced to form the obstacle to the flow E in the container 1.
  • FIG. 2c it is indicated that the separator shown in FIG.
  • the bristles of the brush can advantageously be oriented perpendicular both to the axis of the flow E and the plane containing the rotating magnetic field).

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Abstract

The invention concerns a method and a device for separating marked particles suspended in a viscous medium. The invention is characterized in that it consists in: subjecting (A) the marked particles (PM) to a field on non-stationary forces to generate a continuous rotational or reciprocating movement of the particles and maintaining (B) said field of forces to generate by hydrodynamic interaction an increase in the diffusivity of the marked particles and separating a zone enriched in marked particles. The invention is applicable to liquid phase chromatography for separating magnetically marked cells.

Description

Procédé et dispositif de séparation de particules marquées en suspension dans un milieu visqueux et son application aux processus microbioloqiques.Method and device for separating marked particles suspended in a viscous medium and its application to microbiological processes.
L'invention concerne un procédé et un dispositif de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux et leur application aux processus microbiologiques, tels que la séparation de cellules magnétiquement marquées.The invention relates to a method and a device for separating labeled particles in a viscous medium and their application to microbiological processes, such as the separation of magnetically labeled cells.
Le domaine technique de la séparation des particules marquées, en suspension dans un milieu visqueux parmi d'autres particules non marquées, a fait l'objet d'un nombre croissant d'études et de développements, en vue d'applications aux processus de microbiologie ou, plus généralement, de biotechnologie.The technical field of the separation of marked particles, suspended in a viscous medium among other unmarked particles, has been the subject of an increasing number of studies and developments, with a view to applications to microbiology processes. or, more generally, biotechnology.
C'est en particulier le cas en ce qui concerne la séparation de cellules marquées magnétiquement, au moyen de billes magnétiques, lesquelles sont solidarisées à certaines cellules par l'intermédiaire d'anticorps, qui réagissent avec les antigènes de surface de chaque cellule considérée.This is in particular the case with regard to the separation of magnetically labeled cells, by means of magnetic beads, which are attached to certain cells by means of antibodies, which react with the surface antigens of each cell considered.
Lorsque de telles cellules sont en suspension dans un liquide physiologique, tel que le sang ou un milieu intercellulaire, la viscosité du fluide, constitutif de ce milieu, est très importante, un tel système présentant un nombre de Reynolds très faible, Re = 0. Parmi les travaux les plus remarquables réalisés jusqu'à ce jour dans le domaine technique considéré, on peut se reporter à l'article publié par M. Hoyos, Lee R. Moore, Kara E. MC Closkey, Shlomo Margel, Merav Zaberi, Jeffrey J. Chalmers, Maciej Zborowski intitulé "Study of magnetic particles puise injected into an annular SPLITT like channel inside a quadrupole magnetic field" et édité par le Journal of chromatography A, 903( 2000) 99-116.When such cells are suspended in a physiological fluid, such as blood or an intercellular medium, the viscosity of the fluid, constituting this medium, is very high, such a system having a very low Reynolds number, Re = 0. Among the most remarkable works carried out to date in the technical field considered, one can refer to the article published by M. Hoyos, Lee R. Moore, Kara E. MC Closkey, Shlomo Margel, Merav Zaberi, Jeffrey J. Chalmers, Maciej Zborowski entitled "Study of magnetic particles puise injected into an annular SPLITT like channel inside a quadrupole magnetic field" and published by the Journal of chromatography A, 903 (2000) 99-116.
L'article précité décrit un appareil et un procédé dans lesquels des particules (cellules) marquées magnétiquement sont soumises à un champ de forces stationnaire, invariant dans le temps, par l'intermédiaire d'un champ magnétique quadrupolaire, fixe et stationnaire. Le flux de particules, marquées et non marquées, circule dans un canal sensiblement annulaire, ménagé entre deux cylindres concentriques verticaux. Les particules marquées et non marquées et le fluide porteur sont introduits par des conduites d'admission radialement opposées et placées en partie supérieure du canal. Les particules précitées sont transportées par convection et gravité vers la partie inférieure du canal. L'application d'un champ magnétique sensiblement axial et d'amplitude stationnaire permet de faire dériver les particules marquées magnétiquement vers la paroi interne du cylindre extérieur matérialisant le canal, en l'absence de dérive des particules non marquées. Une première et une deuxième conduite de sortie, placées chacune en partie inférieure du canal au voisinage de la paroi interne du cylindre extérieur respectivement de la paroi du cylindre intérieur, permettent de collecter les particules marquées par élution, d'une part, et les particules non marquées par gravité, d'autre part. Les essais réalisés dans le cadre de la mise en œuvre du procédé et de l'appareil précités ont donné satisfaction. Toutefois, il est apparu que le processus de séparation est fortement dépendant des conditions opératoires, telles que l'amplitude du champ de forces, et donc du champ magnétique appliqué, et que le débit relatif de particules et de fluide porteur introduits. En particulier, la concentration en particules de l'ensemble doit, en principe, être limitée à une valeur de concentration inférieure à 1%, pour éviter les interactions entre particules. Ces interactions sont susceptibles de perturber le, sinon de s'opposer au, processus de séparation décrit précédemment.The aforementioned article describes an apparatus and a method in which magnetically marked particles (cells) are subjected to a stationary force field, invariable in time, by means of a quadrupolar, fixed and stationary magnetic field. The flow of particles, marked and unmarked, circulates in a substantially annular channel, formed between two vertical concentric cylinders. The marked and unmarked particles and the carrier fluid are introduced through radially opposite intake pipes and placed in the upper part of the channel. The particles above are transported by convection and gravity to the lower part of the channel. The application of a substantially axial magnetic field and of stationary amplitude makes it possible to divert the magnetically marked particles towards the internal wall of the external cylinder materializing the channel, in the absence of drift of the unmarked particles. A first and a second outlet pipe, each placed in the lower part of the channel in the vicinity of the inner wall of the outer cylinder respectively of the wall of the inner cylinder, make it possible to collect the particles marked by elution, on the one hand, and the particles not marked by gravity, on the other hand. The tests carried out within the framework of the implementation of the above-mentioned method and apparatus have given satisfaction. However, it has become apparent that the separation process is highly dependent on the operating conditions, such as the amplitude of the force field, and therefore of the magnetic field applied, and that the relative flow rate of particles and of carrier fluid introduced. In particular, the concentration of particles in the assembly must, in principle, be limited to a concentration value of less than 1%, to avoid interactions between particles. These interactions are likely to disrupt, if not oppose, the separation process described above.
Un inconvénient du procédé et de l'appareil décrits dans l'article précité réside en conséquence dans la forte dépendance du rendement de séparation aux conditions de mise en œuvre du processus de séparation par application d'un champ magnétique stationnaire décrit.A drawback of the method and of the apparatus described in the aforementioned article therefore lies in the strong dependence of the separation efficiency on the conditions for carrying out the separation process by application of a described stationary magnetic field.
Un autre inconvénient du procédé et de l'appareil décrits dans l'article précité résulte de la condition limitant la concentration des particules à une valeur faible. Une telle limitation interdit, en pratique, une application d'un tel processus de séparation à des quantités importantes de particules, c'est à dire en situation réelle ou naturelle, lorsque, même en présence d'une faible quantité de particules ou cellules marquées supposées pathogènes par exemple, il existe un nombre important de particules ou de cellules non marquées, non pathogènes, susceptibles de provoquer des interactions, néfastes au bon déroulement du processus de séparation. La présente invention a pour objet la mise en œuvre d'un procédé et d'un dispositif de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux, dans lesquels les limitations et inconvénients précités sont sensiblement supprimés. En particulier, un objet de la présente invention est la mise en œuvre d'un procédé et d'un dispositif de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux susceptibles d'être mis en œuvre en présence d'un nombre important de particules et d'un grand volume de ce milieu.Another drawback of the method and the apparatus described in the above-mentioned article results from the condition limiting the concentration of the particles to a low value. Such a limitation prohibits, in practice, an application of such a separation process to large quantities of particles, that is to say in a real or natural situation, when, even in the presence of a small quantity of marked particles or cells assumed to be pathogenic, for example, there are a large number of unmarked particles or cells, non-pathogenic, capable of causing interactions, detrimental to the proper functioning of the separation process. The subject of the present invention is the implementation of a method and a device for separating marked particles in a viscous medium, in which the abovementioned limitations and disadvantages are substantially eliminated. In particular, an object of the present invention is the implementation of a method and a device for separating marked particles in a viscous medium capable of being implemented in the presence of a large number of particles and d 'a large volume of this medium.
Un autre objet de la présente invention est la mise en œuvre d'un procédé et d'un dispositif de séparation de particules dans un milieu visqueux susceptibles d'être mis en œuvre en présence d'un nombre important de particules non marquées, d'une part, et, simultanément, en présence d'un nombre faible ou très faible de particules marquées, d'autre part, ces particules marquées apparaissant ainsi en faible ou très faible concentration dans l'ensemble des particules. Un autre objet de la présente invention est en conséquence, compte tenu de la faible ou de la très faible concentration des particules marquées dans l'ensemble des particules, l'application de ce procédé et de ce dispositif à la détection précoce d'éléments étrangers ou différenciés, en particulier lorsque ces éléments sont des cellules, présentant un caractère pathogène ou non pathogène.Another object of the present invention is the implementation of a method and a device for separating particles in a viscous medium capable of being implemented in the presence of a large number of unlabeled particles, on the one hand, and, simultaneously, in the presence of a small or very small number of marked particles, on the other hand, these marked particles thus appearing in low or very low concentration in all of the particles. Another object of the present invention is therefore, given the low or very low concentration of the labeled particles in all of the particles, the application of this method and this device to the early detection of foreign elements or differentiated, in particular when these elements are cells, having a pathogenic or non-pathogenic character.
Le procédé de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux, objet de la présente invention, s'applique à tout milieu visqueux présentant un nombre de Reynolds voisin de la valeur zéro ou de valeur supérieure et comprenant en suspension des particules marquées et des particules non marquées, soumises à un phénomène de diffusion.The method of separating marked particles in a viscous medium, object of the present invention, applies to any viscous medium having a Reynolds number close to zero or greater and comprising in suspension marked particles and particles not marked, subject to a diffusion phenomenon.
Il est remarquable en ce qu'il consiste à soumettre les particules marquées à un champ de forces non stationnaire, pour engendrer un mouvement de rotation continu ou alterné des particules marquées au sein de ce milieu visqueux et à maintenir ce champ de forces non stationnaire pour maintenir le mouvement de rotation continu ou alterné des particules marquées ou des éléments de marquage au sein du milieu visqueux et engendrer, par interaction hydrodynamique avec les particules marquées et non marquées au voisinage des particules marquées, un accroissement de diffusivité des particules. Ceci permet, d'engendrer une zone enrichie en particules marquées. Le dispositif séparateur de particules marquées dans un milieu visqueux comprenant des particules marquées magnétiquement et des particules non marquées est remarquable en ce qu'il comporte au moins un récipient contenant le liquide visqueux, ce récipient comportant une fenêtre d'entrée d'un écoulement du liquide visqueux contenant des particules marquées et non marquées en suspension, une fenêtre de sortie, placée sensiblement en vis à vis de la fenêtre d'entrée dans la direction de l'écoulement et des fenêtres latérales de sortie placées au voisinage de la paroi interne du récipient, à hauteur de la fenêtre de sortie. Des circuits d'application d'un champ magnétique non stationnaire orienté dans un plan de symétrie du récipient sont prévus. La fenêtre de sortie permet de recueillir les particules non marquées magnétiquement et les fenêtres latérales permettent de recueillir les particules marquées magnétiquement lors de l'application du champ magnétique non stationnaire.It is remarkable in that it consists in subjecting the marked particles to a non-stationary force field, to generate a continuous or alternating rotational movement of the marked particles within this viscous medium and to maintaining this non-stationary force field for maintain the continuous or alternating rotational movement of the marked particles or of the marking elements within the viscous medium and generate, by hydrodynamic interaction with the marked and unmarked particles with near the marked particles, an increase in the diffusivity of the particles. This allows to generate an area enriched with marked particles. The device for separating marked particles in a viscous medium comprising magnetically marked particles and unmarked particles is remarkable in that it comprises at least one container containing the viscous liquid, this container comprising an inlet window for a flow of the viscous liquid containing marked and unmarked particles in suspension, an outlet window, placed substantially opposite the inlet window in the direction of flow and the lateral outlet windows placed in the vicinity of the internal wall of the container, near the exit window. Circuits for applying a non-stationary magnetic field oriented in a plane of symmetry of the container are provided. The exit window makes it possible to collect the particles not marked magnetically and the side windows make it possible to collect the particles marked magnetically during the application of the non-stationary magnetic field.
Le procédé et le dispositif de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux, objets de l'invention, trouvent application à toute opération ou technique de laboratoire ou industrielle de chromatographie en phase liquide, ou séparation continue, aux techniques de séparation de cellules marquées dans toute opération ou technique de laboratoire ou industrielle dans le domaine des processus de biotechnologies, de microbiologie ou autre, telle que la minéralogie.The method and the device for separating labeled particles in a viscous medium, which are the subject of the invention, find application in any laboratory or industrial operation or technique of liquid chromatography, or continuous separation, to techniques for separating labeled cells in any laboratory or industrial operation or technique in the field of biotechnology, microbiology or other processes, such as mineralogy.
En particulier, lorsque les particules marquées, sont des particules marquées magnétiquement, au moyen de microbilles magnétiques par exemple, l'étape consistant à soumettre les particules marquées à un champ de forces non stationnaire peut consister à appliquer à ces particules un champ magnétique variable ; ceci permet d'engendrer une pluralité de flux élémentaires de fluide visqueux au voisinage des particules marquées en rotation autour d'un axe sensiblement orthogonal au plan contenant la direction du champ magnétique variable, les flux élémentaires de liquide visqueux provoquant l'interaction hydrodynamique. Ils seront mieux compris à la lecture de la description et à l'observation des dessins ci-après, dans lesquels :In particular, when the marked particles are magnetically marked particles, by means of magnetic microbeads for example, the step consisting in subjecting the marked particles to a non-stationary force field can consist in applying to these particles a variable magnetic field; this makes it possible to generate a plurality of elementary flows of viscous fluid in the vicinity of the particles marked in rotation about an axis substantially orthogonal to the plane containing the direction of the variable magnetic field, the elementary flows of viscous liquid causing the hydrodynamic interaction. They will be better understood on reading the description and on observing the drawings below, in which:
- la figure 1a représente, à titre illustratif, un organigramme des étapes essentielles permettant la mise en œuvre du procédé objet de la présente invention ;- Figure 1a shows, by way of illustration, a flow diagram of the essential steps allowing the implementation of the method which is the subject of the present invention;
- la figure 1 b représente, à titre illustratif, un diagramme illustratif de l'interaction hydrodynamique entre particules marquées, fluide constituant le milieu visqueux et particules non marquées, mise en œuvre dans le cadre du procédé objet de la présente invention ; - les figures 2a, 2b et 2c représentent, à titre illustratif, différentes variantes de mise en œuvre de l'interaction hydrodynamique de la figure 1 b, ces différentes variantes de mise en œuvre correspondant, avantageusement, à des contextes de mise en œuvre différents mais complémentaires, permettant d'induire des mécanismes de séparation distincts ; - la figure 3 représente, à titre illustratif, un mode de mise en œuvre préférentiel non limitatif d'un champ de forces non stationnaire au moyen d'un champ magnétique variable, non stationnaire, lorsque les particules ou cellules à séparer sont marquées magnétiquement ;- Figure 1b shows, by way of illustration, an illustrative diagram of the hydrodynamic interaction between marked particles, fluid constituting the viscous medium and unmarked particles, implemented in the context of the process which is the subject of the present invention; - Figures 2a, 2b and 2c show, by way of illustration, different variants of implementation of the hydrodynamic interaction of Figure 1b, these different variants of implementation corresponding, advantageously, to different contexts of implementation but complementary, allowing to induce separate separation mechanisms; - Figure 3 shows, by way of illustration, a preferred non-limiting mode of implementation of a non-stationary force field by means of a variable, non-stationary magnetic field, when the particles or cells to be separated are magnetically marked;
- les figures 4a à 4c représentent, à titre illustratif, l'évolution d'un milieu visqueux contenant des particules marquées et non marquées réparties aléatoirement dans ce milieu visqueux, la séparation des particules marquées, dans une telle situation, intervenant essentiellement selon un processus de flottabilité ;- Figures 4a to 4c show, by way of illustration, the evolution of a viscous medium containing marked and unmarked particles randomly distributed in this viscous medium, the separation of the marked particles, in such a situation, occurring essentially according to a process buoyancy;
- la figure 5a représente un diagramme de probabilité de présence par unité de volume, en fonction de la distance, de deux particules dans un milieu visqueux sous l'effet d'un champ magnétique non stationnaire, en l'absence de gravité, les particules étant non marquées, selon la courbe A, l'une des particules étant marquée magnétiquement, selon la courbe B ;- Figure 5a shows a probability diagram of the presence per unit volume, as a function of the distance, of two particles in a viscous medium under the effect of a non-stationary magnetic field, in the absence of gravity, the particles being unmarked, according to curve A, one of the particles being magnetically marked, according to curve B;
- les figures 5b et 5c représentent, à titre illustratif, une vue de dessus de la trajectoire de particules non marquées magnétiquement et de particules marquées respectivement introduites par un écoulement du milieu visqueux lorsque ces particules sont soumises au procédé objet de la présente invention ; - la figure 6 représente, à titre illustratif, en vue de dessus, un dispositif séparateur de particules marquées magnétiquement contenues dans un écoulement de particules marquées et non marquées, le champ de forces non stationnaire étant engendré par application d'un champ magnétique tournant. Le procédé de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux, conforme à l'objet de la présente invention, sera maintenant décrit en liaison avec les figures 1a, 1 b et les figures suivantes.- Figures 5b and 5c show, by way of illustration, a top view of the trajectory of non-magnetically marked particles and of marked particles respectively introduced by a flow of the viscous medium when these particles are subjected to the process which is the subject of the present invention; - Figure 6 shows, by way of illustration, in top view, a separator device for magnetically marked particles contained in a flow of marked and unmarked particles, the non-stationary force field being generated by application of a rotating magnetic field. The process for the separation of labeled particles in a viscous medium, in accordance with the object of the present invention, will now be described in conjunction with FIGS. 1a, 1b and the following figures.
En référence à la figure 1a, on indique que le procédé objet de l'invention s'applique à des particules marquées PM et à des particules non marquées PNM dans un milieu visqueux, le milieu visqueux précité pouvant être constitué par tout système dont le nombre de Reynolds Re est voisin de zéro, Re ≡ 0.Referring to FIG. 1a, it is indicated that the process which is the subject of the invention applies to particles marked PM and to particles not marked PNM in a viscous medium, the aforementioned viscous medium being able to be constituted by any system the number of which of Reynolds Re is close to zero, Re ≡ 0.
Bien que le procédé objet de la présente invention soit plus particulièrement adapté pour les liquides visqueux précités, il peut être mis en œuvre de manière non limitative pour des fluides de degré de viscosité plus faible, c'est-à-dire dans des situations où le nombre de Reynolds est plus important.Although the process which is the subject of the present invention is more particularly suitable for the aforementioned viscous liquids, it can be implemented in a nonlimiting manner for fluids with a lower degree of viscosity, that is to say in situations where the Reynolds number is greater.
D'une manière générale, on indique que les particules marquées PM et non marquées PNM sont en suspension dans ce milieu visqueux et qu'elles sont soumises ou non à un phénomène de diffusion dans le milieu visqueux précité. On comprend, en particulier, que le phénomène de diffusion peut être un phénomène de diffusion très lent, tel qu'un phénomène de sédimentation, lorsque les particules marquées et non marquées sont soumises aux seules forces de gravité dans le milieu visqueux ou, au contraire, à un écoulement spécifique lorsque ces particules marquées et non marquées sont introduites sous forme d'un écoulement dans le milieu visqueux. Le cas échéant, les particules marquées ou non marquées ne sont soumises à aucun phénomène de diffusion lorsque, par exemple, les particules marquées ou non marquées sont introduites dans le milieu visqueux et soumises à de seuls mouvements de convexion, lors de cette introduction, en l'absence de phénomène de diffusion réellement perceptible. Dans ce cas, on considère une vitesse de diffusion sensiblement nulle.In general, it is indicated that the particles marked PM and not marked PNM are in suspension in this viscous medium and whether or not they are subjected to a phenomenon of diffusion in the aforementioned viscous medium. It is understood, in particular, that the diffusion phenomenon can be a very slow diffusion phenomenon, such as a sedimentation phenomenon, when the marked and unmarked particles are subjected only to the forces of gravity in the viscous medium or, on the contrary , to a specific flow when these marked and unlabeled particles are introduced in the form of a flow in the viscous medium. Where appropriate, the marked or unmarked particles are not subjected to any diffusion phenomenon when, for example, the marked or unmarked particles are introduced into the viscous medium and subjected to only convection movements, during this introduction, in the absence of a really perceptible diffusion phenomenon. In this case, we consider a substantially zero diffusion speed.
En référence à la figure 1a, on indique que le procédé objet de l'invention consiste à soumettre les particules marquées PM à un champ de forces non stationnaire F(t) pour engendrer un mouvement MR de rotation continu ou alterné des particules marquées MR-PM ou des éléments de marquage au sein du milieu visqueux à l'étape A, puis à l'étape B, à maintenir le champ de forces non stationnaire pour maintenir le mouvement de rotation continu ou alterné des particules marquées au sein du milieu visqueux et engendrer, par interaction hydrodynamique avec les particules marquées et non marquées au voisinage des particules marquées, un accroissement de diffusivité des particules. Ce processus permet d'engendrer, en zone de faible densité en particules du milieu, une zone enrichie en particules marquées PM. Sur la figure 1a, l'étape B représente l'interaction hydrodynamique entre le fluide visqueux et les particules marquées et non marquées provoquant l'accroissement de diffusivité noté D des particules marquées.Referring to FIG. 1a, it is indicated that the process which is the subject of the invention consists in subjecting the particles marked PM to a field of forces not stationary F (t) to generate a continuous or alternating rotational MR movement of particles marked MR-PM or marking elements within the viscous medium in step A, then in step B, to maintain the force field non-stationary to maintain the continuous or alternating rotational movement of the marked particles within the viscous medium and to generate, by hydrodynamic interaction with the marked and unmarked particles in the vicinity of the marked particles, an increase in diffusivity of the particles. This process makes it possible to generate, in an area of low density of particles in the medium, an area enriched with particles marked PM. In FIG. 1a, step B represents the hydrodynamic interaction between the viscous fluid and the marked and unlabeled particles causing the increase in diffusivity denoted D of the marked particles.
Le mode opératoire du processus d'interaction hydrodynamique est le suivant : le champ de forces non stationnaire est utilisé pour produire une mise en mouvement sur elles-mêmes des particules marquées, cette mise en mouvement ayant pour effet d'engendrer, par interaction hydrodynamique, des flux de liquide visqueux au voisinage des particules marquées. Ces flux de liquide visqueux ont eux-mêmes pour effet de provoquer la mise en mouvement des particules du voisinage, ainsi qu'il sera décrit dans la description. Ce mouvement des particules voisines de chaque particule marquée engendre, à son tour, une modification des flux autour de chaque particule marquée PM, cette modification engendrant un mouvement erratique augmentant la diffusivité de chaque particule marquée PM.The operating mode of the hydrodynamic interaction process is as follows: the non-stationary force field is used to produce a setting in motion on themselves of the marked particles, this setting in motion having the effect of generating, by hydrodynamic interaction, viscous liquid flows in the vicinity of the marked particles. These viscous liquid flows themselves have the effect of causing the movement of the particles in the vicinity, as will be described in the description. This movement of the neighboring particles of each marked particle generates, in turn, a modification of the fluxes around each particle marked PM, this modification generating an erratic movement increasing the diffusivity of each particle marked PM.
Sur la figure 1b, on a représenté, de manière plus détaillée, le processus précité. Selon la figure 1b, les particules marquées PM soumises au champ de forces non stationnaire entraînées en rotation continue ou alternée engendrent, B1 , un flux du milieu visqueux à leur voisinage. Ces flux engendrent eux- mêmes, B2, un mouvement des particules du voisinage. Le flux est modifié, B3, en surface des particules marquées. Un mouvement erratique "diffusif" des particules marquées PM et des particules voisines est engendré, B4.In Figure 1b, there is shown in more detail the above process. According to FIG. 1b, the particles marked PM subjected to the non-stationary force field entrained in continuous or alternating rotation generate, B1, a flow of the viscous medium in their vicinity. These fluxes themselves generate, B2, a movement of the particles in the vicinity. The flux is modified, B3, at the surface of the marked particles. An erratic "diffusive" movement of particles marked PM and neighboring particles is generated, B4.
Différentes variantes de mise en œuvre de l'interaction hydrodynamique seront maintenant décrites en liaison avec les figures 2a à 2c, ces différentes variantes étant distinctes, mais complémentaires, le processus d'interaction hydrodynamique en tant que tel pouvant être compris comme correspondant à l'une de ces variantes ou, le cas échéant, à la combinaison de ces variantes, ainsi qu'il sera décrit ci-après dans la description. En référence à la figure 2a, on indique que la diffusivité de chaque particule marquée PM permet d'engendrer, au voisinage de chaque particule marquée PM, une région à faible densité de particules, chaque région à faible densité de particules et la particule marquée PM associée à celle-ci étant alors soumise à un phénomène de flottabilité, en raison de la faible densité de particules dans la région précitée. Ceci permet de séparer les particules marquées dans une zone de densité réduite en particules du milieu visqueux. En effet, en raison du phénomène de flottabilité précité, l'ensemble constitué par la région à faible densité de particules et la particule marquée associée à cette dernière et située sensiblement au centre de la zone précitée est soumis au phénomène de flottabilité, lequel provoque le transfert de cet ensemble en direction contraire au champ gravitationnel ou centripète dans le cas d'un système soumis à centrifugation.Different implementation variants of the hydrodynamic interaction will now be described in connection with FIGS. 2a to 2c, these different variants being distinct, but complementary, the hydrodynamic interaction process as such can be understood as corresponding to one of these variants or, where appropriate, to the combination of these variants, as will be described below. after in the description. Referring to FIG. 2a, it is indicated that the diffusivity of each particle marked PM makes it possible to generate, in the vicinity of each particle marked PM, a region with low particle density, each region with low particle density and the particle marked PM associated with the latter then being subjected to a buoyancy phenomenon, due to the low density of particles in the aforementioned region. This makes it possible to separate the particles marked in an area of reduced density into particles from the viscous medium. In fact, due to the above-mentioned buoyancy phenomenon, the assembly constituted by the region with low particle density and the marked particle associated with the latter and situated substantially in the center of the aforementioned area is subjected to the buoyancy phenomenon, which causes the transfer of this assembly in the opposite direction to the gravitational or centripetal field in the case of a system subjected to centrifugation.
Une deuxième variante de mise en œuvre de l'interaction hydrodynamique correspond, ainsi que représenté en figure 2b, au cas plus spécifique où le milieux visqueux comporte une zone à densité relative plus faible en particules, en particulier dans le cas où le milieu visqueux, comportant les particules marquées et non marquées en suspension, est soumis à un phénomène de sédimentation par exemple.A second variant of implementation of the hydrodynamic interaction corresponds, as shown in FIG. 2b, to the more specific case where the viscous medium comprises an area with a relative density lower in particles, in particular in the case where the viscous medium, comprising the marked and unmarked particles in suspension, is subjected to a phenomenon of sedimentation for example.
Dans un tel cas, ainsi que représenté schématiquement en figure 2b, l'interaction hydrodynamique permet d'engendrer une migration de chaque particule marquée PM vers la zone à densité relative plus faible. Ceci est dû au fait que la diffusivité engendrée par l'interaction hydrodynamique est plus faible dans les régions de plus faible densité et que, selon le fait général connu en tant que tel, les particules migrent vers les régions de plus faible diffusivité. Ce processus d'interaction hydrodynamique, tel que représenté en figure 2b, permet de séparer les particules marquées dans la zone à densité relative plus faible en particules. Bien entendu, la deuxième variante précitée peut être mise en œuvre en combinaison avec la première variante décrite en liaison avec la figure 2a.In such a case, as shown diagrammatically in FIG. 2b, the hydrodynamic interaction makes it possible to generate a migration of each particle marked PM towards the zone with lower relative density. This is due to the fact that the diffusivity generated by the hydrodynamic interaction is lower in the regions of lower density and that, according to the general fact known as such, the particles migrate towards the regions of lower diffusivity. This hydrodynamic interaction process, as shown in FIG. 2b, makes it possible to separate the marked particles in the zone with a relative density lower in particles. Of course, the aforementioned second variant can be used implemented in combination with the first variant described in connection with Figure 2a.
En ce qui concerne la création d'une zone à densité relative plus faible en particules, on indique que celle-ci peut être engendrée par un phénomène de sédimentation ou également par un phénomène de centrifugation appliqué au récipient contenant le milieu visqueux et les particules marquées et non marquées.With regard to the creation of a zone with a lower relative density of particles, it is indicated that this may be caused by a phenomenon of sedimentation or also by a phenomenon of centrifugation applied to the container containing the viscous medium and the marked particles. and not marked.
Une troisième variante de mise en œuvre de l'interaction hydrodynamique sera maintenant décrite en liaison avec la figure 2c. En référence à la figure précitée, on indique que, dans cette situation, le phénomène de diffusion correspond avantageusement à un écoulement E des particules marquées et non marquées, cet écoulement pouvant être introduit avec le milieu visqueux.A third variant of implementation of the hydrodynamic interaction will now be described in conjunction with FIG. 2c. Referring to the aforementioned figure, it is indicated that, in this situation, the diffusion phenomenon advantageously corresponds to a flow E of the marked and unlabeled particles, this flow being able to be introduced with the viscous medium.
Sur la figure 2c, on a représenté l'écoulement E contenant les particules marquées et non marquées PM + PNM, cet écoulement étant introduit dans un récipient représenté sur la figure 2c en vue de dessus. La vitesse de l'écoulement correspondant à une vitesse de diffusion est notée Ud .In Figure 2c, there is shown the flow E containing the marked and unmarked particles PM + PNM, this flow being introduced into a container shown in Figure 2c in top view. The flow speed corresponding to a diffusion speed is denoted Ud.
Préalablement à l'application du champ de forces pour la mise en œuvre du procédé objet de la présente invention, le récipient peut être rempli du liquide visqueux.Prior to the application of the force field for the implementation of the process which is the subject of the present invention, the container can be filled with the viscous liquid.
Sur application du champ de forces non stationnaire aux particules marquées PM, les particules non marquées PNM contenues dans le récipient se comportent alors comme un obstacle sensiblement aléatoire au flux de l'écoulement E . Le procédé objet de l'invention consiste en outre, pendant le maintien du champ de forces non stationnaire, à soumettre l'écoulement E de particules marquées et non marquées à un obstacle ou une série d'obstacles aléatoire interposé sur le trajet de l'écoulement. Ce type d'obstacle OBS peut être constitué par une matrice d'obstacles fixes, un milieu poreux ou autre.On application of the non-stationary force field to the particles marked PM, the unmarked particles PNM contained in the container then behave as a substantially random obstacle to the flow of the flow E. The process which is the subject of the invention also consists, during the maintenance of the non-stationary force field, in subjecting the flow E of marked and unmarked particles to an obstacle or a series of random obstacles interposed on the path of the flow. This type of obstacle OBS can consist of a matrix of fixed obstacles, a porous medium or the like.
Ce mode opératoire permet de soumettre les particules marquées à un phénomène de diffusion latérale amplifiée. La diffusion latérale amplifiée est ainsi engendrée sur les particules marquées dans une direction sensiblement perpendiculaire à l'écoulement E . Du fait du phénomène de diffusion latérale précité, les particules marquées sont ainsi déviées vers les zones latérales adjacentes à l'écoulement E , zones périphériques de ce dernier, alors que les particules non marquées sont sensiblement maintenues dans la zone centrale de l'écoulement précité. Ce mode opératoire permet de séparer les particules marquées et non marquées.This procedure makes it possible to subject the marked particles to an amplified lateral diffusion phenomenon. The amplified lateral diffusion is thus generated on the particles marked in a direction substantially perpendicular to the flow E. Due to the aforementioned lateral diffusion phenomenon, the marked particles are thus deflected towards the lateral zones adjacent to the flow E, peripheral zones of the latter, while the unmarked particles are substantially maintained in the central zone of the aforementioned flow. . This procedure makes it possible to separate the marked and unmarked particles.
Un mode de mise en œuvre préférentiel du procédé de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux objet de la présente invention sera maintenant décrit en liaison avec la figure 3. En référence à la figure précitée, on indique que les particules marquées peuvent avantageusement être constituées par des particules marquées magnétiquement. Lorsque le procédé objet de l'invention est mis en œuvre pour la séparation de cellules, telles que des cellules pathogènes par exemple, celles-ci peuvent être marquées au moyen de billes magnétiques de manière connue en tant que telle. A titre d'exemple non limitatif, on indique que les billes magnétiques peuvent être des billes ferro-magnétiques ou super- paramagnétiques. Dans les processus de marquage précités, les particules magnétiques sont fixées aux cellules par l'intermédiaire d'anticorps qui réagissent avec les antigènes de surface des cellules précitées. Dans ces conditions, chaque particule marquée ou chaque cellule marquée est susceptible d'acquérir, au moins en présence de l'application d'un champ magnétique, un moment magnétique noté P .A preferred embodiment of the process for the separation of marked particles in a viscous medium which is the subject of the present invention will now be described in conjunction with FIG. 3. With reference to the above-mentioned figure, it is indicated that the marked particles can advantageously be formed by magnetically marked particles. When the process which is the subject of the invention is implemented for the separation of cells, such as pathogenic cells for example, these can be labeled by means of magnetic beads in a manner known per se. By way of nonlimiting example, it is indicated that the magnetic balls can be ferro-magnetic or super-paramagnetic balls. In the abovementioned labeling processes, the magnetic particles are attached to the cells by means of antibodies which react with the surface antigens of the abovementioned cells. Under these conditions, each labeled particle or each labeled cell is capable of acquiring, at least in the presence of the application of a magnetic field, a magnetic moment denoted P.
En conséquence, le procédé objet de l'invention, ainsi que représenté de manière illustrative en figure 3, peut consister, à l'étape A de la figure 1a, à appliquer, aux particules marquées magnétiquement, un champ magnétique variable B(t) afin de permettre d'engendrer un mouvement de rotation continu ou alterné des particules marquées PM, lequel provoque, à son tour, une pluralité de flux élémentaires de fluide visqueux tournant au voisinage des particules marquées autour d'axes de rotation sensiblement orthogonaux au plan contenant le champ magnétique variable. Les flux élémentaires de liquide visqueux induisent alors l'interaction hydrodynamique dans les conditions précédemment citées dans la description. Dans un mode de réalisation préférentiel, on indique que le champ magnétique est un champ magnétique tournant d'amplitude sensiblement fixe.Consequently, the process which is the subject of the invention, as shown in an illustrative manner in FIG. 3, can consist, in step A of FIG. 1a, in applying, to the magnetically marked particles, a variable magnetic field B (t) in order to make it possible to generate a continuous or alternating rotational movement of the particles marked PM, which in turn causes a plurality of elementary flows of viscous fluid rotating in the vicinity of the marked particles around axes of rotation substantially orthogonal to the plane containing the variable magnetic field. The elementary flows of viscous liquid then induce the hydrodynamic interaction under the conditions previously mentioned in the description. In a preferred embodiment, it is indicated that the magnetic field is a rotating magnetic field of substantially fixed amplitude.
On conçoit dans ces conditions que les particules marquées PM sont mises en rotation continue ou alternée par l'intermédiaire du champ magnétique précité lorsque ce dernier est un champ tournant ou un champ variable. Le processus de séparation est alors produit par l'interaction entre particules répulsive, de friction, ou hydrodynamique par l'intermédiaire des flux voisins de liquide visqueux.It is therefore conceivable that the particles marked PM are put into continuous or alternating rotation via the aforementioned magnetic field when the latter is a rotating field or a variable field. The separation process is then produced by the interaction between repellant, friction, or hydrodynamic particles via neighboring flows of viscous liquid.
En particulier, l'interaction hydrodynamique, telle que décrite précédemment en liaison avec les figures 2a, 2b et 2c, peut être mise en œuvre :In particular, the hydrodynamic interaction, as described above in connection with Figures 2a, 2b and 2c, can be implemented:
- entre les particules elles-mêmes, en particulier avec les particules non marquées ;- between the particles themselves, in particular with the unlabeled particles;
- avec le fluide lui-même ou milieu visqueux dans lequel les particules sont immergées en suspension ;- with the fluid itself or viscous medium in which the particles are immersed in suspension;
- avec un milieu poreux ou, le cas échéant, avec des obstacles spécifiques en particulier lorsqu'un écoulement E est introduit.- with a porous medium or, where appropriate, with specific obstacles in particular when a flow E is introduced.
Lorsque, en particulier, le procédé objet de la présente invention est mis en œuvre en présence d'un phénomène de sédimentation, ainsi que représenté en figure 2a, le paramètre fondamental qui gouverne le procédé objet de la présente invention est le rapport de la vitesse de rotation de chaque particule marquée, vitesse de rotation égale à ω x a où ω désigne la vitesse angulaire de rotation des particules et a désigne le rayon moyen de chaque particule, pour chaque particule marquée prise isolément et soumise au champ magnétique rotatif, à la vitesse de sédimentation désignée U et représentée par une flèche verticale descendante en figure 2a.When, in particular, the method object of the present invention is implemented in the presence of a sedimentation phenomenon, as represented in FIG. 2a, the fundamental parameter which governs the method object of the present invention is the ratio of the speed of rotation of each marked particle, speed of rotation equal to ω xa where ω denotes the angular speed of rotation of the particles and a denotes the mean radius of each particle, for each marked particle taken in isolation and subjected to the rotating magnetic field, at the speed of sedimentation designated U and represented by a vertical downward arrow in FIG. 2a.
Dans ces conditions, pour une vitesse de sédimentation U déterminée et pour une vitesse angulaire de rotation ω de chaque particule dotée d'un rayon moyen a, le rapport de la vitesse de rotation à la vitesse de sédimentation est donné par le nombre sans dimension désigné rapport de rotation : = ûλ≤r Ce paramètre peut être ajusté soit en augmentant l'amplitude et la vitesse de rotation du champ magnétique, soit en réduisant la vitesse de sédimentation U.Under these conditions, for a determined sedimentation speed U and for an angular speed of rotation ω of each particle with an average radius a, the ratio of the speed of rotation to the speed of sedimentation is given by the dimensionless number designated rotation ratio: = ûλ≤r This parameter can be adjusted either by increasing the amplitude and the speed of rotation of the magnetic field, or by reducing the sedimentation speed U.
Pour une valeur déterminée du rapport de rotation ni précité, le temps nécessaire pour la séparation dépend bien entendu de la vitesse angulaire ω et peut ainsi être mesuré en nombre de révolutions des particules. Ce temps nécessaire à la séparation des particules marquées, compté en nombre de révolutions des particules, est constant compté en nombre de révolutions des particules. Les figures 4a à 4c représentent la mise en œuvre du procédé objet de l'invention pour ni = 1000, la séparation étant obtenue en quelques centaines de révolutions à partir d'une situation indifférenciée en figure 4a où les particules marquées et non marquées ont été introduites dans le récipient, puis soumises successivement au champ de forces au moyen d'un champ magnétique rotatif de vitesse angulaire ω en figure 4b, pour finalement produire la séparation en zone supérieure du liquide visqueux en figure 4c.For a given value of the aforementioned rotation ratio ni, the time required for the separation depends of course on the angular speed ω and can thus be measured in number of revolutions of the particles. This time necessary for the separation of the marked particles, counted in number of revolutions of the particles, is constant counted in number of revolutions of the particles. FIGS. 4a to 4c represent the implementation of the process which is the subject of the invention for ni = 1000, the separation being obtained in a few hundred revolutions from an undifferentiated situation in FIG. 4a where the marked and unmarked particles have been introduced into the container, then successively subjected to the force field by means of a rotating magnetic field of angular speed ω in FIG. 4b, to finally produce the separation in the upper zone of the viscous liquid in FIG. 4c.
Les figures 4a, 4b et 4c correspondent non pas à de simples schémas illustratifs, mais au contraire à des résultats successifs d'une simulation numérique réalisée au moyen de la dynamique de STOKES, à partir d'un programme de simulation basé sur les principes d'une telle dynamique dite STOKESIAN DYNAMICS en langage anglo-saxon.FIGS. 4a, 4b and 4c correspond not to simple illustrative diagrams, but on the contrary to successive results of a numerical simulation carried out by means of the dynamics of STOKES, from a simulation program based on the principles of '' such a dynamic called STOKESIAN DYNAMICS in Anglo-Saxon language.
La mise en œuvre du procédé objet de la présente invention dans lequel les phénomènes de diffusivité et de flottabilité mis en évidence sont décrits en liaison avec les figures 2a et 2b précédentes, ainsi que représenté en figures 4a à 4c, ne présente pas de limitation due à l'épaisseur finale du lit des particules non marquées PNM séparées, ainsi que représenté en figure 4c.The implementation of the method which is the subject of the present invention in which the phenomena of diffusivity and buoyancy highlighted are described in conjunction with the preceding figures 2a and 2b, as shown in figures 4a to 4c, does not have any limitation due at the final bed thickness of the separated PNM unmarked particles, as shown in Figure 4c.
La figure 5a représente un diagramme de probabilité par unité de volume de trouver une paire de particules dans le milieu visqueux en l'absence de gravité. La courbe A représente, pour des particules non marquées, la valeur de cette probabilité p en fonction de la distance. On constate, pour la courbe A correspondante, que, pour une distance inférieure à 2a, c'est-à-dire deux fois le rayon moyen de chaque particule, la probabilité est sensiblement nulle. Une telle probabilité, au-delà de la distance 2a, atteint une valeur déterminée, laquelle décroît ensuite en fonction de la distance des particules pour atteindre une valeur palier sensiblement constante. On comprend en effet que la probabilité est, dans ce cas, uniquement liée à des considérations géométriques et /ou de valeur relative de condition d'écoulement dans le fluide visqueux par exemple.FIG. 5a represents a probability diagram per unit of volume of finding a pair of particles in the viscous medium in the absence of gravity. Curve A represents, for unmarked particles, the value of this probability p as a function of distance. We note, for the corresponding curve A, that, for a distance less than 2a, that is to say twice the mean radius of each particle, the probability is substantially zero. Such a probability, beyond the distance 2a, reaches a determined value, which then decreases as a function of the distance of the particles to reach a substantially constant plateau value. It is in fact understood that the probability is, in this case, only linked to geometrical and / or relative value considerations of flow condition in the viscous fluid for example.
Au contraire, dans le cas de la courbe B, on constate que la distribution de probabilité d'existence de deux particules, l'une d'elles étant marquée, en fonction de la distance est sensiblement nulle sur une distance de séparation X sensiblement égale à quatre fois la distance 2a de la courbe A et que cette probabilité atteint ensuite une valeur déterminée sensiblement égale à la valeur de seuil dans le cas des particules non marquées pour atteindre sensiblement la même valeur limite de probabilité en fonction de la distance.On the contrary, in the case of curve B, we see that the probability distribution of existence of two particles, one of them being marked, as a function of the distance is substantially zero over a separation distance X substantially equal at four times the distance 2a of curve A and this probability then reaches a determined value substantially equal to the threshold value in the case of unmarked particles in order to reach substantially the same limit value of probability as a function of the distance.
Les courbes A et B de la figure 5a, obtenues de même par simulation à partir de la dynamique de STOKES, montrent ainsi que lors de la mise en œuvre du procédé objet de la présente invention sur des particules marquées, il existe toujours, au voisinage de ces dernières, lorsqu'elles sont soumises à un mouvement de rotation continu ou alterné par exemple, une distance X constitutive du voisinage de chaque particule marquée et de la région à faible densité de particules. Cette région constitue, ainsi que mentionné précédemment dans la description, avec la particule marquée associée à cette dernière, la zone soumise au phénomène de flottabilité permettant de séparer les particules marquées par utilisation du champ gravitationnel ou de centrifugation.The curves A and B of FIG. 5a, obtained likewise by simulation from the dynamics of STOKES, thus show that during the implementation of the process which is the subject of the present invention on marked particles, there always exists, in the vicinity of the latter, when they are subjected to a continuous or alternating rotational movement for example, a distance X constituting the vicinity of each marked particle and the region with low particle density. This region constitutes, as mentioned previously in the description, with the marked particle associated with the latter, the zone subjected to the buoyancy phenomenon making it possible to separate the marked particles by use of the gravitational field or of centrifugation.
Les figures 5b et 5c obtenues de même par simulation à partir de la dynamique de STOKES permettent de comprendre le mode opératoire du procédé objet de la présente invention, tel qu'illustré en figure 2c. Sur la figure 5b, on a représenté, en vue de dessus, un milieu visqueux dans lequel est introduit un écoulement E constitué par un fluide de même nature que le milieu visqueux et comportant des particules non marquées et une série d'obstacles aléatoires fixes, non représentés au dessin. Les trajectoires des particules non marquées sont représentées sur la figure 5b sur la totalité de la longueur L du récipient contenant le fluide visqueux. On constate que les particules présentent un faible degré de diffusivité latérale, les particules s'écartant légèrement, de quelques millimètres, de la trajectoire ou direction moyenne de l'écoulement E , dans une direction perpendiculaire à cet écoulement. Le phénomène de diffusivité est qualifié de latéral en raison de la non prise en compte de tout phénomène de sédimentation ou de gravité, lequel, dans le cas de la figure 5b, serait susceptible de s'exercer dans une direction orthogonale au plan de la figure 5b. A titre d'exemple non limitatif, pour une longueur L du récipient, c'est-à-dire pour un trajet d'écoulement s'exerçant sur cette longueur L égale à 2 à 3 cm par exemple, l'étalement des trajectoires, sur la distance d'étalement de trajectoires D N βst de quelques millimètres.FIGS. 5b and 5c similarly obtained by simulation from the dynamics of STOKES make it possible to understand the operating mode of the method which is the subject of the present invention, as illustrated in FIG. 2c. FIG. 5b shows a top view of a viscous medium into which is introduced a flow E constituted by a fluid of the same nature as the viscous medium and comprising unmarked particles and a series of fixed random obstacles, not shown in the drawing. The trajectories of the unmarked particles are shown in FIG. 5b over the entire length L of the container containing the viscous fluid. It is found that the particles have a low degree of lateral diffusivity, the particles slightly deviating, by a few millimeters, from the trajectory or mean direction of the flow E, in a direction perpendicular to this flow. The diffusivity phenomenon is qualified as lateral due to the fact that any sedimentation or gravity phenomenon is not taken into account, which, in the case of FIG. 5b, would be likely to be exerted in a direction orthogonal to the plane of the figure. 5b. By way of nonlimiting example, for a length L of the container, that is to say for a flow path acting on this length L equal to 2 to 3 cm for example, the spreading of the trajectories, over the trajectory spreading distance D N βst of a few millimeters.
Au contraire, ainsi que représenté en figure 5c, et pour un même écoulement E introduit dans un fluide visqueux correspondant sur une longueur L, l'écoulement E comportant également des particules marquées soumises au procédé objet de la présente invention, on constate, dans les mêmes conditions que dans le cas de la figure 5b, une diffusivité latérale beaucoup plus importante, la distance de diffusivité notée DL étant environ dans un rapport 7 à 8.On the contrary, as shown in FIG. 5c, and for the same flow E introduced into a corresponding viscous fluid over a length L, the flow E also comprising marked particles subjected to the process which is the subject of the present invention, it can be seen, in the same conditions as in the case of FIG. 5b, a much greater lateral diffusivity, the diffusivity distance denoted DL being approximately in a ratio 7 to 8.
Ainsi, les particules non marquées, lesquelles ne sont pas soumises à la variation du champ magnétique, et donc à la force non stationnaire, présentent une diffusion latérale de faible valeur, alors que les particules marquées, soumises au procédé objet de la présente invention, présentent une diffusion latérale beaucoup plus prononcée dans le rapport précité.Thus, the unmarked particles, which are not subjected to the variation of the magnetic field, and therefore to the non-stationary force, have a lateral diffusion of low value, while the marked particles, subjected to the process object of the present invention, show a much more pronounced lateral diffusion in the aforementioned report.
Dans ces conditions, et bien qu'une dérive due à la gravité puisse être mise en évidence, on comprend en particulier, ainsi que représenté schématiquement en figure 2c, que l'introduction d'un milieu poreux dans le volume contenu par le liquide visqueux permet alors de séparer les particules marquées, lesquelles sont déviées vers les zones périphériques de l'écoulement E , alors que les particules non marquées, non déviées, restent sensiblement dans la zone centrale, telle que représentée en figure 5b et donc au voisinage de l'axe de l'écoulement E .Under these conditions, and although a drift due to gravity can be demonstrated, it is understood in particular, as shown schematically in FIG. 2c, that the introduction of a porous medium into the volume contained by the viscous liquid then makes it possible to separate the marked particles, which are deflected towards the peripheral zones of the flow E, while the unmarked particles, not deflected, remain substantially in the central zone, as shown in FIG. 5b and therefore in the vicinity of the axis of the flow E.
Un justificatif quantitatif de l'intérêt de la mise en œuvre du procédé de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux, conforme à l'objet de la présente invention, au moyen d'un champ de forces non stationnaire et, en particulier, par application d'un champ magnétique variable, tel qu'un champ magnétique rotatif, vis à vis des procédés connus de l'art antérieur dans lesquels le champ magnétique utilisé est fixe, sera donné ci-après dans la description. On considère en premier lieu la mise en œuvre du procédé objet de la présente invention, tel qu'illustré en figure 2c, dans lequel la vitesse de l'écoulement correspondant à une vitesse de dérive est notée Ud .A quantitative proof of the advantage of implementing the process for the separation of marked particles in a viscous medium, in accordance with the object of the present invention, by means of a non-stationary force field and, in particular, by application of a variable magnetic field, such as a rotating magnetic field, with respect to known methods of the prior art in which the magnetic field used is fixed, will be given below in the description. We first consider the implementation of the process which is the subject of the present invention, as illustrated in FIG. 2c, in which the flow speed corresponding to a drift speed is denoted Ud.
Le paramètre rapport de rotation, nombre sans dimension, dans cette situation, est donné par la relation : n2 = -Û - (1 )The parameter rotation ratio, dimensionless number, in this situation, is given by the relation: n2 = - Û - (1)
Ud U d
Dans cette relation, ω et a, ainsi que mentionné précédemment, représentent la vitesse angulaire d'une particule isolée soumise au champ magnétique et le rayon moyen de chaque particule marquée.In this relation, ω and a, as mentioned previously, represent the angular velocity of an isolated particle subjected to the magnetic field and the mean radius of each marked particle.
La valeur quadratique moyenne de la diffusion latérale, dans ces conditions pour une géométrie et une série d'obstacles données, est une fonction de n2, rapport de rotation, la dérive due à la gravité étant en outre négligée afin de se placer dans le cas de comparaison le moins favorable.The mean quadratic value of the lateral diffusion, under these conditions for a given geometry and series of obstacles, is a function of n 2 , rotation ratio, the drift due to gravity being furthermore neglected in order to be placed in the least favorable comparison case.
Ainsi que mentionné précédemment, la valeur du paramètre rapport de rotation n2 peut être choisie à discrétion en augmentant ou en diminuant la vitesse de l'écoulement Ud . Pour une géométrie spécifique du récipient contenant le liquide visqueux, en particulier la longueur L et la largeur / de celui- ci, la longueur L étant mesurée dans la direction de l'écoulement et la largeur / dans la direction perpendiculaire à l'écoulement, et pour une valeur donnée du paramètre de rotation n2, la vitesse de séparation en nombre de rotations est proportionnelle à Ud et inversement proportionnelle à la longueur L du séparateur. Le flux de particules engendré fluxl , dans ces conditions, est de la forme :As mentioned previously, the value of the rotation ratio parameter n 2 can be chosen at will by increasing or decreasing the speed of the flow Ud. For a specific geometry of the container containing the viscous liquid, in particular the length L and the width / of the latter, the length L being measured in the direction of flow and the width / in the direction perpendicular to the flow, and for a given value of the rotation parameter n 2 , the separation speed in number of rotations is proportional to Ud and inversely proportional to the length L of the separator. The flow of particles generated fluxl, under these conditions, is of the form:
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000018_0001
Dans cette relation, le symbole α indique une relation de proportionnalité. Le couple mécanique appliqué à chaque particule marquée est proportionnel, en référence à la figure 3, à la valeur du moment magnétiqueIn this relation, the symbol α indicates a relation of proportionality. The mechanical torque applied to each marked particle is proportional, with reference to Figure 3, to the value of the magnetic moment
P à l'amplitude B du champ magnétique et au sinus de leur angle, lequel dépend de la propriété d'hystérésis des particules ferro-magnétiques notamment. A partir des formules pour la rotation, un ordre de grandeur de la valeur du flux 1 est donné par la relation (3) :P to the amplitude B of the magnetic field and to the sine of their angle, which depends on the hysteresis property of the ferro-magnetic particles in particular. From the formulas for the rotation, an order of magnitude of the value of flow 1 is given by the relation (3):
flux λ a ^ a BF (3)flux λ a ^ a BF (3)
L Ln2a2η L Ln 2 a 2 η
Dans cette relation, ή désigne la valeur de la viscosité du fluide visqueux et n2 désigne la valeur du rapport de rotation précédemment mentionnée dans la description. P désigne la valeur du moment magnétique et B la valeur ou amplitude du champ magnétique.In this relation, ή denotes the value of the viscosity of the viscous fluid and n 2 denotes the value of the rotation ratio previously mentioned in the description. P denotes the value of the magnetic moment and B denotes the value or amplitude of the magnetic field.
En comparaison, et pour un dispositif semblable de l'art antérieur permettant d'appliquer un champ magnétique B sensiblement stationnaire, une déflection des particules marquées d'un angle θ par rapport à l'axe central de l'écoulement étant obtenue, la valeur de l'angle de déflection θ vérifie la relation : tan(0 ') α- π™ηaUd- (4) 'In comparison, and for a similar device of the prior art making it possible to apply a substantially stationary magnetic field B, a deflection of the particles marked by an angle θ relative to the central axis of the flow being obtained, the value deflection angle θ checks the relation: tan (0 ') α- π ™ ηaUd- (4)'
Dans la relation précédente, les mêmes paramètres désignent les mêmes entités que dans le cas des relations précédentes relatives au flux 1 , l'entité V2? désignant le gradient du champ magnétique, dans la direction perpendiculaire à la direction de l'écoulement.In the previous relationship, the same parameters designate the same entities as in the previous relationships relating to flow 1, the entity V2? designating the gradient of the magnetic field, in the direction perpendicular to the direction of flow.
Pour des valeurs d'angle de déflection θ et de longueur L du milieu visqueux dans lequel le processus de séparation est mis en œuvre, l'expression du flux de particules flux 2 est de la forme : (5)
Figure imgf000019_0001
For values of deflection angle θ and length L of the viscous medium in which the separation process is implemented, the expression of the flow of particles flow 2 is of the form: (5)
Figure imgf000019_0001
Pour des dimensions sensiblement identiques de mise en œuvre du procédé dans le cas du procédé objet de la présente invention au moyen d'un champ magnétique non stationnaire respectivement au moyen d'un champ de valeur fixe de l'art antérieur, le rapport des flux de particules s'écrit flux1/flux2 de la forme : a _ B_ (6) flux2 a B 'For substantially identical dimensions of implementation of the method in the case of the method which is the subject of the present invention by means of a non-stationary magnetic field respectively by means of a fixed value field of the prior art, the ratio of the fluxes of particles is written flux1 / flux2 of the form: a _ B_ (6) flux2 a B '
A l'observation de la relation (6), et à supposer que l'on applique un champ magnétique B de même amplitude dans les deux cas, en estimant le gradient de champ magnétique sur un séparateur de largeur /, la valeur du gradient de champ magnétique VB est de l'ordre de S/1.On observing the relation (6), and supposing that a magnetic field B of the same amplitude is applied in both cases, by estimating the magnetic field gradient on a separator of width /, the value of the gradient of magnetic field VB is of the order of S / 1.
Dans ces conditions, la relation précédente (6) s'écrit selon la relationUnder these conditions, the previous relation (6) is written according to the relation
(7) : fl 1 a ^B_ = L m flux2 aBIl a ' Ainsi, et par comparaison du procédé objet de l'invention au procédé de séparation de l'art antérieur, il apparaît que le rapport des flux de particules marquées dans les deux cas est égal au rapport de la largeur /, ou dimension orthogonale à la direction d'écoulement, au rayon moyen de chaque particule a. Pour une largeur / de l'ordre de 1 mm et pour un rayon de particules élémentaire de l'ordre d'un micromètre, le procédé objet de la présente invention présente donc un gain d'un facteur 1000 par rapport au procédé de l'art antérieur. En particulier, en raison du fait qu'il n'est pas nécessaire d'engendrer un gradient de champ magnétique, le procédé objet de la présente invention permet de travailler sur des échantillons beaucoup plus larges et, en définitive, sur un nombre beaucoup plus important de cellules marquées et non marquées. Ainsi, alors que le nombre de cellules marquées, en particulier lorsque ces cellules sont pathogènes par exemple, peut être très faible, ceci permet d'effectuer une séparation de cellules marquées, alors que le nombre de cellules marquées et donc pathogènes est encore très faible en proportion, par rapport aux cellules non marquées. Une description plus détaillée d'un séparateur constitutif d'un appareil mettant en œuvre le procédé objet de la présente invention et spécialement adapté à la mise en œuvre de ce dernier sera maintenant donnée en liaison avec la figure 6, dans le cas où un écoulement E est introduit dans le milieu visqueux.(7): fl 1 a ^ B_ = L m flux2 aBIl a 'Thus, and by comparison of the process which is the subject of the invention with the separation process of the prior art, it appears that the ratio of the flows of labeled particles in the two cases is equal to the ratio of the width /, or dimension orthogonal to the direction of flow, to the mean radius of each particle a. For a width / of the order of 1 mm and for an elementary particle radius of the order of one micrometer, the process which is the subject of the present invention therefore has a gain of a factor of 1000 compared to the process of prior art. In particular, due to the fact that it is not necessary to generate a magnetic field gradient, the method which is the subject of the present invention makes it possible to work on much larger samples and, ultimately, on a much larger number. important of marked and unlabeled cells. Thus, while the number of labeled cells, in particular when these cells are pathogenic for example, can be very low, this makes it possible to carry out a separation of marked cells, while the number of labeled cells and therefore pathogenic is still very low in proportion, compared to unlabeled cells. A more detailed description of a separator constituting an apparatus implementing the method which is the subject of the present invention and specially adapted to the implementation of the latter will now be given in connection with FIG. 6, in the case where a flow E is introduced into the viscous medium.
Dans ces conditions, on indique que le séparateur comporte un récipient 1.Under these conditions, it is indicated that the separator comprises a container 1.
Le récipient 1 comporte une fenêtre d'entrée FΕ d'admission de l'écoulement E . Le récipient 1 présente une longueur L et une largeur / dans la direction perpendiculaire à l'écoulement E . Une fenêtre de sortie FS est prévue à l'opposé de la fenêtre d'entrée FΕ et sensiblement en vis à vis de celle-ci. Des ajutages latéraux notés FL1 , FL2 sont prévus, lesquels mettent en relation l'intérieur du récipient 1 avec des orifices de sortie, les ajutages latéraux FL1 et FL2 ayant leur entrée placée au voisinage de la périphérie du récipient 1 , à hauteur de la fenêtre de sortie FS.The container 1 comprises an inlet window FΕ for admitting the flow E. The container 1 has a length L and a width / in the direction perpendicular to the flow E. An outlet window FS is provided opposite the inlet window FΕ and substantially opposite the latter. Lateral nozzles denoted FL1, FL2 are provided, which connect the interior of the container 1 with outlet orifices, the lateral nozzles FL1 and FL2 having their inlet placed near the periphery of the container 1, at the height of the window FS output.
La longueur L du récipient 1 peut être de 1 à 2 cm par exemple et la largeur / de quelques millimètres. En outre, des solénoïdes S1, S2 et S3, S4 sont disposés en opposition et décalés de π/2 dans le plan de la figure 6, les solénoïdes S1 , S2 et S3, S4 étant alimentés par une tension alternative de manière à engendrer un champ magnétique tournant B(t) , lequel est par exemple dans le plan de la figure 6. Enfin, un obstacle OBS, tel qu'une matrice poreuse ou, le cas échéant, une brosse munie de poils orthogonaux au plan de la figure 6, peut également être introduite afin de former l'obstacle à l'écoulement E dans le récipient 1. En référence à la figure 2c, on indique que le séparateur représenté en figure 6 permet d'assurer la déviation des particules PM vers la périphérie interne du récipient 1 et finalement vers les ajutages latéraux FL1 et FL2 par exemple, alors que les particules non marquées PNM ne sont sensiblement pas déviées et peuvent donc être recueillies au niveau de la fenêtre de sortie FS. Dans le cas où une brosse est constitutive de l'obstacle OBS, les poils de la brosse peuvent avantageusement être orientés perpendiculairement à la fois à l'axe de l'écoulement E et au plan contenant le champ magnétique tournant ) . The length L of the container 1 can be 1 to 2 cm for example and the width / a few millimeters. In addition, solenoids S1, S2 and S3, S4 are arranged in opposition and offset by π / 2 in the plane of FIG. 6, the solenoids S1, S2 and S3, S4 being supplied by an alternating voltage so as to generate a rotating magnetic field B (t), which is for example in the plane of FIG. 6. Finally, an OBS obstacle, such as a porous matrix or, if necessary, a brush provided with bristles orthogonal to the plane of FIG. 6 , can also be introduced to form the obstacle to the flow E in the container 1. With reference to FIG. 2c, it is indicated that the separator shown in FIG. 6 makes it possible to ensure the deflection of the PM particles towards the internal periphery from the container 1 and finally to the lateral nozzles FL1 and FL2 for example, while the unmarked particles PNM are not substantially deviated and can therefore be collected at the exit window FS. In the case where a brush constitutes the OBS obstacle, the bristles of the brush can advantageously be oriented perpendicular both to the axis of the flow E and the plane containing the rotating magnetic field).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux, ce milieu visqueux comprenant des particules marquées et des particules non marquées, ces particules marquées et non marquées, en suspension dans ce milieu visqueux, étant soumises ou non à un phénomène de diffusion, caractérisé en ce qu'il consiste : a) à soumettre lesdites particules marquées à un champ de forces non stationnaire pour engendrer un mouvement de rotation continu ou alterné des particules marquées au sein dudit milieu visqueux ; b) à maintenir ledit champ de forces non stationnaire pour maintenir ledit mouvement de rotation des particules marquées ou des éléments de marquage au sein dudit milieu visqueux et engendrer, par interaction hydrodynamique avec lesdites particules marquées et non marquées au voisinage des particules marquées, un accroissement de diffusivité des particules, ce qui permet, de séparer une zone enrichie en particules marquées.1. A method of separating marked particles in a viscous medium, this viscous medium comprising marked particles and unlabeled particles, these marked and unlabeled particles, in suspension in this viscous medium, being subjected or not to a diffusion phenomenon, characterized in that it consists: a) in subjecting said labeled particles to a non-stationary force field to generate a continuous or alternating rotational movement of the labeled particles within said viscous medium; b) maintaining said non-stationary force field in order to maintain said rotational movement of the marked particles or of the marking elements within said viscous medium and to generate, by hydrodynamic interaction with said marked and unmarked particles in the vicinity of the marked particles, of diffusivity of the particles, which makes it possible to separate an area enriched in marked particles.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'interaction hydrodynamique permet d'engendrer, au voisinage de chaque particule marquée, une région à faible densité de particules, chaque région à faible densité de particules et la particule marquée associée à celle-ci étant soumise à un phénomène de flottabilité, ce qui permet de séparer lesdites particules marquées.2. Method according to claim 1, characterized in that the hydrodynamic interaction makes it possible to generate, in the vicinity of each labeled particle, a region with low particle density, each region with low particle density and the labeled particle associated with that this being subjected to a buoyancy phenomenon, which makes it possible to separate said labeled particles.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit phénomène de flottabilité est engendré par l'intermédiaire du phénomène de gravité. 3. Method according to claim 2, characterized in that said buoyancy phenomenon is generated through the phenomenon of gravity.
4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que ledit phénomène de flottabilité est engendré par l'intermédiaire d'une centrifugation.4. Method according to claim 2 or 3, characterized in that said buoyancy phenomenon is generated by means of centrifugation.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que, pour un milieu visqueux comportant une zone à densité relative plus faible en particules, ladite interaction hydrodynamique permet d'engendrer une migration de chaque particule marquée vers ladite zone à densité relative plus faible, ce qui permet de séparer lesdites particules marquées dans ladite zone à densité relative plus faible en particules. 5. Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that, for a viscous medium comprising an area with a relative density lower in particles, said hydrodynamic interaction makes it possible to generate a migration of each marked particle towards said area to lower relative density, which makes it possible to separate said marked particles in said zone with lower relative density in particles.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite zone à densité relative plus faible en particules est engendrée par sédimentation.6. Method according to claim 5, characterized in that said zone with a relative density lower in particles is generated by sedimentation.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que, pour un phénomène de diffusion correspondant sensiblement à un écoulement des particules marquées et non marquées, celui-ci consiste en outre, pendant le maintien dudit champ de forces non stationnaire, à soumettre ledit écoulement des particules marquées et non marquées à au moins un obstacle, interposé sur le trajet dudit écoulement, de façon à soumettre lesdites particules marquées à un phénomène de diffusion latérale amplifiée dans une direction sensiblement perpendiculaire audit écoulement, lesdites particules marquées étant sensiblement déviées, du fait de cette diffusion latérale, vers les zones périphériques dudit écoulement et lesdites particules non marquées étant sensiblement maintenues dans la zone centrale dudit écoulement, ce qui permet de séparer lesdites particules marquées et non marquées. 7. Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that, for a diffusion phenomenon corresponding substantially to a flow of the marked and unmarked particles, this further consists, during the maintenance of said non-force field stationary, subjecting said flow of marked and unmarked particles to at least one obstacle, interposed on the path of said flow, so as to subject said marked particles to a phenomenon of lateral diffusion amplified in a direction substantially perpendicular to said flow, said marked particles being substantially deflected, due to this lateral diffusion, towards the peripheral zones of said flow and said unmarked particles being substantially maintained in the central zone of said flow, which makes it possible to separate said marked and unmarked particles.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que lesdites particules marquées étant constituées par des particules marquées magnétiquement, ladite étape a) consiste à appliquer auxdites particules marquées magnétiquement un champ magnétique variable, ce qui permet d'engendrer une pluralité de flux élémentaires de fluide visqueux au voisinage desdites particules marquées en mouvement dont l'axe de rotation est sensiblement orthogonal au plan contenant ledit champ magnétique variable, les flux élémentaires de liquide visqueux provoquant ladite interaction hydrodynamique.8. Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that said marked particles being constituted by magnetically marked particles, said step a) consists in applying to said magnetically marked particles a variable magnetic field, which makes it possible to generate a plurality of elementary flows of viscous fluid in the vicinity of said particles marked in movement whose axis of rotation is substantially orthogonal to the plane containing said variable magnetic field, the elementary flows of viscous liquid causing said hydrodynamic interaction.
9. Procédé selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que pour une vitesse de sédimentation U déterminée, une vitesse angulaire de rotation ω et un rayon moyen a desdites particules marquées, le rapport de la vitesse de rotation à la9. Method according to one of claims 2 to 7, characterized in that for a determined sedimentation speed U, an angular speed of rotation ω and an average radius of said marked particles, the ratio of the speed of rotation to the
_ ω.a vitesse de sédimentation est_ ω. the sedimentation rate is
U _, donne par : le temps nécessaire à la séparation des particules marquées à géométrie et pour une valeur ni données, en nombre de révolutions desdites particules, est sensiblement constant.U _, given by: the time necessary for the separation of the particles marked with geometry and for a given value ni, in number of revolutions of said particles, is substantially constant.
10. Dispositif séparateur de particules marquées dans un milieu visqueux comprenant des particules marquées magnétiquement et des particules non marquées, caractérisé en ce qu'il comporte au moins :10. Device for separating marked particles in a viscous medium comprising magnetically marked particles and unmarked particles, characterized in that it comprises at least:
- un récipient contenant ledit liquide visqueux, ce récipient comportant une fenêtre d'entrée d'un écoulement d'un flux de particules marquées et non marquées ; - une fenêtre de sortie placée sensiblement en vis à vis de ladite fenêtre d'entrée dans la direction de l'écoulement et des fenêtres latérales de sortie placées au voisinage de la paroi latérale interne dudit récipient à hauteur de la fenêtre de sortie ;- A container containing said viscous liquid, this container comprising an inlet window for a flow of a flow of marked and unmarked particles; - An outlet window placed substantially opposite said inlet window in the direction of flow and lateral outlet windows placed in the vicinity of the internal side wall of said container at the height of the outlet window;
- des moyens d'application d'un champ magnétique non stationnaire, ladite fenêtre de sortie permettant de recueillir lesdites particules non marquées et lesdites fenêtres latérales permettant de recueillir lesdites particules marquées magnétiquement, lors de l'application dudit champ magnétique non stationnaire audit écoulement.- Means for applying a non-stationary magnetic field, said outlet window making it possible to collect said unmarked particles and said side windows making it possible to collect said magnetically marked particles, during the application of said non-stationary magnetic field to said flow.
11. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit récipient comporte en outre au moins un obstacle à l'écoulement, constitué par une matrice poreuse, une brosse à poils sensiblement orientés, ledit obstacle remplissant au moins partiellement ledit récipient. 11. Device according to claim 10, characterized in that said container further comprises at least one obstacle to the flow, constituted by a porous matrix, a brush with bristles substantially oriented, said obstacle at least partially filling said container.
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