WO2003014346A2 - Hochdurchsatz dna-isolierung und -transfektion zur analyse der funktion von genen bzw. genprodukten - Google Patents

Hochdurchsatz dna-isolierung und -transfektion zur analyse der funktion von genen bzw. genprodukten Download PDF

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WO2003014346A2
WO2003014346A2 PCT/EP2002/008962 EP0208962W WO03014346A2 WO 2003014346 A2 WO2003014346 A2 WO 2003014346A2 EP 0208962 W EP0208962 W EP 0208962W WO 03014346 A2 WO03014346 A2 WO 03014346A2
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WO
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dna
robot
cells
screening
microtiter plates
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Application number
PCT/EP2002/008962
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English (en)
French (fr)
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WO2003014346A3 (de
Inventor
Ulrich Pessara
Michael Kazinski
Johannes GÖRL
Original Assignee
Xantos Biomedicine Ag
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Publication date
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Publication of WO2003014346A3 publication Critical patent/WO2003014346A3/de
Priority to US10/773,100 priority patent/US20040265855A1/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a collection of nucleic acid molecules for a desired property of the nucleic acid or a (poly) peptide encoded thereby, comprising the steps (a) automated picking a collection of cells containing the collection of nucleic acid molecules by means of a first robot; (b) automated lysis of the cells using a second robot; (c) automated separation of the cell DNA from the cell debris using the second robot; (d) optionally automated separation of endotoxins from the DNA by means of the second robot if the cells are bacteria; (e) automated transfection of cells with the DNA obtained in step (c) or, if the cells are bacteria, in step (d) using a third robot; and (f) automated screening for the desired property using a fourth robot.
  • the invention further relates to a method for improving the binding properties of the (poly) peptide, which is identified by the screening method according to the invention or encoded by the identified or isolated DNA, and to a method for producing a medicament based on (poly) obtainable by the method according to the invention.
  • peptides and also the formulation of the substance obtained with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent are also the formulation of the substance obtained with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • High-throughput screening has been a tried and tested tool for finding potential active substances in pharmaceutical research for years.
  • the transfer of high-throughput technology to processes such as DNA isolation from bacteria and the transfection of cellular systems is a relatively new approach. It is especially the screening of cDNA libraries of interest.
  • the screening of cDNA or generic libraries, which are usually cloned in bacteria, requires a process which can generally be divided into four stages and 1) picking the bacterial colonies, 2) DNA preparation, 3) DNA transfection and 4) includes reading a functional test.
  • DNA is usually isolated from bacteria using two different methods: alkaline lysis of bacteria with subsequent purification of the DNA obtained via columns or adhesion of the DNA obtained from alkaline lysis to special microparticles (so-called “beads”).
  • Appropriate methods are designed for implementation in the laboratory or on pipetting machines for a low sample throughput.
  • the daily throughput varies and, depending on the method, is limited to a maximum of 3000-6000 preparations per day. Due to the limited sample throughput, these methods are not suitable for high throughput.
  • DNA can be introduced into the cell by producing cell membrane-permeable DNA complexes or by penetrating or fusing with the cell membrane. Physical methods such as magnetofection or electroporation are also suitable for high-pressure applications. Individual stages of screening processes in complex libraries can already be carried out in automated form. Appropriate devices are available from Beckman Coulter or Tecan. The Biomek 2000 (Beckman Coulter; Fullerton, USA) and the Genesis (Tecan; Durham, USA) are semi-automated work platforms for the use of microtiter plates. These systems represent general working platforms that can be adapted, for example, for use in DNA preparation.
  • EP 569 115 A2 describes an automated high-throughput DNA preparation system for the use of microtiter plates.
  • the integration of modified centrifuges enables DNA preparation after alkaline lysis.
  • this method already represents an improvement over the processes from the prior art described above.
  • a degree of purity of the DNA is not achieved.
  • One reason for this is that the DNA is still contaminated by endotoxins.
  • this system like the Genesis (Tecan) and the Biomek 2000 (Beckman) systems, is not designed as a conveyor belt system or can be expanded as such. It is therefore not possible to nest the individual work steps.
  • the sample throughput of the aforementioned systems is thus limited to about 3000-6000 preparations / day at most.
  • PCT / EPOO / 00683 describes a method for identifying nucleic acid sequences which have a non-selectable activity.
  • the method comprises the steps from the preparation of the DNA library to the cultivation of the host cells, the DNA preparation, transfection of the target cells with the target DNA to the functional determination of the activity of the DNA in the target cell.
  • This application already represents a process that one certain degree of automation of the DNA preparations.
  • Embodiments for two robots, each of which can carry out DNA preparation and DNA transfection, are shown accordingly. With this method, sample throughputs in the order of more than 10 3 preparations per day can also be achieved.
  • PCT / EP00 / 13132 describes a screening method for nucleic acids, which also includes nucleic acids with selectable activity. In addition to the screening process, the automation of the process and a preferred embodiment for carrying out the DNA preparation and DNA transfection with the aid of individual robots are also recorded. This method can also be used to run sample throughputs in the aforementioned range.
  • the invention relates to a method for screening a collection of nucleic acid molecules for a desired property of the nucleic acid or one of them encoded (poly) peptide, comprising the steps (a) automated picking of a collection of cells containing the collection of nucleic acid molecules by means of a first robot; (b) automated lysis of the cells using a second robot; (c) automated separation of the cell DNA from the cell debris using the second robot; (d) optionally, automated separation of endotoxins from the DNA by means of the second robot if the cells are bacteria; (e) automated transfection of cells with the DNA obtained in step (c) or, if the cells are bacteria, in step (d) using a third robot; and (f) automated screening for the desired property using a fourth robot.
  • Step (d) of the method according to the invention is optional. Especially when the sensitivity of the preferably eukaryotic cells to be transfected to endotoxin is low, it is preferably carried out, but can also be omitted.
  • the method according to the invention comprises either steps (a), (b), (c), (d), (e) and (f) or the sequence of steps (a), (b), (c), (e) and (f).
  • step (d ') following step (e) and step (e') following step (f ) corresponds.
  • selection in the sense of this invention relates to a number of nucleic acid molecules beyond 10 3 different molecules, preferably at least 10 4 different molecules, more preferably from at least 10 5 different molecules and particularly preferably from 10 6 different molecules such as 2x10 6 or 3x10 6 different molecules.
  • nucleic acid molecules are preferably coding regions together with homologous or heterologous expression control sequences. It is particularly preferred that they represent or essentially represent the genome of an organism.
  • This organism can be a prokaryote, for example a bacterium, or a eukaryote, for example a yeast. If the organism is a Eukaryote, in a preferred embodiment it is a mammal, for example a human.
  • polypeptide describes both peptides and polypeptides (proteins).
  • a chain of up to 30 amino acids is referred to as a peptide and a chain of more than 30 amino acids as a polypeptide.
  • Step is not carried out by human hands, but purely by machine.
  • cell debris means the mass of cell components obtained after lysis of a cell, which, for example, is obtained by centrifugation
  • 3000 x g of aqueous supernatant, which contains the DNA, can be separated.
  • Cell debris usually contains proteins and, in bacteria,
  • robot means automated work station with gripper arms and specific product processing stations such as Centrifuges, incubation places etc.
  • a screening method in which the four procedural steps of colony picking, DNA preparation, DNA transfection and the reading out of a functional screening assay are carried out automatically by robots, thereby enabling an overall process that is automated for high-throughput screening.
  • the automated removal of endotoxins, preferably with the aid of magnetic microparticles, is to be considered as an essential component of this method in one embodiment (ie the embodiment including step (d)). Only in this way, in combination with the other automated steps, is a time-acceptable framework for high-throughput screening of libraries with a high degree of complexity achieved.
  • the purification of the DNA from endotoxins is in this embodiment an essential requirement.
  • the separation of the endotoxins is not essential. This is particularly the case when the cells to be transfected are less sensitive to endotoxins and are therefore not significantly impaired or killed by endotoxin contamination in conventional DNA purification processes.
  • a sample throughput of up to 30,000 / 40,000 samples per day can be achieved for the first time.
  • the combination of serial production technology with the components described can generate a throughput which has hitherto not been achieved in the production of transfectable DNA.
  • These can be examined for their biological function using the same high-throughput method after transfection in preferably eukaryotic cells. This enables a complete cDNA library to be screened within one month.
  • the collection of nucleic acid molecules is a gene bank.
  • gene bank is known in the prior art and is defined in Winnacker, "Genes and Clones", VCH Weinheim 1985 (p. 403) as "collection of cloned DNA fragments which represent an entire genome".
  • the invention also includes those gene banks which have holes, i.e. do not represent the entire genome or which are at an expression stage, e.g. of a certain tissue, a stage of disease or development, etc.
  • the nucleic acid molecules are genomic DNA or cDNA molecules or RNAi Oligonucleotides.
  • RNAi Oligonucleotides are synthesized, for example, by Dharamcon (LaFayette, USA) Xeragon (Germantown, USA) or Ambion (Austin, USA).
  • the library is an expression cDNA library, preferably a eukaryotic library, particularly preferably a human library.
  • expression cDNA library is also well understood in the prior art.
  • the cDNA molecules are cloned in an expression vector which enables their expression in a suitable host; see. Winnacker, op. Cit. or Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual”; CSH Press, Gold Spring Harbor 1989.
  • the gene bank is preferably normalized (i.e. the genes contained in the gene bank are present in almost the same number) and / or are enriched for “full length cDNA”.
  • the collection of nucleic acids is a collection of clones.
  • a clone collection is to be understood as a collection of selected cDNA clones, which preferably contains "full-length cDNA".
  • the cells in step (a) and / or step (e) are mammalian cells, insect cells, Yeast cells or bacteria.
  • mammalian cells examples include COS cells, HUVEC cells, Aspergillus (niger / nidulans etc.) cells or CHO cells.
  • insect cells examples include Spodoptera frugiperda cells.
  • yeast cells include those of the species S. cerevisiae or P. pastoris.
  • Suitable bacteria can be both gram-negative and gram-positive.
  • the bacteria are gram-negative bacteria.
  • the particularly advantageous properties of the method according to the invention come into play particularly in the case of gram-negative bacteria, since in particular these have endotoxins as components of the cell wall or cell membrane.
  • bacteria of the type E. coli in particular are used for cloning purposes in the prior art.
  • the gram-negative bacteria therefore belong to the type E. coli.
  • E. coli DH5 ⁇ , E. coli Shure and E. coli JM 109 are particularly preferred.
  • steps (a) to (f) are carried out in microtiter plates.
  • Microtiter plates have the advantage that they have a standardized size regardless of the number of wells ("holes"), which makes them particularly suitable for automated handling by robots.
  • Microtiter columns (available, for example, from Nunc) usually consist of PVC or polystyrene. They can have 6, 24, 96, 384 or 1536 wells. Microtiter plates with 96 or 384 wells are preferably used in the method according to the invention.
  • all steps (a) to (f) are carried out in microtiter plates.
  • the microtiter plates are provided with barcodes.
  • This embodiment is particularly advantageous because it enables complete "tracking" of all plates, even after changing from one robot to the next.
  • An assignment can thus be particularly simple and time-preserving way from plating out the cells for processing by the first robot to functional screening and read-out by the fourth robot. After functional screening has been carried out, the starting clones on the sample plate can be readily accessed.
  • the barcode technology on robots 2 and 3 also enables the individual processes to be nested within the conveyor belt system.
  • the first robot is characterized by at least one and preferably all of the following features (a) digital image processing system for detecting the plated bacteria, (b) work station with gripper arm for microtiter plates for transferring the microtiter plates between the processing stations , (c) separation module, provided with one or more needle-tipped heads for picking plated single colonies and storage in microtiter plates, (d) integrated product processing stations for cleaning the needles between the work steps and replication of the deposited single colonies in microtiter plates and (e) Computerized bar code (“barcode”) identification and tracking system (“tracking").
  • the microtiter plates are preferably 96- or 384-well plates.
  • the integrated product processing stations include a sterilization system. It is further preferred that the gripping arm is a robot arm which is provided with at least two heads equipped with tips, the heads being used alternately for pecking and being cleaned on the sterilization station. A modular structure of the robot arm is also preferred, which enables an exchange of gripper arm modules for separation head modules.
  • the lysis is an alkaline lysis.
  • the implementation of the alkaline lysis is described in Sambrook loc. Cit. As well as elsewhere in this description.
  • the second robot is characterized by at least one and preferably all of the following features (a) conveyor belt transport system combined with gripping arms for microtiter plates for reloading the products and transfer of the microtiter plates between the product processing stations, (b) product processing stations integrated in the transport system , in particular centrifuges, automatic pipetting machines, shakers and incubation places for incubation at different temperatures, (c) sensors for the detection of product positions as well as for error detection, (d) software for nested processing of several processes in the machine for a continuous production operation and (e) Computer-assisted bar code (“barcode”) identification and tracking system (“tracking”) preferably with internal product tracking, which has a time stamp (“timestamp”) function for various respect time-critical subprocesses.
  • barcode bar code identification and tracking system
  • microtiter plates are 96, 384 or 1536 perforated plates.
  • the cell DNA is separated in step (c) by means of silica particles.
  • the term "separation of the cell DNA by means of silica particles” means that the cell DNA (i.e. plasmid DNA or, in an alternative embodiment, chromosomal DNA) is bound to these particles and is separated from the cell debris.
  • the separation step is therefore a purification step.
  • the silica particles can be easily separated from the cell debris by centrifugation.
  • the silica particles are magnetic silica particles.
  • the embodiment is particularly preferred because the magnetic particles can be separated from the cell debris and other supernatant in a simple manner by using a magnet.
  • Corresponding methods are described, for example, in US Pat. No. 6,027,945 and WO 98/31840.
  • the endotoxins are removed in step (d) by precipitation with SDS / isopropanol.
  • a suitable composition is 2.5% SDS in isopropanol.
  • the DNA bound to silica particles is further purified by washing with acetone.
  • the endotoxins are separated in step (d) by means of endotoxin-binding particles, which are preferably magnetic endotoxin-binding particles.
  • the endotxon-binding particles can preferably be configured as magnetic particles.
  • the transfection of cells in step (e) is mediated by calcium phosphate, electroporation or by lipofection.
  • the transfection of cells in step (e) is mediated by calcium phosphate or lipofection.
  • Lipofection can be mediated by lipids, liposomes or lipid combinations. Examples are Effectene (Qiagen; Hilden), Fugene (Röche, Basel), Metafectene (Biontex), Lipofectamine or Lipfectamine 2000, Lipofectin, Oligofectamine (Invitrogen, Düsseldorf). Metafecten, oligofectamine or calcium phosphate are particularly suitable for the transfection of RNAi oligonucleotides.
  • the transfection is carried out by means of DNA-binding magnetic biocompatible microparticles.
  • biocompatible microparticles refers to microparticles that are biologically inert or that can be broken down in the cell.
  • modified magnetic microparticles can be used in the DNA preparation step, which can then be used directly for transfection.
  • the method referred to below as magnetotransfection is based on the following parameters:
  • the transfectable DNA is bound to biocompatible, magnetic microparticles.
  • the microparticles with the bound DNA are applied to the cell cultures.
  • the DNA-microparticle complexes are concentrated on the cell surface and absorbed into the cell via endocytotic processes.
  • the DNA microparticles can be introduced into the cell / cell nucleus by strengthening the magnetic field.
  • Such a method of magnetotransfection is known in the prior art and is described, for example, in PCT / EP01 / 07261.
  • the effectiveness of this method can be improved by using lipophilic uptake enhancers e.g. can be further increased by lipofectamine.
  • the magnetic concentration of the complexes or the introduction of the DNA microparticles into the cell / cell nucleus on the cell surface has a significant effect increased transfection efficiency.
  • the amount of sample (DNA) used can be reduced and, with regard to the amount used in a high-throughput system, enables considerable cost savings.
  • the transfection process can be carried out on a robot system which has similar specifications to the robot system used for DNA preparation.
  • the process steps can be further reduced and the overall process can be accelerated.
  • This preferred embodiment provides a high-throughput transfection system with which a daily throughput of up to 40,000 samples per day can be realized in a particularly cost-effective and time-saving manner.
  • the third robot is characterized by at least one and preferably all of the following features (a) conveyor belt transport system combined with gripping arms for microtiter plates for reloading the products and transfer of the microtiter plates between the product processing stations, (b) product processing stations integrated in the transport system , in particular pipetting stations, shakers, incubation stations and incubator for cultivating the transfectants, (c) sensors for the detection of product positions and for error detection, (d) sterile positive pressure ventilation to prevent contamination of the cell cultures, (e) software for the nested processing of several in the Machine-based processes for continuous production operation and (f) Compute.r-supported bar code (“barcode”) - identification and tracking system (“tracking”), preferably with an internal one Product tracking that includes a timestamp function for nesting time-critical subprocesses.
  • barcode bar code
  • tracking Compute.r-supported bar code
  • the fourth robot is characterized by at least one and preferably all of the following features (a) system for determining fluorescence, luminescence or color reactions from cell culture assays, (b) pipetting station with Gripping arm for microtiter plates for transferring the microtiter plates from the incubator to and between the product processing stations, (c) processing stations for adding and aspirating cell culture media or reagents and incubation in the incubator and (d) computer-assisted bar code (“barcode”) - Identification and tracking system (“tracking").
  • the system is preferably an ELISA reader or a microtiter plate imaging system. It is further preferred that the system is suitable for determining the cell morphology. As with the other robots, it is preferred that the microtiter plate have 96 or 384 wells. In addition to the processing stations for the addition and suction of cell culture media etc., the robot can have further product processing stations, such as Shakers, incubator places.
  • the fourth robot is characterized by at least one and preferably all of the following features (a) digital image processing system and image acquisition system for determining line morphology, luminescence and / or fluorescence, (b) pipetting station with gripping arm for microtiter plates to transfer the microtiter plates from the incubator to and between the product processing stations, (c) processing stations for adding and aspirating cell culture media or reagents and incubation in the incubator and (d) computer-aided bar code (“barcode”) - identification and Tracking system.
  • digital image processing system and image acquisition system for determining line morphology, luminescence and / or fluorescence
  • pipetting station with gripping arm for microtiter plates to transfer the microtiter plates from the incubator to and between the product processing stations
  • processing stations for adding and aspirating cell culture media or reagents and incubation in the incubator
  • barcode computer-aided bar code
  • image processing system is to be understood as a system that is able to automatically detect and analyze differences in luminescence or fluorescence properties and differences in morphology of the cells to be examined.
  • the data processing of such a system is primarily based on neural networks or other digital image analysis algorithms corresponding to the state of the art.
  • image acquisition system is to be understood as an automated microscopy station that is capable of generating images of the cells to be examined by means of camera or “scanning” systems.
  • automatic screening is functional screening.
  • the term “functional screening” means that the nucleic acid, such as DNA or the (poly) peptide encoded thereby, is tested for a function.
  • An RNA can be tested for a ribozyme, an anti-sense property or for the binding property in the sense of an aptamer.
  • the encoded (poly) peptide is predominantly tested for a desired property.
  • RNAi oligonucleotide double-stranded RNA
  • Elbashir et al., 2002 can be tested for its ability to reduce or switch off the expression of genes.
  • functional screening is screening for an enzymatic, pharmacological or therapeutic property.
  • the property of inducing apoptosis in the cell can be determined using cell morphology or cell assays such as CDD + assay (Röche Diagnostics, Basel / Switzerland) or by caspase activation.
  • the functional screening is a screening for the function of secreted proteins.
  • the proteins encoded by the transfected cDNA are secreted into the cell supernatant. This supernatant is transferred to target cells and the function of the secreted protein is determined by its action on the target cell.
  • the cell transfected with the cDNA can also be brought into contact with the target cell and the function of the expressed protein (for example on the cell surface) can be determined by action on the target cell.
  • functional screening is screening for activation or suppression of a reporter system.
  • Suitable reporter systems are known in the prior art and include reporter gene assays (for example for the transcriptional activation of indicator proteins, enzymatic activation / deactivation of indicator proteins). Examples are the “Green Fluorescent Protein” (GFP), luciferase (Firefly) from the field of fluorescence-based reporter systems.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • FFP Green Fluorescent Protein
  • FFP luciferase
  • the screening is a screening for altered cell morphology, cell death or proliferation.
  • 2, 3 or all 4 robots are arranged in a belt line.
  • At least 2, such as 3 or all 4 individual work stations / robots for colony picking, DNA preparation, DNA transfection and reading out, the functional screening assay are additionally linked or combined by means of belt road systems. Intermediate steps between the individual processes that were previously necessary are thereby avoided and the sample throughput is further increased.
  • a DNA, (poly) peptide or transfectant containing this (s) identified in the screening method is purified or isolated.
  • the substances or the corresponding transfectant be purified to a form which is no longer contaminated and thus pure. This is possible in a particularly simple manner with the method according to the invention, since e.g. the positively tested substance is immediately available by using the master plate.
  • the further purification steps for the substances or the corresponding transfectants can be carried out using conventional methods.
  • the present invention also relates to a method for improving the binding properties of the (poly) peptide which is encoded by the DNA identified or isolated in the screening method according to the invention, comprising the steps (a) identifying the binding sites of the (poly) peptide and its binding partner through site-specific mutagenesis or chimeric protein studies; (b) molecular modeling of the binding site of both the (poly) peptide and the binding partner; and (c) modification of the (poly) peptide to improve the binding specificity or the affinity of the binding.
  • the (poly) peptide can be modified to increase binding affinity or potency and specificity. For example, if there are electrostatic interactions between a particular residue of the (poly) peptide in question and a region of the (poly) peptide, the total charge in that region can be changed so as to increase the existing interaction.
  • Computer programs can be helpful in identifying binding sites. Suitable computer programs can thus be used to identify interactive sites of a putative inhibitor and the polypeptide by computer-assisted searching for complementary structure motifs (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120).
  • Other suitable computer systems for the computer-aided design of proteins and peptides are described in the prior art, for example in Berry, Biochem. Soc. Trans.
  • the three-dimensional and / or crystallographic structure of the activators of the expression of the (poly) peptide according to the invention can be used for the design of peptidomimetic activators, for example in connection with the (poly) peptide identified according to the invention (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933 - 12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).
  • the modification in step (c) is a replica of the (poly) peptide by peptidomimetics.
  • the (poly) peptide is further modified as a lead structure in order to (i) a modified active center, a modified activity spectrum, a modified organ specificity and / or (ii) an improved activity and / or (iii) reduced toxicity (an improved therapeutic index) and / or (iv) reduced side effects and / or (v) a delayed start of therapeutic effectiveness, the length of therapeutic effectiveness and / or (vi) changed pharmacokinetic parameters (absorption, distribution, metabolism or excretion) and / or (vii) modified physicochemical parameters (solubility, hygroscopic properties, color, taste, smell, stability, condition) and / or (viii) improved general specificity, Organ / tissue specificity, and / or (ix) optimized administration form and route by (i) esterification of carboxy groups or (ii) esterification of hydroxyl groups with carboxylic acids or (iii) esterification of hydroxyl groups to, for
  • the present invention relates to a method for producing a medicament, comprising the steps of the method according to the invention and furthermore the formulation of the substance obtained with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • the medicine can be manufactured by conventional means.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents are known to the person skilled in the art and include, for example, phosphate-buffered saline solutions, water, emulsions, such as, for example, oil / water emulsions, various types of wetting agents or detergents, sterile solutions, etc.
  • Medicaments which comprise such carriers can be formulated using known conventional methods. These drugs can be administered to an individual in an appropriate dose. Administration can be oral or parenteral, for example intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intramuscular, local, intranasal, intrabronchial or intradermal, or via a catheter at one location in an artery. The treating doctor determines the type of dosage according to the clinical factors.
  • the type of dosage depends on various factors, such as, for example, the body size or weight, the body surface, the age, gender or general health of the patient, but also on the agent to be administered specifically, the duration and mode of administration, and other medications that may be administered in parallel.
  • a typical dose can be, for example, in a range between 0.001 and 1000 ⁇ g, doses below or above this exemplary range being conceivable, especially taking into account the factors mentioned above.
  • the dose should be in a range between 1 ⁇ g and 10 mg units per day.
  • compositions of the invention can be administered locally or systemically.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions and emulsions.
  • non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and organic ester compounds such as ethyl oleate, which are suitable for injections.
  • Aqueous carriers include water, alcoholic aqueous solutions, Emulsions, suspensions, saline solutions and buffered media.
  • Parenteral carriers include sodium chloride solutions, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, Ringer's lactate, and bound oils.
  • Intravenous carriers include, for example, liquid, nutrient and electrolyte supplements (such as those based on Ringer's dextrose).
  • the composition of the invention may also include preservatives and other additives such as antimicrobial compounds, antioxidants, complexing agents and inert gases.
  • compounds such as interleukins, growth factors, differentiation factors, interferons, chemotactic proteins or a non-specific immunomodulatory agent can be included.
  • cDNA banks are plated on agar plates, the individual colonies are picked and transferred to microtiter plates in which the bacteria are cultivated for multiplication.
  • microtiter plates in which the bacteria are cultivated for multiplication.
  • several growth plates are inoculated from these master plates and cultivated for propagation in order to generate sufficient bacteria for DNA isolation (replication).
  • the growth plates with the bacterial suspension are centrifuged and the supernatant aspirated.
  • the pellets are then resuspended in a buffer containing RNAse (P1), an alkaline lysis buffer (P2) is added and this is then neutralized (P3).
  • P1 RNAse
  • P2 alkaline lysis buffer
  • P3 neutralized
  • the plates are centrifuged and the supernatant placed in an intermediate plate.
  • P4 is then dispensed to bind bacterial endotoxins, centrifuged again after incubation and the supernatant placed in a second intermediate plate.
  • Silica becomes the supernatant dispensed to bind the DNA. It is centrifuged, the supernatant is suctioned off and the pellet is washed with acetone. After centrifugation again, the
  • a defined amount of the DNA solution from the DNA plates produced in Robot 2 is pipetted into intermediate plates and a control plasmid (ß-Gal), calcium chloride, HBS is added. After incubation to form the complex, chloroquine is dispensed to the mixture, and after the mixture a defined amount of the mixture is pipetted onto the cell culture. The medium is changed after 4-5 h.
  • a substrate is added to the cell culture plates, which causes a color change in apoptotic cells. This color change is evaluated in an ELISA reader and the cells are discarded.
  • bacteria are centrifuged in growth plates and treated with an RNAse buffer. The bacteria are resuspended on an orbital shaker. Then a lysing and a neutralizing buffer are added. By adding a first type of magnetic microparticle, cell debris and proteins are bound. The magnetic microparticles are separated on a magnetic plate and the supernatant is placed in an intermediate plate. After that, a second variety is optional added magnetic microparticles that bind to bacterial endotoxins.
  • endotoxin precipitation reagents can be used, which after the
  • Precipitation of the endotoxins can be removed via the first microparticle separation step.
  • Bind DNA From these magnetic microparticles, the DNA can either be eluted and used for transfections, or with the appropriate formulation of the
  • Microparticles can be used directly for transfections.
  • the DNA-microparticle complexes produced during DNA isolation can be used directly for transfections.
  • Example 1 Sequence of the screening process for determining the function of genes or gene products
  • the bacteria containing DNA were plated on agar plates with a selection antibiotic in such a way that the greatest possible number of individual clones was evenly distributed on the plates. After an overnight incubation at 37 ° C., the colonies were picked by a robot and placed in 384 microtiter plates (MTP) in which 60 ⁇ ⁇ LB medium with selection antibiotic was present. These plates were incubated overnight at 37 ° C. and overlaid the following day with a mixture of LB medium and glycerin, so that the final concentration of glycerol was 15%. The plates (hereinafter referred to as Master MTP) were then stored at -80 ° C.
  • MTP microtiter plates
  • the Master MTP were thawed and replicated with a replication tool on a first robot in 4X96 "DeepwelP" MTP.
  • 1.5 ml of LB medium with selection antibiotic were placed in each of these 96 MTPs.
  • the plates were incubated overnight in a chute cabinet at 37 ° C., the shaking speed was 280 rpm.
  • the 96 MTP were centrifuged at 3000 g for 5 min and the supernatant was aspirated.
  • 170 ⁇ l P1 50 mM Tris pH 8.0; 10 mM EDTA pH 8.0; 100 ⁇ g / ml RNAse A (Qiagen) were added to a shaking station with a dispenser, shaken for 5 min at 1000 rpm, 170 ⁇ ⁇ P2 (200 mM NaOH 1% SDS) was added, shaken at 300 rpm for 10 s and incubated at RT for 5 min, then 170 ⁇ P3 (3 M KAc, pH 5.5) were added and shaken at 1000 rpm for 30 s after a 5 min incubation The MTP were centrifuged at 3500 g for 5 min at 4 ° C.
  • the supernatant was removed and placed in an intermediate MTP.
  • To the supernatant were added 120 // I P4 (2.5% SDS (Roth) in isopropanol) and Incubated for 20 min at 4 ° C. The mixture was then centrifuged for 10 min at 3500 g and the supernatant was placed in a new intermediate plate.
  • silica 50 mg / ml SiO 2 (12.5 g in 250 ml water) added and incubated for 5 min at RT
  • the silica suspension was prepared as follows: 12.5 g of silica on 250 ml of water were stirred for 30 min, de r supernatant (contains silica fume) sedimented; removed; 150 ⁇ ⁇ conc. HCI added, made up to 250 ml with H 2 0 (measuring cylinder) and autoclaved. The mixture was then centrifuged at 2000 g for 5 min and the supernatant was discarded.
  • the cells to be transfected were plated on the day before the transfection with a cell density of approx. 8000 cells / well in a 96-well cell culture plate.
  • COS-7 cells are seeded at a cell density of approximately 5000 cells / well in 10% DMEM and incubated for 24 hours at 37 ° C in the incubator.
  • the cDNA is introduced into the cells by lipofection with Metafectene (Biontex, Kunststoff) and incubated for 3 hours at 37 ° C. in the incubator.
  • endothelial cell growth medium PromoCell, Heidelberg
  • the supernatant is then removed and transferred to endothelial cells (Human Umbelical Vein Endothelial Cells, HUVECs or Microvascular Endothelial Cells, HMVECs).
  • HUVEC cells are previously sown with a cell density of 2000 cells / well in endothelial cell growth medium (Promocell, Heidelberg). After the medium has been completely removed, the supernatant of the COS-7 cells is transferred to the endothelial cells. The cells are incubated for 6 days at 37 ° C. in the incubator and the activities of the secreted proteins are determined by the cytosolic reduction of Alamar Blue (BioSource, Solingen).
  • test steps are carried out using protocols according to Current Protocols (Ausubel et. Al, 2002).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen einer Sammlung von Nukleinsäuremolekülen auf eine gewünschte Eigenschaft der Nukleinsäure oder eines davon kodierten (Poly)peptids, umfassend die Schritte (a) automatisiertes Picken einer Sammlung von Zellen, die die Sammlung von Nukleinsäuremolekülen enthalten, mittels eines ersten Roboters; (b) automatisierte Lyse der Zellenmittels eines zweiten Roboters; (c) automatisierte Abtrennung der Zell-DNA vom Zelldebris mittels des zweiten Roboters; (d) optional automatisierte Abtrennung von Endotoxinen von der DNA mittels des zweiten Roboters sofern die Zellen Bakterien sind; (e) automatisierte Transfektion von Zellen mit der in Schritt (c) oder, sofern die Zellen Bakterien sind, in Schritt (d) erhaltenen DNA mittels eines dritten Roboters; und (f) automatisiertes Screenen auf die gewünschte Eigenschaft mittels eines vierten Roboters. Fernerbetrifft die Erfindung Verfahren zur Verbesserung der Bindungseigenschaften des (Poly)peptids, das durch die in dem erfindungsgemässen Screeningverfahren identifiziert oder von der identifizierten oder isolierten DNA kodiert wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels auf der Basis von mit dem erfindungsgemässen Verfahren erhältlichen (Poly)peptiden und ferner die Formulierung des erhaltenen Stoffes mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.

Description

Hochdurchsatz DNA-Isolierung und -Transfektion zur Analyse der Funktion von Genen bzw. Genprodukten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen einer Sammlung von Nukleinsauremolekulen auf eine gewünschte Eigenschaft der Nukleinsaure oder eines davon kodierten (Poly)peptids, umfassend die Schritte (a) automatisiertes Picken einer Sammlung von Zellen, die die Sammlung von Nukleinsauremolekulen enthalten, mittels eines ersten Roboters; (b) automatisierte Lyse der Zellen mittels eines zweiten Roboters; (c) automatisierte Abtrennung der Zeil-DNA vom Zelldebris mittels des zweiten Roboters; (d) optional automatisierte Abtrennung von Endotoxinen von der DNA mittels des zweiten Roboters sofern die Zellen Bakterien sind; (e) automatisierte Transfektion von Zellen mit der in Schritt (c) oder, sofern die Zellen Bakterien sind, in Schritt (d) erhaltenen DNA mittels eines dritten Roboters; und (f) automatisiertes Screenen auf die gewünschte Eigenschaft mittels eines vierten Roboters. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Verbesserung der Bindungseigenschaften des (Poly)peptids, das durch das erfindungsgemäße Screeningverfahren identifiziert oder von der identifizierten oder isolierten DNA kodiert wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels auf der Basis von mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen (Poly)peptiden und ferner die Formulierung des erhaltenen Stoffes mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
In der Beschreibung ist eine Anzahl von Dokumenten aus dem Stand der Technik zitiert. Der Offenbarungsgehalt dieser Dokumente ist hiermit per Referenz in seiner Gesamtheit in die vorliegende Beschreibung inkorporiert.
Hochdurchsatzscreening ist ein seit Jahren bewährtes Instrument zur Auffindung potentieller Wirkstoffe in der pharmazeutischen Forschung. Die Übertragung von Hochdurchsatztechnologie auf Verfahren wie DNA-Isolierung aus Bakterien sowie der Transfektion zellulärer Systeme ist ein relativ neuer Ansatz. Dabei ist insbesondere das Screenen von cDNA-Bibliotheken von Interesse. Das Screening von cDNA- oder generischen Bibliotheken, die üblicherweise in Bakterien kloniert vorliegen, erfordert einen Prozeß, der sich allgemein in vier Stufen unterteilen läßt und 1) das Picken der Bakterienkolonien, 2) die DNA-Präparation, 3) die DNA- Transfektion sowie 4) das Auslesen eines funktionellen Tests umfaßt.
Die Isolierung von DNA aus Bakterien erfolgt üblicherweise anhand von zwei verschiedenen Methoden: Alkalische Lyse von Bakterien mit anschließender Aufreinigung der gewonnenen DNA über Säulen oder Adhesion der aus alkalischer Lyse gewonnenen DNA an spezielle Mikropartikel (sogenannte „Beads").
Ein Protokoll zur alkalischen Lyse findet sich beispielsweise in (Sambrook et al. „Molecular Cloning, A Laboratory Handbook" CSH Press, Cold Spring Harbor 1989; oder Ausubel et al.; Current Protecols, in Molecular Biology 2002; John Wiley & Sons, Inc., N.Y.) beschrieben. Methoden zur Aufreinigung von DNA, RNA oder deren Hybriden mit Hilfe magnetischen Silica-Partikeln sind beispielsweise in US 6,027,945 bzw. WO 98/31840 beschrieben. Die Entfernung von Zell-Debris durch den Einsatz von magnetischen Mikropartikeln wird in US 5,646,283 gezeigt. Diese Aufreinigung beruht in der Regel aber auf chemischen Reinigungsmethoden und ist daher nur sehr bedingt für das Screenen komplexer Bibliotheken geeignet.
Entsprechende Verfahren sind für die Durchführung im Labor oder auf Pipetierautomaten für einen geringen Probendurchsatz ausgelegt. Der Tagesdurchsatz variiert und ist je nach Methode auf maximal 3000-6000 Präparationen pro Tag beschränkt. Durch den begrenzten Probendurchsatz sind diese Methoden nicht für den Hochdurchsatz geeignet.
Zur Transfektion von DNA in eukaryontische Zellsysteme erfüllen chemische Methoden wie Lipofektion die Anforderungen für einen Hochdurchsatz an Proben. Durch die Herstellung Zellmembran-permeabler DNA-Komplexe oder durch das Eindringen bzw. der Verschmelzung mit der Zellmembran kann DNA in die Zelle eingeschleust werden. Ebenfalls für den Hochdrucksatz geeignet sind physikalische Methoden, wie Magnetofektion oder Elektroporation. Einzelne Stufen von Screening-Prozessen komplexer Bibliotheken lassen sich bereits in automatisierter Form durchführen. Entsprechende Geräte sind von Beckman Coulter oder Tecan erhältlich. Der Biomek 2000 (Beckman Coulter; Fullerton, USA) bzw. der Genesis (Tecan; Durham, USA) sind semi-automatisierte Arbeitsplattformen für die Verwendung von Mikrotiterplatten. Diese Systeme stellen allgemeine Arbeitsplattformen dar, die sich beispielsweise für den Einsatz zur DNA- Präparation adaptieren lassen. Die Anwendungsmöglichkeiten sind jedoch eingeschränkt, da z.B. keine Zentrifugen integriert sind. Somit sind vorteilhafte Versuchs-Protokolle, wie beispielsweise eine DNA-Präparation durch alkalische Lyse („Mini-Prep") nicht durchführbar. Zudem sind manuelle Schritte wie z.B. zum Pelletieren/Präzipitieren der Bakterien nötig.
In der EP 569 115 A2 wird ein automatisiertes Hochdurchsatz-DNA- Präparationssystem für die Verwendung von Mikrotiterplatten beschrieben. Durch die Integration von modifizierten Zentrifugen wird eine DNA-Präparation nach der alkalischen Lyse ermöglicht. Insofern stellt dieses Verfahren gegenüber den vorstehend beschriebenen Prozessen aus dem Stand der Technik bereits eine Verbesserung dar. Allerdings wird ein Reinheitsgrad der DNA, wie er für den Einsatz von Transfektionen erforderlich ist, nicht erreicht. Dies liegt unter anderem daran, daß die DNA noch durch Endotoxine kontaminiert ist. Nachteilig ist auch, daß dieses System wie auch das Genesis (Tecan)- und das Biomek 2000 (Beckman) -System nicht als Bandstraßensystem konzipiert ist bzw. als solches ausgebaut werden kann. Eine Verschachtelung der einzelnen Arbeitsschritte ist daher nicht möglich. Der Probenduchsatz der vorgenannten Systeme ist somit im Höchstfall auf etwa 3000- 6000 Präparationen / Tag beschränkt.
In der PCT/EPOO/00683 wird ein Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen, die eine nicht selektionierbare Aktivität aufweisen, beschrieben. Das Verfahren umfaßt die Schritte von der Bereitstellung der DNA- Bibliothek über das Kultivieren der Wirtszellen, die DNA-Präparation, Transfektion der Zielzellen mit der Ziel-DNA bis zur funktioneilen Bestimmung der Aktivität der DNA in der Zielzelle. Diese Anmeldung stellt bereits ein Verfahren dar, das einen gewissen Automatisierungsgrand der DNA-Präparationen beinhaltet. Entsprechend werden Ausführungsformen für zwei Roboter, die jeweils die DNA-Präparation und DNA-Transfektion durchführen können, dargestellt. Auch mit diesem Verfahren lassen sich Probendurchsätze in der Größenordnung von über 103 Präparationen pro Tag bewerkstelligen.
Die PCT/EP00/13132 beschreibt ein Screeningverfahren für Nukleinsäuren, das auch Nukleinsäuren mit selektionierbarer Aktivität beinhaltet. Neben dem Screeningverfahren ist auch die Automatisierung des Verfahrens sowie eine bevorzugte Ausführungsform zur Durchführung der DNA-Präparation und DNA- Transfektion unter Zuhilfenahme einzelner Roboter erfaßt. Mit diesem Verfahren lassen sich ebenfalls Probendurchsätze in der vorgenannten Größenordnung fahren.
Alle vorstehend beschriebenen Verfahren haben den Nachteil, daß sie für das Screenen vollständiger Genbanken auf Moleküle mit gewünschten Eigenschaften in einem kürzeren Zeitrahmen ungeeignet sind. Das Screenen von Genbanken mit beispielsweise einer Komplexität von bis zu oder sogar über 106 cDNA's erfordert nämlich einen hohen Probendurchsatz pro Tag, um praktisch handhabbar zu sein und in einem überschaubaren zeitlichen Rahmen zu den gewünschten Eigenschaften zu führen. Ein derartiger Probendurchsatz ist nicht nur durch eine Optimierung der im Stand der Technik beschriebenen einzelnen Prozesse möglich. Vielmehr müssen neue Wege beschritten, d.h. neue Kombinationen von Prozessen ermittelt werden, damit Genbanken mit einem hohen Komplexitätsgrad funktioneller Studien in einem annehmbaren und für therapeutische Entwicklungen sinnvollen Zeitrahmen unterworfen werden können. Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem war, ein diesen Anforderungen gerecht werdendes Verfahren bereitzustellen.
Dieses technische Problem wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Screenen einer Sammlung von Nukleinsauremolekulen auf eine gewünschte Eigenschaft der Nukleinsaure oder eines davon kodierten (Poly)peptids, umfassend die Schritte (a) automatisiertes Picken einer Sammlung von Zellen, die die Sammlung von Nukleinsauremolekulen enthalten, mittels eines ersten Roboters; (b) automatisierte Lyse der Zellen mittels eines zweiten Roboters; (c) automatisierte Abtrennung der Zeil-DNA vom Zelldebris mittels des zweiten Roboters; (d) gegebenenfalls automatisierte Abtrennung von Endotoxinen von der DNA mittels des zweiten Roboters, sofern die Zellen Bakterien sind; (e) automatisierte Transfektion von Zellen mit der in Schritt (c) oder, sofern die Zellen Bakterien sind, in Schritt (d) erhaltenen DNA mittels eines dritten Roboters; und (f) automatisiertes Screenen auf die gewünschte Eigenschaft mittels eines vierten Roboters.
Der Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist optional. Speziell bei geringer Sensitivität der zu transfizierenden vorzugsweise eukaryontischen Zellen gegenüber Endotoxin wird er zwar bevorzugt durchgeführt, kann aber auch entfallen.
Entsprechend umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren entweder die Schritte (a), (b), (c), (d), (e) und (f) oder die Schrittfolge (a), (b), (c), (e) und (f).
Letztere Schrittfolge kann erfindungsgemäß auch als (a) (b) (c) (d') und (e') bezeichnet werden, wobei der Schritt (d') dem Schritt (e) und der Schritt (e') dem Schritt (f) entspricht.
Der Begriff "Sammlung" im Sinne dieser Erfindung betrifft eine Anzahl von Nukleinsauremolekulen jenseits von 103 verschiedenen Molekülen, vorzugsweise von mindestens 104 verschiedenen Molekülen, stärker bevorzugt von mindestens 105 verschiedenen Molekülen und besonders bevorzugt von 106 verschiedenen Molekülen wie 2x106 oder 3x106 verschiedenen Molekülen.
Die "Nukleinsäuremoleküle" sind vorzugsweise codierende Regionen zusammen mit homologen oder heterologen Expressionskontrollsequenzen. Besonders bevorzugt ist, daß sie das Genom eines Organismus repräsentieren oder im wesentlichen repräsentieren. Dieser Organismus kann ein Prokaryot, beispielsweise ein Bakterium, oder ein Eukaryot, z.B. eine Hefe, sein. Sofern der Organismus ein Eukaryot ist, ist er in einer bevorzugten Ausführungsform ein Säuger, beispielsweise ein Mensch.
Der Begriff "(Poly)peptid" beschreibt sowohl Peptide wie auch Polypeptide (Proteine).
Dabei wird konventionsgemäß eine Kette von bis zu 30 Aminosäuren als Peptid und eine Kette von über 30 Aminosäuren als Polypeptid bezeichnet.
Der Begriff "automatisiert" bedeutet im Sinne dieser Erfindung, daß der jeweilige
Schritt nicht von Menschenhand, sondern rein maschinell durchgeführt wird.
Allerdings schließt diese Begriffsbestimmung selbstverständlich Manipulationen und
Einstellungen an der Maschine (dem Roboter) durch Menschenhand ein.
Der Begriff "Zelldebris" bedeutet im Sinne dieser Erfindung die nach Lyse einer Zelle erhaltene Masse aus Zellbestandteilen, die durch Zentrifugation beispielsweise bei
3000 x g von wässrigem Überstand, welcher die DNA enthält, abgetrennt werden kann. Zelldebris enthält üblicherweise Proteine und, bei Bakterien,
Zellmembranbestandteile.
Der Begriff "Roboter" bedeutet automatisierte Arbeitsstation mit Greifarmen und spezifischen Produktbearbeitungsstationen wie z.B. Zentrifugen, Inkubationsplätzen etc.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Screeningverfahren bereitgestellt, bei dem die vier Verfahrensschritte Kolonie-Picken, DNA-Präparation, DNA- Transfektion sowie das Auslesen eines funktionalen Screening Assays durch Roboter automatisiert durchgeführt werden und damit ein für ein Hochdurchsatzscreening automatisierter Gesamt-Prozeß ermöglicht wird. Als wesentlicher Bestandteil dieses Verfahrens in einer Ausführungsform (d.h. der Schritt (d) einschließenden Ausführungsform) ist die automatisierte Entfernung von Endotoxinen, vorzugsweise mit Hilfe magnetischer Mikropartikel zu betrachten. Erst hierdurch wird, in Kombination mit den weiteren automatisierten Schritten, ein zeitlich annehmbarer Rahmen für das Hochdurchsatzscreening von Bibliotheken mit einem hohen Komplexitätsgrad erreicht. Um die DNA für die Transfektion direkt einsetzen zu können, ist die Reinigung der DNA von Endotoxinen in dieser Ausführungsform nämlich eine essentielle Voraussetzung. Somit erst kann die aus der DNA- Präparation gewonnene DNA kann direkt für Analysen und Transfektionen eingesetzt werden. Besonders vorteilhaft ist, daß zeitintensive Zentrifugationssch ritte erheblich reduziert werden. Methoden zur Entfernung von Endotoxinen aus DNA, RNA oder deren Hybriden mit Hilfe von magnetischen Silica-Partikeln sind in US 6,194,562 bzw. WO 99/54340 beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens (nämlich der Ausführungsform ohne Schritt (d)) ist die Abtrennung der Endotoxine nicht essentiell. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn die zu transfizierenden Zellen gegenüber Endotoxinen eine geringe Sensitivität aufweisen und daher bei üblichen DNA- Aufreinigungsverfahren durch Endotoxin-Kontamination nicht wesentlich beeinträchtigt oder abgetötet werden.
Durch die Kombination der automatisierten Einzelprozesse, die von zusammengeschalteten Robotern durchgeführt werden, kann erstmals ein Probendurchsatz von bis zu 30000 / 40000 Proben pro Tag erreicht werden. Mit anderen Worten, durch die Kombination serieller Produktionstechnik mit den beschriebenen Komponenten (gemäß beider oben beschriebenen Ausführungsformen) kann ein bisher nicht erreichter Durchsatz bei der Herstellung transfektionsfähiger DNA generiert werden. Diese können mit demselben Hochdurchsatz-Verfahren nach der Transfektion in vorzugsweise eukaryontischen Zellen auf ihre biologische Funktion hin untersucht werden. Dies ermöglicht das Screenen einer kompletten cDNA-Genbank innerhalb eines Monats.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Sammlung von Nukleinsauremolekulen eine Genbank.
Der Begriff "Genbank" ist im Stand der Technik bekannt und in Winnacker, "Gene und Klone", VCH Weinheim 1985 (S. 403) definiert als "Sammlung klonierter DNA- Fragmente, die ein gesamtes Genom repräsentieren". Die Erfindung schließt auch solche Genbanken ein, die Löcher aufweisen, d.h. nicht das gesamte Genom repräsentieren oder die ein Expressionsstadium, z.B. eines bestimmten Gewebes, eines Krankheits- oder Entwicklungsstadiums etc. repräsentieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Nukleinsäuremoleküle genomische DNA- oder cDNA-Moleküle oder RNAi- Oligonukleotide. Entsprechende RNAi-Oligonukleotide werden beispielsweise von Dharamcon (LaFayette, USA) Xeragon (Germantown, USA) oder Ambion (Austin, USA) sythetisiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Genbank eine Expressions-cDNA-Genbank, vorzugsweise eine eukaryontische Genbank, besonders bevorzugt eine humane Genbank.
Auch der Begriff "Expressions-cDNA-Genbank" ist im Stand der Technik wohl verstanden. In einer Expressions-cDNA-Genbank sind die cDNA-Moleküle in einem Expressionsvektor kloniert, der ihre Expression in einem geeigneten Wirt ermöglicht; vgl. Winnacker, a.a.O. oder Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual"; CSH Press, Gold Spring Harbor 1989.
Bevorzugt liegt die Genbank normalisiert (d. h. die in der Genbank enthaltenen Gene liegen in nahezu gleicher Anzahl vor) und/oder angereichert für „volle Länge cDNA" vor.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Sammlung von Nukleinsäuren eine Klonsammlung. Unter einer Klonsammlung ist eine Kollektion ausgewählter cDNA- Klone zu verstehen, die bevorzugt „volle-Länge-cDNA" enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Zellen in Schritt (a) und/oder Schritt (e) Säugerzellen, Insektenzellen, Hefezellen oder Bakterien.
Beispiele für Säugerzellen sind COS-Zellen, HUVEC-Zellen, Aspergillus (niger/nidulans etc.)-Zellen oder CHO-Zellen. Beispiele für Insektenzellen sind Spodoptera frugiperda-Zellen. Geeignete Hefezellen schließen solche der Arten S. cerevisiae oder P. pastoris ein. Geeignete Bakterien können sowohl gram-negativ wie auch gram-positiv ein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Bakterien gram-negative Bakterien. Die besonders vorteilhaften Eigenschaften des erfindungsgemäßen Verfahrens kommen insbesondere bei gram-negativen Bakterien zum Tragen, da insbesondere diese Endotoxine als Zellwand- bzw. Zellmembranbestandteile aufweisen. Von den gram-negativen Bakterien werden insbesondere Bakterien der Art E. coli für Klonierungszwecke im Stand der Technik eingesetzt.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens gehören die gram-negativen Bakterien daher zur Art E. coli. Besonders bevorzugt sind E. coli DH5 α, E. coli Shure und E. coli JM 109.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird mindestens einer der Schritte (a) bis (f) (mit oder ohne Schritt (d)) in Mikrotiterplatten durchgeführt.
Konventionelle Mikrotiterplatten weisen den Vorteil auf, daß sie unabhängig von der Anzahl der Vertiefungen ("Löcher") eine standardisierte Größe aufweisen, die sie besonders geeignet für eine automatisierte Handhabung durch Roboter macht. Mikrotiterpaltten (beispielsweise erhältlich von der Fa. Nunc) bestehen üblicherweise aus PVC oder Polystyrol. Sie können 6, 24, 96, 384 oder 1536 Vertiefungen aufweisen. Bevorzugt eingesetzt im erfindungsgemäßen Verfahren werden Mikrotiterplatten mit 96 oder 384 Vertiefungen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden sämtliche Schritte (a) bis (f) (mit oder ohne Schritt (d)) in Mikrotiterplatten durchgeführt.
In einer zusätzlich bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Mikrotiterplatten mit Barcodes versehen.
Diese Ausführungsform ist deshalb besonders vorteilhaft, da sie ein lückenloses "Tracking" sämtlicher Platten, auch nach dem Wechsel von einem Roboter zum nächsten ermöglicht. Eine Zuordnung kann somit auf besonders einfache und zeitwahrende Weise vom Ausplattieren der Zellen für die Bearbeitung durch den ersten Roboter bis zum funktioneilen Screenen und Read-out durch den vierten Roboter erfolgen. Nach erfolgtem funktionellem Screenen kann so ohne weiteres auf die Ausgangsklone auf der Musterplatte zurückgegriffen werden.
Durch die Barcode-Technik auf den Robotern 2 und 3 wird zudem die Verschachtelung der einzelnen Prozesse innerhalb des Bandstraßensystems ermöglicht.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der erste Roboter gekennzeichnet durch mindestens eines und vorzugsweise alle der nachfolgenden Merkmale (a) digitales Bildverarbeitungssystem zur Erfassung der ausplattierten Bakterien, (b) Arbeits-Station mit Greifarm für Mikrotiterplatten zum Transfer der Mikrotiterplatten zwischen den Bearbeitungsstationen, (c) Separations- Modul, versehen mit einem oder mehreren Nadel-bestückten Köpfen zum Picken von ausplattierten Einzelkolonien und Ablage in Mikrotiterplatten, (d) integrierte Produktbearbeitungsstationen zur Säuberung der Nadeln zwischen den Arbeitsschritten und Replikation der abgelegten Einzelkolonien in Mikrotiterplatten und (e) Computer-gestütztes Strich-Code („Barcode")-ldentifikations-und Nachverfolgungssystem („Tracking").
Die Mikrotiterplatten sind vorzugsweise 96- oder 384-Lochplatten. Die integrierten Produktbearbeitungsstationen schließen ein Sterilisationssystem ein. Bevorzugt ist ferner, daß der Greifarm ein Roboterarm ist, der mit mindestens zwei Spitzenbestückten Köpfen versehen ist, wobei die Köpfe wechselseitig zum Picken eingesetzt und auf der Sterilisierungsstation gesäubert werden. Auch ist ein modularer Aufbau des Roboterarms bevorzugt, der einen Austausch von Greifarm- Modulen gegen Separationskopf-Module ermöglicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Lyse eine alkalische Lyse. Die Durchführung der alkalischen Lyse ist u.a in Sambrook a.a.O. wie auch an anderer Stelle in dieser Beschreibung dargelegt.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der zweite Roboter gekennzeichnet durch mindestens eines und vorzugsweise alle der nachfolgenden Merkmale (a) Bandstraßentransportsystem kombiniert mit Greifarmen für Mikrotiterplatten zum Umladen der Produkte und Transfer der Mikrotiterplatten zwischen den Produktbearbeitungsstationen, (b) im Transportsystem integrierte Produktbearbeitungsstationen, insbesondere Zentrifugen, Pipettier-Automaten, Schüttler und Inkubationsplätze zur Inkubation bei verschiedenen Temperaturen, (c) Sensorik zur Detektion von Produktpositionen sowie zur Fehlerdetektion, (d) Software zur verschachtelten Bearbeitung mehrerer in der Maschine befindlichen Prozesse für einen kontinuierlicher Produktionsbetrieb und (e) Computer-gestütztes Strich-Code („Barcode")-ldentifikations-und Nachverfolgungssystem („Tracking") bevorzugt mit internem Produkt-Tracking, das eine Zeitstempel- („Timestamp"-) Funktion zur Verschachtelung zeitkritischer Subprozesse enthält.
Auch hier ist bevorzugt, daß die Mikrotiterplatten 96-, 384- oder 1536-Lochplatten sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Abtrennung der Zeil-DNA in Schritt (c) mittels Silica-Partikel.
Der Begriff "Abtrennung der Zeil-DNA mittels Silica-Partikel" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, daß die Zeil-DNA (d.h.Plasmid-DNA oder in einer alternativen Ausführungsform chromosomale DNA) an diese Partikel gebunden wird und vom Zelldebris abgetrennt wird. Im Prinzip ist der Abtrennungsschritt somit ein Aufreinigungsschritt. Die Silica-Partikel können auf einfache Weise durch Zentrifugation vom Zelldebris abgetrennt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Silica-Partikel magnetische Silica-Partikel. Die Ausführungsform ist deshalb besonders bevorzugt, weil die magnetischen Partikel auf einfache Weise durch Einsatz eines Magneten vom Zelldebris und sonstigem Überstand abgetrennt werden können. Entsprechende Verfahren sind z.B. in der US-A 6,027,945 und der WO 98/31840 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Abtrennung der Endotoxine in Schritt (d) durch Fällung mit SDS/Isopropanol.
Eine geeignete Zusammensetzung beträgt 2,5% SDS in Isopropanaol.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die an Silica-Partikel gebundene DNA durch Waschen mit Aceton weiter aufgereinigt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Abtrennung der Endotoxine in Schritt (d) mittels Endotoxin-bindender Partikel, die vorzugsweise magnetische Endotoxin-bindende Partikel sind.
Die Endotxon-bindenden Partikel können vorzugsweise als magnetische Partikel ausgestaltet sein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Transfektion von Zellen in Schritt (e) durch Calciumphosphat, Elektroporation oder durch Lipofektion vermittelt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Transfektion von Zellen in Schritt (e) durch Calziumphosphat oder Lipofektion vermittelt. Eine Vermittlung der Lipofektion kann durch Lipide, Liposome oder Lipidkombinationen erfolgen. Beispiele hierfür sind Effectene (Qiagen; Hilden), Fugene (Röche, Basel), Metafectene (Biontex), Lipofektamine oder Lipfectamine 2000, Lipofectin, Oligofectamine (Invitrogen, Karlsruhe). Für die Transfektion von RNAi-Oligonukleotiden sind besonders Metafecten, Oligofectamine oder auch Calziumphosphat geeignet.
Entsprechende Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in "Transfection Technologies" (Methods Mol. Biol. 2000; 130: 91-102) oder Current Protocols (Ausubel et al., 2002; 9.1) beschrieben.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Transfektion vermittels DNA-bindender magnetischer biokompatibler Mikropartikel durchgeführt.
Der Begriff "biokompatible Mikropartikel" bezeichnet Mikropartikel, die biologisch inert sind oder in der Zelle abgebaut werden können.
In dieser bevorzugten Ausführungsform können bereits in dem Verfahrensschritt der DNA-Preparation modifizierte magnetische Mikropartikel verwendet werden, die anschließend direkt zur Transfektion eingesetzt werden können. Dem nachfolgend als Magnetotransfektion bezeichneten Verfahren liegen folgende Parameter zugrunde:
Die transfektionsfähige DNA wird an biokompatible, magnetische Mikropartikel gebunden. Die Mikropartikel mit der gebundenen DNA werden auf die Zellkulturen aufgebracht. Durch Anlegen eines Magnetfeldes werden die DNA-Mikropartikel- Komplexe auf der Zelloberfläche aufkonzentriert und über endozytotische Prozesse in die Zelle aufgenommen. Alternativ können die DNA-Mikropartikel durch Verstärken des Magnetfeldes in die Zelle/den Zellkern eingebracht werden. Ein derartiges Verfahren der Magnetotransfektion ist im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in der PCT/EP01/07261 beschrieben. Die Effektivität dieses Verfahrens kann durch die Verwendung lipophiler Aufnahmeverbesserer z.B. durch Lipofektamin noch weiter gesteigert werden.
Die magnetische Auf konzentrierung der Komplexe bzw. das Einbringen der DNA- Mikropartikel in die Zelle/den Zellkern auf der Zelloberfläche bewirkt eine erheblich erhöhte Transfektionseffizienz. Dadurch kann die eingesetzte Proben- (DNA-) Menge reduziert werden und ermöglicht im Hinblick auf die Menge bei einem Hochdurchsatzsystem eingesetzten Proben eine erhebliche Kostenersparnis. Weiterhin kann durch die Verwendung dieser magnetischen Mikropartikel der Transfektionsprozess auf einem Robotersystem durchgeführt werden, welches ähnliche Spezifikationen wie das zur DNA-Präparation verwendete Robotersystem aufweist. Zusätzlich können die Verfahrensschritte weiter reduziert und der Gesamt- Prozeß beschleunigt werden.
Diese bevorzugte Ausführungsform stellt ein Hochdurchsatz-Transfektionssystem bereit, mit dem auf besonders kosten- und zeitsparende Weise ein Tagesdurchsatz von bis zu 40000 Proben pro Tag realisiert werden kann.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der dritte Roboter gekennzeichnet durch mindestens eines und vorzugsweise alle der nachfolgenden Merkmale (a) Bandstraßentransportsystem kombiniert mit Greifarmen für Mikrotiterplatten zum Umladen der Produkte und Transfer der Mikrotiterplatten zwischen den Produktbearbeitungsstationen, (b) im Transportsystem integrierte Produktbearbeitungsstationen, insbesondere Pipettier- Stationen, Schüttler, Inkubationsplätze sowie Brutschrank zur Kultivierung der Transfektanten, (c) Sensorik zur Detektion von Produktpositionen sowie zur Fehlerdetektion, (d) sterile Überdruckbelüftung zur Verhinderung von Kontaminationen der Zellkulturen, (e) Software zur verschachtelten Bearbeitung mehrerer in der Maschine befindlichen Prozesse für einen kontinuierlicher Produktionsbetrieb und (f) Compute.r-gestütztes Strich-Code („Barcode")- Identifikations-und Nachverfolgungssystem („Tracking") bevorzugt mit internem Produkt-Tracking, das eine Zeitstempel- („Timestamp"-) Funktion zur Verschachtelung zeitkritischer Subprozesse enthält.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der vierte Roboter gekennzeichnet durch mindestens eines und vorzugsweise alle der nachfolgenden Merkmale (a) System zur Bestimmung von Fluoreszenz, Lumineszenz bzw. Farbreaktionen aus Zellkultur-Assays, (b) Pipettier-Station mit Greifarm für Mikrotiterplatten zum Transfer der Mikrotiterplatten vom Brutschrank zu und zwischen den Produktbearbeitungsstationen, (c) Bearbeitungsplätze für Zugabe und Absaugen von Zellkultur-Medien bzw. Reagentien und Inkubation im Brutschrank und (d) Computer-gestütztes Strich-Code („Barcode")-ldentifikations-und Nachverfolgungssystem („Tracking").
Das System ist vorzugsweise ein ELISA-Reader oder ein Mikrotiterplatten-Imaging- System. Ferner bevorzugt ist, daß das System zur Bestimmung der Zellmorphologie geeignet ist. Wie bei den anderen Robotern ist bevorzugt, daß die Mikrotiterplatte 96 oder 384 Vertiefungen aufweisen. Neben den Bearbeitungsplätzen für die Zugabe und das Absaugen von Zellkulturmedien etc. kann der Roboter weitere Produktbearbeitungsstationen aufweisen, wie z.B. Schüttler, Inkubatorplätze.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der vierte Roboter gekennzeichnet durch mindestens eines und vorzugsweise alle der nachfolgenden Merkmale (a) digitales Bildverarbeitungssystem und Bildaquisitionssystem zur Bestimmung von Zeil- Morphologie, Lumineszenz und/oder Fluoreszenz, (b) Pipettier-Station mit Greifarm für Mikrotiterplatten zum Transfer der Mikrotiterplatten vom Brutschrank zu und zwischen den Produktbearbeitungsstationen, (c) Bearbeitungsplätze für Zugabe und Absaugen von Zellkultur-Medien bzw. Reagentien und Inkubation im Brutschrank und (d) Computergestütztes Strich-Code („Barcode")-ldentifikations-und Nachverfolgungssystem („Tracking").
Unter dem Begriff " Bildverarbeitungssystem" ist ein System zu verstehen, das in der Lage ist, automatisch Lumineszenz- oder Fluoreszenzeigenschafts-Unterschiede und Morphologie-Unterschiede der zu untersuchenden Zellen zu detektieren und zu analysieren. Vornehmlich basiert die Datenverarbeitung eines solchen Systems auf neuronalen Netzen oder anderen dem Stand der Technik entsprechenden digitalen bildanalytischen Algorithmen. Unter dem Begriff " Bildaquisitionssystem" ist eine automatisierte Mikroskopierstation zu verstehen, die durch Kamera- oder "Scanning"-Systeme in der Lage ist, Bilder der zu untersuchenden Zellen zu generieren.
Sowohl Bildverarbeitungs- als auch Aquisitionssystem sind hierbei für einen Hochdurchsatz geeignet.
In noch einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das automatische Screenen ein funktionelles Screenen.
Der Begriff "funktionelles Screenen" bedeutet im Sinne dieser Erfindung, daß die Nukleinsaure, wie DNA oder das davon kodierte (Poly)peptid auf eine Funktion getestet wird. Eine RNA kann auf eine Ribozym-, eine anti-sense Eigenschaft oder auf die Bindungseigenschaft im Sinne eines Aptamers hin getestet werde. Überwiegend wird jedoch das kodierte (Poly)peptid auf eine gewünschte Eigenschaft getestet.
Ein RNAi-Oligonucleotid (doppelsträngige RNA) (Elbashir et al., 2002) kann auf seine Eigenschaft hin getestet werden, die Expression von Genen zu vermindern oder auszuschalten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das funktioneile Screenen ein Screenen auf eine enzymatische, pharmakologische oder therapeutische Eigenschaft.
Diese Eigenschaft wird üblicherweise an dem (Poly)peptid getestet. Beispielsweise kann die Eigenschaft, Apoptose in der Zelle zu induzieren, anhand von Zellmorphologie oder Zell-Assays wie CDD+-Assay (Röche Diagnostics, Basel/Schweiz) oder durch Caspase-Aktivierung bestimmt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das funktioneile Screening ein Screenen auf die Funktion von sekretierten Proteinen. Hierbei werden die von der transfizierten cDNA codierten Proteine in den Zellüberstand sezemiert. Dieser Überstand wird auf Zielzellen überführt und die Funktion des sekretierten Proteins durch Wirkung auf die Zielzelle bestimmt. Alternativ kann auch die mit der cDNA transfizierte Zelle mit der Zielzelle in Kontakt gebracht werden und die Funktion des exprimierten Proteins (beispielsweise auf der Zelloberfläche) durch Wirkung auf die Zielzelle bestimmt werden.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das funktioneile Screenen ein Screenen auf Aktivierung oder Suppression eines Reportersystems.
Geeignete Reportersysteme sind im Stand der Technik bekannt und umfassen Reportergenassays (beispielsweise zur transkriptioneilen Aktivierung von Indikatorproteinen, enzymatische Aktivierung /Deaktivierung von Indikatorproteinen). Beispiele sind das "Green Fluorescent Protein" (GFP), Luciferase (Firefly) aus dem Bereich der auf Fluoreszenz basierenden Reportersysteme.
In weiteren Ausführungsformen ist das Screenen ein Screenen nach veränderter Zeil-Morphologie, Zelltod oder Proliferation.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind 2, 3 oder alle 4 Roboter in einer Bandstraße angeordnet.
In dieser bevorzugten Ausführungsform werden mindestens 2, wie 3 oder alle 4 einzelnen Arbeitsstationen / Roboter für Koloniepicken, DNA-Präparation, DNA- Transfektion und Auslesen das funktioneilen Screening-Assays zusätzlich durch Bandstraßensysteme verknüpft bzw. kombiniert. Bisher notwendige Zwischenschritte zwischen den einzelnen Prozessen werden dadurch vermieden und der Probendurchsatz weiter erhöht.
Durch den Einsatz von Bandtransportsystemen in Kombination mit Überkopfmanipulatoren wird durch entsprechende Verschachtelung der Prozeßschritte ein serieller Produktionsprozeß erreicht, der im Gegensatz zu klassischen Pipetierstationen keine Limitation bezüglich des Produktionsvolumens aufweist. Die alternative Verwendung von 96-Loch- oder 384-Loch-Platten erhöht zusätzlich die Flexibilität.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein(e) im Screeningverfahren identifizierte(s) DNA, (Poly)peptid oder diese(s) enthaltende Transfektante aufgereinigt oder isoliert.
Für die weitere Bearbeitung der im Screening-Verfahren positiv getesteten DNA/RNAi-Oligonucleotide/(Poly)peptide ist es wünschenswert, daß die Substanzen oder die entsprechende Transfektante zu einer nicht mehr kontaminierten und damit reinen Form aufgereinigt wird. Dies ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auf besonders einfache Weise möglich, da z.B. die positiv getestete Substanz unmittelbar über den Rückgriff auf die Masterplatte zur Verfügung steht. Die weiteren Aufreinigungsschritte für die Substanzen oder die entsprechenden Transfektanten können nach konventionellen Verfahren erfolgen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Verbesserung der Bindungseigenschaften des (Poly)peptids, das durch die in dem erfindungsgemäßen Screeningverfahren identifizierten oder isolierten DNA kodiert wird, umfassend die Schritte (a) Identifizierung der Bindungsstellen des (Poly)peptids und seines Bindungspartners durch Stellenspezifische Mutagenese oder chimäre Proteinstudien; (b) molekulares Modellieren der Bindungsstelle sowohl des (Poly)peptids wie auch des Bindungspartners; und (c) Modifikation des (Poly)peptids, um die Bindungsspezifizität oder die Affinität der Bindung zu verbessern.
Das (Poly)peptid kann modifiziert werden, um die Bindungsaffinität oder Wirksamkeit und Spezifizität zu erhöhen. Wenn z.B. elektrostatische Interaktionen zwischen einem bestimmten Rest des in Frage stehenden (Poly)peptids und einer Region des (Poly)peptids bestehen, kann die Gesamtladung in dieser Region verändert werden, um so die bestehende Interaktion zu erhöhen. Computerprogramme können bei der Identifizierung von Bindungsstellen hilfreich sein. So können geeignete Computerprogramme zur Identifizierung von interaktiven Stellen eines vermeintlichen Inhibitors und dem Polypeptid durch Computergestütztes Suchen nach Komplementärstrukturmotifen verwendet werden (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Weitere geeignete Computersysteme für das Computer-gestützte Design von Proteinen und Peptiden sind im Stand der Technik beschrieben, z.B. in Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sei. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Modifizierungen des (Poly)peptids können z.B. durch Peptidomimetics hergestellt werden. Andere Inhibitoren können auch mittels Synthese von kombinatorischen Peptidomimetic-Bibliotheken durch sukzessive chemische Modifizierung und Testen der erhaltenen Zusammensetzungen identifiziert werden. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von kombinatorischen Peptidomimetic-Bibliotheken sind im Stand der Technik beschrieben , z.B. in Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220- 234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Darüber hinaus kann die dreidimensionale und/oder kristallographische Struktur der Aktivatoren der Expression des erfindungsgemäßen (Poly)peptids für das Design von peptidomimetischen Aktivatoren verwendet werden, z.B. in Verbindung mit dem erfindungsgemäß identifizierten (Poly)peptid (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933- 12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Modifikation in Schritt (c) eine Nachbildung des (Poly)peptids durch Peptidomimetics.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das (Poly)peptid als Leitstruktur weiter modifiziert, um (i) ein modifiziertes aktives Zentrum, ein modifiziertes Aktivitätsspektrum, eine modifizierte Organspezifizität und/oder (ii) eine verbesserte Aktivität und/oder (iii) eine verminderte Toxizität (ein verbesserter therapeutische Index) und/oder (iv) verminderte Nebenwirkungen und/oder (v) ein zeitlicher versetzter Beginn der therapeutischen Wirksamkeit, der Länge der therapeutischen Wirksamkeit und/oder (vi) veränderte pharmakokinetische Parameter (Resorption, Distribution, Metabolismus oder Exkretion) und/oder (vii) modifizierte physikochemische Parameter (Löslichkeit, hygroskopische Eigenschaften, Farbe, Geschmack, Geruch, Stabilität, Zustandsform) und/oder (viii) verbesserte generelle Spezifität, Organ- /Gewebespezifität, und/oder (ix) optimierte Verabreichungsform und- route durch (i) Veresterung von Carboxyigruppen oder (ii) Veresterung von Hydroxylgruppen mit Carbonsäuren oder (iii) Veresterung von Hydroxylgruppen zu beispielsweise Phosphaten, Pyrophosphaten oder Sulfaten oder Bemsteinsäurehalbester oder (iv) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder (v) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Komplexen oder (vi) Synthese von pharmakologisch aktiven Polymeren oder (vii) Einführung von hydrophilen Gruppen oder (viii) Einführung/Austausch von Substituenten in Aromaten oder Seitenketten, Veränderung des Substituentenmusters oder (ix) Modifikation durch Einführung von isosterischen oder bioisosterischen Gruppen oder (x) Synthese von homologen Verbindungen oder (xi) Einführung von verzweigten Seitenketten oder (xii) Konversion von Alkylsubstituenten zu zyklischen Analogen oder (xiii) Derivatisierung von Hydroxylgruppen zu Ketalen oder Acetalen oder (xiv) N-Acetylierung zu Amiden, Phenylcarbamaten oder (xv) Synthese von Mannich-Basen, Iminen oder (xvi) Umwandlung von Ketonen oder Aldehyden in Schiffs-Basen, Oxime, Acetale, Ketale, Enolester, Oxazolidine, Thiozolidine oder Kombinationen davon zu erreichen.
Die verschiedenen obengenannten Schritte sind allgemein im Stand der Technik bekannt. Sie umfassen oder basieren auf quantitativen Struktur-Wirkungs- Beziehungen (QSAR)-Analysen (Kubinyi, "Hausch-Analysis and Related Approaches", VCH Verlag, Weinheim, 1992), kombinatorischer Biochemie, klassischer Chemie und anderen (vgl. beispielsweise Holzgrabe and Bechtold, Deutsche Apotheker Zeitung 140(8), 813-823, 2000).
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens und ferner die Formulierung des erhaltenen Stoffes mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel. Das Arzneimittel kann auf konventionellem Wege hergestellt werden.
Beispiele für geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. Phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie z.B. Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Netzmittel oder Detergenzien, sterile Lösungen, etc. Arzneimittel, die solche Träger umfassen, können mittels bekannter konventioneller Methoden formuliert werden. Diese Arzneimittel können einem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung kann oral oder parenteral erfolgen, z.B. intravenös, intraperitoneal, subcutan, intramuskulär, lokal, intranasal, intrabronchial oder intradermal, oder über einen Katheter an einer Stelle in einer Arterie. Die Art der Dosierung wird vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt. Es ist dem Fachmann bekannt, daß die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie z.B. der Körpergröße bzw. dem Gewicht, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten, aber auch von dem speziell zu verabreichenden Mittel, der Dauer und Art der Verabreichung, und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel verabreicht werden. Eine typische Dosis kann z.B. in einem Bereich zwischen 0,001 und 1000 μg liegen, wobei Dosen unterhalb oder oberhalb dieses beispielhaften Bereiches, vor allem unter Berücksichtigung der oben erwähnten Faktoren, vorstellbar sind. Im allgemeinen sollte sich bei regelmäßiger Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung die Dosis in einem Bereich zwischen 1 μg- und 10 mg-Einheiten pro Tag befinden. Wird die Zusammensetzung intravenös verabreicht, was nicht bevorzugt empfohlen wird, um die Gefahr einer anaphylaktischen Reaktionen zu minimieren, sollte sich die Dosis in einem Bereich zwischen 1 μg- und 10 mg- Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht pro Minute befinden. Die Zusammensetzung der Erfindung kann lokal oder systemisch verabreicht werden. Präparate für eine parenterale Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wäßrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie z.B. Olivenöl, und organische Esterverbindungen wie z.B. Ethyloleat, die für Injektionen geeignet sind. Wäßrige Träger umfassen Wasser, alkoholisch-wäßrige Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Salzlösungen und gepufferte Medien. Parenterale Träger umfassen Natriumchlorid-Lösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat und gebundene Öle. Intravenöse Träger umfassen z.B. Flüssigkeits-, Nährstoff- und Elektrolyt-Ergänzungsmittel (wie z.B. solche, die auf Ringer-Dextrose basieren). Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann außerdem Konservierungsmittel und andere Zusätze umfassen, wie z.B. antimikrobielle Verbindungen, Antioxidantien, Komplexbildner und inerte Gase. Desweiteren können, abhängig von der beabsichtigten Verwendung, Verbindungen wie z.B. Interleukine, Wachstumsfaktoren, Differenzierungsfaktoren, Interferone, chemotaktische Proteine oder ein unspezifisches immunmodulatorisches Agens enthalten sein.
Allgemein kann der Gesamtprozess, welcher der Erfindung zugrunde liegt, beispielsweise wie folgt dargestellt werden:
1. Picken der Bakterienkolonien und Replikation (Roboter 1)
cDNA Bänke werden auf Agar Platten ausplattiert, die einzelnen Kolonien gepickt und in Mikrotiterplatten transferiert, in denen die Bakterien zur Vermehrung kultiviert werden. In einem 2. Schritt werden aus diesen Master-Platten mehrere Wachstumsplatten angeimpft und zur Vermehrung kultiviert, um ausreichend Bakterien für die DNA Isolierung zu generieren (Replikation).
2. DNA-Präparation (Roboter 2)
Die Wachstumsplatten mit der Bakteriensuspension werden zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Anschließend werden die Pellets in einem RNAse-haltigem Puffer resuspendiert (P1), ein alkalischer Lysepuffer (P2) zugesetzt und dieser anschließend neutralisiert (P3). Diese Schritte werden auf einem Orbitalschüttler durchgeführt, an dem ein Mehrkanaldispenser befestigt ist.
Nach einer kurzen Inkubation werden die Platten zentrifugiert und der Überstand in eine Zwischenplatte verbracht. Anschließend wird P4 zur Bindung bakterieller Endotoxine zudispensiert, nach einer Inkubation erneut zentrifugiert und der Überstand in eine 2. Zwischenplatte verbracht. Zu diesem Überstand wird Silika dispensiert, um die DNA zu binden. Es wird zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und das Pellet mit Aceton gewaschen. Nach einer erneuten Zentrifugation wird der
Acetonüberstand abgesaugt, das Silika Pellet mit 60°C heißem Wasser resuspendiert (Ablösung der DNA), zentrifugiert und die DNA Lösung in Endplatten verbracht.
(Puffer 1: Tris EDTA mit RNAse, P2: NaOH / SDS, P3: Kaliumacetatpuffer, P4: SDS in Isopropanol)
3. DNA-Transfektion (Roboter 3)
Eine definierte Menge der DNA Lösung aus dem in Roboter 2 produzierten DNA Platten wird in Zwischenplatten pipettiert und ein Kontrollplasmid (ß-Gal), Calciumchlorid, HBS zugegeben. Nach einer Inkubation zur Komplexbildung wird Chloroquine zum Ansatz dispensiert, und nach der Mischung eine definierte Menge des Ansatzes auf die Zellkultur pipettiert. Nach 4-5 h wird ein Mediumwechsel durchgeführt.
4. funktioneller Screening Assay (Roboter 4)
Nach 24-48h wird zu den Zellkulturplatten ein Substrat zugegeben, welches bei apoptotischen Zellen einen Farbumschlag verursacht. Dieser Farbwechsel wird in einem ELISA Reader ausgewertet und die Zellen verworfen.
2) DNA-Präparations- und Transfektions-Verfahren unter Verwendung von magnetischen Mikropartikeln:
Bakterien werden nach ihrem Wachstum in Wachstumsplatten zentrifugiert und mit einem RNAse Puffer behandelt. Die Resuspendierung der Bakterien erfolgt auf einem Orbitalschüttler. Anschließend werden ein lysierender und ein neutralisierender Puffer zugefügt. Durch die Zugabe von einer ersten Sorte magnetischen Mikropartikel werden Zelldebris und Proteine gebunden. Die magnetischen Mikropartikel werden auf einer Magnetplatte abgetrennt und der Überstand in eine Zwischenplatte gegeben. Danach wird optional eine zweite Sorte magnetischer Mikropartikel zugegeben, welche an bakterielle Endotoxine binden.
Diese werden ebenfalls magnetisch abgetrennt und der Überstand in eine 2.
Zwischenplatte verbracht. Diese Schritte können durch Zugabe einer Mischung beider Mikropartikelsorten kombiniert werden.
Alternativ können Endotoxin-Fällungsreagenzien eingesetzt werden, welche nach der
Fällung der Endotoxine über den ersten Mikropartikel-Separationsschritt entfernt werden.
In einem letzten Schritt werden Magnetische Mikropartikel zugegeben, welche die
DNA binden. Von diesen magnetische Mikropartikeln kann die DNA entweder eluiert und für Transfektionen eingesetzt werden oder bei entsprechender Formulierung der
Mikropartikel direkt für Transfektionen eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die während der DNA Isolierung hergestellten DNA-Mikropartikel-Komplexe direkt für Transfektionen eingesetzt werden.
Das Beispiel erläutert die Erfindung.
Beispiel 1: Ablauf des Screeningverfahrens zur Bestimmung der Funktion von Genen bzw. Genprodukten
1. Kolonie Picken und Replikation
Die DNA enthaltenden Bakterien wurden auf Agarplatten mit Selektionsantibiotikum so ausplattiert, daß eine möglichst hohe Zahl einzelner Klone gleichmäßig auf den Platten verteilt vorlag. Nach einer Übernacht-Inkubation bei 37°C wurden die Kolonien von einem Roboter gepickt und in 384er Mikrotiterplatten (MTP) verbracht, in denen 60 μ\ LB Medium mit Selektionsantibiotikum vorlag. Diese Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und am folgenden Tag mit einer Mischung aus LB Medium und Glycerin überschichtet, so daß die Endkonzentration von Glycerin 15% betrug. Anschließend wurden die Platten (nachfolgend als Master MTP bezeichnet) bei -80°C gelagert. Zur weiteren Verwendung wurden die Master MTP aufgetaut und mit einem Replikationstool auf einem ersten Roboter in 4 X 96er „DeepwelP'-MTP repliziert. In diesen 96er MTP wurden je 1 ,5 ml LB Medium mit Selektionsantibiotikum vorgelegt. Nach dem Animpfen wurden die Platten über Nacht in einem Schütteischrank bei 37°C inkubiert, die Schüttelgeschwindigkeit betrug 280 rpm.
2. DNA Präparation
Die 96er MTP wurden bei 3000g für 5min zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Auf einer Schüttelstation mit Dispenser wurden 170μl P1 (50 mM Tris pH 8,0; 10 mM EDTA pH 8,0; 100 μg/ml RNAse A (Qiagen) zugegeben, 5min bei 1000 rpm geschüttelt, 170 μ\ P2 (200 mM NaOH;1 % SDS) zugegeben, für 10s bei 300 rpm geschüttelt und für 5min bei RT inkubiert. Anschließend wurden 170 μ\ P3 (3 M KAc, pH 5,5) zugegeben und für 30 s bei 1000 rpm geschüttelt. Nach einer 5min Inkubation bei 4°C wurden die MTP für 5 min bei 3500 g abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und in eine Zwischen-MTP verbracht. Zu dem Überstand wurden 120 //I P4 (2,5 % SDS (Roth) in Isopropanol) gegeben und für 20 min bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde für 10 min bei 3500 g abzentrifugiert und der Überstand in eine neue Zwischenplatte verbracht. Es wurden 120 μ\ Silika (50 mg/ml Si02 (12,5 g auf 250 ml Wasser) zugegeben und für 5 min bei RT inkubiert. Die Silikasuspension wurde hierbei folgendermaßen hergestellt: 12,5 g Silika auf 250 ml Wasser wurde 30 min gerührt, der Überstand (enthält Silikastaub) sedimentiert; abgenommen; 150 μ\ konz. HCI zugegeben, mit H20 aufgefüllt auf 250 ml (Messzylinder) und autoklaviert. Anschließend wurde für 5 min bei 2000 g abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Es wurden 400 μ\ Aceton zugegeben, für 1 min bei 1000 rpm geschüttelt und anschließend 5 min bei 2000 g abzentrifugiert. Danach wurde der Überstand abgesaugt und die Platten mit den Silikapellets für 20 min auf einer Heizplatte bei 70°C getrocknet. Anschließend wurden 140 μ\ bidestilliertes Wasser mit einer Temparatur von 65°C zugegeben, 5min bei 800 rpm geschüttelt, 5min bei 3000 g abzentrifugiert und der Überstand mit der DNA in einer 96 Well Polystyrol MTP gelagert. 3. Transfektion
Die zu transfizierenden Zellen wurden am Vortag der Transfektion mit einer Zelldichte von ca. 8000 Zellen / Well in einer 96 Well Zellkulturplatte ausplattiert. In eine Zwischen MTP wurde 5 I ß-Gal Plasmid (c= 100ng/μl) dispensiert und anschließend 20 μ\ der DNA Lösung (c=100ng μl) zugegeben. Anschließend wurden 20 μ\ L1 (0,25 M CaCI2) zugegeben, kurz geschüttelt und anschließend 25 μ\ L2 (2x HBS) zugegeben. Nach 20min Inkubation bei RT wurden 15μl L3 (2 mM Chlorochin- Lösung) zugegeben und kurz geschüttelt. Von dieser Mischung wurden 9 μ\ auf die Zellen gegeben und für 5-6 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde ein Mediumwechsel (DMEM / 10 % FCS) durchgeführt. Nach Inkubation über Nacht wurde erneut ein Mediumwechsel (DMEM / 10 % FCS) durchgeführt.
4. Funktionelles Auslesen
Zu den transfizierten Zellen wurden 30 μ\ CPRG Lösung 2,31 ml 0,1 M Natriumphosphatlösung, 30 μ\ 100x MgCI2, 660 l CPRG-Lösung zu jedem Well der Zellkulturplatte gegeben und für 1-3 h inkubiert. Anschließend wurden die Platten in einem ELISA Reader vermessen (Absorbtionsmessung bei 570 nm )
Beispiel 2: funktionelles Screening nach sekretierten Proteinen:
COS-7 Zellen werden mit einer Zelldichte von etwa 5000 Zellen / Well in 10% DMEM ausgesät und 24h bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die cDNA wird durch Lipofektion mit Metafectene (Biontex, München) in die Zellen eingebracht und 3h bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Nach vollständiger Abnahme des Mediums wird Endothelial Cell Growth Medium (PromoCell, Heidelberg) zugegeben und die Zellen 48h bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Danach wird der Überstand abgenommen und auf Endothelzellen (Human Umbelical Vein Endothelial Cells, HUVECs oder Microvascular Endothelial Cells, HMVECs) überführt. Diese HUVEC Zellen werden zuvor mit einer Zelldichte von 2000 Zellen / Well in Endothelial Cell Growth Medium (Promocell, Heidelberg) ausgesät. Nach vollständiger Entnahme des Mediums wird der Überstand der COS-7 Zellen auf die Endothelzellen überführt. Die Zellen werden 6 Tage bei 37°C im Brutschrank inkubiert und die Aktivitäten der sekretierten Proteine durch die zytosolische Reduktion von Alamar Blue bestimmt (BioSource, Solingen) bestimmt.
Die einzelnen Versuchschritte werden, sofern nicht anders angegeben, mit Protokollen nach Current Protocols (Ausubel et. al, 2002) durchgeführt.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Screenen einer Sammlung von Nukleinsauremolekulen auf eine gewünschte Eigenschaft der Nukleinsaure oder eines davon kodierten (Poly)peptids, umfassend die Schritte
(a) automatisiertes Picken einer Sammlung von Zellen, die die Sammlung von Nukleinsauremolekulen enthalten, mittels eines ersten Roboters;
(b) automatisierte Lyse der Zellen mittels eines zweiten Roboters;
(c) automatisierte Abtrennung der Zeil-DNA vom Zelldebris mittels des zweiten Roboters;
(d) gegebenenfalls automatisierte Abtrennung von Endotoxinen von der DNA mittels des zweiten Roboters sofern die Zellen Bakterien sind;
(e) automatisierte Transfektion von Zellen mit der in Schritt (c) oder, sofern die Zellen Bakterien sind, in Schritt (d) erhaltenen DNA mittels eines dritten Roboters; und
(f) automatisiertes Screenen auf die gewünschte Eigenschaft mittels eines vierten Roboters.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Sammlung von Nukleinsauremolekulen eine Genbank oder eine Klonsammlung ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nukleinsäuremoleküle genomische DNA- oder cDNA-Moleküle oder RNAi-Oligonucleotide sind.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Genbank eine Expressions- cDNA-Genbank, vorzugsweise eine eukaryontische Genbank, besonders bevorzugt eine humane Genbank ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zellen in Schritt (a) und/oder Schritt (e) Säugerzellen, Insektenzellen, Hefezellen oder Bakterien sind.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Bakterien gram-negative Bakterien sind.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die gram-negativen Bakterien zur Art E. coli gehören.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei mindestens einer der Schritte (a) bis (f) in Mikrotiterplatten durchgeführt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei sämtliche Schritte (a) bis (f) in Mikrotiterplatten durchgeführt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Mikrotiterplatten mit Barcodes versehen sind.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der erste Roboter gekennzeichnet ist durch
(a) digitales Bildverarbeitungssystem zur Erfassung der ausplattierten Bakterien,
(b) Arbeits-Station mit Greifarm für Mikrotiterplatten zum Transfer der Mikrotiterplatten zwischen den Bearbeitungsstationen,
(c) Separations-Modul, versehen mit einem oder mehreren Nadelbestückten Köpfen zum Picken von ausplattierten Einzelkolonien und Ablage in Mikrotiterplatten,
(d) integrierte Produktbearbeitungsstationen zur Säuberung der Nadeln zwischen den Arbeitsschritten und Replikation der abgelegten Einzelkolonien in Mikrotiterplatten und
(e) Computer-gestütztes Strich-Code („Barcode")-Identifikations-und Nachverfolgungssystem („Tracking").
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Lyse eine alkalische Lyse ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der zweite Roboter gekennzeichnet ist durch
(a) Bandstraßentransportsystem kombiniert mit Greifarmen für Mikrotiterplatten zum Umladen der Produkte und Transfer der Mikrotiterplatten zwischen den Produktbearbeitungsstationen,
(b) im Transportsystem integrierte Produktbearbeitungsstationen, insbesondere Zentrifugen, Pipettier-Automaten, Schüttler und Inkubationsplätze zur Inkubation bei verschiedenen Temperaturen,
(c) Sensorik zur Detektion von Produktpositionen sowie zur Fehlerdetektion,
(d) Software zur verschachtelten Bearbeitung mehrerer in der Maschine befindlichen Prozesse für einen kontinuierlicher Produktionsbetrieb und
(e) Computer-gestütztes Strich-Code („Barcode")-ldentifikations-und Nachverfolgungssystem („Tracking") bevorzugt mit internem Produkt- Tracking, das eine Zeitstempel- („Timestamp"-) Funktion zur Verschachtelung zeitkritischer Subprozesse enthält.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Abtrennung der Zeil- DNA in Schritt (c) mittels Silica-Partikel erfolgt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Silica-Partikel magnetische Silica- Partikel sind.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Abtrennung der Endotoxine in Schritt (d) mittels Endotoxin-bindender Partikel erfolgt, die vorzugsweise magnetische Endotoxin-bindende Partikel sind.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Abtrennung der Endotoxine in Schritt (d) durch Fällung mit SDS/Isopropanol erfolgt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die an Silica-Partikel gebundene DNA durch Waschen mit Aceton weiter aufgereinigt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Transfektion von Zellen in Schritt (e) durch Calciumphosphat, Elektroporation oder durch Lipofaktoren vermittelt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Transfektion vermittels DNA-bindender magnetischer biokompatibler Mikropartikel durchgeführt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei der dritte Roboter gekennzeichnet ist durch
(a) Bandstraßentransportsystem kombiniert mit Greifarmen für Mikrotiterplatten zum Umladen der Produkte und Transfer der Mikrotiterplatten zwischen den Produktbearbeitungsstationen,
(b) im Transportsystem integrierte Produktbearbeitungsstationen, insbesondere Pipettier-Stationen, Schüttler, Inkubationsplätze sowie Brutschrank zur Kultivierung der Transfektanten,
(c) Sensorik zur Detektion von Produktpositionen sowie zur Fehlerdetektion,
(d) sterile Überdruckbelüftung zur Verhinderung von Kontaminationen der Zellkulturen,
(e) Software zur verschachtelten Bearbeitung mehrerer in der Maschine befindlichen Prozesse für einen kontinuierlicher Produktionsbetrieb und
(f) Computer-gestütztes Strich-Code („Barcode")-ldentifikations-und Nachverfolgungssystem („Tracking") bevorzugt mit internem Produkt- Tracking, das eine Zeitstempel- („Timestamp"-) Funktion zur Verschachtelung zeitkritischer Subprozesse enthält.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 , wobei der vierte Roboter gekennzeichnet ist durch
(a) System zur Bestimmung von Fluoreszenz, Lumineszenz bzw. Farbreaktionen aus Zellkultur-Assays, (b) Pipettier-Station mit Greifarm für Mikrotiterplatten zum Transfer der Mikrotiterplatten vom Brutschrank zu und zwischen den Produktbearbeitungsstationen,
(c) Bearbeitungsplätze für Zugabe und Absaugen von Zellkultur-Medien bzw. Reagentien und Inkubation im Brutschrank und
(d) Computer-gestütztes Strich-Code („Barcode")-ldentifikations-und Nachverfolgungssystem („Tracking").
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei der vierte Roboter gekennzeichnet ist durch
(a) digitales Bildverarbeitungssystem und Bildaquisitionssystem zur Bestimmung von Zeil- Morphologie, Fluoreszenz und/oder Lumineszenz
(b) Pipettier-Station mit Greifarm für Mikrotiterplatten zum Transfer der Mikrotiterplatten vom Brutschrank zu und zwischen den Produktbearbeitungsstationen,
(c) Bearbeitungsplätze für Zugabe und Absaugen von Zellkultur-Medien bzw. Reagentien und Inkubation im Brutschrank und
(d) Computer-gestütztes Strich-Code („Barcode")-ldentifikations-und Nachverfolgungssystem („Tracking").
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei das automatische Screenen ein funktionelles Screenen ist.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das funktionelle Screenen ein Screenen auf eine enzymatische, pharmakologische oder therapeutische Eigenschaft ist.
26. Verfahren nach Anspruch 14 oder 25, wobei das funktionelle Screenen ein Screenen auf Aktivierung oder Suppression eines Reportersystems ist, oder wobei das Screenen ein Screenen auf die Funktion eines sekretierten Proteins ist.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei 2, 3 oder 4 Roboter in einer Bandstraße angeordnet sind.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, wobei ein(e) im Screeningverfahren identifizierte(s) DNA, (Poly)peptid oder diese(s) enthaltende Transfektante aufgereinigt oder isoliert wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28 ferner umfassend die Verbesserung der Bindungseigenschaften des (Poly)peptids, das durch die in dem Screeningverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28 identifizierten oder isolierten DNA kodiert wird, umfassend die Schritte
(a) Identifizierung der Bindungsstellen des (Poly)peptids und seines Bindungspartners durch Stellen-spezifische Mutagenese oder chimäre Proteinstudien;
(b) molekulares Modellieren der Bindungsstelle sowohl des (Poly)peptids wie auch des Bindungspartners; und
(c) Modifikation des (Poly)peptids, um die Bindungsspezifizität oder die Affinität der Bindung zu verbessern.
30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Modifikation in Schritt (c) eine Nachbildung des (Poly)peptids durch Peptidomimetics ist.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei das (Poly)peptid als Leitstruktur weiter modifiziert wird, um
(i) ein modifiziertes aktives Zentrum, ein modifiziertes Aktivitätsspektrum, eine modifizierte Organspezifizität und/oder (ii) eine verbesserte Aktivität und/oder (iii) eine verminderte Toxizität (ein verbesserter therapeutische Index) und/oder (iv) verminderte Nebenwirkungen und/oder (v) ein zeitlicher versetzter Beginn der therapeutischen Wirksamkeit, der
Länge der therapeutischen Wirksamkeit und/oder (vi) veränderte pharmakokinetische Parameter (Resorption, Distribution,
Metabolismus oder Exkretion) und/oder (vii) modifizierte physikochemische Parameter (Löslichkeit, hygroskopische
Eigenschaften, Farbe, Geschmack, Geruch, Stabilität, Zustandsform) und/oder (viii) verbesserte generelle Spezifität, OrganVGewebespezifität, und/oder (ix) optimierte Verabreichungsform und- route durch
(i) Veresterung von Carboxyigruppen oder (ii) Veresterung von Hydroxylgruppen mit Carbonsäurer (iii) Veresterung von Hydroxylgruppen zu beispiels\ ten,
Pyrophosphaten oder Sulfaten oder Bernsteinsäure
(iv) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder
(v) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Komplexen oder
(vi) Synthese von pharmakologisch aktiven Polymeren oder
(vii) Einführung von hydrophilen Gruppen oder
(viii) Einführung/Austausch von Substituenten in Aromaten oder
Seitenketten, Veränderung des Substituentenmusters oder (ix) Modifikation durch Einführung von isosterischen oder bioisosterischen
Gruppen oder (x) Synthese von homologen Verbindungen oder (xi) Einführung von verzweigten Seitenketten oder (xii) Konversion von Alkylsubstituenten zu zyklischen Analogen oder (xiii) Derivatisierung von Hydroxylgruppen zu Ketalen oder Acetalen oder (xiv) N-Acetylierung zu Amiden, Phenylcarbamaten oder (xv) Synthese von Mannich-Basen, Iminen oder (xvi) Umwandlung von Ketonen oder Aldehyden in Schiffs-Basen, Oxime,
Acetale, Ketale, Enolester, Oxazolidine, Thiozolidine oder Kombinationen davon zu erreichen.
32. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend die Schritte des Verfahrens nach einem der Ansprüche 23 bis 31 und ferner die Formulierung des erhaltenen Stoffes mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
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